CN117285746A

CN117285746A - 一种基于点击化学反应的固化剂及原位凝胶

Info

Publication number: CN117285746A
Application number: CN202310405455.0A
Authority: CN
Inventors: 安杰; 彭梦琪; 李恒朝; 李筠玉; 侯佳曼; 张小河; 王莉君; 王闽龙
Original assignee: Beijing Singularity Potential Energy Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Singularity Potential Energy Technology Co ltd
Priority date: 2023-04-17
Filing date: 2023-04-17
Publication date: 2023-12-26

Abstract

本发明提供了一种基于点击化学反应的新型固化剂组合物，可用于含有游离巯基的聚合物的共价交联反应，利用这一固化剂组合物能够实现水凝胶的快速原位形成。所述固化剂组合物由磺酰氟类化合物和碱组成。这一新型固化剂组合物通过将游离巯基高效氧化偶联生成二硫键的点击化学反应，实现共价交联过程。利用这一技术能够制备原位凝胶，其以含有游离巯基的亲水聚合物为原料，利用上述点击化学反应，通过生成二硫键的方式实现聚合物链的共价交联，从而形成三维网状结构凝胶。例如，一种N‑乙酰‑L‑半胱氨酸改性的壳聚糖，能够通过上述点击化学反应快速成胶，也可在动物组织表面原位成胶；形成的水凝胶的机械性能和生物相容性好，且具有良好的组织粘附性，作为生物医用水凝胶以粘合组织、闭合伤口，具有广阔的应用前景。

Description

一种基于点击化学反应的固化剂及原位凝胶

技术领域

本发明属于生物医用材料领域，涉及一种基于点击化学反应的固化剂及原位凝胶。

背景技术

外伤或外科手术后的伤口处理及修复具有重要的临床和研究意义。常用的缝合技术存在需要麻醉、操作复杂及感染风险大等缺点。医用伤口粘合剂由于能够快速止血，粘合伤口而成为了更好的临床选择。然而，目前临床使用的医用伤口粘合剂由于组织黏附强度低、难以降解、生物兼容性差等缺点而应用受限。

水凝胶粘合剂因其化学和物理性质容易调控、紧密贴合伤口、促进伤口修复等优点而成为伤口处理和修复的潜在重要材料。其中，天然高分子水凝胶由于良好的生物相容性和生物降解能力备受关注。然而，现有的天然高分子水凝胶存在反应效率低、机械性能差、组织黏附性能力欠佳等缺点。

水凝胶制备方法主要分为物理交联和化学交联。其中物理交联是指由聚合物分子通过分子间的非共价相互作用在水溶液中自聚集形成。物理水凝胶在一定的物理刺激下，他们往往会破裂。这也限制了物理凝胶作为伤口闭合和修复的组织粘合剂的使用。化学交联是水凝胶制备的重要途径之一。分子链通过共价键交联形成三维网络结构，结构稳定性好。共价键通常由单体的自由基聚合或高分子链中官能团相互反应形成。

壳聚糖作为一种天然多糖，因为其无毒、可生物降解、生物相容等特点在生物医学和制药领域均有广泛的应用。同时，二硫键是自然界中一种普遍存在的结构，广泛存在于天然产物中，在生物系统中发挥着至关重要的作用。尽管目前已经有相关的研究，利用含有巯基的小分子改性壳聚糖通过氧化反应形成共价二硫键而交联成水凝胶，然而，由于形成二硫键的氧化反应效率低，使得形成水凝胶时间长，水凝胶强度弱，组织黏附能力差。近年来，点击化学反应因为其高效、经济、绿色而广泛应用于有机合成、医药研发及材料研发当中。因此，含有巯基的小分子修饰的壳聚糖在高效的点击化学反应下快速生成二硫键，进而高效地原位形成水凝胶将大幅改善天然高分子水凝胶的相关性质，使其在粘合组织，闭合伤口等领域具有更广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于点击化学反应的固化剂和天然高分子原位凝胶及其在粘合组织中的用途。本发明使用无毒、可生物降解、生物相容的天然高分子壳聚糖作为主要材料，用含有巯基的生物相容小分子N-乙酰-L-半胱氨酸进行改性，通过高效的硫酰氟介导的点击化学反应实现快速原位成胶。

