BRPI0810530B1 - composição, uso da mesma, biomaterial sintético, seu método de fabricação e kit para formar o mesmo - Google Patents

Description

(54) Título: COMPOSIÇÃO, USO DA MESMA, BIOMATERIAL SINTÉTICO, SEU MÉTODO DE FABRICAÇÃO E KIT PARA FORMAR O MESMO (51) Int.CI.: A61L 15/58; A61L 31/02; C08L 71/02 (30) Prioridade Unionista: 13/04/2007 US 60/911,737 (73) Titular(es): KUROS BIOSURGERY AG (72) Inventor(es): ANNEMIE REHOR; SIMONA CERRITELLI

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para COMPOSIÇÃO, USO DA MESMA, BIOMATERIAL SINTÉTICO, SEU MÉTODO DE FABRICAÇÃO E KIT PARA FORMAR O MESMO.

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a biomateriais, especialmente selantes teciduais poliméricos e a moléculas precursoras capazes de formar biomateriais, especialmente selantes teciduais poliméricos e a métodos de preparação e a uso dos mesmos. Em particular, a presente invenção refere-se a biomateriais para selagem ou bloqueio de dilacerações, cortes, ou abrasões de tecido.

Antecedentes da invenção

Enquanto realiza procedimentos médicos como parte de uma intervenção cirúrgica ou tratamento de ferimentos, um médico deve frequentemente lidar com extravasamento de fluidos corporais, como fluidos cerebroespinhais durante cirurgia cerebral ou espinhal, ou sangue resultante de um ferimento, doença ou distúrbio ou de um procedimento cirúrgico. A restauração de tecido e integridade circulatória é importante para um resultado positivo de um tratamento independente de ser o dano resultado de um ferimento ou de um procedimento cirúrgico.

O método mais antigo de juntar tecidos feridos é o uso de pren20 dedores mecânicos como pregadores, grampos, ou suturas. Prendedores de tecidos mecânicos sofrem de uma variedade de limitações. Prendedores mecânicos exigem habilidade significativa, consomem tempo para aplicar e podem vazar ao longo da linha de junção, o que pode em si causar trauma adicional ao tecido circundante. Além disso, prendedores mecânicos podem ser ineficazes em vários órgãos altamente vascularizados. Estas desvantagens tornam mais lento o procedimento cirúrgico e o tempo de cicatrização.

Tentativas para superar estas desvantagens resultaram no desenvolvimento de adesivos, colas ou selantes capazes de unirem, rapidamente, superfícies de tecidos, sozinhos, ou em combinação com fixação mecânica, promovendo, ou pelo menos não inibindo, a cicatrização normal, e reduzindo ou prevenindo a perda de fluidos corporais.

Uma classe comum de adesivos teciduais é a de materiais com

Petição 870180029271, de 12/04/2018, pág. 8/17 bases em fibrina, que contêm um concentrado de fibrinogênio e trombina. Os adesivos de fibrina são tipicamente adesivos de dois componentes que quando misturados com uma fonte de cálcio reagem para simular os últimos estágios da cascata de formação de coágulo de sangue de ocorrência natural. O coágulo resultante adere ao tecido e liga tecidos, aberturas e tecido de selagem até ocorrer cicatrização. No entanto, adesivos com bases em fibrina tiveram sucesso limitado devido à baixa resistência dos materiais de selagem e o risco de transfecção associado ao uso de produtos derivados de sangue humano.

Colas com bases em gelatina reticulada com um aldeído também tiveram sucesso limitado. Representante desta classe de colas são gelatina-resorcinol reticulado com formaldeído (GRF) ou glutaraldeído (GRFG). Embora colas com bases em gelatina tenham sido extensivamente estudadas e mostraram ser eficazes, de maneira geral, estas composições tiveram sucesso limitado devido ao uso de soluções quentes de gelatina, irritação de tecido associada com o aldeído e a criticalidade dos procedimentos de manuseio necessários para a obtenção de reticulação apropriada no local da junção.

Devido às limitações descritas acima, um esforço de desenvolvimento considerável foi direcionado para a descoberta de uma composição sintética adequada para utilização como colas ou selantes teciduais. Para isso, cianoacrilatos, poliuretanos, polimetilmetacrilatos e polietileno glicóis, entre outros polímeros sintéticos,foram investigados como colas ou selantes teciduais com sucesso limitado. Existem poucas colas ou composições selantes teciduais que satisfazem as exigências de resistência mecânica e biocompatibilidade, além de propriedades de manuseio consistentes com uma grande variedade de fixações cirúrgicas.

Entretanto, estas composições apresentam desvantagens com relação ao manuseio e propriedades mecânicas como inchamento do biomaterial. Assim, existe uma necessidade de um biomaterial que possa ser aplicado como uma cola ou selante tecidual que não seja somente biocompatível, mas que tenha também uma cura bem-definida e apresente uma combi3 nação das propriedades mecânicas requeridas.

É, portanto, um objetivo da presente invenção prover composições, métodos e kits adequados para formar biomateriais sintéticos para uso como selante tecidual. É, ainda, outro objetivo da invenção, prover um biomaterial sintético para uso como selante tecidual que apresente baixo aumento de volume devido à absorção de água. É ainda, outro objetivo da invenção prover um biomaterial sintético para uso como selante tecidual, que seja completamente ressorvível ao longo do tempo. É, ainda, outro objetivo da invenção prover um biomaterial sintético com boa resistência mecânica para uso como selante tecidual. É, ainda, outro objetivo da invenção prover um biomaterial sintético que possa servir potencialmente como um auxiliar para reparo suturado de lesão durai durante cirurgia craniana e reduzir ou evitar vazamento de fluido cerebroespinhal para o ambiente externo.

Sumário da invenção

Composições e métodos para fabricação de biomateriais para uso como selantes teciduais, kits contendo moléculas precursoras para formação dos biomateriais, e o uso de biomateriais em fixações cirúrgicas são aqui descritos. As composições, que são usadas para fabricação dos biomateriais, incluem pelo menos uma primeira e uma segunda moléculaa precursoraa. A primeira molécula precursora contém pelo menos dois grupos nucleofílicos, e a segunda molécula precursora contém pelo menos dois grupos eletrofílicos. Os grupos nucleofílico e eletrofílico da primeira e da segunda moléculas precursoras são capazes de formar ligações covalentes uns com os outros em condições fisiológicas. A reticulação ocorre preferivelmente em água em condições básicas. As moléculas precursoras são selecionadas com base nas propriedades desejadas do biomaterial. Em uma modalidade, a primeira molécula precursora é um polímero com base em poli(etileno glicol) tendo x grupos nucleofílicos selecionados no grupo que consiste em grupos tiol ou amino, em que x é maior ou igual a 2. Preferivelmente, os x grupos nucleofílicos são grupos tiol. Preferivelmente a segunda molécula precursora é um copolímero em bloco poli(óxido de etileno-óxido de polipropileno) (PEO-PPO) multirramifiçado funcionalizado em cada uma de suas ramificações com grupos insaturados conjugados e a segunda molécula precursora é da fórmula geral I:

A-[(C₃H6O)n-(C2H₄O)_m-B]i (Fórmula I) em que m e n são inteiros de 1 a 200, i é superior a 2, preferivelmente 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, A é um ponto de ramificação, B é um grupo conjugado insaturado, por exemplo, acrilato.

Esses polímeros são vendidos pela BASF com o nome comercial Tetronic®.

Em uma modalidade preferida, a primeira molécula precursora é um poli(etileno glicol) (PEG) de quatro ramificações funcionalizado em cada uma de suas ramificações por um grupo tiol (pentaeritritol poli(etileno glicol)éter tetrassulfidrila PEG tetratiol). Em uma modalidade mais preferida, pentaeritritol poli(etileno glicol)éter tetrassulfidrila tem um peso molecular em uma faixa de cerca de 2 a 20 kD, mais preferivelmente em uma faixa de cerca de 3 a 11 kD e ainda mais preferivelmente em uma faixa de cerca de 5 a 10 kD. Em outra modalidade, os grupos insaturados conjugados B da segunda molécula precursora são grupos acrilato. Preferivelmente, o ponto de ramificação A da segunda molécula precursora é selecionado no grupo que consiste em carbono, glicerol, pentaeritritol, dipentaeritritol e etileno diamina. Mais preferivelmente, o ponto de ramificação A da segunda molécula precursora é etileno diamina. A segunda molécula precursora de fórmula I tem um peso molecular na faixa de cerca de 10 a 25 kD, mais preferivelmente na faixa de cerca de 12 a 20 kD e ainda mais preferivelmente na faixa de cerca de 14 a 18 kD. Preferivelmente, cada uma das ramificações da primeira ou segunda molécula precursora possui o mesmo grau de polimerização. Isto significa que cada ramificação da primeira ou da segunda molécula precursora possui um peso molecular idêntico.

A escolha de moléculas precursoras em que a soma do número de grupos nucleofílicos e grupos eletrofílicos é superior ou igual a cinco, resulta na formação de uma rede tridimensional. Opcionalmente, a composição contém um ou mais aditivos, como colorantes, agentes tixotrópicos, agentes radiopacos, cargas, estabilizantes ou agentes bioativos. Em uma modalidade preferida, a composição contém um colorante selecionado no grupo de azul de metileno, verde de lissamina ou verde rápido. Também opcionalmente, a composição contém uma base. Em uma modalidade, a base é carbonato de sódio. Na modalidade preferida, os biomateriais formados a partir das composições são usados para reduzir, inibir, ou conter a perda de fluidos corporais, como perda de fluido cerebroespinhal após cirurgia cerebral ou espinhal. Em uma modalidade preferida, as composições são usadas como selante médico. Em outra modalidade preferida, as composições são usadas para revestir a superfície de um tecido. Em outra modalidade, as composições são usadas para a fabricação de um medicamento para efetuar a fixação não-cirúrgica de uma primeira superfície e de uma segunda superfície.

Para preparar os biomateriais da presente invenção, um método para fabricação do biomaterial compreende as etapas de:

i) prover uma primeira molécula precursora ii) prover uma segunda molécula precursora iii) reagir as duas moléculas precursoras na presença de uma solução básica para formar uma rede tridimensional reticulada.

Preferivelmente a solução básica tem um pH em uma faixa de 9 a 14, mais preferivelmente em uma faixa de 10 a 13 e ainda mais preferivelmente em uma faixa de 10 a 12. O pH da solução resultante de cada uma das etapas i), ii) ou iii) fica preferivelmente em uma faixa de 9 a 13, mais preferivelmente entre 9,5 e 11,5 e ainda mais preferivelmente entre 9,8 e 11 para permitir gelificação rápida. Preferivelmente, a solução básica é uma solução de carbonato de sódio. Após pôr em contato as duas moléculas precursoras e a solução básica, o biomaterial é rapidamente formado; preferivelmente o biomaterial é formado em menos de dois minutos, mais preferivelmente em menos de 10 segundos e ainda mais preferivelmente em menos de 5 segundos.

As moléculas precursoras podem ser armazenadas separadamente como pós secos e/ou em soluções tamponadas, tendo tipicamente um pH ácido. Em uma modalidade preferida, a primeira molécula precursora é armazenada como pó seco em um primeiro recipiente e a segunda molécula precursora é armazenada em uma solução aquosa tamponada tendo um pH ácido em um segundo recipiente. Opcionalmente, a base pode ser armazenada em solução em um terceiro recipiente. As moléculas precursoras podem ficar em contato por minutos ou horas antes do uso. Em uma modalidade, a primeira molécula precursora e a segunda molécula precursora são mantidas separadas e somente são misturadas antes da transferência da mistura resultante para uma seringa de compartimento duplo. Um compartimento da seringa inclui a mistura das moléculas precursoras e o outro compartimento, a solução básica. Para preparar um biomaterial com as características exigidas, o controle da concentração das moléculas precursoras antes da reticulação é um importante parâmetro. Para manter este controle, a seringa de compartimento duplo pode conter dois compartimentos com uma razão volumétrica predefinida. Preferivelmente a razão volumétrica dos compartimentos é de 1 :5 e mais preferivelmente 1 :10. O compartimento maior contém a mistura das moléculas precursoras e o compartimento menor, a solução básica. A seringa de compartimento duplo é equipada com um cabeçote de spray destacável e os conteúdos dos dois compartimentos são pulverizados em conjunto para formar o biomaterial com uma rede tridimensional in situ, no local de necessidade do corpo.

Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1 mostra um gráfico linear de uma comparação de percentagem de inchamento versus tempo de formulações representativas dos biomateriais divulgados e um biomaterial comercialmente disponível quando armazenado em solução salina tamponada com fosfato a 37°C.

A figura 2 mostra um gráfico linear de uma comparação de percentagem de inchamento versus tempo de formulações representativas dos biomateriais divulgados e um biomaterial comercialmente disponível quando armazenado em solução salina tamponada com fosfato a 50°C.

A figura 3 mostra a influência do tampão no tempo de gelificação para a composição 10 preparada com tampão TEA em pH 7,4, 8 e 8,5.

A figura 4 mostra a influência do tampão no tempo de gelificação para a composição 13 preparada com um tampão de borato em pH 9,13, 9,32 e 9,47.

Descrição Detalhada da Invenção

Definições

Biocompatibilidade ou biocompatível, aqui neste contexto, refere-se à capacidade de um material ter uma resposta apropriada ao hospedeiro em uma aplicação específica. No sentido mais amplo, isto significa uma ausência de efeitos adversos ao corpo de maneira a aumentar o benefício do material e/ou tratamento para o paciente.

Biomaterial ou composição, neste contexto, refere-se a um material projetado para fazer uma interface com sistemas biológicos para preferivelmente avaliar, tratar, ou selar, qualquer tecido, órgão ou função do corpo. Biomaterial refere-se ao material completo (moléculas precursoras mais todos os aditivos, base ou solventes e agentes bioativos, se houver) no momento e após ter alcançado e passado de seu ponto de gelificação. Composição refere-se ao material completo antes de ter atingido seu ponto de gelificação.

Concentração de componentes precursores neste contexto refere-se a percentual em massa, sendo definida como a massa do soluto em gramas multiplicada por 100 dividida pela massa da solução total em gramas, (isto é, soma de solvente e soluto): % em massa = massa de soluto (100) / massa da solução total.

Ligação insaturada conjugada pode se referir à alternância de ligações múltiplas com ligações simples de carbono-carbono, carbono- heteroátomo ou heteroátomo-heteroátomo. Duplas ligações espaçadas por uma unidade de CH ou CH2 são referidas como duplas ligações homoconjugadas.

Reticulação, neste contexto significa a formação de ligações cova lentes.

Densidade de reticulação neste contexto significa o peso molecular médio entre duas reticulações (M_c) das respectivas moléculas.

Grupo eletrofílico neste contexto, refere-se a grupos funcionais que são capazes de aceitar um par de elétrons de um nucleófilo em uma reação de formação de ligação polar. Os termos eletrófilo e grupo eletrofílico são usados como sinônimos.

Funcionalidade neste contexto significa o número de sítios reativos em uma molécula precursora.

Sítios reativos se referem a grupos nucleofílicos e eletrofílicos que são capazes de reagir uns com os outros pelo menos, mas não exclusivamente, nas condições do corpo humano ou de animal.

Gel refere-se ao estado da matéria entre líquido e sólido. Assim, um gel tem algumas das propriedades de um líquido (isto é a forma é resiliente e deformável) e algumas das propriedades de um sólido (isto é a forma é discreta o suficiente para manter três dimensões em uma superfície bidimensional).

Ponto de gel neste contexto refere-se ao ponto onde o módulo viscoso e o módulo elástico se cruzam e a viscosidade aumenta. Assim, o ponto de gel é o estágio em que um líquido começa a tomar as características semissólidas de um gel.

Formação in situ neste contexto refere-se à capacidade das misturas de moléculas precursoras que são substancialmente nãoreticuladas antes e na ocasião da injeção de formarem ligações covalentes umas com as outras em uma temperatura fisiológica no local de injeção no corpo.

Peso molecular neste contexto refere-se ao peso molecular médio-peso de um número de moléculas em qualquer amostra dada, como usualmente utilizado na técnica. Assim, uma amostra de PEG 5 000 poderia conter uma mistura estatística de moléculas de polímero com peso na faixa de, por exemplo, 4 000 a 6 000 dáltons (D) com uma molécula diferindo ligeiramente da outra em uma faixa. Especificação de uma faixa de pesos moleculares indica que o peso molecular médio pode ser qualquer valor entre os limites especificados, e pode incluir moléculas singulares fora desses limites. Assim, uma faixa de pesos moleculares de cerca de 2 000 D a cerca de 20

000 D indica um peso molecular médio de pelo menos cerca de 2 000 D, indo até cerca de 20 kD.

Multifuncional neste contexto significa mais de um grupo funcional por molécula precursora.

Grupo nucleofílico neste contexto refere-se a grupos funcionais que são capazes de doar um par de elétrons a um eletrófilo em uma reação de formação de uma ligação polar. Preferivelmente o nucleófilo é mais nucleófilo do que H₂O em pH fisiológico. Um exemplo de um nucleófilo forte é um tiol e refere-se a moléculas que contêm estes grupos funcionais. Os termos nucleófilo e grupo nucleofílico são usados como sinônimos.

Oligômero e polímeros são usados no sentido usual dos termos. Um oligômero é um polímero de baixo peso molecular. Oligômeros tipicamente contêm entre duas e dez unidades monoméricas. Neste contexto, polímeros tipicamente contêm mais de 10 unidades monoméricas.

Polímero com base em poli(etileno glicol) refere-se a um polímero em que a cadeia ou cadeias poliméricas do polímero são predominante, preferível e completamente constituídas de poli(etileno glicol).

Fisiológicas neste contexto significam condições que podem ser encontradas em vertebrados vivos. Em particular, condições fisiológicas se referem às condições do corpo humano como temperatura, pH, etc. Temperatura fisiológica significa em particular uma faixa de temperaturas de 35°C a 42°C, preferivelmente cerca de 37°C em pressão atmosférica.

Rede polimérica neste contexto refere-se ao produto de um processo em que substancialmente todos os monômeros, oligômeros, ou polímeros usados como moléculas precursoras estão ligados por ligações intermoleculares, preferivelmente covalentes, através de seus grupos funcionais disponíveis para formar uma macromolécula.

Moléculas precursoras neste contexto refere-se a moléculas que formam a rede polimérica do biomaterial. Além da rede polimérica, o biomaterial pode conter aditivos e agentes ativos biológicos. Moléculas precursoras podem ser selecionadas entre monômeros, oligômeros e polímeros funcionalizados.

Contraparte respectiva neste contexto significa o parceiro de reação de uma dada molécula precursora. A contraparte respectiva ao grupo eletrofílico é o grupo nucleofílico e vice-versa.

Reação autosseletiva neste contexto significa que a primeira molécula precursora da composição reage muito mais rápido com a segunda molécula precursora da composição e vice-versa do que com outros compostos presentes na composição e/ou no local da reação. Neste contexto, o grupo nucleofílico da primeira molécula precursora preferencialmente se liga a um grupo eletrofílico da segunda molécula precursora ao invés de a outros compostos biológicos, e um grupo eletrofílico da segunda molécula precursora preferencialmente se liga ao grupo nucleofílico da primeira molécula precursora ao invés de a outros compostos biológicos.

Inchamento neste contexto refere-se à absorção de água dos biomateriais da presente invenção. Isto é uma função do aumento de massa do biomaterial no inchamento de equilíbrio, tipicamente após colocação do biomaterial em um excesso de tampão de PBS (10 mM de solução salina tamponada com fosfato, por exemplo, P3813-pó da Sigma fornece um tampão de fosfato a 0,01 M, cloreto de potássio a 0,0027 M e cloreto de sódio a 0,138 M, pH 7,4). Tipicamente o inchamento de equilíbrio é alcançado em 2 dias e é definido como o tempo que o biomaterial levou para alcançar sua massa máxima antes de sua degradação. Inchamento é medido dividindo a massa do biomaterial no inchamento de equilíbrio pela massa inicial do biomaterial 10 min após a reação de reticulação. Os termos absorção de água e inchamento são usados como sinônimos neste pedido.

Força coesiva refere-se à capacidade dos biomateriais da presente invenção permanecer em intactos, isto é não romperem, rasgarem ou trincarem, quando submetidos a tensões físicas ou condições ambientais, resistência coesiva e Resistência a rompimento são usadas como sinônimos neste pedido.

Resistência adesiva refere-se à capacidade dos biomateriais da presente invenção de serem capazes de permanecer fixados aos tecidos no local de administração quando submetidos a tensões físicas ou condições ambientais.

Composições

É fornecida uma composição para fabricação de um biomaterial reticulável in situ que pode ser preferivelmente usado para reduzir, prevenir ou conter a perda de fluido no corpo humano. A composição contém pelo menos uma primeira e uma segunda moléculas precursoras multifuncionais. Opcionalmente aditivos, colorantes e/ou agentes biologicamente ativos podem ser adicionados às moléculas precursoras para formar uma composição. A composição inclui moléculas precursoras mais qualquer aditivo e/ou ativo biológico e as moléculas precursoras podem polimerizar in situ no local de necessidade do corpo para formar a rede polimérica do biomaterial. A estrutura das moléculas precursoras é selecionada com base no tipo de biomaterial que é desejado.

A. Precursores

A primeira molécula precursora contém pelo menos dois grupos nucleofílicos, e a segunda molécula precursora contém pelo menos dois grupos eletrofílicos. A primeira e a segunda moléculas precursoras são selecionadas de modo que os grupos nucleofílico e eletrofílico sejam capazes de formar ligações covalentes umas com as outras em condições fisiológicas ou em condições básicas. Isto pode ser obtido por diferentes mecanismos de reação. Um mecanismo de reação é uma reação de substituição nucleofílica. Em outra modalidade, as moléculas precursoras formam ligações covalentes via uma adição de Michael entre grupos ou porções nucleofílicas da primeira molécula precursora e grupos ou porções insaturadas conjugadas da segunda molécula precursora. A reação de adição de Michael envolve a reação de um nucleófilo, como um grupo tiol, amina, ou hidroxila, com uma porção insaturada conjugada, como uma porção contendo carbonila α,β-insaturada.

Exemplos de moléculas precursoras incluem, mas não se limitam a, derivados de poliéter, como polioxialquilenos ou derivados dos mesmos, peptídeos, e polipeptídeos, copolímeros em bloco ou aleatórios poli(vinil pirrolidinona) (PVP), e poli(aminoácidos). Derivados de polioxialquilenos preferidos são polietileno glicol (PEG), óxido de polipropileno (PPO), óxido de polietileno (PEO), óxido de polietileno-co- óxido de polipropileno (PEO-PPO), copolímeros aleatórios ou em bloco de co -óxido de polietileno, poloxâmeros, meroxapols, poloxaminas e álcool polivinílico (PVA). Copolímeros em bloco ou homopolímeros (quando A=B) podem ser lineares (do tipo AB, ABA, ABABA ou ABCBA), estrela (A_nB ou BA_nC, onde B é pelo menos n-valente, e n é 3 a 6) ou ramificados (múltiplo as dependendo de B). Moléculas precursoras preferidas são selecionadas entre PEGs e copolímeros em bloco PEO-PPO. No máximo da preferência, PEGs e copolímeros em bloco PEO-PPO são aplicados em combinação um com o outro. A primeira molécula precursora preferida é um polímero com base em poli(etileno glicol) tendo x grupos nucleofílicos selecionados no grupo que consiste em grupos tiol ou amino, em que x é maior ou igual a 2. Preferivelmente, a segunda molécula precursora é um copolímero em bloco multirramificado poli(óxido de etileno-óxido de polipropileno) (PEO-PPO) de fórmula geral (I):

Α-[(0₃Η₆0)_η-(θ2Η₄0)_π-Β]ί (Fórmula I) em que m e n são inteiros de 1 a 200 i é maior que 2, preferivelmente 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 A é um ponto de ramificação

B é um grupo insaturado conjugado.

As moléculas precursoras são monômeros, oligômeros e/ou polímeros multifuncionais. Preferivelmente o peso molecular da primeira molécula precursora fica na faixa de 2 a 20 kD, mais preferivelmente de 3 a 11 kD, no máximo da preferência de 5 a 10kD. O peso molecular preferido da segunda molécula precursora fica preferivelmente entre 10 e 25kD, mais preferivelmente entre 12 e 20kD, no máximo da preferência entre 14 e 18kD.

