WO2015167253A1 - 키토산 카테콜 합성물질을 이용한 췌장소도 막의 표면 개질 방법 - Google Patents

키토산 카테콜 합성물질을 이용한 췌장소도 막의 표면 개질 방법 Download PDF

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WO2015167253A1
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catechol
peg
chitosan
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cells
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PCT/KR2015/004326
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변영로
김지웅
정지헌
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서울대학교산학협력단
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells

Definitions

  • the present invention synthesizes hydrocaffeic acid (HCA) having a catechol structure to the chitosan by forming an amide bond and takes advantage of the adhesiveness of dopa (D0PA).
  • HCA hydrocaffeic acid
  • D0PA dopa
  • the present invention relates to a method for modifying the surface of the pancreas also.
  • Type 1 diabetes 5-10% of all diabetic patients are type 1 diabetes, and the disease is caused by the insulin deficiency due to the destruction of beta cells that secrete insulin from the pancreas. It mainly occurs in children and adolescents. Diabetes, or insulin, is called insulin dependent diabetes because it must be used for treatment. Since type 1 diabetes is a type of autoimmune disease, scientists are studying techniques to prevent type 1 diabetes by modulating the immune system to suppress it, and there is currently no way to cure type 1 diabetes. When the initial diagnosis is made, changes in diet and blood sugar management can help. In the treatment of type 1 diabetes, blood glucose control or pancreas transplantation may be performed while insulin hormone is administered throughout life, and transplantation may suppress the occurrence of complications due to diabetes.
  • pancreatic islets cells Most of the organs needed to transplant pancreatic islet cells contain the pancreas of the brain lion. Although the method of use is universal, it is true that there are many difficulties in supply. Therefore, pancreatic islet cell transplantation methods with less rejection from animals that can replace them are needed.
  • porcine pancreatic islet cells have less collagen (col lagen) layers on the surface of the cell membrane, and thus, the pancreatic islet cells do not form hard clusters (c lusters) and are easily broken. There is a need for a way to overcome this easily broken phenomenon.
  • Chitosan is a substance that can be obtained abundantly from nature and can be widely supplied as a commodity. Chitosan is a kind of amino polysaccharide that exists in nature. It is a natural product obtained by deacetylating chitin contained in the cell walls of microorganisms such as crabs, shrimp shells, cuttlefish bones, bear mushrooms and bacteria. It is non-toxic and biodegradable and has biocompatibility. It has biological properties such as cell binding and tissue culture, antibacterial and hemostatic action, lowers cholesterol, intestinal metabolism, and anti-cancer activity by immune enhancement. It is known to have physiological effects such as liver function improvement, hypoglycemic action and heavy metal detoxification.
  • Catechol is the main component of the photographic developer obtained by heating an alkaline aqueous solution of chlorophenol to about 200 o C. It is easy to oxidize and is also called pyrocatechol, brenzcatechin, or dihydroxybenzene. . About 50% of the synthesized catechols are used for the production of pesticides and the rest are used as precursors to microchemicals such as perfumes and drugs (Figel H et aL, "Phenol Der ivat ives” in Ul lmann's Encyc lopedi a of Industr ial Chemi stry, Wi ley-VCH, 2002). The majority of industrial flavors and fragrances are catechols as a starting material.
  • the present inventors modified the pancreatic islet surface by bonding a catechol directly adherent to the membrane surface of the pancreatic islet to chitosan, in order to overcome the phenomenon of the pancreatic islet cells after separating the pancreatic islet.
  • the chitosan-catechol composites can be usefully used for surface modification of pancreatic islet membranes.
  • the present invention has been completed.
  • the object of the present invention is to bind chitosan and catechol derivatives, or complexes of poly-L-lysine and catechol derivatives to pancreatic islet cells. It also provides a method for surface modification including pancreas. It is also an object of the present invention to provide a surface-modified pancreatic islet in which a complex of chitosan and catechol derivatives, or poly-L-lysine and catechol derivatives is bound to the pancreatic islet surface.
  • the present invention comprises the steps of binding the chitosan and catechol derivatives, or a complex of poly-L-lysine and catechol derivatives to the pancreatic islet cells. It also provides a method for surface modification including pancreas.
  • the present invention also provides surface modified pancreatic islets in which the complexes of chitosan and catechol derivatives, or poly-L-lysine and catechol derivatives are bound to the pancreatic islet surface.
  • pancreatic isotropy modified by the surface modification method of the present invention is less easily broken into single cells in the existing cluster form and inhibits the activation of inflammation mediators during initial contact with blood to prevent blood glossiness. Pancreas can also minimize losses.
  • chitosan-conjugated pancreatic ducts may be further introduced with a multilayered surface modification using a polymer such as polyethylene glycol as a crosslinking agent on the membrane surface to minimize host immune response and prolong the survival of transplanted pancreatic ducts.
  • FIG. 1 is a diagram representing a mechanism in which chitosan-catechol binds to the pancreatic duct membrane.
  • FIG. 2 is a picture taken with a confocal laser scanning microscope focusing on the middle part of the pancreatic intestine by treating the phosphoric acid-induced chitosan-catechol with INS-1, which is a fluorescent substance FITC *.
  • Figure 3 is a result of measuring cell viability by using a live dead kit (Live Dead kit), red fluorescence represents the dead cells, green fluorescence represents the living cells and A treated chitosan-catechol as a control Pancreatic islet is a non-pancreatic islet and B is a pancreatic islet treated with chitosan-catechol.
  • Live Dead kit live dead kit
  • red fluorescence represents the dead cells
  • green fluorescence represents the living cells
  • Pancreatic islet is a non-pancreatic islet
  • B is a pancreatic islet treated with chitosan-catechol.
  • Figure 4 is a result of measuring the cytotoxicity and viability by using the Lactate Dehydrogenase assay (LDH) assay, in preparation for the survival of the chitosan-catechol-treated control (100%) It is a graph showing the survival rate of the experimental group cells.
  • LDH Lactate Dehydrogenase assay
  • FIG. 5 is a diagram illustrating aggregat ion between cells by treating chitosan-catechol to INS-1 cells.
  • A is a control image of the INS-1 cells treated without any treatment after 1 hour culture
  • B is a chitosan-catechol-treated cells after 1 hour culture image.
  • C is the image of cells treated with no treatment after 2 hours of incubation
  • D is 2 hours After incubation, binding images of the cells treated with chitosan-catechol.
  • E is an image observed after 4 hours of no treatment
  • F is after chitosan-catechol treatment
  • Figure 6 is an image showing the viability of the INS-1 cell spheroid (spheroid) made using the hanging drop using a live dead kit.
  • A is an image showing the survivability of the INS-1 ellipsoid without any treatment as a control
  • B is an image showing the survivability of the INS-1 ellipsoid after chitosan-catechol treatment.
  • 7 is a diagram confirming the stability and INS-1 cell spheroids using trypsin-EDTA.
  • A is an INS-1 cell ellipsoid image without any treatment
  • B is an INS-1 cell ellipsoid image treated with 0.1% chitosan-catechol.
  • A is an image focused on the middle part of the pancreatic islets, and B is a three-dimensional image of several focus images combined.
  • A is an image of the pig pancreatic islets treated with no treatment as a control
  • B is an image of the pig pancreatic islets treated with chitosan-catechol.
  • A is an image focused on the middle part of the pancreatic islets, and B is a three-dimensional image of several focus images combined.
