CN116333124A - 与pd-l1结合的抗原结合蛋白 - Google Patents

Abstract

公开了抗PD‑L1IgG类抗体，其具有改进的以更高产率制造的能力。更具体地，公开了可以以更高的产率制备的结合PD‑L1的人抗体、PD‑L1结合片段。

Description

与PD-L1结合的抗原结合蛋白

本申请是申请号为201780021396.X、申请日为2017年1月27日、发明名称为“与PD-L1结合的抗原结合蛋白”的中国发明专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为PCT/US2017/015429的国家阶段申请，该国际申请要求于2016年1月29日提交的美国临时专利申请第62/288,912号的优先权，其全文内容在此以引用方式并入本文。

序列表

本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且其全部内容并入本文供参考。2017年1月27日创建的所述ASCII拷贝被命名为126036-06620_ST25.txt，大小为8.0千字节。

技术领域

本发明提供了抗PD-L1 IgG类抗体，其具有改进的以更高产率制备的能力。更具体地，本发明提供与PD-L1结合的人抗体、PD-L1结合片段和此类抗体的衍生物，以及包含此类片段的PD-L1结合多肽。

背景技术

程序性死亡配体1(PD-L1)是40kDa的第一类跨膜蛋白。作为PD-1的配体的PD-L1(人PD-L1 cDNA由EMBL/GenBank Acc.No.NM_001267706所示的碱基序列组成，小鼠PD-L1cDNA由NM_021893所示的碱基序列组成)在所谓的抗原提呈递细胞(如活化的单核细胞和树突细胞)中表达。这些细胞向T淋巴细胞呈递诱导多种免疫诱导信号的相互作用分子，并且PD-L1是通过结合PD-1而诱导抑制信号的这些分子之一。已经揭示PD-L1结合抑制表达PD-1的T淋巴细胞的活化(细胞增殖和各种细胞因子产生的诱导)。PD-L1表达不仅在免疫活性细胞中得到证实，而且在某种肿瘤细胞系中得到证实(源自单核细胞白血病的细胞系、源自肥大细胞的细胞系、源自肝癌的细胞系、源自成神经细胞的细胞系和源自乳腺癌的细胞系)(Nature Immunology(2001),vol.2,issue 3,p.261-267)。

程序性死亡1(PD-1)是CD28受体家族的成员，CD28受体家族包括CD28、CTLA-4、ICOS、PD-L1和BTLA。该家族的最初成员CD28是在添加单克隆抗体后通过增强T细胞增殖的功能效应而发现的(Hutloff et al.(1999)Nature 397:263-266；Hansen et al.(1980)Immunogenics 10:247-260)。已经鉴定了PD-1的两种细胞表面糖蛋白配体，即PD-L1和PDL-2，并且已经显示这两种细胞表面糖蛋白配体在与PD-1结合时下调T细胞活化并且使细胞因子分泌发生(Freeman et al.(2000)J.Exp.Med.192:1027-34；Latchman et al.(2001)Nat.Immunol.2:261-8；Carter et al.(2002)Eur.J.Immunol.32:634-43；Ohigashi etal.(2005)Clin.Cancer Res.11:2947-53)。PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)都是与PD-1结合的B7同系物。还显示PD-L1在细胞表面上的表达通过IFN-γ刺激而上调。

已经在包括人肺癌、卵巢癌和结肠癌以及各种骨髓瘤的几种鼠和人癌症中发现了PD-L1的表达(Iwai et al.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:12293-7；Ohigashi etal.(2005)Clin.Cancer Res.11:2947-53)。已经提出PD-L1通过增加抗原特异性T细胞克隆的凋亡而在肿瘤免疫中发挥作用(Dong et al.(2002)Nat.Med.8:793-800)。还有人提出PD-L1可能参与肠粘膜炎症，抑制PD-L1抑制了与结肠炎相关的疾病(Kanai et al.(2003)J.Immunol.171:4156-63)。

发明内容

本发明发现在美国专利申请美国专利公开第2013-0323249号(2013年5月31日提交的13/907,685)(其公开内容并入本文供参考)中公开作为野生型的SEQ ID NO.213为重链和SEQ ID NO.214为轻链的抗体(称为H6B1L)在给定氨基末端片段化的某些条件下不能以足够的量来制造。因此，本发明提供了变体H6B1L抗体，其尤其可以在CHO细胞中制备而没有轻链片段化。

在一种实施方式中，本发明提供了与PD-L1表位结合的IgG类的全人抗体，所述全人抗体具有与SEQ ID NO.1的氨基酸序列至少95％相同的重链可变域序列，并且具有与选自SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的氨基酸序列至少95％相同的轻链可变域序列。优选地，全人抗体具有重链和轻链，其中抗体具有选自SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2(本文称为H6B1L-EM)和SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.3(本文称为H6B1L-EV)的重链/轻链可变域序列。

在某些实施方式中，本发明提供了全人抗体Fab片段，所述全人抗体Fab片段具有来自重链的可变域区和来自轻链的可变域区，其中所述重链可变域序列与氨基酸序列SEQID NO.1至少95％相同，所述轻链可变域序列与选自SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的氨基酸序列至少95％相同。优选地，全人抗体Fab片段具有重链可变域区和轻链可变域区，其中抗体具有选自SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.3的重链/轻链可变域序列。

在一种实施方式中，本发明提供了单链人抗体，所述单链人抗体具有来自重链的可变域区和来自轻链的可变域区以及连接重链和轻链可变域区的连接肽，其中所述重链可变域序列与氨基酸序列SEQ ID NO.1至少95％相同，所述轻链可变域序列与选自SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3的氨基酸序列至少95％相同。优选地，单链全人抗体具有重链可变域区和轻链可变域区，其中单链全人抗体具有选自SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.3的重链/轻链可变域序列。

在一种实施方式中，本发明还提供了治疗广谱的哺乳动物癌症或广谱的炎性疾病和自身免疫疾病的方法，包括给予有效量的抗PD-L1多肽，其中所述抗PD-L1多肽选自与合PD-L1表位结合的IgG类的全人抗体、全人抗体Fab片段和单链人抗体及其组合，所述全人抗体Fab片段具有来自重链的可变域区和来自轻链的可变域区，所述单链人抗体具有来自重链的可变域区和来自轻链的可变域区以及连接重链和轻链可变域区的连接肽；

