KR20220035182A

KR20220035182A - 생체적합성의 유연성 지혈 시트

Info

Publication number: KR20220035182A
Application number: KR1020227004797A
Authority: KR
Inventors: 에이브러햄 라이니어 키리위어; 로사 필라르 펠릭스 라나오; 주스트 옵스틴; 요하네스 카스파 마티아스 엘리자베스 벤더
Original assignee: 가트 테크놀로지스 비.브이.
Priority date: 2019-07-12
Filing date: 2020-07-09
Publication date: 2022-03-21
Also published as: EP3996757B1; EP4215221A1; AU2020312628A1; BR112022000511A2; US20220133947A1; PL3996757T3; CA3146839A1; WO2021009013A1; ES2950186T3; CN114096286A; CN114096286B; EP3996757A1; JP2022540341A

Abstract

본 발명은

3차원 상호 연결된 간극 공간을 포함하는 방수성 응집성 섬유성 담체 구조물로서, 상기 섬유성 담체 구조물은 반응성 친핵성 기를 보유하는 친핵성 중합체를 함유하는 섬유를 포함하는, 방수성 응집성 섬유성 담체 구조물; 및

Description

생체적합성의 유연성 지혈 시트

본 발명은 수술 중 출혈을 최소화하기 위해 적합하게 사용될 수 있는 생체적합성, 유연성, 지혈 시트에 관한 것이다. 이 지혈 시트는

3차원 상호 연결된 간극 공간을 포함하는 방수성 응집성 섬유성 담체 구조물로서, 상기 섬유성 담체 구조물은 반응성 친핵성 기를 운반하는 친핵성 중합체를 함유하는 섬유를 포함하는, 방수성 응집성 섬유성 담체 구조물; 및

간극 공간 내에 분포된 반응성 중합체 입자로서, 적어도 3개의 반응성 친전자성 기를 보유하는 수용성 친전자성 중합체를 포함하며, 상기 반응성 친전자성 기는 공유 결합의 형성 하에, 조직과 혈액의 아민기 및 친핵성 중합체의 반응성 친핵성 기와 반응할 수 있는, 간극 공간 내에 분포된 반응성 중합체 입자

를 포함한다.

실질(parenchymatous) 조직에 대한 수술 절차 중 주요 과제 중 하나는 출혈 제어를 이루는 것이다. 밀봉선 제어, 전기 소작(electrocautery) 및 초음파 밀봉은 예를 들어 간 또는 신장에 대한 수술 중에 종종 충분하지 않다. 결과적으로, 간 절제술이나 부분 신장 절제술과 같은 절차에는 출혈을 조절하기 위한 대안적 접근이 필요하다. 이를 위해 광범위한 국소 지혈 제품이 개발되어 임상적으로 이용 가능하다.

Lewis 등(Control of bleeding in surgical procedures: critical appraisal of HEMOPATCH (Sealing Hemostat), Dove Press Journal: Medical Devices Evidence and Research, 22 Dec. 2015, 1-9)은 합성, 단백질 반응성 단량체 및 콜라겐 지지체(backing)를 포함하여 구성된 지혈 패드(HEMOPATCH)에 대해 기술하였다. 활성면은 단백질 반응성 단량체인 N-히드록시숙신이미드 작용화된 폴리에틸렌 글리콜(NHS-PEG)로 덮여 있다. NHS-PEG는 콜라겐 패드를 조직에 빠르게 부착하여 지혈을 촉진하고 유지한다.

Schuhmacher 등(Safety and effectiveness of a synthetic hemostatic patch for intraoperative soft tissue bleeding, Med Devices (Auckl). 2015; 8: 167-174)은 흡수성 지지체 물질, 산화 셀룰로오스 및 폴리에틸렌 글리콜 하이드로겔을 포함하여 구성된 지혈 패치(Veriset™)에 대해 기술하였다. Veriset™ 지혈 패치는 즉시 사용 가능한 패치로 제공되며 폴리에틸렌 글리콜 면이 아래로 향하도록 출혈 부위에 적용된다.

Boerman 등(Next Generation Hemostatic Materials Based on NHS-Ester Functionalized Poly(2-oxazoline)s, Biomacromolecules (2017), 18, 2529-2538)은 N-히드록시숙신이미드 에스테르(NHS)-작용성 폴리(2-옥사졸린)(NHS-POx)을 젤라틴 패치에 코팅함으로써 얻어지는 합성, 비생체활성 지혈 제품이며, 이는 중합체, 숙주 혈액 단백질, 젤라틴 및 조직 사이에 공유-가교를 형성함으로써 작용하여 상처 부위를 밀봉하고 수술 중 출혈을 방지한다.

US 2010/0233246에는 2부(two-part) 반응성 폴리에틸렌 글리콜 분말이 함침된 콜라겐 스펀지 또는 시트를 포함하는 생체적합성 중합체 장치가 기재되어 있으며, 여기서 상기 반응성 분말은 친핵성 기를 갖는 제1 폴리에틸렌 글리콜 및 친전자성 기를 갖는 제2 폴리에틸렌 글리콜을 포함하고, 여기서 폴리에틸렌은 글리콜 분말은 건조한 상태에서 미반응성을 유지한다.

WO 2010/059280에는 무수 섬유 시트가 기재되어 있으며, 이는 섬유 중합체의 제1 성분으로서 상기 중합체는 친전자성 기 또는 친핵성 기를 함유하는 제1 성분, 및 상기 시트가 생물학적 조직과 접촉하는 수성 매질에 노출될 경우 제1 성분을 가교할 수 있어 생물학적 조직에 접착되는 가교된 하이드로겔을 형성하는 제2 성분을 포함하며; 여기서:

a) 여기서 제2 성분은 제1 성분의 섬유성(fibrous) 중합체와 동일하거나 상이한 골격 구조를 갖고, 만일 제1 성분이 친핵성 기를 함유하는 경우 친전자성 기를 함유하거나 또는 만일 제1 성분이 친전자성 기를 함유하는 경우 친핵성 기를 함유하는 섬유성 중합체이거나;

b) 제2 성분은 제1 성분의 섬유성 중합체 상의 코팅이고, 여기서 상기 코팅은 만일 제1 성분이 친핵성 기를 함유하는 경우 친전자성 기를 함유하거나 또는 만일 제1 성분이 친전자성 기를 함유하는 경우 친핵성 기를 함유하거나; 또는

c) 제2 성분은 제1 성분의 섬유성 중합체의 간극(interstices) 내에 분산되고 포획된 건조 분말이고, 여기서 상기 분말은 만일 제1 성분이 친핵성 기를 함유하는 경우 친전자성 기를 함유하거나 또는 만일 제1 성분이 친전자성 기를 함유하는 경우 친핵성 기를 함유한다.

US 2011/0250257에는 무수 섬유성 시트가 기재되어 있으며, 이는 섬유성 중합체의 제1 성분 및 제2 성분을 포함하며, 상기 중합체는 친전자성 기 또는 친핵성 기를 함유하고, 제2 성분은 상기 시트가 생물학적 조직과 접촉하는 수성 매질에 노출되어 생물학적 조직에 접착성인 가교된 하이드로겔을 형성하는 경우에 제1 성분을 가교할 수 있으며; 여기서 제2 성분은 섬유성 중합체이고 만일 제1 성분이 친핵성 기를 함유하는 경우 친전자성 기를 함유하거나 또는 만일 제1 성분이 친전자성 기를 함유하는 경우 친핵성 기를 함유하거나; 또는

제2 성분은 제1 성분의 섬유성 중합체 상의 코팅이며, 여기서 상기 코팅은 만일 제1 성분이 친핵성 기를 함유하는 경우 친전자성 기를 함유하거나 또는 만일 제1 성분이 친전자성 기를 함유하는 경우 친핵성 기를 함유하거나; 또는

제2 성분은 제1 성분의 섬유성 중합체의 간극 내에 분산되고 포획된 건조 분말이고, 여기서 상기 분말은 만일 제1 성분이 친핵성 기를 함유하는 경우 친전자성 기를 함유하거나 또는 만일 제1 성분이 친전자성 기를 함유하는 경우 친핵성 기를 함유한다.

WO 2011/124640에는

a) 건조된 형태의 생체적합물질의 매트릭스를 포함하는 스펀지를 제공하는 단계,

b) 건조 분말 형태의 하나의 반응성 중합체 물질을 제공하는 단계,

c) a) 및 b)를 접촉시켜 b)의 물질이 상기 스펀지의 적어도 하나의 표면에 존재하도록 하는 단계, 및

d) b)의 물질을 a)의 스펀지에 고정하는 단계

를 포함하는 지혈 스펀지 제조방법이 기재되어 있다.

WO 2012/057628에는 친전자성 활성화 폴리옥사졸린(EL-POx)의 건조 물질 적어도 1 중량%를 포함하는 조직 접착 의료 제품이 기재되어 있으며, 상기 EL-POx는 적어도 하나의 펜던트 친전자성 기를 포함하는 적어도 2개의 반응성 친전자성 기를 포함한다. EL-POx 외에도 의료 제품에는 친핵성 활성화 폴리옥사졸린(NU-POx)이 포함될 수 있다. 조직 접착 제품의 예로는 접착 조직 테이프, 조직 밀봉제, 지혈 다공성 물질 및 임플란트가 포함된다.

WO 2016/056901에는 코팅된 메쉬, 코팅된 폼 또는 코팅된 분말로부터 선택되는 접착성 지혈 제품이 기재되어, 상기 지혈 제품은

적어도 5 부피%의 다공성을 갖고 반응성 친핵성 기를 함유하는 친핵성 중합체를 포함하는 외부 표면을 포함하는 다공성 고체 기재;

고체 기재의 적어도 일부를 덮는 접착 코팅으로서, 상기 코팅은 친전자성 활성화 폴리옥사졸린(EL-POx)을 포함하고, 상기 EL-POx는 평균 적어도 하나의 반응성 친전자성 기를 함유하는, 접착 코팅

을 포함한다.

접착성 지혈 제품은 다공성 고체 기재를 제공하는 단계; EL-POx 및 용매를 포함하는 코팅액으로 기재를 코팅하는 단계; 및 용매를 제거하는 단계를 포함한다.

본 발명자들은 복강경 수술 절차 동안 출혈을 방지하는 데 특히 적합한 생체적합성의 유연성 지혈 시트를 개발했다.

본 발명에 따른 지혈 시트는 숙주 혈액 단백질 및 조직 뿐만 아니라 섬유성 담체 구조물 내의 반응성 친핵성 기와 공유 결합할 수 있는 반응성 친전자성 중합체를 포함하는 작은 입자를 보유하는 방수성 응집성 섬유성 담체 구조물을 포함하며, 이에 의해 지혈 및/또는 조직 접착을 유도한다. 따라서, 본 발명의 일 견지는

간극 공간 내에 분포된, 복수의 반응성 중합체 입자로서, 공유 결합의 형성 하에, 조직 및 혈액의 아민기 뿐만 아니라 친핵성 중합체의 반응성 친핵성 기와도 반응할 수 있는 적어도 3개의 반응성 친전자성 기를 보유하는 수용성 친전자성 중합체를 포함하며, 상기 반응성 중합체 입자는 0.5-100 ㎛ 범위의 직경을 갖고, 섬유성 담체 구조물의 적어도 3중량%의 양으로 존재하는, 복수의 반응성 중합체 입자

를 포함하는 생체적합성의 유연성 지혈 시트에 관한 것이다.

본 발명의 지혈 시트는 혈액이 간극 공간을 침투할 수 있으므로 혈액을 쉽게 흡수하는 방수성 응집성 섬유성 담체 구조물을 포함한다. 이 섬유성 담체 구조물은 반응성 중합체 입자로 쉽게 함침될 수 있다. 액체 함침과 달리, 이러한 건식 함침은 담체 구조물의 구조적 무결성 또는 기계적 특성에 영향을 미치지 않는다. 본 발명의 지혈 시트에 의해 혈액이 흡수되면, 시트 내의 반응성 중합체 입자가 혈액에 젖음('wetted')과 동시에 용해되기 시작하여, 친전자성 중합체가 혈액 및 조직 내 반응성 친핵성 기, 그리고 섬유성 담체 구조물 내 반응성 친핵성 기 모두와 반응하는 것이 가능하게 되어, 혈액 응고 및 조직 밀봉을 유도하며, 이 모두는 지혈에 기여한다.

본 발명자들은 이론에 구속되기를 원하지 않지만, 본 발명의 지혈 시트의 유리한 특성은 반응성 중합체 입자가 섬유성 담체 구조물 전체에 분포되어 최소의 굽힘을 생성한다는 사실에 기인할 수 있다고 믿으며, 그리고 작은 입자 크기로 인해 이러한 반응성 중합체 입자는 혈액 또는 기타 수성 체액과 접촉할 때 빠르게 용해되는 사실에 기인할 수 있다고 믿는다. 따라서, 상처 부위에 시트를 적용하면 한편으로는 반응성 친전자성 중합체와 다른 한편으로는 혈액 단백질, 조직 및 섬유성 담체 구조물 사이에 빠른 공유 가교가 일어나서, 겔의 형성을 이끌며, 이는 상처 표면을 밀봉하고, 출혈을 멈추게 하고, 섬유성 시트를 조직에 강력하게 접착할 수 있다. 방수성 섬유성 담체 구조물은 적용 중 및 적용 후 기계적 강도를 제공하고, 과도한 팽창을 방지한다.

본 발명의 지혈 시트는 그 유연성으로 인해, 불규칙한 형태의 출혈 부위에 적합하게 적용될 수 있다. 지혈 시트는 이미 적용된(applied) 시트가 출혈을 완전히 멈추게 하지 않는 경우 층 위에 층으로 적용될 수 있다.

본 발명의 다른 견지는 지혈 시트의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은

위에서 정의한 방수성 응집성 섬유성 담체 구조물의 시트를 제공하는 단계;

위에서 정의한 반응성 중합체 입자를 제공하는 단계; 및

섬유성 담체 구조물의 간극 공간 내에 반응성 중합체 입자를 분포시키는 단계

를 포함한다.

