CN115335093A - 止血器具及其制造方法 - Google Patents

Abstract

提供一种止血器具。所述止血器具包括:包括生物兼容性聚合物的多孔基质层；加载于该多孔基质层上并且包括其中引入了含多元酚的部分的聚合物的止血层；以及结合层，其介于多孔基质层和止血层之间以防止多孔基质层与止血层分离。

Description

止血器具及其制造方法

技术领域

本发明公开涉及一种止血器具及其制造方法。更具体地说，本发明公开涉及一种具有改进的止血性能、粘合性能、密封性能和吸收性能的止血器具及制造该止血器具的方法。

背景技术

当今的外科技术已经取得很大的进步，但停止手术中出血的止血技术仍处于早期发展阶段。止血剂的主要目的是停止出血。止血剂需要具备多种功能使其正确使用。具体而言，止血剂应具有停止出血的功能。止血剂应固定地附着在需要止血的所需组织部位，以实现其止血功能。止血剂应具有吸收血液和减少失血的附加功能。

许多止血剂是广为人知并且是目前可商购取得。此类止血剂包括基于纤维蛋白的止血剂(其在身体的血液凝固机制的最后阶段使用纤维蛋白)、基于氰基丙烯酸酯的止血剂(基于与实时粘合剂相同的成分和原理以诱导止血)(参见例如韩国专利公开第2009-0077759号)、以及作为止血的物理屏障的由壳聚糖、明胶、胶原蛋白等天然聚合物材料组成的止血剂。然而，基于纤维蛋白的止血剂具有源于生物体成分的疾病感染的风险，并且难以应用于服用抗凝剂的患者的止血。基于氰基丙烯酸酯的止血剂当在体内降解时会产生甲醛等有毒物质。由天然聚合物材料组成的止血剂不具有比预期的更好的止血性能和更低的对活组织的粘合强度。此外，该聚合物的一些在密封性和吸收性上较差。

不溶于血的海绵状结构已知为用于止血的医疗产品。这些医疗产品基于体内凝血机制从出血部位吸收血液并停止出血。该医疗产品是方便使用的，因为它们由于缺乏粘合性而不会粘合到手术器械上。由于其吸收血液的能力，该医疗产品可以将血液从出血部位密封。然而，该医疗产品需要另一个手段用于与出血部位的组织紧密接触，因为它们不倾向于粘合到活组织上。另一个缺点是该医疗产品的止血性能差。

另一种已知的用于止血的医疗产品是一种血溶性膜结构。在与来自出血部位的血液接触时，该医疗产品溶解以在出血部位形成物理薄膜并粘合到出血部位。基于此机制，该医疗产品实现止血。由于其粘合功能，该医疗产品排除使用另一个手段以粘合到活组织的不便。该医疗产品具有止血性能优异的优点，但其容易粘到手术器械上而造成使用上的不便，并且不能将血液从出血部位密封。

发明内容

发明的详细说明

解决问题的手段

根据本公开的一个方面，提供一种止血器具，包括:包括生物兼容性聚合物的多孔基质层；加载于该多孔基质层上的止血层并且该止血层包括其中引入了含有具有一个或多个羟基的苯环的部分的聚合物；以及结合层，其介于多孔基质层和止血层之间以防止多孔基质层与止血层分离。

根据本公开的另一个方面，提供一种制造止血器具的方法。在一个实施方式中，该方法包括(a)溶解聚合物于水中以制备用于形成止血层的溶液，该聚合物包括引入于其中的含酚或多元酚的部分，(b)提供由生物相容性聚合物组成的多孔基质，(c)将用于形成止血层的溶液与多孔基质的表面接触，使得该用于形成止血层的溶液浸渍到多孔基质的孔中，以及(d)干燥该用于形成止血层的溶液以同时在该多孔基质的表面上形成止血层并在该多孔基质和该止血层之间的界面形成结合层。

附图说明

图1是说明止血器具的一个实施方式的示意剖面图。

图2是说明当根据一个实施方式的止血器具应用于出血部位时的止血和血液密封过程的示意图。

图3示出止血多层海绵的结构，其是通过将具有低粘度的壳聚糖-儿茶酚溶液浸渍至明胶层中制成的止血多层海绵结构和通过将具有高粘度的壳聚糖-儿茶酚溶液浸渍至明胶层中制成的止血多层海绵结构。

图4示出多层海绵的横截面扫描电子显微镜图像。

图5示出显示止血海绵的密封性分析结果的照片。

具体实施方式

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。通常，此处和下文中使用的学术用语是本领域公知和常用的。

现在将参照附图而更详细地描述本文公开的各种实施方式。

本发明公开的一个方面提供一种止血器具。图1是说明该止血器具的一实施方式的示意剖面图。参考图1，止血器具100包括:多孔基质层110，其包括生物兼容性聚合物；止血层130，其装载在该多孔基质层110上并包括了其中引入了含多元酚的部分的聚合物；以及结合层120，其介于该多孔基质层110和该止血层130之间以防止该多孔基质层110与该止血层130分离。

多孔基质层110可为编织织物、非编织织物、发泡聚合物或海绵的形式。多孔基质层110可与损伤部位诸如出血部位接触并且可以具有多个孔以容纳吸收的体液。多孔基质层110可保留引入其中的血液、渗出液和其他流体，以防止它们溢出损伤部位，而实现止血。基质优选由具有适当弹性并且对诸如血液的液体具有良好润湿性和吸收性的生物兼容性聚合物组成。孔在基质中可以相互内连以形成三维结构。

