KR20230054283A - 페리틴 가교 방식을 도입한 지속적 자가 치유가 가능한 안정화된 카테콜기 수식 하이드로젤 - Google Patents

Abstract

본 발명은 지속적인 자가 치유가 가능한 카테콜(Catechol)기로 수식된 하이드로젤 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 페리틴(Ferritin) 단백질을 매개로 하는 카테콜기 수식 고분자의 가교 및 하이드로젤 형성 방법과 이를 이용한 조직공학적 응용 방법을 포함한다. 본 발명의 카테콜기 수식 하이드로젤은 페리틴 가교 방식을 도입하였으며, 페리틴의 철 이온을 반복적으로 방출, 저장하는 셔틀 효과를 통해 카테콜기와 Fe³⁺이온 간 배위 결합이 제한 없이 가역적으로 형성되며, 이를 통해 지속적인 자가 치유 능력을 갖는 하이드로젤을 제공할 수 있다. 또한, 공존하는 카테콜기 간 비가역적 공유 결합에 의해 수용액 상에서도 안정적으로 구조가 장기간 유지될 수 있다는 장점이 있으며, 이를 통해 카테콜기 수식 고분자 하이드로젤의 조직공학 및 의료적 적용 범위를 넓힐 수 있다.

Description

페리틴 가교 방식을 도입한 지속적 자가 치유가 가능한 안정화된 카테콜기 수식 하이드로젤 {Ferritin-mediated crosslinking for catechol-functionalized polymer hydrogel with prolonged self-healing ability and stability}

본 발명은 지속적인 자가 치유가 가능한 카테콜(Catechol)기로 수식된 하이드로젤 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 페리틴(Ferritin) 단백질을 매개로 하는 카테콜기 수식 고분자의 가교 및 하이드로젤 형성 방법과 이를 이용한 조직공학적 응용 방법을 포함한다.

생명공학 및 의학 분야의 연구가 확장되고 관련 기술이 발전할수록 새로운 기능과 다양한 용도로 복합 적용이 가능한 생체고분자 하이드로젤에 대한 의료적 시장 수요가 급격히 확대되고 있다. 이에, 히알루론산 하이드로젤 분야의 기술 연구는 상업화를 통한 고부가가치의 창출이 가능한 분야로 주목 받고 있다.

카테콜기로 수식된 고분자 하이드로젤은 우수한 생체적합성과 접착성을 가짐에 따라 조직공학, 의공학분야 등 여러 분야에서 각광받는 재료로서 적용되고 있다. 이는 홍합 접착 시스템을 모사한 것으로서, 독성이 매우 적고 약물 탑재 능력이 우수하여 세포 배양, 이식 및 약물 전달 등에 활용될 수 있다는 특징이 있다.

이때 고분자에 수식된 카테콜기를 가교 시키기 위해 산화제를 이용한 산화 반응 또는 철 이온과의 결합을 이용하고 있다. 그러나 이러한 산화 가교 방법의 경우 비가역적 공유 결합이 형성되므로 구조적으로는 안정할 수 있으나, 형성된 하이드로젤에 손상이 가해졌을 때 손상을 스스로 회복하는 자가 치유(Self-healing) 능력이 없어 그 응용에 한계가 있다는 문제가 있다. 즉, 젤을 형성한 뒤 주사로 주입하는 경우와 같이 젤 구조에 영향을 주는 과정이 있거나 하이드로젤 블록 조립 또는 3D 바이오 프린팅을 통한 복잡한 구조체 제작에는 적용되기 어려우며 피로와 심한 균열이 발생할 수 있는 환경에서는 수명이 제한적이다.

또한 철 이온과의 가역적 배위 결합을 통한 가교 방법은 제형에 손상이 가해져도 그 손상을 스스로 회복하는 자가 치유 능력을 갖도록 하지만, 자가 치유 지속 시간이 한정적이고 수용액 상에서 철 이온과의 결합이 해리됨에 따라 구조적으로 불안정해지기 때문에, 세포 배양, 약물 전달 등 수분 환경이 요구되는 경우에는 적용하기 어려운 적용에 한계가 있다. 따라서 카테콜기 기반 하이드로젤의 기존 한계점을 극복하여 적용 분야를 확장할 수 있는 새로운 가교 시스템이 요구되고 있다.