  • the present invention is a chitosan (chi tosan) described in the following [Formula 2] and catechol (catechol) derivative described in the formula (4), or poly-L-lysine (poly-L-lysine) And surface modified pancreatic islets, wherein the complex of catechol derivatives is bound to the pancreatic islet surface.
  • n is an integer of 1-20.
  • the surface-modified pancreatic islet is preferably prepared by the following method, but is not limited thereto. '
  • step 2) binding the complex of step 1) to the pancreatic islet membrane.
  • Step 1) preferably forms a complex in which the primary amine group of chitosan or poly-L-lysine and the carboxyl group of the catechol derivative described in [Formula 4] are reacted with an amide, and the catechol derivative
  • the high H-caffeine acid hydrocaf fei c acid (HCA)
  • HCA hydrocaffeic acid
  • HCA hydrocaffeic acid
  • -C00H group of the formula [1] under weakly acidic conditions
  • Step 1) is tris buffer (Tr is buf fer), phosphate buffered saline (phosphate It is preferable to use a basic buffer such as buffered saline, Hepes buffer, MOPS buffer, bicine buffer, tricine buffer or TES buffer. It is not limited.
  • step 2) it is preferable to bind the complex generated in step 1) to the pancreatic islets, and more preferably, chitosan-catechol is also bound to the pancreatic islet membrane.
  • step 2) it is preferable to fix chitosan on the surface of the pancreatic duct using the catechol structure and adhesiveness contained in the chitosan-catechol of [Formula 3] according to the present invention.
  • step 2) the amine group present in the collagen membrane of the pancreatic islets and the catechol structure bonded to the chitosan and the amino acids present on the membrane surface of the pancreatic islet also form coto bonds as shown in FIG. 1. It is preferable to bind the pancreatic tract to the membrane surface.
  • the reaction of chitosan and pancreatic islet according to the present invention is preferably performed at weak base conditions of pH 8, but is not limited thereto.
  • the method may further include the step of additionally introducing a surface-modifying substance to the hydroxy (hydroxy) group of the catechol derivative that is not bound to the surface amine group also pancreatic.
  • the surface modification material is preferably polyethylene glycol (PEG) or a polyethylene glycol derivative, and the polyethylene glycol or polyethylene glycol derivative is preferably attached to the same or different functional groups at both ends.
  • PEG polyethylene glycol
  • polyethylene glycol derivative is preferably attached to the same or different functional groups at both ends.
  • polyethylene glycol (PEG) has a very high hydrodynamic capacity and a very high ability to trap water molecules, polyethylene glycol bound to the surface of the pancreas also forms a water molecule film so that immune cells are not recognized as antigens. To prevent it.
  • the functional group is preferably any one selected from the group consisting of catechol group, amine group, hydroxyl group, carboxyl group, thiol group and sulfone group.
  • a bioactive material is additionally introduced into the functional group of the polyethylene glycol or polyethylene glycol derivative to which the functional group is attached, and the bioactive material is more preferably heparin.
  • the PEG derivatives include PEG-DOPA monomethoxy polyethylene glycol, PEG succinimide of PEG propionic acid, PEG butanoic acid succinimide of PEG butanoic ac.
  • Branched PEG-HNS branched PEG-NHS PEG succinimidyl succ inate, succinimide of carboxymethyl at ed PEG, benzotriazole carbonate of PEG (benzotr i azole carbonate of PEG), PEG-glycidyl ether, PEG-oxycarbonyl imidazole, PEG nitrophenyl carbonates, PEG— Aldehyde (PEG—aldehyde), PEG succinimidyl carboxymethyl ester, PEG succinimidyl ester, and the like can be used.
  • the surface modification method of the pancreatic islets of the present invention is preferably used in diseases requiring transplantation of pancreatic islet cells for the treatment of type 1 diabetes, but is not limited thereto.
  • the present inventors activate the -C00H group of the hydrocaf feic acid (HCA) of [Chemical Formula 1] in order to combine chitosan and catechol, A reaction with an amine group of chitosan as shown in [Formula 2] was finally combined with a dopa (D0PA) structure to the chitosan to generate chitosan-dopa as shown in [Formula 3] (see FIG. 1).
  • the chitosan-catechol labeled with the fluorescent material (FITC) was used to bind to INS-1 cells and the image was confirmed by confocal laser scanning microscopy. ).
  • the lactate dehydrogenase (LDH) analysis was used to remove dead cells due to synthetic material treatment, and then the amount of lactate secreted by lysing live cells was measured.
  • LDH lactate dehydrogenase
  • the chitosan-catechol-treated INS-1 cells showed strong magnification power (see FIG. 5).
  • the image was confirmed by confocal laser scanning microscope using chitosan-catechol labeled with fluorescent material (FITC), and the chitosan-catechol was detected on the pancreatic islet surface. Good binding was observed (see FIG. 8).
  • FITC fluorescent material
  • the image was confirmed by confocal laser scanning microscope using chitosan-catechol labeled with fluorescent material (FITC). It was confirmed that the pancreatic spot also binds to the surface (see FIG. 10).
  • FITC fluorescent material
  • the pancreatic is easily coated on the surface of the membrane, and the pancreatic islet can be formed by using other materials or PEGylation method using the chitosan primary amine group.
  • the pancreatic isotropy modified by the surface modification method of modifying the membrane surface into a multi-layer structure alleviates the brittleness easily broken down into single cells in the existing cluster form, inhibits the activation of inflammatory mediators during initial contact with blood clots, and prevents blood leakage. By minimizing the loss of pancreatic cells at the beginning of transplantation, it is possible to minimize host immune response and prolong the survival of transplanted pancreatic islets.
  • hydrocaffeic acid (hydrocaf fe ic ac id; HCA)
  • lOmg chitosan-catechol of Formula 3 above was added to Hank's Balanced Salt Solution (HBSS). )) (pH 8) Melted. The mixture was added to INS-1 cells in a cell incubator (37 ° C, 5> C0 2 )
  • a complete layer solution of 10 mg of chitosan-catechol of Formula 3 in HBSS (pH 8) of 1 was added to the pancreatic islet. After reacting for 1 hour at 37 0 C, 5% C0 2 ), the pancreatic islet was further washed with HBSS pH 7) buffer to stop the reaction and incubated in M199 until use.
  • a cell culture group was added to the pancreatic islet by adding a buffer of 5 mg of chitosan-catechol of Formula 3 to HBSS (pH 8). After reacting for 1 hour at 0 C, 5% C0 2 ), the pancreatic islet was washed with HBSS (pH 7) buffer to stop the reaction and incubated in M199 medium until use.
  • INS-1 cells were placed in 96 well culture plates with 5 X 10 3 cells and cultured for at least one day, then stabilized. Then, the medium was completely removed and treated with 1.0% of the FITC-labeled chitohan-catechol synthesized above. After the reaction was time-washed twice with HBSS, the image was confirmed by confocal laser scanning microscope. As a result, as shown in Fig.
  • the live dead survival / toxicity kit (invi trogen, Grand Island, NY) stains dead cells in red and live cells in green. Since the activity of intracellular esterases causes non-fluorescent cell penetrating calcein AM to be a strong fluorescence, live islets cells produce a strong equivalent green fluorescence. Ethidium homodimer (EthD-l) enters the damaged islet quine and then binds to the nucleic acid to produce red fluorescence in dead islets.
