CN115869456A - 一种原位凝胶化抗溶胀增强型组织粘合剂材料的制备 - Google Patents
一种原位凝胶化抗溶胀增强型组织粘合剂材料的制备 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种原位凝胶化抗溶胀增强型组织粘合剂的制备。具体的，本发明将末端修饰琥珀酰亚胺活性酯多臂聚乙二醇溶液和修饰儿茶酚基团并同时含多个伯氨基团聚合物溶液作为成胶主要组分。通过溶液混合涂抹或注射，聚乙二醇末端活性酯基团和聚合物上氨基自发进行亲核取代反应原位形成凝胶粘附于组织表面。粘附于组织表面后，凝胶中儿茶酚发挥自氧化交联作用可以抵抗吸水溶胀，氧化后儿茶酚基团还可与组织蛋白上氨基、巯基等发生多种键合达到增强组织粘合效果。
Description
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，具体地，本发明涉及一种原位凝胶化抗溶胀增强型组织粘合剂的制备。
背景技术
组织粘合剂在临床医学具有较高的应用价值，其通常可用于粘膜组织粘合、密封、药物输送释放等诸多领域。尽管已经开发了各种高生物安全性用于软组织的粘合剂配方，但它们的临床使用仍然受到粘合力不足、溶胀性大的限制。例如，临床中常见的纤维蛋白粘合剂其对组织的粘附强度只有约15 KPa，同时还存在病毒传播的风险(如细小病毒B19、肝炎和HIV)。
聚乙二醇(PEG)作为一种高生物安全性聚合物，已被开发出多种衍生物分子用于组织粘合剂的制备，例如多臂PEG活性酯和多臂PEG巯基双组分凝胶 (CoSeal)、多臂PEG活性酯和三赖氨基双组分凝胶(DuraSeal)和基于PEG丙烯酸的光活化凝胶(FocalSeal)。
虽然此类凝胶的组织粘合强度相比于纤维蛋白胶有所提升，但仍显不足 (20～30KPa)；此外，由于这些合成粘合剂中PEG分子吸水性较强，从而在植入体内后由于吸收周围的组织液，造成体积的变大从而可能压迫周围神经等组织，同时吸水会造成凝胶力学性能及粘合强度急剧下降，影响其使用的有效性。因此，开发出在复杂的化学和机械环境下具有强黏附性的抗溶胀凝胶粘合剂是非常值得研究的。
海洋生物贻贝可以分泌粘合蛋白，使其可以在潮湿环境下牢固粘附于不同材质表面，这是因为含有一种不寻常的氨基酸，L-3,4-二羟基-L-苯丙氨酸(DOPA)。其中含有的儿茶酚基团可以与羟基、阳离子基团、苯环等形成氢键、阳离子-π、π-π堆叠等非共价相互作用，同时在氧化作用下转化为醌结构，具有高度反应活性，能与包括硫醇、胺和醌在内的多种基团进行迈克尔加成、希夫碱、歧化偶合等多种反应。近年来，受贻贝启发的水凝胶粘合剂已经有诸多报道，例如Lee等人报道一种由儿茶酚功能化壳聚糖形成的组织粘合剂(Adv.Funct.Mater.2019,29,1900495)和一种由儿茶酚功能化四臂聚乙二醇组织粘合剂(Langmuir 2010,26,3790-3793)；Neto等人报道一种儿茶酚功能化透明质酸制备的水凝胶粘合剂(Small 2014,10, 2459-2469)。但这些凝胶的自氧化速度很慢，无法通过儿茶酚之间的交联快速形成凝胶，需要数天之久，因此此类粘合剂通常需要加入大量有毒的氧化剂，如高碘酸钠、过氧化氢/辣根过氧化物酶等，这也极大的限制了其临床应用。
本发明通过将修饰儿茶酚功能基团并含多个伯氨基团的水溶性聚合我作为多功能交联剂，与末端修饰活性酯的多臂聚乙二醇进行原位凝胶化反应形成聚合物网络并对组织进行密封。如图1所示，聚合物网络中儿茶酚基团在中性pH环境下缓慢氧化形成高反应活性的醌，通过醌之间的自交联反应及醌与伯氨基间反应使得凝胶网络更加紧密从而不断抵抗水分子的进入避免凝胶的溶胀，同时还可与组织蛋白上氨基、巯基等发生多种键合达到增强组织粘附效果。
