KR102164819B1 - 지혈용 기구 및 이의 제조방법 - Google Patents

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KR102164819B1
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Abstract

생체적합성 고분자를 포함하는 다공성 매트릭스 층; 상기 다공성 매트릭스 층 위에 적재되며, 다가페놀 함유 잔기가 도입된 고분자를 포함하는 지혈 층; 및 상기 다공성 매트릭스 층과 상기 지혈 층 사이에 개재되어 상기 다공성 매트릭스 층과 상기 지혈 층이 분리되지 않도록 하는 결속 층을 포함하는 지혈용 기구가 제공된다.

Description

지혈용 기구 및 이의 제조방법{Apparatus for hemostasis and method for manufacturing the same}
본 명세서에 개시된 기술은 지혈용 기구 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 지혈성능, 접착성능, 밀폐성능 및 흡수성능이 개선된 지혈용 기구 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
오늘날 외과수술의 기법은 많이 발전한데 반해, 외과수술에서 필수적으로 발생하는 출혈을 막는 지혈기술의 발전은 저조한 상황이다. 지혈제의 기본적인 목표는 출혈을 멈추게 하는 것이다. 지혈제로 적절하게 사용되기 위해서는 출혈을 멈추게 하는 지혈기능과, 지혈을 원하는 부위에 고정되어 지혈기능을 발현할 수 있게 하는 조직접착기능이 요구된다. 또한, 혈액을 흡수하고, 혈액 손실량을 줄일 수 있는 밀폐 기능 또한 요구된다.
현재 상용화된 지혈제로는 생체의 혈액응고 기작의 마지막 단계의 피브린(fibrin)을 응용한 피브린계 지혈제, 순간 접착제와 같은 성분과 원리로 지혈을 유도하는 시아노아크릴레이트(cyanoacrylate)계 지혈제(예를 들어, 대한민국공개특허공보 제2009-0077759호), 물리적 장막의 역할을 하여 지혈하는 특성을 이용한 키토산, 젤라틴, 콜라겐 등과 같은 천연고분자 소재의 지혈제가 널리 알려져 있다. 하지만, 피브린계 지혈제는 생체에 기인하는 성분에 의해 질병 감염의 위험이 있고 항응고제 복용 환자에 대해 지혈이 어려운 문제가 있다. 한편, 시아노아크릴레이트계 지혈제는 생체 내에서 분해되면서 포름알데히드와 같은 독성물질이 발생하는 단점이 있다. 천연고분자 소재의 지혈제는 지혈성능과 생체조직에 대한 접착력이 예상보다 우수하지 않고, 일부 고분자들은 밀폐성 및 흡수성이 우수하지 못하다.
지혈 목적의 의료기기로 혈액에 대해 비용해성인 스펀지형 구조인 제품이 있다. 출혈이 일어난 부위에서 혈액들을 흡수하여 체내에 존재하는 혈액 응고 기전을 통해 지혈을 한다. 별도의 접착 기능이 없어 사용 시 수술 기구 등에 붙지 않는 편리성 및 출혈된 혈액의 흡수를 통해 그 출혈 부위 혈액을 밀폐할 수 있는 점에서 장점이 있으나, 생체 조직에 접착되지 않아 별도의 수단을 통해 출혈 부위 조직에 밀착해야 하고, 지혈 성능이 떨어지는 단점이 있다.
또 다른 지혈 목적의 의료기기로 혈액에 대해 용해성인 멤브레인형 구조인 제품이 있다. 출혈이 일어난 부위에서 혈액과 접촉 시 용해되어 출혈부위에 막을 형성하면서 접착되어, 물리적인 막을 형성하는 기전을 통해 지혈을 한다. 접착 기능을 가져 별도의 수단으로 생체 조직에 밀착해야 하는 불편함이 없고 지혈 성능이 우수한 장점이 있으나, 사용 시 수술 기구 등에도 들러붙는 불편함과 출혈 부위 혈액을 밀폐할 수 없는 단점이 있다.
본 명세서에 개시된 기술의 일 측면에 의하면, 생체적합성 고분자를 포함하는 다공성 매트릭스 층; 상기 다공성 매트릭스 층 위에 적재되며, 하이드록시기를 하나 이상 구비한 벤젠고리를 함유한 잔기가 도입된 고분자를 포함하는 지혈 층; 및 상기 다공성 매트릭스 층과 상기 지혈 층 사이에 개재되어 상기 다공성 매트릭스 층과 상기 지혈 층이 분리되지 않도록 하는 결속 층을 포함하는 지혈용 기구가 제공된다.
본 명세서에 개시된 기술의 다른 측면에 의하면, (a) 페놀 또는 다가페놀 함유 잔기가 도입된 고분자를 물에 용해시켜 지혈 층 형성용 용액을 준비하는 단계; (b) 생체적합성 고분자로 이루어진 다공성 매트릭스를 제공하는 단계; (c) 상기 지혈 층 형성용 용액을 상기 다공성 매트릭스의 표면에 접촉시켜 상기 다공성 매트릭스의 공극 내에 함침시키는 단계; 및 (d) 상기 지혈 층 형성용 용액을 건조시켜 상기 다공성 매트릭스 표면 위에 지혈 층을 형성하는 동시에 상기 다공성 매트릭스와 상기 지혈 층의 계면에 결속 층을 형성하는 단계를 포함하는 지혈용 기구의 제조방법이 제공된다.
도 1은 지혈용 기구의 일 구현예를 나타내는 개략적인 단면도이다.
도 2는 일 구현예에 따른 지혈용 기구를 출혈 부위에 적용하여 지혈 및 밀폐하는 과정을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 3은 낮은 점도 값과 높은 점도 값을 갖는 키토산-카테콜 용액을 사용하여 젤라틴 층에 함침하여 제조한 지혈용 다중 층 스폰지의 구조를 나타낸 결과이다.
도 4는 다중 층 구조의 스폰지의 절단면을 주사전자현미경으로 관찰한 사진이다.
도 5는 지혈용 스폰지의 밀폐 특성 분석 결과를 보여주는 사진이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고, 통상적으로 사용되는 것이다.
이하 도면을 참조하여 본 명세서에 개시된 다양한 기술에 대해 좀더 상세히 설명하고자 한다.
본 명세서에 개시된 기술의 일 측면에 의하면, 지혈용 기구가 제공된다. 도 1은 지혈용 기구의 일 구현예를 나타내는 개략적인 단면도이다. 도 1을 참조하면, 지혈용 기구(100)는 생체적합성 고분자를 포함하는 다공성 매트릭스 층(110); 다공성 매트릭스 층(110) 위에 적재되며, 다가페놀 함유 잔기가 도입된 고분자를 포함하는 지혈 층(130); 및 다공성 매트릭스 층(110)과 지혈 층(130) 사이에 개재되어 다공성 매트릭스 층(110)과 지혈 층(130)이 분리되지 않도록 하는 결속 층(120)을 포함한다.
다공성 매트릭스 층(110)은 직물, 부직포, 발포 중합체 또는 스펀지의 형태를 가질 수 있다. 다공성 매트릭스 층(110)은 출혈 부위와 같은 손상 부위에 접촉하여 체액을 흡수할 수 있도록 다수의 공극을 구비할 수 있으며, 유입된 혈액, 삼출물 또는 기타 유체를 내부에 보유할 수 있어 손상 부위 외부로 넘치지 않도록 출혈을 정지하는 역할을 한다. 매트릭스는 적절한 탄성을 가질 수 있으며 혈액과 같은 액체에 대해 젖음성 및 흡수성이 우수한 생체적합성 고분자로 이루어진 것이 바람직하다. 상기 공극 구조는 매트릭스 내에서 상호 연결된 3차원 구조를 가질 수 있다.
상기 생체적합성 고분자는 체내에 적용 후 효소에 의한 분해, 생물학적 분해 또는 가수분해 등으로 시간 경과에 따라 체내에 흡수될 수 있는 재료인 것이 바람직하다.
또한 상기 생체적합성 고분자는 혈액에 대해서 비용해성으로서, 특히 체내 조건인 중성 및 37℃ 부근에서 비수용성인 성질을 갖는 재료인 것이 바람직하다. 상기 생체적합성 고분자의 생분해 시간은 체내에 적용 후 3개월 이내일 수 있으며, 바람직하게는 8주 이내 일 수 있다. 상기 기간에 상처 봉합 후 목적 달성이 되면 자연스럽게 분해되는 것이 바람직하다.
