JP5805882B2 - カテコール基が結合したキトサンまたはポリアミン及び末端にチオール基が結合したポロキサマーを含むヒドロゲル及びこれの製造方法及びこれを利用した止血剤 - Google Patents

Description

本発明は、カテコール基が結合したキトサン及び末端にチオール基が結合したプルロニックを含む接着性ヒドロゲル組成物に関し、より詳細には生体内外での安定性を持って、温度感受性であり、止血効果が優れて生体接着剤として利用可能な接着剤組成物及びこれを含む医療用接着剤、癒着防止剤及び表面吸着防止剤に関する。

接着剤とは、物体と他の物体の表面を付着させるのに用いられる物質で、国際標準化機構（ＩＳＯ）では「接着（adhesion）は二面が化学的または物理的な力、または、その両者によって一体化する状態で、接着剤（adhesive）は、接着剤によって二つ以上の物体を一体化することが可能にする物質」と定義している。接着剤は、その便利さにより日常生活、産業活動の種々の分野で幅広く用いられており、主成分に応じて無機接着剤と有機接着剤に分類される。有機接着剤はさらに合成有機接着剤と天然有機接着剤に分類され、合成有機接着剤は、熱硬化性樹脂または熱可塑性樹脂を含む樹脂系接着剤、ゴム系接着剤、及びフェノール、及びエポキシを含む混合系接着剤に分類される。しかし、有機合成接着剤の場合、最近有害物質が放出されるなどの問題が発生している。これは、特に有機溶剤中の揮発性有機溶剤の使用及び未反応モノマーの揮発によるものである。特に、建築時内装材に用いられる接着剤の場合、現状はホルムアルデヒドなどの有害物質を放出しないように規制が強化され、このような状況において、にかわ系接着剤、大豆蛋白質系接着剤、タンニン系接着剤に対する開発がなされている。

「粘着剤」とは、接着剤の一種と見ることができ、接着剤に一部分に加える圧力（指圧）だけでも被着材に十分に接着して、接着剤に比べて凝集力が低く応力緩和がはやく、外力に対して簡単に変形が可能な点弾性的な挙動を示す物質をいう。粘着剤に用いられる原料は、天然ゴム、合成ゴム、アクリル及びシリコンなどの熱可塑性樹脂で、その大部分は弾性を持つことが特徴である。このように、粘着剤は接着剤とは異なって何度も繰り返して使っても接着力を維持できる特徴を持ち、ベタベタにくっつく性質を持って、これを粘着性（stickiness）という。

シーラント（Sealant）と止血剤（hemostats）を含む組織接着剤分野への研究開発は急速に進んでいる。１９９８年米ＦＤＡでフィブリンシーラント（Fibrin sealant）が許可されてから、毎年新しい組織接着剤が絶えず開発されている。このような組織接着剤は、既に外科的、または内科的手術で用いられている縫合術、クリップ術、又は焼灼といった技術を代替できる素材として脚光を浴びている。

縫合術等のような既存の外科的な技術は、強い引張力（strong tensile strength）を持つが、患者の苦痛の誘発及び手術後の除去などの問題を持っている。それに対して、組織接着剤は、はやい接着時間、使用の簡単さ、手術後の除去が不要など長所を多く持っているが、低い接着性及び引張力（low adhesiveness and tensile strength）と、水分存在下の接着性が顕著に落ちる制限がある。このような組織接着剤の限界を克服するための研究が続けられている。

組織接着剤は、組織に直接接触するため、生体適合性が求められる。また、医療用接着剤の場合には、通常生体内で用いられるため、接着が本質的に体液と血液中に流れ込まれると、生体が直接関与するため、より厳しい条件で毒性と危害性があってはならず、より厳密な生体適合性及び生分解性が求められる。

一般に、組織接着剤は、皮膚、血管、消化器、脳神経、成形外科、及び整形外科などの種々の領域で用いられるため、各々異なる特性を要するが、主に次のような特徴が求められる。即ち、１）水分が存在する場合にも、常温、常圧で早く接着しなければならない、２）毒性があってはならず、滅菌が可能でなければならない、３）創傷面に密着して十分な機械的強度を維持しなければならない、４）生分解性であり、止血効果を示す、５）生体治癒に効果がなければならない。

現在、商用化または実用化されている組織接着剤は、大きくシアノアクリレート瞬間接着剤、フィブリングルー、ゼラチングルー及びポリウレタン系接着剤などがある。シアノアクリレート瞬間接着剤は、最近になって高機能性及び高性能を持つ瞬間接着剤の研究において脚光を浴びている。特に、生体適合性、柔軟性、及び低毒性の生体組織縫合用医療用瞬間接着剤は、止血、抗菌効果だけでなく縫合糸の代替も可能であるため、先進国を中心に研究が活発に進行している。

このようなシアノアクリレート系組織接着剤は、現在ダーマボンド（Dermabond；Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ）とインダーミル（Indermil；ＵＳ Ｓｕｒｇｉｃａｌ）等の製品に商用化されている。このようなシアノアクリレート系組織接着剤は、単一物質で、短い時間に室温で開始剤なしに水分によって硬化され、外観が透明で接着強度が大きい長所があるが、衝撃に弱くて耐熱性に劣る短所を持っている。また、毒性が酷く、現在はほとんど使われなく、米国を除いた他の国で臨床で部分的に使っているが、一部組織毒性及び副作用のために使用が制限されている。

また、フィブリングルー接着剤は、最初１９９８年米国ＦＤＡによって心臓外科に応用が許可された。その後、フィブリン組織接着剤に対する研究開発が活発になり、現在Ｔｉｓｓｅｅｌ ＶＨ（Ｂａｘｅｒ）とＥｖｉｃｅｌ（商品名）（Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ）等の製品が商用化されている。

フィブリン系組織接着剤は、シアノアクリレート系と共に組織接着剤市場のほとんど大部分を占めている。

フィブリン組織接着剤は、フィブリンの架橋反応を利用して、フィブリノーゲン、トロンビン、塩化カルシウム、及び線溶酵素の阻害剤を組織接着剤であり、末梢神経の縫合、微小血管の縫合などに適用して、縫合の代用、または補強のための臨床応用が実施されている。

このようなフィブリングルー接着剤は、接着部位の水分に影響を受けず早く接着して、血小板と凝固障害がなく、生体適合性が優秀な長所を持っている。しかし、接着力が弱く、生分解速度が速く、感染の危険性があるなどの問題がある。

また、ゼラチングルーは、生体由来の組織接着剤で、ゼラチン−レゾルシノール−ホルマリン（ＧＲＦ）で架橋させたものが開発された。

その他、ゼラチン−グルタルアルデヒドのような組織接着剤が開発されたが、組織接着性は高いが、架橋剤として用いられるホルマリンやグルタルアルデヒドが生体内の蛋白質とも架橋反応を起こして、組織毒性を起こす短所を持っている。

