JP5681605B2 - アジドまたはアセチレン末端水溶性ポリマー - Google Patents

Description

本発明は、アジド部分またはアルキン部分を含む親水性化合物ならびにポリマーの誘導体、その合成方法、および分子の特徴もしくは特性の改善におけるその使用方法に関する。

ＰＥＧと略記される親水性ポリマー、ポリ（エチレングリコール）を共有結合させることは、タンパク質、ペプチド、および特に疎水性分子を含む多くの生物活性分子の水溶解性および生物学的利用能を増大し、循環時間を延長する１つの方法である。ＰＥＧは、医薬において、人工移植材料に、ならびに生体親和性、毒性の無いこと、および免疫抗原性の無いことが重要である他の用途において、広範囲にわたって使用されてきた。ＰＥＧの所望の特性を最大にするためには、水溶解性および循環半減期を増大させる一方、親分子の生物活性に逆効果を与えないなどの、ＰＥＧポリマー結合に通常伴う有利な特徴を与えるために、生物活性分子に結合しているＰＥＧポリマーまたはポリマー類の総分子量および水和状態を十分に高くする必要がある。

ＰＥＧ誘導体は、しばしば、リシン、システインおよびシスチジン残基、Ｎ−テルミナス、炭水化物部分などの反応性化学官能基により生物活性分子に結合される。タンパク質および他の分子は、ポリマーに結合可能な反応性部位の数がしばしば制限される。ポリマー結合を介した変性に最も適する部位は、しばしば受容体結合において重要な役割を果たし、分子の生物活性の保持のために必要である。結果として、生物活性分子上のこのような反応性部位に、ポリマー鎖を無差別に結合することは、しばしばポリマー変性分子の生物活性の著しい低下または全体の喪失さえももたらす。Ｒ．Ｃｌａｒｋ等、（１９９６）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１：２１９６９〜２１９７７。標的分子に所望の利点を与えるため、十分なポリマー分子量を有する結合体を形成するために、従来の技術的探索では、通常は、分子に多数のポリマーアームをランダムに結合させ、それにより、親分子の生物活性における低下、またはさらに全体的喪失の危険性を増大している。

タンパク質にＰＥＧ誘導体を結合するための位置を形成する反応性部位は、タンパク質の構造によって決定される。酵素を含むタンパク質は、アルファ−アミノ酸が種々配列した構造であり、一般構造Ｈ_２Ｎ−ＣＨＲ−ＣＯＯＨを有する。１個のアミノ酸のアルファアミノ部分（Ｈ_２Ｎ−）は、隣接するアミノ酸のカルボキシル部分（−ＣＯＯＨ）に結合して、アミド結合を形成し、これは−（ＮＨ−ＣＨＲ−ＣＯ）_ｎ−と表され、下付き数字「ｎ」は、数百または数千に相当しうる。Ｒによって表される部分は、タンパク質生物活性のための、およびＰＥＧ誘導体の結合のための反応性部位を含むことができる。

例えば、アミノ酸リシンの場合には、イプシロン位ならびにアルファ位に、−ＮＨ_２部分がある。イプシロン−ＮＨ_２は、塩基性ｐＨの状態で自由に反応する。ＰＥＧによるタンパク質誘導体化の分野における技術の多くは、タンパク質中に存在するリシン残基のイプシロン−ＮＨ_２部分に結合するためのＰＥＧ誘導体の開発を対象としてきた。「進歩したＰＥＧ化のためのポリエチレングリコールおよび誘導体」（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）、Ｎｅｋｔａｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃａｔａｌｏｇ、２００３、１〜１７頁。しかし、これらのＰＥＧ誘導体には、全て、それらをタンパク質の表面上にしばしば多数存在するリシン残基の間に選択的に組み込むことができないという共通の限界がある。これは、例えばリシン残基が、酵素活性部位に存在するタンパク質活性に重要である場合に、または受容体結合部位の場合のように、他の生物分子とのタンパク質の相互作用の媒介にリシン残基が役割を果たす場合に、著しい限定となりうる。

タンパク質ＰＥＧ化のための現在の方法の、第２の、および同じく重要な厄介な問題は、ＰＥＧ誘導体が所望の残基ではない残基と望ましくない副反応を生じる可能性があることである。ヒスチジンは、構造的に−Ｎ（Ｈ）−と表される反応性イミノ部分を含むが、イプシロン−ＮＨ_２と反応する誘導体の多くは、また−Ｎ（Ｈ）−と反応しうる。同様に、アミノ酸システインの側鎖は、構造的に−ＳＨと表される遊離スルフヒドリル基を担持している。いくつかの場合に、リシンのイプシロン−ＮＨ_２基を対象とするＰＥＧ誘導体が、またシステイン、ヒスチジンまたは他の残基と反応する。これは、ＰＥＧ誘導体化生物活性分子の複合混合物、および標的とする生物活性分子の活性を破壊する危険を作り出す可能性がある。明確で予測可能な、タンパク質表面上の特定部位における生物活性分子に、１個または複数のＰＥＧポリマーを選択的にカップリングさせるようにする、タンパク質内の単一の部位に化学官能基の導入を可能とするＰＥＧ誘導体を開発することは望ましいはずである。

リシン残基に加えて、当技術分野においてシステイン、シスチジンおよびＮ−末端を含む他のアミノ酸側鎖を標的とする活性化ＰＥＧ反応試薬の開発に多大の努力が向けられてきた。米国特許第６６１０２８１号。「進歩したＰＥＧ化のためのポリエチレングリコールおよび誘導体」（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）、Ｎｅｋｔａｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃａｔａｌｏｇ、２００３、１〜１７頁。特定部位の突然変異誘発および当技術分野において知られている他の技法を使用して、システイン残基を、タンパク質の構造中に部位選択的に導入することができ、得られた遊離スルフヒドリル部分は、チオール反応性官能基を担持するＰＥＧ誘導体と反応させることができる。しかし、この探索は、遊離スルフヒドリル基の導入が、得られるタンパク質の発現、折りたたみ、および安定性を複雑にするという点で複雑である。したがって、同時にスルフヒドリルおよびタンパク質中に通常見出される他の化学官能基と適合性（すなわち、望ましくない副反応をしない）である一方、タンパク質に１個または複数のＰＥＧポリマーを選択的にカップリングさせることが可能である、生物活性分子に化学官能基を導入する手段を有することは望ましいであろう。

当技術分野のサンプリングからわかる通り、タンパク質の側鎖、特に、リシンアミノ酸側鎖上の−ＮＨ_２部分およびシステイン側鎖上の−ＳＨ部分に結合させるために開発されてきたこれらの誘導体の多くには、これらの合成および使用において、問題があることがわかった。ある誘導体は、加水分解を受けやすく、したがって血流などの水流環境中で、非常に永くは持続しない、タンパク質との不安定な結合を形成する。ある誘導体は、より安定な結合を形成するが、結合が形成される前に加水分解されやすく、これは、ＰＥＧ誘導体上の反応性基が、タンパク質が結合される前に不活性化される恐れがあることを意味する。ある誘導体は、多少有毒であり、したがって生体内での使用に、あまり適さない。ある誘導体は、実際に有用であるためには反応するのが遅すぎる。ある誘導体は、タンパク質の活性を担っている部位に結合することによってタンパク質の活性を喪失させる。ある誘導体は、これが結合しようとする部位が明確でなく、このことは、また望ましい活性の喪失および結果の再現性の欠如をもたらす可能性がある。タンパク質をポリ（エチレングリコール）部分で変性することに伴う課題を克服するために、より安定である（例えば、米国特許第６６０２４９８号）またはチオール部分と分子および表面上で選択的に反応する（例えば、米国特許第６６１０２８１号）ＰＥＧ誘導体が開発されてきた。選択的に反応して、安定な化学結合を形成する要請があるまで、生理学的環境において化学的に不活性であるＰＥＧ誘導体が、当技術分野において明らかに必要である。

近年、タンパク質科学において、全く新規な技術が報告されており、これはタンパク質の部位特定変性に伴う限界の多くを克服することを約束する。詳細には、新規な成分が、原核生物Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（大腸菌）（例えば、Ｌ．Ｗａｎｇ等（２００１）、Ｓｃｉｅｎｃｅ２９２：４９８〜５００）および真核生物Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（例えば、Ｊ．Ｃｈｉｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ３０１：９６４〜７（２００３））のタンパク質合成機構部分に加えられ、これは非遺伝子的にコードされたアミノ酸を生体内でタンパク質に組み込むことを可能にした。光親和性標識を含む新規な化学的、物理的、生物学的特性を有するいくつかの新規なアミノ酸および光異性化可能なアミノ酸、ケトアミノ酸、およびグリコシル化アミノ酸が、大腸菌中の、および酵母中のタンパク質に、アンバーコドン、ＴＡＧに応じてこの方法論を使用して効率的に、高い信頼度で組み込まれてきた。例えば、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ等（２００２）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２４：９０２６〜９０２７；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ＆Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ（２００２）、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ １１：１１３５〜１１３７；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ等（２００２）、ＰＮＡＳ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９９：１１０２０〜１１０２４：およびＬ．Ｗａｎｇ＆Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ（２００２）、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．、１〜１０参照。これらの研究は、アルキン基およびアジド部分などの化学官能基を選択的に、型通りに導入することが可能であることを示した。これらの化学官能基は、タンパク質中に見出されず、２０個の通常の遺伝子的にコードされたアミノ酸中に見出される全ての官能基に対して化学的に不活性であり、効率的および選択的に反応して安定な共有結合を形成する。

