CN113365652A - 止血用组合物及包含该组合物的容器 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种包含胶原、稳定剂、凝血酶的止血用组合物及包含该组合物的容器，上述止血用组合物及包含该组合物的容器可通过简单的方法用于刻不容缓的出血患者，无毒性，不存在对血液的感染的问题，生物降解速度块，止血效果好，从而可有效用作止血剂。

Description

止血用组合物及包含该组合物的容器

技术领域

本申请主张基于2019年5月28日申请的韩国专利申请第10-2019-0062613号的优先权的利益，而公开于该韩国专利申请文献的所有内容作为本说明书的一部分包含在本说明书中。

本发明涉及止血用组合物及包含该组合物的容器。

背景技术

包括密封剂(Sealant)和止血剂(hemostats)在内的组织粘合剂领域的研究开发得到快速成长。自从1998年美国FDA许可血纤蛋白粘合剂(Fibrin sealant)以来，每年都不断开发出新的组织粘合剂。上述组织粘合剂作为能够替代在现有技术中用于外科或内科手术中的缝合术、夹闭术、灸术等技术的材料备受关注。

缝合术等现有的外科技术虽然具有强抗拉强度(strong tensile strength)，但存在引起患者的疼痛及术后去除等问题。相反，组织粘合剂虽然具有快速粘结，便于使用，术后无需去除等很多有点，但具有低粘合性及抗拉强度(low adhesiveness and tensilestrength)和存在水分时粘合性显著降低的局限性。为克服上述组织粘合剂的局限性，进行了持续的研究。

因组织粘结剂直接与组织接触，从而需要生物相容性。另外，在医疗用粘合剂的情况下，因通常用于人体内，当粘合本质上流入体液和血液中之后，人体直接干预，因此需要以更加严格的条件消除毒性和危害性，需要更加严密的生物相容性和生物可降解材料。

目前商用化及/或实用化的组织粘合剂大致有腈基丙烯酸脂瞬间粘合剂、纤维蛋白胶、明胶及聚氨酯系等。近来，腈基丙烯酸脂瞬间粘合剂在具备高功能性及高性能的瞬间粘合剂的研究方面备受关注。尤其是，生物相容性、柔韧性好及低毒性的组织缝合用医疗瞬间粘合剂，不仅起到止血、抗菌作用，还可以替代缝合线，因此以发达国家为中心积极开展研究。

上述腈基丙烯酸脂系瞬间粘合剂，目前已实现行业化的有Dermabond(Johnson&Johnson)和Indermil(US Surgical)等产品。上述腈基丙烯酸脂系瞬间粘合剂，虽然具有作为单一物质可在短时间内，在室温下无需起始剂通过水分固化，外观透明，粘合性腔的优点，但存在耐冲击性弱，耐热性低等缺点。另外，因毒性大，现在几乎不使用，虽然在除美国之外的其他国家部分用于临床，但因部分组织毒性和脆弱性，其使用得到限制。

另外，纤维蛋白胶粘合剂最初在1998年获得FDA在心外科方面的应用许可。之后，对纤维蛋白组织粘合剂的研究开发很活跃，目前已实现行业化的有Tisseel VH(Baxer)和Evicel TM(Johnson&Johnson)等产品。。纤维蛋白系组织粘合剂与腈基丙烯酸脂系一起占据大部分组织粘合剂时长。纤维蛋白组织粘合剂利用纤维蛋白的交联反应，将纤维蛋白原、凝血酶、氯化钙及酶的抑制剂作为组织粘合剂，应用于末梢神经的缝合、微血管的缝合等，实施替代或强化缝合的临床应用。上述纤维蛋白胶粘合剂具有不受粘合部位的水分的影响，快速粘合，不存在与血小板的凝固障碍，生物相容性好的优点。但是，具有粘合力弱，生物降解速度快，存在血液的感染危险的局限性。

另外，明胶作为来源于人体的组织粘合剂开发出明胶-间苯二酚-福尔马林(GRF)交联而成的组织粘合剂。其外，虽然开发出明胶-戊二醛等组织粘合剂，组织粘合性高，但存在因用作交联剂的福尔马林或戊二醛还与人体内的蛋白质发生交联反应，从而产生组织毒性的缺点。

另外，聚氨酯系粘合剂开发成固化后能够维持结合部的柔韧性的弹性粘合剂的形式。该粘合剂的特征是通过吸收人体组织表面的水提高与组织的粘着性，与水反应在数分钟内固化以使固化物具有柔韧性，具有固化的粘合剂适合生物降解的优点。但是，但具有作为合成原料的芳香族二异氰酸酯具有人体毒性的缺点。

另外，如“Avitene”(Alcon)、“Helitene”(Duhamed)等胶原单独成分的止血剂，虽然是非血液制剂但非常昂贵，作为单独成分五组织粘合效果，因此只用作止血剂。

另外，作为另一现有技术介绍有“Fibrin monomer based tissue adhesive，USPatent 5464471，1995”、“Hemostatic and tissue adhesive，US Patent 5883078，1999”、“Fibrinogen/chitosan hemostatic agents，US Patent 5773033，1998”、“Therapeu ticfibrinogen compositions，US Patent 5605887，1997”等，但这些在粘合性止血剂的产品中使用纤维蛋白原、凝血酶、血液凝固剂、抑肽酶等血液制剂及来源于牛的蛋白质等，从而存在由此引起的特定疾病的感染危险及因原料保障、存储、制造过程所需的过多的费用产品价格高的问题。