其中所述全人抗体具有与氨基酸序列SEQ ID NO.1至少95％相同的重链可变域序列，并且具有与选自SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的氨基酸序列至少95％相同的轻链可变域序列；

其中所述全人抗体Fab片段具有与氨基酸序列SEQ ID NO.1至少95％相同的重链可变域序列，并且具有与选自SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的氨基酸序列至少95％相同的轻链可变域序列；并且

其中所述单链人抗体具有与氨基酸序列SEQ ID NO.1至少95％相同的重链可变域序列，并且具有与选自SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的氨基酸序列至少95％相同的轻链可变域序列。在某些实施方式中，重链可变区包含如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的氨基酸序列中所示的CDR1域、CDR2域和CDR3域，

在某些实施方式中，全人抗体具有重链和轻链，其中抗体具有选自SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2(本文称为H6B1L-EM)和SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.3(本文称为H6B1L-EV)的重链/轻链可变域序列。优选地，全人抗体Fab片段具有重链可变域区和轻链可变域区，其中所述抗体具有选自SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2(本文称为H6B1L-EM)和SEQ ID NO.1/SEQ IDNO.3(本文称为H6B1L-EV)的重链/轻链可变域序列。优选地，全人单链抗体具有重链可变域区和轻链可变域区，其中单链全人抗体具有选自SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.1/SEQ ID NO.3的重链/轻链可变域序列。

在一种实施方式中，本发明提供与PD-L1表位结合的IgG类的全人抗体，其中所述抗体包含重链可变域并且包含轻链可变域，所述重链可变域包含与SEQ ID NO.1中所示的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，所述轻链可变域包含如SEQ ID NO.2或SEQ IDNO.3中所示的氨基酸序列。

在其他实施方式中，本发明提供与PD-L1表位结合的IgG类的全人抗体，其中所述抗体包含重链可变域并且包含轻链可变域，所述重链可变域包含分别如SEQ ID NO:5、SEQID NO:6和SEQ ID NO:7的氨基酸序列所示的CDR1域、CDR2域和CDR3域，所述轻链可变域包含如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3中所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，本发明的全人抗体可以是IgG1或IgG4。

在一种实施方式中，本发明还包括药物组合物，其包含本发明的抗PD-L1抗体(或其片段)和药学上可接受的载体。

本发明还包括治疗患有癌症或自身免疫疾病或炎性疾病的人对象的方法，所述方法包括给予有效量的抗PD-L1全人抗体、Fab片段或scFv。在一种实施方式中，待治疗的广谱的哺乳动物癌症选自：卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、骨髓瘤、成神经细胞性的CNS瘤、单核细胞白血病、B细胞性白血病、T细胞性白血病、B细胞性淋巴瘤、T细胞性淋巴瘤、肥大细胞性肿瘤及其组合。在一种实施方式中，自身免疫疾病或炎性疾病选自：肠粘膜炎症、结肠炎相关的消耗病、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、病毒感染、类风湿性关节炎、骨关节炎、牛皮癣、克罗恩病(Cohn’s disease)和炎性肠道疾病。

在一种实施方式中，本发明的抗体或片段在哺乳动物宿主细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO))细胞中产生。

附图说明

图1A和1B显示了上图(图1A)中的原始野生型抗体H6B1L和下图(图1B)中的本变体抗体H6-B1L-EM的轻链的比较质谱特征峰。如图1B中所述，与亲本轻链相比，没有检测到H6B1LEM轻链的轻链(LC)片段。图1中描述的抗体在CHO细胞中产生。

具体实施方式

定义

“抗原结合蛋白”是包含与抗原结合的部分的蛋白质，并且任选地，包含使得抗原结合部分采取促进抗原结合蛋白与抗原结合的构象的支架或骨架部分。抗原结合蛋白的实例包括抗体、抗体片段(例如抗体的抗原结合部分)、抗体衍生物和抗体类似物。抗原结合蛋白可包含，例如，具有枝接的CDRs或CDR衍生物的供选择的蛋白质支架或人工支架。此类支架包括但不限于抗体衍生支架以及全合成支架，所述抗体衍生支架包含为了例如稳定抗原结合蛋白的三维结构而引入的突变，所述全合成支架包含例如生物相容性聚合物。参见，例如，Korndorfer et al.,2003,Proteins:Structure,Function,and Bioinformatics,Volume 53,Issue 1:121-129；Roque et al.,2004,Biotechnol.Prog.20:639-654。另外，可以使用肽抗体模拟物(“PAMs”)，以及基于用纤维蛋白连接素成分作为支架的抗体模拟物的支架。

抗原结合蛋白可以具有例如天然存在的免疫球蛋白的结构。“免疫球蛋白”是四聚体分子。在“完整的免疫球蛋白”(其具有与天然存在的免疫球蛋白的重链和轻链相似的重链和轻链)中，每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50至70kDa)。每条链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100至110个或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基末端部分限定了主要负责效应子功能的恒定区。人轻链被分类为κ(kappa)或λ(lambda)轻链。重链被分为μ(mu)、δ(delta)、γ(gamma)、α(alpha)或ε(epsilon)，并将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过约12个或更多个氨基酸的“或更区连接，重链还包括约10个以上氨基酸的“以上区。一般参见Fundamental Immunology Ch.7(Paul,W.,ed.,2nd ed.RavenPress,N.Y.(1989))(出于所有目的整体并入供参考)。每个轻/重链对的可变区形成抗体结合位点，使得完整的免疫球蛋白具有两个结合位点。应注意，术语“天然存在的免疫球蛋白”不是指免疫球蛋白的来源，而是指免疫球蛋白的总体结构。