タンパク質中に、非遺伝子的にコードされたアミノ酸を組み込む能力は、リシンのイプシロン−ＮＨ_２、システインのスルフヒドリル−ＳＨ、ヒスチジンのイミノ基等などの天然に生じる官能基の、価値のある代替を提供することができる化学官能基を導入することを可能にする。ある種の化学官能基が、通常の２０個の遺伝子的にコードされたアミノ酸中に見出される官能基に対して不活性であるが、正確に、効率的に反応して、安定な結合を形成することが知られている。例えば、アジド基およびアセチレン基は、触媒量の銅の存在下で、水性状態においてＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］シクロ付加反応を行うことが当技術分野において知られている。例えば、Ｔｏｒｎｏｅ等（２００２）、Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：３０５７〜３０６４；および、Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ等（２００２）、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．編４１：２５９６〜２５９９参照。例えば、タンパク質構造中に、アジド部分を導入することによって、タンパク質中に見出されるアミン、スルフヒドリル、カルボン酸、ヒドロキシ基に対して化学的に不活性であるが、円滑に、効率的にアセチレン部分とさらに反応して、シクロ付加生成物を形成する官能基を組み込むことができる。重要なことには、アセチレン部分が存在しない場合には、アジドは化学的に不活性であり、他のタンパク質側鎖の存在において、生理学的状態下で非反応性である。

米国特許第６６１０２８１号明細書 米国特許第６６０２４９８号明細書

Ｒ．Ｃｌａｒｋ等、（１９９６）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１：２１９６９〜２１９７７ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）、Ｎｅｋｔａｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃａｔａｌｏｇ、２００３、１〜１７頁 Ｌ．Ｗａｎｇ等（２００１）、Ｓｃｉｅｎｃｅ２９２：４９８〜５００ Ｊ．Ｃｈｉｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ３０１：９６４〜７（２００３） Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ等（２００２）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２４：９０２６〜９０２７ Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ＆Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ（２００２）、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ １１：１１３５〜１１３７ Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ等（２００２）、ＰＮＡＳ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９９：１１０２０〜１１０２４ Ｌ．Ｗａｎｇ＆Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ（２００２）、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．、１〜１０参照 Ｔｏｒｎｏｅ等（２００２）、Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：３０５７〜３０６４ Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ等（２００２）、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．編４１：２５９６〜２５９９参照

当技術分野は、タンパク質構造中に非遺伝子的にコードされたアミノ酸を導入する組成物および方法を開示しているが、新規な化学官能基と、効率的かつ特異的に反応することができるＰＥＧ誘導体を開発する努力がなされていなかった。したがって、ＰＥＧポリマーに伴う利益（すなわち、増大した溶解性、安定性および半減期ならびに減少した免疫原性）を提供し、しかも、ポリ（エチレングリコール）誘導体によるタンパク質の変性における使用に対して、より大きな選択性および多様性を提供する新規なＰＥＧ誘導体が当技術分野において必要である。本発明は、このこと、および他のニーズを実現する。

本発明は、いくつかの実施形態において、ポリマーおよび少なくとも１個の末端アジド部分を含む水溶性化合物を提供する。化合物またはポリマーは、広範囲の適切な水溶性化合物またはポリマーから選択することができる。一実施形態において、化合物またはポリマーは、限定はしないが、核酸分子、ポリペプチド、荷電した化合物またはポリマー、および直鎖、分枝もしくは多アームの化合物またはポリマーを含む。他の実施形態においてポリマーには、限定はしないが、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、およびポリ（オレフィンアルコール）が含まれる。いくつかの実施形態において、ポリマーには、限定はしないが、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（オキシエチル化グリセロール）、ポリ（オキシエチル化ソルビトール）、ポリ（オキシエチル化グルコース）、およびポリ（ビニルアルコール）が含まれる。本発明の水溶性化合物は、例えば、アジド部分が、ポリマー骨格に、共有結合的に直接結合しているポリ（エチレングリコール）アジドなどのポリマーである。別法としては、アジド部分は、ポリマー骨格に、リンカーを介して共有結合的に結合することができる。いくつかの実施形態において、ポリマーは直鎖ポリマーであり、化合物は、アジド部分以外の反応性官能基により置換されていない。他の実施形態において、ポリマーは、ランダムもしくはブロックコポリマーもしくはターポリマーである。

いくつかの実施形態において、本発明は、ａ）ポリマー骨格の少なくとも第１の末端にアジド部分、ｂ）ポリマー骨格の第２の末端に少なくとも第２の官能基を含む、ダンベル構造を有する水溶性化合物を提供する。第２の官能基は、もう１つのアジド部分または異なる反応基であってよい。いくつかの実施形態において、第２の官能基は、アジド部分と反応性ではない。本発明は、いくつかの実施形態において、分枝分子構造の少なくとも１個のアームを含む水溶性化合物を提供する。例えば、分枝分子構造は樹状であってよい。

いくつかの実施形態において、アジド部分は、表面上または分子中にあることがある他の反応性部分と結合を形成する。例えば、反応性部分は、アセチレン部分でありうる。アジド部分は、リンカー部分を含む結合によって前記ポリマーに結合することができる。これらの実施形態において、ポリマーは、前記リンカー部分に結合するために、アジド部分以外の少なくとも第２の官能基を含むことができる。例えば、第２の官能基は、求核性置換に対し特異的であり得て、リンカー部分は、前記官能基と反応する能力のある求核性部分を含むことができる。他の実施形態において、第２の官能基は、アミン特異的であり、前記リンカー部分は、活性アミン部分を含む。他の例として、第２の官能基は求電子性カルボニルにおける反応に対して特異的であり、前記リンカー部分は、求電子性カルボニル部分を含むことができる。例えば、第２の官能基は活性化エステルとの反応に対して特異的であり得て、リンカー部分は、活性化エステルを含むことができる。他の例として、第２の官能基はケトンとの反応に対して特異的であり得て、前記リンカー部分はケトンを含む。他の実施形態において、第２の官能基はチオール求核剤との反応に対して特異的であり、リンカー部分は、チオール求核剤を含む。第２の官能基は、いくつかの実施形態において、ヒドロキシル求核剤との反応に対して特異的であり、リンカー部分は、ヒドロキシル求核剤を含む。

いくつかの実施形態において、本発明の水溶性化合物は、約１１以下のｐＨにおいて水性環境において安定である。

適切なリンカー部分は、限定しないが、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、および−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−を含む。

また、本発明は、加水分解に対して安定である水溶性活性化ポリマーを提供し、この活性化ポリマーは次式を有し：
Ｒ−ＣＨ_２ＣＨ_２−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ−Ｎ_３、式中、
ｎは、約５〜３０００であり、Ｒは、キャッピング基、官能基またはアジドと同一または異なっていてよい脱離基である。Ｒは、例えば、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、アルコキシル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、１−ベンゾトリアゾリルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネート、１−ベンゾトリアゾリルカーボネート、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、アミノオキシ、保護アミン、ヒドラジド、保護ヒドラジド、保護チオール、カルボン酸、保護カルボン酸、イソシアナート、イソチオシアナート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセタミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレート、およびトレシレート、アルケン、およびケトンからなる群から選択される官能基であってよい。

また、本発明は、ポリマーおよび少なくとも１個のアセチレン部分を含む水溶性化合物を提供し、このポリマーは、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、およびポリ（オレフィンアルコール）からなる群から選択される。ポリマーは、いくつかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（オキシエチル化グリセロール）、ポリ（オキシエチル化ソルビトール）、ポリ（オキシエチル化グルコース）、およびポリ（ビニルアルコール）からなる群から選択される。例えば、化合物は、ポリ（エチレングリコール）アセチレンであってよく、このアセチレン部分は、エーテル結合を介して、ポリマー骨格に共有結合している。いくつかの実施形態において、化合物は、ポリ（エチレングリコール）アセチレンであり、アセチレン部分は、ポリマー骨格に直接共有結合している。別法として、アセチレン部分は、リンカーを介してポリマー骨格に共有結合することができる。いくつかの実施形態において、ポリマーは、直鎖ポリマーであり、化合物は、アセチレン部分以外は、置換されない。他の実施形態において、ポリマーは、ランダムもしくはブロックコポリマーまたはターポリマーである。

いくつかの実施形態において、本発明は、ａ）ポリマー骨格の少なくとも第１の末端にアセチレン部分、ｂ）ポリマー骨格の第２の末端に少なくとも第２の官能基を含む、ダンベル構造を有する水溶性化合物を提供する。第２の官能基は、もう１つのアセチレン部分または異なる反応基であってよい。いくつかの実施形態において、第２の官能基は、アセチレン部分と反応性ではない。本発明は、いくつかの実施形態において、分枝分子構造の少なくとも１個のアームを含む水溶性化合物を提供する。例えば、分枝分子構造は樹状であってよい。

いくつかの実施形態において、アセチレン部分は、表面上または分子中の反応性部分と結合を形成する。例えば、反応性部分は、アセチレン部分でありうる。アセチレン部分は、リンカー部分を含む結合によって前記ポリマーに結合することができる。これらの実施形態において、ポリマーは、前記リンカー部分に結合するために、アセチレン部分以外の少なくとも第２の官能基を含むことができる。例えば、第２の官能基は、求核性置換に対し特異的であり得て、リンカー部分は、前記官能基と反応する能力のある求核性部分を含むことができる。他の実施形態において、第２の官能基は、アミン特異的であり、前記リンカー部分は、活性アミン部分を含む。他の例として、第２の官能基は求電子性カルボニルにおける反応に対して特異的であり、前記リンカー部分は、求電子性カルボニル部分を含むことができる。例えば、第２の官能基は活性化エステルとの反応に対して特異的であり得て、リンカー部分は、活性化エステルを含むことができる。他の例として、第２の官能基は、ケトンとの反応に対して特異的であり得て、前記リンカー部分は、ケトンを含む。他の実施形態において、第２の官能基は、チオール求核剤との反応に対して特異的であり、リンカー部分は、チオール求核剤を含む。第２の官能基は、いくつかの実施形態において、ヒドロキシル求核剤との反応に対して特異的であり、リンカー部分は、ヒドロキシル求核剤を含む。