한국공개특허공보 제10-2013-0055847호

본 발명에서는 이러한 종래 가교 시스템의 한계점을 극복하기 위해 페리틴 단백질을 도입해 카테콜기 수식 고분자 내에 공유결합 및 철 이온 배위결합을 동시에 유도하는 새로운 가교 시스템을 개발하고자 하였다. 페리틴은 세포 내의 대표적인 철 저장 단백질로서 인체 내 거의 모든 세포에서 발현된다. 페리틴은 4500개의 철 이온을 저장할 수 있는 공간(Cavity)을 형성하는 24개의 소단위체들로 구성되며, 주된 기능은 인체 내 유리된 독성이 있는 Fe²⁺ 이온을 불용성의 Fe³⁺ 이온으로 산화시켜 내부에 보유함으로써 가역적 배위결합을 형성하여 세포를 보호하고, 철 이온을 필요로 할 때는 환원제로서 Fe²⁺ 상태로 다시 환원시켜 페리틴 외부로 방출, 공급하는 역할을 담당할 수 있다. 이러한 페리틴의 철 이온 셔틀(Shuttle) 기능은 카테콜기 수식 고분자의 가교에 활용될 수 있다. 또한, 카테콜기는 퀴논(Quinone)으로 산화되어 공유 결합이 형성될 수 있으므로 하나의 가교제로 두가지 방식의 결합이 동시에 공존하는 가교 시스템을 구축할 수 있었다.

또한 이러한 특징으로 인해 페리틴으로 가교된 카테콜기 수식 고분자 하이드로젤은 기존의 산화제 또는 철 이온으로 가교된 카테콜기 수식 하이드로젤이 가지지 못하였던 수분 환경에서의 장기간 구조적 안정성과 지속적인 자가 치유(Self-healing) 능력을 동시에 보여줄 수 있다.

이를 위해, 본 발명은 철 이온을 포함하는 페리틴 단백질 및 카테콜기가 수식된 고분자 물질을 포함하는, 하이드로젤 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 하이드로젤 조성물을 포함하는, 3차원 구조체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 하이드로젤 조성물을 포함하는, 인공 장기 또는 인공 조직의 제조용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 하이드로젤 조성물을 포함하는, 약물 전달용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 하이드로젤 조성물의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 양상은 철 이온을 포함하는 페리틴 단백질 및 카테콜기가 수식된 고분자 물질을 포함하는, 하이드로젤 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 하나의 양상은, 상기 하이드로젤 조성물을 포함하는, 3차원 구조체를 제공한다.

본 발명의 다른 하나의 양상은, 상기 하이드로젤 조성물을 포함하는, 인공 장기 또는 인공 조직의 제조용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 하나의 양상은, 상기 하이드로젤 조성물을 포함하는, 약물 전달용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 하나의 양상은, 상기 하이드로젤 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 카테콜기 수식 하이드로젤은 페리틴 가교 방식을 도입하였으며, 페리틴의 철 이온을 반복적으로 방출, 저장하는 셔틀 효과를 통해 카테콜기와 Fe³⁺이온 간 배위 결합이 제한 없이 가역적으로 형성되며, 이를 통해 지속적인 자가 치유 능력을 갖는 하이드로젤을 제공할 수 있다. 또한, 공존하는 카테콜기 간 비가역적 공유 결합에 의해 수용액 상에서도 안정적으로 구조가 장기간 유지될 수 있다는 장점이 있으며, 이를 통해 카테콜기 수식 고분자 하이드로젤의 조직공학 및 의료적 적용 범위를 넓힐 수 있다.

도 1은 페리틴 단백질을 적용한 카테콜기 수식 고분자의 새로운 가교 시스템 개발 과정에 관한 것이다.
도 2는 페리틴의 철 이온 저장능력을 확인한 결과에 관한 것이다.
도 3은 카테콜기에 의한 페리틴의 철 이온 방출 효과를 확인한 것이다.
도 4는 가교 방식의 차이가 기계적 물성에 영향을 미치는지 여부를 확인한 것이다.
도 5 내지 7은 페리틴에 의한 카테콜기 수식 고분자 가교 메커니즘을 확인한 것이다.
도 8 및 9는 페리틴 가교 시스템의 자가 치유 (self-healing) 능력을 확인한 것이다.
도 10은 하이드로젤 블록 조립을 통한 3차원 구조체 형성에 관한 것이다.
도 11은 Fe³⁺ 이온과 산화제 혼합물을 이용한 가교 테스트 결과에 관한 것이다.
도 12는 페리틴 기반 가교가 다양한 카테콜 수식 고분자들에 대한 새로운 가교방식으로 활용될 수 있음을 확인한 것이다.
도 13은 가교 방식에 따른 카테콜기 수식 히알루론산 고분자 하이드로젤의 접착력을 확인한 것이다.

이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

실시예들에 대한 특정한 구조적 또는 기능적 설명들은 단지 예시를 위한 목적으로 개시된 것으로서, 다양한 형태로 변경되어 실시될 수 있다. 따라서, 실시예들은 특정한 개시형태로 한정되는 것이 아니며, 본 명세서의 범위는 기술적 사상에 포함되는 변경, 균등물, 또는 대체물을 포함한다.

본 발명의 하나의 양태는, 철 이온을 포함하는 페리틴 단백질 및 카테콜기가 수식된 고분자 물질을 포함하는, 하이드로젤 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 페리틴은 헤모글로빈과 더불어 체내에서 철의 주요한 저장물질로서, 비장, 간, 골수 등 세망내피계에 많이 존재하는 것으로 알려져 있다. 페리틴은 거의 구상의 단백으로서, 가운데에　3가의 철을 둘러싸고 있다.