また、ポリウレタン系接着剤は、硬化後、接合部の柔軟性が維持される弾性接着剤形態で開発された。この接着剤は、生体組織表面の水を吸収して、組織との密着性を高めて、水と反応して数分以内に硬化して、硬化物が柔軟性を持つことが特徴であり、硬化した接着剤が適切に生分解される長所を持っている。しかし、合成原料である芳香族ジイソシアネートが生体毒性がある短所を持っている。

既に開発された組織接着剤は、高分子、または架橋剤の毒性と弱い接着力などの問題点をまだ持っている状況である。このような問題を克服しようと最近ではムール貝由来の蛋白質である３，４−ジヒドロキシフェニル−Ｌ−アラニン（ＤＯＰＡ）を利用した組織接着剤開発に対する研究が進行している。

ＤＯＰＡ物質は、ムール貝の足糸に存在する足糸蛋白質（foot protein）由来のもので、足糸蛋白質に存在するチロシン（tyrosine）がポリフェノール酸化剤（polyphenol oxidase）によって水和されて得られるアミノ酸である。この物質は、親水性表面と非常に強い水素結合を形成することができ、金属や半金属などとも強い配位結合ができる特徴を持つ。また、ＤＯＰＡ残基は、ＤＯＰＡ−キノン形態で酸化されながら、蛋白質分子らの架橋を図ることになる。

ＤＯＰＡを利用した組織接着剤は、現在Ｃｅｌｌ−Ｔａｋ（商品名）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）とＭＡＰ（商品名）（Ｓｗｅｄｉｓｈ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ Ｌａｂ．）という製品に商業化されている。しかし、このような製品は、１グラムのムール貝の足糸蛋白質を得るために１０，０００個のムール貝が必要となる。このような低い抽出効率と、高い生産原価とのために、用途が限定され、細胞や組織培養接着剤にだけ用いられている。

ＵＳＰＴＯデータベースで検索したところ、要約及び請求の範囲にキトサン及び接着剤を含む特許は、ただ１４個が出願された。これらの特許の多くは、製紙産業に関するものである。米国特許第５，７７３，０３３号は、フィブリノーゲン／キトサン止血剤を開示するが、組織接合に使うためのものではない。発明の名称が「生物学的組織用接着剤（Adhesive for Biological Tissue）」である米国特許第６，３２９，３３７号は、組換えヒト血しょう蛋白質、及び二官能性、または多官能性アルデヒドから製造されたグル製剤を開示する。キトサンは、溶液の接度を向上させるための製剤に、または二官能性、または多官能性アルデヒドとの架橋結合剤として使われた。米国特許第５，４９６，８７２号は、潜在的な製剤のかなりを網羅したリストの中に、キトサンを開示したが、結合するチオール、カルボン酸及びラジカルに依存的である。米国特許第６，２００，５９５号は、潜在的な医療用接着剤として使うための、キトサンを含む多価カチオン性基質と多価アニオン性基質の組合を開示した。この特許で接合力は、７０ｇ−ｆ／ｃｍ^２を越えないと報告された。また、この発明は、二つの成分を使用直前に混合する必要がある。米国特許第６，９９１，６５２号は、細胞成長のためのマトリックスとして用いられる多くの潜在的な物質の列挙されたうちの一つとしてキトサンを開示した。

文献を調べて、精製工程として、及び共添加剤を導入する手段としてキトサンの透析を使ったことが明らかになった。
例えば、米国特許第６，３１０，１８８号は、キトサンの透析を利用して低分子量化合物を除去する。

多くのシステムが組織接着剤の分野の使用に考慮されたが、現在有用なシステムは、毒性、不充分な強度、または、使用の困難を含む欠陥を有する。従って、滅菌及び使用が便利な形態で提供できる、安全で効果的な組織接着剤の追加的な組成物が当該分野に必要である。このような高度な接着性を有する組成物は、さらに薬品送達に相当なメリットを提供する。美容及び再建外科手術に使うための充填剤、バルク組成物、または、再建組成物を提供する、高度に水和されたまま残っている組成物が、当該分野に必要である。

前記従来技術の問題点を解決するために、本発明者は、人体に無害なキトサン（chitosan）、またはポリアミン（polyamine）にカテコール基を結合させた化合物とポロキサマー（polaxamer）の両末端にチオール基を結合させた化合物を含む生体適合性及び機械的強度が優秀で、温度感受性の優れた組織接着力を持つ接着性ヒドロゲルを開発することによって本発明を完成した。

そこで、本発明の目的は、キトサン（chitosan）またはポリアミン（polyamine）にカテコール基を結合させた化合物とポロキサマー（polaxamer）の両末端にチオール基を結合させた化合物とを含む接着性ヒドロゲルを提供することにある。

また、本発明の他の目的は、キトサン（chitosan）またはポリアミン（polyamine）にカテコール基を結合させた化合物とポロキサマー（polaxamer）の両末端にチオール基を結合させた化合物とを含む接着性ヒドロゲルを医療用接着剤（bioadhesive）、癒着防止剤及び表面吸着防止剤用素材に応用することにある。

また、本発明のさらに他の目的は、キトサン（chitosan）またはポリアミン（polyamine）にカテコール基を結合させた化合物とポロキサマー（polaxamer）の両末端にチオール基を結合させた化合物とを含む接着性ヒドロゲルの製造方法を提供することにある。

前記のような本発明の目的を達成するために本発明は（ｉ）カテコール基が結合したキトサン（chitosan）またはポリアミン（polyamine）及び（ii）末端にチオール基が結合したポロキサマー（polaxamer）とを含む接着性ヒドロゲル組成物を提供する。

キトサンは、海老、ロブスター、及びカニを含む甲殻類の外骨格からのキチンを部分的に脱アセチル化して誘導されたカチオン性多糖類である。キトサンの化学的性質は、脱アクリル化（１，４）−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン重合体としてよく説明される。キトサンの接着性質は、一部の場合ににおいて知られている。しかし、現在まで、キトサンに基づいた接着剤製品は全く生産されたことがない。これは、キトサンが濃酸性溶液に溶ける性質による取り扱いが難しい点と、組織と速かに接合する形態で送達しにくいことに多く起因する。

本発明で記載するカテコール基は下記一般式（１）で表され；

カテコール基が結合したキトサン（chitosan）またはポリアミン（polyamine）は、分子量が１０，０００Ｄａないし１，０００，０００Ｄａであることが好ましく、より好ましくは分子量が５０，０００Ｄａないし２００，０００Ｄａであるものを使うことがヒドロゲルの安全性及び接着力の側面から最も好ましい。

