WO2015174643A1 - 표면 처리된 나노섬유를 포함하는 하이드로젤 및 이의 제조방법 - Google Patents

표면 처리된 나노섬유를 포함하는 하이드로젤 및 이의 제조방법 Download PDF

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WO2015174643A1
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hydrogel
nanofibers
bioadhesive
chitosan
chitin
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PCT/KR2015/003725
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황동수
오동엽
이도훈
정재혁
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포항공과대학교 산학협력단
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    • A61L27/56—Porous materials, e.g. foams or sponges

Definitions

  • the present invention relates to a bioadhesive hadrogel comprising the surface-treated nanofibers and a method for preparing the same, and to a bioadhesive composition, a tissue engineering support, and a drug delivery carrier comprising the bioadhesive hydrogel.
  • Bioadhesives refer to substances that have adhesion properties to various biological samples such as cell membranes, cell walls, lipids, proteins, DNA, growth factors, cells, tissues, etc., and are scaffolds for tissue adhesives, hemostatic agents, and tissue engineering.
  • Various biomedical benefits are possible, such as drug delivery carriers, tissue augmentation, wound healing agents, or anti-adhesion agents.
  • Bioadhesives require strong adhesion and crosslinking ability and maintain their function in vivo for a long time.
  • Bioadhesives currently commercially available or commercially available include cyanoacrylate instant adhesives, fibrin glues, gelatin glues, and polyurethane-based adhesives.
  • fibrin-based bioadhesives currently used in actual patients have little side effects such as immune reactions to the human body, but are limited in use because their adhesion ability is very low, and the price is also high.
  • An object of the present invention is a dihydroxyphenyl moiety, trihydroxyphenyl, covalently bonded to the surface of chitin nanofibers or chitosan nanofibers.
  • Another object of the present invention to provide a bioadhesive composition comprising the bioadhesive hydrogel.
  • Another object of the present invention to provide a support for tissue engineering comprising the bioadhesive hydrogel.
  • Yet another object of the present invention is to provide a drug delivery carrier comprising the bioadhesive hydrogel.
  • Another object of the present invention is to prepare a hydrogel with chitin nanofibers or chitosan nanofibers; And it provides a bioadhesive hydrogel manufacturing method comprising the step of performing a surface treatment of the nanofiber by treating the surface treatment material of the formula (1) to the surface of the nanofiber contained in the hydrogel.
  • the present invention is a dihydroxyphenyl residue, trihydroxypheny residue, or tannic acid covalently bonded to the surface of chitin nanofibers or chitosan nanofibers
  • the present invention relates to a hydrogel containing surface treated nanofibers.
  • the hydrogel containing the surface-treated nanofibers It relates to a manufacturing method.
  • the hydrogel including the surface-treated nanofibers of the present invention has excellent bioadhesive power and is intended to provide a bioadhesive composition and a method for preparing the bioadhesive with minimal side effects on the living body. Therefore, the bioadhesive hydrogel can be widely used as a bioadhesive, a tissue engineering support, or a drug delivery carrier.
  • La is a hydrogel containing chitin nanofibers prepared in the present invention
  • Lb is an XRD image of a hydrogel containing chitin nanofibers prepared in the present invention.
  • Figure 2a is a structural formula according to the method for synthesizing chitin nanofiber surface-treated with gallic acid according to the present invention.
  • Figure 2b is a hydrogel containing chitin nanofibers according to the present invention
  • Figure 2c is an image showing the color development by the treatment of Arnow assay reagent on the flesh (flesh).
  • FIG. 3 is an adhesive composition containing chitin nanofiber hydrogel surface-treated with Fe 3+ and gallic acid, and an adhesive composition containing chitin nanofiber hydrogel surface-treated with NaIO 4 and gallic acid according to one embodiment of the invention.
  • Figure 4a is an oxidizing agent or chitin nanofiber hydrogel surface-treated with gallic acid
  • This figure shows the binding mechanism that occurs with TOPA when Fe 3+ is added.
  • Figure 4b is a graph proved using the Raman Spectrometer, a binding reaction that occurs substantially with TOPA when Fe 3+ is added to the chitin nanofiber hydrogel surface-treated with gallic acid. . ,
  • 5 is a rat of a hydrogel containing chitin nanofiber surface-treated with gallic acid
  • a graph showing the results of measuring cytotoxicity against osteoblasts (MC-3T3 el). 6 is a diagram schematically illustrating the appearance of a sea urchin surface.
  • FIG. 7 is a diagram schematically illustrating a hydrogel including chitin nanofibers surface treated with gallic acid.
  • FIG. 9 is a photograph showing the adhesion of the two hydrogels according to the present invention.
  • 10 is a schematic diagram showing a process of increasing the adhesion by treating the oxidant to the chitosan hydrogel prepared according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 is a photograph of the hydroxyapatite / adhesive composite prepared according to one embodiment of the present invention in water and shake to test the adhesion.
  • Hydrogels containing the surface treated nanofibers according to the present invention are similar to the wound healing mechanism of Sea squirt.
  • 6 is a diagram schematically illustrating the appearance of a sea urchin surface.
  • the sea squirrel is surrounded by armor called tunics, which are mainly tunicin, cellulose nanofibrils (l 40 GPa, 26 nm x 2.2 mm) and TOPA (coated with protein microfibers). 3,4,5-trihydroxyphenylalanine).
  • tunics which are mainly tunicin, cellulose nanofibrils (l 40 GPa, 26 nm x 2.2 mm) and TOPA (coated with protein microfibers). 3,4,5-trihydroxyphenylalanine).
  • tunics which are mainly tunicin, cellulose nanofibrils (l 40 GPa, 26 nm x 2.2 mm) and TOPA (coated with protein microfibers). 3,4,5-trihydroxyphenylalanine).
  • Tannic acid also known as sediment and tannin
  • the main agent of the leather action is polyhydric phenol. It combines with collagen to denature the animal's hides into stable skins.
  • Tannin (I) is a mapped seed ester such as hydroxyl groups, such as sugars and quinic acid, and molar assets, and nucleated hydroxydiphenic acid that ellagic acid is ring-opened. It is hydrolyzed by acid, alkali and tanase to produce gallic acid, ellagie acid and the like.
  • the gall bladder and the fruit of Terminalia chebula are used in the treatment of leather.
  • Tannin (II) includes catechins, leucoanthocyanates, and proanthocyanates, which are derivatives of flavans, and stilbenes. However, some condensation types have hydrolytic properties such as glycosides or esters of molar assets, but when they are heated with acid, they are polymerized to produce a red amorphous precipitate called phloba-phene. It has astringent taste (astringent taste), and green tea contains catechins, esters formed with gallic acid at its third position, and leucoanthocyanin in the thin juice of raw persimmon.
  • Gallic acid and ellagic acids are biosynthesized in the shikimic acid pathway, and the flavanes skeleton is a composite of the shikimic acid and acetic acid-malonic acid pathways.
  • the physiological function of tannins in plants is not clear, but their strong binding to proteins suggests a defense against disease.
  • Tannic acid is a kind of natural polyphenol and may have a structure of the following formula.
  • the molecular structure of tannic acid is not limited thereto, and may exist in the form of various polymers having various functional groups.
  • tannic acid has a large number of hydroxyl groups in a molecule, and thus has a property of being easily combined with macromolecules such as polysaccharides, proteins, and alkaloids.
  • three or more galloyl groups which may be present in the molecule, may bind to iron (III) ions to form stable complexes of the octahedral structure.
  • each galloyl group may have different iron ( ⁇ ).
  • Crosslinking can be formed by using silver as a center metal.
  • the structure of tannic acid is as follows.
  • Bioadhesive hydrogel according to an embodiment of the present invention includes a surface-treated nanofibers, specifically, dihydroxyphenyl residues, trihydroxyphenyl (covalently bonded to the surface of chitin nanofibers or chitosan nanofibers) trihydroxypheny residues, or surface treated nanofibers containing tannic acid.
  • the hard draw gel is prepared by covalently binding to chitosan nanofibers, chitin nanofibers, or chitosan, which is a similar fiber structure of tunisin, to tannin acid or a surface treatment material of Chemical Formula 1 below.
  • R1 is a hydrogen atom or -OH
  • R2 is -H, -COOH, -CHO, -NH 2 , -SH, at least one hydrogen atom of a straight or branched alkyl group of 1 to 10 carbon atoms, or a cyclic alkyl group of 3 to 10 carbon atoms is a hydrogen atom,- An alkyl group substituted with COOH, -CHO, -NH 2 , or -SH.
  • the compound having Formula 1 is catechol (catechol), dopa (3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA), topa (3,4,5- trihydroxyphenylalanine, TOPA),
  • It may be selected from the group consisting of pyrogallol, and gallic acid, preferably gallic acid and pyrogallol.
  • the surface-coupling method may be used to form a covalently-ol.
  • the amine group (-NH 2 ) of the nanofibers and the carboxyl group (-COOH) of gallic acid (-COOH) are peptided (- CONH-) was used as a reaction (FIG. 2A), but is not limited thereto.
  • Compound having the formula (1) chitin nanofibers, chitosan nanofiber, or a heunhap water loo by weight 0 /. Based on the range of 0.1 to 30% by weight, ⁇ to 10 parts by weight 0/0, 1 to 30 parts by weight 0/0, 10 to 30 may be a weight 0/0, or 10 to 20% by weight.
  • hydrogel refers to a hydrosol that loses fluidity due to incidence, or a hydrophilic polymer having a three-dimensional network structure and a microcrystalline structure is formed by expanding with water. A large amount of water is filled in a lattice of a polymeric material to swell to maintain a three-dimensional structure, and refers to a material that is liquid but solid-like.
  • Hydrogels can absorb at least 20% or more of the total weight of water and are thermodynamically stable after hydrogels are swollen in solution, having mechanical and physicochemical properties that correspond to the intermediate forms of liquids and solids. . Hydrogels have mechanical flexibility similar to real tissues, and contain a lot of water, but do not break the bond of the gel by water, which requires adhesion to wet biological surfaces containing moisture and resistance to external moisture. Applications to medical adhesives and the like that are supposed to have been actively being made.
  • the hydrogel having excellent tissue adhesion according to the present invention is a hydrogel having excellent tissue adhesion according to the present invention. Therefore, the hydrogel having excellent tissue adhesion according to the present invention is a hydrogel having excellent tissue adhesion according to the present invention.
  • tissue adhesives such as tissue adhesives, hemostatic agents, tissue engineering supports, drug delivery carriers, tissue stratification agents, wound healing agents or anti-adhesion agents.
  • tissue adhesives such as tissue adhesives, hemostatic agents, tissue engineering supports, drug delivery carriers, tissue stratification agents, wound healing agents or anti-adhesion agents.
  • tissue engineering supports such as tissue adhesives, hemostatic agents, tissue engineering supports, drug delivery carriers, tissue stratification agents, wound healing agents or anti-adhesion agents.
  • drug delivery carriers such as tissue stratification agents, wound healing agents or anti-adhesion agents.
  • tissue stratification agents such as an adhesive for medical purposes to provide.
  • Hydrogel according to the present invention has an adhesive strength at 50% relative humidity of 5 to 100 Mpa, 5 to 80 Mpa, 20 to 100 Mpa, 20 to 80 Mpa, 50 to 80 Mpa, 50 to 60 Mpa, or 55 to 60 It can be Mpa.