生物兼容性聚合物优选为在体内应用后可通过酶促降解、生物降解或水解而随时间在体内吸收的材料。

生物兼容性聚合物优选为不溶于血液的材料。特别地，生物兼容性聚合物为在体内条件的约37℃的中性pH值下不溶于水。生物兼容性聚合物在体内应用后3个月内被生物降解，优选为在8周内被生物降解。优选为生物兼容性聚合物在伤口闭合后达到预期目的后的上述期间内自然降解。

生物兼容性聚合物可为天然或合成的可生物降解聚合物。具体而言，天然可生物降解聚合物可选自由胶原蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白、明胶、弹性蛋白、甲壳质、壳聚糖、淀粉、右旋糖、右旋糖酐、海藻酸、透明质酸、纤维素、它们的衍生物、以及它们的共聚物组成的组。具体而言，合成可生物降解聚合物可选自由聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚(ε-己内酯)(PCL)、聚羟基链烷酸酯、聚酐、聚原酸酯、多胺、它们的衍生物、及它们的共聚物组成的组。提供前述可生物降解聚合物仅用于说明目的。可使用包括可水解骨架诸如酰胺、脂肪族酯、脲、氨基甲酸酯、醚或肽骨架的任何聚合物而没有特别限制。

生物兼容性聚合物的衍生物可以是生物兼容性聚合物的盐。或者，生物兼容性聚合物的衍生物可以是生物兼容性聚合物的官能基团(例如，-OH、-SH、-NH₂、-COOH或-NHC(O)CH₃)被其他亲水性基团取代或改性而形成的改性产物或改性产物的其他生物兼容性聚合物或盐。

包括生物兼容性聚合物的基质可以是例如明胶或胶原蛋白垫，其在体内移植后引起较少的炎症反应并提供优异的生物功能性和生物降解性。由于止血后相应组织中大量表达的蛋白酶的作用，明胶及胶原蛋白垫以上述高速率降解。基质具有生物兼容性聚合物的主要止血作用。基质的二次止血作用是由于体液的吸收和膨胀基质的有效压缩。此外，基质具有优异的密封性能。

生物兼容性聚合物可以是交联的或未交联的。生物兼容性聚合物优选具有不溶于水并且即使暴露于血液也能保持其形状的交联结构。生物兼容性聚合物可形成可吸收血液同时保持其形状的多孔结构。多孔结构可以赋予基质血液密封性。

生物兼容性聚合物可由可加工成多孔基质的纤维状、粉末状或液体原料制备。生物兼容性聚合物的制备可以涉及在1.5-4的pH值下酸化和用碱性溶液中和。可以通过冷冻干燥生物兼容性聚合物的凝胶、悬浮液或溶液来制备使用生物兼容性聚合物的多孔基质。可以通过在有机溶剂中将原料与交联剂混合并聚合该原料来使基质交联。交联剂可以是例如戊二醛、甲醛、乙醛、乙烯甲醛、乙醛或乙烯异丙醇。

多孔基质层110的厚度没有特别限制，但为1至20毫米(mm)，优选为1至15毫米。如果厚度小于下限，则多孔基质层不能作为对血液的充分吸收屏障。同时，如果厚度超过上限，体内降解可能需要花很长时间。

止血层130作为与多孔基质层110分离的层而存在，并且可以经由结合层120与多孔基质层110堆叠而不与多孔基质层110分离。止血层130包括聚合物，其中引入了含有具有一个或多个羟基的苯环的部分(即，含酚或多元酚的部分)。含有苯环的部分是含有多元酚的部分，从止血性能和粘合性能方面来说是优选的。多元酚是指具有两个以上羟基(-OH)的苯环。多元酚优选为具有两个羟基(-OH)的儿茶酚(-OH)或具有三个羟基(-OH)的倍酚(gallol)。在一些实施方式中，酚或多元酚的一些氢原子可以被其他亲水性官能基团取代。

聚合物优选为生物兼容性聚合物。生物兼容性聚合物可为天然或合成的可生物降解聚合物。具体而言，生物兼容性聚合物与上述用于多孔基质层110的聚合物相同。

聚合物可选自由明胶、胶原蛋白、纤维蛋白、弹性蛋白、透明质酸、海藻酸、海藻酸盐、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素、羟甲基纤维素、纤维蛋白、肝素、甲壳质、壳聚糖、以及它们的衍生物组成的组，考虑到止血性能、生物降解性、以及组织再生效果，它们是优选的。

含酚的部分或含多元酚的部分诸如儿茶酚或倍酚可例如通过官能基团诸如-NH₂、-SH、-OH或-COOH连接到聚合物骨架的侧链或末端。含酚或多元酚的部分可以用“酚-L-”或“多元酚-L-”表示，其中L可为单键、任选含有-O-、-S-、-NH-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)O-或-C(O)NH-的C₁-C₁₀脂肪烃链或任选含有-O-、-S-、-NH-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)O-或-C(O)NH-的C₃-C₁₀脂环烃链。

通常，含酚或多元酚的部分可通过生物兼容性聚合物的官能基团与含酚或多元酚的化合物的末端基之间的反应而与生物兼容性聚合物缀合。该反应可以通过各种途径引入，诸如化学合成、电化学合成、以及酶促合成。

基于生物兼容性聚合物中的重复单元的总摩尔数，含酚或多元酚的部分可以以1至50摩尔％、1至40摩尔％、1至30摩尔％或2至25摩尔％的量存在。如果含酚或多元酚的部分的含量低于下限，则可能导致血液溶解度低以及止血性能和粘合性能差。同时，如果含酚或多元酚的部分的含量超过上限，则儿茶酚可能被氧化。

各种材料适用于止血层130。反应流程图1和2示出壳聚糖聚合物的合成方法，其中通过壳聚糖聚合物和含儿茶酚的化合物之间的反应引入了含儿茶酚的部分。

[反应流程图1]

[反应流程图2]