本発明は、限定はしないが、ＰＥＧ誘導体を含む、水溶性化合物またはポリマーの誘導体により、タンパク質を選択的に変性する極めて効率的な方法を提供する。本発明の水溶性化合物またはポリマーの誘導体は、適当な官能基を含む任意のタンパク質に添加することができる。適当な官能基は、限定はしないがアミノ末端、カルボキシル末端を含む適切な位置にある分子、またはポリペプチド鎖内の１個または複数のアミノ酸を変性することによって、ポリペプチドに付加される。適当な官能基は、１個または複数の天然に生じるアミノ酸の１個または複数の側鎖を変性することによって、ポリペプチドに付加してもよい。別法として、適当な官能基は、官能基を存在させながらアミノ酸による標準的化学的ポリペプチド合成を使用して、または非遺伝子的にコードされたアミノ酸、例えばアジドまたはアセチレン部分を含むアミノ酸を、セレクターコドンに応じてタンパク質中に選択的に組み込むことによって、ポリペプチドに組み込むことができる。一度組み込まれると、次いで、アミノ酸側鎖を任意の適切に反応性のある水溶性化合物またはポリマーによって変性することができる。適切に反応性のある化合物またはポリマーは、限定はしないが、ＰＥＧ誘導体を含む。ポリペプチドの適当な官能基に、水溶性化合物または誘導体を結合するために利用できる適切な反応は、限定はしないが、例えばそれぞれアセチレンまたはアジド誘導体によるＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］シクロ付加反応（例えば、ＰａｄｗａＡ．、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、４巻（１９９１）ＴｒｏｓｔＢ．Ｍ．編、Ｐｅｒｇａｍｏｎ、Ｏｘｆｏｒｄ、１０６９〜１１０９頁；およびＨｕｉｓｇｅｎＲ．、１３−Ｄｉｐｏｌａｒ Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８４）ＰａｄｗａＡ．編、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１〜１７６頁、参照）を含む。

この方法は、求核性置換反応でなくシクロ付加を含むものであるので、タンパク質は非常に高い選択性で変性することができる。反応は、反応混合物に触媒量のＣｕ（Ｉ）塩を添加することによって、優れたレギオ選択性（１４＞１５）で水性状態において室温で実施することができる。例えば、Ｔｏｒｎｏｅ等、（２００２）、Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：３０５７〜３０６４；および、Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ等、（２００２）、ＡｎｇｅｗＣｈｅｍ．Ｉｎｔ．編４１：２５９６〜２５９９参照。［３＋２］シクロ付加により本発明のタンパク質に付加される分子は、アジドまたはアセチレン誘導体を有する任意の分子を実際に含む。これらの分子は、アセチレン基、例えばｐ−プロパギルオキシフェニルアラニン、またはアジド基、例えばｐ−アジド−フェニルアラニンをそれぞれ有する、変性天然生成アミノ酸または非天然アミノ酸上の適当な官能基に付加することができる。

Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］シクロ付加から生じた、得られた５員環は、一般に還元環境において可逆的ではなく、水性環境において長期間加水分解に対して安定である。したがって、広範囲の物質の物理的、化学的特徴を、要求のきびしい水性状態の下で、本発明の活性ＰＥＧ誘導体により変性することができる。さらにより重要なことは、アジドおよびアセチレン部分が、互いに特異的であるので（さらに、例えば任意の通常の２０個の遺伝子的にコードされたアミノ酸の側鎖官能基とは反応しない）、タンパク質は１個または複数の特定の部位において、非常に高い選択性で変性することができる。

また、本発明は、限定はしないが、１個または複数のアセチレンまたはアジド部分を有する、ＰＥＧ誘導体および関連の親水性ポリマーを含む、化合物およびポリマーの水溶性かつ加水分解に安定な誘導体を提供する。アセチレン部分を含むＰＥＧポリマー誘導体は、セレクターコドンに応じてタンパク質中に選択的に導入されたアジド部分とのカップリングに対して、高度に選択的である。同様に、アジド部分を含むＰＥＧポリマー誘導体は、セレクターコドンに応じてタンパク質中に選択的に導入されたアセチレン部分とのカップリングに対して、高度に選択的である。

さらに詳しくは、アジド部分は、アルキルアジド、アリールアジドおよびこれらのアジドの誘導体を含む。アルキルおよびアリールアジドの誘導体は、アセチレン特異的反応性が維持される限り、他の置換基を含むことができる。アセチレン部分は、アルキルおよびアリールアセチレンならびにそれぞれの誘導体を含む。アルキルおよびアリールアセチレンの誘導体は、アジド特異的反応性が維持される限り、他の置換基を含むことができる。

本発明は、アジドおよびアセチレン部分を有する物質と、限定はしないが、アセチレンまたはアジド部分を有するＰＥＧポリマー誘導体などの、水溶性化合物またはポリマーとのコンジュゲートを含む。例えば、アジド部分を含むＰＥＧポリマーは、アセチレン官能性を担持する非遺伝子的にコードされたアミノ酸を含むタンパク質中の位置で生物活性分子に結合することができる。ＰＥＧおよび生物活性分子をカップリングする結合は、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］シクロ付加生成物を含む。

ＰＥＧが、生体材料の表面を変性するために使用できることは、当技術分野においてよく確立されている（例えば米国特許第６６１０２８１号参照）。また本発明は、１個または複数の反応性アジドまたはアセチレン部位およびＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］シクロ付加結合を介して、表面に結合されている１個または複数の本発明のアジドまたはアセチレン含有ポリマーを有する表面を含む、生体材料を包含する。また、生体材料および他の物質は、カルボン酸、アミン、アルコールまたはチオール部分を含む結合によるなど、アジドまたはアセチレン結合以外の結合により、アジドまたはアセチレン活性化ポリマー誘導体に結合することが可能であって、引き続く反応に利用できるアジドまたはアセチレン部分を残す。

本発明は、本発明のアジドおよびアセチレン含有化合物またはポリマーを合成する方法を含む。アジド含有化合物またはポリマー誘導体の場合には、アジドは、ポリマーの炭素原子に直接結合させることができる。別法として、得られたポリマーが、その末端または分子中の任意の他の所望の位置にアジド部分を有するように、１個の末端にアジド部分を有する結合剤を、通常の活性化ポリマーに結合することによって、アジド含有化合物またはポリマー誘導体を調製することができる。アセチレン含有化合物またはポリマー誘導体の場合には、アセチレンをポリマーの炭素原子に直接結合させることができる。別法として、得られたポリマーが、分子内またはその末端にアセチレン部分を有するように、１個の末端にアセチレン部分を有する結合剤を、通常の活性化ポリマーに結合することによって、アセチレン含有化合物またはポリマー誘導体を調製することができる。

より詳細には、ＰＥＧ誘導体などのアジド含有、水溶性化合物またはポリマーの場合には、少なくとも１個の活性ヒドロキシル部分を有する水溶性ポリマーが反応して、その上にメシレート、トレシレート、トシレートまたはハロゲン脱離基などのより反応性の部分を有する置換ポリマーを生成する。スルホニル酸ハライド、ハロゲン原子および他の脱離基を含む、ＰＥＧまたは他の化合物もしくはポリマー誘導体の調製および使用は、当業者にはよく知られている。次いで、得られた置換ポリマーは、反応して、ポリマーの末端にあるアジド部分を、より反応性の部分で置換する。別法として、少なくとも１個の活性求核性または求電子性部分を有する水溶性ポリマーは、共有結合がポリマーと結合剤の間に形成され、アジド部分がポリマーの末端に位置するように、アジドを１個の末端に有する結合剤と反応する。アミン、チオール、ヒドラジド、ヒドラジン、アルコール、カルボキシレート、アルデヒド、ケトン、チオエステルなどを含む求核性および求電子性部分は、当業者にはよく知られている。

さらに詳細には、アセチレン含有化合物またはポリマー誘導体の場合には、少なくとも１個の活性ヒドロシル部分を有する水溶性ポリマーが反応を行って、アセチレン部分を含む先駆体から、ハロゲンまたは他の活性化脱離基を置換する。別法として、共有結合がポリマーと結合剤の間に形成され、アセチレン部分が、ポリマーの末端に位置するように、少なくとも１個の活性求核性または求電子性部分を有する水溶性ポリマーが、１個の末端にアセチレンを有する結合剤と反応を行う。ハロゲン部分、活性化脱離基、求核性または求電子性部分の使用は、有機合成ならびにＰＥＧ誘導体の調製および使用という意味合いで当技術分野において専門家にはよく確立されていることである。

したがって、本発明はＰＥＧ、アジドまたはアセチレン部分を含む誘導体などの水溶性化合物またはポリマーによるタンパク質を選択的に変性する方法を提供する。アジドおよびアセチレン含有ＰＥＧ誘導体は、生体適合性、安定性、溶解性および免疫原性の欠如が重要である、表面および分子の特性を変性するのに使用することができ、一方、タンパク質にＰＥＧ誘導体を結合する、当技術分野において知られていたよりも、より選択的な手段を同時に提供する。

定義
用語「官能基」、「活性部分」「活性化基」、「脱離基」、「反応性部位」、「化学反応性基」および「化学反応性部分」は、当技術分野において、および本明細書では、分子の明確な、定義可能な部分または単位のことをいう。この用語は、何らかの機能または活性を示し、他の分子と反応する分子の部分を示すために、本明細書では使用される。

用語「結合（ｌｉｎｋａｇｅ）」または「リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）」は、化学反応の結果として通常形成され、一般に共有結合である基または結合のことを、本明細ではいう。加水分解に安定な結合とは、この結合が水中において実質上安定であり、有用ｐＨで、例えば生理学的状態下で長期間、おそらくいつまでも水と反応しないことを意味する。加水分解に不安定または分解性結合とは、この結合が例えば血液を含む水または水性溶液において、分解性であることを意味する。酵素的に不安定または分解性結合とは、１個または複数の酵素によって分解され得る結合を意味する。当技術分野において理解されている通り、ＰＥＧおよび関連するポリマーは、ポリマー骨格中に、またはポリマー骨格とポリマー分子の１個または複数の末端官能基との間のリンカー基中に、分解性結合を含み得る。例えば、ＰＥＧカルボン酸または活性化ＰＥＧカルボン酸と生物学的活性剤上のアルコール基との反応によって形成されるエステル結合は、一般に生理学的状態下で、加水分解して、反応試薬を放出する。他の加水分解による分解性結合には、カーボネート結合、アミンとアルデヒドとの反応から得られたイミン結合、アルコールとリン酸基との反応によって形成されたリン酸エステル結合、ヒドラジドおよびアルデヒドの反応生成物であるヒドラゾン結合、アルデヒドおよびアルコールの反応生成物であるアセタール結合、ホルメートおよびアルコールの反応生成物であるオルトエステル結合、例えばＰＥＧなどのポリマー末端にあるアミン基およびペプチドのカルボキシル基によって形成されるペプチド結合、例えばポリマーの末端にあるホスホルアミダイトおよびオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキル基によって形成されるオリゴヌクレオチド結合が含まれる。