另外，包含明胶基质成分的FloSeal(Baxter)是使用最多的产品，是向明胶基质添加混合于氯化钙溶液的凝血酶以具有止血效果的产品。这尤其可用于在对除眼睛之外的部位的各种区域进行外科手术时，无法通过结扎(ligature)或一般的措施有效调节或不能调节的出血情况。但是，这大致分为凝血酶、明胶、氯化钙溶液三个部分，各溶液不能一次性混合，而是需要分两个步骤混合，因此需要一些时间。因此，在进行外科手术时，在出现严重的结扎及出血的争分夺秒的紧急状态下，没有按照复杂的产品说明书进行混合的充裕的时间，依次进行的过程有可能威胁刻不容缓的出血患者的生命，存在对于使用者来说非常繁琐的问题。

另外，上述止血用产品因用于人体，需提供对其成分的质量的最高的安全标准、储藏安全性及简单的使用方法。尤其是，在混合使用两种以上的成分的情况下，需制作成“即用(ready-to-use)”的形式，以易于混合的状态提供。

因此，需要开发出一种毒性非常小，易于储藏及使用，使用方法简单，可用于刻不容缓的患者，生物降解性好的止血剂。

先行技术文献

【专利文献】

(专利文献1)美国专利注册5464471号

(专利文献2)美国专利注册5773033号

(专利文献3)美国专利注册5605887号

发明内容

发明要解决的问题

为解决上述问题，本发明人开发出包含胶原、稳定剂、凝血酶的止血用组合物及包含该组合物的容器，其可通过简单的方法用于刻不容缓的出血患者，无毒性，不存在对血液的感染的问题，生物降解速度块，止血效果好，以此完成本发明。

因此，本发明的目的在于提供一种包含胶原、稳定剂、凝血酶的止血用组合物及包含该组合物的容器。

本发明的另一目的在于，提供一种包含填充有上述止血用组合物的第一容器及填充有稀释液的第二容器的套盒。

本发明的又一目的在于，提供一种利用上述止血用套盒制造的水凝胶。

解决问题的方法

为达到上述目的，根据本发明的一方面，提供一种包含胶原、稳定剂及凝血酶的粉末剂形式的止血用组合物，其中，上述胶原和凝血酶相邻而设。

更具体而言，本发明提供一种包含胶原粉末的第一层、包含稳定剂粉末的第二层及包含凝血酶粉末的第三层在容器内分层填充的止血用组合物，其中，上述包含胶原粉末的第一层和包含凝血酶粉末的第三层相邻而设及/或上述包含稳定剂粉末的第二层设置于最先与稀释液混合的位置。

上述止血用组合物可按稳定剂、凝血酶、胶原或稳定剂、胶原、凝血酶的顺序安排；或可按凝血酶、胶原、稳定剂或胶原、凝血酶、稳定剂的顺序安排。

更具体而言，上述止血用组合物可按包含稳定剂粉末的第二层、包含凝血酶粉末的第三层、包含胶原粉末的第一层或包含稳定剂粉末的第二层、包含胶原粉末的第一层、包含凝血酶粉末的第三层的顺序安排，或可按包含凝血酶粉末的第三层、包含胶原粉末的第一层、包含稳定剂粉末的第二层或包含胶原粉末的第一层、包含凝血酶粉末的第三层、包含稳定剂粉末的第二层的顺序安排。

在上述止血用组合物中，上述胶原为交联胶原。

在上述止血用组合物中，上述交联胶原通过如下制造方法制得，包括：

S1)用乙醇或甲醇处理胶原的步骤；

S2)向经上述S1)步骤处理的胶原添加酸以制造pH2～4的胶原溶液的步骤；

S3)将从上述S2)步骤制得的胶原溶液弄成中性状态之后，离心分离制造酯化胶原的步骤；

S4)向从上述S3)步骤制得的酯化胶原添加交联剂以制造交联胶原的步骤；及

S5)将从上述S4)步骤制得的交联胶原分散于净化水之后，进行冷冻干燥的步骤。

在上述止血用组合物中，上述交联胶原的分子量为100,000至1,000,000Dalton。

在上述止血用组合物中，相对于上述止血用组合物的总重量，包含上述胶原40至97重量％。

在上述止血用组合物中，上述稳定剂为从由白蛋白(human serum albumin)、甘露醇、醋酸钠(C₂H₃NaO₂)、蔗糖、海藻糖、山梨醇及甘氨酸构成的组中选择的一种以上。

在上述止血用组合物中，上述稳定剂为甘露醇。

在上述止血用组合物中，相对于上述止血用组合物的总重量，包含上述稳定剂1至30重量％。

在上述止血用组合物中，相对于上述止血用组合物的总重量，包含上述凝血酶2至50重量％。

根据本发明的另一方面，提供包含上述止血用组合物的容器。

根据本发明的另一方面，提供一种止血用套盒，包括：第一容器，填充有包含胶原、稳定剂及凝血酶的粉末剂形式的止血用组合物；及第二容器，填充有稀释液；在上述第一容器中，上述胶原和凝血酶相邻而设。

更具体而言，本发明提供一种止血用套盒，包括：第一容器，填充有分层填充包含胶原粉末的第一层、包含稳定剂粉末的第二层及包含凝血酶粉末的第三层的止血用组合物；及第二容器，填充有稀释液；在上述第一容器中，上述包含胶原粉末的第一层和包含凝血酶粉末的第三层相邻而设，而包含稳定剂粉末的第二层设置于最先与稀释液混合的位置。

在上述止血用套盒中，上述稀释液为从由氯化钙(CaCl₂)溶液、氯化钠(NaCl)溶液、人血清白蛋白(human serum albumin)及醋酸钠(C₂H₃NaO₂)溶液构成的组中选择的一种以上。