天然存在的免疫球蛋白链的可变区表现出由三个高变区(也称为互补决定区或CDRs)连接的相对保守的骨架区(FR)的相同通用结构。从N末端到C末端，轻链和重链都包含域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。每个域的氨基酸分配符合Kabat等人在Sequencesof Proteins of Immunological Interest,5^th Ed.,US Dept.of Health and HumanServices,PHS,NIH,NIH Publication no.91-3242,1991中的定义。免疫球蛋白链中氨基酸的其他编号系统包括IMGT.RTM.(国际免疫遗传学信息系统；Lefranc et al,Dev.Comp.Immunol.29:185-203；2005)和AHo(Honegger and Pluckthun,J.Mol.Biol.309(3):657-670；2001)。

抗体可以从含有具有不同抗原特异性的免疫球蛋白的血清或血浆等来源获得。如果对这些抗体进行亲和纯化，则可以针对特定的抗原特异性进行富集强化。这种富集的抗体制剂通常由少于约10％的针对特定抗原具有特异性结合活性的抗体组成。使这些制剂经历几轮亲和纯化可以增加针对抗原具有特异性结合活性的抗体的比例。以这种方式制备的抗体通常被称为“单特异性”。单特异性抗体制剂可由约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或99.9％的针对特定抗原具有特异性结合活性的抗体组成。

除非另有说明，“抗体”是指完整的免疫球蛋白或其与完整抗体为特异性结合而竞争的抗原结合部分。在一种实施方式中，抗体是完整的免疫球蛋白。抗原结合部分可以通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶切或化学切割制备。抗原结合部分尤其包括Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv、域抗体(dAbs)和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、嵌合抗体、双抗体、三抗体、四抗体和含有足以令特异性抗原与多肽结合的至少一部分免疫球蛋白的多肽。

可以使用如上所述的Kabat等人、如上所述的Lefranc等人和/或如上所述的Honegger和Pluckthun所描述的系统鉴定给定抗体的互补决定区(CDRs)和骨架区(FR)。可以将一个或多个CDRs共价或非共价地并入分子中，以使该分子成为抗原结合蛋白。抗原结合蛋白可以合并CDR(s)以作为较大多肽链的一部分，可以将CDR(s)共价连接至另一条多肽链，或者可以非共价地合并CDR(s)。CDRs允许抗原结合蛋白与感兴趣的特定抗原特异地结合。

抗原结合蛋白可具有一个或多个结合位点。如果存在多于一个结合位点，则结合位点可以彼此相同或可以不同。例如，天然存在的人免疫球蛋白通常具有两个相同的结合位点，而“双特异性”或“双官能团”抗体具有两个不同的结合位点。

术语“人抗体”包括具有一个或多个源自人免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体或抗体的抗原结合片段。在一种实施方式中，所有可变区和恒定区均源自人免疫球蛋白序列(全人抗体)。这些抗体可以多种方式制备，其实例如下所述，包括通过用感兴趣的抗原免疫小鼠，所述小鼠经过遗传修饰以表达源自人重链和/或轻链编码基因的抗体。可以以多种方式鉴定人抗体，包括通过噬菌体展示或通过用感兴趣的抗原免疫小鼠，其中小鼠经遗传修饰以表达源自人重链和/或轻链编码基因的抗体。在一种实施方式中，使用重组方法制备全人抗体，使得抗体的糖基化模式不同于具有相同序列的抗体(如果它存在于自然界中的话)的糖基化模式。

“人源化抗体”具有通过一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加而不同于源自非人物种的抗体序列的序列，使得与非人物种抗体相比，当将人源化抗体给药于人对象时，人源化抗体不太可能诱导免疫应答和/或诱导较不严重的免疫应答。在一种实施方式中，使非人物种抗体的重链和/或轻链的骨架和恒定域中的某些氨基酸突变，以产生人源化抗体。在另一种实施方式中，来自人抗体的恒定域与非人物种的可变域融合。在另一种实施方式中，改变非人抗体的一个或多个CDR序列中的一个或多个氨基酸残基，以降低非人抗体在给药于人对象时的可能的免疫原性，其中改变的氨基酸残基对抗体与其抗原的免疫特异性结合来说不是关键的，或所做的对氨基酸序列的改变是保守性变化，使得人源化抗体与抗原的结合不显著差于非人抗体与抗原的结合。如何制备人源化抗体的实例可以在美国专利第6,054,297、5,886,152和5,877,293号中找到。

术语“嵌合抗体”是指含有来自一种抗体的一个或多个区域和来自一种或多种其他抗体的一个或多个区域的抗体。在一种实施方式中，一个或多个CDRsy源自人抗PD-L1抗体。在另一种实施方式中，所有CDR均源自人抗PD-L1抗体。在另一种实施方式中，来自多于一种人抗PD-L1抗体的CDR在嵌合抗体中混合并匹配。例如，嵌合抗体可以包含来自第一人抗PD-L1抗体的轻链的CDR1，来自第二人抗PD-L1抗体的轻链的CDR2和CDR3，以及来自第三抗PD-L1抗体的重链的CDRs。其他组合也是可能的。此外，骨架区可以源自相同的抗PD-L1抗体中的一种，源自一种或多种不同的抗体(例如人抗体)，或源自人源化抗体。在嵌合抗体的一个实例中，重链和/或轻链的一部分相同于、同源于或源自来自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体，而链的其余部分相同于、同源于或源自来自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体。还包括表现出所期望的生物活性(即特异性结合PD-L1的能力)的这种抗体的片段。

“Fab片段”是具有V_L、V_H、C_L和C_H1域的单价片段；F(ab')₂片段是具有两个Fab片段的二价片段，所述两个Fab片段在铰链区通过二硫键连接；Fd片段具有V_H和C_H1域；Fv片段具有抗体单臂的V_L和V_H域；dAb片段具有V_H域、V_L域、或V_H或V_L域的抗原结合片段(美国专利第6,846,634；6,696,245号，美国申请公布第20/0202512；2004/0202995；2004/0038291；2004/0009507；2003/0039958号，和Ward et al.,Nature341:544-546,1989)。