  • the hydrogel has a relative humidity
  • the adhesive strength at 100% may be 0.05 Mpa to 10 MPa, 0.1 to 10 Mpa, 1 to 10 Mpa, 5 to 10 Mpa, or 0.05 to 5 Mpa.
  • the present invention relates to a bioadhesive composition
  • a bioadhesive composition comprising a hydrogel containing the surface-treated nanofibers.
  • Bioadhesive composition of the present invention can be present in place of i-cyano-acrylic adhesive, or fibrin-based adhesive or the like, which is mainly used on the market, used in several areas of skin, such as blood vessels, digestive, neurological, plastic surgery, orthopedics.
  • the biocompatible biotissue adhesive of the present invention can replace surgical sutures, can be used to block unnecessary blood vessels, and can be used for soft tissues such as facial tissues, cartilage, or hard tissues such as bones and teeth. It can be used for hemostasis and suture, and it is possible to apply it as a home suspension.
  • the bioadhesive of the present invention may be applied to the inner and outer surfaces of a living body, that is, the bioadhesive of the present invention may be applied to the outer surface of a living body such as skin or the surface of an internal organ exposed during a surgical procedure. Can be applied as
  • the bioadhesive of the present invention can be used to bond damaged parts of tissues, to seal leakage of air or fluid from tissues, to adhere medical instruments to tissues, or to fill defects of tissues.
  • biological tissue is not particularly limited herein, for example, skin, bone, nerve, axon, cartilage, blood vessels, cornea, muscle, fascia, brain, prostate, breast, endometrium, lung, spleen, small intestine , Liver, testes, ovaries, cervix, rectum, stomach, lymph nodes, bone marrow, kidneys, and the like, but is not limited thereto.
  • the bioadhesive of the present invention may not only be used for hemostasis and suture of soft tissues such as cartilage or hard tissues such as bones and teeth, but may also be applied to progeny of bone components.
  • Hydroxyapatite and It may be one or more selected from the group consisting of octacalculphosphate, but is not limited thereto.
  • the bioadhesive of the present invention can be used for wound healing.
  • the biocompatible bioadhesive of the present invention can be used as a dressing applied to a wound.
  • the bioadhesive of the present invention can be used for skin closure. That is, the bioadhesive of the present invention may be applied topically and used to seal the wound, replacing the suture.
  • the bioadhesive of the present invention can be applied to restoring hernia, for example, can be used for the surface coating of the mesh (mesh) used for restoring hernia.
  • the bioadhesive of the present invention can also be used to prevent closure and leakage of tubular structures such as blood vessels.
  • the bioadhesive of the present invention can be used for hemostasis.
  • the bioadhesive of the present invention may be used as an anti-adhesion agent after surgery.
  • Adhesion occurs at all surgical sites, where other tissues stick around the wound around the surgical site. Adhesion occurs about 97% after surgery, especially 5 to 7% of which causes serious problems.
  • the wound may be minimized during surgery or anti-inflammatory agents may be used.
  • TP A tissue plasminogen activator
  • TP A tissue plasminogen activator
  • the bioadhesive of the present invention can be applied to exposed tissue after surgery to be used to prevent adhesions occurring between the tissue and surrounding tissue.
  • the present invention relates to a support for tissue engineering comprising a pseudohydrogel.
  • Tissue engineering technology refers to culturing cells isolated from a patient's tissue in a support to prepare a cell-support complex, and then transplanting the prepared cell-support complex again in vivo. Skin, artificial bones, artificial cartilage, artificial cornea, artificial blood vessels, artificial muscles Applied for playback.
  • Bioadhesive hydrogels of the present invention can provide scaffolds similar to living tissue to optimize the regeneration of living tissue and organs in tissue engineering techniques.
  • Hydrogels of the present invention can be easily attached to various bioactive substances involved in the action of promoting the growth and / or differentiation of cells through the interaction with cells or tissues of the living body, and help in the regeneration and recovery of allergic tissues.
  • the amine functional group in the hydrogel is used as a functional group for bioconjugation of other bioactive substances, so that the bioactive substance can be readily bioconjugated.
  • bioconjugation means two or more
  • physiologically active substance may be included in order to implement an artificial extracellular matrix of a structure similar to a natural extracellular matrix
  • Biomolecules are sometimes referred to collectively.
  • the bioactive substance may include cells, proteins, nucleic acids, sugars, enzymes, and the like, and examples thereof include cells, proteins, polypeptides, polysaccharides, monosaccharides, loligosaccharides, fatty acids, nucleic acids, and the like. Can be mentioned.
  • the cell may be any cell, including prokaryotic and eukaryotic cells, for example osteoblasts, fibroblasts, hepatocytes, neurons cancer cells, B cells ( B cells), white blood cells, etc., including immune cells (immunocytes) and embryonic cells (embryonic cells), etc.,
  • prokaryotic and eukaryotic cells for example osteoblasts, fibroblasts, hepatocytes, neurons cancer cells, B cells ( B cells), white blood cells, etc., including immune cells (immunocytes) and embryonic cells (embryonic cells), etc.
  • the physiologically active substance may include a plasmid nucleic acid as a nucleic acid material, hyaluronic acid as a sugar substance, heparin sulfate, chondroitin sulfate, alginate, and hormonal protein as a protein substance, but is not limited thereto.
  • the present invention relates to a drug delivery carrier comprising the hydrogel.
  • Bio-injectable tissue adhesive hydrogel according to the present invention is effective for drug delivery It can be used as an artificial extracellular matrix as a scaffold.
  • the drug is not particularly limited, and may include, but is not limited to, chemicals, small molecules, peptides, protein drugs, nucleic acids, viruses, antibacterial agents, anticancer agents, anti-inflammatory agents, or combinations thereof.
  • the small molecule may be, but is not limited to, contrast crabs (e.g., ⁇ contrast agent, ⁇ 2 contrast agent such as superparamagnetic material, radioisotopes, etc.), fluorescent markers, dyeing materials, and the like.
  • contrast crabs e.g., ⁇ contrast agent, ⁇ 2 contrast agent such as superparamagnetic material, radioisotopes, etc.
  • fluorescent markers e.g., fluorescent markers, dyeing materials, and the like.
  • fibroblasts The peptide or protein drug, hormones, hormonal analogs, enzymes, inhibitors, signaling proteins or parts thereof, antibodies or parts thereof, single chain antibodies, binding proteins or binding domains, antigens, adhesion proteins, structural proteins, regulatory proteins, Toxin proteins, cytokines (cytokine), transcriptional regulators, blood coagulation factors, or vaccines, and the like, but are not limited thereto. More specifically, fibroblasts
  • FGF Fibroblast growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • TGF transforming growth factor
  • BMP bone morphogenetic protein
  • hGH human growth hormone
  • Porcine growth hormone pGH
  • G-CSF leukocyte growth factor
  • EPO erythrocyte growth factor
  • Macrophage growth factor (M-CSF), tumor necrosis factor (TNF), epidermal growth factor (EGF), platelet-induced growth factor (PDGF), interferon, interleukins, calcitonin,
  • Nerve growth factor (NGF), growth hormone releasing factor,
  • the nucleic acid may be RNA, DNA or cDNA, and the sequence of the nucleic acid may be a coding site sequence or a non-coding site sequence (eg, antisense
  • Oligonucleotides (anti-sense oligonucleotides or siRNA).
  • the virus may be a viral core containing the entire virus or a nucleic acid of the virus, ie the nucleic acid of the packaged virus without the envelope of the virus.
  • viruses and virus centers that can be transported include Papillomavirus, Adenovirus,
  • Baculovirus, retrovirus core, and semilky virus core are Baculovirus, retrovirus core, and semilky virus core, and the like.
  • the antimicrobial agent may be minocycline, tetracycline, optoxacin, phosphomycin, mergaine, profloxacin, ampicillin, penicillin, doxycycline, thienamycin,
  • Cephalosporins Cephalosporins, norcardycins, gentamicins, neomycins, kanamycins, guomomycins, micronomycins, amikacins, tobramycins, dibecasins, cytotaxins, sefacllers,
  • the anticancer agent includes paclitaxel, taxotier, adriamycin, endostatin, angiostatin, mitomycin, bleomycin, cisplatin, carboplatin, doxorubicin, daunorubicin, idarubicin, 5-fluorouracil, methotrexate, Actinomycin -D, or a combination thereof, but is not limited thereto.
  • the anti-inflammatory agent is acetaminophen, aspirin, ibuprofen, diclofenac, indomethacin, pyricampam, phenopropene, flubiprofen, ketoprofen, naphthoxen, supropene, toxoprofen, synoxy Cam, tenoxycamp, or a combination thereof, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a bioadhesive comprising a surface-treated nanofiber comprising a dihydroxyphenyl residue, a trihydroxypheny residue, or tannic acid covalently bonded to the surface of chitin nanofibers or chitosan nanofibers.
  • the hydrogel may be a hydrogel formed by a bond between dihydroxyphenyl, trihydroxyphenyl moiety, or tannic acid contained in the nanofibers, and an oxidizing agent or a metal ion.
  • the method for producing a bioadhesive hydrogel of the present invention comprises the steps of preparing a hydrogel with chitin nanofibers or chitosan nanofibers; And treating the surface of the nanofibers contained in the hydrogel with tannic acid or a surface treatment material of Formula 1 to perform surface treatment of the nanofibers;
  • Bioadhesive hydrogel manufacturing method comprising a.
  • R 1 is a hydrogen atom or a hydroxyl group
  • R2 is a hydrogen atom, -COOH, -CHO, -N3 ⁇ 4, -SH, or at least one hydrogen atom of a linear, branched, or cyclic alkyl group of 1 to 10 carbon atoms is hydrogen, -COOH, -CHO, -NH 2 , or An alkyl group substituted with at least one group selected from the group consisting of SH.
  • the preparing of the hydrogel may be a bioadhesive hydrogel manufacturing method which is performed by adding a metal ion or an oxidizing agent to nanofibers.
  • the metal ion may be Ca 2+ , Fe 2+ , Fe 3+ , V 4+ , V 3+ , V 2+ , and the like, but is not limited thereto.
  • the oxidant may be sodium periodate, tetrabutylammonium periodate, hydrogen peroxide, or the like, but is not limited thereto.
  • the addition amount of the metal ion or oxidizing agent is based on the dihydroxyphenyl residue, trihydroxyphenyl residue, or tannic acid contained in the nanofibers 5 to 5 mol, 0.15 to 5 mol, 0.15 to 15 mol, 0.5 to 5 moles, 5 to 15 moles, () .5 to 1.5 moles, or 0.15 to 1.5 moles.
  • the adding of the metal is a step of coordinating the metal ions with dihydroxyphenyl residue, trihydroxyphenyl residue, or tannic acid contained in the nanofibers.
  • the present invention is contained in the nanofibers
  • a bioadhesive hydrogel comprising reacting a dihydroxyphenyl residue, a trihydroxyphenyl residue, or tannic acid with Fe 3+ ions.
  • Chitosan is a process in which the acetamide group is removed from chitin, that is, deacetylation
  • the chitosan may use 85-95% deacetylated chitosan.
  • the chitin nanofibers may be carried out in a hydrogel state containing nanofibers, and in the case of chitosan, it may be performed in a solution state dissolved in water because it is soluble in water.
  • the step of adding the oxidant is contained in the nanofibers
  • a dihydroxyphenyl residue, trihydroxyphenyl residue, or tannic acid is oxidized by an oxidizing agent to form a covalent bond between the dihydroxyphenyl residue, trihydroxyphenyl residue, or tannic acid.