在上述止血用套盒中，上述稀释液为氯化钙溶液；相对于上述稀释液的总重量，包含上述氯化钙0.001至30重量％。

在上述止血用套盒中，在上述止血用套盒中，第一容器和第二容器相互结合，以使止血用组合物和稀释液混合形成水凝胶；上述水凝胶的平均气孔大小为50μm至200μm。

在上述止血用套盒中，上述水凝胶的pH为6至8。

在上述止血用套盒中，在上述第一容器中，按稳定剂、凝血酶、胶原或稳定剂、胶原、凝血酶的顺序填充；或按凝血酶、胶原、稳定剂或胶原、凝血酶、稳定剂的顺序填充。

更具体而言，在上述第一容器中可按包含稳定剂粉末的第二层、包含凝血酶粉末的第三层、包含胶原粉末的第一层或包含稳定剂粉末的第二层、包含胶原粉末的第一层、包含凝血酶粉末的第三层的顺序填充，或可按包含凝血酶粉末的第三层、包含胶原粉末的第一层、包含稳定剂粉末的第二层或包含胶原粉末的第一层、包含凝血酶粉末的第三层、包含稳定剂粉末的第二层的顺序填充。

在上述止血用套盒中，上述胶原为交联胶原。

在上述止血用套盒中，上述交联胶原通过如下制造方法制得，包括：

S1)用乙醇或甲醇处理胶原的步骤；

S2)向经上述S1)步骤处理的胶原添加酸以制造pH2～4的胶原溶液的步骤；

S3)将从上述S2)步骤制得的胶原溶液弄成中性状态之后，离心分离制造酯化胶原的步骤；

S4)向从上述S3)步骤制得的酯化胶原添加交联剂以制造交联胶原的步骤；及

S5)将从上述S4)步骤制得的交联胶原分散于净化水之后，进行冷冻干燥的步骤。

在上述止血用套盒中，上述交联胶原的分子量为100,000至1,000,000Dalton。

在上述止血用套盒中，相对于上述止血用组合物的总重量，包含上述胶原40至97重量％。

在上述止血用套盒中，上述稳定剂为从由白蛋白(human serum albumin)、甘露醇、醋酸钠(C₂H₃NaO₂)、蔗糖、海藻糖、山梨醇及甘氨酸构成的组中选择的一种以上。

在上述止血用套盒中，上述稳定剂为甘露醇。

在上述止血用套盒中，相对于上述止血用组合物的总重量，包含上述稳定剂1至30重量％。

在上述止血用套盒中，相对于上述止血用组合物的总重量，包含上述凝血酶2至50重量％。

发明效果

本发明的包含胶原、稳定剂、凝血酶的止血用组合物的止血效果好。

另外，本发明的包含胶原、稳定剂、凝血酶的止血用组合物，因稳定凝血酶的活性，从而易于保管，而且因能够以低的重量混合组合物，可方便快捷使用。

另外，包含本发明的包含胶原、稳定剂、凝血酶的止血用组合物的容器，可方便快捷使用，而且，因无毒性，不存在对血液的感染的问题，生物降解速度块，与血液接触时膨胀，膨胀率大，因此止血效果好。

因此，本发明的止血用组合物及包含该组合物的容器可用作止血套盒。

附图概述

图1为将实施例1及比较例1与氯化钙溶液混合时，测量随混合次数所需力获得的曲线图；

图2为对将实施例1及比较例1与氯化钙溶液混合制得的各水凝胶的SEM图像；

图3为测量对实施例1及比较例1的各膨胀率获得的曲线图；

图4为测量对实施例1及比较例1的各面积变化量获得的曲线图；

图5为将实施例1及比较例1各用于大鼠肾脏切除模型并测量止血所需时间获得的曲线图；

图6为表示将实施例1及比较例1各用于大鼠肾脏切除模型之后的止血能力的图像。

最佳实施方式

下面，对本发明的实施例进行详细说明。但是，不限于示例，本发明不受示例的限制，本发明只通过将要后述的权利要求书的范围被定义。

在详细说明本发明的过程中，若认为对相关已公开功能或结构的具体说明有碍于对本发明的理解，则将省略其详细说明。

在说明本发明的构成要素时，可使用第一、第二、A、B、(a)、(b)等术语。上述术语只是用于区分一个构成要素和另一构成要素，而相应构成要素的本质或顺序不受上述术语的限制。

在说明本发明的过程中，表示程度的术语“约”、“实际上”、“程度”等用于在所提及的意思中公开固有的制造及物质允许误差时，接近其数值的意思，其目的在于防止不道德的侵权人不恰当使用为帮助理解提及正确或绝对的数值的内容。

本发明提供一种包含胶原、稳定剂及凝血酶的粉末剂形式的止血用组合物，其中，上述胶原和凝血酶相邻而设。

具体而言，上述止血用组合物可按稳定剂、凝血酶、胶原或稳定剂、胶原、凝血酶的顺序填充；或可按凝血酶、胶原、稳定剂或胶原、凝血酶、稳定剂的顺序填充。上述止血用组合物使用时可与稀释液混合使用，此时，较佳地，上述止血用组合物在最先与稀释液混合的位置安排稳定剂，因此，较佳地，按稳定剂、凝血酶、胶原或稳定剂、胶原、凝血酶的顺序安排。