“单链抗体”或“链抗体v”是其中V_L和V_H区通过连接子(例如氨基酸残基的合成序列)连接以形成连续蛋白质链的抗体。在某些实施方式中，连接子足够长以允许蛋白质链自身折回并形成单价抗原结合位点(参见例如，Bird et al.,1988,Science 242:423-26和Huston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-83)。双抗体是包含两条多肽链的二价抗体，其中每条多肽链包含通过连接子连接V_H和V_L域，所述连接子太短而不能使在同一链上的两个域之间配对，因此使得每个域与另一条多肽链上的互补域配对(参见例如，Holliger et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-48和Poljak et al.,1994,Structure 2:1121-23)。如果双抗体的两条多肽链相同，那么由它们配对产生的双抗体将具有两个相同的抗原结合位点。具有不同序列的多肽链可用于制备具有两个不同抗原结合位点的双抗体。类似地，三抗体和四抗体分别是包含三条和四条多肽链的抗体，并分别形成可以相同或不同的三个和四个抗原结合位点。

“中和抗体”或“抑制性抗体”是使用实施例中如本文描述的那些测定测量的当过量的抗PD-L1抗体将活化量减少至少约20％时抑制PD-L1的蛋白水解活化的抗体。在各种实施方式中，抗原结合蛋白将PD-L1的蛋白水解活化量减少至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％和99.9％。

本领域普通技术人员按照本说明书的教导并使用本领域已知的技术可以容易地制备抗体的片段或类似物。片段或类似物的优选氨基末端和羧基末端出现在功能域的边界附近。可以通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公共或专有序列数据库进行比较来鉴定结构域和功能域。计算机化的比较方法可用于鉴定在已知结构和/或功能的其他蛋白质中存在的序列基序或预测的蛋白质构象域。鉴定折叠成已知三维结构的蛋白质序列的方法是已知的。参见Bowie et al.,1991,Science 253:164。

“253移植抗体”是包含一个或多个CDRs和骨架的抗体，所述一个或多个CDRs源自特定物种或同种型的抗体，所述骨架是相同或不同物种或同种型的另一抗体的骨架。

“多特异性抗体”是识别一种或多种抗原上的多于一个表位的抗体。这类抗体的亚类是识别相同或不同抗原上的两个不同表位的“双特异性抗体”。

如果抗原结合蛋白以1纳摩尔或更低的解离常数与抗原结合，则抗原结合蛋白“特异性结合”抗原(例如，人PD-L1)。

“抗原结合域”、“抗原结合区”或“抗原结合位点”是抗原结合蛋白的一部分，该部分含有与抗原相互作用并有助于抗原结合蛋白的特异性和对抗原的亲和力的氨基酸残基(或其他部分)。对于特异性结合其抗原的抗体，这将包括其CDR域中至少一个的至少一部分。

“表位”是由抗原结合蛋白结合(例如由抗体)的分子的一部分。表位可以包含分子的非连续部分(例如在多肽中，多肽的一级序列中不连续，但是在多肽的三级和四级结构的情况下，彼此足够接近以通过抗原结合蛋白结合的氨基酸残基)。

使用GAP计算机程序(GCG Wisconsin Package，版本10.3(Accelrys,San Diego,Calif.)的一部分)使用它的默认参数，通过比较序列来确定两个多核苷酸或两个多肽序列的“百分比同一性”或“百分比同源性”。

术语“多核苷酸”“寡核苷酸”和“核酸”在全文中可互换使用，并包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如mRNA)、使用核苷酸类似物(例如，肽核酸和非天然存在的核苷酸类似物)生成的DNA或RNA的类似物、及其杂合体。核酸分子可以是单链或双链的。在一种实施方式中，本发明的核酸分子包含编码抗体或其片段、衍生物、突变蛋白或变体的连续开放阅读框。

如果它们的序列可以以反平行方向排列，使得一个多核苷酸中的每个核苷酸与其他多核苷酸中的互补核苷酸相对，而不会存在间隙，且任一序列的5'或3'末端均没有未配对核苷酸，则两个单链多核苷酸是彼此的“互补”。如果两个多核苷酸可以在适当严格的条件下彼此杂交，则多核苷酸与另一个多核苷酸“互补”。因此，多核苷酸可以在并非对方互补的情况下与另一多核苷酸互补。

“载体”是可用于将与之连接的另一核酸引入细胞的核酸。一种载体是“质粒”，其是指另外的核酸片段可以连接到其内部的线性或环状双链DNA分子。另一种载体是病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，其中可以将另外的DNA片段引入病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如包含细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。“表达载体”是一种可以指导所选多核苷酸表达的载体。

如果调节序列影响核苷酸序列的表达(例如表达的水平、时间或位置)，则核苷酸序列与调节序列“可操作地连接”。“调节序列”是影响与其可操作地连接的核酸的表达(例如表达的水平、时间或位置)的核酸。调节序列可以例如直接对受调节的核酸发挥其作用，或通过一个或多个其他分子(例如与调节序列和/或核酸结合的多肽)的作用来发挥其作用。调节序列的实例包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如多腺苷酸化信号)。调节序列的其他实例描述于例如Goeddel,1990,Gene Expression Technology:Methods inEnzymology 185,Academic Press,San Diego,Calif.和Baron et al.,1995,NucleicAcids Res.23:3605-06。

“宿主细胞”是可用于表达核酸(例如本发明的核酸)的细胞。宿主细胞可以是原核生物，例如大肠杆菌，或者它可以是真核生物，例如单细胞真核生物(例如酵母或其他真菌)、植物细胞(例如烟草或番茄植物细胞)、动物细胞(例如人细胞、猴细胞，仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞)或杂种细胞。宿主细胞的实例包括猴肾细胞COS-7系(ATCC CRL1651)(参见Gluzman et al.,1981,Cell 23:175)、L细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCC CCL163)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或其衍生系(如Veggie CHO)和在无血清培养基中生长的相关细胞系(参见Rasmussen et al.,1998,Cytotechnology 28:31)或DHFR缺陷的CHO株DX-B11(参见Urlaub et al，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-20)、HeLa细胞、BHK(ATCC CRL 10)细胞系、源自非洲绿猴肾细胞系CV1(ATCC CCL 70)的CV1/EBNA细胞系(参见McMahan et al.,1991,EMBO J.10:2821)、人胚肾细胞(如293、293EBNA或MSR 293)、人表皮A431细胞、人Colo205细胞、其他转化的灵长类细胞系、正常二倍体细胞、源自原代组织和原代外植体的体外培养的细胞株、HL-60、U937、HaK或Jurkat细胞。在一种实施方式中，宿主细胞是非人的哺乳动物宿主细胞。通常，宿主细胞是可以用编码多肽的核酸转化或转染的培养的细胞，所述核酸然后可以在宿主细胞中表达。短语“重组宿主细胞”可用于表示已用待表达的核酸转化或转染的宿主细胞。宿主细胞也可以是包含核酸但除非将调节序列引入宿主细胞中使调节序列与核酸可操作地连接就不以所期望的水平表达的细胞。应理解，术语宿主细胞不仅指特定的对象细胞，还指这种细胞的后代或潜在后代。因为在随后的世代中由于例如突变或环境影响可能会发生某些变化，这样的后代实际上可能不与亲本细胞相同，但仍包括在本文所用术语的范围内。在一种实施方式中，宿主细胞是CHO细胞。