Preferivelmente, o ponto de ramificação A da segunda molécula precursora é selecionado no grupo que consiste em carbono, glicerol, pentaeritritol, dipentaeritritol e etileno diamina. Em uma modalidade, o biomaterial é formado de um copolímero em bloco multirramificado poli(óxido de etilenoóxido de polipropileno) (PEO-PPO) de fórmula I em que A é uma molécula etileno diamina (isto é onde i é igual a 4) e B é um grupo acrilato (Tetronic®13 tetra-acrilato). Copolímeros em bloco poli(óxido de etileno-óxido de polipropileno) (PEO-PPO) de quatro ramificações com uma molécula núcleo etileno diamina são vendidos pela BASF com o nome comercial Tetronic®. Em uma outra modalidade, as composições incluem um tetra-acrilato Tetronic® tendo um peso molecular de cerca de 15 kD (Tetronic® 1107) e um PEG tetratiol com um peso molecular de cerca de 10 kD. Em outra modalidade, o biomaterial é formado a partir de tetra-acrilato Tetronic® tendo um peso molecular de cerca de 15 kD e um PEG tetratiol tendo um peso molecular de cerca de 5 kD. Em outra modalidade preferida, o biomaterial é formado a partir de um tetra-acrilato Tetronic® tendo um peso molecular de cerca de 15 kD e um PEG-ditiol linear com funcionalização terminal de peso molecular de cerca de 3,4 kD. Em ainda outra modalidade, o tetra-acrilato Tetronic® é reticulado com ditiotreitol (DTT). Características mecânicas do biomaterial (isto é resistência coesiva e resistência adesiva, inchamento e tempo de gelificação) são influenciadas pelo número de ramificações das moléculas precursoras e pelo comprimento dessas ramificações. Um alto número de ramificações em cada molécula precursora resultará em uma rede com reticulação mais densa tendo resistência coesiva maior. Entretanto, a ressorção do biomaterial resultante será mais lenta. O comprimento de cadeia da primeira molécula precursora tem uma influência no inchamento do biomaterial resultante. Cadeias mais longas de poli(etileno glicol) fornecerão um biomaterial mais inchável.

Preferivelmente as moléculas precursoras são simétricas, o que significa que as ramificações têm o mesmo peso molecular e estrutura.

A soma da funcionalidade da primeira e da segunda moléculas precursoras é superior a ou igual a cinco. Em uma modalidade, a primeira molécula precursora tem uma funcionalidade de quatro, e a segunda molécula precursora uma funcionalidade de três. Em outra modalidade, a primeira molécula precursora tem uma funcionalidade de dois, e a segunda molécula precursora uma funcionalidade de quatro. Em ainda outra modalidade, uma das moléculas precursoras tem uma funcionalidade de oito e a outra de quatro. Em ainda outra modalidade, ambas as moléculas precursoras possuem uma funcionalidade de quatro ou mais. Uma molécula precursora pequena e compacta formará uma rede polimérica com maior resistência do que uma molécula precursora extensa, embora a funcionalidade e o parceiro de reação possam ser os mesmos para ambas as moléculas.

Como uma diretriz geral, a razão entre os primeiro e segundo componentes é selecionada de modo que a maioria dos grupos funcionais de ambos os componentes reajam com as respectivas contrapartes. A razão dos grupos funcionais das primeira e segunda moléculas precursoras (isto é a razão de grupos eletrofílicos para grupos nucleofílicos fica na faixa de 0,7 a 1,2, mais preferivelmente entre 0,8 e 1,1 e no máximo da preferência 1 (isto é, razão estequiométrica).

a. Grupos nucleofílicos

Os grupos nucleofílicos do primeiro componente precursor são capazes de reagir com grupos eletrofílicos, como grupos insaturados conjugados em vários mecanismos de reação, preferivelmente autosseletivamente no corpo humano, através de uma substituição nucleofílica ou reação de adição de Michael. Os nucleófilos que são úteis são aqueles que são preferivelmente reativos a grupos insaturados conjugados via reações de adição, em particular em uma reação de adição de Michael autosseletiva, em condições do corpo humano ou animal. A reatividade do nucleófilo depende da identidade do grupo insaturado. A identidade do grupo insaturado é primeiramente limitada por sua reação com água em pH fisiológico. Assim, os nucleófilos úteis são, geralmente, mais nucleofílicos que a água em pH fisiológico. Nucleófilos adequados incluem, mas não se limitam a, -SH, -NH₂, -OH, -PH₂, e -CO-NH-NH₂

A utilidade de nucleófilos particulares depende da situação prevista e da quantidade de autosseletividade desejada. Na modalidade preferida, o nucleófilo é um tiol. No entanto, aminas e/ou grupos hidroxila podem também ser nucleófilos efetivos.

Deve-se prestar atenção particular ao pH, já que a amina ou tiol desprotonados são nucleófilos muito mais fortes do que a amina ou tiol protonado. Assim, se for dedicada atenção particular ao pK de uma amina ou tiol usado como o nucleófilo forte, autosseletividade substancial pode ser obtida. Condições de reação em que o pH da solução está próximo ao pK das aminas ou tióis das moléculas precursoras favorecem a reação do grupo insaturado conjugado com a amina ou tiol fornecido, ao invés de com outros nucleófilos presentes no sistema.

Os grupos nucleofílicos podem estar contidos em moléculas com grande flexibilidade na estrutura global. Por exemplo, um nucleófilo difuncional poderia ser apresentado na forma de Nuc-P-Nuc, onde P indica um monômero, oligômero ou polímero e Nuc refere-se ao nucleófilo. Da mesma forma, um polímero ramificado, P, poderia ser derivatizado com vários nucleófilos para criar P-(NuC)j., onde i é maior que 1. O nucleófilo poderia fazer parte da estrutura de repetição, por exemplo (P-NuC),. Claramente, nem todos os P ou os nucleófilos dessa estrutura precisam ser iguais.

Polietileno glicóis e seus derivados podem ser quimicamente modificados para conter grupos amino primário ou tiol múltiplos de acordo com métodos apresentados, por exemplo, no Capítulo 22 de POLY (ETHYILENE GLYCOL) CHEMISTRY: BIOTECHNICAL AND BIOMEDICAL APPLICATIONS, J. Milton Harris, ed., Plenum Press, NY (1992). Em uma modalidade mais preferida, o tiol presente nas extremidades da primeira molécula precursora é introduzido nos polímeros com bases em PEG pela substituição dos grupos hidroxila terminais por um grupo tiol (SH). A molécula precursora assim obtida reage mais rapidamente com a segunda molécula precursora do que com uma molécula precursora em que o grupo tiol é introduzido através de um grupo mercaptopropionato.

Várias formas de PEG multiamino são comercialmente disponíveis na Nektar Therapeutics, Inc. of San Carlos, Calif, (através de sua aquisição de Shearwater Polymers of Huntsville, Ala.), e da Texaco Chemical Company of Houston, Tex. com o nome Jeffamine. PEGs multiamino úteis na presente invenção incluem diaminas (série D) e triaminas (série T) Jeffamine da Texaco, que contêm dois e três grupos amino primários por molécula, respectivamente. Poliaminas como etilenodiamina (H₂N - CH2CH2 - NH2), tetrametilenodiamina (H₂N - (CH₂)4 - NH2), pentametilenodiamina (cadaverina) (H2N - (CH₂)₅ - NH₂) , hexametil- enodiamina (H₂N- (CH₂)6NH₂), bis(2-hidroxietil)amina (HN- (CH₂CH₂OH)₂), bis(2- aminoetil)amina (HN- (CH₂CH₂NH₂)₂), e tris(2-aminoetil)amina (N- (CH₂CH₂NH₂)3) podem também ser usados como o polímero sintético contendo grupos nucleofílicos múltiplos.

Ditiotreitol (HS-CH₂-CHOH-CHOH-CH₂-SH) podem também ser usados como o polímero sintético contendo grupos nucleofílicos múltiplos. Primeiras moléculas precursoras preferidas

Em uma modalidade preferida, a primeira molécula precursora é um PEG tetratiol de acordo com a fórmula II:

em que n fica na faixa de 25 a 60.

b. Grupos eletrofílicos

Os grupos eletrofílicos da segunda molécula precursora são preferivelmente grupos conjugados insaturados. Estruturas de P e dos grupos conjugados insaturados podem ser similares àquelas descritas acima para os nucleófilos. É somente necessário que um precursor eletrofílico contenha dois ou mais de tais grupos eletrofílicos. Em uma modalidade, os grupos eletrofílicos são grupos insaturados conjugados.

É possível realizar reações de adição nucleofílicas, em particular reações de adição de Michael em uma ampla variedade de compostos insaturados conjugados. Nas estruturas mostradas abaixo, uma estrutura monomérica, oligomérica ou polimérica é indicada como P. Várias possibilidades preferidas para a identidade específica de P são discutidas abaixo. P pode ser acoplado a grupos insaturados conjugados reativos, incluindo, mas não se restringindo, às estruturasem umeradas de 1 a 20 na Tabela 1.

Tabela 1: Estruturas conjugados	moleculares contendo P e grupos insaturados
X
	X= H, CH3, CN.COOW R= H, W, fenil-(Ph)
Ys P	Y = NH, O, 1,4-Ph W = cadeia alifática C1-C5
la
U AvzB	A, B = H, alquila
	R= H, alquila
II Ϊ	Y = O, NH, 1,4 Ph
lb

^Ρ X = Ν, CH

Ο

χ

Y-W	ΞΞΞ-— S-W II 0	fí ΞΞΖ S-W II 0
16	17	18

fí	?x	Y“ 0, NH
na—s-y.	—P—Y	x = íon de metal alcalino ou alcanino terroso
o w	o w
		W= P, 1,4-Ph-P
19	20

Duplas ligações reativas podem ser conjugadas a um ou mais grupos carbonila em uma estrutura linear de cetona, éster ou amida (1a, 1b, 2) ou a dois em um sistema de anel, como em um derivado maleico ou paraquinoide (3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10). No último caso, o anel pode ser fundido para fornecer uma naftoquinona (6, 7, 10) ou uma 4,7-benzimidazolodiona (8) e os grupos carbonila podem ser convertidos em uma oxima (9, 10). A dupla ligação pode ser conjugada a uma dupla ligação heteroátomo-heteroátomo, como uma sulfona (11), um sulfóxido (12), um sulfonato ou uma sulfonamida (13), ou um fosfonato ou fosfonamida (14). Finalmente, a dupla ligação pode ser conjugada a um sistema aromático deficiente em elétrons, como um íon

4-vinilpiridínio (15). Triplas ligações podem ser usadas em conjugação com ligações múltiplas com bases em carbonila ou heteroátomo (16, 17, 18, 19, 20).

Estruturas como 1a, 1b e 2 são com bases na conjugação de uma dupla ligação carbono-carbono com um ou dois grupos captadores de elétrons. Um deles é sempre uma carbonila, aumentando a reatividade, passando de uma amida para um éster e, então para uma estrutura de fenona. A adição nucleofílica é mais fácil na diminuição do impedimento estérico, ou no aumento do poder de captação de elétrons na posição alfa. Por exemplo, a seguinte relação existe, CH₃<H<COOW<CN, onde CH₃ tem o menor poder de captação de elétrons e CN tem o maior poder de captação de elétrons.

A reatividade mais alta obtida usando as duas últimas estruturas pode ser modulada variando o volume dos substituintes na posição beta, onde ocorre o ataque nucleofílico; a reatividade decresce na ordem P<W<Ph<H. Assim, a posição de P pode ser usada para modular a reatividade a nucleófilos. Esta família de compostos inclui alguns compostos cuja toxicologia e uso em medicina é bastante conhecido. Por exemplo, polímeros solúveis em água com acrilatos e metacrilatos em suas extremidades são polimerizados (por mecanismos de radical livre) in vivo. Assim, polímeros contendo acrilato e metacrilato tem sido usados no corpo em produtos clínicos, mas em um esquema de reação química dramaticamente diferente.