本发明的止血用组合物可以是粉末剂形式的各成分层状叠加的形式。具体而言，是包含胶原粉末的第一层、包含稳定剂粉末的第二层及包含凝血酶粉末的第三层在容器内分层填充的止血用组合物，其中，上述包含胶原粉末的第一层和包含凝血酶粉末的第三层可相邻而设，或进而上述包含稳定剂粉末的第二层可设置于最先与稀释液混合的位置。因此，上述止血用组合物可按包含稳定剂粉末的第二层-包含凝血酶粉末的第三层-包含胶原粉末的第一层或包含稳定剂粉末的第二层-包含胶原粉末的第一层-包含凝血酶粉末的第三层的顺序安排，或可按包含凝血酶粉末的第三层-包含胶原粉末的第一层-包含稳定剂粉末的第二层或包含胶原粉末的第一层-包含凝血酶粉末的第三层-包含稳定剂粉末的第二层的顺序安排。

上述胶原包含于止血用组合物，通过吸收出血部位的血液，拉动血小板起到止血作用。另外，上述胶原在与血小板附着时，不是在什么的都没有的状态下结合，而是与作为起到如粘合剂的作用的物质的vWF(von Willebrand's factor)结合，以促进血小板与作为存在于细胞表面上的膜糖蛋白的GPIb/IX复合体的结合，从而实现第一次止血。

上述胶原可以是对各种动物的组织进行酸或碱性处理，或进行胃蛋白酶等的酶处理提取的蛋白质。

相对于上述止血用组合物的总重量，可包含上述胶原40至97重量％。此时，若包含40重量％以下，则有可能降低止血额效果，而若包含97重量％以上，则因包含相对少的上述凝血酶及稳定剂，降低整体止血用组合物的化学稳定性或降低止血效果。

另外，上述胶原可以是交联胶原，此时，较佳地，交联胶原的分子量为100,000至1,000,000Dalton，但非限制。若上述交联胶原的分子量小于100,000Dalton，则因虽然血液吸收力块但血液凝固满，有可能降低止血效果，而若超过1,000,000Dalton，则血液吸收力有可能显著降低。

上述交联胶原可通过化学交联法、物理交联法或它们的组合制得，此时通过化学交联法制得的交联胶原为利用交联剂自我交联结合(crosslinking)的胶原。另外，通过物理交联法制得的交联胶原是通过干热处理、紫外线照射、伽马线照射交联的胶原。

在此，上述交联剂可以是从由Formaldehyde、Glutaraldehyde、Carbodiimides(EDC)、Polyepoxy compounds构成的组选择的一种以上的交联剂。较佳为Carbodiimides(EDC)，但非限制。

上述交联胶原因机械强度好，能实现物理压迫止血效果，从而可止住大出血。

上述交联胶原可以是交联酯化胶原获得的胶原。

在本发明的一实施例中，上述交联胶原通过如下制造方法制得，包括：

S1)用乙醇或甲醇处理胶原的步骤；

S2)向经上述S1)步骤处理的胶原添加酸以制造pH2～4的胶原溶液的步骤；

S3)将从上述S2)步骤制得的胶原溶液弄成中性状态之后，离心分离制造酯化胶原的步骤；

S4)向从上述S3)步骤制得的酯化胶原添加交联剂以制造交联胶原的步骤；及

S5)将从上述S4)步骤制得的交联胶原分散于净化水之后，进行冷冻干燥的步骤。

上述S1)步骤为用乙醇或甲醇处理胶原的步骤，是将胶原溶解于乙醇或甲醇以易于后续混合交联剂的步骤，是制造胶原溶液的步骤。

在上述S1)步骤前，还可包括将动物皮肤组织用酸性溶液进行处理以提取缺端胶原的步骤。

上述S2)步骤为向经上述S1)步骤处理的胶原添加酸以制造pH2～4的胶原溶液的步骤，是向胶原溶液添加酸以使胶原成为完全溶解于乙醇或甲醇的状态的步骤。

上述S3)步骤为将从上述S2)步骤制得的胶原溶液弄成中性状态之后，离心分离制造酯化胶原的步骤，是去除由位于胶原的两末端的约12～27个氨基酸构成的飞螺旋结构的端肽(telopeptide)，酯化去除上述端肽的部分的步骤。在此，端肽被认为是向人体内投入胶原时引起免疫反应的主要原因，因此，较佳地，在用作医药品等的原料时，去除端肽使用缺端胶原或酯化胶原，以避免免疫反应。