上述一种基于点击化学的固化剂组合物，用于含有游离巯基的聚合物的共价交联反应，包含：

磺酰氟类化合物和碱，所述磺酰氟类化合物的通式为R(SO₂F)_n，所述碱为有机碱或无机碱；

其中所述R为氟、甲基取代的苯环、苄基、苯氧基、咪唑鎓盐、乙酰胺取代苯胺基中的一种；n等于1或2；

其中所述组合物在与液态含有游离巯基的聚合物或含有游离巯基的聚合物的溶液混合后快速通过形成二硫键发生共价交联。

上述一种原位凝胶形成组合物，所述原位凝胶形成组合物包含：

组分A：一种含有游离巯基的亲水聚合物和碱，所述碱为有机碱或无机碱；

组分B：磺酰氟类化合物的饱和溶液，所述磺酰氟类化合物的通式为R(SO₂F)_n；

其中所述碱为三乙胺、甲醇胺、乙醇胺、三乙醇胺、1，8-二氮杂二环十一碳-7-烯、吡啶、碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠中的一种或几种的任意比例混合；

其中所述组分A和组分B在水性环境中接触时快速形成水凝胶。

所述一种基于点击化学的固化剂组合物，其特征在于：可以在以有机溶剂为介质，以水为介质或生理条件下使用。

所述一种基于点击化学的固化剂组合物，包含：

其中所述磺酰氟类化合物选自如下图的化合物A、化合物B、化合物C、化合物D、化合物E、化合物F或其在有机溶剂或水中的溶液；

优选的，所述磺酰氟类化合物为饱和化合物A硫酰氟溶液；

优选的，所述碱为三乙胺。

所述一种原位凝胶形成组合物，能够在生理条件下使用；组分A与组分B接触后，在水环境中能够在1min后形成水凝胶；在1min内，其为可注射液体。

所述一种原位凝胶形成组合物，包含：

其中所述含有游离巯基的亲水聚合物选自含有巯基的小分子改性的壳聚糖、α，ω-二巯基聚乙二醇、四臂聚乙二醇硫醇；

优选的，所述含有游离巯基的亲水聚合物为含有巯基的小分子改性的壳聚糖；

优选的，所述碱为三乙胺；

其中所述磺酰氟类化合物饱和溶液选自如下图的化合物A、化合物B、化合物C、化合物D、化合物E、化合物F在有机溶剂或水中的溶液；

优选的，所述的磺酰氟类化合物为化合物A硫酰氟饱和溶液。

所述一种原位凝胶形成组合物，所述组分A为：含有巯基的小分子改性的壳聚糖溶液和三乙胺溶液。

其中所述含巯基的小分子为N-乙酰-L-半胱氨酸，所述壳聚糖粘度＞400mPa.s，所述含巯基的小分子改性的壳聚糖的巯基含量为300-400μmol/g；

其中所述壳聚糖溶液的溶剂为PBS缓冲液(0.01M)，溶液质量体积比(w/v)为2％-4％；

优选的，所述壳聚糖溶液质量体积比为4％；

其中所述三乙胺溶液，溶液摩尔浓度为0.05-1.00M；

优选的，所述三乙胺溶液的摩尔浓度为0.20M；

其中所述三乙胺溶液的溶剂为乙腈或水；

优选的，所述三乙胺溶液的溶剂为乙腈；

其中所述组分B为：化合物A硫酰氟的饱和溶液，所述溶液为乙腈。

本发明所述的一种基于点击化学反应的共价交联原位凝胶，将两个组分混合均匀即可原位快速成胶。

本发明所述的原位凝胶形成组合物，其特征在于，将组分A，B混合均匀即可通过形成二硫键原位快速成胶。

本发明还提供了一种固化剂组合物和原位凝胶形成组合物在组织粘合中的用途。

本发明的有益效果在于：

1)本发明使用无毒、可生物降解、生物相容的天然高分子壳聚糖作为主要材料，用含有巯基的生物相容小分子N-乙酰-L-半胱氨酸进行改性。

2)本发明利用硫酰氟介导的点击化学反应，通过将游离巯基高效氧化偶联生成二硫键而聚合成胶，快速高效。

3)本发明水凝胶的机械性能良好，具有优异的组织粘附性能，使用时稳定不易损坏。

附图说明