其中x、y和z都是整数，并且m是50至6,000的整数。

反应流程图1示出通过碳二亚胺偶联形成酰胺部分，其中羧酸封端的儿茶酚诸如3,4-二羟基氢肉桂酸(即氢咖啡酸)与壳聚糖骨架的胺基团偶联。反应在5至6的pH值下进行，以防止儿茶酚氧化。使用质子溶剂诸如乙醇以防止在反应过程中不溶于水的壳聚糖的沉淀。由于这种酰胺偶联的结果，儿茶酚通常以相对于胺基团的4至30摩尔％的取代度被引入至聚合物骨架中。通过数天的长时间反应，可以引入取代度为80摩尔％或更高的摩尔。

反应流程图2示出还原性胺化反应，其中醛封端的儿茶酚诸如3,4-二羟基苯甲醛与壳聚糖骨架的胺基反应并且使用还原剂诸如NaBH₄将生成的亚胺键(-C＝N-)还原成-C-N-键。由于此还原性胺化的结果，儿茶酚可以在短时间内以18至80摩尔％的取代度引入至聚合物骨架中。

在与血液接触时溶解并形成凝胶的材料可用于止血层。如此的材料包括壳聚糖-儿茶酚、透明质酸-儿茶酚、明胶-儿茶酚、胶原蛋白-儿茶酚、多胺-儿茶酚、壳聚糖-倍酚、透明质酸-倍酚、明胶-倍酚、胶原蛋白-倍酚、以及多胺-倍酚。

在上述各种聚合物中，例如，已知聚合化合物诸如壳聚糖已知会停止出血。具体而言，壳聚糖中带正电的-NH₃ ⁺会吸引血液中带负电的血小板，从而使血小板迅速聚集，实现快速止血。然而，由于该特征限于pH 2的极酸性环境，壳聚糖在接近中性环境(pH 7)的活体中基本上缺乏止血能力。然而，根据本发明公开的止血器具的止血层中使用的聚合物是用诸如儿茶酚或倍酚的多元酚改性的，从而即使在诸如血液的中性水环境中也具有粘合特性。结果，改性聚合物溶解在血液中，一段时间后，它具有电吸引力而与红血球在出血组织部位形成止血膜。止血膜维持数日，并在体内可被酶自然降解。

由于苯酚或多元苯酚中存在芳香族和-OH基团，固体止血层130可以容易地溶解在血液中然后形成胶凝。止血层130的止血和粘合机制可以用多种方式来解释。止血层130通过芳香族基团之间的π-π相互作用、氢键、以及与金属离子的配位键或金属离子与芳环之间的阳离子-π键实现快速且强的止血并粘合到组织，而无需使用单独的特殊的交联剂或施加紫外线或热能。

在优选的实施方式中，止血层130可包括含酚或多元酚的部分及其氧化形式两种。结果，具有-OH的苯环和具有＝O的苯环可共存于止血层130的聚合物中。例如，引入止血层130的聚合物中的儿茶酚部分

的羟基(-OH)可在止血器具100的制造过程中被人工或自然氧化，以将一些儿茶酚部分转化为醌部分

含醌的部分可与诸如组织蛋白、血液蛋白或溶解在血液中的止血层的聚合物的有机材料中存在的-NH₂反应，而在蛋白质和儿茶酚部分之间形成共价键。共价键的形成可进一步增强止血层粘合组织和停止出血的能力。形成共价键后，醌部分的氧代基团(＝O)被还原成羟基(-OH)。羟基可以与有机材料中的氮原子和氧原子保持氢键。醌可以与胺反应形成共价键，例如，通过迈克尔型加成(反应流程图3)或席夫碱反应(反应流程图4)。

[反应3]

[反应4]

在一个实施方式中，基于含酚或多元酚的部分和氧化的部分的总摩尔数，止血层130中氧化的部分的含量可为50摩尔％或以下，优选为40摩尔％或以下，更优选为30摩尔％或以下。氧化的部分的含量的下限优选为0.1摩尔％或以上。在此范围内，可优化止血层130粘合到组织和停止出血的能力。如上所述，随着氧化的部分的含量增加，强键诸如共价键的数量增加。然而，从快速止血的观点来看，需要保持较高的-OH含量。因此，优选将-OH的含量控制在适当的范围内。

尽管通过共价键的结合机制比上述阳离子-π结合机制慢，但它可以诱导对组织蛋白的非常强的粘合强度。因此，当止血器具100应用于出血的人体组织时，可提高包括止血层130的止血器具100的停止出血和密封血液的能力。

随着生物兼容性聚合物中引入的含酚或多元酚的部分中与一个苯环结合的-OH基团的数量增加，氧化为醌形式的可能性随着时间的推移而增加，但能够与外来蛋白质相互作用的位点的数量增加，实现改善的止血性能和粘合性能。

结合层120介于多孔基质层110和止血层130之间。止血器具100具有多层结构，其中能够吸收血液的多孔基质层110结合至具有止血性能和粘合性能的止血层130上。非常重要的是，在止血器具100的运输和使用期间，两层彼此良好地结合，而不会相互分离。然而，因用于止血层130多孔基质层110的水溶性材料和不溶于水的材料具有不同的物理特性，所以没有个别粘合剂时可能难以将两层彼此结合。为了防止两层之间的分离，可以制备这些层的半成品并用另外的粘合剂将它们彼此粘合。然而，粘合剂的使用可能会受到毒性和工艺效率低下的限制。

止血层130的组成成分可以简单地涂布在多孔基质层110的表面上而无需使用额外的粘合剂。然而，在这种情况下，两层可能不能充分地彼此相互作用，导致它们之间的粘合性差。结果，在止血器具100的运输和使用期间，两层可能会彼此分离或脱落，严重影响最终产品的质量。