As estruturas 3-10 apresentam reatividade muito alta a nucleófilos, devido tanto à configuração cis da dupla ligação quanto à presença de dois grupos captadores de elétrons. Cetonas insaturadas reagem mais rápido do que amidas ou imidas, devido à eletronegatividade mais forte destes grupos carbonila. Assim, derivados de ciclopentenodiona reagem mais rápido do que os maleimídicos (3), e paraquinonas reagem mais rápido do que hidrazidas maleicas (4) e ciclo-hexanonas, devido à conjugação mais extensa. As naftoquinonas (7) apresentam a mais alta reatividade. P pode ser posto em posições onde ele não reduz a reatividade do grupo insaturado, que está na parte oposta do anel (3, 5), em outro anel (7, 8) ou ligado a O através de uma para-quinona mono-oxima (9, 10). Para reduzir a velocidade da reação de adição nucleofílica, P pode também ser ligado à dupla ligação reativa (6, 8). A ativação de duplas ligações para adição nucleofílica pode ser obtida usando grupos captadores de elétrons com bases em heteroátomo. Na realidade, análogos contendo heteroátomo de cetonas (11, 12), ésteres e amidas (13, 14) proporcionam comportamento de captação de elétrons similar. A reatividade à adição nucleofílica aumenta com a eletronegatividade do grupo. Assim, as estruturas possuem a seguinte relação, 11>12>13>14, onde 11 é o mais eletronegativo e 14 é o menos eletronegativo. A reatividade à adição nucleofílica é também aumentada pela ligação com um anel aromático. Uma forte ativação de duplas ligações pode também ser obtida, usando grupos captadores de elétrons com bases em anéis aromáticos. Qualquer estrutura aromática contendo um cátion similar a piridínio (por exemplo, derivados de quinolina, imidazol, pirazina, pirimidina, piridazina, e compostos similares contendo nitrogênio-sp2) polariza fortemente a dupla ligação e torna possível rápidas adições do tipo Michael.

Triplas ligações carbono-carbono conjugadas com grupos captadores de elétrons com bases em carbono ou heteroátomo podem facilmente reagir com nucleófilos de enxofre para fornecerem produtos de adição simples e dupla. A reatividade é influenciada pelos substituintes, em uma maneira similar a compostos análogos contendo dupla ligação discutidos acima. Em uma modalidade preferida, os grupos eletrofílicos são grupos acrilato.

Segundas moléculas precursoras preferidas

Na modalidade preferida, a segunda molécula precursora é um monômero, oligômero ou polímero que contém acrilatos. Em particular, o segundo precursor é um composto de acordo com a Fórmula Ia, como uma modalidade específica da Fórmula I:

//°

(Formula Ia) em que nem são inteiros de 1 a 200.

Preferivelmente, n fica em uma faixa de 18 a 22 e m fica em uma faixa de 58 a 62.

Tetronic® é um copolímero em bloco tetrafuncional com base em óxido de polietileno e óxido de polipropileno disponível da BASF. Copolímeros em bloco Tetronic® podem ser funcionalizados com grupos insaturados conjugados, como grupos acrilato, reagindo os grupos hidroxila livres do polímero com um excesso de cloreto de acriloíla na presença de uma base. Outro grupo eletrofílico pode ser adicionado de maneira similar.

c. Aditivos

A composição pode conter adicionalmente aditivos orgânicos e/ou inorgânicos, como agentes tixotrópicos, agentes radiopacos e/ou agentes fluorescentes para acompanhar o desempenho da aplicação ou para detectar instantaneamente o vazamento potencial que não for prontamente visível, estabilizantes para estabilização das moléculas precursoras para evitar polimerização prematura e/ou cargas que podem resultar em um aumento nas propriedades mecânicas (por exemplo, resistência máxima à compressão e módulo de Young E) do biomaterial comparado às propriedades mecânicas da rede polimérica. Exemplos de agentes de estabilização incluem eliminadores de radical, como hidroxitolueno butilado ou ditiotreitol.

Dependendo da aplicação, a composição (e, portanto, o biomaterial) pode conter um colorante, preferivelmente um colorante orgânico, como um corante. Em uma modalidade azul de metileno é adicionado como colorante. Azul de metileno não só age como um colorante , mas também age como um estabilizante para as moléculas precursoras contendo acrilato agindo como um agente de redução. Pode também agir como um indicador para formação de dissulfeto (já que ele se torna incolor com a redução). Em outra modalidade, verde rápido é adicionado como colorante. Outro colorante preferido é verde de lissamina. Verde de lissamina e verde rápido são colorantes que possuem a capacidade de alterar a cor devido ao pH da solução. Eles são verdes em condições ácidas e azul em condições básicas. Portanto, estes dois colorantes possuem a vantagem adicional de indicar a boa mistura das soluções de molécula precursora com a solução básica.

d. Bases

A reticulação in situ das primeira e segunda moléculas precursoras ocorre em condições básicas. Várias bases obedecem aos requisitos de catalisação da reação em condições fisiológicas e de não serem prejudiciais ao corpo do paciente, agindo assim como ativadores na formação do biomaterial. Bases adequadas incluem, mas não se restringem a, alquilaminas terciárias, como tributilamina, trietilamina, etildi-isopropilamina, ou N,N- dimetilbutilamina. Para uma dada composição (e principalmente dependente do tipo de moléculas precursoras), o tempo de gelificação é dependente do tipo de base e do pH da solução. Assim, o tempo de gelificação da composição pode ser controlado e ajustado à aplicação desejada variando o pH da solução básica. O aumento do pH da solução básica reduzirá o tempo de gelificação, mas também aumentará o tempo de degradação do biomaterial. Portanto, um compromisso entre tempo de gelificação e degradação tem de ser obtido. Em uma modalidade preferida, a base, como o ativador da reação de reticulação covalente é selecionada dentre soluções tampão aquosas que possuem seu pH e valor de pK na mesma faixa. A faixa de pK fica preferivelmente entre 9 e 13. Se a base possui dois valores de pK na faixa básica, o primeiro fica preferivelmente entre 8,5 e 10 e o segundo entre 10 e 13. Tampões adequados incluem, mas não se restringem a, carbonato de sódio, borato de sódio e glicina. Em uma modalidade, a base preferida é carbonato de sódio. Preferivelmente, a solução básica tem um pH em uma faixa de 9 a

14, mais preferivelmente na faixa de 10 a 13 e ainda mais preferivelmente em uma faixa de 10 a 12.

e. Agentes bioativos

O biomaterial pode também conter fatores bioativos, como pequenas moléculas ou proteínas peptídeos que podem se difundir vagarosamente a partir do biomaterial ajudando o tecido a se regenerar e cicatrizar. Nesses casos, o biomaterial funciona tanto como selante tecidual com propriedades regenerativas de tecido adicionais e como matriz de distribuição de fármaco. Os fatores bioativos e/ou pequenas moléculas podem simplesmente ser misturados no biomaterial ou podem ser covalentemente ligados ao biomaterial pela incorporação de um grupo tiol livre na molécula e liberados por degradação hidrolítica ou enzimática. Os fatores bioativos podem ser fatores de crescimento, preferivelmente aqueles da superfamília TGF beta e PDGF.

II. Biomateriais

Como mencionado acima, os requisitos de biomateriais, e portanto a escolha das moléculas precursoras, dependem da finalidade e sítio de aplicação no corpo. Em uma modalidade preferida, o biomaterial forma um revestimento, uma barreira ou selo que evita, reduz, ou contém a perda de fluido. Perda de fluido inclui, mas não se restringe à perda de qualquer fluido biológico ou gás como perda de sangue, perda de fluido cerebroespinhal ou perda de gás dos pulmões. O biomaterial pode ser aplicado internamente ou externamente ao corpo. Para esta finalidade, o biomaterial deve ter boa resistência adesiva e coesiva, um tempo de gelificação rápido adaptável, um baixo aumento de volume devido à absorção de água, bem como uma ressorção completa pelo corpo ao longo do tempo. Enquanto a estabilidade mecânica do biomaterial é essencialmente dependente da densidade de reticulação da rede polimérica, a absorção de água pelo biomaterial é influenciada pela ação recíproca da densidade de reticulação, e da hidrofobicidade da rede polimérica. Densidade de reticulação e natureza hidrofóbica do biomaterial são determinadas em uma extensão maior pela estrutura e razão dos componentes precursores. Portanto, absorção de água e desem24 penho mecânico do biomaterial podem ser controlados e influenciados pela escolha apropriada dos componentes precursores.

Características de Biomateriais

Em uma modalidade, o biomaterial é usado para selar a dura máter do cérebro ou espinha após ter sido cortada ou lesionada para evitar ou reduzir o vazamento de fluido cerebroespinhal para o ambiente externo após intervenção cirúrgica. A selagem pode ser feita como um complemento à sutura ou se a lesão á dura máter não for tão grande, o biomaterial pode ser usado como o único meio de fechamento para efetuar a fixação não cirúrgica de uma primeira superfície com uma segunda superfície. Na aplicação mais preferida, a composição é usada como um complemento à sutura no reparo durai após cirurgia craniana. Um fator que influencia o tempo de reação para formar o biomaterial para uso como um selante durai (referido como selante) é o pH da composição na ocasião da reticulação. As moléculas precursoras são dissolvidas em uma solução tampão aquosa com um pH entre 2 e 7,5, mais preferivelmente entre 4 e 5. Em uma modalidade preferida acetato de sódio com um pK de 4,76, fosfato de sódio com um pK1 de 2,15 e um pK2 de 7,2 ou ácido clorídrico (HCI) são empregados para preparar as soluções tamponadas ou para ajustar o pH das soluções de moléculas precursoras. Após ou durante a mistura das moléculas precursoras (e quaisquer aditivos e/ou agentes biologicamente ativos) uma base tem de catalisar a reação como um ativador. Preferivelmente a solução básica é usada como um ativador tendo pelo menos um de seus valores de pK em uma faixa de 9 a 13. Os mais preferidos são carbonato de sódio com um pK2 de 10,33 ou borato de sódio com pK1 de 9,23 e pK2 de 12,74. Adicionalmente borato de sódio tem propriedades antissépticas e é também por essa razão vantajosamente usado para aplicações a feridas. Em outra modalidade glicina, pode ser usada como ativador com um pK2 de 9,78. Preferivelmente, a composição na ocasião da reticulação tem um pH em uma faixa de 9 a 13, mais preferivelmente em uma faixa de 9,5 a 11,5, ainda mais preferivelmente em uma faixa de 9,8 a 11 e ainda mais preferivelmente em uma faixa de 10,3 a 10,6.

A composição usada como selante durai tem de ter um tempo de reticulação muito rápido para ficar no lugar e evitar imediatamente o vazamento. Preferivelmente, a composição se reticula em menos de dois minutos, ainda mais preferivelmente em menos de um minuto e no máximo da preferência entre 5 e 20 segundos e ainda mais preferivelmente entre 1 e 5 segundos.

O inchamento do biomaterial deve ser limitado já que o inchamento pode resultar em pressão nos tecidos resultando em compressão do nervo ou isquemia. Como definido anteriormente, o inchamento do selante não deve exceder 1,5 e preferivelmente é menor do que 1, mais preferivelmente menor que 0,5. O mais preferido é o inchamento que resulta em um valor na faixa de 0,1 a 1,5, mais preferivelmente em uma faixa de 0,1 a 1 e ainda mais preferivelmente de 0,1 a 0,8. Em uma modalidade preferida, pelo menos uma das moléculas precursoras tem como espinha dorsal uma molécula mais hidrofóbica do que polietileno glicol. Por exemplo, em uma modalidade, a primeira molécula precursora tem uma espinha dorsal de PEG em combinação com um copolímero em bloco PEO/PPO como espinha dorsal da segunda molécula precursora. Preferivelmente ambas as moléculas precursoras possuem um número de ramificações com funcionalidade terminal de três ou mais. No máximo da preferência ambas as moléculas precursoras contêm quatro ramificações com funcionalidade terminal. Preferivelmente a primeira molécula precursora é um PEG tetratiol (Fórmula II) tendo um peso molecular entre 4 kD e 11 kD mais preferivelmente entre 5kD e 10kD. O segundo componente precursor preferivelmente é um tetra-acrilato Tetronic® (Fórmula I) tendo um peso molecular entre 10kD e 20kD, mais preferivelmente de cerca de 15kD. Em particular, boas propriedades de um material selante devem ser obtidas combinando um PEG tetratiol de 5kD ou 10kD com um tetra-acrilato Tetronic®. A concentração da segunda molécula precursora (o precursor eletrofílico) que forma o biomaterial fica na faixa de 8 % a 18% em p/p , mais preferivelmente entre 10% e 16% em p/p e no máximo da preferência entre 12% e 14% em p/p. A concentração da primeira molécula precursora (molécula precursora nucleofílica) é calculada e ajustada de acordo com a razão desejada de grupos funcionais entre a primeira e a segunda moléculas precursoras. As faixas de concentração das moléculas precursoras também possuem um impacto significativo no inchamento, gelificação e tempo de ressorção do biomaterial e por esta razão a faixa ótima é de importância para as propriedades finais do selante. O início do processo com uma baixa concentração das moléculas precursoras aumentará o tempo de gelificação, mas resultará em um biomaterial que inchará menos. Em outra modalidade, o biomaterial se degradará in vivo em menos de 12 semanas.