本明細書においては、用語「生物活性分子」「生物活性部分」または「生物活性剤」は、限定はしないが、ウイルス、バクテリア、真菌類、植物、動物およびヒトを含む生物学的生体の任意の、物理的または生化学的特性に影響を与え得る任意の物質を意味する。特に、本明細書では、生物活性分子には、診断、治療緩和、治療、あるいはヒトまたは他の動物の疾病の予防、あるいはヒトまたは動物の、物理的または精神的に健康な状態を向上させるためのものである任意の物質が含まれる。生物活性分子の例には、限定はしないが、ペプチド、タンパク質、酵素、小分子薬剤、染料、脂質、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、細胞、ウイルス、リポソーム、微小粒子およびミセルが含まれる。本発明で使用に適する生物活性剤のクラスには、限定はしないが、抗生物質、殺カビ剤、抗ウイルス性剤、抗炎症剤、抗癌剤、心臓血管薬、抗不安薬、ホルモン、成長因子、ステロイド剤などが含まれる。

用語「アルキル」、「アルケン」および「アルコキシ」には、直鎖および分枝アルキル、アルケン、およびアルコキシがそれぞれ含まれる。用語「低級アルキル」は、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルのことをいう。用語「アルコキシ」は、例えば式−ＯＲまたは−ＲＯＲ_１の酸素置換アルキルのことをいい、式中ＲおよびＲ_１は、それぞれ独立に選択されたアルキルである。用語「置換アルキル」および「置換アルケン」は、それぞれ限定はされないが、Ｃ_３〜Ｃ_６シクロアルキル、例えばシクロプロピル、シクロブチルなど；アセチレン；シアノ；アルコキシ、例えばメトキシ、エトキシなど；低級アルカノイルオキシ、例えばアセトキシ；ヒドロキシ；カルボキシル；アミノ；低級アルキルアミノ、例えばメチルアミノ；ケトン；ハロ、例えばクロロまたはブロモ；フェニル；置換フェニルなどの１個または複数の妨害のない置換基で置換されているアルキルおよびアルケンのことをいう。用語「ハロゲン」には、フッ素、塩素、ヨウ素および臭素が含まれる。

「アリール」は、それぞれ５または６個の炭素原子の、１個または複数の芳香族環を意味する。多重アリール環は、ナフチルにおけるように縮合し得るし、またはビフェニルにおけるように非縮合でありうる。アリール環は、１個または複数の環式炭化水素、ヘテロアリールもしくは複素環で、縮合されていても縮合されていなくてもよい。

「置換アリール」は、置換基として１個または複数の妨害のない基を有するアリールである。

用語「置換基」は、限定はしないが、妨害のない置換基を含む。「妨害のない置換基」は、安定な化合物を生じる基である。適切な、妨害のない置換基またはラジカルには、限定しないが、ハロ、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１０アルケニル、Ｃ_２〜Ｃ_１０アルキニル、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルコキシ、Ｃ_１〜Ｃ_１２アラルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルカリール、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルケニル、フェニル、置換されたフェニル、トルオイル、キシレニル、ビフェニル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルコキシアルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルコキシアリール、Ｃ_７〜Ｃ_１２アリールオキシアルキル、Ｃ_７〜Ｃ_１２オキシアリール、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルスルフィニル、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキルスルホニル、−（ＣＨ_２）_ｍ−Ｏ−（Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル）式中ｍは１〜８、アリール、置換アリール、置換アルコキシ、フルオロアルキル、複素環式ラジカル、置換複素環式ラジカル、ニトロアルキル、−ＮＯ_２、−ＣＮ、−ＮＲＣ（Ｏ）−（Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル）、Ｃ_２〜Ｃ_１０アルキルチオアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル）、−ＯＨ、−ＳＯ_２、．ｄｂｄ．Ｓ、−ＣＯＯＨ、−ＮＲ_２、カルボニル、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル）−ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）−ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−（Ｃ_１〜Ｃ_１０アリール）−Ｓ−（Ｃ_６〜Ｃ_１０アリール）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ_１〜Ｃ_１０アリール）、−（ＣＨ_２）_ｍ−Ｏ−（−（ＣＨ_２）_ｍ−Ｏ−（Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル）式中各ｍは、１〜８、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ_２、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ_２、−ＳＯ_２ＮＲ_２、−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ_２、−ＮＲＣ（Ｓ）ＮＲ_２、その塩などが含まれる。各Ｒは、本明細書ではＨ、アルキル基または置換アルキル、アリールまたは置換アリール、アラルキルまたはアルカリールである。

本発明は、平均分子量約８００ダルトン（Ｄａ）〜約１０００００ダルトンを有する水溶性ポリマー骨格を含むアジドおよびアセチレン含有ポリマー誘導体を提供する。水溶性ポリマーのポリマー骨格は、限定はしないが、核酸分子、ポリペプチド、荷電化合物、またはポリマー、線状、分枝または多重アーム化合物またはポリマー、およびポリ（エチレングリコール）（すなわち、ＰＥＧ）を含む任意の適切な化合物またはポリマーであってよい。しかし、限定はしないが、ポリ（デキストラン）およびポリ（プロピレングリコール）などのＰＥＧ関連分子を含む、他の化合物およびポリマーも本発明の実施における使用に適しており、この点で用語ＰＥＧまたはポリ（エチレングリコール）は、包括的なもので排他的であることを意図するものではないことを理解すべきである。用語ＰＥＧは、任意のこの形態にあるポリ（エチレングリコール）を含み、二官能性ＰＥＧ、多アームＰＥＧ、フォークＰＥＧ、分枝ＰＥＧ、懸垂ＰＥＧ（すなわち、ポリマー骨格に懸垂している１個または複数の官能基を有するＰＥＧまたは関連ポリマー）、または中に分解性結合を有するＰＥＧを含む。

本明細書では用語「水溶性ポリマー」は、水性溶媒に可溶な任意のポリマーのことをいう。治療用ポリペプチドへの水溶性ポリマーの結合は、限定はしないが、増大もしくは調節された血清半減期、または非変性形態に比べて、増大もしくは調節された治療半減期、調節された免疫原性、調節された物理的会合特徴（凝集および多量体形成、変性受容体結合および変性受容体二量化もしくは多量化など）を含む、変化をもたらす。水溶性ポリマーは、それ自体、生物活性を有していても、いなくてもよい。適切なポリマーには、限定はしないがポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、モノＣ_１〜Ｃ_１０アルコキシもしくはそのアリールオキシ誘導体（米国特許第５２５２７１４号に記載されており、これを参照により本明細書に組み込む）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸、ジビニルエーテル無水マレイン酸、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド、デキストラン、デキストランスルフェートを含むデキストラン誘導体、ポリプロピレングリコール、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ヘパリン、ヘパリン断片、ポリサッカライド、オリゴサッカライド、グリカン、セルロースもしくはセルロース誘導体（限定はしないが、メチルセルロースまたはカルボキシメチルセルロース）、デンプンまたはデンプン誘導体、ポリペプチド、ポリアルキレングリコールおよびその誘導体、ポリアルキレングリコールのコポリマーおよびその誘導体、ポリビニルエチルエーテル、ならびにアルファ−ベータ−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アパルトアミド等、あるいはそれらの混合物が含まれる。かかる水溶性ポリマーの例には、限定はしないが、ポリエチレングリコールおよび血清アルブミンが含まれる。

本明細書では、用語「ポリアルキレングリコール」は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、およびその誘導体のことをいう。用語「ポリアルキレングリコール」は、直鎖ならびに分枝ポリマー、および１キロダルトン（ｋＤａ）と１００ｋＤａの間の平均分子量を包含する。他の例示的実施形態は、例えばＳｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのカタログ「生物医学的用途のためのポリエチレングリコールおよび誘導体」（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（２００１）などの商品供給者のカタログに列挙されている。

通常は、ＰＥＧは、透明、無色、無臭、水に可溶、熱に安定、多くの化学反応薬に不活性であり、加水分解または変質せず、一般に無毒である。ポリ（エチレングリコール）は、生体親和性であると考えられ、これは、ＰＥＧが害を及ぼすことなしに、生きている組織もしくは生体と共存できるということである。さらに詳細には、ＰＥＧは実質上非免疫原性であり、これはＰＥＧが、体内で免疫性反応を生じる傾向にないということである。生物活性薬剤などの、体内において何らかの望ましい機能を有する分子に結合した場合、ＰＥＧは、この薬剤を覆う傾向があり、生体が薬剤の存在に耐えることができるように、どのような免疫反応も低減または排除することができる。ＰＥＧ結合体は、実質的免疫反応を生ずる傾向がなく、または凝固もしくは他の望ましくない影響を生じる傾向にない。式−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−ＣＨ_２ＣＨ_２−を有するＰＥＧは、式中ｎが約３〜約４０００、一般に約２０〜約２０００であり、本発明の実施において１つの有用なポリマーである。約８００Ｄａ〜約１０００００Ｄａの分子量を有するＰＥＧは、ポリマー骨格として特に有用である。