前記カテコール基が結合したポリアミン（polyamine）は、具体的には、エチレンジアミン（ethylene diamine）、１，３−ジアミノプロパン（1,3-diaminopropane）、ヘキサメチレンジアミン（hexamethylenediamine）、テトラエチルメチレンジアミン（tetraethylmethylenediamine）、プトレシン（putrescine）、カダベリン（cadaverine）、スペルミジン（spermidine）、スペルミン（spermine）、直鎖状ポリエチレンイミン（polyethyleneimine,linear）、分岐状ポリエチレンイミン（polyethyleneimine,branched）、ポリリジン（ε-poly-L-lysine）及びポリ（アリルアミン塩酸塩）（poly(allylamine hydrochloride)）からなる群から選択されるいずれか一つまたは二つ以上であるもので、より好ましくは直鎖状ポリエチレンイミン（polyethyleneimine,linear）、分岐状ポリエチレンイミン（polyethyleneimine,branched）、ポリリジン（ε-poly-L-lysine）及びポリ（アリルアミン塩酸塩）（poly(allylamine hydrochloride)）からなる群から選択されるいずれか一つ、または二つ以上であるが、これに制限されない。

ポロキサマー（polaxamer）は、温度感応性高分子で、低温では液体状態であり、体温に達しては、固体状態になる温度感受性高分子で、注射型物質で適切に用いられている。

本発明で記載するポロキサマー（polaxamer）は、下記一般式２で表されるプルロニック、または下記一般式３で表されるテトロニックであることを特徴とするヒドロゲル組成物である。プルロニックは、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）−ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）−ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）の構造を持つブロックコポリマーであり、具体的な例としては、Ｆ３８、Ｆ６８、Ｆ７７、Ｆ７７、Ｆ９８、Ｆ１０８、及びＦ１２７誘導体と、Ｌ３１、Ｌ４２、Ｌ４３、Ｌ４４、Ｌ６２、Ｌ７２、及びＬ１０１誘導体と、Ｐ７５、Ｐ１０３、及びＰ１０４誘導体が含まれ、テトロニックは、エチレンジアミン（ethylene diamine）末端にポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）−ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）が４方向に官能気化されているブロックコポリマーであり、具体的な例としては１１０７、１３０７、１３０ｒ２、１５０ｒ１、３０４、７０１、７０２、７０４、９０１、９０４、９０８、及び９０ｒ４が含まれるが、これに制限されない。

前記一般式（２）で、ａは２ないし２００の整数であり；ｂは１０ないし１００の整数であり；好ましくは前記ａは２ないし１４１の整数であり；前記ｂは１６ないし６９の整数であり；そしてａとｂは、１：９ないし８：２の割合で存在する。

前記一般式（３）で、ａは２ないし６００の整数であり；ｂは１０ないし１５０の整数であり；好ましくは前記ａは１０ないし４５５の整数であり；前記ｂは１７ないし１１６の整数であり；そしてａとｂは、１：９ないし９：１の割合で存在する。

前記末端にチオール基が結合したプルロニック、または末端にチオール基が結合したテトロニックは、分子量が５００Ｄａないし５００，０００Ｄａであるものを用いることが、ミセル形成後、密接にパッキングする側面とカテコール基が結合したキトサンとの安定した化学的結合ができる面において最も好ましい。

本発明は、キトサンまたはポリアミンにカテコール基を結合させて、ポロキサマーの両末端にチオール基を結合させることによって本発明に係る接着性ヒドロゲルは既存の生体接着用ヒドロゲルに比べて温度に感応する特性と少なくとも１ｋＰａ以上の弾性係数、生体内外での安全性及びはやくて強い接着力の側面において優秀な効能を持つようになる。

さらに、本発明の接着剤組成物は、水、低級アルコール、または、これらの混合物を含む。低級アルコールは、アルコール分子中に含まれた炭素数により炭素数が少ない（炭素数１ないし６）アルコールを意味し、低級アルコールは、水に溶解するが、電離されることなく、イオンが発生しない中性物質であり、アルコールのＯＨ基は、塩基のＯＨ基とは性質が異なって、アルカリ性を示さない。前記低級アルコールに属するものとしては、これに制限されないが、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、アミルアルコール、ｎ−アミルアルコール、イソアミルアルコール、ｎ−ヘキシルアルコールが挙げられ、本発明の接着剤組成物の低級アルコールとして好ましくはエタノールが用いられる。

また、本発明の接着剤組成物にはその物性の改善のための添加剤などが用いられ、前記添加剤は、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者によって適切に選択されることができる。

「接着」とは、通常の意味として、初期に固化されて、時間の経過により弾性が落ちた状態になった場合、再付着が難しいものである。しかしながら、本発明での「接着」は「粘着」を含む意味で、「粘着」とは、点弾性の特性が維持された状態の形態で圧力によって簡単につくことができ、弾力が落ちた後にも何度も再接着が可能になることをいう。本発明の接着剤組成物は粘着剤としての特性を持っている。

本発明の接着剤組成物は、これに制限されないが、全体組成物に対し、カテコール基が結合したキトサン０．１ないし２０重量％、末端にチオール基が結合したプルロニック３ないし５０重量％、及び水、低級アルコール、またはこれらの混合物３５ないし９０重量％を含む。より好ましくは、カテコール基が結合したキトサン０．５ないし１０重量％、末端にチオール基が結合したプルロニック８ないし２０重量％、及び水、低級アルコール、またはこれらの混合物７５ないし９０重量％を含み、最も好ましくは、カテコール基が結合したキトサン０．５ないし４重量％、末端にチオール基が結合したプルロニック１０ないし１８重量％、及び水、低級アルコール、またはこれらの混合物８０ないし８５重量％を含み、接着剤の安全性及び接着力、そして使用の側面において注入しやすい面において最も良い。

本発明において、ヒドロゲル組成物は、治療用薬物をさらに含んでもよい。
ヒドロゲル組成物にさらに含まれてもよい治療用薬物としては、難溶性薬物（poorly soluble drugs）、治療用ペプチド、蛋白質、または抗体を含む薬品が挙げられ、ヒト成長ホルモン、エリスロポエチン、インターフェロン、インスリン、インターロイキン、カルシトニン、Ｇ−ＣＳＦ、アンジオポイエチン（Angiopoietin）、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ、モノクローナル抗体、抗体断片が含まれてもよく、止血蛋白質、抗生剤、鎮痛剤がヒドロゲル組成物にさらに含まれてもよく、舌の下から応急投与が必要な狭心症治療剤、喘息及びアレルギー鼻炎舌下免疫治療として用いられるアレルゲンエキス（allergen extract）、抗ヒスタミン、及び抗アレルギー剤を含んでもよい。