  • LDH lactamide dehydrogenase
  • INS-1 cells Incubate INS-1 cells with 10 ⁇ RPMI-1640 with 10% FBS Plates were plated with 5xl0 5 cells and incubated at 5% C0 2 , 37 0 C. After incubation for 2 days, the cells were treated with INS-1 cells (lxlO 3 cel l / n ⁇ HBSS) and chitosan-catechol (0.01V 0.125%, 0.25% and 0.5>). The well plates were incubated for 4 hours at 200 ⁇ per well. Survival of INS-1 cells was quantitatively analyzed by Lactate Dehydrogenase Cytotoxicity Kit (LDH; Pr omega, Madison, Wis.).
  • LDH Lactate Dehydrogenase Cytotoxicity Kit
  • Lactate dehydrogenase is a water soluble cytoplasmic enzyme in cells, released into the culture medium along with cells that have died due to damage to the cell's Fulazma hinne.
  • the increase in lactate activity in the medium is proportional to the lysed cells.
  • the released LDH in the supernatant is measured by enzymatic analysis and results in the formation of red formazan due to the conversion of tetrazolium ium salt.
  • FIG. 4 shows that the chitosan-catechol-treated cells showed similar lactate secretion compared to the INS-1 cells (control) without any treatment, and marked cell production compared to the control group treated with DMS0. It was confirmed that the 3 ⁇ 4 rate (Fig. 4).
  • INS-1 cells were put in a high concentration experimental lab, and 5 mg of chitosan-catechol in 1 HBSS (pH 8) was added to the tube containing the INS-1 cells, followed by cell culture (37 0 C, 5). % C0 2 ) after reacting for 1 to 4 hours and observed the coercive force of the cells. After the reaction for 1 hour, the untreated cell A and chitosan-catechol treated cell B were observed by optical microscopy ( Figures 5A and 5B), and after 2 hours of reaction, no treatment was performed. Image of cells (C) and chitosan-catechol treated cells (D) (FIGS. 5C and 5D), cells treated with no reaction after reaction for 4 hours (E) and cells treated with chitosan-catechol (F) Are observed images (FIGS. 5E and 5F).
  • pancreas transplantation in order to create a similar environment between transplanted and transplanted cells, the following experiment was performed to create a cell cluster similar in shape to a cluster of pancreatic islets.
  • the method of making INS-1 cell globules was made by aggregating the INS-1 cells into three groups using a hanging drop to form clusters of uniform size. 30? Drops of a cell suspension consisting of INS-1 cells (1000 islets) are applied inside the Petridar cap with PBS. 72 hours after incubation in a cell incubator, the Pasteur pipette was used to remove HSs and ICCs. Using this method, INS-1 cells were made to form a cluster of cells similar to those of islet cells, and the survival of the cell clusters was carried out as in Experiment 2 using the live dead survival / toxicity kit.
  • FIG. 6A was a result of experiments with no-treated insulin secreting cells (INS-1) globules, and green cells were observed
  • FIG. 6B was chitosan-cate.
  • FIG. 6A was a result of experiments with the INS-1 cell globules treated with the call, it was confirmed that green cells such as 6A were observed (FIG. 6).
  • Trypsin-EDTA was used to break down the protein that connects the cells to the cells, and the bound cell clusters were separated into single cells to release the bound cells by collagen.
  • concentration of trypsin By controlling the concentration of trypsin, the glomerular power and stability of the globular body were confirmed by observing the degree of separation of single-celled INS-1 cell globules and chitosan-catechol-coated INS-1 cell globules.
  • INS-1 cell glomeruli were treated with 0.025% trypsin for 10 minutes and image (control) (FIG. 7A) and chitosan-catechol 0.1% treated with INS-1 cell globules treated with 0.025% trypsin
  • the globular image when analyzed for 10 minutes was analyzed.
  • the phenomenon of falling into single cells was observed more strongly, but in the case of INS-1 cell globules treated with 0.1% chitosan ⁇ catechol, it was confirmed that the falling into single cells was weak. In other words, it was confirmed that chitosan-catechol prevented the separation of the cells to some extent.
  • the rat pancreatic pancreatic pancreas was also confirmed chitosan-catechol binding in the same manner as in ⁇ Experimental Example 1>.
  • Fig. 9 the pig pancreatic islets treated without any treatment (Fig. 9a) and the chitosan-treated pig pancreatic islets (Fig. 9b) show that a large number of cells are green. It was confirmed that binding of kohl to porcine pancreatic islets did not affect viability (FIG. 9).
  • the pig pancreatic pancreatic pancreatic pancreatic pancreatic pancreatic was also confirmed chitosan-catechol binding in the same manner as in ⁇ Experimental Example 1>.

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Abstract

본 발명에서는, 빵 나무(Artocarpus altilis) 열매, 잎 또는 줄기 추출물, 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로 본 발명에 따른 빵 나무 열매, 잎 또는 줄기 추출물 또는 이의 분획물은 암세포주의 성장과 인체 면역 기능에 중요한 역할을 하는 스탯3(signal transducers and activators of transcription3, STAT3)의 활성을 억제시키므로 대장암, 위암, 전립선암, 유방암, 신장암, 간암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암 또는 췌장암 등의 암 예방 및 치료에 유용하게 사용할 수 있을 것이다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
키토산 카테콜 합성물질을 이용한 췌장소도 막의 표면 개질 방법 【기술분야】
본 발명은 카테콜 (catechol )구조를 갖는 하이드로카페인산 (hydrocaffeic acid; HCA)을 키토산 (Chitosan)에 아미드 결합 (amide bond) 형성을 통하여 합성하고 도파 (D0PA)가 가지고 있는 흡착력 (adhesiveness)을 장점으로 하여 췌장소도 막 표면올 개질하는 방법에 관한 것이다.
[배경기술】
전체 당뇨환자 중 5 - 10%가 1형 당뇨병에 해당되며 췌장에서 인슐린을 분비하는 베타세포가 파괴되어 인술린이 절대적으로 부족하여 생기게 되는 질병으로서，주로 소아나 청소년들에게 발병하는 특징이 있어 '소아당뇨'， 또는 치료에 반드시 인슐린을 사용해야 하므로 '인슐린 의존성 당뇨병 '이라고도 불린다. 제 1형 당뇨병은 일종의 자가면역질환이기 때문에, 과학자들은 이를 억제하기 위해 면역체계를 조절하는 방법을 통해 제 1형 당뇨병을 예방하는 기술을 연구 중에 있으며 현재 제 1형 당뇨를 완치하는 방법은 없지만， 초기 진단이 이루어지면 식사의 변화와 혈당 관리 등으로 도움을 받을 수 있다. 제 1형 당뇨병의 치료방법으로는 평생 동안 인슐린 호르몬을 투여하면서 혈당을 조절하거나, 췌장 이식을 할 수 있으며 이식을 하는 경우 당뇨병으로 인한 합병증의 발생을 억제할 수 있다. 그러나 마취 또는 수술의 위험도와 이식 수술 후 평생 동안 거부반웅을 방지하기 위하여 면역억제제를 복용하여야 하는 점을 감안하여야 한다. ' 현재까지 제 1형 당뇨병 환자들의 최선의 치료는 췌장소도세포의 이식이다. 췌장소도세포를 이식하는데 필요한 장기는 대부분 뇌사자의 췌장을 활용하는 방법이 보편화하여 있지만， 공급에 많은 어려움에 있는 것이 사실이다. 따라서， 이를 대체할 수 있는 동물로부터 얻은 거부반웅이 적은 췌장소도세포이식 방법이 필요한 상항이다.