上述S3)步骤可以是对形成中性状态的胶原溶液进行胃蛋白酶处理以取出端肽，第一次制造具有酯官能团的酯化胶原之后，利用离心分离器分离高纯度的酯化胶原的步骤。

此时，较佳地，上述离心分离以1,000rpm至30,000rpm执行5分钟至3小时以只被酯化胶原侵削，但非限制。

在此，上述分离高纯度的酯化胶原的方法，包括：

(a)在容器内准备包含去除端肽的缺端胶原的试料的步骤；

(b)执行使上述包含缺端胶原的试料从上述容器流入具备过滤膜的过滤模块，向上述过滤模块施加压力以使上述试料在经过滤膜过滤的超滤过程的步骤；

(c)收集通过上述超滤过程，经上述过滤膜过滤并从上述过滤模块流出的酯化胶原溶液的步骤；

(d)测量经过滤膜过滤的酯化胶原溶液的流量，以确定超滤速度的步骤；

(e)当上述超滤速度减少至一定速度以下，则停止上述超滤过程的步骤；

(f)向上述试料中未能通过上述过滤膜回到上述容器的残留物添加水之后，使其流入上述具备过滤膜的过滤模块以执行渗滤过程的步骤；

(g)收集通过上述渗滤过程，经上述过滤膜过滤并从上述过滤模块流出的酯化胶原溶液的步骤；

(h)重复上述(f)步骤和上述(g)步骤的步骤。

在上述(b)步骤中，通过利用泵的抽吸作用使包含缺端胶原的试料从上述容器流入上述具备过滤膜的过滤模块，向上述过滤模块可施加约10～30psi的压力。

在上述(e)步骤中，当上述超滤速度减少至约1g/分钟以下，则停止上述超滤过程。

在上述(f)步骤中，可向回到上述容器的残留物添加与通过超滤过程过滤的溶液相同的量的净化水。

较佳地，上述(f)步骤及(g)步骤中的渗滤过程至少执行5次。

因此，可通过上述(a)至(h)步骤，在酯化缺端胶原的同时，获得高纯度的酯化胶原。

另外，上述S4)步骤为向从上述S3)步骤制得的酯化胶原添加交联剂以制造交联胶原的步骤，是交联酯化胶原，以提供在具备物理压迫止血效果的同时，不发生免疫反应的交联胶原的步骤。

另外，如上所述，上述S4)步骤中的交联剂可以是从由Formaldehyde、Glutaraldehyde、Carbodiimides(EDC)、Polyepoxy compounds构成的组选择的一种以上的交联剂，在此不再赘述。

上述S5)步骤为将从上述S4)步骤制得的交联胶原分散于净化水之后，进行冷冻干燥的步骤，是去除残留在交联胶原中的未去除交联剂及缺端胶原的胶原的步骤。因此，上述S5)步骤将从上述S4)步骤制得的交联胶原分散于净化水，以将未去除微量的交联剂及缺端胶原的胶原溶解于净化水，并通过冷冻干燥，在溶解于净化水的状态下冷冻去除。另外，此时冷冻条件可以是用于该技术领域的通常的方法。

上述稳定剂包含于止血用组合物，以稳定上述凝血酶的活性，而且在与稀释液混合时，以低重量快速混合组合物。因此，通过使上述稳定剂包含于止血用组合物，在将具有强止血效果的胶原和凝血酶与稀释液混合时，以低重量快速混合的同时，可通过非活性物质保证维持止血用组合物的化学稳定性及生物活性。

上述稳定剂为从由白蛋白(human serum albumin)、甘露醇、醋酸钠(C₂H₃NaO₂)、蔗糖、海藻糖、山梨醇及甘氨酸构成的组中选择的一种以上。

此时，上述稳定剂包含从由白蛋白、甘露醇及醋酸钠构成组中选择的一种以上，从而可维持凝血酶的化学稳定性及生物活性。

另外，上述稳定剂包含从由甘露醇、醋酸钠、蔗糖、海藻糖、山梨醇及甘氨酸构成的组中选择的一种以上，从而可抑制止血时间的延长，维持血液凝固活性。

另外，上述稳定剂包含从由甘露醇、醋酸钠、蔗糖、海藻糖、山梨醇及甘氨酸构成的组中选择的一种以上，从而可以低重量快速混合组合物。

较佳地，上述稳定剂为甘露醇，但非限制。

上述甘露醇为广泛存在于蘑菇、石榴的根等植物的白色的针状或柱状结晶，易溶于水，也用作泄剂，用作甘油的替代剂。

尤其是，上述甘露醇大幅提高干燥粉末的重组速度，维持重组的粉末的一惯性，减少干燥粉末的吸湿性以减少粉末间的凝聚强度，从而增加粉末的流动性。

相对于上述止血用组合物的总重量，可包含上述稳定剂1至30重量％。此时，若包含小于1重量％，则难以维持上述胶原和凝血酶的化学稳定性及生物活性，在与稀释液混合时因需要高重量而降低混合便利性，而若包含30重量％以上，则因包含相对少的上述胶原及凝血酶，降低整体止血用组合物的止血效果。

上述凝血酶包含于止血用组合物，其作为强力的止血因子参与血液凝固，在水解血液中的可溶性纤维蛋白原变换为不溶性的纤维蛋白的反应中起到催化剂的作用。另外，上述凝血酶在作为第二次止血过程的利用血液的凝固因子的活性形成纤维素的过程中，可诱导血小板的活性。

相对于上述止血用组合物的总重量，可包含上述凝血酶2至50重量％。此时，若包含2重量％以下，则有可能降低止血额效果，而若包含50重量％以上，则因包含相对少的上述胶原及稳定剂，降低整体止血用组合物的化学稳定性或降低止血效果。

上述止血用组合物可以是粉末剂形式，较佳地，干燥粉末剂形式的止血用组合物为制造成不容易被外部环境及水分变质为液体状态的粉末剂形式。上述止血用组合物为粉末剂形式，可通过各成分具有化学稳定性，容易维持不相互混合的状态。另外，具有使用及保管容易的优点。

根据本发明的另一实施例，可提供包含上述止血用组合物的容器。

此时，包含上述止血用组合物的容器因处于填充有胶原、稳定剂及凝血酶的状态，使用风阀非常简单，从而具有能够用于刻不容缓的出血患者的优点。尤其是，在进行外科手术时，在出现严重的结扎及出血的紧迫的状态、争分夺秒的状态，只需与稀释液混合立即用于出血部位，从而不仅提高使用者的便利性，而且具有使用方法非常简单，以至于即使不是专业技术人员也能容易使用。

根据本发明的又一方面，提供一种止血用套盒，包括：第一容器，填充有包含胶原、稳定剂及凝血酶的止血用组合物；及第二容器，填充有稀释液；在上述第一容器中，上述胶原和凝血酶相邻而设。