ポリマー骨格は、線状または分枝であってよい。分枝ポリマー骨格は、当技術分野において一般に知られている。通常、分枝ポリマーは、中心の枝核部分および、この中心の枝核に結合されている複数のポリマー直鎖を有している。一般に、ＰＥＧは、グリセロール、グリセロールオリゴマー、ペンタエリスリトールおよびソルビトールなどの種々のポリオールへのエチレンオキシドの付加によって調製することができる分枝形態において使用される。中心の分枝部分は、リシンなどのいくつかのアミノ酸からも得ることができる。分枝ポリ（エチレングリコール）は、一般形式Ｒ（−ＰＥＧ−ＯＨ_ｍ）で表すことができ、式中Ｒはグリセロール、グリセロールオリゴマー、ペンタエリスリトールなどの核部分に由来し、ｍはアームの数を表す。米国特許第５９３２４６２号；第５６４３５７５号；第５２２９４９０号；第４２８９８７２号；米国特許出願２００３／０１４３５９６；ＷＯ９６／２１４６９およびＷＯ９３／２１２５９（それぞれ、全体を参照により本明細書に組み込む）において記載されているものなどの、多アームＰＥＧ分子もまたポリマー骨格として使用することができる。

分枝ＰＥＧは、ＰＥＧ（−ＹＣＨＺ_２）_ｎによって表されるフォークＰＥＧの形態であることもでき、式中Ｙは結合基であり、Ｚは規定の長さの原子鎖によってＣＨに結合された活性化末端基である。

さらに他の分枝形態、懸垂ＰＥＧは、ＰＥＧ鎖の末端ではなくＰＥＧ骨格に沿って、カルボキシルなどの反応基を有する。

これらのＰＥＧの形態に加えて、このポリマーは、骨格中の弱いまたは分解性結合により調製することもできる。例えば、ＰＥＧは、加水分解しやすいポリマー骨格中のエステル結合により調製することができる。以下に示す通り、この加水分解は、低分子量断片へのポリマーの開裂をもたらす：−ＰＥＧ−ＣＯ_２−ＰＥＧ−＋Ｈ_２Ｏ→ＰＥＧ−ＣＯ_２Ｈ＋ＨＯ−ＰＥＧ−。

当業者には、用語ポリ（エチレングリコール）またはＰＥＧは、全ての上記形態を表し、または含むことが理解されよう。

また、他のポリマーの多くが、本発明に適する。水溶性であり、２〜約３００の末端を有するポリマー骨格が、本発明において特に有用である。適切なポリマーの例には、限定はしないが、ポリプロピレングリコール「ＰＰＧ」などの他の、ポリ（アルキレングリコール）、そのコポリマー（例えばエチレングリコールおよびプロピレングリコールのコポリマー）、そのターポリマー、それらの混合物などが含まれる。ポリマー骨格の各鎖の分子量は変化することができるが、一般に、これは約８００Ｄａ〜１０００００Ｄａ、しばしば約６０００Ｄａ〜約８００００Ｄａの範囲にある。

当業者であれば、実質上水溶性の骨格に対する上記リストは、決して網羅的なものではなく、単に例示的なものであること、および上記の品質を有する全てのポリマー材料が考慮されていることを理解するであろう。

本発明のポリマー誘導体は、「多官能性」であり、ポリマー骨格は、少なくとも２個の末端、および官能基で官能化または活性化された多分３００ほどの末端を有することを意味している。多官能性ポリマー誘導体は、２個の末端を有する線状ポリマーを含み、各末端は、同一または異なっていてもよい官能基に結合している。

一実施形態において、ポリマー誘導体は、次の構造を有する：
Ｘ−Ａ−ＰＯＬＹ−Ｂ−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
［式中、
Ｎ＝Ｎ＝Ｎは、アジド部分であり、
Ｂは、存在していても、存在していなくてもよい結合部分であり、
ＰＯＬＹは、水溶性非抗原性ポリマーであり、
Ａは、結合部分であり、これは、存在していても、存在していなくてもよく、かつＢと同一または異なっていてもよく、および
Ｘは、第２の官能基である］。

ＡおよびＢに対する結合部分の例には、１８個までの、さらに好ましくは１〜１０個の炭素原子を含む多官能化アルキル基を含む。窒素、酸素、硫黄などのヘテロ原子が、アルキル鎖と一緒に含まれていてもよい。アルキル鎖は、ヘテロ原子において分枝してもよい。ＡおよびＢに対する結合部分の他の例には、１０個までの、さらに好ましくは５〜６個の炭素原子を含む多官能化アリール基が含まれる。アリール基は、１個または複数の炭素原子、窒素、酸素または硫黄原子で置換することができる。適切な結合基の他の例には、米国特許第５９３２４６２号および同第５６４３５７５号ならびに米国特許出願２００３／０１４３５９６に記載されている結合基が含まれる。このそれぞれを、参照によりその全体を本明細書に組み込む。当業者であれば、結合部分に対する上記リストは、決して網羅的なものではなく、単に例示的なものであること、および上記の品質を有する全ての結合部分が考慮されていることを理解するであろう。

Ｘとして使用するための適切な官能基の例には、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、アルコキシル、活性化エステル（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルおよび１−ベンゾトリアゾリルエステルなど）、活性カーボネート（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネート、１−ベンゾトリアゾリルカーボネートなど）、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、アミノオキシ、保護アミン、ヒドラジド、保護ヒドラジド、保護チオール、カルボン酸、保護カルボン酸、イソシアナート、イソチオシアナート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセタミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレート、およびトレシレート、アルケン、ケトン、およびアジドが含まれる。理解されている通り、選択されたＸ部分は、アジド基と反応が生じないようにアジド基と共存できるべきである。アジド含有ポリマー誘導体は、第２の官能基（すなわち、Ｘ）もアジド部分であることを意味するホモ二官能性、または第２の官能基が異なる官能基であることを意味するヘテロ二官能性であってよい。

当技術分野において理解されている通り、用語「保護された」は、何らかの反応条件下で、化学的反応性官能基の反応を防止する保護基または部分の存在することをいう。保護基は、保護される化学的反応性基のタイプによって変化することになる。例えば、化学的反応性基が、アミンまたはヒドラジドの場合には、保護基は、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）からなる群から選択される。化学的反応性基が、チオールの場合には、保護基は、オルトピリジルジスルフィドであり得る。化学的反応性基が、ブタン酸またはプロピオン酸などのカルボン酸、またはヒドロキシル基である場合には、保護基は、ベンジル、またはメチル、エチルもしくはｔｅｒｔ−ブチルなどのアルキル基であり得る。当技術分野において知られている他の保護基も本発明において使用することができる。

文献における、末端官能基の特定の例には、Ｎ−スクシンイミジルカーボネート（例えば、米国特許第５２８１６９８号、第５４６８４７８号参照）、アミン（例えば、Ｂｕｃｋｍａｎｎ等、Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．１８２：１３７９（１９８１）、Ｚａｐｌｉｐｓｋｙ等、Ｅｕｒ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．１９：１１７７（１９８３）参照）、ヒドラジド（例えば、Ａｎｄｒｅｓｚ等、Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．１７９：３０１（１９７８）参照）、スクシンイミジルプロピオネートおよびスクシンイミジルブタン酸（例えば、Ｏｌｓｏｎ等、Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１７０〜１８１頁、Ｈａｒｒｉｓ＆Ｚａｐｌｉｐｓｋｙ編、ＡＣＳ、ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＤ．Ｃ．、１９９７；また、米国特許第５６７２６６２号参照）、スクシンイミジルスクシネート（例えば、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ等、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．７：１７５（１９８４）およびＪｏｐｐｉｃｈ等、Ｍａｋｒｏｌｏｌ．Ｃｈｅｍ．１８０：１３８１（１９７９）参照）、スクシンイミジルエステル（例えば、米国特許第４６７０４１７号参照）、ベンゾトリアゾールカーボネート（例えば、米国特許第５６５０２３４号参照）、グリシジルエーテル（例えば、Ｐｉｔｈａ等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９４：１１（１９７９）、Ｅｌｌｉｎｇ等、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３：３５４（１９９１）参照）、オキシカルボニルイミダゾール（例えば、Ｂｅａｕｃｈａｍｐ等、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３１：２５（１９８３）、Ｔｏｎｄｅｌｌｉ等、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １：２５１（１９８５）参照）、ｐ−ニトロフェニルカーボネート（例えば、Ｖｅｒｏｎｅｓｅ等、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１１：１４１（１９８５）；およびＳａｒｔｏｒｅ等、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２７：４５（１９９１）参照）、アルデヒド（例えば、Ｈａｒｒｉｓ等、Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｃｈｅｍ．Ｅｄ．２２：３４１（１９８４）、米国特許第５８２４７８４号、米国特許第５２５２７１４号参照）、マレイミド（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ等、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：３４３（１９９０）Ｒｏｍａｎｉ等、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ２：２９（１９８４）、およびＫｏｇａｎ、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｍ．２２：２４１７（１９９２）参照）、オルトピリジル−ジスルフィド（例えば、Ｗｏｇｈｉｒｅｎ等、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．４：３１４（１９９３）参照）、アクリロール（例えば、Ｓａｗｈｎｅｙ等、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２６：５８１（１９９３）参照）、ビニルスルホン（例えば、米国特許第５９００４６１号参照）。前述の文献の全てを参照により本明細書に組み込む。

好ましい実施形態において、本発明のポリマー誘導体は、次の構造を有するポリマー骨格を含む：
Ｘ−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
［式中、
Ｘは、上述の官能基であり、および
ｎは、約２０から約４０００である］。

他の実施形態において、本発明のポリマー誘導体は、次の構造を有するポリマー骨格を含む：
Ｘ−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｍ−Ｗ−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
［式中、
Ｗは、１〜１０個の間の炭素原子を含む、脂肪族または芳香族リンカー部分であり、
ｎは、約２０から約４０００、および
Ｘは、上記の通りの官能基である］。