  • the step of preparing the hydrogel before performing the step of preparing the hydrogel, it may be to perform a step of deacetylation to the nanofibers.
  • the obtained hydrogel containing chitin nanofibers was analyzed by transmission electron microscope (TEM) and X-ray diffraction (XRD), and the results are shown in FIGS. La and lb.
  • the morphology of the dried hydrogel containing chitin nanofibers was studied using a high-resolution scanning electron microscope JEOL JSM-7401F (SEM, Japan).
  • the chitin nanofiber hydrogel prepared in the presence of the nanofibers could be confirmed using the TEM, as shown in Figure lb, whether the nanofibers are the same as the chitin nanofibers XRD analysis I could confirm through
  • the XRD experiment showed that under conditions of 40 kV / 100 mA Ni-filtered Cu K a radiation,
  • the gallic acid-chitin conjugation present in the hydrogel containing chitin nanofibers surface-treated with gallic acid was analyzed by Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR), and the results are shown in FIG. 2B.
  • FT-IR Fourier transform infrared spectroscopy
  • FT-IR analysis was performed using a single-beam MIDAC M 1200 (Midiac corporation, Mass., USA), having a 4 cm resolution and ranging from 1000 to 4000 cm 1 .
  • 6b is a schematic illustration of a hydrogel comprising chitin nanofibers surface treated with gallic acid.
  • a modified Amow assay was performed with chitin hydrolysis methods widely used for amino acid and polyphenol extract analysis. 5 mg, 10 mg, and 15 mg of gallic acid and 25 mg of dried adhesive are vacuum sealed in a glass ampoule containing 6 M HC1 500 and 20 mol (to minimize oxidation) and heated to 1 KTC, respectively. It was. 24 hours later, in each glass ampoule The solution was diluted 10 fold. A change in color was observed by adding 500 ⁇ of 1.45 M sodium nitrite / 0.4 M sodium molybdate solution to each diluted solution of 500 ⁇ and lM NaOH lm l was added to each dilute solution to observe the change of color.
  • Chitin nanofibers surface-treated with gallic acid were subjected to various adhesion experiments to determine the adhesion on the surface similar to biological tissue.
  • hydrogels containing chitin nanofibers bonded with gallic acid prepared in step 1 a curing process is required to maintain adhesion in water, and different curing methods by pyrogalization, that is, coordination with metal ions.
  • Two types of adhesive compositions were prepared through the method and the curing method by covalent bonding for the remainder.
  • the Fegal 3 is mixed with the pyrogallium-linked chitin nanofiber prepared in Example 1 so that the molar ratio of pyrogallol: Fe 3+ is 3: 1.
  • the pyrogal was cured by -Fe coordination to prepare an adhesive composition containing chitin nanofiber hydrogels surface treated with Fe 3+ and gallic acid.
  • pyrogalol-bonded chitin nanofibers prepared in Example 1 were subjected to pyrogallol: I (the oxidant NaI0 4 so that the molar ratio of V is 2: 1.
  • Fe 3+ Fe 3+ -DOPA hydrogel is a catechol (residue of DOPA) and achieved a coordination bond and said to have the strongest known reversible binding of the water, residue of catechol and the coordinate bond of Fe 3+ of DOPA is It is well known that it can be analyzed by Raman spectroscopy (Holten-Andersen, N. et al.
  • Raman spectra were obtained using LabRam ARAMIS (Horiba Jobin-Yvon, France) under the following conditions. All spectra were collected data values, a value of 400 cm 1 to 1600 cm- 1 range is irradiated with light of 785 nm in samples.
  • the adhesion in water of the two types of adhesive compositions of Example 3 was measured. Apply the composition to the ends of two aluminum bars 10 mm x 10 mm in size of 10 mm x 50 mm. The ends of the two aluminum sticks of lOmm X IOmm with the adhesive composition applied are folded and clipped to face each other. The two aluminum bars are clipped to form a pair of adhesion test sample samples. In this way, 5 pairs of samples were prepared for each of the two adhesive compositions and then immersed in PBS (pH 7.4) buffer for 2 hours.
  • PBS pH 7.4
  • strain-stress graph shows the x-axis and the y-axis as stress.
  • the highest stress value before the adhesive falls between two aluminum bars is defined as the shear strength of the sample.
  • the adhesive strength and stress-strain curve graphs of the two adhesive compositions are shown in FIG. 3. (Kim, BJ (2014).
  • Example 5 Cytotoxicity Test on Osteoblasts
  • the experimental method and principle of measuring cell viability are as follows. A chitin nanofiber material surface-treated with the gallic acid as an adhesive composition was coated on a cell culture dish to be an experimental group, and a cell culture dish with nothing coated was used as a control. Two types of cell culture dishes were prepared with a solution in which osteoblasts prepared in advance were evenly dispersed.
  • CCK-8 cell counting kit-8
  • the CCK-8 reagent reacts with the cell metabolites and develops color
  • the cell population can be determined from the extinction coefficient of the medium containing the cells.
  • the increase in cell population is proportional to cell viability.
  • FIG. 5 Cell viability test results are shown in FIG. 5.
  • the red circle shows the cell viability of the glass substrate treated with the adhesive composition of the present invention
  • the black circle shows the cell viability when the glass substrate not treated with the adhesive composition of the present invention is used as a control. .
  • the adhesive composition of the present invention was treated.
  • Chitosan (85-95% deacetylated chitosan) lg was added to 100 ml of aqueous hydrochloric acid solution at pH 2. Melted. The pH of the chitosan solution was increased to 5.5 by dropping 1 M aqueous sodium hydroxide solution. Two equivalents of gallic acid relative to the monomer (glucosamine) and L equivalents of EDC relative to the gallic acid were dissolved in 20 ml of methanol. After 15 minutes of complete dissolution of the EDC, NHS (1 equivalent of EDC) was added to the solution with methane. After 30 minutes of NHS addition, the chitosan solution and the solution containing gallic acid / EDC / NHS were mixed and the mixture was held for 12 hours. The process was carried out in an ice bath, and the EDC and NHS in the hydrogel composites were subjected to massive dilution, centrifogation,
  • the gallic acid-chitosan conjugation present in the chitosan hydrogel containing gallic acid was analyzed by proton Nuclear magnetic resonance (1H-NMR), and as a result, chitosan hydrogel 1H-NMR data containing gallic acid were shown in FIG. 7. .
  • Chitosan hydrogels containing gallic acid require a curing process in order to maintain adhesion in water, and different curing methods by pyrogallol, that is, by coordination bonds with metallic silver and by covalent bonds for a long time.
  • Two types of adhesive compositions were prepared by the method. The method for preparing the adhesive composition was substantially the same as Example 3, but the chitin hydrogel containing the gallic acid of Example 3 was used, but in this embodiment the chitosan hydrogel containing the gallic acid of Example 6 instead. Was used.
  • chitosan hydrogel containing gallic acid prepared in Example 6 was mixed with FeCl 3 so that the molar ratio of pyrogallol: Fe 3+ was 3: 1 Curing was carried out by -Fe coordination bond to prepare an adhesive composition containing a chitosan hydrogel containing Fe 3+ and gallic acid.
  • a chitosan hydrogel containing gallic acid prepared in Example 6 was used so that the molar ratio of pyrogallol: ICV was 2: 1.
  • Two types of adhesive compositions containing chitosan hydrogels containing KV and gallic acid were prepared by crosslinking through covalent bonding by treating the oxidizing agent NaI0 4 .
  • FIG. 8 is a photograph showing the adhesion of the prepared hydrogel, and coordination between the hydrogel and the metal by covalent bonding between pyrogallol residues. It shows the form of the hydrogel crosslinked by the bond.
  • the pH is a picture of increasing the pH to increase the number of coordination bonds to increase the pH. In other words, it is a form photo of a simple hydrogel.
  • the chitosan nanofibers of the present application is shown in Figure 3 the physical properties verification test results.
  • Example 8 Characterization of Bioadhesives Comprising Chitosan Hydrogel
  • Chitosan / Gallic acid hydrogel was used as an adhesive for fixing bone conducting substances such as hydroxyapatite (calcium-phosphate complex) or bovine flour, which is actually used for bone regeneration during clinical surgery.
  • the test method for characterization as an underwater adhesive in the aquatic environment in the body for use in the clinical is as follows. . 20% (w / w) of the chitosan / gallic acid water prepared in Example 7 was dissolved to form a hydrogel containing chitosan. At this time, the concentration of chitosan / gallic acid
  • the prepared hydrogel was mixed with hydroxyapatite or bovine flour, and strong covalent bonds were formed by using an oxidizing agent, NaI0 4 to increase the contact force and are shown in [FIG. 9A]. Even when the oxidant was not used, sufficient adhesion was shown. In this example, the oxidant was used together to induce a strong bond.
  • the prepared hydroxyapatite / adhesive composite was placed in water and shaken vigorously, but no constituents were separated and dropped, and strong adhesive force was maintained for at least one week, and is shown in [FIG. 9B].
  • the adhesive has the potential as a bioadhesive, which is a suture or long-lasting suture in mucosal tissues and organs inside a living body.

Abstract

본 발명은 표면 처리된 나노섬유을 포함하는 생체접착성 하이드로젤, 이의 제조방법, 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명을 통하여 제공되는 표면 처리된 나노섬유를 이용한 하이드로젤은, 우수한 생체접착력을 가지므로, 생체접착제, 조직공학용 지지체, 또는 약물 전달용 담체 등으로 폭넓게 응용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
표면 처리된 나노섬유를 포함하는 하이드로젤 및 이의 제조방법 【기술분야】
본 발명은 표면 처리된 나노섬유를 포함하는 생체접착성 하아드로젤 및 이의 제조방법과 상기 생체접착성 하이드로젤을 포함하는 생체접착제 조성물, 조직공학용 지지체, 및 약물전달용 담체로의 용도에 관한 것이다. 【배경기술】 생체접착제는 생물의 세포막, 세포벽, 지질, 단백질, DNA, 성장인자, 세포, 조직 등과 같은 다양한 생물시료에 부착 특성을 갖는 물질을 말하며， 조직접착제, 지혈제， 조직공학용 지지체 (scaffold), 약물전달용 담체 (drug delivery carrier), 조직층진제 (tissue augmentation), 상처 치료제, 또는 유착방지제 등의 다양한 생의학적 웅용이 가능하다.
이러한 생체접착제는 강력한 접착능력 및 가교능력이 필요하고， 오랜 기간 생체 내에서 그 기능을 유지해야 한다. 현재 상용화 또는 실용화되고 있는 생체접착제로는 시아노아크릴레이트 (cyanoacrylate) 순간 접착제, 피브린 글루 (fibrin glue), 젤라틴 글루 (gelatin glue), 및 폴리우레탄계 접착제 등이 있다.
그러나， 합성 고분자를 이용한 생체접착제의 경우， 생체 내의 수용액이 있는 상태에서 매우 약한 접착력을 보이며, 시아노아크릴레이트 계열
생체접착제의 경우, 인체에 면역 반웅 등의 부작용을 일으키는 것이 큰 한계로 지적되고 있다.
또한, 현재 실제 환자에게 사용되고 있는 피브린 계열의 생체접착제의 경우, 인체에 면역 반웅 등의 부작용은 적지만, 그 접착 능력이 매우 낮은 수준이기 때문에 사용에 한계가 있으며， 가격 또한 비싸다.