图1为改性壳聚糖的合成

图2为壳聚糖改性前后的产物红外表征

图3为实施例CS-NAC水凝胶流变学性能评价

图4为水凝胶的扭转实验结果

图5为双染荧光显微镜图

图6为大鼠伤口模型及处理

图7为大鼠伤口组织HE染料染色显微镜图

具体实施方式

除另有说明外，本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

本发明所用“含巯基改性的壳聚糖”为N-乙酰-L-半胱氨酸修饰的壳聚糖，按照如下方法合成：

1.将500mg粘度＞400mPa.s的壳聚糖(CS)完全溶解在去离子水中，加入1-羟基苯并三唑(HOBT)(2.58mmoL)，搅拌至完全溶解。

2.室温下，将N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)(5.16mmoL)加入CS溶液中，搅拌至完全溶解。再将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)(20.64mmoL)加入CS溶液中，搅拌至完全溶解。

3.用HCl(1M)调节pH至5，反应过夜。

4.反应完成后，将反应产物装入透析袋(截留分子量为14kDa)，在含有乙二胺四乙酸(2μM)，HCl(5mM)的去离子水中透析3天，每天换2次水。冷冻干燥获得修饰的壳聚糖CS-NAC样品。

合成示意图如图1所示。

制备完成后，用Ellman试剂测定自由巯基的含量，测得巯基含量为300-400μmol/g。通过傅立叶变换红外吸收光谱仪对壳聚糖改性前后的产物进行红外表征，如图2所示，FT-IR(KBr)：1619.7(amideIband)，1514.2(amideIIband)，1314.61(amideIIIband)cm^-1。证明了：在HOBT和EDC·HCl的作用下，N-乙酰-L-半胱氨酸被成功接枝在壳聚糖上。

实施例、本发明水凝胶的制备

1.将冻干后的CS-NAC以质量体积比4％溶解在PBS(1X，1.00mL)溶液中。振荡，使其充分溶解，该溶液现配现用。

2.配制0.20M的三乙胺在乙腈中的溶液。

3.将SO₂F₂气体通入乙腈溶液中，配制饱和SO₂F₂溶液。

4.加入0.1mL步骤2中溶液到步骤1溶液中，混合均匀。再加入0.1mL步骤3中溶液到上述溶液中，混合均匀。凝胶在30s内形成。

通过以下测试证明本发明的有益效果。

测试1、实施例所述水凝胶的强度和稳定性测定

1、实验方法

对实施例制备的水凝胶进行流变学性能评价。

2、实验结果

如图3所示。CS-NAC水凝胶，在初始阶段，储能模量(G′)大于损耗模量(G″)，表现出凝胶体的性质。从图5的结果可以看出，随着扫描时间的增加，水凝胶的G′从14.13Pa增加到69.55Pa，这是因为在凝胶网络中引入了更多二硫键，因而凝胶强度增加。

综上所述，本发明的水凝胶具有良好的结构稳定性。

测试2、实施例所述水凝胶的粘附性能测定

1、实验方法

搭接剪切强度和扭转能力是评价水凝胶组织粘附能力的重要评价指标，本发明对实施例的水凝胶通过搭接剪切测试和扭转实验测试粘附能力。

水凝胶组织粘附性能评价方法：采用搭接剪切测试和扭转实验评价水凝胶的组织粘附能力，测试仪器为万能材料测试机，型号为Instron3367。

搭接剪切测试过程如下：先将猪皮切割为1cm×3.5cm，用PBS溶液洗净后，再将200μL水凝胶均匀黏附在猪皮的表面，粘接面积为1×1cm²，立即将另外一块猪皮覆盖在该样本上。室温下，用20g的砝码压在结合部位过夜，然后上机测试。测试速度为10mm/min，记录最大力，检测粘附性能。