상기 생체적합성 고분자는 천연 생분해성 고분자 또는 합성 생분해성 고분자일 수 있다. 천연 생분해성 고분자의 구체적인 예로 콜라겐(collagen), 섬유결합소(fibronectin), 피브린(fibrin), 젤라틴(gelatin), 엘라스틴(elastin), 키틴(chitin), 키토산(chitosan), 전분(starch), 덱스트란(dextran), 알긴산(alginic acid), 히알루론산(hyaluronic acid), 셀룰로오스, 이들의 유도체 및 이들의 공중합체로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 합성 생분해성 고분자의 예로 폴리락트산(poly(lactic acid), PLA), 폴리글리콜산(poly(glycolic acid), PGA), 폴리(D,L-락타이드-코-글리콜라이드(poly(D,L-lactide-co-glycolide, PLGA), 폴리(ε-카프로락톤)(poly(ε-caprolactone, PCL), 폴리하이드록시알카노에이트(polyhydroxyalkanoate), 폴리안하이드라이드(polyanhydride), 폴리오르토에스테르(polyorthoester), 폴리아민(polyamine), 이들의 유도체 및 이들의 공중합체로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 상기 열거된 생분해성 고분자는 예시로 든 것일 뿐, 가수분해가 가능한 아마이드(amide), 지방족 에스테르(aliphatic ester), 우레아(urea), 우레탄(urethane), 에테르(ether), 단백질(peptide) 등의 주사슬을 포함하는 고분자이면 특별히 제한되지 않는다.
상기 생체적합성 고분자의 유도체는 상기 생체적합성 고분자의 염이나, 상기 생체적합성 고분자의 -OH, -SH, -NH2, -COOH 또는 -NHC(O)CH3와 같은 작용기를 통해 다른 친수성기 또는 다른 생체적합성 고분자로 치환되거나 개질되어 형성된 다양한 변형물 및 이의 염을 의미한다.
상기 생체적합성 고분자를 포함하는 매트릭스로서, 생체에 이식 후 염증 반응이 적고 뛰어난 생체 기능성과 생분해성 등을 제공한다는 면에서 바람직하게는 예를 들어 젤라틴 패드 또는 콜라겐 패드가 사용될 수 있다. 젤라틴과 콜라겐 패드는 지혈 후 해당 조직에서 많이 발현되는 단백질 분해효소의 작용으로 인해 상기 언급한 빠른 속도로 분해가 된다. 또한 상기 매트릭스는 생체적합성 고분자 자체의 1차 지혈 효과와 더불어 체액의 흡수 및 팽창에 의한 압박 효과에 의한 2차 지혈 효과를 가질 뿐 아니라 밀폐 성능이 우수하다.
상기 생체적합성 고분자는 가교된 것이거나 가교되지 않은 것일 수 있으며, 바람직하게는 가교된 구조를 가짐으로써 물에 녹지 않아 혈액에 노출되어도 형태를 유지할 수 있다. 상기 생체적합성 고분자를 이용하여 다공성 구조체로 형성하게 되면 혈액을 흡수하면서도 형태를 유지함으로써 혈액에 대해 밀폐성을 부여할 수 있다.
상기 생체적합성 고분자는 다공성 매트릭스로 가공될 수 있는 섬유상, 분말상 또는 액상의 원료 물질로부터 제조될 수 있으며 pH 1.5~4 조건의 산성화 및 알칼리 용액에 의한 중성화 과정을 포함할 수 있다. 상기 생체적합성 고분자를 이용한 다공성 매트릭스는 상기 생체적합성 고분자의 겔, 현탁액 또는 용액의 동결건조로 제조될 수 있다. 가교를 위해 유기 용매 중에서 상기 원료와 가교제를 혼합하여 고분자화반응을 통해 가교화 매트릭스를 형성할 수 있다. 상기 가교제로는 글루타르알데히드(glutaraldehyde), 포름알데히드(formaldehyde), 아세트알데히드(acetaldehyde), 에틸렌포름알데히드(formaldehyde), 아세트알데히드(acetaldehyde), 에틸렌 이소프로판올(ethylene isopropanol) 등이 사용될 수 있다.
다공성 매트릭스 층(110)의 두께는 특별히 제한되지 않지만 1 내지 20 밀리미터(mm), 바람직하게는 1 내지 15 밀리미터일 수 있다. 두께가 상기 범위 미만에서는 출혈된 혈액에 대해 충분한 흡수장막의 역할을 할 수 없고, 상기 범위 초과에서는 체내 분해기간이 매우 길 수 있다.
지혈 층(130)은 다공성 매트릭스 층(110)과 별도의 층으로서 존재하며, 결속 층(120)을 매개로 다공성 매트릭스 층(110)과 서로 분리되지 않고 적층될 수 있다. 지혈 층(130)의 재료는 하이드록시기(-OH기)를 하나 이상 구비한 벤젠고리를 함유한 잔기(moiety), 즉 페놀 또는 다가페놀 함유 잔기가 도입된 고분자를 포함한다. 지혈 및 접착성능 면에서 상기 고분자는 바람직하게는 하이드록시기를 2 이상 구비한 다가페놀 함유 잔기가 도입된 것일 수 있다. 상기 다가페놀 함유 잔기의 다가페놀은 벤젠 고리에 2 이상의 -OH기를 포함하는 것으로, 바람직하게는 -OH가 2개인 카테콜 또는 -OH기가 3개인 갈롤을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 상기 페놀 또는 다가페놀의 수소 중 일부가 다른 친수성 작용기로 치환될 수 있다.
상기 고분자는 생체적합성 고분자인 것이 바람직하며, 천연 생분해성 고분자 또는 합성 생분해성 고분자일 수 있다. 상기 생체적합성 고분자의 구체적인 예는 다공성 매트릭스 층에 사용되는 고분자에 관한 설명에서 상술한 바와 같다.
바람직하게는 상기 고분자는 우수한 지혈성능, 생분해성 및 조직재생 효과를 고려하여, 젤라틴, 콜라겐, 피브린, 엘라스틴, 히알루론산, 알긴산, 알지네이트, 카복시메틸셀룰로오스, 카복시에틸셀룰로오스, 하이드록시메틸셀룰로오스, 피브린, 헤파린, 키틴, 키토산 및 이의 유도체일 수 있다.
하이드록시기를 갖는 페놀 함유 잔기나 카테콜 또는 갈롤 등의 다가페놀 함유 잔기가 상기 고분자의 주사슬의 측쇄 또는 말단에 예를 들어, -NH2, -SH, -OH, 또는 -COOH와 같은 작용기를 통해 연결될 수 있다. 상기 페놀 또는 다가페놀 함유 잔기는 "페놀-L-" 또는 "다가페놀-L-"의 형태로 구성될 수 있다. 여기서 L은 단일결합, 탄소수 1 내지 10개의 지방족 탄화수소기 사슬 또는 탄소수 3 내지 10개의 지환족 탄화수소기 사슬일 수 있으며, L을 이루는 사슬 내에 -O-, -S-, -NH-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)O- 또는 -C(O)NH-가 포함될 수 있다.
통상적으로 생체적합성 고분자의 작용기와 페놀 또는 다가페놀 함유 화합물의 말단기 사이의 반응으로 생체적합성 고분자에 페놀 또는 다가페놀 함유 잔기가 컨쥬게이션될 수 있다. 상기 반응은 화학적 합성, 전기화학적 합성, 효소를 이용한 합성 등 다양한 방식에 의해 도입될 수 있다.
상기 페놀 또는 다가페놀 함유 잔기는 상기 생체적합성 고분자의 반복단위를 기준으로 1 내지 50 mol%, 1 내지 40 mol%, 1 내지 30 mol%, 또는 2 내지 25 mol% 함유될 수 있다. 상기 범위 미만에서는 혈액에 대한 용해성이 작고 지혈 및 접착 성능이 저하될 수 있으며, 상기 범위 초과에서는 카테콜 산화가 발생할 수 있다.
지혈 층(130)에 적합한 다양한 재료들 중 하기 반응식 1 및 반응식 2는 키토산 고분자와 카테콜 함유 화합물의 반응에 의해 카테콜 함유 잔기가 도입된 키토산 고분자들의 합성방법들을 나타낸다.