综上，本发明通过涂抹或注射的方式，利用活性酯与伯氨基的快速酰胺化反应，以及基于儿茶酚基团的交联反应设计出一款可以快速凝胶化并抵抗溶胀的高粘附性水凝胶粘合剂，有望对临床中现有凝胶类粘合剂组织粘附效果不佳、溶胀性大等问题进行改进。
发明内容
本发明的目的是提供一种供临床使用便捷、粘附性强、不溶胀、组织粘合能力强、生物相容性优异的医用组织粘合剂材料。
本发明第一方面提供了一种原位凝胶化抗溶胀增强型组织粘合剂，所述水凝胶包括：
(1)末端修饰活性酯的多臂聚乙二醇；
(2)接枝儿茶酚基团并含多个伯氨基聚合物；
(3)成胶缓冲溶液；
其中，所述末端修饰琥珀酰亚胺活性酯基团的四臂化聚乙二醇具有以下一个或多个特征：
(1)聚乙二醇的臂数≥2；
(2)重均分子量为5000～40000；
(3)单种聚乙二醇聚合物(PEG)的分散系数(PDI)为1～1.1。
在另一优选例中，所述末端修饰琥珀酰亚胺活性酯基团的四臂化聚乙二醇的臂数为2～8，其中最佳为4。
在另一优选例中，所述末端修饰琥珀酰亚胺活性酯基团的四臂化聚乙二醇的分子量为5000～20000，其中最佳为10000。
在另一优选例中，所述末端修饰琥珀酰亚胺活性酯基团的四臂化聚乙二醇为四臂化聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯(SC)、四臂化聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯(SCM)、四臂化聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸酯(SG)、四臂化聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯(SS)等；较佳地，为四臂化聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯(SC) 和四臂化聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸酯(SG)，最佳为四臂化聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯(SC)。
其中，所述接枝儿茶酚基团并含多个伯氨基聚合物具有以下一个或多个特征：
(1)该聚合物重均分子量为1000～100000，且每个重复单元中含有伯氨基，可选聚烯丙基氨、聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚精氨酸、壳聚糖中的一种或多种；
(2)通常选用儿茶酚衍生物会含氨基聚合物进行接枝修饰，其接枝率为5％至40％之间，较优需≥15％；
(3)该聚合物衍生物具有较好的水溶性，生物体内可以降解、降解前后产物无毒。
在另一优选例中，所述含多个伯氨基聚合物可以为聚赖氨酸、聚精氨酸、聚乙烯亚胺、羧甲基壳聚糖等，其中较优的为聚赖氨酸和聚乙烯亚胺，最优为聚赖氨酸。
在另一优选案例中，所述修饰儿茶酚方法可以通过利用3,4-二羟基苯甲酸、3,4-二羟基苯乙酸、3,4-二羟基苯丙酸、3,4-二羟基苯丁酸末端的羧基和聚合物上的氨基，在缩合剂碳化二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或者4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)作用下反应得到，其中较优为3,4-二羟基苯丙酸在EDC/NHS作用下合成得到，儿茶酚衍生物和聚合物重复单元的摩尔比在2:1～1:2之间，EDC及NHS或DMTMM与聚合物冲服单元的摩尔比在2:1～1:2之间。