扭转实验测试过程如下：先将猪皮切割为3cm×8cm，用PBS溶液洗净后，再将1mL掺入微量孔雀石蓝的水凝胶均匀涂抹在猪皮上表面。60分钟后，镊子夹住两头扭转猪皮，观察凝胶的黏附状态。

2、实验结果

水凝胶的搭接剪切强度为42.5kPa。与目前相关文献报导的水凝胶搭接剪切强度相当。由此可见，本发明水凝胶具有良好的组织粘附性

如图4所示，扭转前后，水凝胶没有脱落或断裂现象。表明水凝胶在动态伤口处仍有较好的组织粘附性。

综上所述，本发明水凝胶表现出优异的组织粘附能力，在医用组织粘合剂领域有潜在的应用价值。

测试3、实施例所述水凝胶的生物相容性测定

1、实验方法

细胞相容性是组织粘合剂的基本要求之一，按照如下方法对实施例的水凝胶进行细胞相容性评价：

水凝胶的细胞相容性评价采用CCK-8法和活死染色法评价，所用细胞为小鼠成纤维细胞系(L929，国家实验细胞资源共享服务平台)。用CCK-8法评价L929细胞增殖，取100μL含有L929细胞的培养基(约1×10⁵细胞/mL，培养基：10％胎牛血清、1％青霉素和链霉素)于96孔板中。1天后，用PBS缓冲液洗96孔板三次，再往96孔板中添加100μL含有5mg水凝胶的培养基。1天后检测细胞增殖情况，完全培养基作为对照。检测时，吸干96孔板内的培养基，再用PBS缓冲溶液洗3次，之后加入100μL CCK-8稀释液(CCK-8试剂：培养基稀释＝1∶9)，37℃孵育2h后用酶标仪(Biotek Synergy HTX，USA)检测450nm处的吸光度(OD值)。

活死染色检测细胞的存活情况与状态。细胞铺板方法与CCK-8法相同，在100μL含有5mg水凝胶的培养基刺激细胞1天后进行活死染色。将二乙酰荧光素(FDA)溶于丙酮中，配制1mg/mL。将30μL FDA与30μL碘化丙啶(PI)加入10mL PBS溶液中配制双染溶液，混匀后待用。检测时，吸干孔板内的培养基，加入100μL双染溶液，37℃孵育15min后，用荧光显微镜(LeicaDFC450C，GER)进行观察并拍摄。

2、实验结果

在含有5mg水凝胶的培养基与L929细胞共培养1天后，相较于对照组，细胞存活率＞98％，并未表现出细胞毒性，表明水凝胶不会影响L929细胞的增殖。通过活死染色结果(图5)可以看出，视野中基本全部为绿色荧光，即活细胞占了大部分，罕见死细胞，也就是红色荧光区域。此外，经过与含有水凝胶的培养基共培养，细胞保持其梭形的形态，状态良好。综上所述，本发明水凝胶并未影响细胞的增殖与活性，说明其细胞相容性良好。

测试4、实施例所述水凝胶的创面修复能力测定

选取体重在260～280g的雄性SD大鼠，用0.22mL50(50mg/mL)将大鼠麻醉，之后剃除大鼠背部毛发，用手术刀在大鼠背部垂直于脊柱方向平行制造三个长度为1.5cm的全皮层伤口。这三个伤口被分为三组：空白对照组，实验组和医用胶对照组。空白对照组，用生理盐水处理伤口，并且用手轻柔地将伤口两端挤压在一起，保持一分钟；实验组，将水凝胶(200μL)均匀涂敷于伤口上，并且用手轻柔地将伤口两端挤压在一起，保持一分钟；医用胶对照组，将医用胶(北京康派特医疗器械有限公司)(200μL)均匀涂敷于伤口上，并且用手轻柔地将伤口两端挤压在一起，保持一分钟。伤口处理完后，将/>覆盖于伤口表面，并且用医用胶布固定，防止脱落。7天后，通过脱颈法处死大鼠，伤口皮肤被分离，并且用4％多聚甲醛溶液固定72h。随后，这些组织被石蜡包埋，垂直皮肤平面切4μm厚的组织切片。HE染料染色后，使用显微镜(OLYMPUS BX43)观察，结果如图6所示，用天然生物二硫键交联的凝胶具有良好的生物相容性。经凝胶处理的创面未见纤维化和坏死。且凝胶处理后创面附近炎性细胞的出现少于CK组和氰丙烯酸酯处理组。

