KR101818229B1 - 즉각적인 지혈능을 보유한 무출혈 주사바늘의 제조방법 - Google Patents

즉각적인 지혈능을 보유한 무출혈 주사바늘의 제조방법 Download PDF

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이문수
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Abstract

본 발명에 따른 산화된 카테콜기(
Figure 112016092362902-pat00022
)가 키토산에 도입되어 가교된 키토산으로 코팅된 주사바늘은 주사시 발생하는 출혈을 즉각적으로 억제할 수 있어, 당뇨병 환자, 항암치료 환자, 혈우병 환자 등 지혈능력이 떨어지는 환자뿐만 아니라 혈액거부반응을 보이는 환자, 어린이의 주사에도 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있으며, 심장과 같은 박동이 강하고 혈액이 많은 장기의 출혈도 즉각적으로 억제할 수 있는 효과가 있다.

Description

즉각적인 지혈능을 보유한 무출혈 주사바늘의 제조방법{Method of Preparing Bloodless Needles Exhibiting Immediate Hemostatic Capability}
본 발명은 즉각적인 지혈능을 보유한 무출혈 주사바늘에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 카테콜기가 도입된 키토산의 가교결합 정도를 조절하여 즉각적인 지혈능을 보유한 무출혈 주사바늘을 제조하는 방법에 관한 것이다.
혈액 응고 장애를 갖고 있는 환자들의 성공적인 외과수술을 위해 다양한 종류의 지혈용 제품이 개발되어 왔다. 대표적인 의료용 지혈제인 피브린 글루는 생체 내 혈액 응고 단백질을 이용한 지혈제로 생체 적합성을 갖고 있다. 또한 지혈능을 가진 의료용 기기 중 하나인 지혈용 카테터는 카테터의 말단에 탄성을 가지고 있는 재료를 보유하고 있어, 물리적으로 출혈을 막아주는 기능을 갖도록 디자인되었다(미국등록특허 US4133303 A). 그러나 대부분의 지혈능을 가지고 있는 재료 및 기기들은 많은 수분이 존재하는 생체 내에서는 접착능이 떨어지며, 기계적 물성이 약해 쉽게 변성되는 단점을 가지고 있다. 따라서 우수한 조직 접착성 및 생체 적합성을 갖고 있는 생체 재료를 이용한 의료용 제품 개발은 중요한 이슈가 되고 있다.
한편, 홍합 접착능력에 기여하는 작용기인 카테콜기(catechol)가 도입된 키토산(chitosan)은 수용성 환경에서도 조직 및 점막에 대해 우수한 접착능력을 보이는 생체재료로서 응용되어왔다. 국제공개번호 WO2013/077476호에서는 카테콜기가 도입된 키토산 및 말단에 티올기가 결합된 플루로닉을 포함하는 접착성 하이드로겔 조성물에 관한 내용을 개시하고 있으며, 구체적으로는 카테콜기가 도입된 키토산의 우수한 지혈능과 생체접착성에 관한 내용을 개시하고 있다.
또한, 최근에 한국등록특허 제10-1576503호에서 부분적으로 산화된 카테콜기(
Figure 112016092362902-pat00001
)에 의해 가교된 키토산을 코팅하여 제조한 무출혈 주사바늘을 개시하고 있다. 그러나, 무출혈 주사바늘은 안정적인 지혈능을 나타내기까지, ~20초 정도의 시간이 걸리며, 그 시간은 가교된 키토산 필름이 팽윤되어 하이드로겔 형태로 전이되는 시간을 나타낸다.