また、本発明は、前記接着剤組成物を含む医療用接着剤に関するものである。
医療用接着剤（medical adhesive）は、広い意味では医療用具の包装から外科用粘着、接着、及び止血に至るまで広範囲な分野に適用でき、生体適合性があって皮膚に直接使用が可能で、通常生体内で用いられるように生体に直接関与時にも毒性と危害性が全くない接着剤をいう。医療用接着剤として用いられるためには、生体適合性の他にも生分解性、水分抵抗性、滅菌性、非毒性、及び止血効果を持つべきであり、生体の治癒に妨げになってはいけない。本発明の接着剤は、医療用接着剤としての用途を持ち、前記用途には粘着剤としての用途を含む。より詳細には、手術用接着性止血剤及び大腸切開後縫合用医療接着剤として生体に使用可能である。

また、本発明は、前記接着用組成物を含む医療用癒着防止剤に関するものである。
癒着防止剤（Anti-adhesive agent）は、癒着が予想される部位に一定期間、物理的なバリヤーとして残り、隣接した組織の間に癒着が形成されることを防ぐ役割を果たす物質をいう。従って、癒着防止剤は一定期間後には分解あるいは生体内に吸収され、異物として残らない。本発明の接着用組成物は、外科的手術後に誘発されうる癒着を防止する癒着防止剤製造時に含まれてもよい。

また、本発明は、前記接着用組成物を含む表面吸着防止剤に関するものである。
また、本発明は
（Ａ）カテコール基が結合したキトサンまたはポリアミンを製造する工程；
（Ｂ）末端にチオール基が結合したポロキサマーを製造する工程；
（Ｃ）緩衝溶液にカテコール基が結合したキトサンまたはポリアミンを溶解してカテコール−キトサン、またはカテコール−ポリアミン溶液を製造する工程；
（Ｄ）緩衝溶液にチオール基が結合したポロキサマーを溶解してチオール−ポロキサマー溶液を製造する工程；
（Ｅ）工程（Ｃ）のカテコール−キトサン、またはカテコール−ポリアミン溶液と工程（Ｄ）のチオール−ポロキサマー溶液とを混合して接着性ヒドロゲル溶液を製造する工程；及び
（Ｆ）工程（Ｅ）の接着性ヒドロゲル溶液をゲル化させる工程；を含むヒドロゲルの製造方法を提供する。

以下、本発明を工程毎に説明する。
カテコール基が結合したキトサンまたはポリアミンを製造する前記工程（Ａ）は、
（ａ）蒸溜水１００重量部に対しキトサンまたはポリアミン０．２ないし５重量部を添加してキトサンまたはポリアミン溶液を製造する工程；
（ｂ）蒸溜水１００重量部に対しヒドロコーヒー酸（hydrocaffeic acid）１ないし５重量部及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）−カルボイミド塩酸塩（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride；ＥＤＣ）２ないし１０重量部を添加してヒドロコーヒー酸溶液を製造する工程；
（ｃ）工程（ａ）のキトサンまたはポリアミン溶液と工程（ｂ）のヒドロコーヒー酸溶液を１：１ないし３：１の体積比で混合及び撹はんして、カテコール基が結合したキトサンまたはポリアミン混合物を製造する工程；及び
（ｄ）工程（ｃ）のカテコール基が結合したキトサンまたはポリアミン混合物を透析膜を利用して緩衝溶液で６ないし４８時間透析して、カテコール基が結合したキトサンまたはポリアミンを精製して乾燥する工程；を含むことを特徴とする。

前記工程（ｄ）で用いられる緩衝溶液は、ｐＨ４．５ないし５．５であることを特徴とする。ｐＨが４．５未満と低い場合、最終製品面において塩酸の含有量が増加する。ｐＨが５．５を超えて高い場合には、カテコールが酸化が進行する。

前記工程（ｄ）において、緩衝溶液で透析する時間は２４ないし３６時間行うことがさらに好ましい。
前記カテコール基が結合したキトサン（chitosan）またはポリアミン（polyamine）は、分子量が１０，０００Ｄａないし１，０００，０００Ｄａであることが好ましく、ヒドロゲルの安全性及び接着力の側面において分子量が５０，０００ないし２００，０００Ｄａであるものを用いることがより好ましい。

前記カテコール基が結合したポリアミン（polyamine）は、具体的に、エチレンジアミン（ethylene diamine）、１，３−ジアミノプロパン（1,3-diaminopropane）、ヘキサメチレンジアミン（hexamethylenediamine）、テトラエチルメチレンジアミン（tetraethylmethylenediamine）、プトレシン（putrescine）、カダベリン（cadaverine）、スペルミジン（spermidine）、スペルミン（spermine）、直鎖状ポリエチレンイミン（polyethyleneimine,linear）、分岐状ポリエチレンイミン（polyethyleneimine,branched）、ポリリジン（ε-poly-L-lysine）、及びポリ（アリルアミン塩酸塩）（poly(allylamine hydrochloride)）からなる群から選択されるいずれか一つ、または二つ以上であり、より好ましく直鎖状ポリエチレンイミン（polyethyleneimine,linear）、分岐状ポリエチレンイミン（polyethyleneimine,branched）、ポリリジン（ε-poly-L-lysine）、及びポリ（アリルアミン塩酸塩）（poly(allylamine hydrochloride)）からなる群から選択されるいずれか一つ、または二つ以上であるが、これに制限されない。

前記工程（Ａ）のカテコール基が結合したキトサン、またはポリアミンの製造はｐＨ５ないし５．５の条件下で行うことが好ましい。反応を行うに当たりｐＨが低すぎるとキトサンの溶解度が高まって容易になるが、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）−カルボイミド塩酸塩の加水分解が加速されて、転換率や収率の側面において不利になり、ｐＨが高すぎるとキトサンの溶解度が落ちて沈殿が発生して、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）−カルボイミド塩酸塩の加水分解が加速されて、転換率や収率の側面において短所を伴うことになる。

チオール基が結合したポロキサマーを製造する前記工程（Ｂ）は、
（１）非極性有機溶媒１００重量部に対しポロキサマー５ないし１５重量部及び非極性有機溶媒１００体積部に対しトリエチルアミン０．１ないし１体積部を添加してポロキサマー溶液を製造する工程；
（２）非極性有機溶媒１００重量部に対しクロロギ酸ｐ−ニトロフェニル５ないし２０重量部を添加してクロロギ酸ｐ−ニトロフェニル溶液を製造する工程；
（３）工程（１）のポロキサマー溶液と工程（２）のクロロギ酸ｐ−ニトロフェニル溶液を５：１ないし１０：１の体積比で混合及び撹はんして、ポロキサマー混合溶液を製造する工程；
（４）工程（３）のポロキサマー混合溶液を沈殿及び乾燥して、ポロキサマー混合物を製造する工程；
（５）非極性有機溶媒及び極性溶媒の混合液１００重量部に対し工程（４）のポロキサマー５ないし２０重量部及びシステアミン０．２ないし５重量部を添加及び撹はんしてチオール基が結合したポロキサマー混合液を製造する工程；
（６）工程（５）のチオール基が結合したポロキサマー混合液を沈殿及び乾燥して、チオール基が結合したプルロニック混合物を製造する工程；及び
（７）工程（６）のチオール基が結合したポロキサマー混合物を、透析膜を利用して蒸溜水で１２ないし１２０時間透析して、チオール基が結合したプルロニックを精製して乾燥する工程；を含むことを特徴とする。