제 1형 당뇨병의 치료를 위한 돼지 췌장소도 이식에 있어서 가장 큰 문제점은 돼지 췌장소도 분리 후 췌장소도 세포의 부서짐 현상이다. 돼지 췌장소도 세포는 다른 종의 췌장소도 세포와 달리 콜라겐 (col lagen) 층이 세포막 표면에 적게 분포되어 있어서 췌장소도 세포가 단단한 클러스터 (c luster )를 형성하지 못하고 쉽게 부서지는 현상을 볼 수 있다. 이러한 쉽게 부서지는 현상을 극복하기 위한 방법이 필요한 상황이다.
키토산 (Chi tosan)은 자연계로부터 풍부하게 얻어질 수 있으며， 상품으로 널리 공급될 수 있는 물질이다. 키토산은 자연계에 존재하는 아미노폴리사카라이드 (amino polysacchar ide)의 일종으로 게, 새우의 껍질과 오징어 뼈， 곰광이ᅳ 버섯류 및 세균 등의 미생물의 세포벽에 함유되어 있는 키틴을 탈아세틸화하여 얻어지는 천연물질로 독성이 없고 생분해가 가능하여 생체친화성을 가지며， 세포의 결합 및 생체조직배양, 항균성， 지혈작용 등의 생체학적 특성과 콜레스테를 저하작용， 장내대사작용， 면역증강에 의한 항암작용， 간기능 개선 및 혈당저하작용， 중금속 해독작용 등의 생리작용을 하는 것으로 알려져 있다.
카테콜 ( catechol )은 클로로페놀 (chlorophenol )의 알칼리성 수용액을 약 200oC로 가열하면 얻올 수 있는 사진 현상액의 주성분이고， 산화가 되기 쉬우며 피로카테콜， 브렌츠카테킨 또는 디히드록시벤젠이라고도 불리운다. 합성된 카테콜의 약 50%는 살충제 생산에 사용되며 나머자는 향수 및 약품과 같은 미세 화학품에 전구체로서 사용된다 (Fi egel H et aL , "Phenol Der ivat ives" in Ul lmann ' s Encyc lopedi a of Industr ial Chemi stry, Wi ley-VCH , 2002) . 대다수의 산업적 향미 맟 향기는 카테콜이 시작물질이다. 카테콜의 모노에틸에테르 (monoethyl ether )된 구에를 (guethol )은 초콜렛류의 성분인 에틸바닐린 (ethylvani l l in)으로 전환된다. , 이에， 본 발명자들은 췌장소도 분리 후 췌장소도 세포의 부서짐 현상을 극복하기 위하여， 키토산에 췌장소도의 막 표면에 직접 접착성을 띠는 카테콜을 접합시켜 췌장소도 표면을 개질한 결과， 상기 방법은 췌장소도를 견고하게 지지하며 췌장소도의 형태 (morphology) 유지기간을 유의적으로 연장시키는 것올 확인함으로써, 상기 키토산-카테콜 합성물질을 췌장소도 막의 표면 개질에 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써， 본 발명을 완성하였다.
【발명와상세한 설명】
【기술적 과제】 - 본 발명의 목적은 키토산 (chi tosan) 및 카테콜 (catechol ) 유도체， 또는 폴리 -L-라이신 (poly-L-lysine) 및 카테콜 유도체의 복합체를 췌장소도 세포에 결합시키는 단계를 포함하는 췌장소도 표면 개질 방법을 제공하는 것이다. 또한， 본 발명의 목적은 키토산 및 카테콜 유도체， 또는 폴리 -L-라이신 및 카테콜 유도체의 복합체가 췌장소도 표면에 결합된 표면개질된 췌장소도를 제공하는 것이다. 【기술적 해결방법】
상기 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 키토산 (chi tosan) 및 카테콜 (catechol ) 유도체， 또는 폴리 -L-라이신 (poly-L-lysine) 및 카테콜 유도체의 복합체를 췌장소도 세포에 결합시키는 단계를 포함하는 췌장소도 표면 개질 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 키토산 및 카테콜 유도체， 또는 폴리 -L-라이신 및 카테콜 유도체의 복합체가 췌장소도 표면에 결합된 표면개질된 췌장소도를 제공한다. 【유리한 효과】
본 발명의 표면 개질 방법쎄 의해 변형된 췌장소도는 기존의 클러스터 형태에서 단일 세포로 쉽게 부서지는 성질이 완화되고 혈액과의 초기 접촉시 나타나는 염증 매개 물질 활성화를 억제하여 혈액웅고를 방지하여 이식 초기의 췌장소도 손실을 최소화할 수 있다. 또한， 키토산이 결합된 췌장소도 막 표면에 폴리에틸렌글리콜과 같은 중합체를 가교제로 이용하여 다층성 표면개질을 추가적으로 도입하여 숙주 면역 반웅을 최소화하고 이식된 췌장소도의 생존기간을 연장시킬 수 있다. [도면의 간단한 설명】
도 1은 키토산 -카테콜이 췌장소도 막에 결합하는 매커니즘을 표현한 그림이다.
도 2는 형광물질인 FITC* 도입한 키토산-카테콜을 인술린 분비 세포인 INS-1 에 처리하여 췌장소도 중간부분에 초점을 맞춰 공초점 레이저 주사 현미경으로 촬영한 그림이다.
도 3은 라이브데드키트 (Live Dead ki t )를 이용하여 세포 생존성을 측정한 결과로서， 붉은색 형광은 사멸된 세포를 나타내고 녹색 형광은 살아있는 세포를 나타내며 A는 대조군으로서 키토산-카테콜을 처리하지 않은 췌장소도이고 B는 키토산 -카테콜을 처리한 췌장소도이다.
도 4는 락테이트디하이드로제네즈 분석 (Lactate Dehydrogenase assay(LDH) )을 이용하여 세포독성 및 생존성을 측정한 결과로서, 키토산-카테콜을 처리하지 않은 대조군의 생존를에 대비하여 ( 100%) 실험군 세포의 생존률을 나타낸 그래프이다.
도 5는 키토산-카테콜을 INS-1 세포에 처리하여 세포간의 웅집력 (aggregat ion)을 확인한 그림이다. A는 대조군으로써 아무런 처리도 하지 않은 INS-1 세포의 결합을 1시간 배양 후 본 이미지이고， B는 키토산-카테콜을 처리한 세포를 1시간 배양 후 본 이미지이다. C는 아무 처리도 하지 않은 세포의 결합을 2시간 배양 후 본 이미지이고， D는 2시간 배양 후， 키토산-카테콜을 처리한 세포의 결합 이미지이다. E는 아무 처리도 하지 않은 세포를 4시간 후 관찰한 이미지이고， F는 키토산-카테콜 처리 후
4시간 배양 후 관찰한 세포 결합 이미지이다.
도 6은 현적법 (hanging drop)을 이용하여 만든 INS-1 세포 타원체 (spheroid)의 생존성을 라이브데드키트를 이용하여 나타낸 이미지이다.
A는 대조군으로서 아무 처리도 하지 않은 INS-1 타원체의 생존성을 나타낸 이미지이고， B는 키토산 -카테콜을 처리한 후의 INS-1타원체의 생존성을 나타낸 이미지이다 . 도 7은 트립신 -EDTA를 사용하여 INS-1 세포 타원체와 안정성을 확인한 그림이다. A는 아무 처리도 하지 않은 INS-1 세포 타원체 이미지이고， B는 키토산-카테콜 0.1%를 처리한 INS-1 세포 타원체 이미지이다.