术语“重组抗体”是指由用表达载体(或可能多于一种表达载体)转染的宿主细胞(或细胞系)表达的抗体，所述表达载体包含抗体的编码序列或其部分(例如，编码如本文所述的重链或轻链可变区的DNA序列)。在一种实施方式中，所述编码序列不与细胞天然相关。在一种实施方式中，重组抗体具有的糖基化模式不同于具有相同序列的抗体(如果它存在于自然界中的话)的糖基化模式。在一种实施方式中，重组抗体在非人宿主细胞的哺乳动物宿主细胞中表达。值得注意的是，单独的哺乳动物宿主细胞具有独特的糖基化模式。

术语“PD-L1抑制剂”和“PD-L1拮抗剂”可互换使用。每个都是可检测地抑制PD-L1的至少一种功能的分子。相反，“PD-L1激动剂”是可检测地增加PD-L1的至少一种功能的分子。PD-L1抑制剂引起的抑制不需要是完全的，只要可以使用测定来检测即可。可以使用PD-L1功能的任何测定，本文中提供了测定的实例。可以被PD-L1抑制剂抑制或被PD-L1激动剂增加的PD-L1的功能的实例包括癌细胞生长或凋亡(程序性细胞死亡)等。PD-L1抑制剂和PD-L1激动剂的类型的实例包括但不限于PD-L1结合多肽，例如抗原结合蛋白(例如PD-L1抑制性抗原结合蛋白)、抗体、抗体片段和抗体衍生物。

术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”各自是指包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸残基的分子。这些术语包括例如天然和人工蛋白质、蛋白质片段和蛋白质序列的多肽类似物(例如突变蛋白、变体和融合蛋白)以及翻译后修饰的蛋白质或共价或非共价修饰的蛋白质。肽、多肽或蛋白质可以是单体的或聚合体。

多肽(例如抗体)的“变体”包含氨基酸序列，其中相对于另一多肽序列，一个或多个氨基酸残基在氨基酸序列内插入、从氨基酸序列中缺失和/或在氨基酸序列内取代。公开的变体包括例如融合蛋白。

多肽的“衍生物”是例如通过缀合至另一种化学部分(例如聚乙二醇或白蛋白，例如人血清白蛋白)、磷酸化和糖基化而已经被化学修饰的多肽(例如抗体))。除非另有说明，否则术语“抗体”除了包含两条全长重链和两条全长轻链的抗体外，还包括其衍生物、变体、片段和突变蛋白，其实例如下所述。

PD-L1抗原结合蛋白

本发明提供了以10^-6M或更小的结合亲和力与PD-L1表位结合的IgG类的全人抗体，所述全人抗体具有与SEQ ID NO.1的氨基酸序列至少95％相同的重链可变域序列，并且具有与选自SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的氨基酸序列至少95％相同的轻链可变域序列。优选地，全人抗体具有重链和轻链，其中抗体具有选自SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2(本文称为H6B1L-EM)和SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.3(本文称为H6B1L-EV)的重链/轻链可变域序列。亲本抗体H6B1L及其变体-EM和-EV的序列在以下序列表中提供。已经鉴定本文公开的-EM和-EV抗PD-L1抗体具有表达的优势，特别是在CHO细胞中，在CHO细胞中避免了片段化。优选地，本发明的抗PD-L1抗体(或片段)与人PD-L1结合。

抗原结合蛋白包括抑制PD-L1生物活性的全人单克隆抗体。

在一些实施方式中，全人抗体包含重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR3域(如使用Kabat编号方案确定)，所述轻链可变域包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR3域。在一些实施方式中，全人抗体包含重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2域，所述轻链可变域包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR2域。在一些实施方式中，全人抗体包含重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1域，所述轻链可变域包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR1域。在一些实施方式中，全人抗体包含重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域包含分别具有SEQ ID NO:7、6和5的氨基酸序列的CDR3、CDR2和CDR1，所述轻链可变域包含分别具有SEQ ID NO:10、9和8的氨基酸序列的CDR3、CDR2和CDR1。

在某些实施方式中，本发明提供与PD-L1表位结合的IgG类(例如IgG1或IgG4)的全人抗体，其中所述抗体包含重链可变域并且包含轻链可变域，所述重链可变域包含与SEQID NO.1中所示的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，所述轻链可变域包含如SEQ IDNO.2或SEQ ID NO.3中所示的氨基酸序列。在一种实施方式中，本发明提供与PD-L1表位结合的IgG类(例如IgG1或IgG4)的全人抗体，其中所述抗体包含重链可变域并且包含轻链可变域，所述重链可变域包含分别如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的氨基酸序列所示的CDR1域、CDR2域和CDR3域，所述轻链可变域包含如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3中所示的氨基酸序列。

本文还考虑了抗体片段，其中抗体片段与PD-L1结合，并且包含重链可变域且包含轻链可变域，所述重链可变域包含与SEQ ID NO.1中所示的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，所述轻链可变域包含如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3中所示的氨基酸序列。在一种实施方式中，本发明提供了抗PD-L1抗体片段，所述抗PD-L1抗体片段包含重链可变域并且包含轻链可变域，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的氨基酸序列中所示的CDR1域、CDR2域和CDR3域，所述轻链可变域包含如SEQ ID NO.2或SEQ IDNO.3中所示的氨基酸序列。