因此，结合层120用来防止多孔基质层110和止血层130彼此分离。结合层120优选为使用与多孔基质层110和止血层130混溶的材料所形成的。即，使用于多孔基质层110能够与蛋白质或多糖的各种官能基团(例如，-OH、-NH₂以及-COOH)以及于止血层130能够与蛋白质官能基团经由通过缩合反应的氢键或共价键相互作用的材料形成结合层。用于结合层的材料优选为衍生自多孔基质层110和止血层130的组成成分的材料。例如，用于结合层的材料可以是多孔基质层110的主要组成成分和止血层130的主要组成成分的混合物或共聚物。

可以以各种方式引入结合层120。例如，可以通过在层110和层130两层之间层压由结合层材料构成的薄膜、将结合层材料涂布在多孔基质层110上或将结合层材料浸渍至多孔基质层110中来引入结合层120。

在一优选的实施方式中，可以通过将止血层130的成分充分浸渍至多孔基质层110中来形成结合层120。结果，结合层120可包括生物兼容性聚合物和包括引入其中的含酚或多元酚的部分的聚合物的混合区域。止血层130的液体成分在浸渍期间中深入渗透到多孔基质层110中，使得构成多孔基质层110的生物兼容性聚合物的亲水基团可通过氢键与止血层130的成分的羟基强烈地相互作用，使结合层120发挥其作用。因此，使用层110和130的组成成分而无需单独的粘合剂可形成结合层120，避免了在使用额外的粘合剂时遇到的诸如毒性和生物降解性或生物吸收性差的问题。结合层与其他层110和130的混溶性也足够高以防止层110和130彼此分离。

在一个实施方式中，取决于如何形成结合层120，可以在混合区域中建立浓度梯度，其中含多元酚的部分的浓度在从止血层130到由生物兼容性聚合物构成的多孔基质层110的方向上降低。通过浓度梯度，多孔基质层110和止血层130可以通过介于其间的结合层120而彼此更牢固地结合

结合层120的厚度没有特别限制，通常为1至1500微米(μm)，优选为100至1200微米，更优选为200至1000微米。如果结合层120的厚度小于下限，则多孔基质层和止血层可能彼此分离。同时，如果结合层120的厚度超过上限，则可能无法区分多孔基质层，导致其吸收和密封性能劣化。

如上所述，结合层的存在确保层之间足够的粘合强度，而不会因使用额外的粘合剂而引起问题，同时保持止血器具的组成层所需的物理特性。结合层的存在也有利于实现要求的产品性能。

本发明公开的止血器具具有下述的有利效果。具有粘合性的止血层和具有密封性的多孔基质层的结合使得止血器具同时具有粘合性和密封性，使得止血器具无需额外的手段即可粘合至出血组织部位，同时防止止血器具在手术期间粘在手术器械上。因此，止血器具便于使用，具有优异的止血性能，并可密封出血部位的血液。

使用基于身体的凝血机制的基于纤维蛋白的止血剂的不利之处在于对服用抗凝剂的患者不能诱导止血。相反地，本发明公开的止血器具使用模拟3,4-二羟基苯丙氨酸(DOPA)的含多元酚部分，一种贻贝衍生蛋白质，其在水中表现出优异的粘合性能，实现对出血部位的高粘合强度。由于在含多元酚的部分中同时存在芳环和-OH官能基团，止血成分通过多种结合机制与血液蛋白结合，包括氢键、与金属的强配位键、共价键和阳离子-π键，而不是通过体内止血机制，使止血器具能够应用于任何患者并实现快速止血。

止血层和多孔基质层不是简单地结合在一起，而是通过结合层相互结合。结合层的存在防止止血层和多孔基质层在止血器具的运输和使用期间中彼此分离。

特别地，通过使用导入了含有具有羟基的苯环的部分的聚合物能够通过阳离子-π键等机制进行快速止血而作为止血层。此外，能够与外源蛋白共价结合的类醌部分的共存可以同时实现优异的止血和强粘合性。通过结合层与止血层牢固结合的多孔基质层的存在使得本发明公开的止血器具具有吸收和密封血液的能力以及止血性能和粘合性能。

本发明公开的止血器具可在室温下长期保存，即使在高湿环境下其品质也不会发生变化，不像传统的止血产品，传统的止血产品应该在冷藏条件下冷藏以保持其性能。在体内应用本发明公开的止血器具以达到止血、密封的目的后，在体内降解成对人体无害并且可被吸收的材料。因此，本发明公开的止血器具被认为是高度生物相容的。

图2是说明当止血器具应用于出血部位时的止血和血液密封处理的示意图。

根据本公开的另一方面，提供一种用于制造止血器具的方法。在一个实施方式中，该方法包括:(a)将包括引入其中的含多元酚部分的聚合物溶解于水中以制备用于形成止血层的溶液，(b)提供由生物兼容性聚合物组成的多孔基质，(c)将用于形成止血层的溶液与多孔基质的表面接触，使得该用于形成止血层的溶液浸渍到多孔基质的孔中，以及(d)干燥该用于形成止血层的溶液以同时在该多孔基质的表面上形成止血层并在该多孔基质和该止血层之间的界面形成结合层。

在步骤(a)，将包括引入其中的含多元酚部分的聚合物溶解于水中以制备用于形成止血层的溶液。基于100重量份的水，聚合物的用量为0.1至3重量份。用于形成止血层的溶液具有10至2,500cP的粘度，优选为10至1,500cP，更优选为10至1,000cP，使用旋转粘度计在4℃下测量时。