또한, 젤라틴 생체접착제의 경우 가교제로 사용되는 포르말린 (formalin)이나 글루타알데하이드 (glutaraldehyde)가 생체 내의 단백질과도 가교 반응을 일으켜 조직 독성을 일으키는 문제가 있으며, 폴리우레탄계 생체접착제의 경우에는, 합성원료인 방향족 디아이소시아네이트 (diisocyanate)가 생체 독성이 있다는 문제가 있다.
따라서， 이러한 문제점을 극복하기 위해서 수분을 함유하는 생체조직 표면에서 강력한 접착능력 및 가교능력을 가지고, 생체 내에서 최소한의 부작용을 보일 수 있는 이상적인 형태의 생체재료의 개발이 필요하다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명의 목적은 키틴 나노섬유 또는 키토산 나노섬유의 표면에 공유 결합된 디히드록시페닐 (dihydroxyphenyl) 잔기， 트리히드록시페닐
(trihydroxypheny)잔기， 또는 탄닌산을 함유하는 표면 처리된 나노섬유를 포함하는 생체접착성 하이드로젤을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 생체접착성 하이드로젤을 포함하는 생체접착용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 생체접착성 하이드로젤을 포함하는 조직공학용 지지체를 제공하는 것이다
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 생체접착성 하이드로젤을 포함하는 약물전달용 담체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 생체접착성 하이드로젤의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 키틴 나노섬유 또는 키토산 나노섬유로 하이드로젤을 제조하는 단계; 및 상기 하이드로젤에 포함된 나노섬유의 표면에 하기 화학식 1의 표면 처리물질을 처리하여 나노섬유의 표면 처리를 수행하는 단계를 포함하는 생체접착성 하이드로젤 제조방법을 제공하는 것이다. 【기술적 해결방법】
상기 과제를 해결하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 키틴 나노섬유 또는 키토산 나노섬유의 표면에 공유 결합된 디히드록시페닐 (dihydroxyphenyl) 잔기 , 트리히드록시페닐 (trihydroxypheny)잔기，또는 탄닌산 (tannic acid)을 함유하는, 표면 처리된 나노섬유를 포함하는 하이드로젤에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 상기 표면 처리된 나노섬유를 포함하는 하이드로젤의 제조방법에 관한 것이다.
【유리한 효과】
본 발명의 표면 처리된 나노섬유를 포함하는 하이드로젤은 우수한 생체접착력을 가지며， 생체에 대한 부작용이 최소화된 생체접착용 조성물 및 이의 제조 방법을 제공하고자 한다. 따라서, 상기 생체접착성 하이드로젤은 생제접착제, 조직공학용 지지체, 또는 약물 전달용 담체 등으로 폭넓게 웅용될 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 la는 본 발명에서 제조한 키틴 나노섬유를 함유하는 하이드로젤의
TEM 이미지이다.
도 lb는 본 발명에서 제조한 키틴 나노섬유를 함유하는 하이드로젤의 XRD 이미지이다.
도 2a는 본 발명에 따른 갈산으로 표면 처리된 키틴 나노섬유의 합성 방법에 따른 구조식이다.
도 2b는 본 발명에 따른 키틴 나노섬유를 함유하는 하이드로젤과
갈산으로 표면 처리된 키탄 나노섬유를 함유하는 하이드로젤의 FT-IR 작용기 측정 결과를 보여주는 그래프이다. '
도 2c는 멍게 살 (flesh)에 Arnow assay 시약 처리로 인한 발색현상을 보여주는 이미지이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 Fe3+ 및 갈산으로 표면 처리된 키틴 나노섬유 하이드로젤을 함유하는 접착 조성물과, NaI04 및 갈산으로 표면 처리된 키틴 나노섬유 하이드로젤를 함유하는 접착 조성물의 알루미늄 막대에 대한 접착강도 시험결과를 나타내는 그래프이다.
도 4a는 갈산으로 표면 처리된 키틴 나노섬유 하이드로젤에 산화제 또는
Fe3+ 첨가 시 TOPA와 일어나는 결합 기작을 나타내는 그림이다.
도 4b는 갈산으로 표면 처리된 키틴 나노섬유 하이드로젤에 Fe3+ 첨가 시 TOPA와 실질적으로 일어나는 결합반웅올 라만분광기 (Raman Spectrometer)를 활용해서 증명한 그래프이다. . ,
도 5는 갈산으로 표면 처리된 키틴 나노섬유를 포함하는 하이드로젤의 쥐 조골세포 (MC-3T3 el) 에 대한 세포 독성을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다. 도 6는 멍게 표면의 모습을 개략적으로 설명하는 그림이다.
도 7은 갈산으로 표면 처리된 키틴 나노섬유를 포함하는 하이드로젤을 개략적으로 설명하는 그림이다.
도 8은 갈산을 함유하고 있는 키토산 하이드로젤에 갈산이 첨가 되었는지 여부를 1H-NMR 분석결과를 나타낸다.
도 9는 본 발명에 따른 두 가지 하이드로젤의 접착력을 보여준 사진이다. 도 10은 본 발명의 일예에 따라 제조된 키토산 하이드로젤에 산화제를 처리하여 접착력을 증가시키는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 1 1은 본 발명의 일예에 따라 제조된 하이드록시아파타이트 /접착제 복합체를 물속에 넣고 흔들어 접착력을 시험하는 사진이다.
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
본 발명에 따른 표면 처리된 나노섬유를 함유하는 하이드로젤은 멍게 (Sea squirt)의 상처 치료 메커니즘과 유사하다. 도 6는 멍게 표면의 모습을 개략적으로 설명하는 그림이다. 멍게은 튜닉 (tunic)이라고 불리는 갑옷으로 둘러싸여 있으며 , 상기 튜닉은 주로 투니신 (tunicin), 셀롤로즈 나노섬유 (cellulose nanofibrils(l 40 GPa, 26 nm X 2.2 mm)) 및 단백질 마이크로 섬유로 코팅된 TOPA (3,4,5- trihydroxyphenylalanine, 피로갈롤 아미노산)로 구성되어 있다. 멍게가 표면에 상처를 입으면, 다음과 같은 두 가지 반웅이 일어나 상처를 치유한다. 먼저, 바다의 (pH ~8.2)염기 조건에 노출되어 피로갈를 (TOPA의 잔기)이 산화적으로 투니신 또는 피로갈롤와 결합하며， 피로갈를 그룹은 멍게 피 (血)에 많이
존재하는 바나듐 (vanadium)과 배위 결합한다. 튜닉이 다시 생성되는 과정 동안, 공유 및 비공유 결합상호작용이 견고하게 형성하고 탄력 있는 보호벽이 형성되어, 상처 난 조직의 가장자리를 붙이고 과도한 출혈을 조절한다. 탄닌산은 앙금, 탄닌이라고도 하며, 나무의 껍질, 땅속 줄기, 과실 등 식물계에 넓게 존재하고, 다가 페놀을 포함하며 유피성의 복잡한 조성을 가진 식물 성분이다. 식물계에는 농도의 차이는 있으나 널리 분포하며 물관부， 수피, 잎， 과실, 뿌리 등에 들어 있다. 유혁작용의 주체는 다가 페놀로서 단백질, 특히 콜라겐과 결합하여 동물의 생피를 안정된 가죽으로 변성하게 한다. 알칼로이드와 침전반웅을 하고 3가의 철이온과 결합하여 녹색 또는 흑자색의 착화합물을 형성한다. 가수분해형 타닌 (I)과 축합형 타닌 (II)으로 대별한다. 타닌 (I)은 당， 퀴닌산 등의 수산기와 몰식자산, 엘라그산이 개환한 핵사히드록시디페닌산 등의 맵시드형의 에스테르이다. 산, 알칼리, 탄나아제에 의해 가수분해되어 갈산 (gallic acid), 엘라그산 (ellagie acid) 등을 생성한다. 오배자타닌 (붉나무의 벌레혹)， Terminalia chebula의 과실 등은 함량이 많아 가죽을 다루는 데 이용한다. 타닌 (II)는 플라반의 유도체인 카테킨류, 류코안토시안, 프로안토시안 외에스틸벤류 등이 있다. 그러나 축합형이라도 배당체 또는 몰식자산의 에스테르 등 가수분해형의 성질을 가진 것도 있지만, 이들을 산과 가열하면 중합하여 플로바펜 (phloba-phene)이라는 적색 부정형 침전을 만든다. 수렴성 맛 (떫은 맛)이 있으며 녹차에는 카테킨류와 이것의 3번째 위치에서 갈산과 형성된 에스테르， 날감의 떫은 즙에는 류코안토시안이 들어 있다. 갈산, 엘라그산류는 시킴산 경로 (shikimic acid pathway)에서, 플라반류의 골격은 시킴산과 아세트산-말론산 경로의 복합형으로 생합성된다. 식물체에서 타닌의 생리기능에 대해서는 명확하지는 않지만 단백질과 강하게 결합하는 점으로 보면 병층해에 대한 방어작용을 생각할 수 있다.
탄닌산은 천연 폴리 페놀의 일종으로 하기 화학식의 구조를 가질 수 있다. 그러나, 탄닌산의 분자 구조가 이에 한정되는 것은 아니며, 다양한 작용기를 갖는 다양한 중합체의 형태로 존재할 수 있다.
탄닌산은 하기 화학식에서 알 수 있듯, 분자 내에 많은 하이드록실 그룹을 가지고 있기 때문에 다당류, 단백질, 알칼로이드 등의 거대 분자와 쉽게 결합될 수 있는 특성을 가지고 있다. 특히, 분자 내에 존재할 수 있는 3개 이상의 갈로일 그룹 (galloyl group)은 철 (III) 이온 배위결합하여 팔면체 구조의 안정한 착화합물을 형성할 수 있다ᅳ 또한， 각각의 갈로일 그룹이 서로 다른 철 (ΙΠ) 이은을 중심 금속으로 하여 , 가교 결합 (cross link)을 형성할 수 있다. 탄닌산의 구조는 하기와 같다.
Figure imgf000007_0001
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일례에 따른 생체접착성 하이드로젤은 표면 처리된 나노섬유를 포함하며 , 구체적으로 키틴 나노섬유 또는 키토산 나노섬유의 표면에 공유 결합된 디히드록시페닐 (dihydroxyphenyl) 잔기, 트리히드록시페닐 (trihydroxypheny)잔기 , 또는 탄닌산 (tannic acid)을 함유하는， 표면 처리된 나노섬유를 포함한다.
상기 하드드로젤은， 투니신의 유사 섬유구조인 키토산 나노섬유, 키틴 나노섬유 또는 키토산에, 탄닌산 또는 하기 화학식 1의 표면 처리물질을 반웅시켜 나노섬유의 표면에 공유결합으로 결합하여 제조된다.
[화학식 1]
Figure imgf000007_0002
상기 화학식 1에서，
R1은 수소원자 또는 -OH 이고,
R2는 -H, -COOH, -CHO, -NH2, -SH, 탄소수 1 내지 10의 직쇄상 또는 분지상 알킬기, 또는 탄소수 3 내지 10의 환상 알킬기의 1이상의 수소원자가 수소원자, - COOH, -CHO, -NH2, 또는 -SH로 치환된 알킬기이다.
또한， 상기 화학식 1을 갖는 화합물은 카테콜 (catechol), 도파 (3,4- dihydroxyphenylalanine, DOPA), 토파 (3,4,5- trihydroxyphenylalanine, TOPA),
피로갈를 (pyrogallol), 및 갈산 (gallic acid)으로 이루어지는 군에서 선택된 것일 수 있으며, 바람직하게는 갈산과 피로갈롤일 수 있다.