본 발명에 있어서, 상기 고분자 물질은 다당류 고분자 물질일 수 있고, 상기 다당류 고분자 물질은 히알루론산, 알지네이트, 셀룰로오스, 펙틴 또는 콘드로이틴 설페이트로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 페리틴 단백질은, 환원제로서 Fe²⁺ 이온을 방출하여 상기 고분자 물질 간 공유결합을 유도하거나, 및/또는 킬레이트제로서 내부에 Fe³⁺ 이온을 포함하여 상기 고분자 물질에 수식된 카테콜기와 배위 결합을 형성하는 것일 수 있다. 본 발명의 페리틴으로 가교된 카테콜 수식 하이드로젤은 카테콜 수식 히알루론산 하이드로젤에서 산화에 의한 카테콜-카테콜(dicatechol) 공유 결합과, 카테콜-Fe³⁺(catechol/Fe tri-complex) 배위 결합을 동시에 가질 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 하이드로젤 조성물은 고분자 물질이 히알루론산인 경우, 히알루론산 분해효소를 처리하였을 때 pH 7 내지 pH 9의 조건에서 철 이온 방출 정도가 65 내지 75%인 것일 수 있다. 이는 중성, 염기성 조건에서 모두 카테콜 그룹이 페리틴으로부터 철 이온 방출을 유도할 수 있으며 특히 페리틴의 생물학적 역할인 철 이온 저장/방출 능력이 약한 염기성 환경에서 카테콜 수식 고분자의 가교 시스템으로서 활용 가능함을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 하이드로젤 조성물은 탄성 모듈러스(Elastic modulus)의 값이 250 내지 350, 270 내지 330, 290 내지 310 또는 300Pa인 것일 수 있다. 이러한 페리틴 매개 가교 방식에 따른 본 발명의 하이드로젤 조성물은 물성 측면에서 안정적인 하이드로젤 구조를 형성, 유지할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 하이드로젤 조성물은 수용액을 더 포함하거나 수용액 상태인 것일 수 있다. Fe³⁺ 이온으로 가교시킨 하이드로젤은 수용액에 담그게 되면 그 구조가 유지되지 못할 수 있으나, 본 발명의 하이드로젤 조성물은 카테콜-Fe³⁺ 결합뿐 아니라 안정한 공유결합도 동시에 유도하여, 수용액에 담그게 되더라도 그 구조가 일정하게 유지될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 하이드로젤 조성물은 외부의 물리적 자극 (외력) 또는 시간 경과에 따른 결합력 약화 또는 분해에 대해 저항하는, 자가 치유능을 갖는 것일 수 있다. 이러한 자가 치유능은 13 내지 17 시간, 14 내지 16시간 또는 15시간 동안 유지되는 것일 수 있다. 본 발명에 있어서 '자가 치유능'은 외력 또는 시간 경과에 따른 조성물의 결합력 약화에 대해 저항하거나, 약화된 결합력을 회복하거나, 분해, 분리된 상태에서 다시 응집되는 조성물의 안정성과 복원력을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 하이드로젤 조성물은 세포를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 세포는 성체세포, 줄기세포 또는 생식세포일 수 있고 이에 제한되지 않으나 구체적으로 인간 지방 유래 줄기세포인 것일 수 있다. 본 발명의 상기 하이드로젤 조성물은 이에 포함된 세포가 배양기간 동안 높은 생존율을 보이며 하이드로젤 구조도 잘 유지가 된다는 장점이 있다.

본 발명에 있어서, 상기 하이드로젤 조성물은 유변학 분석 장비(Rheometer)를 이용한 Tack test 모드에서, 6 내지 8, 또는 7N의 접착력을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태로서, 상기 하이드로젤 조성물을 포함하는, 또는 이로 구성된 3차원 구조체를 제공한다.

본 발명의 다른 하나의 양태는, 카테콜기 수식 고분자 하이드로젤 조성물의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 상기 제조방법은, 고분자 물질을 포함하는 용액과 페리틴 용액을 혼합하는 단계; 및 pH를 조절하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 제조방법에 있어서, 상기 고분자 물질을 포함하는 용액과 페리틴 용액은 1:50의 중량비로 포함되는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태는, 상기 페리틴 단백질 및 카테콜기가 수식된 고분자 물질을 포함하는, 하이드로젤 조성물의 용도를 제공한다. 구체적으로, 상기 용도는 장기/조직 유사 구조체(인공 장기, 인공 조직)의 제조용, 약물 전달용, 생체 이식용, 3D 바이오 프린팅용, 또는 세포 배양용인 것일 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태는, 상기 페리틴 단백질 및 카테콜기가 수식된 고분자 물질을 포함하는, 장기/조직 유사 구조체(인공 장기, 인공 조직)의 제조용, 약물 전달용, 생체 이식용, 3D 바이오 프린팅용, 또는 세포 배양용 하이드로젤 조성물을 제공한다.