具有上述定义范围的适当粘度的用于形成止血层的溶液可以被很好地吸收和浸渍到多孔基质中。如果粘度小于下限，则可能形成具有过大厚度的结合层，并且用于形成止血层的溶液可能浸渍到最上层中，导致多孔基质层消失。同时，如果粘度超过上限，则多孔基质层和止血层可能会彼此分离并且可能不会形成结合层。

可通过化学合成、电化学合成或酶促合成方法，使用具有苯酚、儿茶酚或倍酚部分的化合物，将含酚或多元酚的部分引入生物兼容性聚合物链中。在一个实施方式中，在加热下将所述生物兼容性聚合物溶解于蒸馏水，将反应物，包括含酚或多元酚的化合物，加入到溶液中，并在4至6的pH下搅拌混合物。

例如，包括导入儿茶酚部分的聚合物的用于形成止血层的溶液是通过以下程序化学制备。首先，1-羟基-2,5-吡咯烷二酮(NHS)溶液被添加至聚合物溶液以制备聚合物/NHS混合溶液并且1-乙基-3-(-3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液被添加至聚合物/NHS混合溶液以制备聚合物/NHS/EDC混合溶液。随后，将多巴胺溶液添加到聚合物/NHS/EDC混合溶液中并与其反应以制备包含引入其中的含有儿茶酚部分的聚合物的止血层形成溶液。

根据本公开的方法，含酚或多元酚的化合物与生物兼容性聚合物之间的反应在水相中进行。在反应期间中，诸如儿茶酚的多元酚通过与水中的氧反应被氧化成醌类化合物。止血层中儿茶酚和醌的共存导致进一步提高的粘合性能和止血性能。

具体而言，在生物兼容性聚合物链中引入具有苯酚部分的化合物可以是例如酪胺、L-酪氨酸或根皮酸。具体而言，在生物兼容性聚合物链中引入了儿茶酚或倍酚部分的化合物可以是例如焦儿茶酚、L-多巴、多巴胺、去甲肾上腺素、咖啡酸、没食子酸、倍酚胺或2-氨基乙烷焦倍酚。

在步骤(c)，使用于形成止血层的溶液与多孔基质的表面接触。为此，例如，将用于形成止血层的溶液分配到PET模具中，将多孔基质布置在分配的溶液的顶部，并在冷藏条件下将用于形成止血层的溶液浸渍到多孔基质中。作为浸渍的结果，可以在多孔基质层和止血层之间引入结合层。在浸渍期间中，将结合层的厚度控制在1至1,500μm的范围内，优选100至1,200μm，更优选200至1,000μm。在这个厚度范围内，多孔基质层的吸收和密封性能可以保持在高水平。

在步骤(d)，将用于形成止血层的溶液冷冻干燥，在多孔基质的表面上形成固体止血层。结合层也可以完全地形成在多孔基质和止血层之间的界面处。

根据本公开的方法，可以通过浸渍工序以简单的方式制造具有由止血层、结合层和多孔基质层组成的多层结构的止血器具。

用本发明方法制作的止血器具对人体无害，具有止血、体内粘合、血液吸收和密封的功能。因此，所述止血器具可用于显著提高现有聚合物止血剂的性能。此外，所述止血器具对于停止出血有效，可应用于需要预防器官穿孔、胆汁渗漏、术后粘合的各个领域。此外，所述止血器具因在使用期间不粘合手术器械，所以使用上方便，并且由于成分不具有水解基团，所以在运输期间其质量不会变化。

将参考以下实施例更具体地解释本发明公开。这些实施例仅用于说明目的并且本公开的范围不应被解释为限于这些实施例，这对于本领域技术人员为显而易见的。

[实施例]

制备例1:明胶-儿茶酚的合成

将300mL的三重蒸馏水放入反应器中并且将已预先分成小份的3g明胶添加至其中。在加热下适当搅拌溶解混合物至少3小时以制备明胶溶液。通过目视观测确认明胶的完全溶解。

将在15mL三重蒸馏水中含1.12g 1-羟基-2,5-吡咯烷二酮(“NHS”)的溶液添加到搅拌的明胶溶液以制备明胶-NHS溶液。将在15mL三重蒸馏水中含1.87g 1-乙基-3-(-3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(“EDC”)的溶液添加到明胶-NHS溶液以制备明胶-NHS-EDC溶液。将在15mL三重蒸馏水中含1.23g多巴胺的溶液添加到明胶-NHS-EDC溶液以制备明胶-NHS-EDC-多巴胺溶液。反应在室温下进行至少5小时。反应完成后，使用透析膜(MWCO：12,000-14,000，SpectraPor)透析反应溶液。将产物冷冻干燥并储存。

将2mg生成的明胶-儿茶酚止血海绵溶解于1mL去离子水中。使用UV-Vis分光亮度计确认儿茶酚的结合率。结果，发现每个明胶分子的儿茶酚结合率为3.3％。

制备例2:透明质酸-儿茶酚的合成

将300mL的三重蒸馏水放入反应器中并且将已预先分成小份的3g透明质酸添加至其中。适当搅拌溶解混合物以制备透明质酸溶液。通过目视观测确认透明质酸的完全溶解。

将在15mL三重蒸馏水中含2.27g NHS的溶液添加到搅拌的透明质酸溶液以制备透明质酸-NHS溶液。将在15mL三重蒸馏水中含3.79g EDC的溶液添加到透明质酸-NHS溶液以制备透明质酸-NHS-EDC溶液。将在15mL三重蒸馏水中含3.00g多巴胺的溶液添加到透明质酸-NHS-EDC溶液以制备透明质酸-NHS-EDC-多巴胺溶液。反应在室温下进行至少5小时。反应完成后，使用透析膜(MWCO：12,000-14,000，SpectraPor)透析反应溶液。将产物冷冻干燥并储存。