이에, 본 발명자들은 기존의 무출혈 주사바늘의 지혈시간을 단축하기 위해, 카테콜기의 산화 정도를 최대로 하여 가교결합이 향상된 키토산 필름을 코팅하여 즉각적인 지혈능을 보유하는 무출혈 주사바늘을 제조하고 상기 무출혈 주사바늘이 주사시 발생하는 출혈을 2초 내외의 시간에 억제할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 주사 후 바늘을 제거한 후 즉각적으로 출혈이 일어나지 않도록 하는 주사바늘의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 주사바늘 코팅용 필름이 표면에 도입된 무출혈 주사바늘을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 무출혈 주사바늘의 단축된 지혈 시간을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 카테콜기가 도입된 키토산-카테콜 용액을 50~70℃의 온도에서 1~5일 동안 방치하여 카테콜기의 산화 및 가교를 유도하는 단계; 및 (b) 상기 키토산-카테콜 용액으로 주사바늘의 표면을 코팅하는 단계를 포함하는 무출혈 주사바늘의 제조방법의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 즉각적인 지혈능을 보유한 무출혈 주사바늘은 주사시간에 상관없이 발생하는 출혈을 즉각적으로 억제할 수 있어, 혈액 응고 장애를 갖고 있는 환자들의 주사에 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 단기 무출혈 주사바늘 제조를 위해 사용한 키토산-카테콜 용액의 자외선-가시광선 분광 스펙트럼 분석 결과를 나타내는 이미지이다.
도 2는 주사형 전자 현미경을 통해 실시예 1에서 제조한 단기 무출혈 주사바늘에 형성된 필름의 물리적인 물성을 비교한 결과를 나타낸다.
도 3은 실시예 1에서 제조한 단기 무출혈 주사바늘에 생체 내 실험 결과를 나타내는 이미지이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 카테콜(catechol)기가 도입된 키토산(chitosan)에 있어서, 상기 카테콜기에 포함되어 있는 -OH기가 =O기로 대부분 산화된 후, 키토산에 포함되어 있는 -NH2 기와 탈수 축합반응을 통해 가교된 키토산-카테콜 용액으로 주사바늘의 표면을 코팅하여 제조한 무출혈 주사바늘이 주사 후 주사바늘을 제거하여도 즉각적으로 출혈이 일어나지 않는 효과가 있는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 일 관점은 (a) 카테콜기가 도입된 키토산-카테콜 용액을 50~70℃의 온도에서 1~5일 동안 방치하여 카테콜기의 산화 및 가교를 유도하는 단계; 및 (b) 상기 키토산-카테콜 용액으로 주사바늘의 표면을 코팅하는 단계를 포함하는 무출혈 주사바늘의 제조방법에 관한 것이다.
상기 카테콜기의 몰기준으로 2 내지　10%, 바람직하게는 2 내지　6%, 가장 바람직하게는 3 내지　5%가 쉬프 염기의 형태로 가교된 것일 수 있다.
바람직하게는 상기 키토산-카테콜은 화학식 3의 화합물일 수 있다.
[화학식 3]
Figure 112016092362902-pat00002
화학식 3에서 L은 단일결합, C2-8의 직쇄 또는 측쇄 알킬렌 또는 -C(=O)-R1-이고, 상기 R1은 단일결합 또는 C2-8의 직쇄 또는 측쇄 알킬렌이다.
또한, 본 발명의 무출혈 주사바늘의 제조방법에서 주사바늘 위에 가교된 키토산-카테콜 용액을 위치시킨 후, 주사바늘을 일정한 속도로 회전시키며 코팅하는 것이 바람직하다.
가교된 키토산-카테콜 용액의 양에 따라 코팅 두께가 조절될 수 있다.
또한, 주사바늘 위에 가교된 키토산-카테콜 용액을 위치시키기 전에 산소 플라즈마 처리를 수행하는 단계를 추가할 수 있으며, 상기 (b) 단계 이후에 건조 단계를 추가로 수행할 수 있는데, 산화를 최대로 하기 위해 최대 30일 동안 건조할 수 있으며, 결과적으로, 카테콜의 산화가 많이 진행될수록 필름의 강도가 향상되는 효과가 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 의한 주사바늘 코팅용 필름은 카테콜(catechol)기가 도입된 키토산(chitosan)에 있어서, 상기 카테콜기의 대부분이 산화되어 가교된 것을 특징으로 하고, 주사 후 즉각적으로 주사바늘을 제거하여도 출혈이 일어나지 않도록 할 수 있다.