本発明のアジド含有ＰＥＧ誘導体は、少なくとも２つの方法によって調製することができる。以下に示す１つの方法においては、平均分子量約８００Ｄａから約１０００００Ｄａを有する水溶性ポリマー骨格、第１の官能基に結合している第１の末端、および適切な脱離基に結合している第２の末端を有するポリマー骨格、をアジドアニオン（ナトリウム、カリウム、ｔｅｒｔ−ブチルアンモニウムなどを含む任意のいくつかの適切な対イオンと対をなすことができる）と反応させる。脱離基は、求核性置換を行い、アジド部分によって置換され、所望のアジド含有ＰＥＧポリマーが得られる。

Ｘ−ＰＥＧ−Ｌ＋Ｎ_３ ⁻→Ｘ−ＰＥＧ−Ｎ_３
示した通り、反応に使用する適切なポリマー骨格は、式Ｘ−ＰＥＧ−Ｌを有し、ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）であり、Ｘは、アジド基と反応しない官能基であり、Ｌは適切な脱離基である。適切な官能基の例には、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、アセタール、アルケニル、アミン、アミノオキシ、保護アミン、保護ヒドラジド、保護チオール、カルボン酸、保護カルボン酸、マレイミド、ジチオピリジン、およびビニルピリジン、およびケトンが含まれる。適切な脱離基の例には、塩化物、臭化物、ヨウ化物、メシレート、トレシレート、およびトシレートが含まれる。

本発明のアジド含有ポリマー誘導体を調製する第２の方法においては、アジド官能性を担持する結合剤を、平均分子量約８００Ｄａから約１０００００Ｄａを有する水溶性ポリマー骨格と接触させる。この結合剤は、ＰＥＧポリマー上の化学官能性と選択的に反応する化学官能性を担持して、結合基によってアジドが、ポリマー骨格から分離されているアジド含有ポリマー誘導体生成物を形成する。

例示的反応式を以下に示す。

Ｘ−ＰＥＧ−Ｍ＋Ｎ−リンカー−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ→ＰＧ−Ｘ−ＰＥＧ−リンカー−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
式中、ＰＥＧは、ポリ（エチレングリコール）、およびＸは、アルコキシまたは上記の官能基などのキャッピング基である。Ｍは、アジド官能性とは反応しないが、Ｎ官能基と効率的かつ選択的に反応する官能基である。

適切な官能基の例を挙げる：Ｎがアミンの場合には、Ｍは、カルボン酸、カーボネートまたは活性化エステル；Ｎがヒドラジドまたはアミノオキシ部分の場合には、Ｍは、ケトン；Ｎが求核剤の場合には、Ｍは、脱離基である。

粗製生成物の精製は、通常、生成物の沈殿によって、必要ならば続いてクロマトグラフィーによって実施することができる。

ＰＥＧジアミンの場合において、さらに特定の例を以下に示す。この例では、１個のアミンが、ｔｅｒｔ−ブチル−Ｂｏｃなどの保護基部分によって保護され、得られたモノ保護ＰＥＧジアミンを、アジド官能性を担持する結合部分と反応させる：ＢｏｃＨＮ−ＰＥＧ−ＮＨ_２＋ＨＯ_２Ｃ−（ＣＨ_２）_３−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ。

この例においては、種々の活性化剤（塩化チオニルまたはカルボジイミド反応試薬、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドまたはＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールなど）を使用して、アミン基をカルボン酸基に結合して、モノアミンＰＥＧ誘導体とアジド担持リンカー部分との間にアミド結合を作り出すことができる。アミド結合をうまく形成した後、生物活性分子を変性するために、得られたＮ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｂｏｃ−保護アジド含有誘導体を直接使用することができ、また、綿密に作業して他の有用な官能基を組み込むことができる。例えば、Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ基を強酸で処理することによって加水分解し、オメガ−アミノ−ＰＥＧ−アジドを生成することができる。得られたアミンを、合成の手掛かりとして使用して、マレイミド基、活性化ジスルフィド、活性化エステルなど他の有用な官能性を、価値のあるヘテロ二官能性反応試薬を作り出すために組み込むことができる。

ヘテロ二官能性誘導体は、ポリマーの各末端に異なる分子を結合することを望む場合に、特に有用である。例えば、オメガ−Ｎ−アミノ−Ｎ−アジドＰＥＧは、アルデヒド、ケトン、活性化エステル、活性化カルボナートなど活性化求電子基を有する分子をＰＥＧの１個の末端に、またアセチレン基を有する分子をＰＥＧの他の末端に結合できるようにする。

本発明の他の実施形態において、ポリマー誘導体は、次の構造を有する：
Ｘ−Ａ−ＰＯＬＹ−Ｂ−Ｃ≡Ｃ−Ｒ
［式中、
Ｒは、Ｈまたはアルキル、アルケン、アルキオキシ、またはアリールもしくは置換アリール基であってよく、
Ｂは、結合部分であり、存在しても存在しなくてもよく、
ＰＯＬＹは、水溶性非抗原性ポリマーであり、
Ａは、結合部分であり、存在しても存在しなくてもよく、またＢと同一または異なっていてもよい、および
Ｘは、第２の官能基である］。

ＡおよびＢに対する結合部分の例には、１８個までの、さらに好ましくは１〜１０個の炭素原子を含む多官能性化アルキル基が含まれる。窒素、酸素または硫黄などのヘテロ原子は、アルキル鎖を伴って含まれてよい。アルキル鎖は、ヘテロ原子において分枝していてもよい。ＡおよびＢに対する結合部分の他の例には、１８個までの、さらに好ましくは５〜６個の炭素原子を含む多官能性化アリール基が含まれる。アリール基は、１個または複数の炭素原子、窒素、酸素または硫黄原子で置換することができる。適切な結合基の他の例には、米国特許第５９３２４６２号、第５６４３５７５号、および米国特許出願２００３／０１４３５９６に記載されている結合基が含まれ、各特許を、参照によりその全体を本明細書に組み込む。当業者であれば、結合部分に対する上記リストは、決して網羅的なものではなく、単に例示的なものであること、および上記の品質を有する全ての結合部分が考慮されていることを理解するであろう。

Ｘとして使用するための適切な官能基の例には、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、アルコキシル、活性化エステル（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルおよび１−ベンゾトリアゾリルエステルなどの）、活性カーボネート（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネートおよび１−ベンゾトリアゾリルカーボネートなどの）、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、アミノオキシ、保護アミン、ヒドラジド、保護ヒドラジド、保護チオール、カルボン酸、保護カルボン酸、イソシアナート、イソチオシアナート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセタミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレート、およびトレシレート、アルケン、ケトン、およびアセチレンが含まれる。理解されている通り、選択されるＸ部分は、アセチレン基との反応が生じないようにアセチレン基と共存すべきである。アセチレン含有ポリマー誘導体は、第２官能基（すなわち、Ｘ）もアセチレン部分であることを意味するホモ二官能性、または第２官能基が異なる官能基であることを意味するヘテロ二官能性であってよい。

他の好ましい実施形態において、本発明のポリマー誘導体は、次の構造を有するポリマー骨格を含む：
Ｘ−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｍ−Ｃ≡ＣＨ
［式中、
Ｘは、上記の通りの官能基であり、
ｎは、約２０から約４０００であり、および
ｍは、１と１０の間である］。

各ヘテロ二官能性ＰＥＧポリマーの特定の例を以下に示す。

本発明のアセチレン含有ＰＥＧ誘導体は、少なくとも２つの方法によって調製することができる。第１の方法においては、平均分子量約８００Ｄａから約１０００００Ｄａを有する水溶性ポリマー骨格、第１の官能基に結合している第１の末端および適切な求核性基に結合している第２の末端を有するポリマー骨格と、アセチレン官能性ならびにＰＥＧ上の求核性基との反応に適する脱離基を担持する化合物とを反応させる。求核性部分担持するＰＥＧポリマーおよび脱離基を担持する分子を混ぜ合わせた場合、脱離基は、求核性置換を行い、求核性部分によって置換され、所望のアセチレン含有ポリマーが得られる。

Ｘ−ＰＥＧ−Ｎｕ＋Ｌ−Ａ−Ｃ→Ｘ−ＰＥＧ−Ｎｕ−Ａ−Ｃ≡ＣＲ’
示した通り、反応において使用するための好ましいポリマー骨格は、式Ｘ−ＰＥＧ−Ｎｕを有し、式中、ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）であり、Ｎｕは求核性部分あり、ＸはＮｕ、Ｌまたはアセチレン官能性と反応しない官能基である。

Ｎｕの例には、アミン、アルコキシ、アリールオキシ、スルフヒドリル、イミノ、カルボキシレート、ヒドラジド、主としてＳＮ２−タイプの機作により反応するはずであるアミノキシ基が含まれる。その他のＮｕ基の例は、主として求核性付加反応により反応するはずである官能基を含む。Ｌ基の例には、塩化物、臭化物、ヨウ化物、メシレート、トレシレート、トシレートおよび求核性置換を行うと予想される他の基ならびにケトン、アルデヒド、チオエステル、オレフィン、アルファ−ベータ不飽和カルボニル基、カーボネートおよび求核剤によって付加を行うと予想される他の求電子性基が含まれる。

好ましい実施形態において、Ａは、１〜１０個の間の炭素原子を有する脂肪族リンカーまたは６〜１４個の間の炭素原子を有する置換アリール環である。Ｘは、アジドと反応しない官能基であり、Ｌは、適切な脱離基である。

本発明のアセチレン含有ポリマー誘導体を調製する第２の方法においては、一方の末端に保護官能基またはキャッピング剤および他方の末端に適切な脱離基を担持する、平均分子量約８００Ｄａから約１０００００Ｄａを有するＰＥＧポリマーを、アセチレンアニオンと接触させる。

例示的反応式を以下に示す。

Ｘ−ＰＥＧ−Ｌ＋−Ｃ≡ＣＲ’→Ｘ−ＰＥＧ−Ｃ≡ＣＲ’
［式中、
ＰＥＧは、ポリ（エチレングリコール）であり、Ｘは、アルコキシまたは上記の官能基などのキャッピング基であり、および
Ｒ’は、Ｈ、アルキル、アルコキシ、アリールまたはアリールオキシ基、あるいは置換アルキル、アルコキシル、アリールまたはアリールオキシ基である］。