因上述止血用套盒利用前述的止血用组合物，胶原、稳定剂及凝血酶也一样，因此，在此不再赘述。

上述第一容器填充有止血用组合物，胶原和凝血酶相邻而设，安排顺序不会受外力影响改变。另外，根据填充于上述第一容器的胶原、稳定剂、凝血酶的安排顺序，不仅改变后续与稀释液混合形成的流动性(flowability)，而且还改变膨胀率及膨胀速度。因此，上述第一容器可按稳定剂、凝血酶、胶原或稳定剂、胶原、凝血酶的顺序填充；或可按凝血酶、胶原、稳定剂或胶原、凝血酶、稳定剂的顺序填充。上述止血用组合使用时可与稀释液混合使用，此时，在上述止血用组合物中，通过结合填充有止血用组合物的第一容器和填充有稀释液的第二容器混合止血用组合和稀释液，此时，较佳地，上述止血用组合物在最先与稀释液混合的位置安排稳定剂。因此，较佳地，在第一容器中，考虑到与稀释液混合的位置，止血用组合物从与稀释液结合的第一容器的喷嘴开始，按稳定剂、凝血酶、胶原或稳定剂、胶原、凝血酶的顺序安排。

上述第二容器填充有稀释液，此时稀释液用于溶解或分散上述第一容器的止血用组合物，可用作溶媒或分散介质。例如，为从由氯化钙(CaCl₂)溶液、氯化钠(NaCl)溶液、人血清白蛋白(human serum albumin)及醋酸钠(C₂H₃NaO₂)溶液构成的组中选择的一种以上。较佳地，为氯化钙溶液或氯化钠溶液，但非限制。

在上述稀释液为氯化钙溶液时，相对于上述稀释液的总重量，可包含上述氯化钙0.001至30重量％，只要是属于与上述止血用组合物容易混合的范围重量％没有特别的限制。

上述第一容器或第二容器的形状及材料没有特别的限制，可以是医药及生物技术领域通常使用的。例如，上述第一容器或第二容器的形状为注射器，而上述第一容器或第二容器的材料为不与从胶原、稳定剂及凝血酶中选择的某一个发生化学反应的材料。

另外，上述止血用套盒可使第一容器和第二容器相互结合，以使止血用组合物和稀释液混合形成水凝胶。

为使上述第一容器和第二容器相互结合，在第一容器的前端部具备结合突起，而第二容器具备结合槽以与具备于第一容器的前端部的结合突起结合。

另外，上述水凝胶为多孔性，在用作止血剂时血液吸收率高，在吸收血液之后也能维持水凝胶的形态，不影响止血效果，从而能够表现出优秀的止血效果。

另外，上述水凝胶的平均气孔大小可为50μm至200μm。若平均气孔大小小于50μm，则血液吸收率减少，而若超过200μm，则在吸收血液之后不能维持水凝胶的形态，从而有可能降低止血效果。

另外，上述水凝胶的形成时间为5秒至5分钟，因此可在争分夺秒的紧迫状态下能够止住严重的结扎及出血。另外，因可在短时间内形成水凝胶，从而易于用户使用。

上述水凝胶通过混合止血用组合物和稀释液具有中性状态的pH，从而在用于人体时可确保生物相容性及生物安全性。与此同时，毒性少，可具有感染安全性。因此，上述水凝胶的pH可为6至8。

作为本发明的另一形式，提供用于出血部位的止血或流血伤口(bleeding wound)治疗的上述止血用组合物的用途(use)。

作为本发明的又一形式，提供包括用上述止血用组合物对需要止血的个体进行处理或治疗的步骤的止血方法。在本发明中，“个体”包括身体的一部分出血，从而需要止血的人在内的所有动物，可使用本发明的止血用组合物对上述个体进行处理、治疗、应用或给药，实现有效止血。

具体实施方式

下面，对本发明较佳实施例及实验例进行说明，以帮助更好地理解本发明。但是，下述实施例仅用以说明本发明而非限制，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明进行修改、变形或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

制造例1：制造酯化胶原粉末

通过下述过程制造酯化胶原粉末：

①向乙醇添加胶原之后，在冷藏状态下进行搅拌；

②利用0.5M的HCl将试料的pH调节为6.7±0.3；

③将上述溶液投入dialysis tubing，利用净化水进行透析；

④对上述溶液进行冷冻及冷冻干燥或侧酯化胶原粉末。

制造例2：制造交联胶原粉末

通过下述过程制造交联胶原粉末：

①将从上述制造例1制得的酯化胶原投入净化水中进行搅拌；

②向充分搅拌的酯化胶原溶液添加EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide)；

③充分搅拌以使EDC与酯化胶原充分反应；

④在冷藏状态下静置2～3天；

⑤将交联固化的交联胶原溶液投入净化水中进行分散；

⑥静置上述交联胶原溶液，发生层分离时，只取交联胶原，溶液扔掉；

⑦重复3～5次上述⑥的过程获得交联胶原；

⑧向Buffer(sodium phosphate/sodium chloride)投入交联胶原，在冷藏状态下静置1～2天以中和Buffer。

⑨中和Buffer之后，净化水洗涤，冷冻及冷冻干燥胶原；

⑩将结束冷冻干燥的上述试料投入blender研磨；

用筛过滤上述粉末，筛选200～355μm大小的粒子。

实验例1：确认流动性(Flowability)

用于按照止血用组合物内作为稳定剂的甘露醇、凝血酶和胶原安排的顺序，确认在与作为稀释液的氯化钙溶液混合时的流动性的差异，按如下表1准备实施例。此时，甘露醇及凝血酶为粉末形式，使用市售的产品，而交联胶原使用从上述制造例2获得的物质。