따라서, 본 발명의 일 견지는

본원에 사용된 용어 "지혈 시트(haemostatic sheet)"는 달리 명시되지 않는 한, 손상된 조직으로부터 출혈을 멈추게 하는 능력을 갖는 시트를 지칭한다. 본 발명의 지혈 시트는 혈액을 겔화함으로써 및/또는 상처 부위를 차폐시키는 밀봉을 형성함으로써 지혈을 달성할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "조직-접착성(tissue-adhesive)"은 시트와 조직 사이의 공유 결합의 형성으로 인해 조직에 달라붙는 지혈 시트의 능력을 지칭한다. 이러한 공유 결합의 형성은 전형적으로 물의 존재를 필요로 한다.

섬유성 담체 구조물과 관련하여 본원에 사용된 용어 "방수성(water-resistant)"이란 용어는 이 구조가 수용성이 아니며, 물에서 분해되지 않아 중성 pH 조건(pH 7) 및 온도 37℃에서 콜로이드 분산물을 형성하는 것을 의미한다.

본원에 사용된 용어 "간극 공간(interstitial space)"은 섬유성 담체 구조물 내의 공극("빈(empty)") 공간을 지칭한다. 섬유성 담체 구조물 내의 간극 공간은 반응성 중합체 입자를 구조 내로 도입할 수 있게 한다. 또한 혈액 및 기타 체액이 간극 공간으로 들어갈 수 있어, 반응성 중합체 입자 내의 수용성 친전자성 중합체가 용해될 수 있다.

0.5-100 ㎛ 범위의 직경을 갖는 반응성 중합체 입자의 농도는 섬유성 담체 구조물 자체, 즉 반응성 중합체 입자가 없는 중량%로 표현된다.

본 발명에 따라 사용되는 "반응성 친전자성 기를 보유하는 수용성 친전자성 중합체(water-soluble electrophilic polymer carrying reactive electrophilic groups)"는 공유 결합의 형성 하에 조직 및 혈액의 아민 기와 반응할 수 있는 적어도 3개의 반응성 기를 보유한다. 이 수용성 친전자성 중합체는 분자량이 적어도 1kDa이고 20℃의 증류수에 대한 용해도가 적어도 50g/L이다.

본 명세서에 사용된 용어 "물 흡수능(water absorption capacity)"은 지혈 시트가 물을 흡수하는 능력의 척도이다. 물 흡수능은 건조 시트 샘플의 무게(중량 = W_d)를 측정한 다음, 샘플을 증류수(37℃)에 45분 동안 담가서 측정된다. 다음으로, 샘플을 물에서 제거하고 기질 외부에 달라붙은 물을 제거하고, 샘플을 다시 칭량한다(중량 = W_w). 물 흡수능 = 100% x (W_w-W_d)/W_d. 물 흡수능은 기질의 다공성뿐만 아니라 물이 있을 때 팽윤하는 능력을 나타낸다.

본원에서 사용되는 용어 "콜라겐(collagen)"은 동물체의 다양한 결합 조직의 세포외 공간에 있는 주요 구조 단백질을 의미한다. 콜라겐은 3개의 폴리펩티드 사슬의 특징적인 삼중 나선을 형성한다. 광물화 정도에 따라 콜라겐 조직은 단단하거나(뼈) 유연하거나(힘줄) 단단한 것으로부터 유연한 것으로 구배를 갖는(연골) 것일 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 용어 "콜라겐"은 또한 젤라틴 이외의 변형된 콜라겐을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "젤라틴(gelatin)"은 가축화된 소, 닭, 돼지, 어류와 같은 동물의 피부, 뼈 및 결합 조직에서 추출한 콜라겐을 부분 가수분해하여 생성된 펩티드 및 단백질의 혼합물을 의미한다. 가수분해 동안 개별 콜라겐 가닥 사이의 자연적인 분자 결합이 더 쉽게 재배열되는 형태로 분해된다.

본원에 사용된 용어 "폴리옥사졸린(polyoxazoline)"은 폴리(N-아실알킬렌이민) 또는 폴리(아로일알킬렌이민)을 지칭하고, 추가로 POx로 지칭된다. POx의 예는 폴리(2-에틸-2-옥사졸린)이다. 용어 "폴리옥사졸린"은 또한 POx 공중합체를 포함한다.

반응성 중합체 입자는 입자 밀도가 담체 구조물 전체에 걸쳐 본질적으로 동일하다는 견지에서 섬유성 담체 구조물의 간극 공간 내에 균질하게 분포될 수 있다. 반응성 중합체 입자는 또한 담체 구조물 전체에 불균질하게 분포될 수 있다. 예를 들어, 지혈 시트가 섬유성 담체 구조물의 얇은 층과 반응성 중합체 입자 층의 적층 형태로 제조되는 경우, 시트 내의 반응성 중합체 입자 밀도가 변동될 수 있다. 특정 응용 분야에 대해, 반응성 중합체 입자 밀도가 구배를 나타내는 경우, 예를 들어, 반응성 입자의 밀도는 출혈 상처에 적용되는 것을 의미하는 시트의 측면 근처에서 가장 낮고, 시트의 다른 측면 근처에서 가장 높다는 점에서 구배를 나타내는 경우에 유리할 수 있다.

반응성 중합체 입자의 직경 분포는 스테인리스강 샘플 분산 장치와 함께 Malvern Mastersizer 2000을 사용하여 레이저 회절에 의해 적절하게 측정될 수 있다. 샘플 분산 장치는 약 시클로헥산 120ml으로 채워지고, 이는 1800rpm의 교반속도로 5~10분간 안정화된 후 백그라운드 측정(블랑(blanc) 측정)을 한다. 샘플 튜브를 흔들어 수평으로 20회 돌린다. 다음으로, 시클로헥산을 함유하는 샘플 분산장치에 약 50mg을 분산시킨다. 샘플을 분산 장치에 넣은 후, 샘플을 1800rpm에서 1분 30분 동안 교반하여 모든 입자가 적절하게 분산되었는지 확인한 후 측정을 수행한다. 분산된 입자에는 초음파 처리가 수행되지 않는다. 평균 입자 크기는 D[4,3], 부피 가중 평균 직경(ΣniDi⁴)/(ΣniDi³)으로 표시된다.

특히 바람직한 구현에서, US 2011/0250257에 기재된 섬유성 조직 밀봉제와 달리, 본 발명의 지혈 시트는 하이드로겔, 즉 상당한 양의 물을 흡수하여 탄성 겔을 형성할 수 있는 수팽윤성 중합체 매트릭스를 형성하지 않는다.

특히 바람직한 구현에 따르면, 본 발명의 지혈 시트는 생체 흡수성이며, 이는 담체 구조물, 반응성 중합체 입자 및 지혈 시트의 임의의 다른 성분이 결국 신체에 흡수된다는 것을 의미한다. 담체 구조물 및 반응성 중합체 입자의 흡수는 전형적으로 그 안에 함유된 중합체의 화학적 분해(예: 가수분해)를 필요로 한다. 인체에 의한 지혈 시트의 완전한 생체 흡수는 전형적으로 1 내지 10주, 바람직하게는 2 내지 8주 내에 달성된다.

본 발명의 지혈 시트는 전형적으로 0.5-25 mm의 압축되지 않은 평균 두께를 갖는다. 보다 바람직하게는, 압축되지 않은 평균 두께는 1-10mm 범위, 가장 바람직하게는 1.5-5mm 범위에 있다.

지혈 시트의 치수는 바람직하게는 시트의 상부 및 하부 각각이 적어도 2㎠, 보다 바람직하게는 적어도 10㎠, 가장 바람직하게는 25-50㎠의 표면적을 갖도록 하는 것이다. 전형적으로 시트는 모양이 직사각형이며 길이가 25-200mm이고 너비가 25-200mm이다.

지혈 시트는 바람직하게는 200 mg/㎤ 미만, 보다 바람직하게는 150 mg/㎤ 미만, 가장 바람직하게는 10-100 mg/㎤의 압축되지 않은 밀도를 갖는다.

본 발명의 일 구현에서 반응성 중합체 입자는 섬유성 담체 구조물의 간극 공간 내에 균질하게 분포된다. 본 발명의 또 다른 구현에서, 지혈 시트는 섬유성 담체 구조물의 층과 반응성 중합체 입자의 층을 교대로 포함하는 적층체이다. 후자의 구현에서, 반응성 중합체 입자는 바람직하게는 반응성 중합체 입자들의 층들을 분리하는 섬유성 담체 구조물의 층들에 들어간다.

본 발명의 지혈 시트는 바람직하게는 본질적으로 무수이다. 전형적으로, 지혈 시트는 5중량% 이하, 보다 바람직하게는 2중량% 이하, 가장 바람직하게는 1중량% 이하의 물 함량을 갖는다.

지혈 시트의 물 흡수능은 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 100% 내지 800% 범위, 가장 바람직하게는 200% 내지 500% 범위 내에 있다.

본 발명의 지혈 시트는 바람직하게는 멸균 상태이다.

지혈 시트의 반응성 중합체 입자는 바람직하게는 카르복실산 에스테르, 설포네이트 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, p-니트로페닐 에스테르, p-니트로티오페닐 에스테르, 산 할라이드 기, 무수물, 케톤, 알데히드, 이소시아네이토, 티오이소시아네이토, 이소시아노, 에폭시드, 활성화된 히드록실기, 올레핀, 글리시딜 에테르, 카르복실, 숙신이미딜 에스테르, 설포 숙신이미딜 에스테르, 말레이미도(말레이미딜), 에텐설포닐, 이미도 에스테르, 아세토 아세테이트, 할로 아세탈, 오르토피리딜 디설피드, 디히드록시-페닐 유도체, 비닐, 아크릴레이트, 아크릴아미드, 요오도아세트아미드 및 이들의 조합으로부터 선택된 반응성 친전자성 기를 보유하는 수용성 친전자성 중합체를 포함한다. 보다 바람직하게는, 반응성 친전자성 기는 카르복실산 에스테르, 설포네이트 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, p-니트로페닐 에스테르, p-니트로티오페닐 에스테르, 산 할라이드 기, 무수물, 케톤, 알데히드, 이소시아네이토, 티오이소시아네이토, 이소시아노, 에폭시드, 활성화된 히드록실기, 글리시딜 에테르, 카르복실, 숙신이미딜 에스테르, 설포 숙신이미딜 에스테르, 이미도 에스테르, 디히드록시-페닐 유도체, 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 보다 더 바람직하게는, 반응성 친전자성 기는 할로 아세탈, 오르토피리딜 디술피드, 말레이미드, 비닐 술폰, 디히드록시페닐 유도체, 비닐, 아크릴레이트, 아크릴아미드, 요오도아세트아미드, 숙신이미딜 에스테르 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 반응성 친전자성 기는 말레이미드, 비닐, 아크릴레이트, 아크릴아미드, 숙신이미딜 에스테르, 설포 숙신이미딜 에스테르 및 이들의 조합으로부터 선택된다.

사용될 수 있는 숙신이미딜 에스테르의 예에는 숙신이미딜 글루타레이트, 숙신이미딜 프로피오네이트, 숙신이미딜 숙신아미드, 숙신이미딜 카르보네이트, 디숙신이미딜 수베레이트, 비스(설포숙신이미딜) 수베레이트, 디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트), 비스(2-숙신이미도옥시카르보닐옥시) 에틸 술폰, 3,3'-디티오비스(설포숙신이미딜-프로피오네이트), 숙신이미딜 카바메이트, 설포숙신이미딜(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트, 비스(설포숙신이미딜)수베레이트, 설포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)-시클로헥산-1-카르복실레이트, 디티오비스-설포숙신이미딜 프로피오네이트, 디설포-숙신이미딜 타르타레이트; 비스[2-(설포-숙신이미딜옥시카르보닐옥시에틸술폰)], 에틸렌 글리콜 비스(설포숙신이미실실숙시네이트), 디티오비스-(숙신이미딜 프로피오네이트)를 포함한다.

사용될 수 있는 디히드록시페닐 유도체의 예는 디히드록시페닐알라닌, 3,4-디히드록시페닐알라닌(DOPA), 도파민, 3,4-디히드록시히드로신남산(DOHA), 노르에피네프린, 에피네프린 및 카테콜을 포함한다.

본 발명의 지혈 시트에서 섬유성 담체 구조물의 사용은 반응성 중합체 입자가 어려움 없이 이 담체 구조물 전체에 균질하게 분포될 수 있다는 이점을 제공한다. 이러한 균질한 분포는 예를 들어 발포 담체 구조물에서 달성하기가 훨씬 더 어렵다.

섬유성 담체 구조물의 섬유는 바람직하게는 1-500㎛, 보다 바람직하게는 2-300㎛, 가장 바람직하게는 5-200㎛의 평균 직경을 갖는다. 섬유의 평균 직경은 현미경을 사용하여 적절하게 측정될 수 있다.

전형적으로, 섬유성 담체 구조물에서 섬유의 적어도 50중량%, 보다 바람직하게는 적어도 80중량%는 1-300㎛의 직경 및 적어도 1mm의 길이를 갖는다.

바람직하게는, 섬유성 담체 구조물에서 섬유의 적어도 50중량%, 더욱 바람직하게는 적어도 80중량%가 적어도 1000 이상의 종횡비(길이 대 직경의 비)를 갖는다.

본 발명에 따라 사용되는 섬유성 담체 구조물은 바람직하게는 펠트 구조물, 직조 구조물 또는 편물 구조물이다. 가장 바람직하게는, 섬유성 담체 구조물은 펠트 구조물이다. 여기에서 "펠트 구조물(felt structure)"이라는 용어는 섬유를 매팅(matting)시키고 압착하여 응집성 물질을 형성함으로써 생성되는 구조물을 의미한다.

특히 바람직한 구현에 따르면, 섬유성 담체 구조물은 생분해성이다.

섬유성 담체 구조물에 함유된 친핵성 중합체는 담체 구조물에 함유된 섬유 전체에 균질하게 분포되거나 외부 코팅층으로 적용될 수 있다. 담체 구조물에 친핵성 중합체가 존재하면 지혈 시트의 접착력과 지혈 특성이 모두 향상된다.