上の例において、脱離基Ｌは、十分な濃度のアセチレンアニオンと接触した場合にＳＮ２タイプの置換を行うのに十分な反応性であるべきである。アセチレンアニオンによる脱離基のＳＮ２置換を実施するのに必要な反応条件は、当分野においてよく知られている。

粗製生成物の精製は、通常、生成物の沈殿によって、続いて必要ならばクロマトグラフィーによって実施される。

（実施例）
以下の実施例を例示のために提供するが、本発明を限定するものではない。

ＰＥＧ−ＯＨ＋Ｂｒ−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｃ：ＣＲ’→ＰＥＧ−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｃ≡ＣＲ’
Ａ Ｂ
ポリアルキレングリコール（Ｐ−ＯＨ）をアルキルハライド（Ａ）と反応させて、エーテル（Ｂ）を形成する。これらの化合物においては、ｎは、１から９の整数であり、Ｒ’は、直鎖または分枝鎖、飽和または不飽和のＣ１からＣ２０のアルキルまたはヘテロアルキル基であり得る。また、Ｒ’は、Ｃ３からＣ７の飽和または不飽和の環式アルキルまたは環式ヘテロアルキル、置換または非置換のアリールまたはヘテロアリール基、あるいは置換または非置換のアルカリール（このアルキルは、Ｃ１からＣ２０の飽和または不飽和のアルキル）またはヘテロアルカリール基であり得る。一般に、Ｐ−ＯＨは、分子量８００から４００００ダルトン（Ｄａ）を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）である。

ｍＰＥＧ−ＯＨ＋Ｂｒ−ＣＨ_２−Ｃ≡ＣＨ→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ_２−Ｃ≡ＣＨ
分子量２００００ダルトン（Ｄａ）（ｍＰＥＧ−ＯＨ２０ｋＤａ、２．０ｇ、０．１ミリモル、Ｓｕｎｂｉｏ）を有するｍＰＥＧ−ＯＨを、ＴＨＦ（３５ｍＬ）中のＮａＨ（１２ｍｇ、０．５ミリモル）で処理した。次いで、キシレン中８０重量％に溶解した臭化プロパギルの溶液（０．５６ｍＬ、５ミリモル、５０当量、Ａｌｄｒｉｃｈ）および触媒量のＫＩをこの溶液に添加し、得られた混合物を２時間、加熱還流した。次いで、水（１ｍＬ）を添加し、溶媒を真空下で除去した。残渣にＣＨ_２Ｃｌ_２（２５ｍＬ）を添加し、有機層を分離し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、体積を約２ｍＬに減少させた。このＣＨ_２Ｃｌ_２溶液をジエチルエーテル（１５０ｍＬ）に滴下した。得られた沈殿を収集し、冷ジエチルエーテルで数回洗浄し、乾燥してプロパギル−Ｏ−ＰＥＧを得た。

ｍＰＥＧ−ＯＨ＋Ｂｒ−（ＣＨ_２）_３−Ｃ≡ＣＨ→ｍＰＥＧ−Ｏ−（ＣＨ_２）_３−Ｃ≡ＣＨ
分子量２００００ダルトン（Ｄａ）（ｍＰＥＧ−ＯＨ２０ｋＤａ、２．０ｇ、０．１ミリモル、Ｓｕｎｂｉｏ）を有するｍＰＥＧ−ＯＨを、ＴＨＦ（３５ｍＬ）中のＮａＨ（１２ｍｇ、０．５ミリモル）で処理した。次いで、５０当量の５−クロロ−１−ペンチン（０．５３ｍＬ、５ミリモル、Ａｌｄｒｉｃｈ）および触媒量のＫＩを、この混合物に添加した。得られた混合物を１６時間、加熱還流した。次いで水（１ｍＬ）を添加し、溶媒を真空下で除去した。残渣にＣＨ_２Ｃｌ_２（２５ｍＬ）を添加し、有機層を分離し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、体積を約２ｍＬに減少させた。このＣＨ_２Ｃｌ_２溶液をジエチルエーテル（１５０ｍＬ）に滴下した。得られた沈殿を収集し、冷ジエチルエーテルで数回洗浄し、乾燥して対応するアルキンを得た。

（１） ｍ−ＨＯＣＨ_２Ｃ_６Ｈ_４ＯＨ＋ＮａＯＨ＋Ｂｒ−ＣＨ_２−Ｃ≡ＣＨ→ｍ−ＨＯＣＨ_２Ｃ_６Ｈ_４Ｏ−ＣＨ_２−Ｃ≡ＣＨ
（２） ｍ−ＨＯＣＨ_２Ｃ_６Ｈ_４Ｏ−ＣＨ_２−Ｃ≡ＣＨ＋ＭｓＣｌ＋Ｎ（Ｅｔ）_３→ｍ−ＭｓＯＣＨ_２Ｃ_６Ｈ_４Ｏ−ＣＨ_２−Ｃ≡ＣＨ
（３） ｍ−ＭｓＯＣＨ_２Ｃ_６Ｈ_４Ｏ−ＣＨ_２−Ｃ≡ＣＨ＋ＬｉＢｒ→ｍ−Ｂｒ−ＣＨ_２Ｃ_６Ｈ_４Ｏ−ＣＨ_２−Ｃ≡ＣＨ
（４） ｍＰＥＧ−ＯＨ＋ｍ−Ｂｒ−ＣＨ_２Ｃ_６Ｈ_４Ｏ−ＣＨ_２−Ｃ≡ＣＨ→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ_２−Ｃ_６Ｈ_４Ｏ−ＣＨ_２−Ｃ≡ＣＨ
ＴＨＦ（５０ｍＬ）および水（２．５ｍＬ）中の３−ヒドロキシベンジルアルコール（２．４ｇ、２０ミリモル）の溶液に、先ず粉体水酸化ナトリウム（１．５ｇ、３７．５ミリモル）、次いで、さらにキシレン中８０重量％溶液に溶解した臭化プロパギルの溶液（３．３６ｍＬ、３０ミリモル）を添加した。反応混合物を６時間、加熱還流した。混合物に１０％のクエン酸（２．５ｍＬ）を添加し、溶媒を真空下で除去した。残渣を酢酸エチル（３×１５ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を飽和ＮａＣｌ溶液（１０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、濃縮して３−プロパギルオキシベンジルアルコールが得られた。

塩化メタンスルホニル（２．５ｇ、１５．７ミリモル）およびトリエチルアミン（２．８ｍＬ、２０ミリモル）を０℃で、ＣＨ_２Ｃｌ_２中の化合物３の溶液（２．０ｇ、１１．０ミリモル）に添加し、反応物を１６時間冷蔵庫に置いた。通常の後処理によりメシレートを淡黄色の油として得た。この油（２．４ｇ、９．２ミリモル）をＴＨＦ（２０ｍＬ）中に溶解し、ＬｉＢｒ（２．０ｇ、２３．０ミリモル）を添加した。反応混合物を１時間加熱還流し、次いで、室温に冷却した。混合物に水（２．５ｍＬ）を添加し、溶媒を真空下で除去した。残渣を酢酸エチル（３×１５ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を飽和ＮａＣｌ溶液（１０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、濃縮して所望の臭化物を得た。

ｍＰＥＧ−ＯＨ２０ｋＤａ（１．０ｇ、０．０５ミリモル、Ｓｕｎｂｉｏ）をＴＨＦ（２０ｍＬ）中に溶解し、この溶液を氷浴中で冷却した。ＮａＨ（６ｍｇ、０．２５ミリモル）を、激しく撹拌しながら数分間にわたって添加した後、上で得られた臭化物（２．５５ｇ、１１．４ミリモル）および触媒量のＫＩを添加した。冷却浴を除去し、得られた混合物を１２時間、加熱還流した。混合物に水（１．０）を添加し、溶媒を真空下で除去した。残渣にＣＨ_２Ｃｌ_２（２５ｍＬ）を添加し、有機層を分離し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、体積を約２ｍＬに減少させた。エーテル溶液（１５０ｍＬ）に滴下すると、白色沈殿が得られ、これを収集してＰＥＧ誘導体を得た。

ｍＰＥＧ−ＮＨ_２＋Ｘ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｃ≡ＣＲ’→ｍＰＥＧ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｃ≡ＣＲ’
末端アルキン含有ポリ（エチレングリコール）ポリマーも、上に示した通り、末端官能基を含むポリ（エチレングリコール）ポリマーを、アルキン官能性を含む反応性分子に結合させることによって得ることができる。

（１） ＨＯ_２Ｃ−（ＣＨ_２）_２−Ｃ≡ＣＨ＋ＮＨＳ＋ＤＣＣ→ＮＨＳＯ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_２−Ｃ≡ＣＨ
（２） ｍＰＥＧ−ＮＨ_２＋ＮＨＳＯ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_２−Ｃ≡ＣＨ→ｍＰＥＧ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_２−Ｃ≡ＣＨ
４−ペンチン酸（２．９４３ｇ、３．０ミリモル）をＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）中に溶解した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（３．８０ｇ、３．３ミリモル）およびＤＣＣ（４．６６ｇ、３．０ミリモル）を添加し、溶液を室温で、終夜撹拌した。得られた粗製ＮＨＳエステル７を、さらに精製することなしに、次の反応において使用した。

分子量５０００Ｄａを有するｍＰＥＧ−ＮＨ_２（ｍＰＥＧ−ＮＨ_２、１ｇ、Ｓｕｎｂｉｏ）をＴＨＦ（５０ｍＬ）中に溶解し、混合物を４℃に冷却した。ＮＨＳエステル７（４００ｍｇ、０．４ミリモル）を激しく撹拌しながら少しずつ添加した。混合物を室温に加温しながら３時間撹拌した。次いで、水（２ｍＬ）を添加し、溶媒を真空下で除去した。残渣にＣＨ_２Ｃｌ_２（５０ｍＬ）を添加し、有機層を分離し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、体積を約２ｍＬに減少させた。このＣＨ_２Ｃｌ_２溶液をエーテル（１５０ｍＬ）に滴下した。得られた沈殿を収集し、真空中で乾燥した。