[반응식 1]
Figure 112020021844779-pat00001
[반응식 2]
Figure 112020021844779-pat00002
(상기 반응식 1 및 2에서, x,y 및 z는 정수이며, m은 50 내지 6,000의 정수)
반응식 1은 카르보다이이미드 커플링에 의한 아마이드 형성방식으로서, 3,4-다이하이드록시하이드로시나믹산(즉, 하이드로카페익산)과 같은 카복실산 말단 카테콜을 키토산 주사슬의 아민에 컨쥬게이션시키는 반응이다. 카테콜 산화를 막기 위해 pH를 5~6으로 제어하여 반응시키며 키토산이 물에 대해 비수용성이므로 에탄올과 같은 양성자성 용매를 사용하여 반응시 침전을 막는다. 이러한 아마이드 커플링반응에 의해 아민 작용기에 대하여 통상 4 내지 30 mol%의 치환도로 카테콜이 고분자 주사슬에 도입되지만 수일 간의 장시간 반응에 의해 80 mol% 이상의 치환도로 카테콜을 도입시킬 수 있다.
반응식 2는 환원성 아민화 반응으로서, 3,4-다이하이드록시벤즈알데하이드와 같은 알데히드 말단 카테콜을 키토산 주사슬의 아민과 반응시킨 후 NaCNBH3나 NaBH4와 같은 환원제를 써서 이민결합(-C=N-)을 -C-N- 결합으로 환원시키는 것이다. 환원성 아민화 반응에 의해 짧은 반응시간에 18 내지 80 mol%의 치환도로 카테콜이 고분자 주사슬에 도입될 수 있다.
혈액에 접촉시 용해된 후 겔을 형성하는 지혈 층 재료로서는 키토산-카테콜, 히알루론산-카테콜, 젤라틴-카테콜, 콜라겐-카테콜, 폴리아민-카테콜, 키토산-갈롤, 히알루론산-갈롤, 젤라틴-갈롤, 콜라겐-갈롤, 폴리아민-갈롤 등을 포함할 수 있다.
위의 다양한 고분자들 중 예를 들어, 키토산과 같은 고분자 화합물이 지혈작용을 하는 것은 양전하를 띠는 -NH3 +가 혈액 속의 음전하를 띠는 혈소판(platelet)을 끌어당기게 되고, 이에 따라 혈소판이 급격하게 응집되어 급속한 지혈 작용이 일어나는 과정에 의해 진행된다고 알려져 있다. 다만, 이 특성은 키토산이 pH 2의 극한 산성 환경에 국한되기 때문에 중성환경(pH 7)에 가까운 생체 내에서는 지혈능력이 거의 없다. 하지만 본 명세서에 개시된 기술에 따른 지혈용 기구의 지혈 층에 사용되는 고분자는 혈액과 같은 중성의 수중 환경에서도 접착력을 가질 수 있도록 카테콜기 또는 갈롤기와 같은 다가페놀로 개질된다. 그 결과, 혈액 중에서 녹아 잠시 후 적혈구와 전기적인 인력을 형성해서 출혈이 있는 조직 부위에 지혈막을 만들게 된다. 형성된 지혈막은 며칠간 유지되다가 몸속 효소에 의해 자연스럽게 분해될 수 있다.
페놀 또는 다가페놀의 방향족 및 -OH기의 존재에 의하여 고체 상태의 지혈 층(130)이 혈액 내에서 쉽게 용해된 후 겔을 형성할 수 있다. 지혈 층(130)의 지혈 및 접착 메커니즘은 다양하게 설명될 수 있으며, 특별한 별도의 가교제를 사용하거나 자외선이나 열에너지를 인가하지 않고도 방향족 그룹 간의 π-π 상호작용, 수소결합, 금속이온과의 배위결합, 금속이온과의 방향족 고리 간의 양이온-π결합을 통해 신속하고 강력한 지혈 및 조직에의 접착이 가능하다.
바람직한 구현예에서, 지혈 층(130)은 페놀 또는 다가페놀 함유 잔기와 함께 이들의 산화된 형태의 잔기를 동시에 포함할 수 있다. 그 결과 지혈 층(130)의 고분자에 -OH를 구비한 벤젠 고리와 =O를 구비한 벤젠 고리가 동시에 존재할 수 있다. 예를 들어, 지혈용 기구(100)의 제조과정에서 지혈 층(130)의 고분자에 결합된 카테콜 기(
Figure 112020021844779-pat00003
)의 -OH를 인위적으로 또는 자연적으로 산화시킴으로써 카테콜기들 중의 일부가 산화된 카테콜(
Figure 112020021844779-pat00004
), 즉 퀴논으로 변환될 수 있다.
상기 퀴논 함유 잔기는 조직 단백질, 혈액 단백질 또는 혈액에 녹은 지혈 층 고분자 등의 유기물에 존재하는 -NH2와 반응하여 단백질과 카테콜기 사이에 공유결합을 형성할 수 있다. 그 결과 조직접착력 및 지혈 능력이 더 강화될 수 있다. 또한 공유결합이 형성된 이후에 퀴논의 옥소기(=O)가 하이드록시기(-OH)로 환원된 다음에는 여전히 유기물 내 질소 및 산소 원자와의 수소결합을 유지할 수 있다. 퀴논이 아민과 반응하여 공유결합을 형성하는 예로 반응식 3과 같이 Michael 부가 반응을 하거나, 반응식 4와 같이 Schiff base를 형성할 수 있다.
[반응식 3]
Figure 112020021844779-pat00005
[반응식 4]
Figure 112020021844779-pat00006
바람직한 구현예에서, 지혈 층(130) 내에 포함된 페놀 또는 다가페놀 함유 잔기와 산화된 잔기의 총합 중 50 mol% 이하, 바람직하게는 40 mol% 이하, 더욱 바람직하게는 30 mol% 이하가 산화된 형태의 잔기일 수 있다. 하한은 0.1 mol% 이상으로 제어되는 것이 바람직하다. 상기 범위에서 지혈 층(130)의 조직 접착능 및 지혈능이 최적화될 수 있다. 산화된 형태의 잔기가 많을수록 상술한 바와 같이 공유결합과 같은 강한 결합이 많이 생길 수 있지만, 빠른 지혈 관점에서는 -OH 함량을 더 많이 유지하는 것이 필요하므로 적절한 범위로 제어되는 것이 바람직하다.
공유결합에 의한 결합 메커니즘은 상술한 양이온-π 결합 메커니즘 등에 비해 속도는 느리지만, 조직 단백질과 매우 강력한 접착력을 유도할 수 있다. 따라서 이러한 지혈 층(130)을 갖는 지혈용 기구(100)를 출혈이 있는 인체 조직에 적용할 경우 지혈 및 밀폐 능력이 향상될 수 있다.
한편, 상기 생체적합성 고분자에 결합되는 페놀 또는 다가페놀 함유 잔기에 있어서, 하나의 벤젠고리에 결합된 -OH기의 개수가 많아질수록 시간경과에 따라 퀴논 형태로 산화될 확률은 높아지는 반면, 외부 단백질과 작용할 수 있는 사이트가 증가하여 지혈 및 접착 성능은 향상될 수 있다.
결속 층(120)은 다공성 매트릭스 층(110)과 지혈 층(130) 사이에 개재된다. 지혈용 기구(100)는 혈액을 흡수하기 위한 다공성 매트릭스 층(110)과 지혈 및 접착 성능을 갖는 지혈 층(130)이 결합된 다층 구조를 가지며, 지혈용 기구(100)가 제조된 후 유통 및 사용 중에 각 층들이 서로 분리되지 않고 잘 결합되어 있는 것이 매우 중요하다. 그런데 다공성 매트릭스 층(110)과 지혈 층(130)은 각각 비수용성과 수용성을 갖는 서로 다른 물성의 재료로서 별도의 접착제 없이 서로 결합이 어려울 수 있다. 층간 분리 방지를 위해 층별로 반제품을 먼저 제작한 후 추가적인 접착제를 사용하는 것은 독성 및 공정의 비효율성 면에서 제한될 수 있다.
또한 추가적 접착제를 사용하지 않고 다공성 매트릭스 층(110)의 표면에 지혈 층(130)을 이루는 성분을 단순히 코팅하는 것만으로는 두 개의 층이 서로 충분한 상호작용을 할 수 없으므로 접착력이 약할 수 있다. 그 결과 지혈용 기구(100)의 유통 및 사용 중에 분리되어 탈착되어 제품의 품질에 심각한 영향을 줄 수 있다.