III. Métodos de formação de biomateriais

A. Armazenamento

A primeira e a segunda moléculas precursoras são preferivelmente armazenadas em solução com exclusão de oxigênio e a baixas temperaturas, por exemplo de cerca de +4°C, para evitar decomposição dos grupos funcionais antes do uso. As moléculas precursoras podem ser armazenadas como pó seco ou como solução em um tampão. Em uma modalidade, as duas moléculas precursoras são armazenadas como solução em um tampão ácido de acetato de sódio. Em outra modalidade a primeira molécula precursora é armazenada como pó seco e a segunda molécula precursora é armazenada em uma solução tendo pH ácido.

B. Preparação de composição para selante tecidual

A composição que forma um biomaterial, em particular um selante tecidual pode ser preparada pelo seguinte método geral:

a) prover pelo menos uma primeira molécula precursora multifuncional contendo pelo menos dois grupos nucleofílicos, preferivelmente quatro grupos nucleofílicos, que opcionalmente inclui aditivos e/ou agentes biologicamente ativos;

b) prover pelo menos uma segunda molécula precursora multifuncional contendo pelo menos dois grupos eletrofílicos, preferivelmente quatro grupos eletrofílicos capazes de formar ligações covalentes com os grupos nucleofílicos da etapa a) em condições fisiológicas, que opcionalmente inclui aditivos e ou agentes biologicamente ativos;

c) dissolver as moléculas precursoras das etapas a) e b) em uma solução tampão, preferivelmente tendo um pH ácido;

d) misturar as soluções de moléculas precursoras obtidas na etapa c); e

e) adicionar uma solução básica durante a etapa d) ou depois, preferivelmente uma solução tampão aquosa com um valor de pH entre 9 e 13 para iniciar a reação de reticulação entre as soluções das primeira e segunda moléculas precursoras.

Em uma modalidade preferida, um método para preparação de biomaterial inclui as etapas de:

i) Prover uma primeira molécula precursora que é um polímero com base em poli(etileno glicol) tendo x grupos terminais tiol, em que x é igual a 2 ou mais que 2, preferivelmente 3, 4, 5, 6, 7 ou 8;

ii) prover uma segunda molécula precursora da fórmula geral:

A-[(C₃H₆O)_n-(C₂H₄O)_m-B]_i em que m e n são inteiros de 1 a 200;

i é maior do que 2, preferivelmente 3, 4, 5, 6, 7 ou 8;

A é selecionado no grupo que consiste em carbono, glicerol, pentaeritritol, dipentaeritritol e etileno diamina;

B é um grupo insaturado conjugado;

iii) reagir as moléculas precursoras das etapas i) e ii) na presença de uma base para formar uma rede tridimensional reticulada.

Quando as primeira e segunda moléculas precursoras são misturadas, a reticulação ocorre com baixa velocidade (de 10 minutos a horas) se o pH da solução for ácido. Para evitar que a mistura atinja o ponto de gelificação antes da administração e para formar o biomaterial em um tempo rápido predefinido é, portanto, necessário armazenar as moléculas precursoras em solução com um pH ácido. Preferivelmente, o pH da solução fica em uma faixa de 2 a 6 e mais preferivelmente em uma faixa de 2,5 a 5,5. Soluções ácidas preferidas são obtidas com uma solução tampão de acetato ou solução de ácido clorídrico.

Em uma modalidade preferida, as primeira e segunda moléculas precursoras são dissolvidas em uma solução tampão tendo um pH ácido. Em outra modalidade preferida, a primeira molécula precursora é um pó seco, a segunda molécula precursora é dissolvida em uma solução tampão tendo um pH ácido e as duas moléculas precursoras são misturadas antes de entrarem em contato com a base. As primeira e segunda moléculas precursoras e quaisquer aditivos e/ou agentes biologicamente ativos, se presentes, podem opcionalmente ser esterilizados antes da mistura. Isto é feito, preferivelmente, por filtração estéril dos componentes precursores e qualquer outro componente solúvel e por irradiação gama de componentes insolúveis em água. As moléculas precursoras obtidas nas etapas a), b) e/ou a mistura obtida na etapa d) podem ser armazenadas durante um tempo prolongado, preferivelmente em baixas temperaturas. Antes da aplicação, as moléculas precursoras (e outros componentes, se presentes) são misturadas umas com as outras, e em seguida com uma solução básica como ativador. Com a introdução da solução básica, a composição rapidamente se gelifica. Preferivelmente, a composição, incluindo a solução básica, tem um pH em uma faixa de 9 a 13, mais preferivelmente em uma faixa de 9,5 a 11,5, ainda mais preferivelmente em uma faixa de 9,8 a 11 e ainda mais preferivelmente em uma faixa de 10,3 a 10,6 para permitir que a gelificação ocorra em menos de 2 minutos, preferivelmente em menos de 10 segundos e mais preferivelmente em menos de 5 segundos. Existem diferentes modos de mistura. Em uma modalidade, três seringas, uma contendo o precursor nucleofílico, outra contendo o precursor eletrofílico, e a terceira contendo a solução básica, podem ser interconectadas usando um dispositivo conector de três vias. Os conteúdos das três seringas são misturados sendo pressionados através de um misturador estático na saída do dispositivo conector de três vias. A composição é injetada diretamente em um local com necessidade de tratamento no corpo, conectando o misturador estático a uma agulha de injeção. Em uma segunda modalidade, uma das soluções de moléculas precursoras é misturada com a solução básica. Isto é feito, preferivelmente conectando a seringa contendo a solução básica à seringa contendo preferivelmente o precursor eletrofílico (opcionalmente contendo também aditivos e/ou agentes ativos biológicos) por meio de um dispositivo conector, que permite uma mistura seringa a seringa dos respectivos conteúdos. Um misturador estático pode fazer parte do dispositivo conector. A mistura se completa quando é alcançada uma mistura homogênea. Após mistura, uma seringa contém uma mistura de base/ molécula precursora e a outra seringa está vazia. Então, a seringa vazia é removida do dispositivo conector e substituída pela seringa contendo a outra molécula precursora opcionalmente contendo também aditivos e/ou agentes ativos biológicos. Novamente, mistura seringa a seringa é uma maneira de obter uma mistura homogênea dos dois conteúdos. Subsequentemente a seringa contendo a mistura é conectada à agulha de injeção e a composição é injetada no local do corpo que a necessita.

Alternativamente, a seringa contendo a mistura base/precursor e a seringa contendo o outro precursor são ligadas por meio de um dispositivo conector de duas vias contendo um misturador estático em sua saída. O dispositivo conector de duas vias pode ser uma seringa de compartimento duplo. Os conteúdos são misturados comprimindo os conteúdos das seringas através do misturador estático. O misturador estático é diretamente ligado à agulha de injeção ou a mistura é comprimida em uma outra seringa, que é, então ligada à agulha de injeção.

Em uma modalidade preferida, as soluções das primeira e segunda moléculas precursoras, preferivelmente primeira e segunda moléculas precursoras dissolvidas em um tampão de acetato de sódio, são misturadas (junto com quaisquer aditivos ou agentes biologicamente ativos, se necessário) e então pulverizadas junto com um ativador, uma solução básica, no tecido.

IV. Kits para formação in situ de Composições Reticuláveis

Os kits da presente invenção são conjuntos de partes usadas para a formação dos biomateriais da presente invenção. O kit contém pelo menos os primeiro e segundo componentes precursores. O kit pode também conter um ou mais dispositivos, como seringas ou seringas de compartimento duplo, para administração das primeira e segunda moléculas precursoras mais quaisquer aditivos e/ou agentes biologicamente ativos. O kit pode também conter recipientes para armazenar as moléculas precursoras e a solução básica. Os kits também contêm dispositivos sem agulha para transferir os conteúdos dos recipientes de um para o outro ou para transferir os conteúdos dos recipientes para uma seringa de compartimento duplo. Opcionalmente, o kit também contém uma solução básica. Preferivelmente, a base é armazenada em um terceiro recipiente. Opcionalmente, as primeira e/ou segunda moléculas precursoras contêm um ou mais aditivos e/ou agentes biologicamente ativos. As moléculas precursoras podem ser colocadas no um ou mais dispositivos antes da administração a um paciente. O kit pode também incluir um corante, por exemplo azul de metileno, verde de lissamina ou verde rápido, que podem ser adicionados ao biomaterial para facilitar a visualização do biomaterial. Em uma modalidade preferida e particularmente adequada para aplicação de biomateriais, as soluções de moléculas precursoras são armazenadas em um dos compartimentos de um dispositivo de compartimento duplo e a solução básica é armazenada no segundo compartimento do mesmo dispositivo. A saída do dispositivo contém um bico de pulverização que opcionalmente pode ser combinado com um misturador estático para otimizar a mistura da solução básica com as soluções de moléculas precursoras. As soluções de moléculas precursoras (mais quaisquer aditivos ou agentes ativos biológicos, se necessário) podem estar contidas no compartimento, pré-misturadas, ou as moléculas precursoras podem ser separadas no compartimento por uma membrana que permite a mistura das moléculas com sua remoção ou destruição.

Em outra modalidade, o kit compreende um primeiro recipiente (sob vácuo), que pode ser um frasco de vidro, contendo a primeira molécula precursora como um pó seco e um segundo recipiente, que pode ser um frasco de vidro, contendo a segunda molécula precursora dissolvida em uma solução aquosa tamponada tendo um pH ácido. Opcionalmente, o primeiro ou o segundo recipiente pode conter um ou mais aditivos selecionados no grupo que consiste em agentes tixotrópicos e agentes radiopacos ou colorantes. O conteúdo do segundo recipiente é transferido para o primeiro reci31 piente por meio de um dispositivo de transferência sem agulha (Mix2Vial® 20/20, West). Depois disso, as primeira e segunda moléculas precursoras são misturadas e dissolvidas em uma solução aquosa tamponada tendo um pH ácido. Um terceiro recipiente, que pode ser um frasco de vidro, inclui uma solução básica. Preferivelmente, a seringa de compartimento duplo é equipada com um adaptador de enchimento duplo. Os dois compartimentos da seringa dual podem ter volumes diferentes. Preferivelmente, o volume do compartimento receptor da mistura das moléculas precursoras é dez vezes maior do que o volume do compartimento receptor da solução básica. O recipiente contendo as moléculas precursoras e o recipiente contendo a base são ligados a um meio de ligação e seus conteúdos são simultaneamente transferidos para os dois compartimentos da seringa puxando os pistões da seringa. O meio de ligação e os dois recipientes são removidos da seringa e a seringa é equipada com um bico de pulverização destacável. A mistura da solução de moléculas precursoras com a solução básica ocorre no bico de pulverização e a mistura íntima resultante é pulverizada no local desejado.

V. Usos para as Composições

Os componentes precursores multifuncionais são selecionados e ajustados para produzir biomateriais com as propriedades desejadas. As moléculas precursoras são capazes de se reticular in situ em temperatura fisiológica, para atender requisitos específicos de selante. Na modalidade preferida, as composições e biomateriais da presente invenção são usados para evitar, reduzir, inibir ou conter perda de fluidos biológicos. Em outra modalidade, as composições e biomateriais da presente invenção são usados para revestir a superfície de um tecido.

A. Selante tecidual

Em uma modalidade, as composições e biomateriais da presente invenção são usados como selantes teciduais. Na modalidade preferida, a composição reticulável in situ forma um biomaterial que forma um revestimento, uma barreira ou um selante para reduzir, inibir, ou conter perda de fluido. Em particular, o biomaterial pode ser usado para inibir, reduzir, ou conter perda de fluido após um procedimento médico. Um procedimento médico inclui, mas não fica restrito à cirurgia cerebral ou neurocirurgia. B.Outras indicações médicas diferentes da de selante tecidual.

Os biomateriais descritos não ficam restritos ao uso em procedimentos cirúrgicos. O biomaterial pode ser usado como um curativo de feridas para feridas em qualquer parte do corpo. Em uma modalidade, o biomaterial pode ser usado como uma bandagem para evitar ou reduzir a perda de sangue resultante de trauma. Em outra modalidade o biomaterial pode ser usado para reduzir ou evitar antiadesão pós-cirúrgica.