상기 카테콜기의 산화 정도는 자외선-가시광선 스펙트럼으로 분석시, 형성되는 가교결합의 증거가 되는 쉬프염기의 특성인 500nm에서의 피크가 0.02 이상의 흡광도를 갖는 것이 바람직하다. 여기서, 흡광도가 0 이상 0.02 아래의 경우에는 상기 카테콜기의 산화 정도가 부분적으로 존재하며, 지혈효과를 보이기 위해 15-20초 이상의 시간이 걸리는 것을 확인하였다(선행등록특허 10-157603호의 결과와 동일).
본 발명은 가교율이 카테콜기의 몰기준으로 3 내지 5%인 화학식 3의 화합물로 구성되는 주사바늘 코팅용 필름에 관한 것이다.
[화학식 3]
Figure 112016092362902-pat00003
화학식 3에서 L은 단일결합, C2-8의 직쇄 또는 측쇄 알킬렌 또는 -C(=O)-R1-이고, 상기 R1은 단일결합 또는 C2-8의 직쇄 또는 측쇄 알킬렌이다.
본 발명에 있어서, 카테콜(catechol) 기가 도입된 키토산(chitosan)에서 -OH기가 =O기로 산화된 다음, 키토산에 포함되어 있는 -NH2기와 탈수 축합반응을 통해 상기 카테콜기가 가교된 것일 수 있다. 상기 카테콜기의 산화 정도는 카테콜기의 몰기준으로 5 내지 10%가 산화될 수 있다.
또한, 상기 탈수 축합반응을 통한 가교는 하기 반응식 1에 나타난 바와 같이, 산화된 카테콜기(
Figure 112016092362902-pat00004
)의 옥소(=O) 기가, 적절한 배향으로 위치된 키토산에 포함되어 있는 아민(-NH2) 기와 반응하여 결합이 형성되는 것을 나타낸다.
[반응식 1]
Figure 112016092362902-pat00005
상기 반응식 1에서,
화학식 1로 표시되는 화합물은 카테콜기(
Figure 112016092362902-pat00006
) 및 산화된 카테콜기(
Figure 112016092362902-pat00007
)가 도입된 키토산의 아민(-NH2) 기를 나타낸 것이고;
화학식 2로 표시되는 화합물은 카테콜기(
Figure 112016092362902-pat00008
) 및 산화된 카테콜기(
Figure 112016092362902-pat00009
)가 도입된 키토산의 산화된 카테콜기를 나타낸 것이고;
화학식 3으로 표시되는 화합물은 화학식 1로 표시되는 화합물과 화학식 2로 표시되는 화합물이 탈수 축합반응을 통해 가교결합하여 형성되는 화합물을 나타낸 것이고; 및
L은 단일결합(single bond), C1-8의 직쇄 또는 측쇄 알킬렌 또는 -C(=O)-R1-이고, 상기 R1은 단일결합(single bond) 또는 C1-8의 직쇄 또는 측쇄 알킬렌이다.
구체적으로, 상기 카테콜기(
Figure 112016092362902-pat00010
) 및 산화된 카테콜기(
Figure 112016092362902-pat00011
)가 도입된 키토산의 전구체는 산화된 카테콜기가 도입되지 않은 키토산이며 후술할 실시예에서 사용한 카테콜기가 도입된 키토산의 구체적인 화학구조식으로는 하기 화학식 4와 같다.