상기 표면 처리 결합방법으로 공유결합올 형성할 수 있는 방법을 이용할 수 있으며， 실시예에서는 상기 나노섬유의 아민기 (-NH2)와 갈산 (gallic acid)의 카르복시기 (-COOH)가 펩타이드화 (-CONH-) 되는 반웅을 이용하였으나 (도 2a), 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 반응의 기초 물질로 사용된, 키틴， 키토산, 타닌 및 갈산은
음식물로부터 추출할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 화학식 1을 갖는 화합물은 키틴 나노섬유， 키토산 나노섬유, 또는 이들의 흔합물의 loo중량0 /。 기준으로 0.1 내지 30 중량 %, ι 내지 10 중량0 /0，1 내지 30 중량0 /0, 10 내지 30 중량0 /0, 또는 10 내지 20 중량 % 일 수 있다.
본 발명에서 용어, "하이드로젤 (hydrogel)" 이란, 하이드로졸이 넁각으로 인하여 유동성을 상실하거나, 3차원 망목 구조와 미결정 구조를 갖는 친수성 고분자가 물을 함유하여 팽창하여 형성된다. 많은 양의 물이 고분자 물질의 격자 내에 채워져 팽윤되어 삼차원적인 구조를 유지하며, 액체지만 고체와 같은 형태를 띠는 재료를 의미한다.
하이드로젤은 전체 중량의 적어도 20% 이상의 수분을 흡수할 수 있으며， 하이드로젤이 용액 상에서 팽윤된 후에는 열역학적으로 안정하게 존재하여, 액체와 고체의 중간 형태에 해당하는 기계적 및 물리화학적 특성을 지니게 된다. 하이드로젤은 실제 조직과 비슷한 기계적 유연함을 가지고 있고， 물을 많이 함유하되, 물에 의해 젤의 결합이 끊어지지 않기 때문에, 수분을 포함하는 젖은 생체 표면과의 접착을 필요로 하고 외부 수분에도 저항성을 가지고 있어야 하는 의료용 접착제 등으로의 응용이 활발하게 이루어지고 있다.
따라서 , 본 발명에 따른 우수한 조직접착성을 갖는 하이드로젤은
조직접착제, 지혈제， 조직공학용 지지체, 약물 전달 담체,조직층진제, 상처 치료제 또는 유착방지제 등의 다양한 생의학적 웅용이 가능하다. 본 발명의 일구현예는 의료목적의 접착제로 사용할 수 있는 표면이 개질된 나노섬유 하이드로젤을 제공한다.
본 발명에 따른 하이드로젤은 상대습도 50%에서의 접착강도가 5 내지 100 Mpa, 5 내지 80 Mpa, 20 내지 100 Mpa, 20 내지 80 Mpa, 50 내지 80 Mpa, 50 내지 60 Mpa, 또는 55 내지 60 Mpa 일 수 있다. 또한, 상기 하이드로젤은 상대 습도
100%에서의 접착강도가 0.05 Mpa 내지 lO MPa, 0.1 내지 10 Mpa, 1 내지 10 Mpa, 5 내지 10 Mpa, 또는 0.05 내지 5 Mpa 일 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 표면 처리된 나노섬유를 함유하는 하이드로젤을 포함하는 생체접착제 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 생체접착제 조성물은 현재 시중에서 주로 이용되고 있는ᅵ 시아노아크릴계 접착제 또는 피브린계 접착제 등을 대체하여, 피부, 혈관, 소화기, 뇌신경, 성형외과, 정형외과 등의 여러 영역에서 사용할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 생체적합성 생체조직접착제는 외과 수술용 봉합사를 대체 할 수 있고， 불필요한 혈관을 폐색 (blocking)하는데 사용될 수 있으며, 안면조직, 연골 등의 연조직 또는 뼈， 치아 등의 경조직의 지혈 및 봉합에 이용될 수 있고, 가정 상비약으로 적용하는 것이 가능하다.
본 발명의 생체적합성 생체접착제 조성물의 다양한 응용 분야를 정리하면 다음과 같다:
일 구현예로, 본 발명의 생체접착제는 생체의 내부 및 외부 표면에 적용될 수 있으며, 즉 본 발명의 생체접착제는 피부와 같은 생체의 외부표면 또는 외과수술 과정에서 노출되는 내부기관의 표면 등에 국소적으로 적용될 수 있다. 또한, 본 발명의 생체접착제는 조직의 손상된 부분을 접착시키거나 조직에서 공기 또는 유체가 누출되는 것을 봉합하거나, 의료기구를 조직에 접착시키거나， 또는 조직의 결함부분을 채우는데 이용될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "생체 조직"은 특별하게 제한되지 않으며, 예를 들어 피부, 뼈, 신경, 액손, 연골, 혈관, 각막， 근육, 근막, 뇌, 전립선, 유방, 자궁내막, 폐, 비장， 소장, 간， 정소, 난소, 경부, 직장, 위， 림프절, 골수， 및 신장 등을 포함하며, 이에 제한되지 않는다.
일 구현예로, 본 발명의 생체접착제는 연골 등의 연조직 또는 뼈, 치아 등의 경조직의 지혈 및 봉합에 이용될 수 있을 뿐만 아니라， 뼈성분의 전구쎄에도 적용할 수 있으며， 상기 전구체 성분으로는 하이드록시아파타이트 및 옥타칼슐포스페이트로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며 이에 한정되는 것은 아니다.
다른 구현예로, 본 발명의 생체접착제는 상처치유 (wound healing)에 이용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 생체적합성 생체접착제는 상처에 적용되는 드레싱 (dressing)으로 이용될 수 있다.
다른 구현예로, 본 발명의 생체접착제는 피부 봉합에 이용될 수 있다. 즉, 본 발명의 생체접착제는 국소적으로 적용되어 상처를 봉합하는 데 이용되어, 봉합사를 대체 할 수 있다. 또한, 본 발명의 생체접착제는 탈장 복원에도 적용될 수 있으며, 예를 들어 탈장복원에 이용되는 메쉬 (mesh)의 표면 코팅에 이용될 수 있다.
다른 구현예로, 본 발명의 생체접착제는 혈관과 같은 관 구조의 봉합 및 누출을 방지하는 데에도 이용될 수 있다. 또한， 본 발명의 생체접착제는 지혈에도 이용될 수 있다.
다른 구현예로, 본 발명의 생체접착제는 수술 후의 유착방지제로 이용될 수 있다. 유착이란 모든 수술 부위에서 발생하는 것으로 수술 부위의 주변에서 다른 조직들이 상처 주위에 달라붙는 현상이다. 유착은 수술 후 97% 정도 발생을 하며, 특히 그 중에서 5내지 7%가 심각한 문제를 야기한다. 이러한 유착을 방지하기 위해서 수술 시 상처를 최소화 한다거나 소염제를 사용하기도 한다. 또한 섬유소의 형성을 방지하기 위하여 TP A(tissue plasminogen activator)를 활성화 하거나, 결정성 용액, 고분자 용액, 고체 막 등의.물리적 장벽을 사용하고 있지만 이러한 방법들은 생체 내에서 독성을 나타낼 수 있으며 다른 부작용을 나타낼 수 있다. '
본 발명의 생체접착제는 수술 후에 노출된 조직에 적용되어 그 조직과 주위의 조직 사이에 발생되는 유착을 방지하는 데 이용될 수 있다.
또 하나의,양태로서, 본 발명은 상가하이드로젤을 포함하는 조직공학용 지지체에 관한 것이다.
조직공학 (Tissue engineering) 기술이란, 환자의 조직으로부터 분리된 세포를 지지체에 배양하여 세포-지지체 복합체를 제조한 후， 제조된 세포-지지체 복합체를 다시 생체 내에 이식하는 것을 말하며, 조직공학 기술은 인공피부， 인공뼈, 인공연골, 인공각막, 인공혈관, 인공근육 등 생체의 거의 모든 장기의 재생에 적용되고 있다.
본 발명의 생체접착성 하이드로젤은 조직공학 기술에서 생체조직 및 장기의 재생을 최적화하기 위하여 생체조직과 유사한 지지체 (scaffold)를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 지지체를 이용하여 간편하게 인공 세포외
기질 (extracellular matrix)을 구현할 수 있으며, 화장품, 상처 피복재, 치과용 매트릭스 등의 의료용 소재로도 활용될 수 있다.
본 발명의 하이드로젤에는 생체의 세포나 조직과 상호작용을 통하여 세포의 성장 및 /또는 분화를 촉진시키고, 아을러 조직의 재생과 회복을 도와주는 작용에 관여하는 각종 생리활성물질들이 쉽게 부착될 수 있다ᅳ
특히, 상기 하이드로젤에 있는 아민 작용기가, 다른 생리활성물질의 생접합을 위한 작용기로 사용되어 생리활성물질이 손쉽게 생접합 될 수 있다. 본 발명에서 용어, "생접합 (bioconjugation)"이란, 두 개 이상의
생분자 (biomolecule)를 결합시키는 것을 의미한다.
또한, 상기 생리활성물질은 천연 세포외 기질과 유사하게 유사한 구조의 인공 세포외 기질을 구현하기 위하여 포함될 수 있는 각종
생체분자 (biomolecule)들을 총칭하기도 한다. 상기 생리활성물질은 세포, 단백질, 핵산, 당， 효소 등올 포함할 수 있으며, 일 예로 세포, 단백질, 폴리펩타이드， 다당류, 단당류, 을리고당류, 지방산, 핵산 등을 들 수 있으며, 대표적으로 세포를 들 수 있다.
상기 세포는, 원핵세포 및 진핵세포를 포함한 모든 세포일 수 있고, 일 예로 조골세포 (osteoblast), 섬유세포 (fibroblast), 간세포 (hepatocyte), 신경세포 (neurons) 암세포 (cancer cell), B세포 (B cell), 백혈구세포 (white blood cell) 등을 포함한， 면역세포 (immunocyte) 및 배아세포 (embryonic cell) 등일 수 있다,
이 외에도， 생리활성물질은 핵산 물질로서 플라스미드 핵산, 당 물질로서 히아루론산, 헤파린 황산염, 콘드로이틴 황산염, 알진염, 단백질 물질로서 호르몬 단백질을 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 하이드로젤을 포함하는 약물 전달용 담체에 관한 것이다.