将2mg生成的透明质酸-儿茶酚止血海绵溶解于1mL去离子水中。使用UV-Vis分光亮度计确认儿茶酚的结合率。结果，发现每个透明质酸分子的儿茶酚结合率为4.3％。

制备例3:壳聚糖-儿茶酚的合成

将300mL的三重蒸馏水放入反应器中并且将已预先分成小份的3g壳聚糖添加至其中。添加3mL的5M盐酸溶液至混合物中。以适当搅拌溶解生成的混合物并将8mL的0.5M氢氧化钠溶液添加至其中。适当搅拌溶解混合物以制备壳聚糖溶液。通过目视观测确认壳聚糖的完全溶解。

将在10mL三重蒸馏水中含2.07g HCA的溶液添加到搅拌的壳聚糖溶液以制备壳聚糖-HCA溶液。将在200mL乙醇中含1.77g EDC的溶液添加到壳聚糖-HCA溶液。反应在室温下进行至少1小时。反应完成后，使用透析膜(MWCO:12,000-14,000,SpectraPor)透析反应溶液。将产物冷冻干燥并储存。

将2mg生成的壳聚糖-儿茶酚止血海绵溶解于1mL去离子水中。使用UV-Vis分光亮度计确认儿茶酚的结合率。发现每个壳聚糖分子的儿茶酚结合率为8.9％。

制备例4:具有明胶层/结合层/壳聚糖-儿茶酚层结构的止血多层海绵的制造

在这个例子中，使用明胶作为多孔基质和制备例3中合成的壳聚糖-儿茶酚作为止血层，制备作为止血器具的止血多层海绵。

止血多层海绵的止血层通过以下步骤形成。首先，将制备例3中合成的冷冻干燥的壳聚糖-儿茶酚1g搅拌溶解于100mL三重蒸馏水中以制备用于形成止血层的溶液。发现溶液的粘度为74.3cP。将溶液分配到模具中后，将作为多孔基质的明胶(海绵状可吸收聚合物)放置在分配的溶液上，使得用于形成止血层的溶液适当地浸渍到明胶中，然后进行冷冻干燥。

生成的止血多层海绵由包括明胶的多孔基质层(底部)、结合层(中间)和包括其中引入的含有儿茶酚部分的壳聚糖的止血层(顶部)组成。

制备例5:具有明胶层/结合层/壳聚糖-儿茶酚层结构的止血多层海绵的制造

除了将0.5g的壳聚糖-儿茶酚溶解于100mL的三重蒸馏水以制备用于形成止血层的溶液之外，以与制备例4中相同的方式制造止血多层海绵。发现用于形成止血层的溶液的粘度为25.7cP。

制备例6:具有明胶层/结合层/明胶-儿茶酚层结构的止血多层海绵的制造

除了将1g的明胶-儿茶酚溶解于100mL的三重蒸馏水以制备用于形成止血层的溶液之外，以与制备例4中相同的方式制造止血多层海绵。发现用于形成止血层的溶液的粘度为14.6cP。

制备例7:具有明胶层/结合层/透明质酸-儿茶酚层结构的止血多层海绵的制造

除了将1g的透明质酸-儿茶酚溶解于100mL的三重蒸馏水以制备用于形成止血层的溶液之外，以与制备例4中相同的方式制造止血多层海绵。发现用于形成止血层的溶液的粘度为13.3cP。

制备例8:以涂布工序制造具有明胶层/结合层/壳聚糖-儿茶酚层结构的止血多层海绵

将制备例3中合成的冷冻干燥的壳聚糖-儿茶酚1.5g搅拌溶解于100mL三重蒸馏水中以制备用于形成止血层的溶液。发现用于形成止血层的溶液的粘度为745cP。将壳聚糖-儿茶酚溶液均匀地涂在明胶层上，然后进行冷冻干燥制成止血多层海绵。

比较制备例1:具有明胶层/结合层/壳聚糖-儿茶酚层结构的止血多层海绵的制造

制备具有在4℃下使用旋转粘度计测量的粘度值在10至2,500cP范围内的壳聚糖-儿茶酚溶液作为用于形成止血层的溶液。使用用于形成止血层的溶液以制造具有多层结构的止血多层海绵。在多层结构中，结合层形成良好，组成层之间没有分离。相反，当使用具有粘度超出上述定义的范围的壳聚糖-儿茶酚溶液时，难以获得具有稳定结构的多层海绵。

图3显示通过将具有低粘度的壳聚糖-儿茶酚溶液浸渍到明胶层中制成的止血多层海绵和通过将具有高粘度的壳聚糖-儿茶酚溶液浸渍到明胶层中制成的止血多层海绵的结构。参考图3，当将具有粘度＜10cP的壳聚糖-儿茶酚溶液浸渍到明胶层中时，过多量的壳聚糖-儿茶酚溶液被吸收到明胶层中，使其无法形成多层结构。同时，如图3的B中所示，当壳聚糖-儿茶酚溶液具有＞2,500cP的粘度时，没有形成结合层，结果，不能获得足够的粘合强度，导致明胶层和壳聚糖-儿茶酚层分离。用于制造图3的A中所示海绵的溶液的粘度是8.3cP。用于制造图3的B中所示海绵的溶液的粘度是2,717cP。

实验例1:多层海绵的观察

在此实验例中，使用扫描电子显微镜以40倍和200倍的放大倍率观察制备例4中制造的多层海绵的横截面。

图4显示多层海绵的横截面扫描电子显微镜图像。参考图4，海绵具有三层结构，由止血层(顶部)、结合层(中部)和多孔基质层(底部)组成。

测量制备例4、5和8中制造的多层海绵的结合层，分别具有厚度390±40μm、900±90μm和310±100μm。

实验例2:海绵的抗拉强度的测量

在此实验例中，测量制备例4中制作的明胶海绵、壳聚糖海绵和多层海绵的抗拉强度。首先，将各海绵切成宽0.6cm、长0.5cm的试样。然后，将试样的两端夹在万能试验机上。试样以5.0mm/min的速度拉动。记录试样断裂时的最大力(N)。实验一式五份独立进行。