[화학식 4]
Figure 112016092362902-pat00012
상기 화학식 4에서,
x:y:z는 6.5:0.5:3 내지 5.5:1.5:3인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 주사바늘 코팅용 필름이 표면에 코팅된 단기 무출혈 주사바늘을 제공한다. 이때, 상기 무출혈 주사바늘의 표면에 코팅된 하이드로겔의 두께는 10~20㎛인 것이 바람직하며, 이 때 5초 이내에 지혈효과를 나타낼 수 있다. 상기 두께가 10㎛ 미만인 경우, 주사시 발생하는 환부를 막기에 충분하지 못한 필름이 포함되므로 출혈이 효과적으로 억제되지 못하는 문제가 있고, 상기 두께가 20~30㎛인 경우, 주사시 주사바늘에 코팅된 필름이 하이드로젤 형태로 전환되는 시간이 걸리므로 즉각적인 지혈효과가 나오기 어려우며, 30㎛를 초과할 경우 두께가 두꺼워 주사바늘과 함께 생체 내 들어가지 못하고 피부에 밀리게 되어 출혈이 효과적으로 억제되지 못하는 문제가 있다.
나아가, 본 발명은 카테콜기(
Figure 112016092362902-pat00013
) 및 대부분이 산화된 카테콜기(
Figure 112016092362902-pat00014
)가 도입되어 최대로 가교된 키토산 용액을 준비하는 단계(단계 1); 및
상기 단계 1의 용액을 사용하여 주사바늘의 표면을 코팅하는 단계(단계 2);를 포함하는 상기 무출혈 주사바늘의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 따른 무출혈 주사바늘의 제조방법을 단계별로 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 무출혈 주사바늘의 제조방법에 있어서, 상기 단계 1은 카테콜기(
Figure 112016092362902-pat00015
) 및 대부분이 산화된 카테콜기(
Figure 112016092362902-pat00016
)가 도입되어 가교된 키토산 용액을 준비하는 단계이다.
이때, 상기 용액은 카테콜기가 도입된 키토산을 용매에 용해시키고 보관하여 카테콜기의 부분 산화 및 가교를 유도할 수 있다. 여기서 상기 보관 온도는 50 내지 70℃가 바람직하고, 55 내지 65℃가 더욱 바람직하고, 60℃가 가장 바람직하다. 또한, 상기 보관 시간은 1 내지 5일이 바람직하고, 2 내지 4일이 더욱 바람직하고 3일이 가장 바람직하다. 나아가, 상기 카테콜기가 도입된 키토산은 전체 용액에 대하여 1~2중량%인 것이 바람직하고, 1.3~1.7중량%인 것이 더욱 바람직하고, 1.5중량%인 것이 가장 바람직하다.
상기 바람직한 보관 온도, 보관 시간 및 카테콜기가 도입된 키토산의 중량% 범위를 벗어나는 경우 단기 무출혈 주사바늘에 코팅하기 위하여 요구되는 필름의 물성을 얻지 못하는 문제가 있다.
본 발명에 따른 무출혈 주사바늘의 제조방법에 있어서, 상기 단계 2는 상기 단계 1의 용액을 사용하여 주사바늘의 표면을 코팅하는 단계이며, 구체적으로는 상기 용액을 주사바늘 위에 위치시킨 후, 주사바늘을 일정한 속도로 회전시키며 균일하게 코팅을 수행하는 단계이다.
본 발명에 따른 무출혈 주사방법에 있어서, 상기 단계 3은 상기 단계 2에서 준비한 무출혈 주사바늘을 사용하여 사람 또는 동물에게 주사하는 단계이다.