【表1】

区分	安排顺序
		实施例1	甘露醇-凝血酶-交联胶原
实施例2	甘露醇-交联胶原-凝血酶
		实施例3	凝血酶-交联胶原-甘露醇
实施例4	交联胶原-凝血酶-甘露醇
		比较例1	凝血酶-甘露醇-交联胶原

上表1所示的实施例1至4及比较例1，测量通过下述方法混合时所需力并将其结构示于表2。

1)准备两个注射器，一个注射器从注射器的喷嘴到入口一侧按与上述实施例1至4及比较例1相同的安排顺序填充各成分，相对于注射器内填充的成分的重量，填充交联胶原90重量％，甘露醇5重量％，凝血酶5重量％。另外，剩余一个注射器填充10％的氯化钙溶液。

2)连接两个注射器(相互旋转筒末端进行结合)。

3)利用机器固定(夹住)填充有实施例1或比较例1的注射器(male type)。

4)利用机器推动填充有氯化钙溶液的注射器(female type)的推杆，将氯化钙溶液推入填充有实施例或比较例1的注射器。测量此时所需的力并标注为N1。

5)变更注射器的位置，在机器上固定(夹住)注射器。

6)推动填充有混合内容物的注射器(male type)的推杆，将混合内容物推入空注射器。测量此时所需的力并标注为N2。

7)重复5)～6)测量混合时所需力。在此，测量每次执行6)步骤时所需的力(N3、N4、...、N20)。

【表2】

如上表2所示，比较例1及实施例1混合所需的力，即混合时产生的压力的大小类似。即比较例1和实施例1的最大重量，在两组中都在N4中急剧减少，大体上减少至N20，这表明在N4之后内容物的整体混合结束，混合时产生的压力逐渐减少并变得相同。实验结果表明，不仅在按凝血酶-甘露醇-交联胶原顺序填充的比较例1，在按甘露醇-凝血酶-交联胶原的顺序安排的实施例1的情况下，也可减少混合所需的压力，保证原材料混合均匀。

另外，不仅在实施例1中，在按甘露醇-交联胶原-凝血酶的顺序安排的实施例2的情况下，也获得与实施例1类似的结果，而在按凝血酶-交联胶原-甘露醇的顺序安排的实施例3和交联胶原-凝血酶-甘露醇的顺序安排的实施例4的情况下，较之实施例1及2，混合时产生的压力的大小稍大。

实验例2：通过SEM(Scanning Electron Microscope)确认微细结构

在执行实施例1之后，利用SEM获得对与氯化钙溶液混合的比较例1及实施例1的微细结构图像。该图像如图2所示。

如上图2所示，不仅在按凝血酶-甘露醇-交联胶原的顺序填充的比较例1，在按甘露醇-凝血酶-交联胶原的顺序安排的实施例1中，也可确认微细密集的多孔性膜结构。因此，不仅在按凝血酶-甘露醇-交联胶原的顺序填充的情况，还在按甘露醇-凝血酶-交联胶原的顺序安排的情况下，也在与氯化钙溶液混合后，通过多孔性结构具有帮助吸收血液，凝固止血的多孔性膜结构。

实验例3：确认膨胀率及面积变化量

为确认根据本发明的止血用组合物在与稀释液混合后表现出来的膨胀率和面积变化量，首先按记载于上述实验例1的表1记载的方式，各准备比较例1及实施例1。各测量准备的比较例1及实施例1的粒子面积。之后，将各试料与氯化钙溶液混合后，按1、2、3、5、10、20、30分钟的间隔测量粒子面积并计算器面积变化量和膨胀率。其结果如图3及图4所示。

膨胀率(％)＝((单位时间稀释粉末的面积-干燥粉末的面积)/干燥粉末的面积)×100

如图3及图4所示，比较例1和实施例1在最初1分钟内急剧膨胀，持续膨胀到2、3、5、10分钟，而10分钟之后面积变化量达到饱和状态。

实验例4：分解度试验

为对包含于根据本发明的止血用组合物内的胶原的生物分解性及分解度进行测量，以确认是否具有生物相容性，是否因分解度低而具有感染危险性，实施分解度试验。首先，准备上述实施例1及比较例1的交联胶原，测量各试料重量。之后，将各试料投入micro-centrifuge tube，调价包含25units/mL的胶原分解酶(Collagenase)的1XPBS buffer 1～2mL，直至填满。将盛有试料的tube放入37℃water bath静置24～72小时。经过24、48、72小时之后，取出试料冷冻干燥之后称重。通过下述计算式利用分解度试验前后测量的试料的重量计算剩余重量比。其结果如表3所示。

剩余重量比(％)＝(分解度试验后试料的干燥重量/分解度试验前试料的干燥重量)×100

【表3】

可确认比较例1及实施例1的交联胶原，在72小时之内通过胶原分解酶使试料几乎完全分解。因此，即使如在本发明中那样，将凝血酶和胶原相邻而设，因交联胶原在相同条件下具有快速分解能力，因此可确认生物分解性高，感染危险性很少。

实验例5：大鼠肾脏切除模型中比较止血性能

为确认根据本发明的止血用组合物的止血能力，与上述实验例1一样，准备实施例1及比较例1。止血能力的比较利用大鼠的肾脏切除模型。切割肾脏引起出血之后，使用实施例1或比较例1并实施30秒钟的止血压迫，之后确认出血与否，发生出血则追加重复30秒钟的止血压迫。测量止血所需时间并将结果示于图5，而止血过程如图6所示。