바람직하게는, 섬유성 담체 구조물의 섬유는 친핵성 중합체를 적어도 5중량%, 더욱 바람직하게는 적어도 10중량%, 더욱 바람직하게는 적어도 50중량% 함유한다. 가장 바람직하게는, 섬유는 상기 친핵성 중합체로 이루어진다.

담체 구조물의 섬유에 함유된 친핵성 중합체는 전형적으로 적어도 2개의 반응성 친핵성 기, 보다 바람직하게는 적어도 5개의 반응성 친핵성 기, 보다 더 바람직하게는 적어도 10개의 반응성 친핵성 기, 가장 바람직하게는 적어도 20개의 반응성 친핵성 기를 함유한다.

친핵성 가교제의 반응성 친핵성 기는 바람직하게는 아민기, 티올기, 포스핀기 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 이러한 반응성 친핵성 기는 아민기, 티올기 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 보다 더 바람직하게는, 반응성 친핵성 기는 아민기이다. 이들 아민기는 바람직하게는 1차 아민기, 2차 아민기 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 아민기는 1차 아민기이다.

섬유성 담체 구조물의 섬유에서 친핵성 중합체는 바람직하게는 적어도 1중량%, 보다 바람직하게는 5 내지 10중량%, 가장 바람직하게는 15 내지 25중량%의 질소 함량을 갖는다.

친핵성 중합체는 바람직하게는 단백질, 키토산, 반응성 친핵성 기를 보유하는 합성 중합체, 반응성 친핵성 기를 보유하는 탄수화물 중합체 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 친핵성 중합체는 젤라틴, 콜라겐, 키토산 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 보다 더 바람직하게는, 친핵성 중합체는 젤라틴, 가장 바람직하게는 가교된 젤라틴이다.

키토산은 자연적으로 발생하는 물질인 키틴(폴리-N-아세틸-D-글루코사민)의 생분해성, 무독성, 복합 탄수화물 유도체이다. 키토산은 키틴의 탈아세틸화된 형태이다. 본 발명에 따라 적용되는 키토산은 탈아세틸화도가 70% 이상인 것이 바람직하다.

섬유성 담체 구조물은 바람직하게는 반응성 친핵성 기를 보유하는 친핵성 중합체를 함유하는 적어도 50중량%, 보다 바람직하게는 적어도 80중량%, 가장 바람직하게는 적어도 90중량%의 섬유를 포함한다.

바람직한 구현에서, 섬유성 담체 구조물은 반응성 친핵성 기를 보유하는 친핵성 중합체를 적어도 50중량% 함유하는 섬유를 적어도 50중량%, 보다 바람직하게는 적어도 80중량%, 가장 바람직하게는 적어도 90중량% 포함한다.

특히 바람직한 구현에 따르면, 섬유성 담체 구조물은 젤라틴, 콜라겐 또는 키토산으로 제조된 섬유를 적어도 50중량%, 보다 바람직하게는 적어도 80중량%, 가장 바람직하게는 적어도 90중량% 포함한다.

바람직한 콜라겐은 텔로펩티드 영역("아텔로펩티드 콜라겐(atelopeptide collagen)")을 갖지 않는다. 본 발명에 따라 사용되는 콜라겐은 바람직하게는 미세섬유형 콜라겐, I형 콜라겐, III형 콜라겐과 같은 합성 인간 콜라겐, 또는 I형 콜라겐과 III형 콜라겐의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다. 열, 방사선 또는 글루타르알데히드와 같은 화학 작용제를 사용하여 가교된 콜라겐을 사용할 수도 있다.

바람직한 구현에 따르면, 섬유성 담체 구조물에서 섬유는 적어도 50중량%, 보다 바람직하게는 적어도 80중량%, 가장 바람직하게는 적어도 90중량%의 젤라틴을 포함한다. 섬유에서 젤라틴은 블룸(Bloom) 강도가 200 이상인 것이 바람직하다.

특히 유리한 구현에서, 섬유성 담체 구조물은 적어도 50중량%, 보다 바람직하게는 적어도 80중량%, 가장 바람직하게는 적어도 90중량%의 부분적으로 가교된 젤라틴을 포함한다. 부분적으로 가교된 젤라틴의 사용은 섬유성 담체 구조물이 체온에서 충분히 안정하고 유연하며, 섬유성 담체 구조물의 팽창으로 인해 폐쇄된 기공 섬유성 겔 구조가 형성되지 않는다는 이점을 제공한다.

본 발명의 지혈 시트의 제조에 있어서, 반응성 중합체 입자의 친전자성 중합체에 있는 반응성 친전자성 기의 분획을 친핵성 중합체의 반응성 친핵성 기와 반응시키는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 반응성 중합체 입자는 섬유성 담체 구조물 내에 효과적으로 고정될 수 있다.

바람직한 구현에 따르면, 섬유성 담체 구조물의 섬유에서 친핵성 중합체의 반응성 친핵성 기는 아민기를 포함하고, 반응성 중합체 입자에서 친전자성 중합체의 반응성 친전자성 기는 카르복실산 에스테르, 설포네이트 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, p-니트로페닐 에스테르, p-니트로티오페닐 에스테르, 산 할라이드 기, 무수물, 케톤, 알데히드, 이소시아네이토, 티오이소시아네이토, 이소시아노, 에폭시드, 활성화된 히드록실기, 글리시딜 에테르, 카르복실, 숙신이미딜 에스테르, 설포숙신이미딜 에스테르, 이미도 에스테르, 디히드록시-페닐 유도체, 및 이들의 조합으로부터 선택된다.

또 다른 바람직한 구현에 따르면, 친핵성 중합체의 반응성 친핵성 기는 티올 기를 포함하고, 반응성 중합체 입자 내의 친전자성 중합체의 반응성 친전자성 기는 할로 아세탈, 오르토피리딜 디설피드, 말레이미드, 비닐 설폰, 디히드록시페닐 유도체, 비닐, 아크릴레이트, 아크릴아미드, 요오도아세트아미드, 숙신이미딜 에스테르, 설포숙신이미딜 에스테르 및 이들의 조합으로부터 선택된다.. 보다 바람직하게는, 반응성 친전자성 기는 숙신이미딜 에스테르, 설포숙신이미딜 에스테르, 할로 아세탈, 말레이미드, 또는 디히드록시페닐 유도체 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 반응성 친전자성 기는 말레이미드 또는 디히드록시페닐 유도체 및 이들의 조합으로부터 선택된다.

본 발명의 바람직한 구현에서, 섬유성 담체 구조물은 산화된 재생 셀룰로오스를 포함하지 않는다.

바람직한 섬유성 담체 구조물은 공기 투과도가 적어도 0.1 L/min x ㎠, 보다 바람직하게는 적어도 0.5 L/min x ㎠인 개방 기공 구조를 갖는다.

공기 투과성은 EN ISO 9237:1995(텍스틸 - 공기에 대한 패브릭의 투과성 측정)에 따라 측정된다.

섬유성 담체 구조물의 섬유는 전기방사, 전기 취입 방사 및 고속 회전 분무기 방사와 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 고속 회전 분무기 방사에 의한 섬유성 담체 구조물의 제조는 US 2015/0010612에 기재되어 있다. 섬유성 담체 구조물로서 시판되는 지혈 섬유성 시트를 사용하는 것도 가능하다. 적합한 상용 제품의 예로는 GELITA TUFT-IT®(ex Gelita Medical)이다.

반응성 중합체 입자는 바람직하게는 본 발명의 지혈 시트에 섬유성 담체 구조물의 5-90중량%, 보다 바람직하게는 10-80중량%, 더욱 더 바람직하게는 20-75중량%, 가장 바람직하게는 50-70중량%의 양으로 존재한다.

반응성 중합체 입자는 바람직하게는 적어도 10중량%의 수용성 친전자성 중합체를 함유한다. 보다 바람직하게는, 반응성 중합체 입자는 수용성 친전자성 중합체를 적어도 50중량%, 더욱 바람직하게는 적어도 90중량% 함유한다.

섬유성 담체 구조물의 간극 공간 내에 분포된 반응성 중합체 입자는 바람직하게는 2-75㎛ 범위, 보다 바람직하게는 1-50㎛ 범위, 가장 바람직하게는 1-25μm 범위내의 부피 가중 평균 입자 크기를 갖는다.

본 발명의 반응성 중합체 입자는 다양한 방식으로, 예를 들어, 밀링, 중합체 용액 분무 건조, 동결 건조, 중합체 용융물 분무 냉각, 분말 혼합물 과립화, 또는 유동층 코팅에 의해 제조될 수 있다.

수용성 친전자성 중합체는 전형적으로 적어도 2 kDa, 보다 바람직하게는 적어도 5 kDa, 그리고 가장 바람직하게는 10-100 kDa의 분자량을 갖는다.

수용성 친전자성 중합체는 바람직하게는 20℃의 증류수에 대한 용해도가 적어도 100g/L, 보다 바람직하게는 적어도 200g/L이다.

본 발명에 따라 사용되는 수용성 친전자성 중합체는 바람직하게는 적어도 4개의 반응성 친전자성 기, 보다 바람직하게는 적어도 8개의 반응성 친전자성 기, 보다 더 바람직하게는 적어도 16개 이상의 반응성 친전자성 기 및 가장 바람직하게는 적어도 32개의 반응성 친전자성 기를 함유한다.

반응성 중합체 입자에 존재하는 수용성 친전자성 중합체는 바람직하게는 폴리옥사졸린, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리우레탄(예를 들어, WO 2017/171551에 기재된 바와 같음) 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 보다 더 바람직하게는 친전자성 중합체는 폴리옥사졸린, 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는 친전자성 중합체는 폴리옥사졸린이다.

반응성 친전자성 기를 포함하는 폴리옥사졸린은 바람직하게는 반복 단위가 하기 화학식 (I)로 표시되는 폴리옥사졸린으로부터 유도된다:

(CHR¹)_mNCOR²

여기서 R², 및 각각의 R¹은 H, 임의로 치환된 C_1-22알킬, 임의로 치환된 시클로알킬, 임의로 치환된 아랄킬, 임의로 치환된 아릴로부터 독립적으로 선택되고; m은 2 또는 3이다.

바람직하게는, 화학식 (I)의 R¹ 및 R²는 H 및 C_1-8알킬, 보다 더 바람직하게는 H 및 C_1-4알킬로부터 선택된다. R¹은 가장 바람직하게는 H이다. 화학식 (I)의 정수 m은 바람직하게는 2이다.

바람직한 구현에 따르면, 폴리옥사졸린은 중합체, 보다 더 바람직하게는 2-알킬-2-옥사졸린의 호모중합체이고, 상기 2-알킬-2-옥사졸린은 2-메틸-2-옥사졸린, 2-에틸-2-옥사졸린, 2-프로필-2-옥사졸린, 2-부틸-2-옥사졸린 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 바람직하게는, 폴리옥사졸린은 2-프로필-2-옥사졸린 또는 2-에틸-옥사졸린의 호모중합체이다. 가장 바람직하게는, 폴리옥사졸린은 2-에틸-옥사졸린의 호모중합체이다.

특히 바람직한 구현에 따르면, 수용성 반응성 중합체는 적어도 20개의 옥사졸린 단위, 보다 바람직하게는 적어도 30개의 옥사졸린 단위 및 가장 바람직하게는 적어도 80개의 옥사졸린 단위를 포함한다. 친전자성 중합체는 바람직하게는 옥사졸린 잔기당 평균 적어도 0.05개의 반응성 친전자성 기를 포함한다. 훨씬 더 바람직하게는, 친전자성 중합체는 옥사졸린 잔기당 평균 적어도 0.1개의 반응성 친전자성 기를 포함한다. 가장 바람직하게는, 친전자성 중합체는 옥사졸린 잔기당 평균 0.12-0.5개의 반응성 친전자성 기를 포함한다.

수용성 친전자성 중합체는 전형적으로 평균 적어도 10개, 보다 바람직하게는 적어도 20개의 반응성 친전자성 기를 보유한다.

폴리옥사졸린은 측쇄에 반응성 친전자성 기(펜던트 반응성 친전자성 기)를 보유하거나, 말단에 반응성 친전자성 기를 보유하거나, 또는 둘 모두에 반응성 친전자성 기를 보유할 수 있다.

본 발명에 따라 사용되는 폴리옥사졸린은 유리하게는 하나 이상의 펜던트 반응성 친전자성 기를 함유한다. 전형적으로, 폴리옥사졸린은 단량체당 0.03-0.5 펜던트 반응성 친전자성 기를 함유하고, 보다 바람직하게는 단량체당 0.04-0.35 펜던트 반응성 친전자성 기를 함유하고, 보다 더 바람직하게는 단량체당 0.05-0.25 펜던트 반응성 친전자성 기를 함유한다.

본 발명에 따라 적용되는 반응성 친전자성 기를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 바람직하게는 반응성 친전자성 기로 종결된 적어도 3개의 암(arm), 보다 바람직하게는 적어도 4개의 암을 포함하는 다중 암 PEG 또는 스타 PEG이다.

수용성 친전자성 중합체 외에, 반응성 중합체 입자는 덱스트란, 알기네이트, 산화 셀룰로오스(산화 재생 셀룰로오스(ORC) 포함), 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히알루론산; 및 이들의 조합으로부터 선택된 다당류를 함유한다. 바람직하게는, 이러한 다당류는 반응성 중합체 입자에 적어도 15중량%, 더욱 바람직하게는 적어도 25중량%, 가장 바람직하게는 적어도 50중량%의 농도로 함유된다. 특히 바람직한 구현에서 반응성 중합체 입자는 적어도 25중량%, 가장 바람직하게는 적어도 50중량%의 ORC를 함유한다.