本发明提供全人抗体Fab片段，所述全人抗体Fab片段具有来自重链的可变域区和来自轻链的可变域区，其中所述重链可变域序列与氨基酸序列SEQ ID NO.1至少95％相同，所述轻链可变域序列与选自SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的氨基酸序列至少95％相同。优选地，全人抗体Fab片段具有重链可变域区和轻链可变域区，其中抗体具有选自SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.3的重链/轻链可变域序列。

在一些实施方式中，全人抗体Fab片段包含重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR3域(如使用Kabat编号方案确定)，所述轻链可变域包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR3域。在一些实施方式中，全人抗体Fab片段包含重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2域，所述轻链可变域包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR2域。在一些实施方式中，全人抗体Fab片段包含重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1域，所述轻链可变域包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR1域。在一些实施方式中，全人抗体Fab片段包含重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域包含分别具有SEQ ID NO:7、6和5的氨基酸序列的CDR3、CDR2和CDR1，所述轻链可变域包含分别具有SEQ ID NO:10、9和8的氨基酸序列的CDR3、CDR2和CDR1。

本发明的抗原结合蛋白的抗原结合片段可通过常规技术产生。此类片段的实例包括但不限于Fab和F(ab')₂片段。

本公开提供了单链人抗体，所述单链人抗体具有来自重链的可变域区和来自轻链的可变域区以及连接重链和轻链可变域区的连接肽，其中所述重链可变域序列与氨基酸序列SEQ ID NO.1至少95％相同，所述轻链可变域序列与选自SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的氨基酸序列至少95％相同。优选地，单链全人抗体具有重链可变域区和轻链可变域区，其中单链全人抗体具有选自SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.3的重链/轻链可变域序列。

在一些实施方式中，单链人抗体包含重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR3(如使用Kabat编号方案确定)，所述轻链可变域包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方式中，单链人抗体包含重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2，所述轻链可变域包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR2。在一些实施方式中，单链人抗体包含重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1，所述轻链可变域包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR1。在一些实施方式中，单链人抗体包含重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域包含分别具有SEQ ID NO:7、6和5的氨基酸序列的CDR3、CDR2和CDR1，所述轻链可变域包含分别具有SEQ ID NO:10、9和8的氨基酸序列的CDR3、CDR2和CDR1。

本发明还提供了治疗广谱的哺乳动物癌症或炎性疾病或自身免疫疾病的方法，包括给予有效量的抗PD-L1多肽，其中所述抗PD-L1多肽选自以至少10^-6M的结合亲和力与PD-L1表位结合的IgG类全人抗体、全人抗体Fab片段和单链人抗体及其组合，所述全人抗体Fab片段具有来自重链的可变域区和来自轻链的可变域区，所述单链人抗体具有来自重链的可变域区和来自轻链的可变域区以及连接重链和轻链可变域区的连接肽；其中所述全人抗体具有与氨基酸序列SEQ ID NO.1至少95％相同的重链可变域序列，并且具有与选自SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3的氨基酸序列至少95％相同的轻链可变域序列；其中所述全人抗体Fab片段具有与氨基酸序列SEQ ID NO.1至少95％相同的重链可变域序列，并且具有与选自SEQID NO.2和SEQ ID NO.3的氨基酸序列至少95％相同的轻链可变域序列；并且其中所述单链人抗体具有与氨基酸序列SEQ ID NO.1至少95％相同的重链可变域序列，并且具有与选自SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的氨基酸序列至少95％相同的轻链可变域序列。

优选地，全人抗体具有重链和轻链，其中抗体具有选自SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.3的重链/轻链可变域序列。优选地，全人抗体Fab片段具有重链可变域区和轻链可变域区，其中所述抗体具有选自SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.1/SEQ ID NO.3的重链/轻链可变域序列。优选地，全人单链抗体具有重链可变域区和轻链可变域区，其中单链全人抗体具有选自SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.1/SEQID NO.3的重链/轻链可变域序列。

在特定的实施方式中，本发明的抗原结合蛋白对PD-L1的结合亲和力(K_a)为至少10⁶。在其他实施方式中，抗原结合蛋白表现出至少10⁷、至少10⁸、至少10⁹或至少10¹⁰的K_a。在另一种实施方式中，抗原结合蛋白表现出与本文实施例中所述抗体基本相同的K_a。

在另一种实施方式中，本发明提供了具有与PD-L1解离速率低的抗原结合蛋白。在一种实施方式中，抗原结合蛋白的K_off为1×10^-4至1×10^-1或更低。在另一种实施方式中，K_off为5×10^-5至5×10^-1或更低。在另一种实施方式中，K_off与本文描述的抗体基本相同。在另一种实施方式中，抗原结合蛋白以与本文所述抗体基本相同的K_off与PD-L1结合。

亲和力参数可使用本领域已知的标准方法(例如BIACORE)确定。

在另一方面，本发明提供了抑制PD-L1活性的抗原结合蛋白。在一种实施方式中，抗原结合蛋白的IC₅₀为1000nM或更低。在另一种实施方式中，IC₅₀为100nM或更低；在另一种实施方式中，IC₅₀为10nM或更低。在另一种实施方式中，IC₅₀与本文实施例中所述的抗体的IC₅₀基本相同。在另一种实施方式中，抗原结合蛋白以与本文所述抗体基本相同的IC₅₀抑制PD-L1的活性。

在另一方面，本发明提供了一种抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白与细胞表面上表达的人PD-L1结合，并且当如此结合时，抑制细胞中的PD-L1信号传导活性，而不会导致细胞表面上PD-L1的量的显著减少。可以使用任何用于确定或估计细胞表面和/或内部的PD-L1的量的方法。在其他实施方式中，抗原结合蛋白与表达PD-L1的细胞的结合导致小于约75％、50％、40％、30％、20％、15％、10％、5％、1％或0.1％的细胞表面PD-L1被内化。