在另一优选案例中，所述修饰儿茶酚修饰方法可以通过利用3,4-二羟基苯甲醛或者3,4,5-三羟基苯甲醛上醛基和聚合物上的氨基自发进行席夫碱反应，反应结束后再使用硼氢化钠还原生成碳氮双键得到，儿茶酚衍生物和聚合物重复单元的摩尔比在2:1～1:2之间，硼氢化钠和和聚合物重复单元的摩尔比为1:1。
在另一优选案例中，所述接枝儿茶酚基团并含多个伯氨基聚合物在水中具有较好水溶性，溶解浓度可以大于等于10％，且溶解溶液清澈透明，流动性佳。
其中，所述成胶缓冲液包含pH为4～6弱酸性缓冲液A及pH为7～10弱碱性缓冲液B两种溶液。
在另一优选例中，pH为4～6弱酸性缓冲液A可为水、盐酸稀释液、醋酸稀释液、硫酸稀释液等；或者为磷酸二氢钠、硫酸氢钠等酸性盐溶液。
在另一优选例中，pH为8～10弱碱性缓冲液B为磷酸氢二钠、碳酸氢钠、四硼酸钠等碱性盐溶液，其中pH为9左右的盐溶液为最佳，其中盐浓度为 0.05～0.2M，最佳为0.15M。
在另一优选例中，所述水凝胶的组织粘附强度可以≥40KPa。
在另一优选例中，所述水凝胶在组织表面有较好的粘附效果，胶在体外模拟体液中(PBS)溶胀平衡后水凝胶的组织粘合强度应没有明显下降甚至增强。
在另一优选例中，所述水凝胶在体外溶胀平衡后水凝胶的吸水率≤5％。
在另一优选例中，所述水凝胶在体外模拟体液中(PBS)溶胀平衡后水凝胶的微观结构没有发生明显的变化。
本发明第二方面提供过了一种本发明第一方面所述的一种原位凝胶化抗溶胀增强型组织粘合剂的制备方法，包括步骤：
(a)对含多个伯氨基聚合物进行儿茶酚基团修饰接枝，得到同时带有氨基及儿茶酚基团的多功能交联剂；
(b)用成胶缓冲液A溶解末端修饰活性酯的多臂聚乙二醇粉末作为成胶前驱液A；
(c)用成胶缓冲液B溶解修饰儿茶酚基团并含多个伯氨基聚合物，作为成胶前驱液B；
(d)将成胶前驱液A和成胶前驱液B混合均匀，并注射/涂抹于伤口组织进行粘合/密封。
在另一优选例中，步骤(b)和(c)的顺序可以互换。
在另一优选例中，所述步骤(b)和(c)之后还包括步骤：将成胶前驱液A 和成胶前驱液B用无菌过滤器进行除菌过滤(0.22μm无菌过滤膜)，或者在配置前将所有主要成份进行辐照灭菌(有效灭菌剂量≥20KGy)。
在另一优选例中，成胶所需的温度为25℃±10℃；较佳地，为25℃。
在另一优选例中，成胶前驱液A和成胶前驱液B的体积可以相同也可以不同，其中较佳为1:1。
在另一优选例中，溶解后成胶前驱液A的物质量浓度为160～300mg/mL，其中较佳为200±10mg/mL。
在另一优选例中，溶解后成胶前驱液B的物质量浓度为50～400mg/mL，其中较佳为200±100mg/mL。
在另一优选例中，步骤(d)中，将成胶前驱A和成胶前驱液B预先混合后，再装填到无菌注射器(单筒)中，进行注射、成胶，从而形成所述的水凝胶材料。
在另一优选例中，步骤(d)中，将成胶前驱A和成胶前驱液B预先混合后，再通过涂抹刷，转移至所需伤口组织部位，原位形成水凝胶。
在另一优选例中，步骤(d)中，如图将成胶前驱A和成胶前驱液B按体积比为1:1分别装填到双筒注射器(混料器)中，进行注射、成胶，从而形成所述的水凝胶材料。
在另一优选例中，成胶所需的时间为5s～180s。
本发明第三方面提供了制备本发明第一方面所述的一种原位凝胶化抗溶胀增强型组织粘合剂的应用，用于制备医用材料。
在另一优选例中，所述医用材料用于组织粘合、组织密封、组织封堵、药物缓释、组织修复等领域。
在另一优选例中，所述医用材料为如下的一个或多个：
(1)作为皮肤敷料(可应用于创伤的皮肤，对受伤皮肤起到保护，同时促进创口的修复愈合)；
(2)作为组织粘合剂(可替代外科手术的缝合对受伤组织进行接合)；
(3)作为止血材料(可应用于人体脉管系统，作为开放性出血伤口的急性封堵止血)；