도 8은 형광물질인 FITC를 도입한 키토산-카테콜을 래트 (rat ) 췌장소도에 처리하여 공초점 레이저 주사 현미경으로 촬영한 이미지이다. A는 췌장소도의 중간부분에 초점을 맞춘 이미지이고， B는 여러 장의 초점이미지를 합쳐 입체적으로 형상화한 이미지이다.
도 9는 라이브 데드 키트를 이용한 돼지 췌장소도의 생존성을 확인한 그림이다. A는 대조군으로써 아무 처리도 하지 않은 돼지 췌장소도의 이미지이고， B는 키토산-카테콜을 처리한 돼지 췌장소도의 아미지이다.
도 10은 형광물질인 FITC를 도입한 키토산-카테콜을 돼지 췌장소도에 처리하여 공초점 레이저 주사 현미경으로 촬영한 이미지이다. A는 췌장소도의 중간부분에 초점을 맞춘 이미지이고， B는 여러 장의 초점이미지를 합쳐 입체적으로 형상화한 이미지이다.
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
이하， 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 [화학식 2]로 기재되는 키토산 (chi tosan) 및 [화학식 4]로 기재되는 카테콜 (catechol ) 유도체, 또는 폴리 -L-라이신 (poly-L-lysine) 및 카테콜 유도체의 복합체가 췌장소도 표면에 결합된 표면개질된 췌장소도를 제공한다.
Figure imgf000007_0001
3]' 키토산 -도파 (Dopa)
Figure imgf000007_0002
[화학식 4] 카테콜 유도체
Figure imgf000008_0001
O H
여기서， n은 1 내지 20의 정수이다.
상기 표면개질된 췌장소도는 하기와 같은 방법으로 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. '
1) 키토산 또는 폴리 -L-라이신의 1차 아민기와 카테콜 유도체의 카르복실기를 아미드 (amide)와 반웅시키는 복합체를 제조하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 복합체를 췌장소도 막에 결합시키는 단계.
이하， 본 발명을 단계별로 더욱 구체적으로 설명한다.
상기 단계 1)은 키토산 또는 폴리 -L-라이신의 1차 아민기와 상기 [화학식 4]로 기재되는 카테콜 유도체의 카르복실기를 아미드 (amide)와 반웅시키는 복합체를 형성하는 것이 바람직하고， 상기 카테콜 유도체는 하이 H로카페인산 (hydrocaf fei c acid(HCA) )인 것이 보다 바람직하고， 상기 [화학식 1]의 하이드로카페인산 (hydrocaf feic acid(HCA) )와 -C00H기를 활성화시킨 후， 약산성 조건하에서 상기 [화학식 2]와 같은 키토산의 아민 (amine)기와 반웅시켜 최종적으로 키토산에 도파 (D0PA) 구조가 결합되어 상기 [화학식 3]과 같은 키토산-도파를 생성시키는 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 키토산 -도파 합성에서 반웅비를 조절하여 한 분자의 키토산에 결합하는 카테콜 (catechol ) 구조의 수를 조절할 수 있다.
상기 단계 1)은 트리스완충액 (Tr i s buf fer) , 인산완충식염수 (phosphate buffered saline)， 헤페스완충액 (HEPES buffer), MOPS 완충액 (MOPS buffer), 비신완충액 (bicine buffer), 트리신완충액 (tricine buffer)또는 TES완충액 (TES buffer)인 염기성 완충액을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 2)는 상기 단계 1)에서 생성된 복합체를 췌장소도에 결합시키는 것이 바람직하고, 키토산-카테콜을 췌장소도 막에 결합시키는 것이 보다 바람직하다.
상기 단계 2)에서는 본 발명에 따른 상기 [화학식 3]의 키토산-카테콜에 포함된 카테콜 구조와 접착성을 이용하여 췌장소도 막 표면에 키토산을 고정시키는 것이 바람직하다.
상기 단계 2)에서 췌장소도의 콜라겐 막에 존재하는 아민 (amine)기， 췌장소도 자체의 막 표면에 존재하는 아미노산과 키토산에 결합된 카테콜 구조가 공유결합을 형성하여 도 1과 같은 형태로 키토산을 췌장소도 막 표면에 결합시키는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 키토산과 췌장소도의 반응은 pH 8 정도의 약염기 조건에서 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한， 상기 방법은 3) 췌장소도 표면 아민기와 결합되지 않은 카테콜 유도체의 하이드록시 (hydroxy)기에 표면개질용 물질을 결합시키는 것을 추가적으로 도입하는 단계.를 추가적으로 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 표면개질용 물질은 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol; PEG) 또는 폴리에틸렌 글리콜 유도체인 것이 바람직하고， 상기 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜 유도체는 양쪽 말단에 같거나 또는 서로 다른 관능기가 부착된 것이 바람직하다. "
상기 폴리에틸렌글리콜 (PEG)은 유체역학적 용량이 매우 크고 물분자를 포집하고 있는 능력이 매우 높기 때문에 췌장소도 표면에 결합된 폴리에틸렌글리콜은 물분자막을 형성하여 면역세포가 항원으로 인식되지 못하도록 하는 역할을 하게 된다.
상기 관능기는 카테콜기， 아민기， 히드록실기， 카르복실기， 티올기 및 설폰기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하다 .
상기 관능기가 부착된 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜 유도체의 관능기에 생체활성 물질이 추가적으로 도입된 것이 바람직하고， 상기 생체활성 물질은 헤파린인 것이 보다 바람직하다.
상기 PEG 유도체로는 PEG-도파 (PEG-DOPA 모노메톡시 PEG monomethoxy polyethylene glycol ) , PEG 프로피론산의 숙시니미드 (succinimide of PEG propionic acid) , PEG부타논산의 숙시니미드 (succ inimide of PEG butanoic ac id) 가지달린 PEG-HNS branched PEG-NHS) , PEG 숙시니미딜 숙시네이트 (PEG succinimidyl succ inate) , 카복시메틸화 PEG의 숙시니口 1드 (succinimide of carboxymethyl at ed PEG) , PEG의 벤조트리아졸 카보네이트 (benzotr i azole carbonate of PEG) , PEG-글리시딜 에테르 (PEG-glycidyl ether ) , PEG-옥시카보닐이미다졸 (PEG— oxycarbonyl imidazole) , PEG 니트로페닐 카보네이트 (PEG ni trophenyl carbonates) , PEG—알데히드 (PEG—aldehyde) , PEG 숙시니미딜 카르복시메틸 에스테르 (PEG succinimidyl carboxymethyl ester ) , PEG 숙시니미딜 에스테르 (PEG succ inimidyl ester ) 등을 사용할 수 있다. 또한， 본 발명의 췌장소도의 표면 개질 방법은 제 1형 당뇨병치료를 위한 췌장소도세포의 이식을 필요로 하는 질환에 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시예에서， 본 발땅자들은 키토산과 카테콜을 결합시키기 위하여， 상기 [화학식 1]의 하이드로카페인산 (hydrocaf feic acid(HCA) )의 -C00H기를 활성화시킨 후， 약산성 조건하에서 상기 [화학식 2]와 같은 키토산의 아민 (amine)기와 반웅시켜 최종적으로 키토산에 도파 (D0PA) 구조가 결합되어 상기 [화학식 3]과 같은 키토산-도파를 생성시켰다 (도 1 참조) . 또한， 상기 형광물질 (FITC)로 표지된 키토산-카테콜을 사용하여 INS-1 세포에 결합시키고 공초점 레이저 주사 현미경으로 이미지를 확인한 결과， 췌장소도 표면에 잘 결합하는 것이 관찰되었다 (도 2 참조) .