在另一方面，本发明提供了在体外或体内(例如，当给药于人对象时)具有至少一天的半衰期的抗原结合蛋白。在一种实施方式中，抗原结合蛋白的半衰期为至少3天。

在另一种实施方式中，抗原结合蛋白的半衰期为4天或更长。在另一种实施方式中，抗原结合蛋白的半衰期为8天或更长。在另一种实施方式中，抗原结合蛋白被衍生化或修饰，使得与未衍生化或未修饰的抗原结合蛋白相比，该抗原结合蛋白具有更长的半衰期。在另一种实施方式中，抗原结合蛋白含有一个或多个点突变以增加血清半衰期，例如WO00/09560(其并入本文供参考)中所述。

本发明还提供了多特异性抗原结合蛋白，例如双特异性抗原结合蛋白，例如通过两个不同的抗原结合位点或区域与PD-L1的两个不同表位结合，或与PD-L1的表位和另一分子的表位结合的抗原结合蛋白。此外，如本文所公开的双特异性抗原结合蛋白可包含来自本文所述抗体之一的PD-L1结合位点和来自本文所述抗体中的另一种的第二PD-L1结合区，包括本文中参考其他出版物所描述的那些。供选择地，双特异性抗原结合蛋白可包含来自本文所述抗体之一的抗原结合位点和来自本领域已知的另一种PD-L1抗体或来自通过已知方法或本文描述的方法制备的抗体的第二抗原结合位点。

制备双特异性抗体的许多方法是本领域已知的。这些方法包括使用如Milsteinet al.,1983,Nature 305:537所述的杂交-杂种细胞和抗体片段的化学偶联(Brennan etal.,1985,Science 229:81；Glennie et al.,1987,J.Immunol.139:2367；U.S.专利第6,010,902号)。此外，双特异性抗体可以通过重组方法产生，例如通过使用亮氨酸拉链部分(即来自优先形成异二聚体的Fos和Jun蛋白；Kostelny et al.,1992,J.Immunol.148:1547)或美国专利第5,582,996号中描述的其他锁和钥匙交互域结构。其他有用的技术包括美国专利第5,959,083和5,807,706号中描述的那些技术。

在另一方面，抗原结合蛋白包含抗体的衍生物。衍生化抗体可包含赋予抗体所期望的特性(例如在特定用途中增加半衰期)的任何分子或物质。衍生化抗体可包含，例如，可检测(或标记)部分(例如放射性、比色性、抗原性或酶促性分子；可检测珠(例如磁珠或电子致密珠(例如金珠))；或与另一分子(例如，生物素或链霉亲和素)结合的分子；治疗或诊断部分(例如，放射性、细胞毒性或药物活性部分)，或增加抗体对特定用途例如给药于对象(例如人对象)、或其他体内或体外用途)的适用性的分子。可用于使抗体衍生化的分子的实例包括白蛋白(例如人血清白蛋白)和聚乙二醇(PEG)。抗体的白蛋白连接的和PEG化的衍生物可以使用本领域熟知的技术制备。在一种实施方式中，抗体与运甲状腺素蛋白(TTR)或TTR变体缀合或以其他方式连接。TTR或TTR变体可以用例如选自葡聚糖、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇和聚乙烯醇的化学物质进行化学改性。

含有一种或多种抗原结合蛋白的寡聚体可用作PD-L1拮抗剂。寡聚体可以是共价连接的或非共价连接的二聚体、三聚体或更高级的寡聚体的形式。考虑使用包含两种或更多种抗原结合蛋白的寡聚体，一个实例是同二聚体。其他寡聚体包括异二聚体、同三聚体、异三聚体、同四聚体、异四聚体等。

一种实施方式涉及包含多个抗原结合蛋白的寡聚体，所述多个抗原结合蛋白通过与抗原结合蛋白融合的肽部分之间的共价或非共价相互作用而连接。这类肽可以是连接肽(间隔子)、或具有促进寡聚化性质的肽。如下文更详细描述的，亮氨酸拉链和衍生自抗体的某些多肽是可以促进与其连接的抗原结合蛋白寡聚化的肽。

在特定的实施方式中，寡聚体包含2至4个抗原结合蛋白。寡聚体的抗原结合蛋白可以是任何形式(例如上述的任何形式)，例如变体或片段。优选地，寡聚体包含具有PD-L1结合活性的抗原结合蛋白。

在一种实施方式中，使用衍生自免疫球蛋白的多肽制备寡聚体。例如Ashkenaziet al.,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:10535；Byrn et al.,1990,Nature 344:677；和Hollenbaugh et al.,1992"Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins",inCurrent Protocols in Immunology,Suppl.4,pages 10.19.1-10.19.11中已经描述了包含与抗体衍生的多肽(包括Fc域)的各种部分融合的某些异源多肽的融合蛋白的制备，所述异源多肽。

一种实施方式涉及包含两个融合蛋白的二聚体，所述融合蛋白通过将抗PD-L1抗体的PD-L1结合片段与抗体的Fc区融合而产生。二聚体可以通过例如如下来制备：将编码融合蛋白的基因融合体插入合适的表达载体中，在用重组表达载体转化的宿主细胞中该表达基因融合体，并使表达的融合蛋白像抗体分子一样组装，于是在Fc部分之间形成链间二硫键以收获二聚体。

术语“语体多肽”包括衍生自抗体Fc区的天然和突变蛋白形式的多肽。还包括含有促进二聚化的铰链区的这种多肽的截短形式。包含Fc部分的融合蛋白(和由其形成的寡聚体)提供了通过蛋白A或蛋白G柱的亲和色谱法容易地纯化的优点。

制备寡聚抗原结合蛋白的另一种方法包括使用亮氨酸拉链。亮氨酸拉链域是促进在其中发现的蛋白质寡聚化的肽。亮氨酸拉链最初在几种DNA结合蛋白中被鉴定出来(Landschulz et al.,1988,Science 240:1759)，并且已经在多种不同的蛋白质中被发现。在已知的亮氨酸拉链中有天然存在的肽及其二聚化或三聚化衍生物。WO 94/10308中描述了适用于产生可溶性寡聚蛋白的亮氨酸拉链域的实例，Hoppe et al.,1994,FEBS Letters344:191中描述了衍生自肺表面活性蛋白D(SPD)的亮氨酸拉链。Fanslow et al.,1994,Semin.Immunol.6:267-78中描述了允许与其融合的异源蛋白质稳定三聚化的亮氨酸拉链的用途。在一种方法中，在合适的宿主细胞中表达包含与亮氨酸拉链肽融合的抗PD-L1抗体片段或衍生物的重组融合蛋白，并且从培养上清液中回收所形成的可溶性寡聚抗PD-L1抗体片段或衍生物。