この実施例は、ポリ（エチレングリコール）のメタンスルホニルエステルの調製を示し、これは、またポリ（エチレングリコール）のメタンスルホネートまたはメシレートと呼ぶことができる。対応するトシレート、およびハライドは、同様の手順によって調製することができる。

ｍＰＥＧ−ＯＨ＋ＣＨ_３ＳＯ_２Ｃｌ＋Ｎ（Ｅｔ）_３→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＳＯ_２ＣＨ_３→
ｍＰＥＧ−Ｎ_３
トルエン１５０ｍＬ中の ｍＰＥＧ−ＯＨ（分子量＝３４００、２５ｇ、１０ミリモル）を窒素下、２時間共沸蒸留し、溶液を室温に冷却した。溶液に乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２４０ｍＬおよび乾燥トリエチルアミン２．１ｍＬ（１５ミリモル）を添加した。溶液を氷浴中で冷却し、蒸留塩化メタンスルホニル１．２ｍＬ（１５ミリモル）を滴下した。溶液を窒素下、室温で終夜撹拌し、この反応物を、無水エタノール２ｍＬを添加することによってクエンチした。この混合物を、真空下で蒸発させて、主にトルエン以外の溶媒を除去し、濾過し、再び真空下で濃縮し、次いで、ジエチルエーテル１００ｍＬ中に沈殿させた。濾液を冷ジエチルエーテルで数回洗浄し、真空中で乾燥してメシレートを得た。

メシレート（２０ｇ、８ミリモル）をＴＨＦ７５ｍＬ中に溶解し、溶液を４℃に冷却した。冷却溶液にアジ化ナトリウム（１．５６ｇ、２４ミリモル）を添加した。この反応物を窒素下、２時間加熱還流した。次いで、溶媒を揮発させ、残渣をＣＨ_２Ｃｌ_２（５０ｍＬ）で希釈した。有機部分をＮａＣｌ溶液で洗浄し、無水ＭｇＳＯ_４上で乾燥した。体積を２０ｍＬに減少し、冷乾燥エーテル１５０ｍＬに加えることによって、生成物を沈殿させた。

（１）Ｎ_３−Ｃ_６Ｈ_４−ＣＯ_２Ｈ→Ｎ_３−Ｃ_６Ｈ_４ＣＨ_２ＯＨ
（２）Ｎ_３−Ｃ_６Ｈ_４ＣＨ_２ＯＨ→Ｂｒ−ＣＨ_２−Ｃ_６Ｈ_４−Ｎ_３
（３）ｍＰＥＧ−ＯＨ＋Ｂｒ−ＣＨ_２−Ｃ_６Ｈ_４−Ｎ_３→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ_２−Ｃ_６Ｈ_４−Ｎ_３
４−アジドベンジルアルコールを、米国特許第５９９８５９５号に記載されている方法を使用して、製造することができる。塩化メタンスルホニル（２．５ｇ、１５．７ミリモル）およびトリエチルアミン（２．８ｍＬ、２０ミリモル）を０℃で、ＣＨ_２Ｃｌ_２中の４−アジドベンジルアルコール（１．７５ｇ、１１．０ミリモル）の溶液に添加し、反応物を１６時間冷蔵庫中に置いた。通常の後処理により、メシレートを淡黄色の油として得た。この油（９．２ミリモル）をＴＨＦ（２０ｍＬ）中に溶解し、ＬｉＢｒ（２．０ｇ、２３．０ミリモル）を添加した。反応混合物を１時間加熱還流し、次いで、室温に冷却させた。混合物に水（２．５ｍＬ）を添加し、溶媒を真空下で除去した。残渣を酢酸エチル（３×１５ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を飽和ＮａＣｌ溶液（１０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、濃縮して所望の臭化物を得た。

ｍＰＥＧ−ＯＨ２０ｋＤａ（２．０ｇ、０．１ミリモル、Ｓｕｎｂｉｏ）をＴＨＦ（３５ｍＬ）中のＮａＨ（１２ｍｇ、０．５ミリモル）で処理し、この混合物に触媒量のＫＩと共にこの臭化物（３．３２ｇ、１５ミリモル）を添加した。得られた混合物を１２時間、加熱還流した。混合物に水（１．０）を添加し、溶媒を真空下で除去した。残渣にＣＨ_２Ｃｌ_２（２５ｍＬ）を添加し、有機層を分離し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、体積を約２ｍＬに減少させた。エーテル溶液（１５０ｍＬ）に滴下すると、沈殿し、これを収集してｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ_２−Ｃ_６Ｈ_４−Ｎ_３が生成した。

ＮＨ_２−ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯ_２Ｈ＋Ｎ_３−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯ_２−ＮＨＳ→Ｎ_３−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯ_２Ｈ
ＮＨ_２−ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯ_２Ｈ（分子量３４００Ｄａ、２．０ｇ）を飽和ＮａＨＣＯ_３（１０ｍＬ）水溶液に溶解し、溶液を０℃に冷却した。３−アジド−１−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドプロピオネート（５当量）を激しく撹拌しながら添加した。３時間後、水２０ｍＬを添加し、混合物をさらに室温で４５分間撹拌した。０．５ＮのＨ_２ＳＯ_４でｐＨを３に調整し、ＮａＣｌを約１５重量％の濃度になるまで添加した。反応混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２（１００ｍＬ×３）で抽出し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、濃縮した。冷ジエチルエーテルで沈殿後、生成物を濾過によって収集し、真空下で乾燥してオメガ−カルボキシ−アジドＰＥＧ誘導体を得た。

ｍＰＥＧ−ＯＭｓ＋ＨＣ≡ＣＬｉ→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ≡Ｃ−Ｈ
当技術分野において知られている通りに調製し、ＴＨＦ中で−７８Ｃに冷却したリチウムアセチリド（４当量）の溶液に、ＴＨＦに溶解したｍＰＥＧ−ＯＭｓの溶液を激しく撹拌しながら滴下した。３時間後、反応物を室温に温め、ブタノール１ｍＬを添加して急冷した。次いで、水２０ｍＬを添加し、混合物を室温でさらに４５分間撹拌した。０．５ＮのＨ_２ＳＯ_４でｐＨを３に調整し、ＮａＣｌを約１５重量％の濃度になるまで添加した。反応混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２（１００ｍＬ×３）で抽出し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、濃縮した。冷ジエチルエーテルで沈殿後、生成物を濾過によって収集し、真空下で乾燥してオメガ−カルボキシ−アジドＰＥＧ誘導体を生成した。

アジド−およびアセチレン含有アミノ酸が、Ｌ．Ｗａｎｇ等、（２００１）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：４９８〜５００、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：９６４〜７（２００３））、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ等、（２００２）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２４：９０２６〜９０２７；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ＆Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ、（２００２）、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ １１：１１３５〜１１３７；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ等、（２００２）、ＰＮＡＳ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９９：１１０２０〜１１０２４：およびＬ．Ｗａｎｇ＆Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ、（２００２）、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．、１〜１０に記載されている方法を使用して、タンパク質中に部位選択的に組み込まれた。アミノ酸が組み込まれてから、タンパク質０．０１ミリモルとのシクロ付加反応を、リン酸緩衝液（ＰＢ）中で、ｐＨ８、ＰＥＧ誘導体２ミリモル、ＣｕＳＯ_４１ミリモル、およびＣｕ線約１ｍｇの存在下で、３７℃で４時間実施した。

前述の記載および関連した図において示された教示の利点を得ながら、本発明が関係する、本発明の多くの変更形態および他の実施形態が、当業者には思い浮かぶであろう。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に限定するものではなく、変更形態および他の実施形態は、添付の特許請求の範囲内に含まれるものであることを理解されたい。特定の用語が、本明細書において使用されているが、それらは、専ら包括的および説明的意味において使用されており、限定するために使用されているものではない。本明細書において引用されている全ての、出版物、特許、および特許出願を、全ての目的のために、参照により本明細書に組み込む。

Claims (13)

1. 加水分解に対して安定であり、次式
   Ｒ−ＣＨ_２ＣＨ_２−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ−Ｃ≡ＣＨ［式中、ｎは５から３０００であり、Ｒはアセチレンと同一または異なっていてよいキャッピング基、官能基、または脱離基である］を有する水溶性活性化ポリマー。
2. Ｒが、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、アルコキシル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、１−ベンゾトリアゾリルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネート、１−ベンゾトリアゾリルカーボネート、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、アミノオキシ、保護アミン、ヒドラジド、保護ヒドラジド、保護チオール、カルボン酸、保護カルボン酸、イソシアナート、イソチオシアナート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセタミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレート、およびトレシレート、アルケン、およびケトンからなる群から選択される、請求項１に記載の水溶性活性化ポリマー。
3. ｎが、５から２２００である、請求項１に記載の水溶性活性化ポリマー。
4. ｎが、３４から１１００である、請求項１に記載の水溶性活性化ポリマー。
5. ｎが、４５から１１０である、請求項１に記載の水溶性活性化ポリマー。
6. Ｒが、メトキシ（ＣＨ_３Ｏ−）である、請求項１に記載の水溶性活性化ポリマー。
7. Ｒが、カルボン酸（ＨＯ_２Ｃ−）である、請求項１に記載の水溶性活性化ポリマー。
8. Ｒが、アミン（Ｈ_２Ｎ−）である、請求項１に記載の水溶性活性化ポリマー。
9. Ｒが、マレイミドである、請求項１に記載の水溶性活性化ポリマー。
10. Ｒが、アミンと反応性である、請求項１に記載の水溶性活性化ポリマー。
11. Ｒが、求電子性カルボニル基と反応性である、請求項１に記載の水溶性活性化ポリマー。
12. Ｒが、チオールと反応性である、請求項１に記載の水溶性活性化ポリマー。
13. Ｒが、ヒドロキシルと反応性である、請求項１に記載の水溶性活性化ポリマー。