상기 구조체, 제조방법, 용도에 있어서, 상기 페리틴, 카테콜기, 고분자 물질, 하이드로젤 등에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.

본 발명의 페리틴을 매개로 하는 카테콜기 수식 고분자 가교 시스템은 지속적인 자가 치유 능력과 더불어 수용액 상에서의 우수한 구조적 안정성, 생체적합성을 보유하여, 이미 형성 되어있는 하이드로젤 시장 (약물전달, 세포치료제, 창상치료용 드레싱 등)뿐 아니라 기존 개발된 하이드로젤로 적용되지 못한 새로운 조직공학 및 의공학 분야에도 적극 활용되어 새로운 기술 응용이 이루어질 수 있을 것으로 예상된다. 예컨대, 본 발명에서 제시된 자가 치유 능력을 활용한 삼차원 조직 유사체 조립 기술은 수많은 바이오 프린팅 기술로도 아직 완벽히 구현하지 못한 인공장기 개발의 성공 가능성을 크게 높일 수 있을 것으로 기대된다.

또한, 본 발명의 페리틴을 이용하는 가교 방식은 카테콜기가 수식된 다양한 고분자, 구체적으로 알긴산, 키토산, 셀룰로오스, 펙틴에도 마찬가지로 적용 가능하므로, 기존의 카테콜기 수식 고분자 한계점을 극복한 다양한 용도로 활용될 수 있는 생체소재로서 응용이 가능하다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 페리틴 단백질 (Ferritin)을 이용한 카테콜기 수식 고분자의 새로운 가교 시스템 개발

카테콜기로 수식된 고분자의 새로운 가교 시스템을 개발하기 위해, 페리틴 단백질을 적용하고자 하였다.

카테콜이 수식된 고분자는 산화제(NaIO₄)의 산화작용을 통한 카테콜-카테콜(dicatechol) 결합 또는 Fe³⁺ 이온과의 상호작용을 통한 카테콜-Fe³⁺(Catechol/Fe tri-complex) 결합으로 인해 가교가 이루어짐을 확인하였다 (도 1a). 세포 내 대표적인 철 저장 단백질인 페리틴은 내부에 Fe³⁺ 이온을 포함하고 있으며 환원제(reductant) 또는 킬레이트제(chelator) 존재 하에 Fe²⁺ 이온을 방출할 수 있으므로, 환원제와 킬레이트제로서 역할을 동시에 수행할 수 있음을 확인하였으며, 이를 통해 카테콜 수식 고분자 가교에 활용해 두 가지 카테콜 가교 메커니즘을 동시에 갖는 가교 시스템을 개발하였다 (도 1b).

페리틴으로 가교된 히알루론산 하이드로젤의 구체적인 제조 과정으로서, 200 kDa 히알루론산 고분자 용액과 50 mg/mL Ferritin 용액을 1:50 비율로 혼합하고, 0.4 M NaOH로 pH를 조절하여 최종 2% 히알루론산 하이드로젤을 제작하였다. 이후 다른 가교제(FeCl₃ 또는 NaIO₄)로 가교시킨 히알루론산 하이드로젤의 경우에도 동일한 2% 농도로 제작하여 비교 분석을 진행하였다.

그 결과, 내부에 철 이온이 함유된 페리틴 단백질과 철 이온이 부재한 페리틴인 아포페리틴 (apoferritin) 단백질을 이용해 카테콜 수식 히알루론산 고분자의 가교를 유도했을 때, 페리틴 단백질이 처리된 경우에만 하이드로젤이 형성됨을 확인하였으며, 따라서 단백질 내 철 이온이 가교에 핵심 역할을 담당한다는 사실을 확인하였다 (도 1c).

실시예 2: 페리틴의 철 이온 저장능력 확인

페리틴의 철 이온 저장능력을 확인하기 위해, FeCl₃ 용액을 이용해 가교시킨 하이드로젤 표면 위에 아포페리틴, 페리틴, 소혈청 알부민 (bovine serum albumin; BSA - 단백질 control 그룹), 인산완충생리식염수 (phosphate buffered saline; PBS - 용매 control 그룹)를 각각 소량 (20 μL) 처리한 뒤, 시간에 따른 하이드로젤 형태 변화를 관찰하였다. 그 결과, 아포페리틴 처리군의 경우 10분 후부터 하이드로젤 형태가 무너지는 것을 확인하여, 하이드로젤 가교가 적절히 이루어지지 않았으며 안정성이 낮음을 확인하였다 (도 2a).