应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了儿茶酚基团在凝胶粘合剂内形成的相互作用。
图2显示了三种该原位凝胶化抗溶胀增强型组织粘合剂的制备使用方法。
图3显示了合成得到的PLL-DOHA紫外吸收图及相应接枝率计算。
图4显示了原位凝胶化抗溶胀增强型组织粘合剂良好的可注射成形性，以及优异的力学性能。
图5显示了原位凝胶化抗溶胀增强型组织粘合剂的凝胶化时间。
图6显示了原位凝胶化抗溶胀增强型组织粘合剂的溶胀性能。
图7显示了原位凝胶化抗溶胀增强型组织粘合剂的流变性能。
图8显示在水中原位凝胶化抗溶胀增强型组织粘合剂粘附于猪皮表面的稳定性。。
图9显示在水中原位凝胶化抗溶胀增强型组织粘合剂溶胀平衡前后的组织粘合强度。
图10显示了原位凝胶化抗溶胀增强型组织粘合剂自氧化前后的红外 (FTIR)谱图
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，首次设计开发出一种新型双交联原位凝胶化组织粘合剂的制备。本发明将末端修饰琥珀酰亚胺活性酯多臂聚乙二醇溶液和侧端修饰儿茶酚基团的含多个伯氨基聚合物溶液作为成胶前驱液，通过聚乙二醇末端活性酯基团和聚合物上多个氨基自发进行亲核取代反应以及聚赖氨酸上儿茶酚基团间的多种相互作用，形成双交联自固化凝胶，活性酯基团及儿茶酚基团还可与组织蛋白上氨基、巯基等发生多种键合达到较强的组织粘附效果。同时通过儿茶酚基团之间的缓慢自交联还可以抵抗组织液等进入发生的溶胀，从而使得凝胶性能保持稳定。在此基础上，完成了本发明。
本发明的主要优点：
(1)本发明利用以末端修饰活性酯的多臂聚乙二醇(n-arm-PEG-NHS与修饰儿茶酚基团并含多个伯氨基聚合物为主要两种原料，可通过活性酯与氨基间高效酰胺化反应，快速形成凝胶粘合于伤口，不使用任何有毒催化基。
(2)本发明通过将修饰儿茶酚基团并含多个伯氨基团的聚合物作为功能交联剂，聚合物网络中儿茶酚基团在中性pH环境发生自氧化交联反应，使得凝胶网络越加紧密从而有效避免水分子进入后产生的较大溶胀。
(3)交联剂上的儿茶酚同时还可与组织蛋白上氨基、巯基等发生多种键合作用达到增强的组织粘附效果。
(4)本发明无有毒物质的使用，生物安全性高，为项目的产品转化提供了良好的基础保障。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例一：新型原位凝胶化抗溶胀增强型组织粘合剂的制备
首先在氮气保护条件下，在0.1M MES(吗啉代乙磺酸)pH＝6.0缓冲溶液中，使用二羟基苯丙酸(DOHA)对聚赖氨酸(PLL)进行接枝修饰，碳化二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)作为缩合剂，基团投料比为PLL：DOHA： EDC：NHS＝1：0.5：1.5：0.5，反应时间为24h，PLL初始浓度为20mg/mL，反应完后反应结束后进行透析，透析液为0.3mmol HCl，透析3天，接着使用纯水透析4h。冻干得到PLL-DOHA衍生物，并使用紫外吸收法测试其接枝率。从图3可以看出，接枝后的PLL-DOHA衍生物的接枝率约为16％，且结果稳定。
凝胶的制备过程为，首先向末端修饰活性酯的四臂聚乙二醇 (4-arm-PEG-NHS)粉末中加入定量的盐酸稀释液，溶解后作为成胶前驱液A， 4-arm-PEG-NHS浓度为20％；然后在PLL-DOHA或PLL中加入等量体积的0.15M Na2HPO4将其溶解作为成胶前驱液B,PLL-DOHA或PLL的浓度为5～20％，再将两相成胶前驱液等量混合后涂抹或注射于目标区域，原位形成水凝胶记为 PEG-PLL/PEG-PLL-DOHA。其中为了加速水凝胶中儿茶酚基团的氧化交联反应作为对照，可在0.15M Na2HPO4缓冲液中加入0.25％H2O2及0.02mg/mL，记为PEG-PLL-DOHA(+H2O2/HRP)。