이때, 상기 단기 무출혈 주사방법은, 주사바늘 표면에 코팅된 필름이 조직 내에 주입된 후, 그 형태 그대로 환부를 막아 출혈이 즉각적으로 억제되는 것을 특징으로 한다. 주사 후 1 내지 5초 내에서 출혈이 억제되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 무출혈 주사바늘의 지혈 능력을 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
먼저, 단기 무출혈 주사바늘을 제조를 위해 사용한 용액의 특성을 확인하기 위해, 선행특허(특허등록 10-1576503호) 조건에 해당하는 4℃에서 3일 동안 보관한 고분자 용액과 60℃에서 3일 동안 보관한 고분자 용액의 자외선-가시광선 분광법으로 흡광도를 측정하여 도 1A에 도시하였다. 검은색 그래프는 전혀 산화시키지 않은 키토산 카테콜을 용액에 해당되며, 빨간색 그래프는 부분적으로 산화시킨 키토산 카테콜 용액에 해당된다(특허등록 10-1576503호에 해당). 파란색 그래프는 사슬의 가교를 최대로 유발한 키토산 카테콜 용액에 해당된다. 퀴논과 아민기의 가교결합으로 생기는 쉬프염기에 해당하는 특성인 500nm에서의 흡광의 정도가 60℃에서 3일 동안 보관하였을 때 더 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
도 2A와 2B는 단기 무출혈 주사바늘에 형성된 필름의 두께와 선행 특허 조건으로 형성된 ~15초 만에 지혈되는 무출혈 주사바늘에 형성된 필름의 두께를 비교한 결과를 나타낸다. 도 2C은 실시예 1에서 제조한 단기 무출혈 주사바늘에 형성된 필름과 선행 특허 조건으로 형성된 ~15초 만에 지혈되는 무출혈 주사바늘에 형성된 필름, 추가로 30일 정도 산화시켜 건조된 필름의 기계적 물성을 비교한 것이다. 주사형 전자 현미경을 통해 실시예 1에서 제조한 단기 무출혈 주사바늘과 선행특허 조건에 해당하는 15초 후 지혈되는 무출혈 주사바늘의 필름을 벗겨내어 관찰한 결과, 단기 무출혈 주사바늘에 코팅된 필름의 두께는 14.1±5.4㎛ 사이에서 형성되며, 15초 후 지혈되는 무출혈 주사바늘의 필름의 두께는 22.2±26.0㎛ 사이에서 형성되는 것을 확인하였다(도 2A 및 2B 참조).
또한, 단기 무출혈 주사바늘에 도입된 필름과 선행 특허 조건으로 형성된 필름의 기계적 물성을 비교하기 위해, Universal testing machine (UTM, Instron 3253)을 이용하여 인장특성을 확인하였다. 실시예1에서 사용된 키토산-카테콜 용액과 선행특허 조건에 해당하는 용액 200㎕를, 24시간 상온 건조 후, 1x2cm의 필름을 형성하였다. 50N Load cell을 이용하여, 5mm/min의 속도로 당기면서, 필름이 찢어지는 순간의 최대 로드값을 측정하였다(도 2C 참조).
나아가, 구체적으로, 도 3A는 랫의 하지정맥 모델을 사용하여 지혈효과를 확인한 것이고, 도 3B는 랫의 심장의 심실 출혈 모델을 사용하여 지혈효과를 확인한 것이다. 도 3C는 심장에 주입한 후, 주입 부위에 고정되어 있는 키토산 카테콜 필름을 확인한 것이다. 실시예 1에서 제조한 단기 무출혈 주사바늘의 지혈시간을 평가하기 위하여 실험을 수행한 결과, 실시예 1에서 제조한 무출혈 주사바늘은 키토산-카테콜 용액으로 형성된 필름이 조직에 즉각적으로 고정됨에 따라, 5초 내에 우수한 지혈효과를 보이는 것을 확인하였다(도 3A 참조).
또한, 실시예 1에서 제조한 단기 무출혈 주사바늘위에 코팅된 필름의 기계적 물성은 선행조건에서 형성된 필름의 물성보다 강하기 때문에 심장조직에 직접주사를 한 후에도 지혈이 되는 것을 확인하였다(도 3B 참조).
따라서, 본 발명에 따른 단기 무출혈 주사바늘은 주사시 발생하는 출혈을 즉각적으로 억제할 수 있어, 당뇨병 환자, 항암치료 환자, 혈우병 환자 등 지혈능력이 떨어지는 환자뿐만 아니라 혈액거부반응을 보이는 환자, 어린이의 주사에도 유용하게 사용할 수 있으며, 특히 심장과 같은 움직임이 큰 장기의 지혈에도 효과가 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예]
제조예 1: 카테콜이 도입된 키토산의 제조
약 30% 아세틸화 되어 있는 키토산(키토산 70/100, 24204, Heppe Medical Chitosan) 3g을 292mL HCl 용액(pH=2)에 6시간 동안 용해시켰다. 상기 키토산 용액에 0.5N NaOH 용액 8mL을 서서히 첨가하여 pH를 5.5로 조절하였다. 제조된 1% 키토산 용액을 12시간 동안 안정화시켰다.