상기 결과에 대한 정량적 분석을 위해, 유변학 분석을 통해 각 용액 처리 전 후 하이드로젤의 기계적 물성을 측정하였다. 그 결과, 용액 처리 전과 비교 시, 처리해준 용액이 하이드로젤 내부로 흡수됨에 따른 팽윤 효과(swelling effect)로 인해 하이드로젤의 기계적 강도가 약 50% 감소함을 확인하였다 (도 2b, c). 그러나 아포페리틴을 처리해준 그룹에서는 팽윤 효과를 넘어서는 수준으로 매우 크게 탄성계수가 감소함을 확인하였으며, 이는 아포페리틴이 본연의 생물학적 역할대로 하이드로젤 가교에 이용된 철 이온을 포집, 저장함으로써 하이드로젤 내 철 이온과 카테콜기 간의 반응을 통해 형성된 고분자 네트워크에 영향을 주고 구조적 안정성을 감소시켰음을 의미한다. 반면, 이미 철 이온을 함유하고 있는 페리틴은 포화상태로 존재하여 더 이상 철 이온을 흡수하지 않기에 하이드로젤 내 고분자 네트워크에 영향을 주지 않음을 알 수 있다.

실시예 3: 카테콜기에 의한 페리틴의 철 이온 방출 효과 확인

페리틴을 이용한 카테콜 수식 히알루론산 고분자의 가교 유도 시 페리틴 내부에 있는 철 이온이 방출되어 가교에 참여하였음을 증명하기 위해, 페리틴을 이용해 형성시킨 하이드로젤을 히알루론산 분해효소 (hyaluronidase; 100 U/mL)를 처리하여 분해하고, 그 용액을 증류수에 대해 24시간 동안 투석(dialysis, 3500 Da 이하 분자량 차단 membrane 이용)을 진행하여 분해된 히알루론산 조각 및 철 이온 등을 제거함으로써 페리틴 단백질을 수거하였다. ICP-MS 분석 (유도결합 플라즈마 질량분석법)을 통해 수거된 페리틴 내부에 남아있는 철 이온의 양을 측정하였다. 또한, pH가 철 이온 방출에 영향을 주는지 확인하기 위해 두 가지 pH 조건에서 (pH 7, 9) 하이드로젤을 제작하여 분석하였다.

그 결과, 카테콜 수식 히알루론산 하이드로젤 형성을 유도할 때 사용한 동일한 양의 페리틴 단백질을 기준으로 약 70%의 철 이온이 카테콜 그룹에 의해 페리틴으로부터 방출되었음을 확인하였으며, 철 이온 방출 정도는 pH 7과 pH 9 조건에서 차이가 없었음을 확인하였다. 중성 (pH 7) 환경에서는 페리틴에 의해 하이드로젤이 형성되지는 않았지만 비슷한 양의 철 이온이 카테콜기에 의해 방출됨을 확인함으로써 기존 FeCl₃ 가교 문헌들에서 보여준 pH 환경에 따른 가교양상과 동일한 결과를 보였다.

따라서 이러한 결과는 중성, 염기성 조건에서 모두 카테콜 그룹이 페리틴으로부터 철 이온 방출을 유도할 수 있으며 특히 페리틴의 생물학적 역할인 철 이온 저장/방출 능력이 약한 염기성 환경에서 카테콜 수식 고분자의 가교 시스템으로서 활용 가능함을 보여준다(도 3).

실시예 4: 가교된 하이드로젤의 기계적 강도 확인

가교 방식의 차이가 기계적 물성에 영향을 미치는지 확인하고자 하였다. 그 결과 페리틴에 의해 가교된 하이드로젤은 NaIO₄으로 가교된 하이드로젤과 유사한 물성을 보였으며 (도 4), 이는 페리틴 매개 가교 방식이 기존에 산업 및 연구분야에서 적용되고 있는 가교 방식과 비교하여 물성적인 측면에서 큰 차이 없이 안정적인 하이드로젤을 형성할 수 있음을 나타낸다.

실시예 5: 페리틴에 의한 카테콜기 수식 고분자 가교 메커니즘의 확인: 철 이온과의 상호작용에 의한 배위결합과 산화에 의한 공유결합의 공존

페리틴을 이용한 카테콜기 수식 고분자 하이드로젤의 형성 과정에 관여하는 화학적 결합을 확인하기 위해 UV-vis spectroscopy 분석을 진행하였다. 페리틴으로 가교된 카테콜 수식 히알루론산 하이드로젤에서 산화에 의한 카테콜-카테콜(dicatechol) 결합을 나타내는 피크 (464 nm)와 Fe³⁺에 의한 카테콜-Fe³⁺(catechol/Fe tri-complex) 결합을 나타내는 피크 (492 nm)를 모두 포괄하는 넓은 파장 영역 (460~510 nm)의 피크가 관찰되었다 (도 5a). 이는 페리틴으로 가교된 카테콜 수식 하이드로젤이 두 가지 결합 모두를 포함하고 있음을 나타낸다.