如图4所示：将混合均匀的成胶液吸取到环形模具中。可看出所形成的 PEG-PLL水凝胶为无色透明状、PEG-PLL-DOHA水凝胶为淡黄色透明状、 PEG-PLL-DOHA(+H2O2/HRP)为棕黑色。证明水凝胶中存在邻苯二苯基团，该基团在H2O2/HRP催化作用下可以快速发生氧化聚合反应使得水凝胶的外观发生明显变化。同时用两块透明玻璃片对圆柱状凝胶进行按压测试，可以看到 PEG-PLL水凝胶可被轻松压扁；而PEG-PLL-DOHA凝胶由于-DOHA之间或-DOHA及-NH2之间存在的非共价相互作用，水凝胶的弹性模量进一步增加，水凝胶具有一定韧性；而PEG-PLL-DOHA(+H2O2/HRP)凝胶由于-DOHA发生的快速氧化交联反应，水凝胶已经变得十分强韧，在玻璃按压下，玻璃片发生断裂，水凝胶依然较好的保持原状。
实施例二：新型原位凝胶化抗溶胀增强型组织粘合剂的凝胶化时间测定
通过观察“倒置离心管，成胶液流动”的方法，测定了 PEG-PLL/PEG-PLL-DOH两种水凝胶的凝胶化时间。按照上诉凝胶制备方法，将两相成胶前驱液混合并开始计时，观察混合后成胶液流动情况，当直到停止流动所记时间视为该凝胶的凝胶化时间。
如图5所示，相同配比下，PEG-PLL-DOHA相对于PEG-PLL具有更慢的成胶速率，这可以证明由于-DOHA的引入，部分氨基位点被DOHA提前占据，从而与活性酯(NHS)交联位点减少，从而导致凝胶的成胶速率变慢，这可以使得凝胶在涂抹或者注射前有更长的时间使得成胶液混合均匀。
实施例三：新型原位凝胶化抗溶胀增强型组织粘合剂溶胀率测定
按照上诉方法制备PEG-PLL、PEG-PLL-DOHA凝胶记录初始重量后(Wb)，将水凝胶置于在20mL PBS中，并放置于37℃恒温摇床中进行吸水平衡。在所设定的不同时间点取出样品，使用吸水纸擦去表面多余的水分后称重(Wa)。
根据以下计算水凝胶吸水率:
吸水率(％)＝Wa/Wb×100％(n＝3)
如图6所示：而PEG-PLL-DOHA最初由于水分子的快速进入发生了轻微的溶胀，但约5h后凝胶的吸水率发生下降并随后保持稳定。因此证明通过-DOHA 自氧化效果可以使得水凝胶的聚合物网络更加密实，从而起到抗溶胀将水排出效果。同时可以发现随着PLL-DOHA的加入量增加，凝胶内基于-DOHA交联越加紧密，从而排出更多的水使得凝胶质量下降到初始质量以下。因此经过筛选，当凝胶中PLL-DOHA含量为50mg/mL时(即成胶液B中PLL-DOHA含量为 10％)，水凝胶在水中质量达到平衡时，质量与初始质量一致，几乎不发生溶胀，因此可选择PEG-PLL-DOHA(PLL-DOHA:50mg/mL)水凝胶作为后续研究对象。同时作为对比，PEG-PLL-DOHA(PLL:50mg/mL)水凝胶溶胀明显，在第5 天溶胀率已经超过200％，且持续增加。
实施例四：新型新型原位凝胶化抗溶胀增强型组织粘合剂流变性能测定
按照上诉所述方法制备PEG-PLL/PEG-PLL-DOHA/PEG-PLL-DOHA (+H2O2/HRP)，其中成胶液B中交联剂含量为10％。本实验通过流变法测定水凝胶的动态力学性能，即储能模量(G’)及损耗模量(G”)。根据上述方法分别准备不同成分比例的成胶液注射于样品台上进行测试。选取LVR中间振幅值并在0～600s内进行时间扫描测定。分析不同水凝胶在成胶液混合之初的网络结构及动态力学反应变化过程。