Exemplos

Materiais

Etileno diamina tetraquis(copolímeros em bloco poli(óxido de etileno-óxido de propileno)) (tetronic® 1107 peso molecular 15 kD, BASF) foi término-funcionalizado com grupos acrilato para chegar a etileno diamina tetraquis((copolímeros em bloco poli(óxido de etileno-óxido de propileno) acrilato) (tetronic- tetra-acrilato, peso molecular 15 kD) de acordo com o método descrito em Biomateriais 25 (2004) 5115-5124.

Preparação de tampão

Trietanolamina (TEA) a 0,3 M foi preparada dissolvendo-se 1,11 g em 25 ml de água milli-Q e ajustando-se o pH por adição de ácido clorídrico a 5 M.

TBS foi preparado dissolvendo-se 8 g de NaCI, 0,2 g de KCI e 3 g de Tris base em 1 I de água MilliQ.

O pH foi ajustado com NaOH a 5 M.

Tampão Glicina: 7,5 g de Glicina e 5,85 g de NaCI foram dissolvidos em 1 I de água MilliQ. O pH foi ajustado com NaOH a 5 M.

Tampão de acetato: Tampões de ácido acético a 10 mM e acetato de sódio a 10 mM foram preparados com água MilliQ. Os dois tampões foram misturados em uma razão adequada para a obtenção do pH desejado.

Tampão de borato: Tampões de ácido bórico a 100 mM e tetraborato de sódio deca-hidratado a 50 mM foram preparados. Os dois tampões foram misturados em uma razão adequada para obtenção do pH desejado

Tampão de carbonato: Tampões de carbonato de sódio a 100 mM e bicarbonato de sódio a 100 mM foram preparados em água MilliQ. As duas soluções foram misturadas em uma razão adequada para obtenção do pH desejado.

Teste de Gelificação

Para avaliar o tempo de gelificação, 50-100 μΙ de montantes especificados de solução de primeira molécula precursora e solução de segunda molécula precursora da Tabela 2 foram pipetados em tubos Eppendorf. Para os materiais de gelificação rápida, as gotas (de igual volume) da respectiva solução de primeira molécula precursora foram colocadas na parede interna para evitar [ ] prematura sem ter ainda entrado em contato com a solução de segundo precursor. Um cronômetro foi iniciado simultaneamente à colocação do Eppendorf em um vórtex, onde as soluções foram então misturadas por exatamente 5 segundos. Imediatamente após a mistura, as soluções combinadas foram testadas com uma agulha e quanto ao tempo para ponto de gel (quando fios finos permanecem ligados à agulha após sua retirada) em que fios finos começam a se manter ligados à agulha quando esta é retirada da solução foi registrado como ponto de gel. Para formulações de rápida gelificação foi registrado o status após teste em 5 segundos (por exemplo fios finos, fios grossos e/ou gel duro). Alternativamente, foi realizada mistura seringa a seringa. Para isso, a solução de primeira molécula precursora e a solução de segunda molécula precursora foram retiradas em seringas, as seringas ligadas a um acoplador e a solução impulsionada para frente e para trás dez vezes. A mistura foi transferida para um prato de pesagem e o ponto de gel determinado como descrito acima por teste com agulha. Após uma gelificação inicial, o hidrogel tipicamente permanece pegajoso até que um grau maior de reticulação é obtido. O tempo que o material precisou para se reticular suficientemente (perda do caráter pegajoso) foi registrado como tempo de cura que reflete o tempo após o qual o material pode ser tocado sem dano.

Exemplo 1: Composições de Selante teciduai

1a: Composição 1: Tetronic-tetra-acrilato e PEG-SH-10

Solução de primeira molécula precursora

235 mg de poli(etileno glicol) tetrassulfidrilaa (PEG-SH-10) (peso molecular 10 kD) e 0,1 mg de verde de lissamina são dissolvidos em 1 mL de tampão de acetato a 10 mM pH 5.

Solução de segunda molécula precursora

315 mg de tetronic-tetra-acrilato (peso molecular 15 kD) são dissolvidos em 1 mL de um tampão de acetato a 10 mM pH 5.

Solução básica

0,22 mL de um tampão de borato a 50 mM pH 9,8 1b: Composição 2: Tetronic-tetra-acrilato e PEG-SH-5 Solução de primeira molécula precursora

112 mg de poli(etileno glicol) tetrassulfidrilaa (PEG-SH-5) (peso molecular 5 kD) e 0,1 mg de verde de lissamina são dissolvidos em 1 mL de tampão de acetato a 10 mM pH 5.

Solução de segunda molécula precursora

315 mg de tetronic-tetra-acrilato (peso molecular 15 kD) são dissolvidos em 1 mL de um tampão de acetato a 10 mM pH 5.

Solução básica

0,22 mL de um tampão de borato a 50 mM pH 10,4 1c: Composição 3: Tetronic-tetra-acrilato e PEG-SH-5 Solução de primeira molécula precursora

168 mg de poli(etileno glicol) tetrassulfidrilaa (PEG-SH-5) (peso molecular 5 kD) são dissolvidos em 1 mL de tampão de acetato a 10 mM pH 4,9.

Solução de segunda molécula precursora

472 mg de tetronic-tetra-acrilato (peso molecular 15 kD) são dissolvidos em 2 mL de um tampão de acetato a 20 mM pH 4,9.

Solução básica

0,3 mL de um tampão de carbonato a 250 mM pH 11,0 1d: Composição 4: Tetronic-tetra-acrilato e PEG-SH-5 Solução de primeira molécula precursora

192 mg de poli(etileno glicol) tetrassulfidrilaa (PEG-SH-5) (peso molecular 5 kD) são dissolvidos em 1 mL de tampão de acetato a 5 mM pH

4,9.

Solução de segunda molécula precursora

472 mg de tetronic-tetra-acrilato (peso molecular 15 kD) são dissolvidos em 1 mL de um tampão de acetato a 15 mM pH 4,9.

Solução básica

0,3 mL de um tampão de carbonato a 250 mM pH 11,0 1e: Composição 5: Tetronic-tetra-acrilato e DTT Solução de primeira molécula precursora

2,5 mg de ditiotreitol (DTT, peso molecular 154 g/mol) são dissolvidos em 500 pL de um tampão de trietanolamina a 0,3 M em pH 8,5. Solução de segunda molécula precursora

120 mg de tetronic-tetra-acrilato (peso molecular 15 kD) são dissolvidos em 500 pL de um tampão de trietanolamina a 0,3 M em pH 8,5.

Ou

Solução de primeira molécula precursora

3,15 mg de ditiotreitol são dissolvidos em 500 pL de um tampão de trietanolamina a 0,3 M em pH 8,5.

Solução de segunda molécula precursora

150 mg de tetronic-tetra-acrilato (peso molecular 15 kD) são dissolvidos em 500 pL de um tampão de trietanolamina a 0,3 M em pH 8,5.

1f: Composição 6: Tetronic-tetra-acrilato e PEG-SH-3.4 de duas ramificações

Solução de primeira molécula precursora

156 mg de poli(etileno glicol) dissulfidrila (PEG-SH-3.4) (peso molecular 3,4 kD) são dissolvidos em 1 mL de tampão de acetato a 10 mM pH 5,5.

Solução de segunda molécula precursora

315 mg de tetronic-tetra-acrilato (peso molecular 15 kD) são dissolvidos em 1 mL de um tampão de acetato a 10 mM pH 5,5.

Solução básica

0,3 mL de um tampão de carbonato a 250 mM pH 10,0.

1g. Composição 7: Tetronic-tetra-acrilato e PEG-SH-10 de 8 ramifica36 ções

Solução de primeira molécula precursora

161 mg de poli(etileno glicol) octassulfidrila de 8 ramificações (PEG-SH-10 de 8 ramificações) (peso molecular 5 kD) são dissolvidos em 1 ml de acetato a 10 mM de pH 4,9.

Segunda molécula precursora

472 mg de tetronic-tetra-acrilato (15 kD) são dissolvidos em 2 ml de acetato a 20 mM de pH 4,9.

Solução básica

0,3 mL de tampão de carbonato de sódio a 0,25 M a pH 11,0 1 h: Composição 8: Tetronic-tetra-acrilato e PEG-SH-5 de 4 ramificações

472 mg de Tetronic-tetra-acrilato, 15 kD

192 mg PEG-tetratiol, 5 kD

0,55 mg Ácido clorídrico

9,5 mg Carbonato de sódio

0,15 mg Azul de metileno hidratado

3,3 g água para injeção Preparação do kit

Solução de estoque de HCI a 5 mM foi preparada diluindo 5 ml de solução de HCI a 100 mM em 95 ml de água milli-Q. Solução de estoque de azul de metileno, 1 mg/ml em HCI 5 mM foi preparada dissolvendo 20 mg de azul de metileno em 20 ml de solução de estoque de HCI. Tampão para reconstituição de tetronic-tetra-acrilato foi preparado a partir de HCI a 5 mM com 0,05 mg/ml de azul de metileno. Foi diluído com solução de estoque de HCI em uma razão de 1 :20, o pH foi ajustado na faixa de 2,3-2,6. O pH da solução básica (tampão de carbonato) foi ajustado na faixa de 11,35-11,45. 472 mg de tetronic-tetra-acrilato foram dissolvidos em 3 ml de tampão tetronic tetra-acrilato frio e mantidos em gelo por 5 minutos para facilitar a solubilização. A solução foi centrifugada por 1 minuto a 3000 rpm para remover bolhas de ar e pipetada em um frasco contendo 192 mg de PEG-tetratiol sendo dissolvida por agitação branda. Após reconstituição do polímero, 3 ml da mistura foram transferidos para o compartimento maior de uma seringa dupla 1 :10. O compartimento menor foi preenchido com 0,4 ml de carbonato de sódio a 300 mM. O êmbolo foi inserido, ar foi cuidadosamente removido da seringa e o bico de pulverização fixado.

1i. Preparação de DuraSeal®

DuraSeal® (Confluent Surgical Inc.) foi preparado de acordo com as instruções para uso.

1j: Composição 10: Tetronic-tetra-acrilato e PEG-SH-3.4 de 2 ramificações

133 mg de poli(etileno giicol) dissulfidrila (PEG-SH-3.4) (peso molecular 3,4 kD) são dissolvidos em 500 μΐ_ de um tampão de trietanolamina a 0,3 M em pH 8,5.

Solução de secunda molécula precursora

220 mg de tetronic-tetra-acrilato (peso molecular 15 kD) são dissolvidos em 500 μί de um tampão de trietanolamina0,3 M a pH 8,5.

1k: Composição 11: Tetronic-tetra-acrilato e PEG-SH-3.4 de 2 ramificações

107 mg de poli(etileno giicol) dissulfidrila (PEG-SH-3.4) (peso molecular 3,4 kD) são dissolvidos em 1,5 mL de um tampão de trietanolamina a 0,3 M em pH 8,5.

Solução de secunda molécula precursora

220 mg de tetronic-tetra-acrilato (peso molecular 15 kD) são dissolvidos em 500 μί de um tampão de trietanolamina a 0,3 M em pH 8,5.

11: Composição 12: Tetronic-tetra-acrilato e PEG-SH-3.4 de 2 ramificações

354 mg de poli(etileno giicol) dissulfidrila (PEG-SH-3.4) (peso molecular 3,4 kD) são dissolvidos em 1,5 mL de um tampão de trietanolamina a 0,3 M a pH 8,5.

Solução de segunda molécula precursora

240 mg de tetronic-tetra-acrilato (peso molecular 15 kD) são dissolvidos em 500 μί de um tampão de trietanolamina 0,3 M em pH 8,5.

1m: Composição 13: Tetronic-tetra-acrilato e PEG-SH-3.4 de 2 ramificações

140,7 mg de poli(etileno glicol) dissulfidrila (PEG-SH-3.4) (peso molecular 3,4 kD) são dissolvidos em 50 μΙ_ de um tampão de borato a 100 mM tampão em pH 10,1, 9,8 e 9,6.

Solução de secunda molécula precursora

286 mg de tetronic-tetra-acrilato (peso molecular 15 kD) são dissolvidos em 50 μΙ_ de um tampão de borato a 100 mM em pH 8,5.

Exemplo 2a: Estabilidade da mistura da primeira e segunda moléculas precursoras

Solução de primeira molécula precursora

194 mg de poli(etileno glicol) tetrassulfidrilaa (PEG-SH-5) (peso molecular 5 kD) são dissolvidos em 1 mL de tampão de acetato 10 mM pH 4,9. O tampão é preparado misturando tampão ácido acético 100 mM com tampão de acetato de sódio 100 mM para obter pH 4,90 e diluindo o tampão 1:10 v/v com água.