본 발명에 따른 생체 주입형 조직접착성 하이드로젤은 약물 전달용 유효 골격 (scaffold)으로서의 인공 세포외 기질로 사용될 수 있다. 상기 약물은 특별하게 제한되지 않으며 , 화학물질, 소분자, 펩타이드, 단백질 의약품, 핵산, 바이러스, 항균제, 항암제, 항염증제, 또는 이들의 흔합물 등을 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 소분자는, 조영게 (예컨대 , ΤΙ 조영제, 초상자성 물질과 같은 Τ2 조영제, 방사성 동위 원소 등), 형광 마커, 또는 염색 물질 등이 될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 펩타이드 또는 단백질 의약품은, 호르몬， 호르몬 유사체, 효소, 효소저해제， 신호전달단백질 또는 그 일부분, 항체 또는 그 일부분, 단쇄 항체, 결합단백질 또는 그 결합 도메인, 항원, 부착단백질, 구조단백질， 조절단백질, 독소단백질, 사이토카인 (cytokine), 전사조절 인자, 혈액 응고 인자, 또는 백신 등을 포함할 수 있으며， 이에 한정되지 않는다. 보다 구체적으로는, 섬유아세포
성장인자 (fibroblast growth factor ;FGF), 혈관내피세포 성장인자 (vascular endothelial growth factor; VEGF), 전환 성장인자 (transforming growth factor; TGF), 골형성
성장인자 (bone morphogenetic protein; BMP), 인간성장호르몬 (hGH),
돼지성장호르몬 (pGH), 백혈구 성장인자 (G-CSF), 적혈구성장인자 (EPO),
대식세포성장인자 (M-CSF), 종양 괴사 인자 (TNF), 상피세포 성장인자 (EGF), 혈소판유도성장인자 (PDGF), 인터페론류, 인터루킨류, 칼시토닌,
신경성장인자 (NGF), 성장호르몬 방출인자 (growth hormone releasing factor),
엔지오텐신 (angiotensin), 황체형성 호르몬 방출 호르몬 (LHRH), 황체 형성 호르몬 방출 호르몬 작동약 (LHRH agonist), 인슐린, 갑상선 자극 호르몬 방출 호르몬 (TRH), 엔지오스타틴 (angiostatin), 엔도스타틴 (endostatin), 소마토스타틴 (somatostatin), 글루카곤, 엔도르핀, 바시트라신 (bacitracin), 머게인, 콜리스틴 (colistin), 단일 항체, 백신류 또는 이들의 흔합물을 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 핵산은, RNA, DNA 또는 cDNA가 될 수 있으며， 핵산의 서열은 암호화 부위 서열 또는 비암호화 부위 서열 (예를 들어, 안티센스
올리고뉴클레오티드 (anti-sense oligonucleotide) 또는 siRNA)이 될 수 있다.
상기 바이러스는， 바이러스 전체 또는 바이러스의 핵산을 포함하는 바이러스 중심부 (core), 즉, 바이러스의 외피 (envelope)없이 패키지 된 바이러스의 핵산이 될 수 있다. 운반될 수 있는 바이러스 및 바이러스 중심부의 예로는 파필로마 바이러스 (Papillomvirus), 아데노 바이러스 (Adenovirus),
배클로바이러스 (baculovirus), 레트로 바이러스 중심부 (retrovirus core), 및 세밀키 바이러스 중심부 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 항균제는, 미노싸이클린， 테트라싸이클린, 오플톡사신， 포스포마이신， 머게인, 프로플록사신, 암피실린， 페니실린, 독시싸이클린, 티에나마이신,
세팔로스포린, 노르카디신, 겐타마이신, 네오마이신, 가나마이신， 과로모마이신, 미크로노마이신， 아미카신, 토브라마이신， 디베카신, 세포탁신, 세파클러,
에리스로마이신, 싸이프로플톡사신， 레보플톡사신， 엔옥사신, 반코마이신, 이미페넴 후시딕산, 또는 이들의 흔합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 항암제는, 파클리탁셀, 텍소티어， 아드리아마이신, 엔도스타틴， 앤지오스타틴, 미토마이신, 블레오마이신， 시스플레틴, 카보플레틴， 독소루비신, 다우노루비신， 이다루비신, 5-플로로우라실, 메토트렉세이트, 엑티노마이신 -D, 또는 이들의 흔합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 항염증제는, 아세트아미노펜, 아스피린, 이부프로펜， 디크로페낙, 인도메타신, 피록시캄， 페노프로펜, 플루비프로펜， 케토프로펜, 나프톡센, 수프로펜, 톡소프로펜, 시녹시캄, 테녹시캄, 또는 이들의 흔합물일 수 있으나， 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 키틴 나노섬유 또는 키토산 나노섬유의 표면에 공유 결합된 디히드톡시페닐 (dihydroxyphenyl) 잔기, 트리히드록시페닐 (trihydroxypheny)잔기, 또는 탄닌산을 포함하는 표면 처리된 나노섬유를 포함하는, 생체접착성
하이드로젤을 제공한다.
본 발명의 하나의 양태로서, 상기 하이드로젤은, 나노섬유에 포함된 디히드록시페닐, 트리히드톡시페닐 잔기, 또는 탄닌산과， 산화제 또는 금속 이온간의 결합으로 형성된 하이드로젤일 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명의 생체접착성 하이드로젤을 제조하는 방법은, 키틴 나노섬유 또는 키토산 나노섬유로 하이드로젤을 제조하는 단계; 및 상기 하이드로젤에 포함된 나노섬유의 표면에 탄닌산 또는 하기 화학식 1의 표면 처리물질을 처리하여 나노섬유의 표면 처리를 수행하는 단계;
를 포함하는 생체접착성 하이드로젤 제조방법이다. [화학식 1]
Figure imgf000014_0001
상기 화학식 1에서,
R1은 수소원자 또는 히드록시기이고，
R2는 수소원자， -COOH, -CHO, -N¾, -SH, 또는 탄소수 1 내지 10의 직쇄상, 분지상， 또는 환상 알킬기의 1이상의 수소원자가 수소, -COOH, -CHO, -NH2, 또는 - SH로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 그룹으로 치환된 알킬기이다.
상기 하이드로젤을 제조하는 단계는 나노섬유에 금속 이온 또는 산화제를 첨가하여 수행하는 것인 생체접착성 하이드로젤 제조방법일 수 있다.
상기 금속 이온은 Ca2+, Fe2+, Fe3+, V4+, V3+, V2+ 등 일수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 산화제는 쇼듐 페리오데이트 (Sodium periodate), 테트라부틸암모늄 페리오데이트 (tetrabutylammonium periodate), 또는 과산화수소 (hydrogen peroxide) 등 일수 있으며， 이제 한정되는 것은 아니다.
또한， 상기 금속이온 또는 산화제의 첨가량은 상기 나노섬유에 포함된 디히드록시페닐 잔기, 트리히드록시페닐 잔기， 또는 탄닌산 1몰 기준으로 으05 내지 5몰, 0.15 내지 5몰 , 0.15 내지 15몰 , 0.5 내지 5몰, 5 내지 15몰, ().5 내지 1.5몰, 또는 0.15 내지 1.5몰 일 수 있다.
상기 금속을 첨가하는 단계는 상기 나노섬유에 포함된 디히드록시페닐 잔기， 트리히드록시페닐 잔기， 또는 탄닌산과 금속 이온을 배위 결합시키는 단계이다.
하나의 구체적 양태로서， 본 발명은 상기 나노섬유에 포함된
디히드록시페닐 잔기， 트리히드록시페닐 잔기， 또는 탄닌산과 Fe3+ 이온을 반응시키는 단계를 포함하는, 생체접착성 하이드로젤의 제조방법을 제공한다. 키토산은 키틴에서 아세트아미드 그룹이 제거된, 즉 탈아세틸화가
50%이상 된 형태로 해당 키토산은 85-95%의 탈아세틸화된 키토산을 사용할 수 있다. 제조방법의 경우에도 키틴 나노섬유의 경우, 나노섬유가 포함된 하이드로젤 상태에서 수행하고, 키토산의 경우, 물에 녹기 때문에 물에 녹여진 용액상태에서 수행할 수 있다.
또한， 상기 산화제를 첨가하는 단계는 상기 나노섬유에 포함된
디히드록시페닐 잔기, 트리히드록시페닐 잔기， 또는 탄닌산이 산화제에 의해 산화되어 디히드록시페닐 잔기 , 트리히드록시페닐 잔기 , 또는 탄닌산 사이에 공유결합을 형성시키는 단계이다.
본 발명의 또 하나의 양태로서, 상기 하이드로젤을 제조하 단계를 수행하기 전에, 상기 나노섬유에 탈아세틸화 처리하는 단계를 추가로수행하는 것일 수 있다.
【발명의 실시를 위한 형태】
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 예시하고 하기에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나， 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로
이해되어야 한다.
하기 실시예에 사용된 물질은 키틴, CaCl2.2H20 (calcium chloride dehydrate), 및 갈산은 Sigma-Aldrich (US)에서 구매하였고, EDC (l-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl carbodiimide) 및 NHS (N-hydroxysuccinimide)는 Thermo scientific에서 구매하였다 . 실시예 1. 키틴 나노섬유의 하이드로젤 제조
1-1: 키틴 나노섬유를 함유하는 하이드로젤의 제조
키틴 나노섬유기반 하이드로젤 제조를 위해서 H. Tamura et al 방법 (Tamum, Η·, Nagahama, H. & Tokura, S. Preparation of chitin hydrogel under mild conditions.
Cellulose 13, 357-364 (2006))을 사용하였다.
먼저 CaCl2.H20 850g을 1L 의 메탄올에 녹여주었고, 키틴 20g을 첨가한 후, 150°C에서 6 시간 동안 섞어주었다. 그 이후， 키틴 나노섬유 하이드로젤을 침전시키기 위해서， 키틴 나노섬유를 함유하는 메탄을 용액 1L에 증류수 20L를 넣어주었다. 그리고 칼슘이온을 물을 기반으로 한 투석 (MWCO = 1,000)을 통해 제거하였다.
하이드로젤에 포함되어있는 키틴 나노섬유의 표면을
탈아세틸화 (deacetylation) 해주기 위해서 '머서화 (mercerization)'를 수행되었다. 구체적으로 키틴 나노섬유 하이드로젤을， 6시간 동안 NaOH (20 wt%) 에서 환류 (reflux)시켜 표면을 탈아세틸화하고, 상기 표면이 탈아세틸화된 키틴 나노섬유는 10,000 rpm으로, 4 °C에서 30분동안 원심분리를 통해 침전시켜 수득한 후, 여러 번 물로 세척해주었다.
상기 수득한 키틴 나노섬유를 함유하는 하이드로젤을 , TEM(transmission electron microscope) 및 XRD(X-Ray Diffraction)로 분석하였으며 , 그 결과를 도 la 및 도 lb에 나타냈다.
건조된 키틴 나노섬유를 함유하는 하이드로젤의 형태는 고해상도 주사형 전자 현미경 (high-resolution scanning electron microscope) JEOL JSM-7401F (SEM, Japan)을 통해 연구하였다.
도 la에 나타낸 바와 같이, 상기 제조된 키틴 나노섬유 하이드로젤에 나노섬유가 있는 것은 TEM을 활용해서 확인할 수가 있었으며, 도 lb에 나타낸 바와 같이， 나노섬유가 키틴 나노섬유와 동일한지 여부는 XRD 분석법을 통해서 확인할 수 있었다.
The XRD 실험은 40 kV/100 mA Ni-filtered Cu K a radiation의 조건에서,
D/MAX-2500/PC (Rigaku, Japan)를 이용해 수행하였으며, XRD 패턴들은 5° 내지 40。산란각의 영역에서 4°/min의 스캐닝 속도로 기록되었다.