前記末端にチオール基が結合したプルロニック、または末端にチオール基が結合したテトロニックは、分子量が０．５ｋＤａないし５００ｋＤａであるものを用いることがミセル形成後、密接にパッキングする側面とカテコール基が結合したキトサンとの安定した化学的結合ができる面において最も好ましい。

前記工程（Ｃ）のカテコール−キトサン、またはカテコール−ポリアミン溶液は、緩衝溶液１００重量％に対しカテコール基が結合したキトサンまたはポリアミン０．１ないし１０重量％を添加して、前記工程（Ｄ）のチオール−ポロキサマー溶液は、緩衝溶液１００重量％に対しチオール基が結合したポロキサマー３ないし５０重量％を添加して製造される。

前記工程（Ｅ）の接着性ヒドロゲル溶液は、カテコール−キトサン、またはカテコール−ポリアミン溶液とチオール−ポロキサマー溶液を１：３ないし３：１の体積比で混合して製造されることが、使用の便利性と反応の安全性の側面において最も好ましい。チオール−ポロキサマー溶液に対して、カテコール−キトサン、またはカテコール−ポリアミン溶液が本発明の前記範囲の下限より少ない量で添加された場合、高濃度のカテコール−キトサン、またはカテコール−ポリアミン溶液が、ｐＨ条件６．５以上で自己集合され、刺激なしにヒドロゲルを形成できる点、及び温度感応性が低下する短所が発生する。チオール−ポロキサマー溶液に対して、カテコール−キトサン、またはカテコール−ポリアミン溶液が、過剰量添加された場合には、高濃度のチオール−ポロキサマー溶液によって部分的溶解が発生し、これによって温度感応性が低下するという短所が発生する。

工程（Ｅ）の接着性ヒドロゲル溶液をゲル化させる前記工程（Ｆ）は、４ないし３７℃の温度で行うことが使用の便利性と生体の特性を利用する側面において最も好ましい。４℃未満の温度でゲル化現象が発生すると、冷蔵状態でもヒドロゲルが形成されるため、注入不可能で、３７℃を超える高温でゲル化現象が発生すると、生体温度３７℃を超えることになるため、注入時生体内でゲルが形成されることなく拡散する問題が発生する。

本発明に係るヒドロゲルは、生体内外での安全性を持ち、温度感受性であり、止血効果が優秀で、生体接着剤として医療用接着剤、癒着防止剤及び表面吸着防止剤に応用が容易である。

組織接着、温度感応性、そしてゲル化特性を持ったカテコール基が結合したキトサン及び末端にチオール基が結合したプルロニックを含む接着性ヒドロゲルの模式図である。 製造例１で製造されたカテコール基が結合したキトサンを核磁気共鳴分光法で測定したスペクトルである。 製造例２で製造された両末端にチオール基が結合したプルロニックを核磁気共鳴分光法で測定したスペクトルである。 比較試験例３ないし９、及び試験例７で測定したヒドロゲルの接着力に対する結果を示したグラフである。 比較試験例１０、１１、対照群及び試験例８で測定したヒドロゲルの止血効果に対する結果を示したグラフである。

以下、実施例によって本発明をより詳細に説明するが、これは発明の構成及び効果を理解させるためのものに過ぎず、本発明の範囲を制限しようとするものではない。

［製造例１］カテコールが結合したキトサンの製造
キトサン（キトサン３００）０．５ｇを０．１Ｍ ＨＣｌ溶液５０ｍＬに溶解して１Ｍ ＮａＯＨを利用して、ｐＨが５を維持できるように調節したキトサン溶液を作った。ヒドロコーヒー酸（3,4-dihydroxy hydrocinnamic acid，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）５９１．０ｍｇとＥＤＣ（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）１２４４．９ｍｇを２５ｍＬの３次蒸溜水に溶解して、キトサン溶液にゆっくり入れた。反応が進行する間、ｐＨが５．５以下になるようにしてｐＨをモニタリングして１２時間常温で反応させた。透析膜（ＭＷＣＯ：１２，０００−１４，０００，ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ）を利用してｐＨ５の条件で２日間透析をして、４時間３次蒸溜水で透析を実施した。透析が完了した物質は、凍結乾燥後、水分がないデシケーターに保管した。核磁気共鳴分光法及び紫外線−可視光線分光光度計を利用して、カテコール結合率を確認した。カテコール基が結合したキトサンを核磁気共鳴分光法にて確認したグラフを下記図２に示し、キトサン１分子当たりカテコールの結合率は９．９％であることを確認した。

［製造例２］末端にチオール基が結合したポロキサマー（polaxamer）の製造
プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７）１０ｇをメチレンクロライド７０ｍＬに溶解して、２２１．２μＬのトリエチルアミンを添加してプルロニック溶液を製造した。製造されたプルロニック溶液をクロロギ酸ｐ−ニトロフェニル（p-nitrophenyl chloroformate）９８９．５ｍｇが溶解されているメチレンクロライド溶液１０ｍＬにゆっくりいれて、２４時間常温で撹はんした後、エバポレーターを利用して溶媒の体積を４０ｍＬになるように減らした。生成物を、ジメチルエーテルを利用して沈殿させた後、減圧乾燥してパウダー形態の活性化したプルロニックを製造した。活性化したプルロニック５ｇをメチレンクロライド２０ｍＬに溶解して、システアミン４２３．４ｍｇをメチレンクロライドとエタノールを１：１の体積比で混合した溶液３０ｍＬに溶解して、二つの溶液を混ぜて常温で２４時間撹はんした。撹はん後、生成物をジメチルエーテルを利用して沈殿させた後、減圧乾燥してパウダー形態を作製し、３次蒸溜水に溶解して膜（ＭＷＣＯ：３，５００，ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ）を利用した透析を９６時間実施して、合成及び精製された物質は、凍結乾燥後、水分がないデシケーターに保管した。核磁気共鳴分光法を利用してプルロニックに対するチオール基結合率を測定した。
チオール基が結合したプルロニックを、核磁気共鳴分光法をによって確認したグラフを下記図３に示し、プルロニック１分子当たりチオール基の結合率は７８％であることを確認した。