Claims

1.一种基于点击化学的固化剂组合物，用于含有游离巯基的聚合物的共价交联反应，包含：

其中R为氟、甲基取代的苯环、苄基、苯氧基、咪唑鎓盐、乙酰胺取代苯胺基中的一种；n等于1或2；

其中所述组合物在与液态含有游离巯基的聚合物或含有游离巯基的聚合物的溶液混合后通过快速生成二硫键发生共价交联。

2.一种原位凝胶形成组合物，所述原位凝胶形成组合物包含:

其中碱为三乙胺、甲醇胺、乙醇胺、三乙醇胺、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯、吡啶、碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠中的一种或几种的任意比例混合；

3.如权利要求1所述一种基于点击化学的固化剂组合物，其特征在于：可以在以有机溶剂为介质、以水为介质或生理条件下使用。

4.如权利要求1所述一种基于点击化学的固化剂组合物，其特征在于：

所述磺酰氟类化合物选自如下图的化合物A、化合物B、化合物C、化合物D、化合物E、化合物F或其在有机溶剂或水中的溶液；

优选的，所述磺酰氟类化合物为饱和化合物A硫酰氟溶液；

其中所述碱为三乙胺、甲醇胺、乙醇胺、三乙醇胺、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯、吡啶、碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠中的一种或几种的任意比例混合；

优选的，所述碱为三乙胺；

5.如权利要求2所述的一种原位凝胶形成组合物，其特征在于：能够在生理条件下使用；组分A与组分B接触后，在水环境中能够在1min后形成水凝胶；在1min内，其为可注射液体。

6.如权利要求2所述的一种原位凝胶形成组合物，其特征在于：

所述含有游离巯基的亲水聚合物选自含有巯基的小分子改性的壳聚糖、α,ω-二巯基聚乙二醇、四臂聚乙二醇硫醇；

所述碱选自三乙胺、甲醇胺、乙醇胺、三乙醇胺、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯、吡啶、碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠；

优选的，所述碱为三乙胺；

所述磺酰氟类化合物饱和溶液选自如下图的化合物A、化合物B、化合物C、化合物D、化合物E、化合物F在有机溶剂或水中的溶液；

优选的，所述的磺酰氟类化合物为化合物A硫酰氟饱和溶液；

7.如权利要求2所述的一种原位凝胶形成组合物，其特征在于：所述组分A为：含有巯基的小分子改性的壳聚糖溶液和三乙胺溶液;

所述含巯基的小分子为N-乙酰-L-半胱氨酸，所述壳聚糖粘度>400 mPa.s，所述含巯基的小分子改性的壳聚糖的巯基含量为300 – 400 μmol/g；

所述壳聚糖溶液的溶剂为PBS缓冲液（0.01M），溶液质量体积比（w/v）为2% – 4%；

优选的，所述壳聚糖溶液质量体积比为4%；

所述三乙胺溶液，溶液摩尔浓度为0.05 – 1.00 M；

优选的，所述三乙胺溶液的摩尔浓度为0.20M；

所述三乙胺溶液的溶剂为乙腈或水；

优选的，所述三乙胺溶液的溶剂为乙腈；

所述组分B为：化合物A硫酰氟的饱和溶液，所述溶液为乙腈。

8.如权利要求2, 5–7任一项所述的一种原位凝胶形成组合物，其特征在于，将组分A,B混合均匀即可通过形成二硫键原位快速成胶。

9.如权利要求1 – 8所述的一种固化剂组合物和原位凝胶形成组合物在组织粘合中的用途。