따라서 결속 층(120)은 다공성 매트릭스 층(110)과 지혈 층(130)이 분리되지 않도록 하는 역할을 한다. 결속 층(120)을 이루는 성분은 다공성 매트릭스 층(110)과 지혈 층(130) 각각에 대해 혼화성을 갖는 재료인 것이 바람직하다. 즉 다공성 매트릭스 층(110)을 이루는 단백질 또는 다당류의 각종 작용기(-OH, -NH2, -COOH 등) 및 지혈 층(130)을 이루는 단백질의 작용기와 수소결합 또는 축합반응에 의한 공유결합으로 상호작용할 수 있는 재료인 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 재료는 다공성 매트릭스 층(110)과 지혈 층(130)을 구성하는 성분으로부터 유래된 것일 수 있다. 예를 들어 상기 재료는 다공성 매트릭스 층(110)을 이루는 주성분과 지혈 층(130)을 이루는 주성분의 블렌드이거나 공중합체일 수 있다.
결속 층(120)은 다양한 방식에 의하여 도입될 수 있으며, 예를 들어 결속 층 재료로 이루어진 필름을 두 개의 층들(110, 130) 사이에 넣고 라미네이팅하는 방식, 다공성 매트릭스 층(110) 위에 결속 층 재료를 코팅하는 방식, 결속 층 재료를 다공성 매트릭스 층(110)에 함침시키는 방식 등으로 도입될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 결속 층(120)은 지혈 층(130) 성분을 다공성 매트릭스 층(110)에 충분히 함침시키는 방식으로 생성될 수 있다. 그 결과, 결속 층(120)은 상기 생체적합성 고분자와 상기 페놀 또는 다가페놀 함유 잔기가 도입된 고분자의 혼합 영역을 포함할 수 있다. 함침 과정에서 액상의 지혈 층(130) 성분이 다공성 매트릭스 층(110) 내에 깊이 침투함으로써, 다공성 매트릭스 층(110)을 이루는 생체적합성 고분자의 친수성기와 지혈 층(130) 성분의 하이드록시기가 수소결합을 통해 강하게 상호작용을 할 수 있어서 결속 층(120)으로서의 역할을 할 수 있다. 그리하여 별도의 접착제 없이 층 구성 성분만으로 결속 층(120)을 형성시킬 수 있어, 추가적 접착제 사용에 의한 독성, 생분해성 또는 생체흡수성 저하 등의 문제가 발생하지 않을 수 있으며 각 층과의 혼화성도 우수하여 층 간 분리가 잘 되지 않을 수 있다.
일 구현예에서, 결속 층(120)을 형성하는 방법에 따라 상기 혼합 영역에 지혈 층(130)으로부터 상기 생체적합성 고분자로 된 다공성 매트릭스 층(110)의 방향으로 다가페놀 함유 잔기의 농도가 낮아지는 형태로 농도 기울기가 형성될 수 있다. 상기 농도 기울기의 형성에 의해 결속 층(120)은 다공성 매트릭스 층(110)과 지혈 층(130) 사이를 매개하여 양 층을 더욱 서로 강하게 결속시킬 수 있다.
결속 층(120)의 두께는 특별히 제한되지 않지만 통상 1 내지 1,500 마이크로미터(㎛)일 수 있으며, 바람직하게는 100 내지 1200 마이크로미터, 더 바람직하게는 200 내지 1,000 마이크로미터일 수 있다. 결속 층(120)의 두께가 상기 범위 미만에서는 다공성 매트릭스 층과 지혈 층이 분리될 수 있고, 상기 범위 초과에서는 다공성 매트릭스 층의 구분이 없어져 흡수 및 밀폐 성능이 저하될 수 있다.
상술한 바와 같이 결속 층의 존재에 의해 지혈용 기구의 각 층에 요구되는 물성을 유지하면서 추가적 접착제 사용에 의한 문제없이 층 간에 충분한 결합력을 가질 수 있으며, 제품 성능을 온전히 구현할 수 있는 장점이 있다.
본 명세서에 개시된 일 구현예에 따른 지혈용 기구는 하기와 같이 여러 가지 뛰어난 효과를 갖는다. 접착 특성을 갖는 지혈 층과 밀폐 특성을 갖는 다공성 매트릭스 층이 서로 결합되어 있어서, 접착 특성과 밀폐 특성을 동시에 가질 뿐 아니라 수술 과정에 사용 시 수술 기구에 들러붙지 않으면서도 별도의 수단없이 출혈 부위 조직에 밀착이 가능하다. 따라서 사용편이성이 우수하며 지혈 성능이 우수하고 출혈 부위 혈액을 밀폐할 수 있다.
생체의 혈액 응고 메커니즘을 이용하는 피브린계 지혈제를 사용할 경우 항응고제를 복용하는 환자에 대해 지혈을 유도할 수 없는 단점이 있다. 하지만, 본 지혈용 기구는 수중에서 뛰어난 접착력을 보이는 홍합 유래 단백질인 도파 물질을 모사한 다가페놀 함유 잔기를 이용함으로써 출혈 부위에 대한 접착력이 뛰어날 뿐 아니라, 방향족 및 -OH 작용기를 동시에 구비함으로써 체내 지혈 메커니즘이 아닌 수소결합, 금속과의 강한 배위결합, 공유결합, 양이온-π결합 등을 비롯한 다양한 결합 메커니즘에 의하여 지혈제 성분이 혈액 단백질과 결합하기 때문에 어떤 환자에게나 적용가능하며 신속한 지혈이 가능하다.
또한 단순히 두 개의 층이 접합된 것이 아니고 지혈 층과 다공성 매트릭스 층을 매개하는 결속 층이 존재하므로 지혈용 기구의 유통 및 사용 과정에서 지혈 층과 다공성 매트릭스 층 사이에 분리가 일어나지 않는다.
특히 상술한 것처럼 본 지혈 층의 재료에 하이드록시기를 구비한 벤젠고리 함유 잔기가 도입된 고분자를 사용하므로 양이온-π결합과 같은 메커니즘으로 신속한 지혈이 가능할 뿐 아니라 퀴논 유사 잔기가 공존하여 외부 단백질과 공유결합에 의한 우수한 지혈 및 강한 접착을 동시에 달성할 수 있다. 이와 함께 결속 층에 의해 견고하게 결합된 다공성 매트릭스 층이 있어서, 본 지혈용 기구는 전술한 지혈 및 접착 성능 이외에 혈액 흡수능 및 밀폐 성능을 겸비할 수 있다.
한편 본 지혈용 기구는 지혈제의 성능 유지를 위해서 냉장 유통해야 하는 종래 제품과 달리 실온에서 장시간 보관이 가능하고 습도가 높은 환경에서도 변질되지 않는다. 또한 본 지혈용 기구는 체내에 적용되어 지혈 및 밀폐 목적을 달성한 이후에 인체에 무해한 물질로 분해 및 흡수되어 생체적합성이 매우 우수하다.
도 2는 일 구현예에 따른 지혈용 기구를 출혈 부위에 적용하여 지혈 및 밀폐하는 과정을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
본 명세서에 개시된 기술의 다른 측면에 의하면, 지혈용 기구의 제조방법이 제공된다. 일 구현예에서, 상기 지혈용 기구의 제조방법은 (a) 다가페놀 함유 잔기가 도입된 고분자를 물에 용해시켜 지혈 층 형성용 용액을 준비하는 단계; (b) 생체적합성 고분자로 이루어진 다공성 매트릭스를 제공하는 단계; (c) 상기 지혈 층 형성용 용액을 상기 다공성 매트릭스의 표면에 접촉시켜 상기 다공성 매트릭스의 공극 내에 함침시키는 단계; 및 (d) 상기 지혈 층 형성용 용액을 건조시켜 상기 다공성 매트릭스 표면 위에 지혈 층을 형성하는 동시에 상기 다공성 매트릭스와 상기 지혈 층의 계면에 결속 층을 형성하는 단계를 포함한다.
(a) 단계에서, 상기 지혈 층 형성용 용액을 준비하기 위해 상기 다가페놀 함유 잔기가 도입된 고분자를 물 100 중량부 대비 0.1 내지 3 중량부를 첨가하여 녹일 수 있다. 상기 지혈 층 형성용 용액은 4℃에서 회전형점도계로 측정한 점도값을 기준으로 10 내지 2,500 cP, 바람직하게는 10 내지 1,500 cP, 더 바람직하게는 10 내지 1,000 cP의 점도를 가질 수 있다.