从图7观察可以看出：在水凝胶反应初始阶段(0～30S)储能模量(G’) 的上升速率PEG-PLL-DOHA(+H2O2/HRP)＞PEG-PLL-DOHA＞PEG-PLL，这是因为相同时间内，由于DOHA发挥着交联作用，因此凝胶中的总交联剂数量更多。而达到平台稳定后，PEG-PLL-DOHA(+H2O2/HRP)水凝胶的G’显著大于 PEG-PLL-DOHA和PEG-PLL，因此-DOHA在氧化后可以形成更为紧密的聚合物网络结构从而拥有好高的力学性能。
实施例五：新型原位凝胶化抗溶胀增强型组织粘合剂水下粘合稳定性测试
按照上诉方法制备PEG-PLL、PEG-PLL-DOHA凝胶并注射到清洗干净的猪皮表面，其中成胶液B中交联剂含量为10％，然后将水凝胶置于在20mL PBS 中，并每天换液。
从图8可以看出，随着浸泡时间的变长，PEG-PLL-DOHA颜色由最初的淡黄色逐步变为褐色，最终变为深棕色，表明随着浸泡的时间变长，水凝胶内在不断进行氧化交联反应，使得凝胶抵抗水分子的进入及增强粘合能力。可以看到PEG-PLL在第15天已经发生了明显的溶胀，凝胶高度明显变高并随后掉落，而PEG-PLL凝胶依然可以牢固地粘附于猪皮之上。
实施例六：新型原位凝胶化抗溶胀增强型组织粘合剂水下粘合强度测定
按照上诉方法制备PEG-PLL、PEG-PLL-DOHA、PEG-PLL-DOHA(+H2O2/HRP)，其中成胶液B中交联剂含量为10％，将成胶液混合均匀后涂抹于两块猪皮间，并浸泡于磷酸盐缓冲液PBS(pH＝7.2)中15天，并每天换液。浸泡后通过氰基丙烯酸酯胶将粘合在一起的猪皮分别固定到表面经过粗糙化处理过的玻璃片的一端。并使用万能力学拉伸机夹住玻璃片对粘合在一起的猪皮进行拉伸，拉伸速率为5mm/min。拉伸过程中所测得的最大值即对应水凝胶的粘合强度，装置示意图如9-(b)所示。
从图9-(a)观察可以看出，浸泡后PEG-PLL水凝胶发生明显溶胀，部分 PEG-PLL凝胶已经从粘合处寄出(红色箭头)，而PEG-PLL-DOHA及 PEG-PLL-DOHA(+H2O2/HRP)凝胶在粘合处几乎没有任何形貌的改变。通过拉伸测试，如图9-(c)所示，浸泡前PEG-PLL-DOHA水凝胶固化之初具有较高的组织粘附强度(～52kPa),而完全氧化后PEG-PLL-DOHA(+H2O2/HRP)可以到～72 kPa，这已经明显高于绝大多数基于PEG基组织粘合剂(20～40kPa)以及猪纤维蛋白胶(～15kPa)。浸泡15天后，PEG-PLL-DOHA凝胶的粘合再次有所提升，粘合强度达到了～68kPa,而PEG-PLL-DOHA(+H2O2/HRP)凝胶粘合强度相对保持稳定，这可能是氧化剂的加入在浸泡前已经让凝胶结构达到稳定。相比之下PEG-PLL凝胶在浸泡后，凝胶强度则发生了明显的下降，已下降至原粘合强度1/2一下。因此，通过-DOHA基团引入可以使得水凝胶达到增强组织粘合的效果。
实施例七：新型原位凝胶化抗溶胀增强型组织粘合剂氧化前后红外(FTIR)谱图分析
根据上述方法将制备PEG-PLL-DOHA，并将其并浸泡于磷酸盐缓冲液PBS (pH＝7.2)15天，并每天换液，使其不断自氧化。并将自氧化前后的水凝胶研磨并冻干，并在冻干粉末中加入KBr压片。然后使用傅里叶全反射红外测试仪在4000～400cm-1范围内分别扫描并记录。
如图10所示的红外谱图：可以得到在自氧化前，在1196cm-1处 PEG-PLL-DOHA凝胶中非氧化儿茶酚上C-O振动峰以及在842cm-1处儿茶酚上 C-H振动峰明显下降。同时，儿茶酚发生自氧化后，凝胶中原有PLL-儿茶酚-OH┅NH2-PLL以及PLL-儿茶酚-OH┅O-PEG分子间氢键在3404cm-1处宽峰振动转变为3420cm-1处PLL-儿茶酚-OH┅O＝C-苯醌-PLL分子内氢键振动峰。
因此，水凝胶中的儿茶酚基团可以发生自氧化变成反应活性更高的苯醌结构，并发生后续的歧化交联等一系列反应形成网络结构更为紧密的凝胶网络结构从而抵抗水分子的进入及增强凝胶的组织粘合强度。