如上述图5所示，在止血所需时间方面，实施例1为月68秒，而比较例1为约45秒。因此，即使如本发明那样将凝血酶和胶原相邻而设，也具有卓越的止血能力。

上述说明仅用于示例性地说明本发明，本发明所属技术领域的技术人员应当理解本发明可在不脱离本发明本质特征的前提下，可以变形的形式实现。因此，所公开的实施例及实验例应从说明的观点进行考虑，而非从限制的观点进行考虑。本发明的范围示于上述说明或权利要求书中，而属于与其相同范围内的所有差异应当被理解为属于本发明的范围之内。

Claims (25)

1.一种包含胶原、稳定剂及凝血酶的粉末剂形式的止血用组合物，其特征在于：上述胶原和凝血酶相邻而设。

2.根据权利要求1所述的止血用组合物，其特征在于：

上述止血用组合物按稳定剂、凝血酶、胶原或稳定剂、胶原、凝血酶的顺序安排；或

按凝血酶、胶原、稳定剂或胶原、凝血酶、稳定剂的顺序安排。

3.根据权利要求1所述的止血用组合物，其特征在于：上述胶原为交联胶原。

4.根据权利要求3所述的止血用组合物，其特征在于：

上述交联胶原通过如下制造方法制得，包括：

S1)用乙醇或甲醇处理胶原的步骤；

S2)向经上述S1)步骤处理的胶原添加酸以制造pH2～4的胶原溶液的步骤；

S3)将从上述S2)步骤制得的胶原溶液弄成中性状态之后，离心分离制造酯化胶原的步骤；

S4)向从上述S3)步骤制得的酯化胶原添加交联剂以制造交联胶原的步骤；及

S5)将从上述S4)步骤制得的交联胶原分散于净化水之后，进行冷冻干燥的步骤。

5.根据权利要求3所述的止血用组合物，其特征在于：上述交联胶原的分子量为100,000至1,000,000Dalton。

6.根据权利要求1所述的止血用组合物，其特征在于：

相对于上述止血用组合物的总重量，包含上述胶原40至97重量％。

7.根据权利要求1所述的止血用组合物，其特征在于：上述稳定剂为从由白蛋白(humanserum albumin)、甘露醇、醋酸钠(C₂H₃NaO₂)、蔗糖、海藻糖、山梨醇及甘氨酸构成的组中选择的一种以上。

8.根据权利要求7所述的止血用组合物，其特征在于：上述稳定剂为甘露醇。

9.根据权利要求1所述的止血用组合物，其特征在于：相对于上述止血用组合物的总重量，包含上述稳定剂1至30重量％。

10.根据权利要求1所述的止血用组合物，其特征在于：相对于上述止血用组合物的总重量，包含上述凝血酶2至50重量％。

11.一种包含权利要求1至10的任一项所述的止血用组合物的容器。

12.一种止血用套盒，包括：

第一容器，填充有包含胶原、稳定剂及凝血酶的粉末剂形式的止血用组合物；及

第二容器，填充有稀释液；

在上述第一容器中，上述胶原和凝血酶相邻而设。

13.根据权利要求12所述的止血用套盒，其特征在于：上述稀释液为从由氯化钙(CaCl₂)溶液、氯化钠(NaCl)溶液、人血清白蛋白(human serum albumin)及醋酸钠(C₂H₃NaO₂)溶液构成的组中选择的一种以上。

14.根据权利要求13所述的止血用套盒，其特征在于：

上述稀释液为氯化钙溶液；

相对于上述稀释液的总重量，包含上述氯化钙0.001至30重量％。

15.根据权利要求12所述的止血用套盒，其特征在于：

在上述止血用套盒中，第一容器和第二容器相互结合，以使止血用组合物和稀释液混合形成水凝胶；

上述水凝胶的平均气孔大小为50μm至200μm。

16.根据权利要求15所述的止血用套盒，其特征在于：上述水凝胶的pH为6至8。

17.根据权利要求12所述的止血用套盒，其特征在于：

在上述第一容器中，按稳定剂、凝血酶、胶原或稳定剂、胶原、凝血酶的顺序填充；或

按凝血酶、胶原、稳定剂或胶原、凝血酶、稳定剂的顺序填充。

18.根据权利要求12所述的止血用套盒，其特征在于：上述胶原为交联胶原。

19.根据权利要求18所述的止血用套盒，其特征在于：

上述交联胶原通过如下制造方法制得，包括：

S1)用乙醇或甲醇处理胶原的步骤；

S2)向经上述S1)步骤处理的胶原添加酸以制造pH2～4的胶原溶液的步骤；

S3)将从上述S2)步骤制得的胶原溶液弄成中性状态之后，离心分离制造酯化胶原的步骤；

S4)向从上述S3)步骤制得的酯化胶原添加交联剂以制造交联胶原的步骤；及

S5)将从上述S4)步骤制得的交联胶原分散于净化水之后，进行冷冻干燥的步骤。

20.根据权利要求18所述的止血用套盒，其特征在于：上述交联胶原的分子量为100,000至1,000,000Dalton。

21.根据权利要求12所述的止血用套盒，其特征在于：相对于上述止血用组合物的总重量，包含上述胶原40至97重量％。

22.根据权利要求12所述的止血用套盒，其特征在于：上述稳定剂为从由白蛋白(humanserum albumin)、甘露醇、醋酸钠(C₂H₃NaO₂)、蔗糖、海藻糖、山梨醇及甘氨酸构成的组中选择的一种以上。

23.根据权利要求22所述的止血用套盒，其特征在于：上述稳定剂为甘露醇。

24.根据权利要求12所述的止血用套盒，其特征在于：相对于上述止血用组合物的总重量，包含上述稳定剂1至30重量％。

25.根据权利要求12所述的止血用套盒，其特征在于：相对于上述止血用组合物的总重量，包含上述凝血酶2至50重量％。

Images