본 발명의 유리한 구현에서, 수용성 친전자성 중합체 외에, 반응성 중합체 입자는 공유 결합의 형성 하에 다른 수용성 중합체의 반응성 친전자성 기와 반응할 수 있는 적어도 2개의 반응성 친핵성 기를 함유하는 친핵성 가교제를 추가로 함유하며, 그리고 선택적으로 하나 이상의 다당류를 함유한다. 친핵성 가교제의 도입은 수용성 친전자성 중합체가 상대적으로 낮은 양의 친핵성 단백질(예, 단 담즙)을 함유하는 혈액, 또는 더 중요하게는 체액이 시트에 들어갈 경우, 친핵성 가교제와 반응할 것이므로, 시트의 지혈 및 접착 특성을 향상시킬 수 있다는 이점을 제공한다. 이 가교 반응은 혈액 또는 체액 흐름을 고정시키는 하이드로겔의 형성으로 이어질 것이며, 이 하이드로겔은 하이드로겔의 반응성 친전자성 기와 조직의 아민/티올기 사이의 공유 결합 형성으로 인해 조직에 달라붙을 것이다. 수용성 친전자성 중합체와 친핵성 가교제를 단일 입자로 결합함으로써, 이 두 반응성 성분이 지혈 시트 전체에 균질하게 분포될 수 있고, 운송 및 취급 중에 분리가 발생하지 않으며, 이들 성분이 입자가 혈액이나 수성 체액과 접촉하면 서로 즉시 반응할 수 있다.

반응성 친전자성 기를 보유하는 수용성 중합체와 친핵성 가교제의 조합을 함유하는 반응성 중합체 입자, 즉 혼성 입자는 습식 과립화 및 후속 건조를 통해, 바람직하게는 감압 하에 제조될 수 있다. 과립화 액체는 수용성 친전자성 중합체와 친핵성 가교제 사이의 과립화 동안 반응이 거의 또는 전혀 일어나지 않도록 선택해야 한다. 이것은 예를 들어 이들 두 성분 중 적어도 하나가 불용성인 과립화 액체를 사용함으로써 달성될 수 있다. 가장 바람직하게는, 반응성 친전자성 기를 보유하는 수용성 중합체는 과립화 액체에 불용성이다.

특히 바람직한 구현에 따르면, 반응성 중합체 입자는 (i) 수용성 친전자성 중합체를 함유하는 친전자성 입자; 및 (ii) 친핵성 가교제를 함유하는 친핵성 입자를 포함하는 입자 응집체이다.

친전자성 입자는 바람직하게는 적어도 30중량%, 보다 바람직하게는 적어도 50중량%, 가장 바람직하게는 적어도 80중량%의 수용성 친전자성 중합체를 함유한다.

친핵성 입자는 바람직하게는 적어도 30중량%, 보다 바람직하게는 적어도 50중량%, 가장 바람직하게는 적어도 80중량%의 친핵성 가교제를 함유한다.

전형적으로, 이 구현에 따른 반응성 혼성 입자는 하기 조성을 가지며,

(a) 50-95 중량% 적어도 3개의 반응성 친전자성 기를 보유하는 수용성 친전자성 중합체;

(b) 5-50 중량% 친핵성 가교제;

(c) 0-50 중량% 다당류;

여기서 성분 (a) 내지 (c)의 조합은 함께 반응성 중합체 입자의 적어도 80중량%, 보다 바람직하게는 적어도 90중량%를 구성한다. 특히 바람직한 구현예에 따르면, 이 구현예에서 사용되는 반응성 친전자성 기를 보유하는 수용성 친전자성 중합체는 폴리옥사졸린(EL-POx)이다.

반응성 중합체 입자는 바람직하게는 수용성 친전자성 중합체에 의해 제공되는 반응성 친전자성 기의 총수와 친핵성 가교제에 의해 제공되는 반응성 친핵성 기의 총수 사이의 비가 25:1 내지 1:1 범위, 보다 바람직하게는 18:1 내지 2:1 범위 및 가장 바람직하게 12:1 내지 2.5:1 범위에 있는 양으로 수용성 친전자성 중합체 및 친핵성 가교제를 함유한다.

친핵성 가교제는 바람직하게는 적어도 3개의 반응성 친핵성 기, 보다 바람직하게는 적어도 5개의 반응성 친핵성 기, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 10개의 반응성 친핵성 기, 가장 바람직하게는 적어도 20개의 반응성 친핵성 기를 함유한다.

친핵성 가교제의 반응성 친핵성 기는 바람직하게는 아민기, 티올기, 포스핀기 및 이들의 조합으로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 아민기, 티올기 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 이러한 반응성 친핵성 기는 아민기이다. 바람직한 구현예에 따르면, 친핵성 가교제에 존재하는 반응성 친핵성 기는 1차 아민기이다.

친핵성 가교제는 바람직하게는 적어도 1중량%, 보다 바람직하게는 5 내지 10중량%, 가장 바람직하게는 15 내지 25중량%의 질소 함량을 갖는다.

본 발명의 일 구현에서 친핵성 가교제는 1,000 g/mol 미만, 보다 바람직하게는 700 g/mol 미만, 가장 바람직하게는 400 g/mol 미만의 분자량을 갖는 저분자량 폴리아민이다. 적합한 저분자량 폴리아민의 예는 디리신; 트리리신; 테트랄리신; 펜타리신; 디시스테인; 트리시스테인; 테트라시스테인; 펜타시스테인; 리신, 오르니틴, 시스테인, 아르기닌 및 이들의 조합으로부터 선택된 2개 이상의 아미노산 잔기, 및 기타 아미노산 잔기를 포함하는 올리고펩티드; 스퍼민; 트리스(아미노메틸)아민; 아르기닌 및 이들의 조합을 포함한다.

본 발명의 또 다른 구현에 따르면, 친핵성 가교제는 친핵성 활성화된 POx(NU-POx); 아민-작용화된 폴리에틸렌 글리콜, 키토산; 키토산 유도체(예: WO 2009/028965에 기재된 바와 같은 디카르복시-유도체화된 키토산 중합체), 폴리에틸렌이민; 폴리비닐아민; 폴리알릴아민; 아민-작용화된 폴리(메트)아크릴레이트; 아미노글리코시드와 같은 아민-작용성 모이어티를 함유하는 당류; 리신, 오르니틴, 시스테인, 아르기닌 및 이들의 조합으로부터 선택된 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 및 이들의 조합의 그룹으로부터 선택되는 고분자량(> 1,000 g/mol) 폴리아민이다. 천연 공급원 또는 재조합의 알부민은 폴리펩티드로서 적합하게 사용될 수 있는 폴리펩티드의 예이다. 4,6-이치환된 데옥시스트렙타민(카나마이신 A, 아미카신, 토브라마이신, 디베카신, 겐타마이신, 시소마이신, 네틸마이신), 4,5-이치환된 데옥시스트렙타민(네오마이신 B, C 및 네오마이신 E(파로모마이신)) 및 비데옥시스트렙타민 아미노글리코시드, 예, 스트렙토마이신은 사용할 수 있는 아미노글리코시드의 예이다. 가장 바람직하게는, 고분자량 폴리아민은 NU-POx이다.

본 발명의 또 다른 구현에서, 반응성 중합체 입자에 사용되는 친핵성 가교제는 1,000 g/mol 미만, 더욱 바람직하게는 700 g/mol 미만, 가장 바람직하게는 400g/mol 미만의 분자량을 갖는 2개 이상의 티올기를 포함하는 저분자량 폴리티올이다. 훨씬 더 바람직하게는, 친핵성 가교제는 트리머캅토프로판, 에탄디티올, 프로판디티올, 2-머캅토에틸 에테르, 2,2'-(에틸렌디옥시)디에탄티올, 테트라(에틸렌 글리콜) 디티올, 펜타(에틸렌 글리콜) 디티올, 헥사에틸렌 글리콜 디티올; 티올 변형 펜타에리트리톨, 디펜타에리트리톨, 트리메틸올프로판 또는 디트리메틸올프로판; 적어도 2개의 시스테인 단위를 함유하는 올리고펩타이드의 군으로부터 선택된다.

본 발명의 또 다른 구현에 따르면, 반응성 중합체 입자에 사용되는 친핵성 가교제는 적어도 2개의 티올기를 포함하는 NU-POx; 티올-작용화된 폴리(메트)아크릴레이트; 티올-작용성 모이어티를 함유하는 다당류, 2개 이상의 티올기를 포함하는 폴리펩타이드의 군으로부터 선택되는 고분자량(> 1,000 g/mol) 폴리티올이다.

바람직하게는, 친핵성 가교제는 친핵성으로 활성화된 POx(NU-POx); 아민-작용화된 폴리에틸렌 글리콜, 키토산; 키토산 유도체, 폴리에틸렌이민; 폴리비닐아민; 폴리알릴 아민; 아민-작용화된 폴리(메트)아크릴레이트; 아민 작용성 모이어티를 함유하는 당류; 리신, 오르니틴, 시스테인, 아르기닌 및 이들의 조합으로부터 선택된 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 및 이들의 조합의 그룹으로부터 선택된 고분자량 폴리아민이다. 보다 바람직하게는, 친핵성 가교제는 NU-POx; 아민-작용화된 폴리에틸렌 글리콜; 젤라틴, 콜라겐 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 고분자량 폴리아민은 NU-POx이다.

고분자량 폴리아민은 바람직하게는 3개 이상의 아민기, 보다 바람직하게는 10개 이상의 아민기, 가장 바람직하게는 20개 이상의 아민기를 포함한다.

본 발명의 특히 바람직한 구현에서, 반응성 중합체 입자는 50-95중량% EL-POx 및 5-50중량% NU-POx, 보다 바람직하게는 60-90중량% EL-POx 및 10-40중량% NU-POx, 가장 바람직하게는 70-85중량% EL-POx 및 15-30중량% NU-POx를 함유한다.

또 다른 유리한 구현에 따르면, 반응성 중합체 입자는 건식 완충 시스템을 함유한다. 바람직하게는, 완충 시스템은 7 내지 11 범위, 더욱 바람직하게는 8 내지 10 범위의 완충 pH를 갖는다.

바람직하게는, 완충 시스템은 적어도 10 mmol.l^-1.pH^-1의 완충 용량을 갖는다. 보다 바람직하게는 완충 용량은 적어도 25 mmol.l^-1.pH^-1, 가장 바람직하게는 완충 용량은 적어도 50 mmol.l^-1.pH^-1이다.

본 발명자들은 예기치 않게 특히 바람직한 접착 특성을 갖는 지혈 시트가 1-20중량%, 보다 바람직하게는 2.5-15중량%, 가장 바람직하게는 5-10중량%의 비반응성 비이온성 중합체를 함유하는 반응성 중합체 입자를 사용함으로써 얻을 수 있다는 것을 발견하였다. 이 비반응성 비이온성 중합체는 반응성 친전자성 기 또는 반응성 친핵성 기를 함유하지 않는다.

매우 바람직한 구현에서, 반응성 중합체 입자는 비반응성 비이온성 중합체로 코팅된다.

비반응성 비이온성 중합체는 바람직하게는 40-70℃ 범위, 보다 바람직하게는 45-65℃ 범위, 및 가장 바람직하게는 50-60℃ 범위의 녹는점을 갖는다. 여기서 녹는은 중합체가 완전히 녹는 온도를 의미한다.

본 발명의 반응성 중합체 입자에 적합하게 적용될 수 있는 비반응성 비이온성 중합체의 예는 폴록사머, 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 조합을 포함한다. 폴록사머는 폴리옥시에틸렌(폴리(에틸렌 옥사이드))의 친수성 사슬 2개가 측면에 위치한 폴리옥시프로필렌(폴리(프로필렌 옥사이드))의 중심 소수성 사슬로 구성된 비이온성 삼중 블록 공중합체이며 화학식 (I)로 표시된다.

여기서 a는 10 내지 110의 정수이고, b는 20 내지 60의 정수이다. a가 80이고 b가 27인 경우, 이 중합체는 폴록사머 188로 알려져 있다. 본 발명에 유용한 다른 공지된 폴록사머는 폴록사머 237(a = 64; 및 b = 37), 폴록사머 338(a = 141; 및 b = 44) 및 폴록사머 407(a = 101; 및 b = 56)이다. 알려져 있으면서 본 발명에 유용한 추가 폴록사머는 폴록사머 108, 폴록사머 182, 폴록사머 183, 폴록사머 212, 폴록사머 217, 폴록사머 238, 폴록사머 288, 폴록사머 331, 폴록사머 338 및 폴록사머 335를 포함한다.

특히 바람직한 구현에 따르면, 비반응성 비이온성 중합체는 폴록사머, 보다 더 바람직하게는 평균 분자량이 2,000-18,000인 폴록사머이고, 가장 바람직하게는 평균 분자량이 7,000-10,000인 폴록사머이다.

입자 응집체에 적용된 폴록사머는 바람직하게는 실온에서 고체이다.

본 발명의 다른 견지는 본 발명에 따른 하나 이상의 지혈 시트를 함유하는 밀봉된 패키지에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 견지는

상기 정의된 방수성 응집성 섬유성 담체 구조물의 시트를 제공하는 단계;

상기 정의된 반응성 중합체 입자를 제공하는 단계; 및

섬유성 담체 구조물의 간극 공간 내에 상기 반응성 중합체 입자를 분포시키는 단계

를 포함하는 지혈 시트의 제조 방법에 관한 것이다:

반응성 중합체 입자는 건식 방법 또는 습식 방법을 사용하여 간극 공간 내에 분포될 수 있으며, 건식 방법이 바람직하다. 건식 방법에서는 반응성 중합체 입자를 분말 형태로 적용하고, 이 분말을 간극 공간을 통해 건조 형태로 분산시킨다.

이 건식 방법의 일 바람직한 구현에 따르면, 반응성 중합체 입자는 섬유성 담체 구조물의 시트를 흔들거나 진동시킴으로써 섬유성 담체 구조물의 간극 공간 내에 분포된다.

건식 방법의 다른 구현에 따르면, 지혈 시트는

a) 섬유성 담체 구조물의 시트를 제공하는 단계,

b) 섬유성 담체 구조물의 시트 상에 반응성 중합체 입자 층을 침착(depositing)시키는 단계;

c) 반응성 중합체 입자의 층 상에 섬유성 담체 구조물의 또 다른 시트를 중첩(superimposing)하는 단계; 및

선택적으로 단계 b) 및 c)를 1회 이상 반복하는 단계

를 포함하는 적층 방법에 의해 제조된다.