表1显示分析海绵强度特性的结果。在测试得到的数值中，明胶海绵和壳聚糖海绵的弹性模量(应力-应变曲线的斜率)分别为0.85和1.02。相比之下，多层海绵的弹性模量为1.71，相当于明胶海绵的2.01倍和壳聚糖海绵的1.68倍。

[表1]

强度特性	明胶海绵	壳聚糖海绵	多层海绵
				最大载荷(N)	3.98	1.51	3.88
拉伸应变(％)	4.17	1.68	2.05
				抗拉强度(N/mm<sup>2</sup>)	0.13	0.05	0.13
弹性模量(N/mm<sup>2</sup>)	0.85	1.02	1.71

实验例3:海绵密封力的比较

在此实验例中，比较制备例4中制作的明胶海绵、壳聚糖海绵和多层海绵的密封力。首先，将红色染料溶液滴在明胶海绵、壳聚糖海绵和多层海绵上。观察每个海绵的顶面和底面。

图5显示揭露止血海绵的密封性分析结果的照片。参考图5，仅在明胶海绵和多层海绵的底面观察到红色染料溶液，表明海绵具有密封力。相比之下，红色染料溶液从壳聚糖海绵的底面渗透到顶面，表明壳聚糖海绵没有密封力。

实验例4:与猪结肠组织的粘合强度比较

在此实验例中，比较制备例4中制作的明胶海绵、壳聚糖海绵和多层海绵的粘合强度。首先，将每个海绵切成1.0×1.0cm的大小，制备矩形结肠组织。将动物血液滴到结肠组织上后，将海绵(尺寸1.0×1.0cm)附着在相应的结肠组织上。然后，将试样的两端夹在万能试验机上。记录海绵与结肠组织分离时的拉伸剪切强度(N)。由拉伸剪切强度(N)计算粘合强度(kPa)。实验一式三份独立进行。

表2显示海绵对血染猪结肠组织的粘合强度。对组织的粘合强度按明胶海绵<壳聚糖海绵<多层海绵的顺序增加。每个实验值是平均值±标准偏差。

[表2]

海绵	粘合强度(kPa)
		明胶海绵	5.23±0.46
壳聚糖海绵	11.80±1.30
		多层海绵	16.93±9.25

实验例5:猪结肠组织的密封和粘合特性

在此实验例中，分析制备例4中制作的明胶海绵、壳聚糖海绵和多层海绵的密封和粘合特性。使用耐破度测定仪分析海绵的密封和粘合特性。实验一式三份独立进行。

使用直径0.8cm的冲头在猪结肠组织中形成孔，并将明胶海绵、壳聚糖海绵和双层海绵中的每一个切割成2.0×2.0cm的尺寸并放置在直径8mm的孔上。将放置海绵的结肠组织置于耐破度测定仪的隔膜上，将空气吹入耐破度测定仪，记录海绵与结肠组织分离的压力。

表3显示分析密封和粘合特性的结果。明胶海绵很容易从组织上剥离，因为它对组织的粘合强度接近0hPa。由于壳聚糖海绵没有密封力，吹入测定仪的空气通过海绵的孔隙泄漏，无法测量压力。相比之下，由于多层海绵对组织具有密封力和粘合强度，因此可以分析其密封-粘合强度。发现多层海绵对猪结肠组织的密封-粘合强度平均为37.8hPa。

[表3]

实验例6:用户便利性比较

在此实验例中，对于考虑到手术期间中的体内水环境中制备例4制造的用作止血剂的明胶海绵、壳聚糖海绵和多层海绵是否不粘附于手术器械并且是否粘附于活体组织，进行评价。

将每块海绵切成1.0×1.0cm的大小，将镊子暴露在生理盐水中，制备长方形结肠组织。用镊子将海绵(尺寸1.0×1.0cm)贴附在组织上后，确认海绵是否与镊子分离。以与上述相同的方式将海绵附着到结肠组织后，确认海绵是否与组织分离。

表4显示是否每个海绵与暴露于生理盐水的镊子分离或与附着到镊子或组织的结肠组织分离。明胶海绵对器械和组织的粘附性差，而壳聚糖海绵对器械和组织的粘附性好。相比之下，与器械接触的多层海绵表面对器械的粘附性较差，而与组织接触的多层海绵表面对组织的粘附性良好。总而言之，多层海绵在用户便利性方面优于其他海绵。

[表4]

海绵	与器械粘合	与组织粘合
			明胶海绵	差	差
壳聚糖海绵	良好	良好
			多层海绵	差	良好

实验例7:大鼠肝出血模型的止血性能

在此实验例中，将制备例4制造的止血多层海绵应用于大鼠肝出血模型以评价其止血性能。

使用9周龄雄性Sprague Dawley大鼠作为实验动物。将动物分成两组：在出血诱导后未处理的对照组和在出血诱导后应用明胶海绵或多层海绵的实验组。

诱导每只大鼠完全麻醉后，对注射部位进行消毒。腹部切开后，露出肝脏，开用无菌生理盐水喷洒以去除异物。用手术刀损伤暴露的肝脏中心以诱导出血。

至于对照组，对诱导的损伤性出血不予处理。在实验组，将明胶海绵或多层海绵放置于出血部位上。

出血诱导3分钟后，肉眼观察是否达到止血。结果如表5所示。对照组和使用明胶海绵的实验组的所有动物即使在出血3分钟后也未观察到止血。也就是说，出血后3分钟内达到的止血率为0％。相反，在使用多层海绵的实验组中的所有动物中都观察到止血。相比之下，在使用多层海绵的实验组中的所有动物中都观察到止血。即，出血后3分钟内达到的止血率为100％。这些结果得出的结论为多层海绵在切开的大鼠肝脏的出血部位有效止血。