［実施例１］カテコール基が結合したキトサン／末端にチオール基が結合したプルロニック組成のヒドロゲルの製造
前記製造例１で製造されたカテコールが結合したキトサン０．１ｇをｐＨ７．４ ＰＢＳ（Phosphate buffered saline）緩衝溶液１０ｇに溶解してキトサン溶液を作製し、前記製造例２で製造された末端にチオール基が結合したプルロニック２．４ｇをｐＨ７．４ ＰＢＳ（Phosphate buffered saline）緩衝溶液１０ｇに溶解して、プルロニック溶液を作製した。前記キトサン溶液５ｇとプルロニック溶液５ｇとを混合してヒドロゲル溶液を製造した。
既に報告されたことバイアルチルティング（vial tilting）法を活用して、０℃から９０℃まで温度を１℃ずつ引き上げてゲル化現象を確認した。その結果４℃ないし３７℃で５分間肉眼で確認して動きがない状態のゲル状態になったヒドロゲルを製造した。

［実施例２］カテコール基が結合したキトサン／末端にチオール基が結合したプルロニック組成のヒドロゲルの製造
前記製造例１で製造されたカテコールが結合したキトサン０．１ｇをｐＨ７．４ ＰＢＳ（Phosphate buffered saline）緩衝溶液１０ｇに溶解してキトサン溶液を作製し、前記製造例２で製造された末端にチオール基が結合したプルロニック３．２ｇをｐＨ７．４ ＰＢＳ（Phosphate buffered saline）緩衝溶液１０ｇに溶解してプルロニック溶液を作製したことを除いては前記実施例１の操作を繰り返した。

［実施例３］カテコール基が結合したキトサン／末端にチオール基が結合したプルロニック組成のヒドロゲルの製造
前記製造例１で製造されたカテコールが結合したキトサン０．２ｇをｐＨ７．４ ＰＢＳ（Phosphate buffered saline）緩衝溶液１０ｇに溶解してキトサン溶液を作製し、前記製造例２で製造された末端にチオール基が結合したプルロニック２．４ｇをｐＨ７．４ ＰＢＳ（Phosphate buffered saline）緩衝溶液１０ｇに溶解してプルロニック溶液を作製したことを除いては前記実施例１の操作を繰り返した。

［実施例４］カテコール基が結合したキトサン／末端にチオール基が結合したプルロニック組成のヒドロゲルの製造
前記製造例１で製造されたカテコールが結合したキトサン０．２ｇをｐＨ７．４ ＰＢＳ（Phosphate buffered saline）緩衝溶液１０ｇに溶解してキトサン溶液を作製し、前記製造例２で製造された末端にチオール基が結合したプルロニック３．６ｇをｐＨ７．４ ＰＢＳ（Phosphate buffered saline）緩衝溶液１０ｇに溶解してプルロニック溶液を作製したことを除いては前記実施例１の操作を繰り返した。

［比較例１］キトサン組成のヒドロゲルの製造
前記製造例１で製造されたカテコール基が結合したキトサン及び前記製造例２で製造された末端にチオール基が結合したプルロニックに代えてキトサン（キトサン３００）を使うこと以外は、前記実施例１の操作を繰り返した。

［比較例２］カテコール基が結合したキトサン組成のヒドロゲルの製造
前記製造例２で製造された末端にチオール基が結合したプルロニックを使わないことを除いては前記実施例１と同様に行った。

［比較例３］プルロニック組成のヒドロゲルの製造
前記製造例１で製造されたカテコール基が結合したキトサン及び前記製造例２で製造された末端にチオール基が結合したプルロニックに代えてプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７）を使うこと以外は前記実施例１の操作を繰り返した。

［比較例４］末端にチオール基が結合したプルロニック組成のヒドロゲルの製造
前記製造例１で製造されたカテコールが結合したキトサンを使わないことを除いては前記実施例１と同様に行った。

［比較例５］キトサン／プルロニック組成のヒドロゲルの製造
前記製造例１で製造されたカテコール基が結合したキトサンの代りにキトサン（キトサン３００）を使って、前記製造例２で製造された末端にチオール基が結合したプルロニックの代りにプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７）を使うこと以外は前記実施例１の操作を繰り返した。

［比較例６］キトサン／末端にチオール基が結合したプルロニック組成のヒドロゲルの製造
前記製造例１で製造されたカテコール基が結合したキトサンの代りにキトサン（キトサン３００）を使うこと以外は前記実施例１の操作を繰り返した。

［比較例７］カテコール基が結合したキトサン／プルロニック組成のヒドロゲルの製造
前記製造例２で製造された末端にチオール基が結合したプルロニックの代りにプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７）を使うこと以外は前記実施例１の操作を繰り返した。

［試験例１］ヒドロゲルの生体外（in vitro）浸食測定
時間経過に伴うヒドロゲルの浸食程度を測定するために前記実施例１で製造されたヒドロゲル１ｍＬを２ｍＬチューブに入れて、ｐＨ７．４ ＰＢＳ １ｍＬを入れた後、残っているヒドロゲルの質量を最初のヒドロゲルの質量と比較して浸食度を測定した。ヒドロゲルの浸食は、ヒドロゲルの安定性を意味し、浸食が早く発生すると、短期間の治療が必要な場合の治療が容易になり、ヒドロゲルの浸食が遅くなると長期間の治療が必要な場合の治療が容易になる。実施例１で製造したヒドロゲルの場合、１２時間以後質量比で１００％が残って、１日後１００％、２日後９４．４３％、７日後８０．０９％、１４日後７２．０２％、３１日後に６６．８３％が残っていた。

［試験例２］ヒドロゲルの生体外浸食測定
前記実施例２で製造されたヒドロゲルを使ったことを除いては前記試験例１の操作を繰り返し、結果を確認した。１２時間以後質量比で１００％が残り、１日後１００％、２日後１００％、７日後１００％、１４日後１００％、３１日後に１００％が残っていた。

［試験例３］ヒドロゲルの生体外浸食測定
前記実施例３で製造されたヒドロゲルを使ったことを除いては前記試験例１と同様に行って結果を確認した。１２時間以後質量比で１００％が残り、１日後１００％、２日後１００％、７日後９５．９１％、１４日後６４．７６％、３１日後に２７．３０％が残っていた。

［試験例４］ヒドロゲルの生体外浸食測定
前記実施例３で製造されたヒドロゲルを使ったことを除いては前記試験例１の操作を繰り返し、結果を確認した。１２時間以後質量比で１００％が残り、１日後１００％、２日後１００％、７日後１００％、１４日後８０．２６％、３１日後に４２．３３％が残っていた。前記試験例１ないし４から本発明に係るヒドロゲルは、カテコール基が結合したキトサン及び末端にチオール基が結合したプルロニックの組成を変化させることによって浸食度を調節する可能性があることを確認した。

［比較試験例１］ヒドロゲルの生体外浸食測定
前記比較例３で製造されたヒドロゲルを使ったことを除いては前記試験例１の操作を繰り返し、結果を確認した。１２時間以後質量比で６０％が残り、１日後１７％、２日後４％、７日後０％、１４日後０％、３１日後に０％が残っていた。