이렇게 수득된 적층체 내 반응성 중합체 입자의 분포는 적층체를 흔들거나 진동시킴으로써 촉진될 수 있다.

반응성 중합체 입자를 분포시키는 습식 방법에서, 저비점 유기 액체 중 반응성 중합체 입자의 분산액을 사용하여 섬유성 담체 구조물을 함침시킨 다음, 바람직하게는 감압에서 저비점 유기 액체를 증발시킨다. 전형적으로, 저비점 유기 액체는 대기압에서 150℃ 미만, 보다 바람직하게는 98℃ 미만, 및 가장 바람직하게는 80℃ 미만의 비점을 갖는다.

바람직하게는, 본 방법에서 분포된 반응성 중합체 입자를 함유하는 담체 구조물은 적어도 5분 동안 수용성 친전자성 중합체의 유리 온도보다 높은 온도로 가열된다. 이러한 방식으로 중합체 입자를 가열하면, 입자가 끈적거리고 섬유성 담체 구조물에 부착된다. 전형적으로, 중합체 입자는 적어도 15분 동안 적어도 40℃, 더욱 바람직하게는 50-80℃의 온도로 가열된다.

대안적으로, 반응성 중합체 입자는 반응성 중합체 입자 내의 반응성 친전자성 기의 분획이 앞서 언급한 섬유의 반응성 친핵성 기와 반응할 수 있도록 분포된 반응성 중합체 입자를 함유하는 섬유성 담체 구조물을 습한 대기에 노출시킴으로써 섬유성 담체 구조물 상에 간단히 부착될 수 있다.

본 방법은 바람직하게는 지혈 시트의 살균을 포함한다. 지혈 시트는 무균 포장 전에 멸균될 수 있다. 대안적으로, 시트는 밀봉된 포장 내에서 멸균될 수 있다.

본 발명은 하기 비제한적인 실시예에 의해 추가로 예시된다.

실시예

일반적으로 건조 후 잔류 물 함량(건조 분말, 과립 및/또는 응집성 섬유성 담체 구조물)이 명시적으로 언급되지 않은 경우, 수준은 2.0% w/w 미만이다.

NHS-POx의 제조

20% NHS-에스테르기를 함유하는 NHS-측쇄 활성화된 폴리[2-(에틸/히드록시-에틸-아미드-에틸/NHS-에스테르-에틸-에스테르-에틸-아미드-에틸)-2-옥사졸린] 삼원 공중합체(= EL -POx, 20% NHS)는 다음과 같이 합성되었다:

폴리[2-(에틸/메톡시-카보닐-에틸)-2-옥사졸린] 공중합체(DP = +/-100)는 60% 2-에틸-2-옥사졸린(EtOx) 및 40% 2-메톡시카르보닐-에틸-2-옥사졸린(MestOx)을 사용하여 CROP에 의해 합성되었다. 40% 2-메톡시카르보닐-에틸기를 함유하는 통계적 공중합체(¹H-NMR)를 얻었다. 두 번째로, 40% 2-메톡시카르보닐-에틸기를 함유하는 중합체를 에탄올아민과 반응시켜 40% 2-히드록시-에틸-아미드-에틸-기를 갖는 공중합체를 생성하였다(¹H-NMR). 그 후, 2-히드록시-에틸-아미드-에틸-기의 절반을 숙신산 무수물과 반응시켜 ¹H-NMR에 따르면 60% 2-에틸기, 20% 2-히드록시-에틸-아미드-에틸-기 및 20% 2-카르복시-에틸-에스테르-에틸-아미드-에틸-기를 갖는 삼원 공중합체를 생성하였다. 마지막으로, 2-카르복시-에틸-에스테르-에틸-아미드-에틸-기는 N-히드록시숙신이미드(NHS) 및 디이소프로필카르보디이미드(DIC)에 의해 활성화되어, EL-POx, 20% NHS를 생성했다. NHS-POx는 ¹H-NMR에 따르면 20% NHS-에스테르기를 함유하였다. NHS-POx를 물(300mL 중 60g)에 2-8℃로 용해하고, 30분 동안 영하 80℃에서 냉각하고 동결 건조했다. 이렇게 얻은 동결 건조된 분말을 칼 피셔(Karl Fischer) 적정을 통해 측정된 물 함량이 0.8% w/w 미만이 될 때까지 40℃에서 Rotavap에서 건조되었다. 이 건조(백색) 분말을 평균 입자 크기가 40μm(D[4,3]) 이하가 될 때까지 볼 밀(Retch MM400)을 사용하여 분쇄하고 알루-알루(alu-alu) 백에 진공 밀봉했다.

NHS-POx 분말의 염색

NHS-POx 분말 20g을 물에 용해시키고, 고성능 분산 기기(Ultra-Turrax, IKA)를 사용하여 Brilliant Blue FCF(Sigma Aldrich) 50mg과 혼합했다. 혼합 직후(2분) 용액을 -78℃에서 동결하고, 후속적으로 밤새 동결 건조시켰다. 이렇게 얻은 동결 건조 분말을 칼 피셔 적정을 통해 측정된 잔류 물 함량이 0.8% w/w 미만이 될 때까지 40℃에서 Rotavap에서 건조시켰다. 다음으로, 건조된(청색) 분말을 볼밀(Retch MM400)을 사용하여 평균 입자 크기가 40μm(D[4,3]) 이하인 청색으로 염색된 NHS-POx 분말이 될 때까지 분쇄하고, 알루-알루 백에 진공 밀봉했다.

NU-POx의 제조

알킬 측쇄에 에틸 및 아민기를 함유하는 폴리옥사졸린은 EtOx 및 MestOx의 CROP 및 후속적인 에틸렌 디아민으로 메틸 에스테르 측쇄의 아미드화에 의해 합성되어 폴리(2-에틸/아미노에틸아미도에틸-2-옥사졸린) 공중합체(NU-POx)가 생성되었다. NU-POx는 ¹H-NMR에 따르면 10% NH₂를 함유하였다. NU-POx를 물(300mL 중 60g)에 2-8℃로 용해하고, 영하 80℃에서 30분 동안 냉각하고 동결 건조했다. 이렇게 얻은 동결 건조된 분말을 칼 피셔 적정을 통해 측정된 물 함량이 0.8% w/w 미만이 될 때까지 40℃에서 Rotavap에서 건조되었다. 이 건조 분말은 평균 입자 크기가 100μm(D[4,3]) 이하가 될 때까지 테이블 탑 분쇄기에서 분쇄하고, 알루-알루 백에 진공 밀봉했다.

반응성 NHS-POx/P188 과립의 제조

1.5, 2.5 또는 3.5중량% Pluronic P188을 함유하는 P188 코팅된 반응성 NHS-POx 과립은 고전단 혼합기에서 P188 분말과 함께 NHS-POx를 65℃에서 10분 동안 가열한 다음, 주위 조건으로 냉각하여 제조했다. 코팅된 과립을 볼밀(Retch MM400)을 사용하여 평균 입자 크기가 40μm(D[4,3]) 이하가 될 때까지 분쇄하고, 알루-알루 백에 진공 밀봉하였다.

이렇게 얻은 과립의 입자 크기 분포는 대략 90 vol.% < 80 μm, 50 vol.% < 40 μm 및 10 vol.% < 10 μm였다.

NHS-POx/P188(2.5%) 과립을 ¹H-NMR 분광기를 사용하여 분석하였다. 15mg의 과립을 1mL의 디메틸설폭시드(DMSO-d6)에 용해시켰다. 용액을 NMR 튜브로 옮기고 ¹H-NMR 스펙트럼을 기록하였다. 획득한 스펙트럼에서 NHS-POx에 결합된 NHS의 양을 계산할 수 있다. 과립에서 NHS-POx에 결합된 NHS의 양은 NHS-POx 출발 물질과 비교하여 101%로 계산되었으며, 이는 과립화 동안 붕괴 또는 가교가 없음을 나타낸다.

NHS-POx/P188 과립을 크기 배제 크로마토그래피에 의해 추가로 분석하였다. SEC 분석을 위한 용리액인 50mM 리튬 클로라이드(2.50mL)를 함유하는 N,N-디메틸아세트아미드에 용해된 5mg의 과립. 폴리(메틸 메타크릴레이트) 표준에 대해 SEC를 측정하고, 얻어진 크기 배제 크로마토그램에서 M_n, M_w 및 PDI를 측정했다. PDI는 1.5 이하였으며, 이는 과립화 중에 가교가 일어나지 않았음을 의미한다.

반응성 NHS-POx/카보네이트 과립의 제조

소듐 카보네이트와 소듐 히드로겐 카보네이트의 1:1 몰/몰 혼합물은 소듐 카보네이트 25.31g과 소듐 히드로겐 카보네이트 20.06g을 초순수 350mL에 녹인 후 액체 질소에서 급속 동결하고 동결 건조하여 제조하였다. 생성된 분말을 감압하에 건조시키고 알루-알루 백에 진공 밀봉하였다.

NHS-POx 25.28g을 균질한 분말이 얻어질 때까지 고전단 혼합기를 사용하여 소듐 카보네이트/소듐 히드로겐 카보네이트 혼합물 1.75g 및 이소프로필 알코올(IPA) 0.80mL와 혼합하였다.

혼합 후, IPA 함량이 0.1% w/w 미만이 될 때까지 습식 과립을 감압 하에 건조시켰다. 건조된 과립을 평균 입자 크기가 25μm 이하가 될 때까지 커피 그라인더에서 분쇄하고, 알루-알루 백에 진공 밀봉하였다.

반응성 NHS-POx/P188/카보네이트 과립의 제조

1.5, 2.5 또는 3.5중량% Pluronic P188을 함유하는 P188 코팅된 반응성 NHS-POx/카보네이트 과립은 고전단 혼합기에서 P188 분말과 함께 NHS-POx/카보네이트 과립을 65℃에서 10분 동안 가열한 다음, 주위 조건으로 냉각함으로써 제조하였다. 코팅된 과립을 볼밀(Retch MM400)을 사용하여 평균 입자 크기가 40μm(D[4,3]) 이하가 될 때까지 분쇄하고 알루-알루 백에 진공 밀봉하였다.

이렇게 얻은 과립의 입자 크기 분포는 대략 90 vol.% < 20 μm, 70 vol.% < 10 μm 및 40 vol.% < 5 μm였다.

반응성 NHS-POx/NU-POx 과립의 제조(IPA 과립화)

청색 또는 백색(염색되지 않은) NHS-POx 분말은 약 1-2% w/w IPA를 함유하는 균질한 눈 같은 분말이 얻어질 때까지 고전단 혼합기에서 이소프로필 알코올(IPA)로 습윤되었다. 그 후, NU-POx 분말을 첨가하여 혼합하였다. 습윤된 청색 NHS-POx 분말은 1:0.6의 몰비로 NU-POx 분말과 혼합되었으며, 상기 몰비는 NHS-POx에 의해 제공된 NHS 기의 수 대 NU-POx에 의해 제공된 아민기의 수의 비를 나타낸다. 습윤된 비염색 NHS-POx 분말은 또한 다른 몰비(1:0.8, 1:1 및 1:1.2)로 NU-POx 분말과 혼합되었다.

혼합 후, 습식 과립을 IPA 함량이 ¹H-NMR을 통해 측정시 0.1% w/w 미만이 될 때까지 감압 하에 건조시켰다. 건조된 과립을 볼밀(Retch MM400)을 사용하여 평균 입자 크기가 50μm(D[4,3]) 이하가 될 때까지 분쇄하고, 알루-알루 백에 진공 밀봉하였다.

이렇게 얻은 과립의 입자 크기 분포는 대략 90 vol.% < 90 μm, 50 vol.% < 45 μm 및 10 vol.% < 15 μm였다.

NHS-POX/NU-POx 과립(1:1)을 ¹H-NMR 분광기를 사용하여 분석하였다. 25 mg의 과립을 20분 동안 초음파 처리하여 트리플루오로아세트산(0.20 mL)에 용해시켰다. 과립이 완전히 용해된 후, 샘플을 내부 표준(0.80mL)으로 말레산(2.5mg/mL)을 포함하는 중수소화 디메틸설폭시드(DMSO-d₆)로 희석하고, NMR 튜브로 옮기고 ¹H-NMR 스펙트럼을 기록했다.

획득한 스펙트럼에서, NHS-POx에 결합된 NHS의 양은 과립에 존재하는 NHS 및 아민기의 몰비와 함께 계산될 수 있다. 과립에서 NHS-POx에 결합된 NHS의 양은 NHS-POx 출발 물질에 결합된 NHS의 양과 동일했으며, 이는 과립화 동안 붕괴 또는 가교가 없음을 나타낸다.

NMR 샘플에서 총 중합체 회수율, 즉 NHS-POx와 NU-POx의 조합은 알려진 양의 내부 표준(말레산)과 다양한 농도의 NHS-POx 및 NU-POx의 기록된 ¹H-NMR 스펙트럼으로부터 구성된 보정 곡선을 사용하여 측정되었다. 총 중합체 회수율은 99%로 측정되었으며, 이는 불용성 가교 물질이 형성되지 않았음을 나타낸다.

NHS-POX/NU-POx 과립(1:1)을 크기 배제 크로마토그래피에 의해 추가로 분석하였다. 20 mg의 과립을 50℃에서 1시간 동안 아세트산 무수물(1.00 mL)로 처리하였다. 이어서, 메탄올(2.00 mL)을 첨가하고, 혼합물을 50℃에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 분취량(0.75mL)을 취하고, 모든 휘발성 물질을 감압 하에 제거했다. 샘플을 SEC 분석을 위한 용리액인 50mM 리튬 클로라이드(2.50mL)를 함유하는 N,N-디메틸아세트아미드에 취하였다. 폴리(메틸 메타크릴레이트) 표준에 대해 SEC를 측정하고, 얻어진 크기 배제 크로마토그램에서 Mn, Mw 및 PDI를 측정했다. PDI는 1.5 이하였으며, 이는 과립화 동안 가교가 발생하지 않았음을 나타낸다. 이 크기 배제 크로마토그래피 방법의 분석적 검증은 0.05mol% 수준에서 NHS-POx와 NU-POx의 의도적 가교가 PDI를 2.5 초과로 증가시키는 것으로 나타났다.