상기 지혈 층 형성용 용액이 적절한 점도를 가져야 상기 다공성 매트릭스에 잘 흡수되어 함침이 될 수 있다. 상기 점도가 상기 범위 미만에서는 결속 층이 너무 많이 생겨 맨 위층까지 함침 되어 다공성 매트릭스 층이 없어질 수 있고, 상기 범위 초과에서는 다공성 매트릭스 층과 지혈 층이 분리되고, 결속 층이 생기지 않을 수 있다.
상기 페놀 또는 다가페놀 함유 잔기를 생체적합성 고분자 사슬에 도입하기 위해 페놀기, 카테콜기 또는 갈롤기를 구비한 화합물을 이용하여 화학적 합성, 전기화학적 합성, 효소를 이용한 합성 방식 등을 이용할 수 있다. 일 구현예에서, 생체적합성 고분자를 증류수에 넣고 열을 가하여 녹이고 페놀 또는 다가페놀 함유 화합물을 포함한 반응물을 투입한 후 pH 4 내지 6의 조건에서 교반하는 과정이 포함될 수 있다.
지혈 층 형성용 용액을 화학적으로 합성하는 방식의 예로서, 카테콜기가 도입된 고분자를 포함하는 지혈 층 형성용 용액을 제조하는 방법은 다음과 같다. 먼저 고분자 용액에 1-하이드록시-2,5-피로리딘디온(NHS) 용액을 첨가하여 고분자/NHS 혼합용액을 제조하고, 상기 고분자/NHS 혼합용액에 1-에틸-3-(-3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 용액을 첨가하여 고분자/NHS/EDC 혼합용액을 제조한다. 이어 상기 고분자/NHS/EDC 혼합용액에 도파민 용액을 첨가하여 반응시킴으로써 카테콜기가 도입된 고분자를 포함하는 지혈 층 형성용 용액을 제조한다.
본 제조방법에 따르면, 페놀 함유 화합물 또는 다가페놀 함유 화합물과 생체적합성 고분자 간의 반응을 수상에서 진행하므로, 상기 반응 과정에서 카테콜과 같은 다가페놀이 물 속의 산소와 반응하여 산화됨에 따라 퀴논 형태의 화합물로 변환될 수 있다. 그 결과 카테콜과 퀴논이 지혈 층 내에 공존하게 되어 접착 성능 및 지혈 성능이 더욱 향상될 수 있다.
생체적합성 고분자 사슬에 도입하는 데 사용되는 상기 페놀기를 구비한 화합물의 구체적인 예로, 티라민, L-타이로신, 플로레틱산(phloretic acid) 등을 들 수 있다. 한편, 생체적합성 고분자 사슬에 도입하는 데 사용되는 상기 카테콜기 또는 갈롤기를 구비한 화합물의 구체적인 예로, 파이로카테콜, L-도파, 도파민, 노르에피네프린, 카페익산, 갈산, 갈롤아민, 2-아미노에텐 파이로갈롤 등을 들 수 있다.
(c) 단계에서, 상기 지혈 층 형성용 용액을 상기 다공성 매트릭스의 표면에 접촉시키기 위해 예를 들어 PET 몰드에 상기 지혈 층 형성용 용액을 분주한 다음, 분주된 용액의 상단에 다공성 매트릭스를 배치하여 냉장 조건에서 함침하는 과정을 수행할 수 있다. 상기 함침 과정을 통해 다공성 매트릭스 층과 지혈 층 사이에 결속 층을 도입할 수 있다. 함침 과정에서 상기 결속 층의 두께가 1 내지 1,500 ㎛, 바람직하게는 100 내지 1200 ㎛, 더 바람직하게는 200 내지 1,000 ㎛로 제어될 수 있다. 상기 결속 층의 두께가 상기 범위가 되도록 함으로써 다공성 매트릭스 층의 흡수 및 밀폐 성능이 우수하게 유지될 수 있다.
(d) 단계에서, 상기 지혈 층 형성용 용액을 동결 건조시킴으로써 상기 다공성 매트릭스 표면 위에 고체 상의 지혈 층을 형성시킬 수 있다. 또한 상기 다공성 매트릭스와 상기 지혈 층의 계면에 결착 층이 완전하게 형성될 수 있다.
상술한 제조방법에 의하면, 본 명세서에 개시된 일 구현예에 따른 지혈용 기구를 함침법의 공정으로 지혈 층-결속 층-다공성 매트릭스 층의 다층 구조를 간단하게 제조할 수 있다.
이러한 방법으로 제조된 지혈용 기구는 인체에 무해하면서 지혈, 생체 내 접착, 혈액의 흡수 및 밀폐 기능을 가짐으로써 기존의 고분자 지혈제의 성능을 대폭 개선시킬 수 있다. 출혈을 멈추게 하는 효과 외에도 장기의 천공, 담즙의 누수, 수술 후 유착 방지 등 다양한 분야로의 적용이 가능하다. 또한 사용 시 수술기구에 들러붙지 않아 편이성이 증대되며 재료 성분에 가수분해(hydrolysis)가능한 기를 포함하지 않으므로 유통 과정에서 변질이 되지 않는 장점이 있다.
이하 본 명세서에 개시된 기술을 다양한 실시예를 통해 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 명세서에 개시된 기술을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 개시된 기술의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예]
제조예 1: 젤라틴-카테콜의 합성
고분자 용액을 제조하기 위하여 준비된 반응기에 300 mL 3차 증류수를 담고, 증류수가 담긴 반응기에 미리 소분한 젤라틴 3 g을 혼합하였다. 혼합된 고분자 용액(젤라틴 용액)에 열을 가하고, 적절히 교반하면서 3시간 이상 용해하였다. 상기 용액을 육안으로 관찰하고 젤라틴이 완전히 용해되었음을 확인하였다.
1-하이드록시-2,5-피로리딘디온(이하 'NHS') 1.12 g을 3차 증류수 15 mL에 용해시키고, 이를 교반 중인 젤라틴 용액에 첨가하여 젤라틴-NHS 용액을 제조하였다. 또한, 1-에틸-3-(-3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 하이드로클로라이드(이하 'EDC') 1.87 g을 3차 증류수 15 mL에 용해시키고, 이를 젤라틴-NHS 용액에 첨가하였다. 젤라틴-NHS-EDC 용액을 제조하고, 도파민 1.23 g을 3차 증류수 15mL에 용해하여 이를 젤라틴-NHS-EDC 용액에 넣어 5시간 이상 상온에서 반응을 진행하였다(젤라틴-NHS-EDC-도파민 용액). 반응이 완료되면 투석막(MWCO: 12,000-14,000, SpectraPor)을 이용하여 투석을 실시하였으며, 투석이 완료된 물질은 동결건조하여 보관하였다.
본 실시예에서 제조된 젤라틴-카테콜 지혈용 스폰지 2 mg을 초순수 1 mL에 용해시켜 카테콜 결합율을 확인하였다. 자외선-가시광선 분광광도계를 이용하여 카테콜 결합율을 측정한 결과로서, 젤라틴 한 분자당 카테콜의 결합율은 3.3% 임을 확인하였다.
제조예 2: 히알루론산-카테콜의 합성
고분자 용액을 제조하기 위하여 준비된 반응기에 300 mL 3차 증류수를 담고, 증류수가 담긴 반응기에 미리 소분한 히알루론산 3 g을 혼합하였다. 혼합된 고분자 용액(히알루론산 용액)을 적절히 교반하면서 용해하였다. 상기 용액을 육안으로 관찰하고 히알루론산이 완전히 용해되었음을 확인하였다.
NHS 2.27 g을 3차 증류수 15 mL에 용해시키고, 이를 교반 중인 히알루론산 용액에 첨가하여 히알루론산-NHS 용액을 제조하였다. 또한, EDC 3.79 g을 3차 증류수 15 mL에 용해시키고, 이를 히알루론산-NHS 용액에 첨가하였다. 히알루론산-NHS-EDC 용액을 제조하고, 도파민 3.00 g을 3차 증류수 15 mL에 용해하여 이를 히알루론산-NHS-EDC 용액에 넣어 5시간 이상 상온에서 반응을 진행하였다(히알루론산-NHS-EDC-도파민 용액). 반응이 완료되면 투석막(MWCO: 12,000-14,000, SpectraPor)을 이용하여 투석을 실시하였으며, 투석이 완료된 물질은 동결건조하여 보관하였다.