［試験例５］ヒドロゲルの生体内（in vivo）浸食測定
生体内でのヒドロゲルの浸食度を測定するためにマウス皮下モデル（ＢＡＬＢ／ｃ、２１−２３ｇ、８ｗ、Ｍ）を導入した。前記実施例１で製造されたヒドロゲル５００μＬをマウス皮下に注入した後、時間に応じて残っているヒドロゲルの質量を最初のヒドロゲルの質量と比較して浸食度を測定した。生体外での浸食結果を基に生体内でヒドロゲルの安全性を測定してみた結果、実施例１で製造したヒドロゲルの場合、１日後質量比で１００％が残って、７日後１００％、１４日後８１．２８％、２５日後７５．０４％が残っていた。

［試験例６］ヒドロゲルの生体内浸食測定
前記実施例２で製造されたヒドロゲルを使ったことを除いては前記試験例５の操作を繰り返し、結果を確認した。１日後質量比で１００％が残り、７日後１００％、１４日後９８．６７％、２５日後９７．４５％が残っていた。
試験例５及び６から本発明に係るヒドロゲルは、カテコール基が結合したキトサン及び末端にチオール基が結合したプルロニックの組成を変化させることによって、浸食度を調節することができ、生体内でも優秀な安全性を持つことを確認することができた。

［比較試験例２］ヒドロゲルの生体内浸食測定
前記比較例３で製造されたヒドロゲルを使ったことを除いては前記試験例５の操作を繰り返し、結果を確認した。１日後質量比で３０％が残り、７日後０％、１４日後０％、２５日後０％が残っていた。

［試験例７］組織接着特性分析
組織接着特性を分析するために、ヒドロゲルホルダーと共に、１５０Ｎロードセル（load cell）が装着された万能材料試験機（ＵＴＭ，universal testing machine）を利用した。先にマウスの皮下組織を６ｍｍパンチを利用して針生検し、これは円筒形検出器に市販されている瞬間接着剤（cyanoacrylate glue）を利用して付着した。前記実施例１で製造されたヒドロゲル０．１ｇを万能材料試験機板上のホルダーに位置させ、皮下組織が付着した円筒形検出器を０．１ｍＮの力で５分間押した。ホルダーの部分の温度は３７℃に固定し、これを引っ張りながら引張強度を測定し、その結果を下記図４に示した。

［比較試験例３］組織接着特性分析
前記比較例１で製造されたヒドロゲルを使ったことを除いては前記試験例７の操作を繰り返し、その結果を下記図４に示した。

［比較試験例４］組織接着特性分析
前記比較例２で製造されたヒドロゲルを使ったことを除いては前記試験例７の操作を繰り返し、その結果を下記図４に示した。

［比較試験例５］組織接着特性分析
前記比較例３で製造されたヒドロゲルを使ったことを除いては前記試験例７の操作を繰り返し、その結果を下記図４に示した。

［比較試験例６］組織接着特性分析
前記比較例４で製造されたヒドロゲルを使ったことを除いては前記試験例７の操作を繰り返し、その結果を下記図４に示した。

［比較試験例７］組織接着特性分析
前記比較例５で製造されたヒドロゲルを使ったことを除いては前記試験例７の操作を繰り返し、その結果を下記図４に示した。

［比較試験例８］組織接着特性分析
前記比較例６で製造されたヒドロゲルを使ったことを除いては前記試験例７の操作を繰り返し、その結果を下記図４に示した。

［比較試験例９］組織接着特性分析
前記比較例７で製造されたヒドロゲルを使ったことを除いては前記試験例７の操作を繰り返し、その結果を下記図４に示した。

［試験例８］止血効果分析
生体内での止血効果を分析するためにラット（Ｎｏｒｍａｌ ＳＤ ｒａｔ、１８５−２００ｇ、５ｗ、Ｍ）の腹腔を切開して出血状態にある肝モデルを構築した。先に手術台の上にケタミン（Ketamine）を利用して麻酔させた後、開腹して重さが測定されたろ紙をパラフィルム上に乗せて、肝の下側に位置させる。対照群としては、１８Ｇ注射器を利用して肝に傷をつけて流血量を測定して、実験群では１８Ｇ注射器で傷をつけた後、直ちに前記実施例１で製造されたヒドロゲルを注入して流血量を測定し、その結果を下記図５に示した。

［比較試験例１０］止血効果分析
前記比較例２で製造されたヒドロゲルを使ったことを除いては前記試験例８の操作を繰り返し、その結果を下記図５に示した。

［比較試験例１１］止血効果分析
前記比較例４で製造されたヒドロゲルを使ったことを除いては前記試験例８の操作を繰り返し、その結果を下記図５に示した。

Claims (19)

1. （ｉ）カテコール基が結合したキトサンまたはポリアミン及び（ii）末端にチオール基が結合したポロキサマーを含むヒドロゲル組成物。
2. 前記カテコール基が結合したキトサンまたはポリアミンは、分子量が１０，０００Ｄａないし１，０００，０００Ｄａであることを特徴とする請求項１に記載のヒドロゲル組成物。
3. 前記カテコール基が結合したキトサンまたはポリアミンは、分子量が５０，０００Ｄａないし２００，０００Ｄａであることを特徴とする請求項１に記載のヒドロゲル組成物。
4. 前記ポロキサマーは、下記一般式２で表されるプルロニック、または下記一般式３で表されるテトロニックであることを特徴とする請求項１に記載のヒドロゲル組成物：
   

   

   （前記一般式（２）で、ａは２ないし２００の整数であり；ｂは１０ないし１００の整数であり；そしてａとｂとは、１：９ないし８：２の割合で存在する）
   

   