상기 준비된 키토산 용액에 3-(3,4-디하이드록시페닐)프로파노익 엑시드 2.37g을 첨가하였다. 이후, 키토산의 아민(-NH2)기와 3-(3,4-디하이드록시페닐)프로파노익 엑시드의 카르복시기(-COOH) 사이에 아마이드 결합(-CONH-)을 형성하기 위한 반응물질로 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC) 2.02g을 50mL 에탄올에 녹인 후 이를 첨가하고, 용액의 산도를 pH 4.5로 조절한 후 1시간 동안 반응을 수행하였다. 본 과정에서 카테콜이 도입된 키토산이 제조되었다.
반응하지 않은 3-(3,4-디하이드록시페닐)프로파노익 엑시드와 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)를 제거하기 위하여, 반응 후의 용액을 투석막 [분자량 컷 오프(cut-off) 12,000-15,000]를 사용하여 염화나트륨과 5N HCl, 3mL을 포함하고 있는 4.5L 3차 증류수에서 2일 동안 투석하였다. 추가로 5N HCl, 3mL을 포함하고 있는 4.5L 3차 증류수에서 2일 동안 투석하였다. 마지막으로 3차 증류수로 6시간 동안 투석한 후, 동결 건조하여 카테콜이 도입된 키토산을 준비하였다(화학식 4, x:y:z = 6.2:0.8:3).
[화학식 4]
Figure 112016092362902-pat00017
실시예 1: 단기 무출혈 주사바늘(26G)의 제조
제조예 1에서 제조한 카테콜이 도입된 키토산 6mg을 400㎕의 3차 증류수에 용해시킨 후, 60에서 3일 동안 보관하여 카테콜기의 산화 및 가교를 대부분 유도하였다. 이에, 카테콜기(
Figure 112016092362902-pat00018
) 및 산화된 카테콜기(
Figure 112016092362902-pat00019
)가 도입되어 가교된 키토산 용액(이하, '키토산-카테콜 용액'으로 명명)을 준비하였다.
상기 키토산-카테콜 용액의 카테콜기 산화 정도는 자외선-가시광선 분광 스펙트럼을 통해 500nm 파장에서의 흡광도를 측정함으로써 확인하였다. 산화된 카테콜기와 키토산의 아민기의 가교 결합이 형성될 경우 500nm 파장에서의 흡광도가 나타나게 된다. 따라서, 키토산-카테콜 용액의 보관 조건이 60℃에서 3일 동안인 경우, 500nm에서 나타나는 흡광도가 0.02 이상이 되는 것을 확인하였다.
한편, 상기 준비한 키토산-카테콜 용액의 안정적인 코팅을 위하여, 26G 두께의 주사바늘을 10분 동안 산소 플라즈마 처리를 수행하였다. 이후, 상기 키토산-카테콜 용액 6.5㎕를 주사바늘에 올려 상온에서 1시간 동안 40rpm으로 회전시키며 코팅을 2회 수행하여 단기 무출혈 주사바늘을 완성하고, 추가적인 건조를 위해 하루 동안 건조하였다. 하루 동안 건조하는 과정에서 추가의 가교결합이 유도될 수 있다.
실시예 2: 단기 무출혈 주사바늘(30G)의 제조
실시예 1에서 사용된 키토산-카테콜 용액의 안정적인 코팅을 위하여, 30G 두께의 주사바늘을 10분 동안 산소 플라즈마 처리를 수행하였다. 이후, 상기 키토산-카테콜 용액 4.2㎕를 주사바늘에 올려 상온에서 45시간 동안 40rpm으로 회전시키며 코팅을 2회 수행하여 단기 무출혈 주사바늘을 완성하고, 추가적인 건조를 위해 하루 동안 건조하였다.