Solução de segunda molécula precursora

545 mg de tetronic-tetra-acrilato (peso molecular 15 kD) são dissolvidos em 2 mL de um tampão de acetato a 20 mM pH 4,9. O tampão é preparado misturando um tampão de ácido acético a 100 mM e um tampão de acetato de sódio 100 mM para obter pH 4,90 e diluindo o tampão 1 :5 v/v com água.

Solução básica

0,3 mL de um tampão de carbonato a 250 mM pH 11,0

Quando somente a primeira e segunda moléculas precursoras são misturadas por rotação por 30 s, gelificação ocorre dentro de 30 min. Tempo de gelificação foi medido mergulhando e retirando uma agulha da solução, o tempo foi computado até o momento em que fios foram formados indicando um avançado grau de reticulação do material. Em uma concentração mais baixa de moléculas precursoras, isto é para soluções de moléculas precursoras preparadas como descrito no exemplo 1c e 1d (composição 3 e composição 4), a gelificação somente ocorre após 1h. Quando a solução básica é aplicada à mistura de moléculas precursoras, ambas as composições gelificam em segundos (em menos de 10 segundos).

Exemplo 2b: Efeito da razão entre o número de grupos funcionais acrilato e tiol presentes nos polímeros correspondentes

A solução de primeira molécula precursora e a solução de segunda molécula precursora definidas no exemplo 1.c são misturadas em diferentes razões volumétricas (0,25:1, 0,375:1, 0,5:1, 0,675:1 e 0,75:1). Estas razões correspondem a razões molares de tiol para acrilato de 1 :0,5, 1 : 0,75, 1 :1, 1 : 1,25 e 1 : 1,5. A solução de primeira molécula precursora e a solução de segunda molécula precursora foram misturadas por 30 segundos por rotação em vórtex. 0,2 mL de um tampão de borato a 50 mM pH 9 foram, então, adicionados em um volume correspondente a um décimo do volume total das soluções de moléculas precursoras. A mistura foi misturada por rotação em vórtex por exatamente 5 segundos. Foi feito um teste, mergulhando uma agulha na solução e retirando-a em seguida, sendo computado o tempo até serem formados fios indicando um grau avançado de reticulação do material. Um tempo de gelificação mínimo de 10-11 segundos foi obtido para as amostras com uma razão molar de acrilato para tiol de 1 : 1 e 1 : 0,75. O tempo de gelificação aumentou para 13-15 segundos para as outras razões.

Exemplo 3: Preparação do biomaterial

3a: Preparação do biomaterial a partir das composições 1, 2, 3, 4 e 6

Antes da aplicação da composição farmacêutica no local desejado, duas seringas distintas são cheias com as soluções das primeira e segunda moléculas precursoras sendo, em seguida conectadas a um acoplador. As soluções das primeira e segunda moléculas precursoras são misturadas transferindo o material contido em uma seringa para a outra seringa (Tipicamente, as soluções são impulsionadas para frente e para trás dez vezes). Embora, a mistura permaneça estável por 10-20 minutos após sua preparação, idealmente a composição farmacêutica deve ser usada dentro de 5 minutos após sua preparação. O biomaterial é formado in situ no local desejado, pela transferência para o local com deficiência de uma mistura contendo primeira e segunda moléculas precursoras e o ativador usando um dispositivo de dois componentes equipado com uma ponta espalhadora ou uma ponta de pulverização. O biomaterial é formado em menos de 1 minuto após a transferência do conteúdo do dispositivo de dois componentes.

3b. Preparação do biomaterial a partir da composição 5,10,11,12 e 13

Duas seringas distintas são cheias com as soluções das primeira e segunda moléculas precursoras sendo, em seguida, conectadas a um acoplador. As soluções das primeira e segunda moléculas precursoras são misturadas transferindo-se o material contido em uma seringa para outra seringa. O ponto de gelificação é atingido na seringa e o biomaterial é extrudado da seringa e para um molde.

3c. Preparação do biomaterial a partir da composição 7

As duas moléculas precursoras são misturadas no processo seringa-para-seringa. Sem adição de uma solução básica, as moléculas precursoras gelificam em 30 min. Isto significa que a mistura das moléculas precursoras pode ser armazenada por 30 minutos antes do uso. Quando 300 μΙ de tampão de carbonato de sódio 0,25 M em pH 11,0 foram adicionados, a gelificação ocorreu em poucos segundos (menos de 5 segundos).

Exemplo 4: Inchamento/Degradação do biomaterial

Para avaliar o inchamento e degradação do biomaterial, biomateriais foram preparados a partir de composições descritas nos exemplos 1 a e 1b. Antes da aplicação das composições no local desejado, duas seringas distintas são cheias com as soluções das primeira e segunda e moléculas precursoras , sendo, então conectadas a um acoplador. As soluções das primeira e segunda moléculas precursoras são misturadas transferindo o material contido em uma seringa para a outra seringa (Tipicamente, as soluções são impulsionadas para trás e para frente 10 vezes). Embora a mistura permaneça estável 10-20 minutos após sua preparação (significando que as misturas não alcançara o ponto de gelificação antes de 10 a 20 minutos), as composições devem idealmente ser usadas 5 minutos após sua preparação. Os biomateriais são formados in situ no local desejado, por transferência para o local desejado de misturas contendo as primeira e segunda moléculas precursoras e da solução básica usando um dispositivo de dois compartimentos equipado com uma ponta espalhadora ou com uma ponta de pulve41 rização. Os biomateriais são formados em menos de 5 segundos após transferência do conteúdo do dispositivo de dois compartimentos. As composições são espalhadas em um prato de pesagem de modo que seja formada uma camada de 1 mm dos biomateriais. O prato de pesagem contendo as soluções reagentes é, então, colocado a 37°C em uma atmosfera umidificada e as soluções curadas por 10 min. 3 discos com um diâmetro de 1,2 cm são cortados de cada filme. As amostras são colocadas em tubos contendo solução tamponada com fosfato (PBS) e colocadas em uma incubadora a 37°C. Biomateriais são removidos dos tubos com a ajuda de uma espátula em diferentes instantes de tempo. Os biomateriais são cuidadosamente secos usando lenços de papel para remover qualquer excesso de água e então pesados. Os biomateriais são, então colocados de volta em seus respectivos tubos e colocados de volta na incubadora. O inchamento atinge um valor de 0,87 ±0,11 para o biomaterial formado a partir da composição do exemplo 1a e 0,32 ± 0,06 % para o biomaterial formado a partir da composição do exemplo 1b após 2 dias em PBS a 37°C. Os dois biomateriais se dissolveram completamente em 28 a 35 dias (Figuras 1 e 2).

Exemplo 5: Teste de Compressão amostras de biomateriais formados a partir da composição 1 como descrito no exemplo 1a e 8 amostras de biomateriais formados a partir da composição 2 como descrito no exemplo 1b foram preparadas enchendo com 100 μΙ das composições 1 e 2 em uma seringa de 1 ml cortada. Os biomateriais foram curados por 5-10 min e então removidos de seu molde. Cilindros com um diâmetro de 5 mm e uma altura de 11,5 mm foram obtidos. Quatro biomateriais foram colocados em PBS a 10 mM em pH 7,4 e quatro biomateriais foram colocados em um tubo seco. Os tubos foram incubados a 37°C por 24 h. Como o tempo de gelificação com uma solução básica tendo um pH de 9,8 e 10,4, respectivamente, foi rápido demais para formar amostras homogêneas, o pH da solução básica foi abaixado para pH 9,6. As amostras foram medidas com um instrumento Zwick Materialprufung 1456. O módulo de Young (módulo elástico) foi determinado com uma célula de carga de 50 N, a resistência máxima com uma célula de carga de 20 kN. A velocidade de pré-carga foi aumentada de 0,05 para 0,1 mm/s e o tempo de espera foi reduzido para 3 s. o módulo de Young foi medido a 3% de compressão mas a uma velocidade de 0,08 mm/s. A mesma velocidade foi aplicada com a célula de carga de 20 kN para registro da pressão até a fissura do material. Amostras de cada um dos biomateriais foram comprimidas em estado seco e após 24 h de incubação em PBS. Nenhum dos biomateriais foi destruído em seu estado seco (armazenado em ar a 37°C por 24 h) quando comprimido até 99%. No estado úmido, a pressão em ruptura foi de 3,8 ± 2,5 N/mm² para o biomaterial formado a partir da composição 1 e 1,51 ±0,17 N/mm² para o biomaterial formado a partir da composição 2. A percetagem de compressão em ruptura foi de 91 ± 3% para o biomaterial formado a partir da composição 1 e 88 ± 2 % para o biomaterial formado a partir da composição 2. O Módulo de Young foi de 0,125 ± 0,005 para o biomaterial formado a partir da composição 1 e 0,10 ± 0,00 N/mm² para o biomaterial formado a partir da composição 2 no estado úmido. No estado seco, o módulo de Young do biomaterial formado a partir da composição 2 foi com o valor de 0,561 ±0,152 N/mm² maior que o do biomaterial formado a partir da composição 1 que apresentou um módulo de Young de 0,152 ± 0,024 N/mm². Exemplo 6: Resistência adesiva e coesiva de biomateriais

As resistências adesiva e coesiva dos biomateriais são examinadas em um teste de ruptura por pressão ( burst test). Medições de teste de ruptura foram realizados de acordo com ASTM F-2329-04 (teste padrão para resistência à ruptura de selantes cirúrgicos. Um sensor de pressão relativa (DeltaOhm TP704-2BGI) foi usado com uma faixa e medição de 0-200 KPA (0-2 bar) (sobrepressão máxima de 400 KPA (4 bar)) e uma resolução de 0,01 KPA (0,1 mbar). Uma bomba seringa com uma vazão constante foi usada como bomba de fluido (Alaris, Asena GH). Para teste de ruptura por pressão, a composição 8 e Duraseal® preparados como descrito no exemplo 1h e 1i são aplicados a uma membrana úmida de colágeno. Para garantir formato de amostra igual, uma membrana de colágeno é colocada sob uma máscara através da qual o selante é aplicado. As amostras são então deixadas curar antes de serem removidas cuidadosamente da máscara. Após medição da espessura e peso da amostra, amostras são Fixadas com grampos (clamped) no dispositivo de teste e testadas separadamente. A pressão crescente, que age diretamente no selante através de um orifício préfabricado no colágeno, é medida constantemente. Após a ruptura do selante, a bomba pode ser desligada e avaliação dos dados coletados pode ser realizada. Para permitir uma comparação das resistências a ruptura de diferentes amostras, suas espessuras foram medidas antes do teste e normalizadas a 1 mm. Pressão de ruptura dos dois selantes cirúrgicos sintéticos demonstrou diferenças claras em suas resistências à ruptura. Embora o biomaterial formado a partir da composição 8 rompa em uma pressão média de 240 mm deHg, DuraSeal® rompe em uma pressão média de 74 mm de Hg. A taxa de falha coesiva para ambos os selantes foi de 90%, o que demonstra uma boa aderência à membrana de colágeno usada no teste.