   （前記一般式（３）で、ａは２ないし６００の整数であり；ｂは１０ないし１５０の整数であり；そしてａとｂとは、１：９ないし９：１の割合で存在する）。
5. 前記カテコール基が結合したポリアミンは、エチレンジアミン、１，３−ジアミノプロパン、ヘキサメチレンジアミン、テトラエチルメチレンジアミン、プトレシン、カダベリン、スペルミジン、スペルミン、直鎖状ポリエチレンイミン、分岐状ポリエチレンイミン及びポリリジンからなる群から選択されるいずれか一つまたは二つ以上であることを特徴とする請求項１に記載のヒドロゲル組成物。
6. 前記カテコール基が結合したキトサンまたはポリアミンは、キトサンまたはポリアミンに対しカテコール基の結合率が１〜２０モル％であることを特徴とする請求項１に記載のヒドロゲル組成物。
7. 前記末端にチオール基が結合したポロキサマーは、ポロキサマーに対してチオール基の結合率が５０〜１００モル％であることを特徴とする請求項１に記載のヒドロゲル組成物。
8. 前記ヒドロゲル組成物は、治療用薬物をさらに含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載のヒドロゲル組成物。
9. 前記治療用薬物は、ヒト成長ホルモン、エリスロポエチン、インターフェロン、インスリン、インターロイキン、カルシトニン、Ｇ−ＣＳＦ、アンジオポイエチン、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ、モノクローナル抗体、抗体断片、止血蛋白質、抗生剤、鎮痛剤、狭心症治療剤、アレルゲンエキス、抗ヒスタミン、及び抗アレルギー剤からなる群から選択される一つ、または二以上であることを特徴とする請求項８に記載のヒドロゲル組成物。
10. 請求項１に記載のヒドロゲル組成物を含む止血剤。
11. （Ａ）カテコール基が結合したキトサンまたはポリアミンを製造する工程；
    （Ｂ）末端にチオール基が結合したポロキサマーを製造する工程；
    （Ｃ）緩衝溶液にカテコール基が結合したキトサンまたはポリアミンを溶解してカテコール−キトサン、またはカテコール−ポリアミン溶液を製造する工程；
    （Ｄ）緩衝溶液にチオール基が結合したポロキサマーを溶解してチオール−ポロキサマー溶液を製造する工程；
    （Ｅ）工程（Ｃ）のカテコール−キトサン、またはカテコール−ポリアミン溶液と工程（Ｄ）のチオール−ポロキサマー溶液とを混合して接着性ヒドロゲル溶液を製造する工程；及び
    （Ｆ）工程（Ｅ）の接着性ヒドロゲル溶液をゲル化させる工程；を含むヒドロゲルの製造方法。
12. 前記カテコール基が結合されたキトサンまたはポリアミンを製造する工程（Ａ）は、
    （ａ）蒸溜水１００重量部に対しキトサンまたはポリアミン０．２ないし５重量部を添加してキトサンまたはポリアミン溶液を製造する工程；
    （ｂ）蒸溜水１００重量部に対しヒドロコーヒー酸１ないし５重量部及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）−カルボイミド塩酸塩（ＥＤＣ）２ないし１０重量部を添加してヒドロコーヒー酸溶液を製造する工程；
    （ｃ）工程（ａ）のキトサンまたはポリアミン溶液と工程（ｂ）のヒドロコーヒー酸溶液とを１：１ないし３：１の体積比で混合及び撹はんして、カテコール基が結合したキトサンまたはポリアミン混合物を製造する工程；及び
    （ｄ）工程（ｃ）のカテコール基が結合したキトサンまたはポリアミン混合物を、透析膜を利用して緩衝溶液で６ないし４８時間透析して、カテコール基が結合したキトサンまたはポリアミンを精製して乾燥する工程；を含むことを特徴とする請求項１１に記載のヒドロゲルの製造方法。
13. 前記末端にチオール基が結合されたポロキサマーを製造する工程（Ｂ）は、
    （１）非極性有機溶媒１００重量部に対しポロキサマー５ないし１５重量部及び非極性有機溶媒１００体積部に対しトリエチルアミン０．１ないし１体積部を添加してポロキサマー溶液を製造する工程；
    （２）非極性有機溶媒１００重量部に対しクロロギ酸ｐ−ニトロフェニル５ないし２０重量部を添加してクロロギ酸ｐ−ニトロフェニル溶液を製造する工程；
    （３）工程（１）のポロキサマー溶液と工程（２）のクロロギ酸ｐ−ニトロフェニル溶液を５：１ないし１０：１の体積比で混合及び撹はんして、ポロキサマー混合溶液を製造する工程；
    （４）工程（３）のポロキサマー混合溶液を沈殿及び乾燥して、ポロキサマー混合物を製造する工程；
    （５）非極性有機溶媒及び極性溶媒の混合液１００重量部に対し工程（４）のポロキサマー５ないし２０重量部及びシステアミン０．２ないし５重量部を添加及び撹はんしてチオール基が結合したポロキサマー混合液を製造する工程；
    （６）工程（５）のチオール基が結合したポロキサマー混合液を沈殿及び乾燥して、チオール基が結合したプルロニック混合物を製造する工程；及び
    （７）工程（６）のチオール基が結合したポロキサマー混合物を、透析膜を利用して蒸溜水で１２ないし１２０時間透析して、チオール基が結合したプルロニックを精製して乾燥する工程；を含むことを特徴とする請求項１１に記載のヒドロゲルの製造方法。
14. 前記工程（Ｃ）のカテコール−キトサン、またはカテコール−ポリアミン溶液は、緩衝溶液１００重量％に対しカテコール基が結合したキトサンまたはポリアミン０．１ないし１０重量％を添加して製造されることを特徴とする請求項１１に記載のヒドロゲルの製造方法。
15. 前記工程（Ｄ）のチオール−ポロキサマー溶液は、緩衝溶液１００重量％に対しチオール基が結合したポロキサマー３ないし５０重量％を添加して製造されることを特徴とする請求項１１に記載のヒドロゲルの製造方法。
16. 前記工程（Ｅ）の接着性ヒドロゲル溶液は、カテコール−キトサン、またはカテコール−ポリアミン溶液とチオール−ポロキサマー溶液を１：３ないし３：１の体積比で混合して製造されることを特徴とする請求項１１に記載のヒドロゲルの製造方法。
17. 接着性ヒドロゲル溶液をゲル化させる前記工程（Ｆ）は、４ないし３７℃の温度で行うことを特徴とする請求項１１に記載のヒドロゲルの製造方法。
18. 前記工程（Ａ）のカテコール基は下記一般式（１）で表され；
    

    

    前記カテコール基が結合したキトサンまたはポリアミンは、分子量が１０Ｄａないし１，０００Ｄａであり、前記カテコール基が結合したポリアミンは、具体的には、エチレンジアミン、１，３−ジアミノプロパン、ヘキサメチレンジアミン、テトラエチルメチレンジアミン、プトレシン、カダベリン、スペルミジン、スペルミン、直鎖状ポリエチレンイミン、分岐状ポリエチレンイミン、ポリリジン及びポリ（アリルアミン塩酸塩）からなる群から選択されるいずれか一つまたは二つ以上であることを特徴とする請求項１２に記載のヒドロゲルの製造方法。
19. 前記工程（Ｂ）の前記するポロキサマーは、下記一般式２で表されるプルロニック、または下記一般式３で表されるテトロニックであることを特徴とする請求項１３に記載のヒドロゲル組成物の製造方法：
    

    

    （前記一般式（２）で、ａは２ないし２００の整数であり；ｂは１０ないし１００の整数であり；そしてａとｂとは、１：９ないし８：２の割合で存在する）
    

    

    （前記一般式（３）で、ａは２ないし６００の整数であり；ｂは１０ないし１５０の整数であり；そしてａとｂとは、１：９ないし９：１の割合で存在する）。

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