또한, 라만 분광법으로도 카테콜-Fe³⁺ 결합으로 인해 생기는 피크가 페리틴을 이용해 가교 시킨 하이드로젤에서 검출됨을 확인하였다 (도 5b).

카테콜-Fe³⁺ 결합은 수용액 상태에서 Fe³⁺ 이온이 카테콜 대신 물분자와 결합을 이루게 되므로 그 결합이 깨지게 되며, 따라서 Fe³⁺ 이온으로 가교시킨 하이드로젤은 수용액에 담그게 되면 그 구조가 유지되지 못할 수 있다. 따라서 페리틴, 산화제 (NaIO₄), FeCl₃로 각각 하이드로젤을 형성시킨 뒤 PBS 내에 넣고 거동을 관찰하였다. 그 결과 FeCl₃을 통해 Fe³⁺ 이온으로 가교시킨 하이드로젤은 3시간 안에 구조가 완전히 무너진 반면, 페리틴으로 가교시킨 하이드로젤은 산화제에 의해 가교된 하이드로젤과 마찬가지로 10일까지도 구조가 잘 유지됨을 확인함으로써, 페리틴에 의한 가교 방식은 카테콜-Fe³⁺ 결합 뿐 아니라 안정한 공유결합도 동시에 유도할 수 있음을 확인하였다 (도 6a, b).

다음으로, 페리틴을 이용해 카테콜기 기반 하이드로젤을 제작하고 제작 직후 및 3시간 이후에 강한 철 이온 킬레이트제인 EDTA를 처리하여 하이드로젤 내부 결합들이 유지되는지 관찰하였다. 그 결과, 가교 직후에는 아무런 처리가 없는 PBS 조건에서와 달리 EDTA 용액이 처리되었을 때 10분 이내 하이드로젤 내 가교가 완전히 풀리는 것을 확인하였는데, 가교 후 3시간 지난 하이드로젤의 경우, 16시간까지도 EDTA에 의해 가교가 완전히 풀리지 않은 것을 확인함으로써 가교 초기에는 철 이온에 의한 배위결합이 빠르게 일어나고 순차적으로 산화에 의한 공유결합이 뒤이어 일어남을 확인하였다 (도 7).

실시예 6: 페리틴 가교 시스템의 자가 치유 (self-healing) 능력 확인

FeCl₃, NaIO₄ 및 페리틴을 이용해 가교시킨 하이드로젤의 자가 치유 능력을 확인하기 위해 하이드로젤 형성 후 도넛 형태로 가운데에 원형의 홀을 만들어 자가 치유 양상을 거시적으로 관찰하였다. 그 결과, 예상대로 산화제 NaIO₄에 의해 공유결합으로만 가교된 하이드로젤은 자가 치유가 되지 않은 반면, 철 이온에 의한 배위결합을 갖는 FeCl₃ 및 페리틴을 이용해 가교된 하이드로젤은 10분 내외로 완전히 자가 치유됨을 확인하였다 (도 8a).

또한, 서로 다른 가교 방식으로 제작된 두 가지 하이드로젤을 붙인 뒤 다시 분리하는 실험을 진행한 결과, 철 이온 결합에 의해 자가 치유 능력을 갖는 하이드로젤 간에만 (FeCl₃ 및 페리틴) 결합이 일어남을 확인하였다 (도 8b).

이를 통해 페리틴으로 카테콜 수식 히알루론산(HA-CA) 가교 유도 시 HA-CA의 카테콜 그룹이 페리틴이 함유하고 있던 철 이온과 배위결합을 갖는다는 것을 재차 확인할 수 있었으며 그로 인해 자가치유능을 갖는 것을 확인하였다.

다음으로, FeCl₃ 또는 페리틴을 이용해 가교 시킨 하이드로젤의 지속적인 자가 치유 능력 유지 시간을 비교하기 위해 유변학적 분석을 실시하였다 (도 9a, c). 하이드로젤 형성 직후, 3시간, 7시간, 15시간 뒤, rheometer(레오미터)를 이용해 변형률 값을 1%와 1000%에서 일정시간 번갈아 가며 자가 치유 성능을 평가하였다.

그 결과, FeCl₃을 이용해 가교 시킨 하이드로젤은 가교 후 7 시간 뒤부터 서서히 자가 치유 능력을 잃기 시작하였으며 15시간 후엔 원래 구조로 회복이 되지 않음을 확인하였다 (도 9a). Fe³⁺ 이온은 시간이 지남에 따라 카테콜 그룹과의 산화 환원 작용에 의해 Fe²⁺ 이온으로 환원되기 때문에 자가 치유 능력이 점차 사라지게 되었으며, 이러한 현상은 거시적으로도 관찰되었다 (도 9b). 반으로 자른 하이드로젤 조각은 젤 형성 직후엔 다시 결합이 가능하여 완전히 치유된 반면, 15시간 후엔 결합이 일어나지 않아 치유가 되지 않음을 확인하였다 (도 9b).