1-2: 갈산으로표면 처리된 키틴 나노섬유를함유하는하이드로젤 제조 갈산으로 표면 처리된 키틴 나노섬유 기반의 하이드로젤 제조를 위해서 다음의 논문들을 참조하였다. (Pasanphan, W., Buettner, G. R. & Chirachanchai, S. Chitosan conjugated with deoxycholic acid and gallic acid: A novel biopolymer-based additive antioxidant for polyethylene. Journal of Applied Polymer Science 109, 38-46 (2008);Yu, S. H. et al. Preparation and characterization of radical and pH-responsive chitosan-gallic acid conjugate drug carriers. Carbohydrate Polymers 84, 794-802 (201 l);Pasanphan, W. & Chirachanchai, S. Conjugation of gallic acid onto chitosan: An approach for green and water-based antioxidant. Carbohydrate Polymers 72, 169-177,(2008).) 상기 실시예 1-1에서 제조한 키틴 나노섬유 하이드로젤 10g을 PBS 버퍼 50 ml에 첨가하였다. 키틴 단량체 (acetyl-glucosamine)에 대하여 2당량의 갈산과, 갈산에 대하여 U당량의 EDC를, 메탄을 20 ml에 용해시켰다. EDC가 완전히 용해된 15분 후， NHS (EDC의 1당량)를 메탄올 용액에 첨가하였다. NHS 첨가 30분 후, 키틴 하이드로젤을 포함하고 있는 버퍼와 갈산 /EDC/NHS을 포함하고 있는 용액을 흔합하고, 흔합물을 12시간동안 유지하였다. 상기 과정은 아이스 배스 (ice bath)내에서 수행하였으며, 하이드로젤 합성물 안의 EDC와 NHS는 대규모 회석， 원심분리법 (centriftagation), 디캔테이션 (decantation), 및 물 가반의 투석웁 이용하여 제거되었다.
상기 갈산으로 표면 처리된 키틴 나노섬유를 함유하는 하이드로젤 속에 존재하는 갈산 -키틴 콘쥬게이션을 FT-IR(Fourier transform infrared spectroscopy)으로 분석하였으며, 그 결과를 도 2b에 나타냈다.
도 2b에 나타낸 바와 같이, 상기 제조된 갈산으로 표면 처리된 키틴 나노섬유를 함유한 하이드로젤에 갈산이 첨가 되었는지 여부를 FT-IR을 활용해서 확인할 수 있었다.
FT-IR 분석은 4 cm 분해능을 가지며， 1000 내지 4000 cm 1 범위를 가진, 싱글범 (single-beam) MIDAC M 1200 (Midiac corporation, MA, USA)를 이용하여 수행하였다.
도 6b는 갈산으로 표면 처리된 키틴 나노섬유를 포함하는 하이드로젤을 개략적으로 설명하는 그림이다.
실시예 2: 비색분석법을통한 갈산 결합의 확인
접착제에 있는 갈산의 함량을 정량 하기 위해, 수정된 Amow 어세이를, 아미노산 및 폴리페놀 추출물 분석에 널리 쓰이는 키틴 가수분해 방법과 함께 수행하였다. 5 mg, 10 mg, 및 15 mg 의 갈산과 25 mg 의 건조된 접착제를, 각각 6 M HC1 500 와 폐놀 20≠ (산화를 최소화하기 위함)를 포함하고 있는 유리 앰플 안에 진공 밀봉하고 1 KTC로 가열하였다. 24 시간 후， 각각의 유리 앰플 안에 용액을 10배 희석시켰다. 1.45 M sodium nitrite/0.4 M sodium molybdate 용액 500 ^를 각각의 희석된 용액 500 ^에 첨가하여 색깔의 변화를 관찰하였고, lM NaOH l ml를 각각의 회석된 용액에 첨가하여 색깔의 변화를 관찰하였다.
상기 각각의 희석된 용액의 색깔 변화를 결과를 도 2c에 나타냈다.
도 2c에 나타난 바와 같이 , 1.45 M sodium nitrite/0.4 M sodium molybdate 용액 를 첨가한 경우 어두운 노란색으로 변하였고, lM NaOH lml를 첨가한 경우 검붉은색으로 변하는 것을 확인할 수 있었다. 실시예 3: 접착조성물의 제조
갈산 (피로갈를산)으로 표면 처리된 키틴 나노섬유가 생체 조직과 유사한 표면에서의 접착력을 알아보기 위하여 여러 접착실험을 수행하였다. 상기 실시예
1에서 제조한 갈산이 결합된 키틴 나노섬유를 함유하는 하이드로젤에서, 수중에서 접착력을 유지하기 위해서 경화 과정이 필요한 데， 피로갈를에 의한 서로 다른 경화 방법, 즉 금속이온과의 배위결합에 의한 경화 방법과 잔기간 공유결합에 의한 경화방법을 통해 두 종류의 접착 조성물을 만들었다.
첫 번째로 배위결합 방법으로, 실시예 1에서 제조된 피로갈를이 결합된 키틴 나노섬유에 피로갈롤: Fe3+의 몰비가 3: 1이 되도록 FeCl3를 섞어 주어
피로갈를 -Fe 배위결합에 의해 경화시켜 Fe3+ 및 갈산으로 표면 처리된 키틴 나노섬유 하이드로젤를 함유하는 접착 조성물을 제조하였다.
두 번째로 공유결합 방법으로, 실시예 1에서 제조된 피로갈롤이 결합된 키틴 나노섬유에 피로갈롤 :I(V 의 몰비가 2: 1이 되도록 산화제인 NaI04를
처리하여 공유결합을 통해 가교시켜， KV 및 갈산으로 표면 처리된 키틴 나노섬유 하이드로젤를 함유하는 두 종류의 접착 조성물를 제조하였다.
Fe3+-DOPA 하이드로젤은 Fe3+가 카테콜 (DOPA의 잔기)과 배위결합을 이루어 물속에서 강한 가역적인 결합을 가진다고 알려져 있는고 , DOPA의 잔기인 카테콜과 Fe3+의 배위결합은 라만 분광법에 의해서 분석 가능하다고 잘 알려져 있다 (Holten- Andersen, N. et al. pH-induced metal-ligand cross-links inspired by mussel yield self-healing polymer networks with near-covalent elastic moduli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108, 2651-2655 (2011)) (Kim, B. J. (2014). Mussel-Mimetic Protein-Based Adhesive Hydrogel. Biomacromolecules.)- 위 논문들을 바탕으로 피로갈를 그룹과 Fe3+간의 배위결합을 라만 분광학 실험을 통해 증명하였다. 라만 분광 실험을 수행한 결과 갈산의 피로갈롤 그룹은 Fe3+와 강하면서도 가역적인 결합을 하고 있음을 확인할 수 있었다.
그 결과를 도 4b에 나타냈다. 라만 스펙트럼은 LabRam ARAMIS (Horiba Jobin-Yvon, France)를 이용하여 다음과 같은 조건에서 얻었다. 모든 스펙트럼은 785 nm의 광을 시료에 조사하여 400 cm 1 내지 1600 cm-1 범위의 값을 데이터 값을 수집했다.
도 4b에 나타난 바와 같이, Fe 3+과 갈산으로 표면 처리된 키틴 나노섬유가 Fe3+-DOPA 복합체처럼 배위결합을 이루어, 물속에서 강한 가역적인 결합이 되어 성공적으로 착화합물이 형성됨을 확인할 수 있었다. 실시예 4: 접착조성물의 수중접착강도 (shear strength) 측정
상기 실시예 3의 두 종류의 접착 조성물의 수중 접착력을 측정하였다. 10mm X 50mm 크기를 가진 두 알루미늄 막대기 10mm X 10mm 면적의 끝부분에 조성물을 바른다. 접착 조성물이 발라져 있는 lOmm X IOmm의 두 알루미늄 막대기 끝을 서로 마주보도록 포개어 클립으로 고정시킨다. 2개의 알루미늄 막대기가 클립으로 고정시키면 1 쌍의 접착 실험 시료 샘폴이 된다. 이런 방식으로 두 개의 접착 조성물에 대해 각각 5쌍의 샘플을 준비한 후 PBS (pH 7.4) 버퍼에 2시간 동안 침지시켰다ᅳ
수중접착강도는 다음과 같은 방법으로 측정되었다. universal testing machine
(INSTRON)을 이용하여 알루미늄 막대기 양쪽올 5 mm/min 속도로 잡아당기면서 거리에 따른 힘을 측정하였다. stress는 F(force)/A(area, 면적)으로 잡아당기는 힘을 단면적 (10mm X 10mm)으로 나눈 값이며 단위는 N/m2이다. strain은 늘어난 비율을 의미하며 [(최종길이 -처음길이) /처음길이] xlOO을 의미한다. Strain-stress 그래프는 X축은 strain y축은 stress로 나태 낸다. 두 알루미늄 바 사이의 접착제가 떨어지기 전 가장 높은 stress 값을 시료의 접착강도 (shear strength)로 정의한다. 두 접착 조성물의 접착 강도 및 stress-strain 커브 그래프는 도 3에 나타내었다. 참고문헌 (Kim, B. J. (2014). Mussel-Mimetic Protein-Based Adhesive Hydro gel. Biomacromolecules) 실시예 5: 조골세포에 대한세포독성 시험 상기 실시예 3의 접착 조성물들이 세포 독성이 있는지 확인하기 위해서, 조골세포 (Mouse osteoblst MC3T3-el; Riken cell bank)에 대한 세포 생존능력 실험을 수행하였다. 실험 방법과 세포 생존 능력 (개체 수) 측정 원리는 다음과 같다. 접착 조성물인 갈산으로 표면 처리된 키틴 나노섬유 물질을 세포 배양 디쉬 (dish)에 코팅하여 실험군으로 삼았고, 아무것도 코팅되지 않는 세포 배양 디쉬를 대조군으로 삼았다. 두 종류의 세포 배양 디쉬에 미리 준비된 조골세포가 골고루 분산된 용액을 분양시켰다. 3일동안 서로 다른 세포 배양 디쉬에서 자라는 조골세포의 개체 수를 CCK-8 (cell counting kit-8)를 이용하여 모니터링 하였다. CCK-8 시약은 세포 대사 물질과 반응하여 발색하기 때문에 세포를 포함하고 있는 배지의 흡광계수를 통해 세포 개체 수를 구할 수 있다. 또한， 세포 개체 수 증가는 세포 생존능력과 비례하는 것으로 이것을 통해 세포 생존 능력을
정량적으로 말할 수 있다.
세포생존 능력 시험 결과를 도 5에 나타냈다. 빨간색원은 본 발명의 접착 조성물을 처리한 유리기판에서의 세포 생존능력을 나타낸 결과이며， 검은색원은 본 발명의 접착 조성물을 처리하지 않는 유리기판을 대조군으로 사용한 경우의 세포 생존능력을 나타낸 결과이다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 접착 조성물을 처리한
유리기판에서의 세포 생존능력이 대조군에 비해서 오히려 향상된 것으로 보아, 본 발명에서 만들어낸 갈산으로 표면 처리된 키틴 나노섬유 하이드로젤이 생체에 무해함을 보여 주었다. 실시예 6: 키토산나노섬유의 하이드로젤 제조
갈산을 함유하고 있는 키토산 하이드로젤 제조를 위해서 다음의 논문들을 참조하였다. (Pasanphan, W., Buettner, G. R. & Chirachanchai, S. Chitosan conjugated with deoxycholic acid and gallic acid: A novel biopolymer-based additive antioxidant for polyethylene. Journal of Applied Polymer Science 109, 38-46 (2008); Yu, S. H. et al.
Preparation and characterization of radical and pH-responsive chitosan-gallic acid conjugate drug carriers. Carbohydrate Polymers 84, 794-802 (201 l);Pasanphan, W. & Chirachanchai, S. Conjugation of gallic acid onto chitosan: An approach for green and water-based antioxidant. Carbohydrate Polymers 72, 169-177,(2008).)