반응성 NHS-POx/NU-POx 과립의 제조(아세톤 과립화)

청색 또는 백색(염색되지 않은) NHS-POx 분말을 고전단 혼합기에서 아세톤으로 적셔 약 1-2% w/w 아세톤을 함유하는 균질한 눈 같은 분말이 얻어질 때까지 습윤시켰다. 그 후, NU-POx 분말을 첨가하여 혼합하였다. 습윤된 청색 NHS-POx 분말은 1:0.20의 몰비로 NU-POx 분말과 혼합되었으며, 상기 몰비는 NHS-POx에 의해 제공된 NHS 기의 수 대 NU-POx에 의해 제공된 아민기의 수의 비를 나타낸다. 습윤된 비염색 NHS-POx 분말은 또한 다른 몰비(1:0.10 및 1:0.40)로 NU-POx 분말과 혼합되었다.

혼합 후, 습윤 과립을 ¹H-NMR을 통해 측정할 때 아세톤 함량이 0.1% w/w 미만이 될 때까지 감압 하에 건조시켰다. 건조된 과립을 Ultra Centrifugal Mill(Retch ZM200)을 사용하여 분쇄하고, 메쉬 크기가 63μm인 시험체로 체질하였다. 체를 통과한 과립분획을 수집하였으며, 평균입경은 50μm(D[4,3]) 이하였다. 과립을 알루-알루 백에 진공 밀봉하였다.

NHS-POX/NU-POx 과립(1:0.20)을 ¹H-NMR 분광기를 사용하여 분석하였다. 25 mg의 과립을 20분 동안 초음파 처리하여, 트리플루오로아세트산(0.20 mL)에 용해시켰다. 과립이 완전히 용해된 후, 샘플을 내부 표준(0.80mL)으로 말레산(2.5mg/mL)을 포함하는 중수소화 디메틸설폭시드(DMSO-d₆)로 희석하고, NMR 튜브로 옮기고 ¹H-NMR 스펙트럼을 기록했다. 획득한 스펙트럼에서 NHS-POx에 결합된 NHS의 양은 과립에 존재하는 NHS 및 아민기의 몰비와 함께 계산될 수 있다. 과립에서 NHS-POx에 결합된 NHS의 양은 NHS-POx 출발 물질에 결합된 NHS의 양과 동일하였으며, 이는 과립화 동안 붕괴 또는 가교가 없음을 나타낸다.

NHS-POX/NU-POx 과립(1:0.20)을 크기 배제 크로마토그래피에 의해 추가로 분석하였다. 20 mg의 과립을 50℃에서 1시간 동안 아세트산 무수물(1.00 mL)로 처리하였다. 이어서, 메탄올(2.00 mL)을 첨가하고, 혼합물을 50℃에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 분취량(0.75mL)을 취하고, 모든 휘발성 물질을 감압 하에 제거했다. 샘플을 SEC 분석을 위한 용리액인 50mM 리튬 클로라이드(2.50mL)를 함유하는 N,N-디메틸아세트아미드에 취하였다. 폴리(메틸 메타크릴레이트) 표준에 대해 SEC를 측정하고, 얻어진 크기 배제 크로마토그램에서 M_n, M_w 및 PDI를 측정했다. PDI는 1.5 이하로 과립화 과정에서 가교가 일어나지 않았음을 의미한다.

반응성 NHS-POx/NU-POx/P188 과립의 제조

반응성 NHS-POx/NU-POx 과립은 이전에 설명한 대로 제조되었다. 후속적으로, 2.5% w/w P188 코팅된 반응성 NHS-POx/NU-POx 과립은 NHS-POx/NU-POx 과립을 P188 분말과 함께 고전단 혼합기에서 65℃에서 10분 동안 가열한 후 주위 조건으로 냉각시켜 제조하였다. 코팅된 과립을 볼밀(Retch MM400)을 사용하여 평균 입자 크기가 40μm(D[4,3]) 이하가 될 때까지 분쇄하고, 알루-알루 백에 진공 밀봉하였다.

NHS-POx/NU-POx/P188 과립을 ¹H-NMR 분광기를 사용하여 분석하였다. 25 mg의 분말을 20분 동안 초음파 처리하여 트리플루오로아세트산(0.20 mL)에 용해시켰다. 과립이 완전히 용해된 후, 샘플을 중수소화 디메틸설폭시드(DMSO-d₆)(0.80 mL)로 희석하고, NMR 튜브로 옮기고 ¹H-NMR 스펙트럼을 기록하였다. 얻어진 스펙트럼으로부터 미반응 NHS의 양은 NHS-POx에 비해 98%로 계산되었다.

NHS-POx/NU-POx/P188 과립을 크기 배제 크로마토그래피에 의해 추가로 분석하였다. 20 mg의 과립을 50℃에서 1시간 동안 아세트산 무수물(1.00 mL)로 처리하였다. 이어서, 메탄올(2.00 mL)을 첨가하고 혼합물을 50℃에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 분취량(0.75mL)을 취하고, 모든 휘발성 물질을 감압 하에 제거했다. 샘플을 SEC 분석을 위한 용리액인 50mM 리튬 클로라이드(2.50mL)를 함유하는 N,N-디메틸아세트아미드에 취하였다. 폴리(메틸 메타크릴레이트) 표준에 대해 SEC를 측정하고, 얻어진 크기 배제 크로마토그램에서 Mn, Mw 및 PDI를 측정했다. PDI는 1.5 이하였으며, 이는 과립화 중에 가교가 일어나지 않았음을 나타낸다.

환원 가교 젤라틴(RXL)의 제조

환원 가교 젤라틴(RXL)을 2가지 절차에 따라 제조하였다:

12g의 젤라틴 분말(Gelita-SPON®, Gelita Medical GmbH)을 40℃에서 2시간 동안 교반하여 0.1몰 수성 소듐 히드록시드 용액 350mL에 용해했다. 투명한 용액을 얻은 후, 혼합물을 주위 온도로 냉각시키고, 32.5mL의 1.0몰 염산 수용액을 첨가하여 pH를 7로 조정하였다. 용액을 액체 질소를 사용하여 급속 동결하고, 밤새 동결 건조시켰다. 이어서, 분말을 커피 그라인더에서 분쇄하고, 감압 건조하고, 알루-알루 백에 진공 밀봉하였다. 이하, 이 환원 가교 젤라틴을 RXL-LS(저염)라 칭한다.

12g의 젤라틴 분말(Gelita-SPON®, Gelita Medical GmbH)을 40℃에서 10분 동안 교반하여 1.0몰 수성 소듐 히드록시드 용액 360mL에 용해했다. 수득된 투명한 용액을 주위 온도로 냉각시키고, 30mL의 농축 염산 용액(37% w/w)을 첨가하여 pH를 7로 감소시켰다.

용액을 액체 질소를 사용하여 급속 동결하고, 밤새 동결 건조시켰다. 이어서, 분말을 커피 그라인더에서 분쇄하고, 감압 건조하고, 알루-알루 백에 진공 밀봉하였다. 이하, 이 환원 가교 젤라틴을 RXL-HS(고염)라 칭한다.

반응성 NHS-POx/RXL 과립의 제조(저염 및 고염)

NHS-POx/RXL 반응성 과립을 하기와 같이 제조하였다: 5g의 청색 NHS-POx 분말을 약 1-2% w/w IPA를 함유하는 균질한 눈과 같은 분말이 얻어질 때까지 고전단 혼합기에서 IPA로 습윤하였다. 이후, RXL-LS 또는 RXL-HS 분말 5g을 첨가하여 혼합하였다. 혼합 후, 습식 과립을 IPA 함량이 ¹H-NMR을 통해 측정시 0.1% w/w 미만이 될 때까지 감압 하에 건조시켰다. 건조된 과립을 평균 입자 크기가 90μm(D[4,3]) 이하가 될 때까지 커피 그라인더에서 밀링하고, 알루-알루 백에 진공 밀봉하였다.

이렇게 얻은 과립의 입자 크기 분포는 대략 90 vol.% < 190 μm, 50 vol.% < 60 μm 및 10 vol.% < 15 μm였다.

RXL을 함유하는 과립을 ¹H-NMR 분광법 분석에 의해 분석하였다. 이를 위해 5%(v/v) 아세트산(1.0mL)을 함유하는 중수소화 클로로포름(CDCl3)을 25mg의 과립에 첨가하였다. NHS-POx는 샘플을 20분 동안 초음파 처리하여 선택적으로 추출되었다. 분산액을 0.22μm 필터에 통과시키고, NMR 튜브로 옮기고 ¹H-NMR 스펙트럼을 기록하였다. 얻어진 스펙트럼으로부터 미반응 NHS의 양은 NHS-POx에 비해 98%로 계산되었다.

NMR 샘플에서 NHS-POx의 회수율은 트리메틸실란을 내부 표준으로 사용하고 다양한 농도의 NHS-POx의 ¹H-NMR 스펙트럼으로 구성된 보정 곡선을 사용하여 측정되었다. 총 NHS-POx 회수율은 100%로 측정되었으며, 이는 불용성 가교 물질이 형성되지 않았음을 나타낸다.

NHS-POx/RXL 과립을 크기 배제 크로마토그래피에 의해 추가로 분석하였다. 따라서, ¹H-NMR 분광법 분석에 사용된 용액에서 분취량(0.15mL)을 취했다. 이 용액을 SEC 분석을 위한 용리액인 50mM 리튬 클로라이드(1.00mL)를 함유하는 N,N-디메틸아세트아미드로 희석하였다. 폴리(메틸 메타크릴레이트) 표준에 대해 SEC를 측정하고, 얻어진 크기 배제 크로마토그램에서 Mn, Mw 및 PDI를 측정했다. PDI는 1.5 이하였으며, 이는 또한 과립화 중에 가교가 발생하지 않았음을 나타낸다.

카보네이트를 함유하는 반응성 NHS-POx/RXL 과립의 제조

먼저, 초순수 350mL에 소듐 카보네이트 25.31g과 소듐 하이드로겐 카보네이트 20.06g을 용해시켜 소듐 카보네이트와 소듐 하이드로겐 카보네이트의 1:1 몰/몰 혼합물을 제조하였다. 용액을 액체 질소에서 급속 동결하고, 동결 건조시켰다. 생성된 분말을 감압하에 건조시키고, 알루-알루 백에 진공 밀봉하였다.

NHS-POx/RXL/카보네이트 과립을 다음과 같이 제조하였다: RXL-LS 또는 RXL-HS 5g 및 소듐 카보네이트/소듐 하이드로겐 카보네이트 0.178g을 고전단 혼합기를 사용하여 혼합하였다. 다음으로, 약 1-2% w/w IPA를 함유하는 청색 NHS-POx 5g을 첨가하고, 균질한 분말이 얻어질 때까지 혼합하였다. 혼합 후, 습식 과립을 IPA 함량이 ¹H-NMR을 통해 측정시 0.1% w/w 미만이 될 때까지 감압 하에 건조시켰다. 건조된 과립을 평균 입자 크기가 100μm(D[4,3]) 이하가 될 때까지 커피 그라인더에서 밀링하고, 알루-알루 백에 진공 밀봉하였다.

반응성 NHS-POx/NH2-PEG 과립의 제조

NHS-POx(6.9g)는 약 1-2% w/w IPA를 함유하는 균질한 눈 같은 분말이 얻어질 때까지 고전단 혼합기에서 IPA로 적셔졌다. 후속적으로, 8.1g의 아민-PEG-아민, 2-암, MW 2k(예: Creative PEGWorks)를 첨가했다(몰 비: 1:1.16, 상기 몰비는 NHS-POx에 의해 제공된 NHS 기의 수 대 PEG-아민에 의해 제공되는 아민기의 수의 비를 나타냄). 형성된 과립을 IPA 함량이 ¹H-NMR을 통해 측정할 때 0.1% w/w 미만이 될 때까지 감압 하에 건조시켰다. 건조된 과립을 평균 입자 크기가 100μm(D[4,3]) 이하가 될 때까지 커피 그라인더에서 밀링하고, 알루-알루 백에 진공 밀봉하였다.

NHS-POX/NH2-PEG 과립을 ¹H-NMR 분광기를 사용하여 분석하였다. 25 mg의 과립을 20분 동안 초음파 처리하여 트리플루오로아세트산(0.20 mL)에 용해시켰다. 과립이 완전히 용해된 후, 샘플을 중수소화 디메틸설폭시드(DMSO-d₆)(0.80 mL)로 희석하고, NMR 튜브로 옮기고, ¹H-NMR 스펙트럼을 기록하였다. 얻어진 스펙트럼으로부터 미반응 NHS의 양은 NHS-POx에 비해 97%로 계산되었다.

NHS-POX/NH2-PEG 과립을 크기 배제 크로마토그래피에 의해 추가로 분석하였다. 20 mg의 과립을 50℃에서 1시간 동안 아세트산 무수물(1.00 mL)로 처리하였다. 이어서, 메탄올(2.00 mL)을 첨가하고, 혼합물을 50℃에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 분취량(0.75mL)을 취하고, 모든 휘발성 물질을 감압 하에 제거했다.

샘플을 SEC 분석을 위한 용리액인 50mM 리튬 클로라이드(2.50mL)을 함유하는 N,N-디메틸아세트아미드에 취하였다. 폴리(메틸 메타크릴레이트) 표준에 대해 SEC를 측정하고, 얻어진 크기 배제 크로마토그램에서 M_n, M_w 및 PDI를 측정했다. PDI는 1.5 이하였으며, 이는 과립화 중에 가교가 일어나지 않았음을 의미한다.

반응성 NHS-PEG/NU-POx 과립의 제조

1.07g의 NHS-PEG 4-암 MW 10k(ex Creative PEGWorks) 및 0.46g의 NU-POx를 막자사발을 사용하여 50uL 디에틸 에테르와 완전히 혼합했다. 균질한 혼합물을 형성한 후, 감압 건조하고 알루미늄 백에 진공 밀봉하였다.