나아가， 키토산-카테콜이 결합된 INS-1 세포의 생존성 확인한 결과， 살아있는 세포기 녹색으로 염색됨으로써 키토산-카테콜 처리가 세포의 생존성에는 큰 영향을 미치지 않음을 확인하였다 (도 3 참조) .
또한， INS-1 세포 생존성을 구체적인 분포도로 확인하기 위하여， 락테이트탈수소효소 (LDH)분석을 이용하여 합성물질 처리로 인해 죽은 세포를 제거한 후， 살아있는 세포를 용해하여 분비되는 락테이트의 양을 측정한 결과， 키토산ᅳ카테콜을 처리한 세포는 높은 락테이트 분비양을 나탄냄으로써 키토산-카테콜이 INS-1 세포에 결합하는 것이 생존성에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다 (도 4 참조) .
나아가， 라이브 데드 생존률 /독성 키트를 이용한 INS-1 세포 구상체 (spheroid)의 웅집력을 확인한 결과， 키토산-카테콜이 처리된 INS-1 세포에서 강한 웅집력을 나타냈다 (도 5 참조 ) ·
또한， 라이브 데드 생존률 /독성 키트를 이용하여 INS-1 세포 구상체 (spheroid)의 생존성 확인한 결과， 키토산-카테콜이 INS-1세포 구상체에 결합하는 것이 생존성에 대해 영향을 미치지 않음을 확인하였다 (도 6 참조) . 나아가, INS-1 세포 구상체의 안정성을 확인하기 위하여, 트립신 (Trypsin-EDTA)를 이용하여 단백질을 분해실험을 수행한 결과， 키토산ᅳ카테콜이 처리된 INS-1 세포 구상체가 트립신에 의해 대조군보다 더욱 쉽게 단세포로 분리되는 것을 확인하였다 (도 7 참조) .
나아가, 췌장소도 표면에 키토산이 고정되었는지를 확인하기 위해서， 형광물질 (FITC)로 표지된 키토산-카테콜을 사용하여 공초점 레이저 주사 현미경으로 이미지를 확인한 결과， 키토산-카테콜은 췌장소도 표면에 잘 결합하는 것이 관찰되었다 (도 8 참조) .
또한， 키토산-카테콜 결합에 의한 돼지 췌장소도의 생존성을 확인하기 위하여， 라이브 데드 생존률 /독성 키트를 이용하여 실험한 결과， 키토산-카테콜이 췌장소도에 결합하는 것이 생존성에 영향을 미치지 않음을 확인하였다 (도 9 참조) .
나아가, 돼지 췌장소도 표면에 키토산이 고정되어 있는지를 확¾하기 위해서， 형광물질 (FITC)로 표지된 키토산-카테콜을 사용하여 공초점 레이저 주사 현미경으로 이미지를 확인한 결과， 키토산-카테콜이 돼지 췌장소도 표면에 결합하는 것을 확인하였다 (도 10 참조) .
따라서， 본 발명의 접착성을 가지는 키토산-카테콜 합성체를 사용하여 췌장소도 막 표면을 쉽게 코팅하고 키토산의 1차 아민 (amine)기에 다른 물질이나 PEG화 (PEGlat ion) 방법을 사용하여 췌장소도 막 표면을 다층 구조로 개질하는 표면 개질 방법에 의해 변형된 췌장소도는 기존의 클러스터 형태에서 단일 세포로 쉽게 부서지는 성질을 완화시키고 혈짝과의 초기 접촉시 나타나는 염증 매개 물질 활성화를 억제 및 혈액웅고를 방지하여 이식 초기의 췌장소도 손살을 최소화함으로써 숙주 면역 반웅을 최소화하고 이식된 췌장소도의 생존기간을 연장시킬 수 있다. 이하， 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 더욱 상세하게 설명한다. 단， 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다. <실시예 1> 키토산과 카테콜의 결합 확인
키토산과 카테콜을 결합시키기 위하여， 하기 [화학식 1]의 하이드로카페인산 (hydrocaf fei c ac id(HCA) )의 -C00H기를 활성화시킨 후， 약산성 조건하에서 (pH=8) 상기 [화학식 2]의 키토산의 아민 (amine)기와 반웅시켜 최종적으로 키토산에 도파 (D0PA) 구조가 결합되어 상기 [화학식 3]의 키토산-도파를 생성시켰다.
[화학식 1] 하이드로카페인산 (hydrocaf fe i c ac id ; HCA)
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Figure imgf000013_0002
토산 -도파 (Dopa)
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<실시예 2> INS-1세포막에 키토산-카테콜 결합 확인
인슐린 분비 세포 (insulin-secreting cell(INS-l)) 막 표면에 키토산-카테콜을 결합시키기 위하여，상기 화학식 3의 lOmg의 키토산-카테콜을 1 의 생리식염 인산완충액 (Hank's Balanced Salt Solution(HBSS))(pH 8)에 녹였다. 상기 흔합액을 INS-1 세포에 첨가하여 세포배양기 (37°C , 5 > C02)에서
1시간 동안 반웅시킨 후 HBSS 완충액으로 INS-1 세포를 세척하여 반웅을 정지시키고 사용 전까지 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. <실시예 3> 래트 (rat) 췌장소도 막에 키토산-카테콜 결합
래트에서 분리한 췌장소도 막 표면에 키토산-카테콜을 결합시키기 위하여， 상기 화학식 3의 10 mg의 키토산-카테콜을 1 의 HBSS(pH 8)에 녹인 완층액을 췌장소도에 첨가하여 세포배양기 (370C , 5% C02)에서 1시간 동안 반웅시킨 후 추가적으로 HBSS pH 7) 완충액으로 췌장소도를 세척하여 반웅을 중지하고 사용 전까지 M199에서 배양하였다.
<실시예 4>돼지 췌장소도 막에 키토산-카테콜 결합 확인
돼지에서 분리한 췌장소도 막 표면에 키토산-카테콜을 결합시키기 위하여， 1 의 HBSS(pH 8)에 상기 화학식 3의 5 mg의 키토산-카테콜을 녹인 완충액을 췌장소도에 첨가하여 세포배양기 (370C , 5% C02)에서 1시간 동안 반웅시킨 후 HBSS(pH 7)완충액으로 췌장소도를 세척하여 반웅을 중지하고 사용 전까지 M199 배지에서 배양하였다.