키토산 (85-95%의 탈아세될화된 키토산) lg을 pH 2인 염산 수용액 100 ml에 녹였다 . 1M 수산화나트륨 수용액을 조금씩 떨어뜨리면서 키토산 용액의 pH를 5.5 까지 증가시켰다. 단량체 (glucosamine)에 대하여 2당량의 갈산과, 갈산에 대하여 L 1당량의 EDC를, 메탄올 20 ml에 용해시켰다. EDC가 완전히 용해된 15분 후, NHS (EDC의 1당량)를 메탄을 용액에 첨가하였다. NHS 첨가 30분 후, 키토산 용액과 갈산 /EDC/NHS을 포함하고 있는 용액을 흔합하고, 흔합물을 12시간동안 유지하였다. 상기 과정은 아이스 배스 (ice bath)내에서 수행하였으며, 하이드로젤 합성물 안의 EDC와 NHS는 대규모 희석, 원심분리법 (centrifogation),
디캔테이션 (decantation), 및 물 기반의 투석을 이용하여 제거되었다.
상기 갈산을 함유하는 키토산 하이드로젤 속에 존재하는 갈산-키토산 콘쥬게이션을 proton Nuclear magnetic resonance (1H-NMR)로 분석하였으며 , 그 결과로서 갈산을 함유하고 있는 키토산 하이드로젤 1H-NMR 데이터를 도 7에 나타냈다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 상기 제조된 갈산을 함유하고 있는 키토산 하이드로젤에 갈산이 첨가 되었는지 여부를 1H-NMR을 활용해서 확인할 수 있었다. 실시예 7: 키토산하이드로젤을 이용한 접착조성물 제조
갈산을 함유하고 있는 키토산 하이드로젤이 수중에서 접착력을 유지하기 위해서 경화 과정이 필요한 데, 피로갈롤에 의한 서로 다른 경화 방법， 즉 금속이은과의 배위결합에 의한 경화 방법과 잔기간 공유결합에 의한 경화방법을 통해 두 종류의 접착 조성물을 제조하였다. 상기 접착 조성물의 제조방법올 실시예 3과 실질적으로 동일하되, 실시예 3의 갈산을 함유하고 있는 키틴 하이드로젤을 사용하였으나, 대신에 본 실시예에서는 실시예 6의 갈산을 함유하고 있는 키토산 하이드로젤을 사용하였다.
첫 번째 금속이온과의 배위결합에 의한 경화 방법으로서， 실시예 6에서 제조한 갈산을 함유하고 있는 키토산 하이드로젤에 피로갈롤: Fe3+의 몰비가 3 : 1이 되도록 FeCl3를 섞어 주어 피로갈를 -Fe 배위결합에 의해 경화시켜, Fe3+ 및 갈산을 함유하고 있는 키토산 하이드로젤을 함유하는 접착 조성물을 제조하였다.
두 번째 잔기간 공유결합에 의한 경화방법으로서, 실시예 6에서 제조한 갈산을 함유하고 있는 키토산 하이드로젤에 피로갈롤: ICV 의 몰비가 2: 1이 되도록 산화제인 NaI04를 처리하여 공유결합을 통해 가교시켜， KV 및 갈산을 함유하고 있는 키토산 하이드로젤을 함유하는 두 종류의 접착 조성물를 제조하였다.
상기 제조된 두 종류의 접착 조성물에 대한 사진을 도 8에 나타냈다.도면 8에 사진은 제조된 하이드로젤의 접착력을 보여준 사진이며, pyrogallol 잔기 사이의 공유결합에 가교의한 하이드로젤과 금속과의 배위결합에 의해 가교된 하이드로젤의 형태를 보여주고 있다. 이때， pH는 pH가 증가할수톡 배위결합의 수를 최대치로 끌어 올릴 수 있어서 pH를 증가시킨 사진이다. 즉， 단순한 하이드로젤의 형태 사진이다. 또한, 본원 키토산 나노섬유 이용한 경우 물성확인 실험결과를 도 3에 나타냈다. 실시예 8: 키토산하이드로젤을포함하는 생체접착제의 특성평가
하이드록시아파타이트를 키토산 하이드로젤에 수중으로 접착한사진과 간단한 실험방법， 키토산 하이드로젤로 기계적 강도는 측정하지 않았지만, 점막에 물속에서 접착
임상수술시 골재생을 위해 실제 사용되는 하이드록시아파타이트 (칼슘- 포스페이트 복합체) 또는 소뼈가루 등의 골전도성 물질 고정을 위한 접착 물질로 키토산 /갈릭산 하이드로젤을 사용하였다. 위와 같이 임상에서 사용되기 위해 체내 수중환경에서의 수중 접착제로서 특성평가를 위한 시험방법은 다음과 같다. . 실시예 7 에서 제조된 키토산 /갈릭산 물의 20%(w/w)가 되도록 녹여 키토산이 포함된 하이드로젤을 형성시킨다. 이 때, 키토산 /갈릭산의 농도는
20%(w/w)에만 국한되지 않으며 , 10%(w/w) 이상의 경우에 층분한 접착력을 유지함을 확인하였다.
,제조된 하이드로젤을 하이드록시아파타이트 또는 소뼈가루와 함께 섞어 주었고, 산화제인 NaI04를 이용하여 강한 공유결합을 형성시켜 접차력을 증가시켰으며 [도 9a]에 나타내었다. 산화제를 사용하지 않는 경우에도 충분한 접착능을 보였으며, 본 실시예 에서는 강한 결합을 유도하기 위해 산화제와 함께 사용하였다.
또한, 제조된 하이드록시아파타이트 /접착제 복합체를 물속에 넣고, 강하게 흔들었으나 분리되어 떨어지는 구성물을 보이지 않았으며, 강한 접착력은 일주일 이상 유지되었으며, [도 9b] 에 나타내었다. 본 실시예는 해당 접착제가 생체접찹제로서 가능성을 지니고 있으며, 이는 생체 내부의 점막조직 및 장기 내 봉합제제 또는 오랫동안 지속가능성
약물전달제제로서의 사용가능성올 내포하고 있다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
키틴 나노섬유 또는 키토산 나노섬유를 포함하며,
상기 나노섬유는 그 표면에 공유 결합된 디히드록시페닐 (dihydroxyphenyl) 잔기 , 트리히드록시페닐 (trihydroxypheny)잔기 , 또는 탄닌산 (tannic acid)을 포함하는 표면 처리된 나노섬유인， 생체접착성 하이드로젤.
【청구항 2】
거 1 1항에 있어서, 상기 표면 처리된 나노섬유는, 탄닌산 또는 하기 화학식 1을 갖는 표면 처리물질을 키틴 나노섬유, 키토산 나노섬유, 또는 키토산에 처리하여 얻어진 것인, 생체접착성 하이드로젤:
【청구항 4】
제 2 항에 있어서, 상기 표면 처리물질은 나노섬유의 100 중량 % 기준으로 0.1 내지 30 중량0 /。로 포함되는 것인, 생체접착성 하이드로젤.
【청구항 5】
제 1 항에 있어서, 상기 하이드로젤은 상대습도 50%에서의 접착강도가 5 내지 100 Mpa이고， 상대 습도 100%에서의 접착강도가 으 05 Mpa 내지 lO MPa 인, 생체접착성 하이드로젤.
【청구항 6】
제 1 항에 있어서, 상기 하이드로젤은 생리활성물질과
생접합 (bioconjugation)된 것인, 생체접착성 하이드로젤.
【청구항 7】
제 6항에 있어서， 상기 생리활성물질은 세포, 단백질, 핵산, 당, 효소, 또는 이들의 흔합물인 것인, 생체접착성 하이드로젤.
【청구항 8]
제 1항에 있어서， 상기 하이드로젤은 금속이온을 첨가하여, 키틴 나노섬유 또는 키토산 나노섬유에 결합된 디히드록시페닐 잔기, 트리히드록시페닐 잔기, 또는 탄닌산과 금속 이온의 결합으로 형성된 것인， 생체접착성 하이드로젤.
I청구항 9]
제 8항에 있어서, 상기 금속 이온은 Ca2+, Fe2+, Fe3+, V4+, V3+, 또는 V2+인 것인, 생체접착성 하이드로젤.
【청구항 10]
게 8항에 있어서, 상기 금속이온은 상기 나노섬유에 포함된 디히드록시페닐 잔기, 트리히드록시페닐 잔기, 또는 탄닌산 1몰 기준으로 0.05 내지 5 몰을 첨가한 것인, 생체접착성 하이드로젤.
【청구항 11】
제 1항에 있어서, 상기 하이드로젤은 산화제를 첨가하여 키틴 나노섬유 또는 키토산 나노섬유에 포함된 디히드록시페닐 잔기, 트리히드록시페닐 잔기, 또는 탄닌산 간의 공유결합으로 형성된 것인, 생체접착성 하이드로젤.
【청구항 12]
제 1 1항에 있어서, 상기 산화제는 쇼듐 페리오데이트 (Sodium periodate), 테트라부틸암모늄 페리오데이트 (tetrabutylammonium periodate), 또는
과산화수소 (hydrogen peroxide)인 것인， 생체접착성 하이드로젤.
【청구항 13】 제 1 1항에 있어서, 상기 산화제는 상기 나노섬유에 포함된 디히드톡시페닐 잔기, 트리히드록시페닐 잔기, 또는 탄닌산 1몰 기준으로 0.05 내지 5 몰을 을 첨가한 것인, 생체접착성 하이드로젤.
【청구항 14】
게 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항의 생체접착성 하이드로젤을 포함하는, 생체접착용 조성물.
【청구항 15】
제 M 항에 있어서, 상기 생체 접착용 조성물은 피부, 뼈， 신경, 액손, 연골， 혈관, 각막, 근육, 근막, 뇌, 전립선, 유방, 자궁내막， 폐， 비장, 소장, 간， 정소， 난소， 경부, 직장, 위, 림프절， 골수, 및 신장으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 생체 조직에 적용되는 것인 생체접착용 조성물.
【청구항 16】
제 14 항에 있어서, 상기 생체 접착용 조성물은 하이드록시아파타이트 및 옥타칼술포스페이트로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 뻐 전구체 물질에 적용되는 것인 생체접착용 조성물.
【청구항 17】
제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항의 생체접착성 하이드로젤을 포함하는, 조직공학용 지지체.
【청구항 18】
제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항의 생체접착성 하이드로젤을 포함하는, 약물전달용 담체.
【청구항 19】
키틴 나노섬유 또는 키토산 나노섬유로 하이드로젤을 제조하는 단계; 및 상기 하이드로젤에 포함된 나노섬유의 표면에 탄닌산 (tannic acid) 또는 하기 화학식 1의 표면 처리물질을 처리하여 나노섬유의 표면 처리를 수행하는 단계;
를 포함하는 생체접착성 하이드로젤 제조방법:
【청구항 22]
제 20항에 있어서， 상기 금속 이온은 Ca2+, Fe2+, Fe3+, V4+, V3+, 또는 V2+인 것인, 생체접착성 하이드로젤 제조방법.
【청구항 23]
제 20항에 있어서, 상기 산화제는 소듐 페리오데이트, 테트라부틸암모늄 페리오데이트, 또는 과산화수소인 것인, 생체접착성 하이드로젤 제조방법.
【청구항 24]
제 19항에 있어서， 상기 하이드로젤을 제조하는 단계를 수행하기 전에, 상기 나노섬유에 탈아세틸화 처리하는 단계를 추가로 수행하는 것인, 생체접착성 하이드로젤 제조방법.
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