실시예 3: 형광 단백질이 봉입된 단기 무출혈 주사바늘(30G)의 제조
실시예 1에서 사용한 키토산 카테콜 용액에 로다민(rhodamine)이 결합되어 있는 알부민 단백질을 10㎍ 용해 시켰다. 그 용액을 이용하여 실시예 2와 동일한 방식으로 단기 무출혈 주사바늘은 제조하였다.
[실험예]
실험예 1: 단기 무출혈 주사바늘 제조공정에서의 보관시간
실시예 1에서 제조한 단기 무출혈 주사바늘의 제조공정에서의 보관시간을 최적화하기 위해, 4℃에서 5일 보관한 용액과 60℃에서 1일 보관한 용액에 대해 500nm에서의 흡광도를 도 1B와 도 1C에 각각 도시하였다. 결과적으로, 4℃에서 5일 보관한 경우, 60℃에서 3일 동안 보관한 경우와 유사하게 흡광도가 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 60℃에서 보관한다고 할지라도 1일 보관하였을 때는, 4℃에서 3일 보관한 용액과 크게 다르지 않은 정도로 산화되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 온도에 따라 산화정도가 달라지는 보관시간을 3일로 정하였으며, 이후 실험에 대해서는 온도에 따라 나타나는 고분자 용액의 특성을 비교하였다.
실험예 2: 단기 무출혈 주사바늘의 필름 두께 관찰
실시예 1에서 제조한 단기 무출혈 주사바늘의 필름두께를 분석하기 위해, 주사형 전자 현미경(Hitachi S-4800)을 이용하였고, 선행특허조건으로 제조된 주사바늘의 필름 두께와 비교하였다. 그 결과는 도 2A 및 도 2B에 나타내었다.
도 2A는 실시예 1에서 제조한 단기 무출혈 주사바늘에 코팅된 필름의 형태를 나타내며, 도 2B는 필름의 두께를 나타낸 그래프이다.
도 2에 나타난 바와 같이, 60℃에서 3일 동안 보관한 용액으로 준비된 주사바늘의 필름은 4℃에서 3일 동안 보관한 용액으로 준비된 필름보다 두께가 감소하는 것으로 나타났다. 구체적으로 각각 14.1±5.4㎛와 22.2±26.0㎛임을 확인하였다.
실험예 3: 필름의 기계적 물성 비교평가
실시예 1에서 제조한 단기 무출혈 주사바늘의 필름의 기계적 물성과, 선행 특허 조건으로 제조한 필름의 기계적 물성을 비교하기 위해, Universal testing machine(UTM, Instron 3253)을 이용하였고, 그 결과는 도 2C에 나타내었다.
도 2C는 실시예 1에서 제조한 단기 무출혈 주사바늘의 조건에 해당하는 60℃에서 3일 동안 보관한 용액으로 준비된 주사바늘의 필름과, 4℃에서 3일 동안 보관한 용액으로 준비된 필름 및 카테콜의 산화를 최대로 하기 위해 30일 간 건조한 필름의 기계적 물성을 비교한 결과이다. 결과적으로, 카테콜의 산화가 많이 진행될수록 필름의 강도가 세지는 것을 확인할 수 있었으며, 각각의 필름이 찢어지는 순간의 최대 로드값은, 4℃에서 3일 보관한 용액으로 형성된 필름의 경우는 3.25±1.22N, 60℃에서 3일 보관한 용액으로 형성된 필름의 경우는 6.07±3.65N으로, 산화가 많이 될수록 최대 로드값이 증가하는 것으로 나타났다. 또한, 필름의 산화를 30일 동안 지속할 경우, 그 로드값은 13.4±4.74N까지 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 4: 생체 내 지혈능력 평가
실시예 1에서 제조한 무출혈 주사바늘의 지혈능력을 평가하기 위하여 하기와 같은 생체내 실험을 수행하였다.