본 실시예에서 제조된 히알루론산-카테콜 지혈용 스폰지 2 mg을 초순수 1 mL에 용해시켜 카테콜 결합율을 확인하였다. 자외선-가시광선 분광광도계를 이용하여 카테콜 결합율을 측정한 결과로서, 히알루론산 한 분자당 카테콜의 결합율은 4.3% 임을 확인하였다.
제조예 3: 키토산-카테콜의 합성
고분자 용액을 제조하기 위하여 준비된 반응기에 300 mL 3차 증류수를 담고, 증류수가 담긴 반응기에 미리 소분한 키토산 3 g을 혼합하였다. 혼합된 고분자 용액(키토산 용액)에 5M 염산용액 3 mL을 첨가하여 적절히 교반하면서 용해하였다. 상기 용액에 0.5M 수산화나트륨용액 8 mL을 첨가하여 적절히 교반하면서 용해하였다. 상기 용액을 육안으로 관찰하고, 키토산이 완전히 용해되었음을 확인하였다.
HCA 2.07 g을 3차 증류수 10 mL에 용해시키고, 이를 교반 중인 키토산 용액에 첨가하여 키토산-HCA 용액을 제조하였다. 또한, EDC 1.77 g을 에탄올 200 mL에 용해시키고, 이를 키토산-HCA 용액에 넣어 1시간 이상 상온에서 반응을 진행하였다. 반응이 완료되면 투석막(MWCO: 12,000-14,000, SpectraPor)을 이용하여 투석을 실시하였으며, 투석이 완료된 물질은 동결건조하여 보관하였다.
본 실시예에서 제조된 키토산-카테콜 지혈용 스폰지 2 mg을 초순수 1 mL에 용해시켜 카테콜 결합율을 확인하였다. 자외선-가시광선 분광광도계를 이용하여 카테콜 결합율을 측정한 결과로서, 키토산 한 분자당 카테콜의 결합율은 8.9%임을 확인하였다.
제조예 4: 젤라틴 층/결속 층/키토산-카테콜 층 구조의 지혈용 다중 층 스폰지의 제조
본 제조예에서는 지혈용 기구의 다공성 매트릭스로서 젤라틴을 이용하고, 지혈 층으로서 상기 제조예 3에서 만든 키토산-카테콜을 이용하여 지혈용 다중 층 스펀지를 제조하였다.
지혈용 다중 층 스폰지의 지혈 층으로 제조예 3의 동결건조 된 키토산-카테콜을 1 g을 100 mL 3차 증류수에 넣고 교반하여 용해하여 지혈 층 형성용 용액을 준비하였다. 이렇게 준비한 용액의 점도 값은 74.3 cP로 확인되었다. 몰드에 준비된 용액을 분주한 다음, 분주된 용액 위에 지혈용 다중 층 스폰지의 다공성 매트릭스로서 젤라틴(흡수성 고분자 스폰지)를 용액 위에 올려 지혈 층 형성용 용액이 젤라틴에 적절히 함침되도록 한 후 동결건조하였다.
그 결과, 젤라틴을 포함하는 다공성 매트릭스 층(하단), 결속 층(중단) 및 카테콜기가 도입된 키토산을 포함하는 지혈 층(상단)으로 구성되는 지혈용 다중 층 스펀지를 수득하였다.
제조예 5: 젤라틴 층/결속 층/키토산-카테콜 층 구조의 지혈용 다중 층 스폰지의 제조
지혈 층으로서 키토산-카테콜 0.5 g을 100 mL 3차 증류수에 용해한 용액을 준비한 것을 제외하고는 제조예 4와 동일한 방법으로 지혈용 다중 층 스펀지를 수득하였다. 상기 지혈 층 형성용 용액의 점도 값은 25.7 cP로 확인되었다.
제조예 6: 젤라틴 층/결속 층/젤라틴-카테콜 층 구조의 지혈용 다중 층 스폰지의 제조
지혈 층으로서 젤라틴-카테콜 1 g을 100 mL 3차 증류수에 용해하여 준비한 것을 제외하고는 제조예 4와 동일한 방법으로 지혈용 다중 층 스펀지를 수득하였다. 상기 지혈 층 형성용 용액의 점도 값은 14.6 cP로 확인되었다.
제조예 7: 젤라틴 층/결속 층/히알루론산-카테콜 층 구조의 지혈용 다중 층 스폰지의 제조
지혈 층으로서 히알루론산-카테콜 1 g을 100 mL 3차 증류수에 용해하여 준비한 것을 제외하고는 제조예 4와 동일한 방법으로 지혈용 다중 층 스펀지를 수득하였다. 상기 지혈 층 형성용 용액의 점도 값은 13.3 cP로 확인되었다.
제조예 8: 젤라틴 층/결속 층/키토산-카테콜 층 구조의 지혈용 다중 층 스폰지의 코팅 공정을 이용한 제조
지혈용 다중 층 스폰지의 지혈 층으로 제조예 3의 동결건조된 키토산-카테콜 1.5 g을 100 mL 3차 증류수에 넣고 교반하여 용해하여 지혈 층 형성용 용액을 준비하였다. 상기 지혈 층 형성용 용액의 점도 값은 745 cP로 확인하였다. 젤라틴 층에 용해한 키토산-카테콜 용액을 고르게 바른 다음, 동결건조하여 지혈용 다중 층 스폰지를 수득하였다.
비교 제조예: 젤라틴 층/결속 층/키토산-카테콜 층 구조의 지혈용 다중 층 스폰지의 제조
지혈용 다중 층 스폰지의 제조 시에 다양한 키토산-카테콜 용액 점도 조건에서 실험한 결과, 4℃에서 회전형점도계로 측정한 점도값을 기준으로 10 내지 2,500 cP 범위의 지혈 층 형성용 용액을 사용하여 제조한 지혈용 스폰지에서는 결속 층이 잘 형성되어 다중 층 구조를 이루며 층 간 분리가 되지 않는 것을 확인하였다. 반면 상기 점도 범위를 벗어날 경우 안정한 구조의 다중 층 스폰지를 얻기 어려웠다.
도 3은 낮은 점도 값과 높은 점도 값을 갖는 키토산-카테콜 용액을 사용하여 젤라틴 층에 함침하여 제조한 지혈용 다중 층 스폰지의 구조를 나타낸 결과이다. 도 3을 참조하면, 키토산-카테콜 용액의 점도 값이 10 cP 이하에서는 도 3의 A와 같이 젤라틴 층을 함침하였을 때 젤라틴 층으로 흡수가 너무 많이 되어 다중 층 구조를 형성할 수 없었다. 또한 도 3의 B와 같이 키토산-카테콜 용액의 점도 값이 2,500 cP를 초과할 경우에는 결속 층이 형성되지 않아 충분한 결합력이 형성되지 못하여 젤라틴 층과 키토산-카테콜 층 사이가 분리되는 것을 확인하였다. 이때 도 3의 A에 나타낸 스폰지를 제조한 용액의 점도 값은 8.3 cP이며, 도 3의 B에 나타낸 스폰지를 제조한 용액의 점도 값은 2,717 cP였다.
실험예 1: 다중 층 구조의 스폰지 구조 관찰
본 실험예에서는 제조예 4에서 제조한 다중 층 구조의 스폰지의 절단면을 주사전자현미경 (SEM, Scanning electron microscope)을 이용하여 40배, 200배 확대하여 스폰지의 구조를 관찰하였다.
도 4는 다중 층 구조의 스폰지의 절단면을 주사전자현미경으로 관찰한 사진이다. 도 4를 참조하면, 지혈 층(상단), 결속 층(중단) 및 다공성 매트릭스 층(하단)의 3중 구조로 제조되었음을 확인할 수 있었다.
결속 층의 두께를 분석한 결과, 제조예 4는 390±40 ㎛, 제조예 5는 900±90 ㎛, 제조예 8은 310±100 ㎛로 측정되었다.
실험예 2: 스폰지의 인장강도 측정
본 실험예에서는 젤라틴 스폰지, 키토산 스폰지 및 제조예 4와 같이 제조한 다중 층 구조의 스폰지의 각 절단면의 너비 0.6 cm, 길이 0.5 cm로 검체를 잘라 준비하였다. 시험장치는 만능재료시험기를 이용하여 검체의 양 끝을 고정시키고, 5.0 mm/min의 속도로 잡아당겨 검체편이 절단될 때의 최대 힘(N)을 측정하였으며, 실험은 독립적으로 5회 수행하였다.