<실험예 1> 공초점 레이저 주사 현미경 (Confocal Laser Scanning Microscopy)을 이용한 INS-1 세포 막에의 키토산-카테콜 결합확인
INS-1 세포 표면에 키토산이 고정되었는지를 확인하기 위하여， 형광물질 (FITC)로 표지된 키토산—카테콜을 사용하여 상기 [실시예 2]와 같은 방식으로 반웅시키고 공초점 레이저 주사 현미경으로 이미지를 확인하였다. INS-1세포를 96 웰 배양 플레이트에 5 X 103세포를 넣고 하루 이상 배양한 후 안정화 시키고 이 후 배지를 완전히 제거하고 앞에서 합성한 FITC 로 표지된 키토한-카테콜을 1.0%로 처리하여 1시간 반웅시키고 나서 HBSS를 이용하여 2차례 워싱한 후 공초점 레이저 주사 현미경으로 이미지를 확인하였다. 그 결과， 도 2에 나타낸 바와 같이, INS-1 세포의 중심구획을 기준으로 형광 이미지를 측정한 결과， 키토산-카테콜이 췌장소도 표면에 잘 결합하는 것이 관찰되었다 (도 2) . <실험예 2> 라이브 데드 생존률 /독성 키트 (LIVE/DEAD
Viabi l ity/Cytotoxicity Kit) 및 락테이트탈수소효소 분석 (Lactate Dehydrogenase(LDH) Assay)을 이용한 INS-1세포 생존성 확인
INS-1 세포 생존성 확인하기 위하여， 라이브 데드 생존률 /독성 키트를 이용하여 세포의 상태를 관찰하였다.
상기 라이브 데드 생존률 /독성 키트 ( invi trogen, Grand Island, NY) )는 죽은 세포를 붉은색으로 염색시키고 살아있는 세포를 녹색으로 염색시킨다. 세포 내 에스터라제 (esterase)의 활성은 비형광 세포 투과 칼세인 (calcein) AM을 강한 형광이 되도록 하기 때문에， 살아있는 소도세포는 강한 균등한 녹색 형광을 생성한다. 에티디움 동종이합체 (Ethidium homodimer)(EthD-l)은 손상된 소도 멤브린으로 들어간 후， 핵산과 결합하여 죽은 소도에서 붉은색 형광을 생성시킨다.
그 결과， 도 3A의 아무런 처리도 하지 않은 INS-K대조군)에서는 녹색을 띠는 많은 세포를 관찰할 수 있었고， 도 3B의 키토산-카테콜을 처리한 INS-1 세포에서는 대조군보다 많은 붉은 색을 띠는 다수의 세포를 발견할 수 있었으나 여전히 많은 세포들이 녹색을 나타냄으로써 키토산-카테콜 처리가 세포의 생존성에는 큰 영향을 미치지 않음을 확인하였다 (도 3) .
또한， INS-1 세포 생존성을 구체적인 분포도로 확인하기 위하여, 락테미트탈수소효소 (LDH)분석을 이용하여 합성물질 처리로 인해 죽은 세포를 제거한후，살아있는 세포를 용해하여 분비되는 락테이트의 양을 측정한후, 본 발명의 키토산-카토콜을 처리한 INS-1 세포의 상대적인 생존성 정도를 백분율 (%)로 나타내었다.
INS-1 세포를 10% FBS가 포함된 10 ^의 RPMI-1640이 있는 배양 플레이트에 5xl05 세포로 깔고 5% C02 , 370C에서 배양하였다. 2일 동안 배양하여 안정화시킨 후， INS-1 세포 ( lxlO3 cel l/n^ HBSS) 및 키토산-카테콜 (0.01V 0.125%, 0.25% 및 0.5 >)이 처리된 INS-1 세포를 96-웰 플레이트에서 웰 당 200 ^씩 4시간 동안 배양하였다. INS-1 세포의 생존률은 락테이트 디하이드로제네즈 (Lactate Dehydrogenase) 세포독성 키트 (LDH; Pr omega , Madison, WI )에 의해 정량적으로 분석되었다. 락테이트 디하이드로제네즈는 세포에 있는 수용성 세포질 효소로서， 세포의 풀라즈마 멤브린에 손상에 의해 죽은 세포에 따라 배양중인 배지로 방출된다. 배지내의 락테이트 활성의 증가는 용해된 세포에 비례한다. 상충액에 있는 방출된 LDH는 효소 분석으로 측정되고， 테트라졸리움 염 (tetrazol ium salt )의 전환으로 인해 붉은색 포르마잔 ( formazan) 생성을 초래한다.
그 결과， 도 4는 아무런 처리도 하지 않은 INS-1 세포 (대조군)와 비교하여 키토산-카테콜을 처리한 세포는 유사한 락테이트 분비양을 나타내고， DMS0를 처리한 비교군과 비교하여 현저한 세포 생¾률을 나타냄을 확인하였다 (도 4) .
따라서， 키토산-카테콜이 INS-1 세포에 결합하는 것이 생존성에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.
<실험예 3> INS-1 세포사이의 웅집력 (aggregation) 확인
INS-1 세포사이의 웅집력을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 실행하였다.
INS-1 세포를 고농도로 실험용 류브에 넣고， 1 HBSS(pH 8)에 5 mg의 키토산-카테콜을 녹인 용액을 상기 INS-1 세포가 있는 튜브에 넣은 후， 세포배양기 (370C , 5% C02)에서 1 내지 4 시간 동안 반웅시킨 후 세포끼리의 웅집력을 관찰하였다. 1시간 동안 반웅 후 아무 처리 하지 않은 세포 A와 키토산-카테콜 처리한 세포 B의 웅집력을 광학현미경으로 관찰하여 이미지를 나타냈고 (도 5A 및 5B) , 2시간 동안 반웅 후 아무 처리도 하지 않은 세포 (C)와 키토산-카테콜 처리한 세포의 이미지 (D) (도 5C 및 5D) , 4시간 동안 반웅 후 아무 처리도 하지 않은 세포 (E)와 키토산-카테콜을 처리한 세포 (F)를 관찰한 이미지이다 (도 5E 및 5F) .
그 결과로서， 도 5에 나타낸 바와 같이， 키토산-카테콜 처리한 세포는 갈색을 띠는 뭉친 세포들이 많이 나타남으로써， 키토산-카테콜 처리시간 의존적으로 강한 응집력올 나타내는 것을 확인하였다 (도 5) .
<실험예 4> 라이브 데드 생존률 /독성 키트를 이용한 INS-1 세포 구상체 (spheroid)의 생존성 확인
췌장이식에 있어서， 이식되는 세포와 이식받는 세포 사이의 유사한 환경을 만들기 위하여， 췌도세포의 클러스터와 유사한 모양의 세포 클러스터를 만드는 하기 실험을 수행하였다.
INS-1 세포 구상체를 만드는 방법은 현적법 (hanging drop)을 이용하여 INS-1 세포를 일정한 3기로 뭉쳐서 균일한 크기의 클러스터를 만들 수 았다. INS-1 세포 (1000 소도세포)로 구성된 세포 현탁액의 30≠방울 (drop)을 PBS가 있는 페트리다쉬 뚜껑 안쪽에 적용시킨다. 세포 배양기에서 배양한 후 72시간에 파스퇴르 파이펫을 사용하여 HSs 및 ICCs를 제거하였다. 상기 방법을 이용하여 INS-1 세포로 췌도세포의 클러스터와 유사한 모양의 세포 클러스터를 만들고， 세포 클러스트의 생존를을 라이브 데드 생존를 /독성 키트를 이용하여 상기 [실험예 2]와 같이 실행하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 도 6A는 아무런 처리도 하지 않은 인슐린 분비 세포 ( INS-1) 구상체로 실험한 결과로서， 녹색을 띠는 세포를 관찰할 수 있었고, 도 6B는 키토산-카테콜을 처리한 INS-1 세포 구상체로 실험한 결과로서 6A와 같이 녹색을 띠는 세포가 관찰됨을 확인하였다 (도 6) .
상기 결과로부터 키토산-카테콜이 INS-1 세포 구상체에 결합하는 것이 생존성에 대해 영향올 미치지 않음을 확인하였다.