먼저, 쥐 하지정맥 모델(SD 랫, 8주령 수컷, 250g)과 쥐 심장 모델(SD 랫, 8주령 수컷, 250g)을 준비하였다. 이후, 실시예 1에서 제조한 단기 무출혈 주사바늘의 표면에 코팅된 필름이 즉각적인 지혈효과를 보이는지 확인하기 위해 주사후 5초 내로 주사바늘을 빼내었다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3은 실시예 1에서 제조한 무출혈 주사바늘에 대한 생체 내 실험 결과를 나타내는 이미지이다. 구체적으로, 도 3A는 실시예 1에서 제조한 주사바늘로 랫 하지정맥 모델을 사용하여 지혈효과를 확인한 것이고, 도 3B는 실시예 2 및 실시예 3에서 제조한 주사바늘로 랫심장모델을 사용하여 관찰되는 지혈효과 및 심장에 고정된 필름을 확인한 것이다.
도 3A에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 제조한 무출혈 주사바늘은 키토산-카테콜 용액으로 형성된 필름이 조직에 즉각적으로 고정됨에 따라 일반적인 주사바늘과 비교하여 현저히 우수한 지혈효과가 있는 것으로 나타났다.
또한, 도 3B에 나타난 바와 같이, 일반적인 주사바늘은 랫 심장에 주사시 출혈이 발생하는 것으로 나타난 반면, 실시예 2에서 제조한 단기 무출혈 주사바늘로 주사하는 경우 출혈이 전혀 발생하지 않는 것으로 나타났다. 또한, 실시예 3에서 제조한 단기 무출혈 주사바늘로 주사한 후에도 출혈이 전혀 발생하지 않았으며, 주사바늘을 제거하였을 때 심장에 고정되어 있는 필름을 형광 이미징 장비(Xenogen, IVIS 200, USA)로 확인할 수 있었다.
이와 같이, 본 발명에 따른 산화된 카테콜기(
Figure 112016092362902-pat00020
)가 키토산에 도입되어 가교된 키토산으로 코팅된 주사바늘은 주사시 발생하는 출혈을 즉각적으로 억제할 수 있어, 당뇨병 환자, 항암치료 환자, 혈우병 환자 등 지혈능력이 떨어지는 환자뿐만 아니라 혈액거부반응을 보이는 환자, 어린이의 주사에도 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있으며, 나아가 심장과 같은 박동이 강하고 혈액이 많은 장기의 출혈도 즉각적으로 억제할 수 있는 효과도 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (7)

  1. 다음 단계를 포함하는 무출혈 주사바늘의 제조방법:
    (a) 카테콜기가 도입된 키토산-카테콜 용액을 50~70℃의 온도에서 3~5일 동안 방치하여 카테콜기의 몰기준으로 5 내지 10%의 산화 및 2 내지 10%의 가교를 유도하는 단계; 및
    (b) 상기 키토산-카테콜 용액으로 주사바늘의 표면을 코팅하는 단계.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 키토산-카테콜은 화학식 3의 화합물인 것을 특징으로 하는 무출혈 주사바늘의 제조방법:
    [화학식 3]
    Figure 112016092362902-pat00021

    화학식 3에서 L은 단일결합, C2-8의 직쇄 또는 측쇄 알킬렌 또는 -C(=O)-R1-이고, 상기 R1은 단일결합 또는 C2-8의 직쇄 또는 측쇄 알킬렌이다.
  4. 제1항에 있어서,
    주사바늘 위에 가교된 키토산-카테콜 용액을 위치시킨 후, 주사바늘을 일정한 속도로 회전시키며 코팅하는 것을 특징으로 하는 무출혈 주사바늘의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    가교된 키토산-카테콜 용액의 양에 따라 코팅 두께가 조절되는 것을 특징으로 하는 무출혈 주사바늘의 제조방법.
  6. 제4항에 있어서,
    주사바늘 위에 가교된 키토산-카테콜 용액을 위치시키기 전에 산소 플라즈마 처리하는 단계를 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는 무출혈 주사바늘의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계 이후에 건조 단계를 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는 무출혈 주사바늘의 제조방법.
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