반응성 NHS-POx/Gelita Spon 과립의 제조

0.2% w/w 미만의 물 함량을 갖는 7.01g의 사전 건조된 젤라틴 분말(Gelita-SPON®, ex Gelita Medical GmbH)을 20,000rpm에서 작동하는 고전단 혼합기를 사용하여 20분 동안 디클로로메탄(200mL)에 분산시켰다. 이어서, NHS-POx(7.02g)를 첨가하고, 5분 동안 교반을 계속하였다. NHS-POx는 용해되지 않았다. 모든 휘발성 물질을 감압하에 현탁액으로부터 제거하였다. 얻어진 분말을 커피 그라인더를 사용하여 평균 입경이 95μm(D[4,3]) 이하가 될 때까지 분쇄한 후 알루-알루 백에 진공 밀봉한 후, 추가로 감압 건조하고, 알루-알루 백에 진공 밀봉하였다.

이렇게 얻은 과립의 입자 크기 분포는 대략 90 vol.% < 190 μm, 50 vol.% < 80 μm 및 10 vol.% < 15 μm였다.

과립을 ¹H-NMR 분광법 분석에 의해 분석하였다. 이를 위해 5%(v/v) 아세트산(1.0mL)을 함유하는 중수소화 클로로포름(CDCl₃)을 25mg의 과립에 첨가하였다. NHS-POx는 샘플을 20분 동안 초음파 처리하여 선택적으로 추출되었다. 분산액을 0.22μm 필터에 통과시키고, NMR 튜브로 옮기고 ¹H-NMR 스펙트럼을 기록하였다. 얻어진 스펙트럼으로부터 미반응 NHS의 양은 NHS-POx에 비해 97%로 계산되었다.

과립을 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 분석에 의해 추가로 분석하였다. 위에서 설명한 여과된 NHS-POx 추출물의 분취량(0.15mL)을 SEC 분석을 위한 용리액인 50mM 리튬 클로라이드(1.00mL)을 함유하는 N,N-디메틸아세트아미드로 희석했다.

샘플은 폴리(메틸 메타크릴레이트) 표준에 대해 SEC에 의해 분석되었으며, PDI는 1.45이었으며, 이는 가교가 발생하지 않았음을 나타낸다.

응집성 섬유성 담체 구조물

본 발명에 따른 조직-접착 시트의 제조에서 섬유성 담체 구조물로서 사용하기 위해 하기 상업적으로 입수가능한 지혈 제품을 선택하였다:

Gelita Tuft-It®: 가교 결합이 감소된 겔폼 섬유의 8개 층으로 구성된 응집성 섬유성 담체 구조물. 각각 약 2mm 두께의 8개 층은 50mm x 75mm의 치수를 갖다. Gelita Tuft-It®의 물 함량은 15% 이하이다. 생성물을 40℃에서 몇 시간 동안 진공 오븐에서 건조시켜 물 함량을 2.0% w/w 이하(중량으로 측정)로 감소시킨 후 응집체 입자로 함침시켰다.

출혈 실험

표준화된 생체 외 및 생체 내 돼지 출혈 모델을 사용하여 지혈 효능을 평가했다. 모든 모델은 헤파린을 사용하여 혈액 응고 시간을 활성화된 응고 시간(ACT)의 약 2~3배까지 증가시킨다.

생체 외 모델: 실제 생체 내 상황을 가능한 한 가깝게 모방하기 위해 도축장에서 헤파린 처리된 신선한 혈액으로 관류된 신선한 간이 있는 살아있는 생체 외 돼지 모델. 간은 산소화, 혈액의 pH, 온도 및 혈압이 생체 경계 내에서 유지되는 관류 기계에 장착된다. 2개의 간과 10리터의 헤파린 처리된 혈액(5000unit/L)을 도축장에서 수집한다. 간은 얼음 상에서 운반되고; 혈액은 주위 온도에서 운반된다. 수집 후 2시간 이내에 장갑과 시아노아크릴레이트 글루로 폐쇄된 병변이 있는지 간을 검사한다.

관류 매개변수: 유속 600ml/분; 압력 10-12 mmHg; 온도 37℃(+/- 1℃); 카보겐 분당 0.25리터

평평하고, 둥근 회전식 마모 도구를 사용하여 천공 출혈의 깊이가 항상 3mm가 되도록 고무 온레이로 간 표면에 원형 출혈 상처(직경 8mm)를 생성한다.

간이 적절하게 관류된 후(색상 및 온도 확인) 다음 절차에 따라 샘플을 테스트한다: 샘플을 올바른 크기(2.7 x 2.7 cm)로 절단하고; 카메라를 켜고; 카메라에 번호를 매기고(site number on camera); 생검(biopsy)을 8mm로 천공하고; 바이옵트(biopt)를 잘라내고; 거즈(2x)로 출혈로부터 혈액을 제거하고; 미리 무게를 잰 거즈에서 30초 동안 혈액을 수집하고;

출혈에 점수를 매기고(2명의 연구원에 의해); 미리 적신 거즈(식염수)로 샘플을 출혈부에 놓고, 1분 동안 약간의 압력을 유지하고; 5분 동안 관찰하고(접착 및 지혈 확인 및 점수 매기기), 30분 후에 반복한다.

생체 내 모델: 마취된 스와인(swine)(국내 돼지, 수컷, 체중 범위: 40kg, 성체)에 표준화된 결합 관통 비장 파열을 가한다.

비장 및 기타 장기에 접근하기 위해 정중선 개복술이 수행된다. 메스(scalpel)를 사용하여 n=3(S1…S3) 피막하 표준화 병변(10mm x 10mm)을 만든다. 지혈 제품은 미리 적신 거즈(식염수)로 부드러운 압력을 가하고, 1분 동안 유지한다. 제품 적용 후 지혈 시간(TTH)이 평가된다. TTH가 0이면, 1분 후 지혈이 이미 이루어졌음을 의미한다.

패치 점수 체계: 응고

++++ 탐포네이드 직후 달성

+++ 탐포네이드 후 <10초에 달성

++ 탐포네이드 후 <30초에 달성

+ 탐포네이드 후 3분 이내에 달성

+/- 3분 후 달성, 두 번째 탐포네이드 적용

- 달성하지 못함

패치 점수 체계 : 적용 후 10분 접착력

++++ 매우 강한 접착력(제거시 패치가 부서짐)

+++ 강력한 접착력(제거시 패치가 부서짐)

++ 강력한 접착력 (패치가 부서지지 않고 제거 가능)

+ 적당한 접착력(패치가 부서지지 않고 제거 가능)

+/- 약한 접착력(패치가 부서지지 않고 제거 가능)

- 달성하지 못함

실시예 1

염색된 중합체 입자를 이용한 담체 구조물의 함침

Vibratory Sieve Shaker AS 300(Retsch)은 염색된 NHS-POx 분말을 다른 담체 구조물에 도입하기 위해 각각 5분씩 2회 연속 작동되었다. 생산 후 지혈 패치는 1g의 실리카가 함유된 알루-알루 파우치에 포장되고 진공 밀봉되었다.

위에서 언급한 진탕기를 사용하여 청색 NHS-POx 분말을 세 가지 다른 담체 구조물에 도입했다.

젤라틴 폼(Gelita Rapid®, Gelita Medical Germany), 스펀지

콜라겐 폼(Surgicoll®, MBP, Germany), 스폰지

섬유성 담체 구조물(Gelita Tuft-It®, Gelita Medical Germany)

진탕 처리 후 청색 NHS-POx 분말은 젤라틴 폼 또는 콜라겐 폼에 거의 침투하지 않은 것으로 나타났다. 메스로 폼을 절단한 후 깊은 함침이 없음이 분명했다.

대조적으로, 진탕 처리는 섬유성 담체 구조물 전체에 걸쳐 청색 NHS-POx 분말을 균질하게 분산시켰다.

실시예 2

반응성 중합체 입자 및 과립으로 담체 구조물 함침

Gelita Tuft-It®(약 0.71g)은 NHS-POx 분말 및 NHS-POx/NU-POx(1:0.6) 과립으로 기계적 진탕 공정을 통해 함침되었다. 염색된 분말(약 0.75g)을 패치에 도입하기 위해 페인트 진탕 기계(Collomix GmbH의 VIBA PRO V)를 사용했다. 담체 구조물 홀더가 있는 어레이를 기계에 고정했다. 어레이를 수직으로 진동시켰다.

함침된 샘플을 PMMA 플레이트에 놓고, 샘플을 다른 열처리를 받는 오븐에 넣었다. 분말 고정을 평가하기 위해, 샘플을 흰색 PMMA 플레이트에 두 번 표시했다. 청색 가루가 나오지 않으면, 결과가 고정된 것으로 간주하였다. 결과는 표 1에 나와 있다.

NHS-POx 분말이 함침된 샘플과 NHS-POx/NU-POx 과립이 함침된 샘플 간에 고정 결과의 차이는 관찰되지 않았다.

반응성 NHS-POx 분말과 NHS-POx/NU-POx 과립은 모두 흡습성이다. 40% 미만의 주변 온도 및 상대 습도(RH)에서 섬유성 담체 구조물은 노출 후 30분 이내에 재현 가능하게 함침될 수 있다. 그러나, 예를 들어 RH 75% 및 25℃에서 함침을 수행하면, 입자/과립이 몇 분 이내에 끈적해져서 재현할 수 없고, 불균질한 함침 특성이 나타난다.

실시예 3

지혈 패치(Gelita Tuft-It®; 50x75 mm, 약 0.7 그램)에 "래팅(rattling)" 유형의 공압 진탕 엔진에 의해 움직이는 스프렁(sprung) 서스펜션에서 1g의 청색 NHS-POx를 흔들어서 함침시켰다. 엔진은 6bar, 146Hz 및 830N 원심력에서 작동되는 NTP 25 B + C(Netter Vibration GmbH)였다. 염색된 NHS-POx 분말을 분산시키기 위해 10초마다 10번의 사이클을 사용하였다. 생산 후, 지혈 패치는 1g의 실리카가 들어있는 알루-알루 파우치에 포장하고, 진공 밀봉하였다.

패치를 2cm x 2cm 조각으로 자르고, 생체 외 간 관류 모델에서 세 번 테스트했다. 지혈 시간(TTH)은 0분(1분 압력 후)이었고, 30분 관찰 시간 동안 재출혈이 관찰되지 않았다. 패치는 매우 우수한 접착 특성을 나타냈다. 조각으로 부수지 않고 패치를 제거하는 것은 불가능했다. 또한, 패치는 유연성과 굽힘 특성이 우수한 것으로 나타났다.

패치는 또한 생체내 포르신(porcine) 헤파린화 모델에서 평가되었다. 그들은 높은 지혈 효능을 제공하고, 우수한 접착 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 활성 출혈은 다양한 장기: 비장, 간 및 신장의 절제에서 효율적으로 중단되었다. 생체 외 및 생체 내 결과의 요약은 표 2에 나와 있다.

실시예 4

지혈 패치(Gelita Tuft-It®; 50x75 mm, 약 0.71 그램)에 앞서 설명한 반응성 NHS-POx/NU-POx(1:0.6) 과립을 함침시켰다. 실시예 3에 기재된 바와 같이 1g의 과립을 패치 전체에 분포시켰다. 다음으로, 지혈 패치를 1g의 실리카를 함유하는 알루-알루 파우치에 포장하고, 진공 밀봉하였다.

패치를 2cm x 2cm 조각으로 자르고, 생체 외 간 관류 모델에서 세 번 테스트했다. 지혈 시간(TTH)은 0(1분 압력 후)이었고, 30분 관찰 시간 동안 재출혈이 관찰되지 않았다. 패치는 또한 뛰어난 유연성과 굽힘 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다.

패치는 또한 생체내 포르신(porcine) 헤파린화 모델에서 평가되었다. 그것들은 매우 우수한 응고 및 접착 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 활성 출혈은 다양한 장기: 비장, 간 및 신장의 절제에서 효율적으로 중단되었다. 결과의 요약은 표 3에 나와 있다.

실시예 5

Gelita Tuft-It®(50 x 75 mm, 약 0.7 g)에 다양한 반응성 중합체 분말을 함침시켰다. 이렇게 얻은 패치의 지혈 특성은 이전에 여기에 설명된 생체외 및 생체내 포르신 출혈 모델에서 테스트되었다.

공압식 진탕 장치를 사용하여 섬유성 담체 구조물에 분말 1.4g을 함침시켰다. 섬유성 담체 시트를 수직으로 진동시켰다. 롱 스트로크 유형의 엔진(NTK 25 AL L, ex Netter Vibration GmbH)은 6bar, 11Hz 및 30mm의 진폭에서 작동되었다. 15초의 4회 사이클을 사용하여 분말을 시트에 분산시켰다. 과립은 시트의 전체 두께에 걸쳐 분포되었다. 또한, 시트 표면의 분포도 균질했다.

9개의 다른 반응성 중합체 분말을 테스트했다. 이들 분말은 NHS-POx 형태 또는 펜타에리트리톨 폴리(에틸렌글리콜)에테르 테트라숙신이미딜 글루타레이트(NHS-PEG) 형태(예: NOF America Corporation)의 반응성 친전자성 기를 보유하는 수용성 중합체를 함유하였다. 반응성 중합체 분말 중 일부는 NHS-POx 또는 NHS-PEG 외에 NHS-POx 및 NHS-PEG의 반응성 NHS-기와 반응할 수 있는 반응성 친핵성 기를 보유하는 중합체를 함유하는 과립이었다. 이들 과립의 제조는 이전에 본원에 기재되어 있다.

테스트한 과립은 다음과 같다.

NHS-POx / P188

NHS-POx/카보네이트

NHS-POx/젤리타 스폰

NHS-POx/NH2-PEG

NHS-POx/RXL(고염)

NHS-POx/RXL(저염)

NHS-POx/RXL(고염) 카보네이트 함유

NHS-PEG/RXL(저염)

NHS-PEG/NU-POx

테스트한 섬유성 담체 구조물과 반응성 중합체 분말의 다양한 조합이 표 4에 나와 있다.