[表5]

实验例8:大鼠颈动脉出血模型的止血性能

在此实验例中，将制备例4中制造的多层海绵应用于大鼠颈动脉出血模型以评价其止血性能。实验一式三份独立进行。

使用9周龄雄性Sprague Dawley大鼠作为实验动物。将动物分成两组：在出血诱导后使用纱布的对照组和在出血诱导后使用多层海绵的实验组。

诱导每只大鼠完全麻醉后，对注射部位进行消毒。将大鼠下颌至胸部的中间区域切开约3cm，使用31G针从颈动脉诱导出血。

在对照组中每只动物，均用纱布覆盖压迫出血部位以止血。在实验组中每只动物，均用多层海绵覆盖出血部位，并和纱布折叠在一起进行加压止血。2分钟后，小心移除纱布或用与纱布折叠的多层海绵，以免损伤止血部位的凝块，用肉眼确认是否止血。

出血后2分钟，肉眼观察是否达到止血。结果示于表6。对照组所有动物出血后2分钟内均未观察到止血，均使用纱布加压止血。相比之下，使用多层海绵的实验组中所有动物在出血后2分钟内观察到止血。也就是说，出血后2分钟内达到的止血率为100％。这些结果得出结论为多层海绵在大鼠颈动脉出血部位停止出血是有效的。

[表6]

实验例9:多层海绵的细胞毒性和皮内反应的评价

在此实验例中，评价制备例4中制造的多层海绵细胞毒性和皮内反应。

通过间接方法测试细胞毒性。首先，将2.0％琼脂和2xMEM以1:1的比例混合。将该混合物覆盖在小鼠来源的细胞L929上，并在其上放置切割成1.0×1.0cm大小的多层海绵。细胞在设定为5％CO₂和37±1℃的饱和蒸汽状态的培养箱中培养。培养48小时后，使用正置显微镜观察细胞形态。加入约2mL中性红，在培养箱中进行孵育15-30分钟。去除中性红后，以PBS洗涤细胞。确认细胞是否变色。

如下测试皮内反应。首先，选择3只体重2.0公斤以上的健康新西兰大白兔，将每只动物背部的毛发剃掉。将来自每个海绵的0.2mL提取物皮内注射到动物体内。观察在注射部位的诸如红斑和水肿等不良反应的发生情况。

表7显示细胞毒性和皮内反应测试的结果。细胞毒性试验表明，在明胶海绵和多层海绵的正下方观察到轻微变形或退化的细胞，并在壳聚糖海绵正下方观察到有限的细胞变形和变色。从这些结果，可以确定所有海绵的细胞毒性均不显著。皮内反应试验表明，所有海绵的提取物皮内注射均未出现诸如红斑、水肿等不良反应。因此，海绵被确定为不会引起皮内反应的材料。

[表7]

海绵	细胞毒性	皮内反应
			明胶海绵	合适的	合适的
壳聚糖海绵	合适的	合适的
			多层海绵	合适的	合适的

Claims (13)

1.一种止血器具，其包含:包括生物兼容性聚合物的多孔基质层；加载于该多孔基质层上的止血层并且所述止血层包含其中引入了含有具有一个或多个羟基的苯环的部分的聚合物；以及结合层，其介于多孔基质层和止血层之间以防止多孔基质层与止血层分离。

2.根据权利要求1所述的止血器具，其中所述生物兼容性聚合物是天然或合成的可生物降解聚合物。

3.根据权利要求1所述的止血器具，其中所述多孔基质层是明胶或胶原蛋白垫。

4.根据权利要求1所述的止血器具，其中所述止血层的聚合物包含被引入其中的含酚或多元酚的部分。

5.根据权利要求4所述的止血器具，其中所述聚合物是生物兼容性聚合物。

6.根据权利要求4所述的止血器具，其中每个含酚或多元酚的部分由“酚-L-”或“多元酚-L-”表示，其中L是单键、任选含有-O-、-S-、-NH-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)O-或-C(O)NH-的C₁-C₁₀脂肪烃链或任选含有-O-、-S-、-NH-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)O-或-C(O)NH-的C₃-C₁₀脂环烃链。

7.根据权利要求1所述的止血器具，其中所述止血层包含具有-OH的苯环和具有＝O的苯环两种。

8.根据权利要求1所述的止血器具，其中所述结合层使用与多孔基质层和止血层混溶的材料形成。

9.根据权利要求8所述的止血器具，其中所述材料是所述多孔基质层的主要组成成分和所述止血层的主要组成成分的混合物或共聚物。

10.根据权利要求4所述的止血器具，其中所述结合层包含生物兼容性聚合物和包含有含酚或多元酚的部分引入其中的聚合物的混合区域。

11.一种用于制造止血器具的方法，其包含：(a)将包含引入其中的含酚或含多元酚部分的聚合物溶解于水中以制备用于形成止血层的溶液，(b)提供由生物兼容性聚合物组成的多孔基质,(c)将用于形成止血层的溶液与多孔基质的表面接触，使得所述用于形成止血层的溶液浸渍到多孔基质的孔中,以及(d)干燥所述用于形成止血层的溶液以同时在所述多孔基质的表面上形成止血层并在所述多孔基质和所述止血层之间的界面形成结合层。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述用于形成止血层的溶液具有10至2,500cP的粘度，使用旋转粘度计在4℃下测量时。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述结合层具有1至1,500μm的厚度。

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