반면, 페리틴을 이용해 가교 시킨 하이드로젤은 페리틴의 철 이온 셔틀 작용으로 인해 15시간까지도 자가 치유능력이 유지됨을 유변학적 분석과 거시적 관찰을 통해 확인하였다 (도 9c, d).

실시예 7: 하이드로젤 블록 조립을 통한 3차원 구조체 형성

페리틴으로 가교시킨 히알루론산 하이드로젤 블록들을 2가지 다른 색으로 염색하여 각 블록들을 육안적으로 구별 가능하도록 제작하였다. 염색된 4개의 하이드로젤 블록들을 교차로 부착했을 때 하나의 구조체로 자가 결합이 일어남을 관찰하였다 (도 10a). 자가 결합된 구조체를 잡아 당겼을 때 부착 경계면이 아닌 다른 부위에서 파손이 일어남을 관찰함으로써 부착된 부위에서는 완전한 자가 결합이 일어남을 확인할 수 있었음 (도 10c).

또한, 서로 다른 형광물질(DiI: 적색, CFSE: 녹색)로 표지된 인간 지방 유래 줄기세포를 각각 하이드로젤 블록에 삼차원 봉입하고 블록들을 서로 붙여 조립하여 하나의 삼차원 구조체를 형성하도록 결합이 가능함을 확인하였다 (도 10b).

또한, 잉크(붉은색)를 포함한 하이드로젤 블록들과 잉크를 포함하지 않은 하이드로젤 블록들을 제작 후, 교차 조립하여 좀 더 복잡한 구조를 제작할 수 있는지 여부를 확인하였다. 그 결과, 근섬유다발과 혈관이 정렬되어 있는 근육과 같이 좀 더 복잡한 구조의 장기/조직 유사 구조체를 형성할 수 있음을 확인하였다 (도 10d). 또한 이렇게 형성된 구조체는 페리틴 가교 시스템의 특성에 의해 수용액 상에서도 그 구조가 그대로 잘 유지됨을 확인하였다 (그림 d).

따라서, 페리틴을 이용한 카테콜기 수식 고분자 하이드로젤 가교 시스템은 서로 다른 특정 세포가 포함된 하이드로젤 블록을 원하는 구조로 쌓거나 조립함으로써 원하는 형태의 인공 장기 및 조직 구조체를 제작하는 기술로 활용 가능함을 알 수 있다.

실시예 8: 페리틴 역할의 대체 불가능여부 확인: Fe ³⁺ 이온과 산화제 혼합물을 이용한 가교 테스트

Fe³⁺ 이온과 산화제를 혼합할 경우 본 발명의 페리틴 가교와 같거나 유사한 효과를 낼 수 있음으로써 이를 통해 페리틴 대체가 가능한지 확인해보기 위해 다양한 혼합물의 여러 부피비 조건에서 카테콜 수식 고분자 하이드로젤을 제작하고 자가 치유 및 수용액 상에서의 구조 안정성을 분석하였다.

그 결과, FeCl₃ : NaIO₄ 부피비 40:1, 20:1 조건에서는 자가 치유 현상이 관찰되었지만 산화제 비율이 그보다 증가했을 때 (10:1, 5:1) 자가 치유 능력이 사라짐을 확인하였다 (도 11a). 그러나, 자가 치유 능력을 보인 상기 혼합물 비율 조건 (40:1, 20:1)에서 제작된 하이드로젤은 상온의 수용액 (PBS) 상에서 24시간 안에 젤 구조가 완전히 무너졌으며, 이는 해당 조건에서는 카테콜-Fe 결합만이 하이드로젤 내부의 네트워크를 형성하고 있음을 알 수 있다 (도 11b).

반면, 자가 치유 능력이 없는 혼합물 비율 조건 (10:1, 5:1)에서 제작된 하이드로젤은 상온의 수용액 상에서 24시간 이상 젤 구조가 안정적으로 유지됨을 관찰함으로써 이 경우에는 반대로 카테콜-카테콜 공유결합만이 하이드로젤 네트워크를 형성하고 있음을 확인하였음 (도 11b).

따라서, 이러한 결과는 철 이온과 산화제의 단순 혼합만으로는 페리틴에 의한 가교 기전을 대체할 수 없으며 페리틴 가교 시스템만이 카테콜-Fe 결합과 카테콜-카테콜 결합이 공존하는 하이드로젤 네트워크 형성을 유도할 수 있음을 나타낸다.

실시예 9: 가교 방식에 따른 카테콜기 수식 고분자 하이드로젤의 생체적합성 평가: 줄기세포 3D 배양 독성 분석

세가지 가교 방식 (FeCl₃, NaIO₄, 페리틴)으로 제작한 카테콜기 기반 히알루론산 하이드로젤 내에 인간 지방 유래 줄기세포 (hADSC)를 삼차원 배양하면서 세포의 생존율을 비교하였다.