<실험예 5> 트립신 (Trypsin-EDTA) 처리를 통한 INS-1 세포 구상체의 안정성 (stabi l ity) 확인
INS-1 세포 구상체의 안정성을 확인하기 위하여， 단백질을 분해실험을 수행하였다.
트립신 (Trypsin-EDTA)를 이용하여 세포와 세포를 연결사키는 단백질을 분해시키고 결합되어 있던 세포 클러스터가 단세포로 분리되어 콜라겐등에 의해 결합되어 있던 세포를 떨어져 나오게 하였다. 트립신의 농도를 조절하여 아무 처리 하지 않은 INS-1 세포 ¾ 만든 구상체와 키토산-카테콜 코팅된 INS-1 세포 구상체가 단세포로 분리되는 정도를 관찰함으로써 구상체의 웅집력 및 안정성을 확인하였다.
구체적으로， INS-1 세포 구상체에 0.025% 트립신을 10분 동안 처리했을 때와 이미지 (대조군) (도 7A) 및 키토산-카테콜 0.1%이 처리된 INS-1 세포 구상체에 0.025%트립신을 10분간 처리했을 때의 구상체 이미지를분석하였다. 대조군의 경우 구상체에서 단일 세포로 떨어지는 현상이 좀더 강하게 관찰이 되었지만 키토산ᅳ카테콜 0.1%가 처리된 INS-1세포 구상체의 경우는 단일 세포로 떨어지는 현상이 약하게 나타나고 있는 것을 확인하였다. 즉, 키토산-카테콜이 세포의 분리를 어느 정도 막아주고 있음을 확인하였다.
<실험예 6> 공초점 레이저 주사 현미경을 이용한 랫트 췌장소도 막의 키토산-카테콜 결합확인
랫트 췌장소도 표면에 키토산이 고정되었는지를 확인하기 위해서， 랫트 췌장소도를 이용하여 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로， 랫트 췌장소도 막의 키토산—카테콜 결합을 확인하였다.
그 결과， 도 8에 나타낸 바와 같이， 키토산-카테콜은 랫트 췌장소도 표면에 잘 결합하는 것을 확인하였다 (도 8) .
<실험예 7> 키토산-카테콜 결합에 의한돼지 췌장소도의 생존성 확인 키토산-카테콜 결합에 의한 돼지 췌장소도의 생존성을 확인하기 위하여， 라이브 데드 생존률 /독성 키트를 이용하여 상기 <실험예 2>와 동일한 방법으로 생존성을 확인하였다.
그 결과， 도 9에 나타낸 바와 같이， 아무런 처리도 하지 않은 돼지 췌장소도 (도 9a) 및 키토산-카테콜을 처리한 돼지 췌장소도 (도 9b)는 다수의 세포들이 녹색을 나타냄으로써， 키토산-카테콜이 돼지 췌장소도에 결합하는 것이 생존성에 영향을 미치지 않음을 확인하였다 (도 9) .
<실험예 8>돼지 췌장소도 막에 키토산-카테콜 결합 확안
돼지 췌장소도 표면에 키토산이 고정되어 았는지를 확인하기 위해서, 돼지 췌장소도를 이용하여 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로， 돼지 췌장소도 막의 키토산-카테콜 결합을 확인하였다.
그 결과， 도 10에 나타낸 바와 같이， 키토산-카테콜이 돼지 췌장소도 표면에 결합하는 것이 관찰되었다 (도 10) .

Claims

【청구와 범위】
【청구항 1]
키토산 (chi tosan) 및 카테콜 (catechol ) 유도체， 또는 폴리 -L-라이신 (poly-L-lysine) 및 카테콜 유도체의 복합체를 췌장소도 세포에 결합시키는 단계를 포함하는 췌장소도 표면 개질 방법 .
【청구항 2】
제 1항에 있어서， 상기 복합체는 키토산 또는 폴리 -L-라이신의 1차 아민기와 카테콜 유도체와 카르복실기를 아미드 (amide)와 반웅시켜 제조되는 것을 특징으로 하는 췌장소도 표면 개질 방법 .
【청구항 3】
제 2항에 있어서, 상기 카테콜 유도체는 하기 [화학식 4]로 기재되는 화합물인 것을 특징으로 하는 췌장소도 표면 개질 방법:
[화학식 4]
Figure imgf000020_0001
여기서， n은 1 내지 20의 정수이다.
【청구항 4】
제 2항에 있어서， 상기 카테콜 유도체는 하이드로카페인산 (hydrocaf feic ac id; HCA)인 것을 특징으로 하는 췌장소도 표면 개질 방법 .
【청구항 5] 제 1항에 있어서， 상기 복합체는 복합체의 카테콜기와 췌장소도 표면 아민기가 결합되는 것을 특징으로 하는 췌장소도 표면 개질 방법 .
【청구항 6】
제 1항에 있어서， 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol; PEG) 또는 폴리에틸렌 글리콜 유도체를 췌장소도 표면 아민기와 결합되지 않은 카테콜 유도체의 하이드록시 (hydroxy)기에 결합시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 췌장소도 표면 개질 방법 .
[청구항 7】
제 6항에 있어서， 상기 폴리에틸렌 글리콜 유도체는 PEG-도파 (PEG-D0PA)， 모노메톡시 PEGOnonomethoxy polyethylene glycol), PEG 프로피론산의 숙시니미드 (succinimide of PEG propionic acid), PEG 부타논산의 숙시니미드 (succinimide of PEG butano c acid), 가지달린 PEG-HNS( branched PEG-NHS), PEG 숙시니미딜 숙시네이트 (PEG succinimidyl succinate), 카복시메틸화 PEG의 숙시니미드 (succinimide of carboxymethylated PEG), PEG의 벤조트리아졸 카보네이트 (benzotriazole carbonate of PEG), PEG-글리시딜 에테르 (PEG-glycidyl ether), PEG-옥시카보닐이미다졸 (PEG— oxycarbonyl imidazole), PEG 니트로페닐 카보네이트 (PEG nitrophenyl carbonates), PEG-알데히드 (PEG—aldehyde)， PEG 숙시니미딜 카르복시메틸 에스테르 (PEG succinimidyl carboxymethyl ester), PEG 숙시니미딜 에스테르 (PEG succinimidyl ester)인 것을 특징으로 하는 췌장소도 표면 개질 방법 .
[청구항 8】
제 6항에 있어서， 상기 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜 유도체는 양쪽 말단에 같거나 또는 서로 다른 관능기가 부착된 것을 특징으로 하는 췌장소도 표면 개질 방법 .
【청구항 9】
제 8항에 있어서， 상기 관능기는 카테콜기, 아민기, 히드록실기， 카르복실기， 타올기 및 설폰기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 췌장소도 표면 개질 방법.
【청구항 10]
제 8항에 있어서， 관능기가 부착된 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴라에틸렌 글리콜 유도체의 관능기에 생체활성 물질이 추가적으로 도입된 것을 특징으로 하는 췌장소도 표면 개질 방법 .
[청구항 11】
제 10항에 있어서， 상기 생체활성 물질은 해파린인 것을 특징으로 하는 췌장소도 표면 개질 방법.
[청구항 12】
키토산 및 카테콜 유도체, 또는 폴리 -L-라이신 및 카테콜 유도체의 복합체가 췌장소도 표면에 결합된 표면개질된 췌장소도.
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