생체 외 및 생체 내 포르신 출혈 모델에서 이러한 패치로 얻은 결과는 표 5에 요약되어 있다.

실시예 6

지혈 패치(Gelita Tuft-It®; 50 x 75 mm, 약 0.7 g)에 NHS-POx/NU-POx/P188 2.5%를 함침시켰다. 1g의 과립을 실시예 2에 기재된 바와 같이 패치 전체에 분포시켰다. 다음으로, 지혈 패치를 1g의 실리카를 함유하는 알루-알루 파우치에 포장하고, 진공 밀봉하였다.

패치는 생체내 포르신 헤파린화 모델에서 평가되었다. 그것들은 매우 우수한 응고와 충분한 접착 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다. P188이 포함되지 않은 동일한 패치와 달리 접착 특성이 감소하여 패치를 한 조각으로 제거할 수 있었다. 활성 출혈은 다양한 장기: 비장, 간 및 신장의 절제에서 효율적으로 중단되었다. 결과의 요약은 표 6에 나와 있다.

실시예 7

지혈 패치(Gelita Tuft-It®, 50 x 75 mm, 약 0.7 g)에 NHS-POx/NU-POx 또는 1.5%, 2.5% 또는 3.5% Pluronic P188을 각각 함유하는 NHS-POx/NU-POx/P188을 함침시켰다. 1g의 과립을 실시예 2에 기재된 바와 같이 패치 전체에 분포시켰다. 다음으로, 지혈 패치를 1g의 실리카를 함유하는 알루-알루 파우치에 포장하고, 진공 밀봉하였다.

패치는 비장 절제술(동맥 출혈)에 대한 생체내 포르신 헤파린화 모델에서 평가되었다. 결과는 표 7에 요약되어 있다.

NHS-POx/NU-POx/P188을 함유하는 패치는 NHS-POx/NU-POx를 함유하는 패치보다 "한 조각(one piece)"으로 적용 후 제거하기가 더 용이하였다.

실시예 8

반응성 NHS-POx/NU-POx 과립의 NU-POx 함량이 지혈 패치의 생체 내 성능에 미치는 영향을 측정하기 위해 실험을 수행했다.

함침 방법

지혈 패치(Gelita Tuft-It®; 50 x 75 mm, 약 0.7g)에 1:0.10, 1:0.20 및 1:0.40의 몰비로 아세톤 과립화를 통해 만든 반응성 NHS-POx/NU-POx 과립을 함침시켰으며, 상기 몰비는 NHS-POx에 의해 제공되는 NHS 기의 수 대 NU-POx에 의해 제공되는 아민기의 수의 비를 지칭한다. 동일한 지혈 패치에도 반응성 NHS-POx 분말이 함침되었다.

Fibroline SL-Preg 실험실 기계를 사용하여 1g의 과립/분말을 패치 전체에 분포시켰다. 다음으로, 지혈 패치를 고정시키고, 건조하고, 실리카 1g이 함유된 알루-알루 파우치에 포장하고, 진공 밀봉하였다.

기계

Fibroline SL-Preg 실험실 기계는 최대 60초 동안 최대 200Hz의 주파수에서 최대 40kV의 전압을 적용하여 전극 사이에서 입자를 이동시킨다. 두 전극판의 크기는 약 50x40cm이다. 상판은 접지되어 있다.

다음과 같은 표준 설정이 사용되었다: 40kV, 100Hz, 20초.

배열

어레이가 바닥 전극판에 장착된 후 분말을 3D 인쇄된 PMMA 어레이에 중량 측정 방식으로 투여했다. 어레이는 스크래핑 카톤(scraping carton) 또는 금속 주걱을 사용하여 반응성 중합체 분말로 채워졌다. 어레이는 50 x 75 x 4mm로 측정되었으며, 22x33 = 726개의 정사각형 웰을 함유하였다(각 웰의 내부 치수: 2 x 2 x 2mm). 726개 웰의 합한 부피는 약 5.8mL였다.

스페이서

스페이서 마스크가 어레이의 상부(top)에 배치되었다. 스페이서는 교류 전기장을 받을 때 입자가 위아래로 움직일 수 있도록 하는 데 사용되었다. 스페이서를 사용하지 않으면, 담체를 통한 침투 및 분포가 제한된다. TUFT-IT의 경우 이것은 3mm의 마스크였다. 그 결과 전극의 거리가 3 + 4mm = 7mm가 된다.

NHS-POx:NU-POx 과립(NU-POx의 0, 10, 20 및 40% 아민기, NHS-POx에 의해 제공되는 NHS 기의 수를 기준으로 백분율 계산)또는 NHS-POx 분말을 함유하는 지혈 패치의 생체 내 성능 POx)은 헤파린 처리되지 않은 생체 내 포르신 모델에서 평가되었다. 테스트된 패치의 세부 정보는 표 8에 나와 있다.

생체 내 테스트

테스트는 성체 암컷 돼지(pig)(40-50kg)를 대상으로 수행되었다. 항응고제를 사용하지 않았다. 패치 성능은 비장과 간 모두에서 테스트되었다. 비장이나 간은 검사 기간이 진행됨에 따라 필요에 따라 위치를 지정하고 외부화하였으며, 생리식염수를 적신 스폰지로 덮어 자연습도를 유지하였다.

다양한 유형의 부상이 생성되었다.

간: 찰과상, 생검 천공 및 절제

비장: 절제술

간 실질(parenchyma)의 적절한 크기의 섹션을 찰과상입히고/펀칭하여 중등도에서 중증의 출혈을 유발했다. 간 찰과상은 외과용 메스와 1 x 1 cm²의 템플릿 및 8 mm 원형 생검 천공을 사용하는 원형 천공에 의해 생성되었다. 간 및 비장 절제술은 외과용 칼을 사용하여 생성되었다.

패치는 조직 절제 또는 흉터 제거 직후에 적용되었다.

- 생검 천공 및 찰과상용 2 x 2cm 조각

- 절제를 위한 7.5 x 5 cm 패치 완성

테스트된 패치를 출혈 조직에 적용하고, 미리 적신 거즈와 식염수를 사용하여 압축하여 부드럽게 누른다. 탐포네이드는 처음 10초 동안 적용한 후 총 5분까지 30초 간격으로 적용했다.

함침되지 않은 TUFT-IT 패치를 기준으로 사용했다(TUFT-IT라고 함).

생체 내 시험의 결과는 표 9에 요약되어 있다.

패치 1 내지 4는 매우 강한 조직 접착력을 보인 반면, TUFT-IT 패치에서는 약한 접착력만 관찰되었다.

패치 1 및 2는 적용 후 매우 제한된 팽창 이상을 나타내지 않았다. 패치 3 내지 4는 더 많았지만 여전히 허용 가능한 팽창을 보여주었다.

실시예 9

지혈 패치(Gelita Tuft-It®; 50 x 75 mm, 약 0.7 g)에 NHS-POx, NHS-POx 분말 또는 NHS-POx/NU-POx 과립의 용액을 함침시켰다. 사용된 NHS-POx/NU-POx 과립은 1:0.20의 몰비로 아세톤 과립화를 통해 제조되었다(실시예 8 참조).

NHS-POx를 함유하는 분무 용액은 NHS-POx를 이소프로필 알코올과 디클로로메탄(200g/L)의 1:1 혼합물에 용해시켜 제조하였다. 단일 분무 사이클에서 유리 실험실 분무기와 가압 공기를 사용하여 이 분무 용액 5mL로 패치를 함침시켰다. 이러한 방식으로 전달된 NHS-POx의 총량은 패치당 1g이었다. 함침 후 패치를 40℃의 오븐에서 2시간 동안 건조시킨 후, 데시케이터에 2일 동안 보관한 후, 실리카 1g이 함유된 알루-알루 파우치에 포장하고, 진공 밀봉하였다.

추가로, 패치는 실시예 8에 기술된 절차를 사용하여 1g의 NHS-POx 분말 또는 1g의 NHS-POx/NU-POx 과립으로 함침되었다.

이렇게 제조된 패치의 성능은 경증(<20mL/분) 및 중증 출혈(>50mL/분) 조건에서 생체 외 간 관류 모델에서 3중으로 테스트되었다. 평평하고 둥근 회전식 마모 도구를 사용하여, 고무 온레이로 천공 출혈 깊이가 항상 3mm가 되도록 간 표면에 원형 출혈 상처(직경 8mm)를 생성하였다. 결과를 표 10에 나타내었다.

Claims

3차원 상호 연결된 간극 공간을 포함하는 방수성 응집성 섬유성 담체 구조물로서, 상기 섬유성 담체 구조물은 반응성 친핵성 기를 보유하는 친핵성 중합체를 함유하는 섬유를 포함하는, 방수성 응집성 섬유성 담체 구조물; 및

간극 공간 내에 분포된, 복수의 반응성 중합체 입자로서, 공유 결합의 형성 하에, 조직 및 혈액의 아민기 뿐만 아니라 친핵성 중합체의 반응성 친핵성 기와도 반응할 수 있는 적어도 3개의 반응성 친전자성 기를 보유하는 수용성 친전자성 중합체를 포함하며, 상기 반응성 중합체 입자는 0.5-100 ㎛ 범위의 직경을 갖고, 섬유성 담체 구조물의 적어도 3중량%의 양으로 존재하는, 복수의 반응성 중합체 입자
를 포함하는 생체적합성의 유연성 지혈 시트.
제1항에 있어서,
섬유성 담체 구조물의 섬유가 1 내지 500 ㎛의 평균 직경을 갖는 지혈 시트.
제1항 또는 제2항에 있어서,
섬유성 담체 구조물이 펠트 구조물, 직조 구조물 또는 편직 구조물, 바람직하게는 펠트 구조물인 지혈 시트.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
수용성 친전자성 중합체가 폴리옥사졸린, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리우레탄 및 이들의 조합으로부터 선택되는 지혈 시트.
제4항에 있어서,
수용성 친전자성 중합체가 폴리옥사졸린인 지혈 시트.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
반응성 친전자성 기가 카르복실산 에스테르, 설포네이트 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, p-니트로페닐 에스테르, p-니트로티오페닐 에스테르, 산 할라이드기, 무수물, 케톤, 알데히드, 이소시아네이토, 티오이소시아네이토, 이소시아노, 에폭시드, 활성화된 히드록실기, 올레핀, 글리시딜 에테르, 카르복실, 숙신이미딜 에스테르, 설포 숙신이미딜 에스테르, 말레이미도(말레이미딜), 에텐설포닐, 이미도 에스테르, 아세토 아세테이트, 할로 아세탈, 오르토피리딜 디설피드, 디히드록시-페닐 유도체, 비닐, 아크릴레이트, 아크릴아미드, 요오도아세트아미드 및 이들의 조합으로부터 선택되는 지혈 시트.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
반응성 중합체 입자가 수용성 친전자성 중합체를 적어도 10중량% 함유하는 지혈 시트.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
반응성 중합체 입자가 (i) 수용성 친전자성 중합체를 함유하는 친전자성 입자; 및 (ii) 친핵성 가교제를 함유하는 친핵성 입자를 포함하는 입자 응집체인 지혈 시트.
제8항에 있어서,
친전자성 입자가 수용성 친전자성 중합체를 적어도 30중량%, 보다 바람직하게는 적어도 50중량%, 및 가장 바람직하게는 적어도 80중량% 함유하는 지혈 시트.
제8항 또는 제9항에 있어서,
친핵성 입자가 친핵성 가교제를 적어도 30중량%, 보다 바람직하게는 적어도 50중량%, 및 가장 바람직하게는 적어도 80중량% 함유하는 지혈 시트.
제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
반응성 중합체 입자가 하기 조성을 가지며,

50-95 중량% 적어도 3개의 반응성 친전자성 기를 보유하는 수용성 친전자성 중합체;

5-50 중량% 친핵성 가교제;

0-50 중량% 다당류;
여기서 성분 (a) 내지 (c)의 조합은 함께 반응성 중합체 입자의 적어도 80중량%, 보다 바람직하게는 적어도 90중량%를 구성하는 지혈 시트.
제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
반응성 중합체 입자는 수용성 친전자성 중합체에 의해 제공되는 반응성 친전자성 기의 총 수와 친핵성 가교제에 의해 제공되는 반응성 친핵성 기의 총 수 사이의 비가 25:1 내지 1:1 범위, 보다 바람직하게는 18:1 내지 2:1 범위, 및 가장 바람직하게는 12:1 내지 2.5:1 범위에 있는 양으로 수용성 친전자성 중합체 및 친핵성 가교제를 함유하는 지혈 시트.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
친핵성 중합체는 단백질, 키토산, 반응성 친핵성 기를 보유하는 합성 중합체, 반응성 친핵성 기를 보유하는 탄수화물 중합체 및 이들의 조합으로부터 선택되는 지혈 시트.
제13항에 있어서,
친핵성 중합체는 젤라틴, 콜라겐, 키토산 및 이들의 조합으로부터 선택되는 지혈 시트.
제14항에 있어서,
친핵성 중합체는 젤라틴, 바람직하게는 가교 젤라틴인 지혈 시트.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
섬유성 담체 구조물이 친핵성 중합체를 적어도 50중량% 포함하는 지혈 시트.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
시트는 25-200 mg/㎤의 비압축 밀도를 갖는 지혈 시트.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 지혈 시트를 함유하는 밀봉된 패키지.
제1항 내지 제3항 및 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 정의된 방수성 응집성 섬유성 담체 구조물의 시트를 제공하는 단계;

제1항 및 제4항 내지 제12항 중 어느 한 항에 정의된 반응성 중합체 입자를 제공하는 단계; 및

섬유성 담체 구조물의 간극 공간 내에서 반응성 중합체 입자를 분포시키는 단계
를 포함하는 지혈 시트의 제조 방법.
제19항에 있어서,
분포된 반응성 중합체 입자를 포함하는 섬유성 담체 구조물을 습한 대기에 노출시켜 앞서 언급한 섬유의 반응성 친핵성 기를 반응성 중합체 입자 내의 반응성 친전자성 기와 반응시키는 지혈 시트의 제조 방법.