표 1은 스폰지의 강도 특성 분석 결과를 보여주는 것으로 해당 시험을 통해 얻은 값 중 탄성계수(modulus of elasticity, stress-strain curve의 기울기)의 경우 각 젤라틴 스폰지는 0.85, 키토산 스폰지는 1.02이며, 이와 비교하여 다중 층 구조의 스폰지의 경우에는 젤라틴 스폰지의 2.01배, 키토산 스폰지의 1.68배로 증가한 탄성계수 값을 확인하였다.
구분 젤라틴 스폰지 키토산 스폰지 다중 층 구조의 스폰지
Max load (N) 3.98 1.51 3.88
Tensile strain (%) 4.17 1.68 2.05
Tensile strength (N/mm2) 0.13 0.05 0.13
Elastic modulus (N/mm2) 0.85 1.02 1.71
실험예 3: 스폰지의 밀폐력 비교
본 실험예에서는 젤라틴 스폰지, 키토산 스폰지 및 제조예 4와 같이 제조한 다중 층 구조의 스폰지의 밀폐력을 비교하기 위하여 젤라틴 스폰지, 키토산 스폰지 및 제조예 4에서 제조된 다중 층 구조의 스폰지에 붉은 염료 용액을 떨어트려 각 스폰지의 윗면과 아랫면을 관찰하였다.
도 5는 지혈용 스폰지의 밀폐 특성 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 5를 참조하면, 젤라틴 스폰지와 다중 층 구조의 스폰지는 밀폐력이 있어 붉은 염료 용액이 아랫면에서만 관찰되었고, 키토산 스폰지는 밀폐력이 없어 아랫면에서 윗면까지 붉은 염료 용액이 모두 스며든 것을 확인할 수 있었다.
실험예 4: 돼지 대장 조직에서의 접착력 비교
본 실험예에서는 젤라틴 스폰지, 키토산 스폰지 및 제조예 4와 같이 제조한 다중 층 구조의 스폰지의 조직에서의 접착력을 비교하기 위하여 각 스폰지를 1.0 x 1.0 cm 크기로 절단하고, 직사각형의 대장 조직을 준비하였다. 대장 조직에 동물의 혈액을 떨어트리고, 그 대장 조직에 1.0 x 1.0 cm 크기의 각 스폰지를 접착시킨 후 만능재료시험기에 양 끝을 고정시켜 접착된 대장 조직과 스폰지가 분리될 때의 인장전단강도 (Tensile-shear strength, N)를 측정하여 접착력 (kPa)을 구했으며, 실험은 독립적으로 3회 수행하였다.
표 2는 각 스폰지가 혈액이 뭍어있는 돼지 대장 조직에서의 접착력을 나타낸 것으로, 젤라틴 스폰지 < 키토산 스폰지 < 다중 층 구조의 스폰지 순으로 조직 접착력이 높아지는 것을 확인하였다. (실험값: 평균 ± 표준편차)
구분 접착력 (kPa)
젤라틴 스폰지 5.23 ± 0.46
키토산 스폰지 11.80 ± 1.30
다중 층 구조의 스폰지 16.93 ± 9.25
실험예 5: 돼지 대장 조직에서의 밀폐와 접착 특성
본 실험예에서는 젤라틴 스폰지, 키토산 스폰지 및 제조예 4와 같이 제조한 다중 층 구조의 스폰지의 밀폐력과 접착력 특성을 분석하기 위하여 각 스폰지를 Bursting 시험기를 이용하여 분석을 실시하였으며, 실험은 독립적으로 3회 수행하였다.
돼지의 대장 조직에 지름 0.8 cm 펀치를 이용하여 구멍을 내고, 각 젤라틴 스폰지, 키토산 스폰지 및 이중 층 구조의 스폰지를 2.0 x 2.0 cm로 재단하여 지름 8 mm의 구멍 위에 올려놓았다. 2.0 x 2.0 cm의 젤라틴 스폰지, 키토산 스폰지 및 다중 층 구조의 스폰지를 각각 올려놓은 대장 조직을 Bursting 시험기 판 위에 위치시켰고, bursting 시험기 내부로 바람을 불어넣어 대장 조직으로부터 각 스폰지가 분리되는 압력을 확인하였다.
표 3은 밀폐-접착 특성 분석 결과를 나타낸 것으로, 젤라틴 스폰지는 조직과의 접착력이 없어 쉽게 떨어져 접착력이 0에 가까웠고, 키토산 스폰지는 밀폐력이 없어 시험기 내부로 바람을 불어넣었을 때 스폰지의 기공 사이로 바람이 새어나와 압력을 측정할 수 없었다. 반면에 다중 층 구조의 스폰지는 밀폐력과 조직 접착력을 모두 갖추고 있기 때문에 밀폐-접착력 분석이 가능하였으며, 돼지 대장 조직에 대한 다중 층 구조의 스폰지는 평균 37.8 hPa의 밀폐-접착력을 갖는 것을 알 수 있었다.
구분 압력(hPa) 평균 표준편차

키토산 스폰지		 약 0
-
-
약 0
약 0

젤라틴 스폰지		 약 0
-
-
약 0
약 0

다중 층 구조의 스폰지		 35.5
37.8
2.8
37.8
41.3
실험예 6: 사용자 편의성 비교
본 실험예에서는 수술 중 체내의 수분 환경을 고려하여 지혈제 용도로서 제조된 각 스폰지가 수술 기구 등에는 비접착하고, 생체 조직에는 접착할 수 있는지 그 능력을 평가하였다.
각 스폰지를 1.0 x 1.0 cm 크기로 절단하고, 생리식염수에 노출된 포셉(Forcep)과 직사각형의 대장 조직을 준비하였다. 1.0 x 1.0 cm 크기의 각 스폰지를 생리식염수에 노출된 포셉으로 접착시킨 후 포셉으로부터 스폰지가 분리되는지 확인하였다. 같은 방법으로 준비된 대장 조직에 각 스폰지를 접착시켜 조직으로부터 스폰지가 분리되는지 확인하였다.
표 4는 각 스폰지가 생리식염수에 노출된 포셉 또는 대장 조직에서 접착 후 분리되는지를 확인하여 나타낸 것으로 젤라틴 스폰지는 기구와 조직에서 모두 접착성이 낮았고, 키토산 스폰지는 기구와 조직에서 모두 접착성이 높았다. 다중 층 구조의 스폰지는 기구가 닿는 표면은 기구 접착성이 낮으면서 조직과 닿는 면은 조직 접착성이 높아 사용자 편의성을 비교하였을 때 다른 스폰지에 비해 우월함을 확인하였다.
구분 기구 접착성 조직 접착성
젤라틴 스폰지 낮음 낮음
키토산 스폰지 높음 높음
다중 층 구조의 스폰지 낮음 높음
실험예 7: 랫트 간 출혈 모델에서의 지혈 성능
본 실험예에서는 제조예 4에서 제조된 지혈용 다중 층 스폰지를 랫트 간 출혈 모델에 적용하여 지혈 성능을 평가하였다.
평가에 사용한 동물은 Sprague Dawley 종이며, 9 주령 된 수컷 랫트(Rat)이다. 시험군은 출혈 유도 후 아무런 처리를 하지 않은 '대조군' 및 젤라틴 스폰지 또는 제조예 4에서 제조된 다중 층 구조의 스폰지를 적용한 '실험군'으로 설정하여 실험하였다.
랫트를 완전한 마취상태를 유도한 후 시술 부위를 소독하였다. 복부 가운데를 절개하여 개복한 후, 간을 노출시키고 노출된 간에 멸균 생리식염수를 뿌려 이물질을 제거한다. 노출된 간의 중앙에 매스를 이용하여 상처(injury)를 내어 출혈을 유도하였다.
대조군은 상처를 내어 유도된 출혈에 아무런 처리를 하지 않았고, 실험군은 젤라틴 스폰지 또는 제조예 4에서 제조한 다중 층 구조의 스폰지)를 출혈 부위에 올려놓았다.