Claims (8)
1.一种原位凝胶化抗溶胀增强型组织粘合剂材料的制备，其主要特征在于所述材料制备主要原料包括：
(1)末端修饰活性酯的多臂聚乙二醇；
(2)修饰儿茶酚基团并含多个伯氨基聚合物；
(3)成胶缓冲溶液；
在成胶反应完成后，水凝胶中交联结构主要为以下三种：1)活性酯与伯氨形成的酰胺键交联结构；2)通过儿茶酚自交联结构；3)与伯氨相互作用形成岐化反应、阳离子-π、席夫碱、迈克尔加成等多种化学/物理交联结构。
2.如权利要求1所述的一种原位凝胶化抗溶胀增强型组织粘合剂材料的制备，其特征在于，水凝胶可以抵抗吸水溶胀，其在磷酸盐缓冲液(PBS)中浸泡吸水平衡后质量与初始重量差值≤5％。
3.如权利要求1所述的一种原位凝胶化抗溶胀增强型组织粘合剂材料的制备，其特征在于，具有较高的组织粘合强度(≥40KPa)，且在中性pH条件下，粘合强度会进一步增强。
4.如权利要求1所述的一种原位凝胶化抗溶胀增强型组织粘合剂材料的制备，其特征在于，其末端修饰活性酯的多臂聚乙二醇具有以下一个或多个特点：
(1)聚乙二醇的臂数≥2
(2)末端活性酯可为N-羟基琥珀酰亚胺碳酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺乙酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺丁二酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺戊二酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺癸二酸酯。
(3)重均分子量为5000～40000；
(4)单种聚乙二醇聚合物(PEG)的分散系数(PDI)为1～1.1。
5.如权利要求1所述的一种原位凝胶化抗溶胀增强型组织粘合剂材料的制备，其特征在于，其所述修饰儿茶酚基团并含多个伯氨基聚合物具有以下一个或多个特点：
(1)该聚合物重均分子量为1000～100000，且每个重复单元中含有伯氨基，可选聚烯丙基氨、聚乙烯亚胺、聚精氨酸、聚赖氨酸、壳聚糖中的一种或多种；
(2)通常选用3,4-二羟基苯甲酸、3,4-二羟基苯乙酸、3,4-二羟基苯丙酸、3,4-二羟基苯丁酸或者3,4-二羟基苯甲醛、3,4,5-三羟基苯甲醛对聚赖氨酸进行接枝，其接枝率为5％至40％之间；
(3)该聚合物衍生物具有较好的水溶性，生物体内可以降解、降解前后产物无毒。
6.如权利要求1所述的一种原位凝胶化抗溶胀增强型组织粘合剂材料的制备，其特征在于，所述成胶缓冲液包含A与B，成胶缓冲液A为乙酸、盐酸等酸稀释液,用水稀释后溶液pH为4-6；成胶缓冲液B为磷酸二氢钠、碳酸氢钠等碱性盐溶液。
7.如权利要求1所述的一种原位凝胶化抗溶胀增强型组织粘合剂材料的制备，其特征在于，制备使用方法为：
(a)配制成胶缓冲液；
(b)将成胶缓冲液A溶解末端修饰活性酯多臂聚乙二醇作为成胶前驱液A；
(c)用成胶缓冲液B溶解修饰儿茶酚多伯氨基聚合物，作为成胶前驱液B；
(d)将成胶前驱液A和成胶前驱液B混合均匀，涂抹或注射于伤口组织进行粘合或封闭。
8.如权利要求7所述的制备使用方法，其特征在于，所述方法包含以下一个或者多个特征：
(1)所述的成胶前驱液A中，溶质的质量浓度为160～300mg/mL,溶液具有较高的透明度及可流动性；
(2)所述的成胶前驱液B中，溶质的质量浓度为20～400mg/mL，溶液具有较高的透明度及可流动性；
(3)成胶前驱液A及成胶前驱液B可以在较短时间内混合均匀(≤10s)。
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