Live/Dead 염색을 실시한 결과, FeCl₃로 가교된 하이드로젤 내에서는 상대적으로 낮은 생존율을 보였으며 배양액 내에서 짧은 시간 내에 하이드로젤 구조가 무너져서 장기 배양이 불가능함을 확인하였다. 반면, NaIO₄ 및 페리틴 가교 방식으로 제작된 하이드로젤 내에선 세포가 7일간의 배양기간 동안 높은 생존율을 보이며 하이드로젤 구조도 잘 유지가 되었음을 확인하였다 (도 12).

이는 페리틴 가교 시스템은 세포 독성을 거의 나타내지 않으며 우수한 생체적합성을 가지고 있음을 시사한다.

실시예 10: 페리틴 가교 방식을 통한 카테콜기 수식 다양한 고분자 하이드로젤 제작

페리틴을 이용한 가교방식이 카테콜 수식 히알루론산(HA-CA) 외에 다른 종류의 다양한 카테콜기 수식 고분자의 가교에도 활용이 될 수 있는지 확인하기 위해, 카테콜이 수식된 알지네이트(alginate), 셀룰로오스(cellulose), 펙틴(pectin), 콘드로이틴 설페이트(Chondroitin sulfate) 용액을 준비하고 페리틴을 처리하여 가교를 유도하였다.

그 결과, 카테콜 수식 히알루론산(HA-CA) 하이드로젤과 마찬가지로 페리틴을 이용함으로써 상기 카테콜 수식 고분자들이 가교되어 하이드로젤을 형성할 수 있음을 확인하였다 (도 13). 따라서, 페리틴 기반 가교가 다양한 카테콜 수식 고분자들에 대한 새로운 가교방식으로 활용될 수 있음을 알 수 있다.

실시예 11: 가교 방식에 따른 카테콜기 수식 히알루론산 고분자 하이드로젤의 접착력 확인

유변학 분석 장비(Rheometer)를 이용하여 Tack test 모드에서 기존 카테콜기 수식 히알루론산(HA-CA) 고분자 가교 방식인 FeCl₃ 또는 NaIO₄ 처리에 의한 가교 방식과 페리틴을 이용한 가교 방식으로 제작한 HA-CA 하이드로젤의 접착력을 비교하였다.

그 결과, 접착력 측면에서는 가교 방식과는 상관없이 그룹 간 유의미한 차이가 없음을 확인하였다 (FeCl₃ 가교: 약 8 N, NaIO₄ 가교: 약 10 N, Ferritin 가교: 약 7 N). 이는 카테콜의 접착 능력이 Ferritin 가교 방식으로 제작된 HA-CA 하이드로젤에서도 유지됨을 확인하는 결과로서, 기존 카테콜 기반 하이드로젤이 활용되는 의료용 접착제 용도를 위해서도 Ferritin 가교 방식이 적용될 수 있음을 시사한다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (11)

1. 철 이온을 포함하는 페리틴 단백질 및 카테콜기가 수식된 고분자 물질을 포함하는, 하이드로젤 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 고분자 물질은 히알루론산, 알지네이트, 셀룰로오스, 펙틴 또는 콘드로이틴 설페이트로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인, 하이드로젤 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 페리틴 단백질은, 환원제로서 Fe²⁺ 이온을 방출하여 상기 고분자 물질 간 공유결합을 유도하거나, 또는 킬레이트제로서 내부에 Fe³⁺ 이온을 포함하여 상기 고분자 물질에 수식된 카테콜기와 배위 결합을 형성하는 것인, 하이드로젤 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 하이드로젤 조성물은 고분자 물질이 히알루론산인 경우, 히알루론산 분해효소를 처리하였을 때 pH 7 내지 pH 9의 조건에서 철 이온 방출 정도가 65 내지 75%인 것인, 하이드로젤 조성물.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 하이드로젤 조성물은 탄성 모듈러스(Elastic modulus)의 값이 250 내지 350Pa인 것인, 하이드로젤 조성물.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 하이드로젤 조성물은 외력 또는 시간 경과에 따른 분자간 결합력 약화에 대해 저항하거나 약화된 분자간 결합력을 회복하는, 자가 치유능을 갖는 것인, 하이드로젤 조성물.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 하이드로젤 조성물은 성체세포, 줄기세포 또는 생식세포를 더 포함하는 것인, 하이드로젤 조성물.
   
8. 제1항의 하이드로젤 조성물을 포함하는, 3차원 구조체.
   
9. 제1항의 하이드로젤 조성물을 포함하는, 인공 장기 또는 인공 조직의 제조용 조성물.
   
10. 제1항의 하이드로젤 조성물을 포함하는, 약물 전달용 조성물.
    
11. 제1항의 하이드로젤 조성물의 제조방법으로서,
    고분자 물질을 포함하는 용액과 페리틴 용액을 혼합하는 단계; 및 pH를 조절하는 단계를 포함하는, 하이드로젤 조성물의 제조방법.
    

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