표 5는 출혈 유도 후 3분이 되는 시점에서 육안으로 지혈이 되었는지 확인한 결과로서, 대조군과 젤라틴 스폰지는 모든 개체에서 출혈 3분 이후에도 지혈되지 않아 출혈 3분 내 지혈 달성도 0% 나타낸 반면, 실험군인 다중 층 구조의 스폰지의 경우에는 출혈 3분 내에 모든 개체가 지혈되어 출혈 3분 내 지혈 달성도 100%를 보였다. 따라서 다중 층 구조의 스폰지가 랫트 간 절개 출혈 부위에서 지혈효과가 있음을 확인하였다.
구분 3분 이내 지혈여부 지혈 달성도 (%)

대조군		 ×
0
×
×

젤라틴 스폰지		 ×
0
×
×

다중 층 구조의 스폰지		 ○
100
○
○
실험예 8: 랫트 경동맥 출혈 모델에서의 지혈 성능
본 실험예에서는 제조예 4에서 제조된 다중 층 구조의 스폰지를 랫트 경동맥 출혈 모델에 적용하여 지혈 성능을 평가하였으며, 실험은 독립적으로 3회 수행하였다.
평가에 사용한 동물은 Sprague Dawley 종이며, 9 주령 된 수컷인 랫트(Rat)이다. 시험군은 출혈 유도 후 거즈로 적용한 '대조군' 및 제조예 4에서 제조된 다중 층 구조의 스폰지를 적용한 '실험군'으로 설정하여 실험하였다.
랫트를 완전한 마취상태를 유도한 후 시술 부위를 소독하였다. 랫트의 턱 아래부터 가슴까지 가운데 부위를 약 3 cm 절개한 후, 확보된 경동맥 혈관을 31G 니들을 이용하여 출혈을 유도하였다.
대조군은 거즈를 사용하여 출혈 부위를 덮어 압박지혈하고, 실험군은 제조예 4에서 제조한 다중 층 구조의 스폰지와 거즈를 함께 포개어 출혈 부위를 덮어 압박지혈 하였다. 2분 후 지혈 부위의 clot에 손상을 가하지 않도록 거즈 또는 거즈와 포개진 다중 층 구조의 스폰지를 조심히 떼어내고 지혈 여부를 육안으로 확인하였다.
표 6는 출혈 후 2분이 되는 시점에서 육안으로 지혈이 되었는지 확인한 결과로서, 거즈 압박 지혈을 실시한 대조군에서는 모든 개체에서 출혈 후 2분에 지혈이 되지 않은 반면, 제조예 4에서 제조한 다중 층 구조의 스폰지 적용한 실험군의 경우에는 출혈 후 2분에 모든 개체에서 지혈이 되어 출혈 2분 내 지혈 달성도 100%를 보였다. 따라서 다중 층 구조의 스폰지가 랫트 경동맥 출혈 부위에서 지혈효과가 있음을 확인하였다.
구분 무게 (g) 2분 이내
지혈 여부		 지혈 달성도 (%)
대조군 307 × 0
313 ×
315 ×
다중 층 구조의 스폰지 316 ○ 100
312 ○
315 ○
실험예 9: 다중 층 구조의 스폰지의 세포독성 및 피내반응 평가
본 실험예에서는 제조예 4에서 제조된 다중 층 구조의 스폰지의 세포독성 및 피내반응을 확인하였다.
세포독성시험은 간접법으로 수행하였으며, 2.0 % Agar와 2xMEM 배지를 각각 1:1 비율로 혼합하여 마우스 유래 세포 L929 위에 중층한 후 그 위에 1.0 x 1.0 cm로 절단한 다중 층 구조의 스폰지를 올려두고 5% CO2와 포화수증기 상태인 37±1℃로 설정된 배양기에서 배양하였다. 배양 48시간 후 정립현미경을 이용하여 세포의 상태를 관찰하였다. Neutral Red를 약 2 mL 적용하고, 배양기에서 15분~30분 동안 반응시켰다. Neutral Red를 제거한 후 PBS로 세척하여 탈색반응이 있는지 확인하였다.
피내반응시험은 체중 2.0 kg 이상의 건강한 New Zealand White계 토끼 3마리를 선정하여 각각의 등 부위 제모를 실시하였고, 피내에 준비한 각 스폰지의 용출물을 0.2 mL씩 피내에 주사하였다. 주사부위의 홍반과 부종 반응 등 양상을 관찰하였다.
표 7은 세포독성과 피내반응을 확인한 결과로서, 세포독성의 경우 젤라틴 스폰지와 다중 층 구조의 스폰지는 스폰지의 바로 밑부분의 약간의 변형되거나 퇴화한 세포가 관찰되었고, 키토산 스폰지는 바로 밑부분에만 제한된 세포변형 및 탈색반응을 확인하였다. 이 결과로부터 모든 스폰지에서의 세포독성이 미미하다고 판단될 수 있었다. 피내반응의 경우 모든 스폰지의 용출물을 피내주사 시 홍반 및 부종 등이 관찰되지 않아 피내반응을 유발하지 않는 물질로 평가되었다.
구분 세포독성 피내반응
젤라틴 스폰지 적합 적합
키토산 스폰지 적합 적합
다중 층 구조의 스폰지 적합 적합

Claims (13)

  1. 생체적합성 고분자를 포함하는 다공성 매트릭스 층;
    상기 다공성 매트릭스 층 위에 적재되며, 하이드록시기를 하나 이상 구비한 벤젠고리를 함유한 잔기가 도입된 고분자를 포함하는 지혈 층; 및
    상기 다공성 매트릭스 층과 상기 지혈 층 사이에 개재되어 상기 다공성 매트릭스 층과 상기 지혈 층이 분리되지 않도록 하는 결속 층을 포함하고,
    상기 결속 층을 이루는 성분은 상기 다공성 매트릭스 층과 상기 지혈 층 각각에 대해 혼화성을 갖는 재료인 것인 지혈용 기구.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 생체적합성 고분자는 천연 생분해성 고분자 또는 합성 생분해성 고분자인 것인 지혈용 기구.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 다공성 매트릭스 층은 젤라틴 패드 또는 콜라겐 패드인 것인 지혈용 기구.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 지혈 층에 포함된 상기 고분자는 페놀 함유 잔기 또는 다가페놀 함유 잔기가 도입된 고분자인 것인 지혈용 기구.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 고분자는 생체적합성 고분자인 것인 지혈용 기구.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 페놀 함유 잔기 또는 상기 다가페놀 함유 잔기는 각각 페놀-L- 또는 다가페놀-L-의 형태이고, 여기서 L은 단일결합, 탄소수 1 내지 10개의 지방족 탄화수소기 사슬 또는 탄소수 3 내지 10개의 지환족 탄화수소기 사슬이며, L을 이루는 사슬 내에 -O-, -S-, -NH-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)O- 또는 -C(O)NH-가 포함될 수 있는 것인 지혈용 기구.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 지혈 층은 -OH를 구비한 벤젠 고리와 =O를 구비한 벤젠 고리를 동시에 포함하는 것인 지혈용 기구.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서,
    상기 재료는 상기 다공성 매트릭스 층을 이루는 주성분과 상기 지혈 층을 이루는 주성분의 블렌드이거나 공중합체인 것인 지혈용 기구.
  10. 제4항에 있어서,
    결속 층은 상기 생체적합성 고분자와 상기 페놀 함유 잔기 또는 다가페놀 함유 잔기가 도입된 고분자의 혼합 영역을 포함하는 것인 지혈용 기구.
  11. (a) 페놀 또는 다가페놀 함유 잔기가 도입된 고분자를 물에 용해시켜 지혈 층 형성용 용액을 준비하는 단계;
    (b) 생체적합성 고분자로 이루어진 다공성 매트릭스를 제공하는 단계;
    (c) 상기 지혈 층 형성용 용액을 상기 다공성 매트릭스의 표면에 접촉시켜 상기 다공성 매트릭스의 공극 내에 함침시키는 단계; 및
    (d) 상기 지혈 층 형성용 용액을 건조시켜 상기 다공성 매트릭스 표면 위에 지혈 층을 형성하는 동시에 상기 다공성 매트릭스와 상기 지혈 층의 계면에 결속 층을 형성하는 단계를 포함하고,
    상기 지혈 층 형성용 용액의 점도는 4℃에서 회전형 점도계로 측정한 점도값을 기준으로 10 내지 2,500 cP인 것인 지혈용 기구의 제조방법.
  12. 삭제
  13. 제11항에 있어서,
    상기 결속 층의 두께는 1 내지 1,500 ㎛인 것인 지혈용 기구의 제조방법.


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