Exemplo 7: Selaqem cirúrgica de Dura de ovelhas

A dura máter de uma ovelha que tinha sido sacrificada há 3 horas foi dissecada. A pele foi removida usando um escalpelo e uma forma retangular foi cortada no crânio usando uma lâmina de ossos. O crânio foi levantado e como a dura estava ainda parcialmente fixada ao crânio esta foi cuidadosamente excisada do crânio e colocada de volta ao cérebro; as composições 1 e 2 (descritas nos exemplos 1a e 1b) foram espalhadas como um filme fino na dura e deixadas curar por 1 min. Não foi observado vazamento de fluidos. Uma espátula redonda plana foi usada para testar e remover/descascar o material curado da dura. A aparência do gel, o tempo de gelificação, e a adesividade foram avaliados quantitativamente em uma escala de 1-5. Para aparência do gel, grau 1 corresponde a um gel não homogêneo. Grau 2 corresponde a um gel que é principalmente bruto, desigual (rough), grau 3 a um gel que tem algumas partes brutas, desiguais, e grau 5 a um gel liso homogêneo. Para tempo de gelificação, grau 1 corresponde a cerca de 50-100% da composição em ponto de escorrimento. Grau 2 corresponde a cerca de 25-50% da composição em ponto de escorrimento, grau 3 a cerca de 5-10% da composição em ponto de escorrimento e grau 5 cerca de 0-5% da composição em ponto de escorrimento. Para adesividade, grau significa que o gel é retirado por descascamento sem nenhuma força, grau que o gel é retirado por descascamento com pouca força, grau 3 que é necessária a aplicação de uma força média para remover o gel, grau 4 que muito pouco do gel é retirado por descascamento, e grau 5 que nada do gel é removido. Para a composição 2 o pH foi aumentado para 10,4 para reduzir o tempo de gelificação. Para comparação, as composições foram também aplicadas às membranas de colágeno úmidas, bem como diretamente ao cérebro. Os dois biomateriais formados a partir das composições mostraram uma capacidade de aderência à dura máter muito boa (biomaterial formado a partir da composição 1-grau 4, biomaterial formado a partir da composição 2-grau 3). A adesividade do biomaterial à dura máter se mostrou muito melhor do que a adesividade às membranas de colágeno. Ao contrário, quando da aplicação do biomaterial a cérebro de ovinos (coberto com as camadas pia máter e araquinóide) este pôde ser removido por descascamento facilmente. A composição 1 gelificou rapidamente (grau 4) e, portanto, no final da aplicação algumas partes desiguais foram criadas devido a material semigelificado entrar em contato com o espalhador (grau 4 para aparência de gel), composição 2, por outro lado, se gelificou bastante vagarosamente (grau 2), mesmo quando o pH da solução básica foi aumentado para 10,4 e nem todo o produto permaneceu no local de aplicação mas escorreu para o lado, especialmente se a dura não era horizontal. Apesar disso, onde o material foi aplicado, uma fina camada de material permaneceu. Em 30 s, o material formou um hidrogel firme e não-pegajoso (grau 5 para aparência de gel). Exemplo 8: Modelo de durotomia de ovelhas

A dura máter de uma ovelha anestesiada foi exposta e foi feita uma incisão de 2 cm na dura e na araquinóide, de modo que ocorreu vazamento de fluido cerebroespinhal. A lesão foi reparada frouxamente usando sutura de polipropileno 4/0 mas deixando um espaço de 1 mm. A composição 8 descrita no exemplo 1 h foi usada com o seguinte método.

Esterilização dos componentes

Todos os componentes do aplicador, bolsas, frascos de vidro e fechamentos foram esterilizados por irradiação gama em uma dose de 21,8 kGy. Depois disso, qualquer manuseio de material estéril foi realizado em uma capela estéril. Tampões e a solução de tetronic-tetra-acrilato foram esterilmente filtradas através de filtros seringa PES de 0,22 pm. PEG-SH-5 foi fornecido não-estéril no kit e filtrado através de um filtro seringa PES de 0,22 pm após reconstituição com tetronic-tetra-acrilato durante a preparação do kit.

Preparação de tampões

A solução básica foi preparada dissolvendo-se 1,59 g de carbonato de sódio em 50 ml de água para injeção. O pH registrado foi de 11,38.

A solução de Tetronic-acrilato foi preparada dissolvendo-se 471 mg de tetronic-tetra-acrilato em 3 ml de HCl a 5 mM contendo 0,05 mg/ml de azul de metileno. A reconstituição foi realizada por rotação em vórtex durante 10-20 s, armazenando-se a solução a 4°C por 10 min e centrifugando-se por 5 min a 2500 rpm. A solução de HCl a 5 mM foi preparada a partir da solução de HCl a 100 mM por diluição com água para injeção. Azul de metileno foi preparado como uma solução a 10 mg/ml de azul de metileno em HCl a 5 mM e então diluído com HCl a 5 mM.

Enchimento asséptico e embalagem do kit

A seringa dupla foi montada com pistões antes da esterilização. 400 pl de carbonato de sódio foram colocados no compartimento menor da seringa que foi embalada junto com 4 cabeçotes do tipo spray e um êmbolo na bolsa 1. O componente PEG-SH-5 foi preparado pesando 192 mg de polímero em um pequeno frasco de vidro. O frasco de vidro foi agitado com etanol e o pó despejado no frasco de vidro estéril sem tocar o lado de fora. O frasco foi fechado com ua tampa de engate por pressão. A solução de tetronic-tetra-acrilato foi retirada para uma seringa de 20 ml e 3,3 ml foram transferidos para uma seringa de 5 ml via um acoplador seringa a seringa. A seringa foi fechada com um fechamento do tipo combi-stopper. O frasco, a seringa de 5 ml, uma agulha azul e uma rosa e um filtro de seringa foram embalados em uma bolsa 2 e selados. As bolsas 1 e 2 foram reunidas em uma bolsa maior e selada por aquecimento. Os kits foram armazenados a menos de -15°C a -25°C e despachados em gelo seco. No dia do experi46 mento, o kit foi removido do estoque e colocado em temperatura ambiente até se descongelar totalmente. Na ocasião de uso, o kit foi aberto no campo estéril. A solução de tetronic-tetra-acrilato foi transferida para o frasco contendo o pó de PEG-SH-5. O pó foi reconstituído agitando gentilmente o frasco durante 1-2 min. A mistura foi retirada novamente para a seringa, que foi conectada a um filtro estéril e uma agulha azul, sendo a solução transferida para o compartimento maior da seringa dupla. O dispensador foi fixado à seringa dupla e o ar que permaneceu foi expelido da seringa dupla. O bico spray foi colocado na seringa dupla e o aplicador ficou assim pronto para o uso. A composição foi pulverizada sobre a lesão durai e o biomaterial se solidificou em menos de 5 segundos. A lesão durai foi cuidadosamente verificada quanto ao reaparecimento de vazamento de CSF. O selante foi capaz de interromper intraoperativamente o vazamento de fluido. O material estava ainda presente após 1 semana e foi completamente reabsorvido após 12 semanas.

Exemplo 9: Teste das propriedades de termogelificação de Tetronicacrilato em altas concentrações

As propriedades de gelificação da composição 11 (descritas no exemplo 1k) e composição da 12 (descritas no exemplo 11) foram comparadas, todas duas, em conjunto com PEG-SH linear 3,4 kDa. Foi esperada que a formação de gel ocorresse através de reticulação química na composição 11 e através de meios físicos (termogelificação) seguidos por reticulação química na composição 12. A composição 11 gelificou em 1,5 minutos após uma mistura seringa a seringa de 30 segundos e teve um tempo de cura de 2-3,5 minutos após aplicação da solução em um prato de pesagem através de uma agulha. No caso da composição 12, um gel se formou quando a composição foi aplicada a um prato de pesagem aquecido por um banho de água circundante a 37°C e o escorrimento do material foi evitado. Entretanto, o tempo de cura foi aumentado para 4-55 minutos e assim a gelificação foi mais longa do que para a composição 11.

Exemplo 10: Influência do pH na cinética de reação

O tempo de gelificação da composição 10 (como preparada no exemplo 1j) versus o pH da solução tampão é representado na Figure 3. Esta mostra que o tempo de gelificação decresce com o aumento de pH. Um comportamento similar é observado para a composição 13 (preparada como descrito no exemplo 1m).

Claims (25)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Composição contendo pelo menos uma primeira e uma segunda molécula precursora, caracterizada pelo fato de que:

   i) a primeira molécula precursora é um polímero com base em

   5 poli(etileno glicol) tendo x grupos nucleofílicos selecionados a partir do grupo que consiste em grupos tiol ou amino, em que x é igual a 2 ou maior que 2, preferivelmente 3, 4, 5, 6, 7 ou 8;

   ii) a segunda molécula precursora é da fórmula geral:

   10 A-[(C3HeO)n-(C2H4O)_m-B]i em que m e n são inteiros de 1 a 200 i é maior que 2, preferivelmente 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 A é um ponto ou porção de ramificação,

   15 B é um grupo conjugado insaturado.
2. 2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que x é igual a 4.
3. 3. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a primeira molécula precursora é pentaeritritol po20 li(etileno glicol)éter tetrassulfidrila.
4. 4. Composição, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que pentaeritritol poli(etileno glicol)éter tetrassulfidrila apresenta um peso molecular na faixa de 2 a 20 kD.
5. 5. Composição, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada 25 pelo fato de que pentaeritritol poli(etileno glicol)éter tetrassulfidrila apresenta um peso molecular na faixa de 3 a 11 kD.
6. 6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que B da segunda molécula precursora é um grupo acrilato.

   30
7. 7. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações

   1 a 6, caracterizada pelo fato de que o ponto ou porção de ramificação A da segunda molécula precursora é selecionado a partir do grupo que consiste

   Petição 870180029271, de 12/04/2018, pág. 9/17 em carbono, glicerol, pentaeritritol, dipentaeritritol e etileno diamina.
8. 8. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações

   1 a 7, caracterizada pelo fato de que a segunda molécula precursora apresenta um peso molecular na faixa de 10 a 25 kD.

   5
9. 9. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações

   1 a 7, caracterizada pelo fato de que contêm adicionalmente uma base.
10. 10. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a base é carbonato de sódio.
11. 11. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindica10 ções 1 a 10, caracterizada pelo fato de que a composição contém adicionalmente um colorante.
12. 12. Composição, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o colorante é selecionado a partir do grupo que consiste em azul de metileno, verde de lissamina e verde rápido.

    15
13. 13. Método para fabricação de um biomaterial, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

    i) prover uma primeira molécula precursora que é um polímero com base em poli(etileno glicol) tendo x grupos nucleofílicos selecionados a partir do grupo que consiste em grupos

    20 tiol ou amino em que x é igual a 2 ou maior que 2, preferivelmente 3, 4, 5 ou 6;

    ii) prover uma segunda molécula precursora da fórmula geral:

    A-[(C3H6O)n-(C2H4O)m-B]i em que

    25 m e n são números inteiros de 1 a 200;

    i é maior do que 2, preferivelmente 3, 4, 5 ou 6;

    A é um ponto ou porção de ramificação;

    B é um grupo insaturado conjugado;

    iii) reagir as moléculas precursoras das etapas i) e ii) na pre30 sença de uma solução básica para formar uma rede tridimensional reticulada.
14. 14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado

    Petição 870180029271, de 12/04/2018, pág. 10/17 pelo fato de que a primeira molécula precursora e a segunda molécula precursora são dissolvidas antes da etapa iii) em solução aquosa tamponada tendo pH ácido.
15. 15. Método, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracteri5 zado pelo fato de que o biomaterial é formado em menos de dois minutos.
16. 16. Método, de acordo com a reivindicação 13 ou 15, caracterizado pelo fato de que o biomaterial é formado em menos de dez segundos.
17. 17. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a composição da etapa iii) tem um pH na faixa de 9 a 13.

    10
18. 18. Biomaterial sintético, caracterizado pelo fato de que é formado a partir da composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 12.
19. 19. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que é para uso como um selante te15 cidual.
20. 20. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que é para revestimento da superfície de um tecido.
21. 21. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindica20 ções 1 a 12, caracterizada pelo fato de que é para reduzir, inibir ou conter perda de um fluido biológico ou gás.
22. 22. Uso da composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para efetuar a fixação não cirúrgica de uma primeira super25 fície com uma segunda superfície.
23. 23. Kit para formar um biomaterial, caracterizado pelo fato de que contêm:

    i) um primeiro recipiente contendo uma primeira molécula precursora que é um polímero com base em poli(etileno glicol) tendo x gru30 pos nucleofílicos selecionados a partir do grupo que consiste em grupos tiol ou amino, em que x é igual a 2 ou maior que 2, preferivelmente 3, 4, 5, 6, 7 ou 8;

    Petição 870180029271, de 12/04/2018, pág. 11/17 ii) um segundo recipiente contendo uma segunda molécula precursora da fórmula geral:

    A-[(C3H6O)n-(C2H₄O)m-B]i em que m e n são números inteiros de 1 a 200 i é maior que 2, preferivelmente 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 A é um ponto ou porção de ramificação B é um grupo conjugado insaturado.
24. 24. Kit, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que inclui adicionalmente um terceiro recipiente contendo a solução básica.
25. 25. Kit, de acordo com a reivindicação 23 ou 24, caracterizado pelo fato de que contêm adicionalmente uma seringa de compartimento duplo.

    Petição 870180029271, de 12/04/2018, pág. 12/17

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    Biomaterial formado a partir da composição 1 Biomaterial formado a partir da composição 2 Duraseal da Confluent