多肽的翻译后修饰

在某些实施方式中，本发明的结合多肽可以进一步包含翻译后修饰。示例性的翻译后蛋白质修饰包括磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化、泛素化、糖基化、羰基化、类泛素化、生物素化或多肽侧链或疏水基团的添加。结果，修饰的可溶性多肽可含有非氨基酸元素，例如脂质、多糖或单糖和磷酸盐。糖基化的优选形式是唾液酸化，唾液酸化使一个或多个唾液酸部分与多肽缀合。唾液酸部分改善了溶解度和血清半衰期，同时还降低了蛋白质的可能的免疫遗传性。参见Raju et al.Biochemistry.2001 31；40(30):8868-76。可以针对PD-L1或PD-1功能中的拮抗作用(例如其对血管生成或肿瘤生长的抑制作用)测试这些非氨基酸元素对多肽功能性的影响。

在一个特定的实施方式中，主题可溶性多肽的修饰形式包括将主题可溶性多肽与非蛋白质性聚合物连接。在一个特定的实施方式中，按照美国专利第4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337号中所述的方式，聚合物是聚乙二醇(“合物是聚)、聚丙二醇或聚氧化烯。

PEG是可商购的，或者可以根据本领域熟知的方法(Sandler and Karo,PolymerSynthesis,Academic Press,New York,Vol.3,pages 138-161)通过乙二醇的开环聚合来制备的水溶性聚合物。术语“术语聚合广泛用于包括任何聚乙二醇分子，而不考虑PEG的末端的大小或修饰，并且可以由下式表示：X-O(CH₂CH₂O)_n-1CH₂CH₂OH(1)，其中n为20至2300，且X为H或末端修饰(例如C_1-4烷基)。在一种实施方式中，本发明的PEG以具有羟基或甲氧基，的一端作为末端，即X是H或CH₃(“甲氧基PEG”)。PEG可以含有结合反应所必需的其他化学基团；该其他化学基团是由分子的化学合成产生的；或者是分子部分最佳距离的间隔物。另外，这种PEG可以由一个或多个连接在一起的PEG侧链组成。具有多于一个PEG链的PEGs被称为多臂或支化PEGs。支化PEGs可以通过例如将聚环氧乙烷添加至各种多元醇(包括甘油、季戊四醇和山梨糖醇)中来制备。例如，可以由季戊四醇和环氧乙烷制备四臂支化PEG。例如EP-A 0 473 084和美国专利第5,932,462号中描述了支化PEG。PEG的一种形式包括通过赖氨酸的主要氨基连接的两个PEG侧链(PEG2)(Monfardini et al.,Bioconjugate Chem.6(1995)62-69)。

尽管PEG是众所周知的，但据我们所知，这是聚乙二醇化^10Fn3多肽可以聚乙二醇化并保留配体结合活性的第一个证明。在优选的实施方式中，聚乙二醇化^10Fn3多肽通过定点聚乙二醇化产生，特别是通过PEG与N末端或C末端的半胱氨酸部分的缀合产生。因此，本发明提供了具有改善的药代动力学特性的靶标结合^10Fn3多肽，该多肽包含：具有约80至约150个氨基酸的^10Fn3域，其中所述^10Fn3域的环的至少一个参与靶标结合；以及共价结合的PEG部分，其中所述^10Fn3多肽以小于100nM的K_D与靶标结合，并且在哺乳动物中具有小于30mL/hr/kg的清除率。PEG部分可以通过定点聚乙二醇化，例如通过与Cys残基连接而与^10Fn3多肽连接，其中Cys残基可以位于^0Fn3多肽的N末端或N末端和大多数N末端β或β样链之间，或位于的^10Fn3多肽的C末端或C末端和大多数C末端β或β样链之间。Cys残基也可以位于其他位置，特别是在不参与靶标结合的任何环上。PEG部分也可以通过其他化学连接(包括通过缀合)与胺连接。

PEG与肽或蛋白质的缀合通常涉及PEG的活化以及活化的PEG中间体直接与靶蛋白质/肽或与连接子偶联，所述连接子随后被激活并与靶蛋白质/肽偶联(参见Abuchowski etal.,J.Biol.Chem.,252,3571(1977)和J.Biol.Chem.,252,3582(1977),Zalipsky,et al.,and Harris et.al.,in:Poly(ethylene glycol)Chemistry:Biotechnical andBiomedical Applications；(J.M.Harris ed.)Plenum Press:New York,1992；Chap.21and22)。应注意，含有PEG分子的结合多肽也称为缀合蛋白，而缺少连接的PEG分子的蛋白可称为未缀合蛋白。

可以选择多种分子量(例如约1,000道尔顿(Da)至100,000Da(n为20至2300))形式的PEG用于缀合PD-L1结合多肽。PEG中的重复单元数“的重近似于以道尔顿为单位描述的分子量。优选活化的连接子上PEG的组合分子量适合于药物用途。因此，在一种实施方式中，PEG分子的分子量不超过100,000Da。例如，如果三个PEG分子连接到连接子，其中每个PEG分子具有12,000Da的相同分子量(每个n约为270)，则连接子上PEG的总分子量为约36,000Da(总n约820)。连接到连接子的PEG的分子量也可以不同，例如，在连接子上的三个分子中，两个PEG分子可以各自为5,000Da(每个n为约110)，并且一个PEG分子可以为12,000Da(n为约270)。

在本发明的特定的实施方式中，PD-L1结合多肽与式-CO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR的一个聚(乙二醇)基团共价连接，其中聚(乙二醇)基团的-CO(即羰基)与结合多肽的氨基之一形成酰胺键；R是低级烷基；x为2或3；m从大约450到大约950；选择n和m以使得缀合物的分子量减去结合多肽的分子量为约10至40kDa。在一个实施方式中，赖氨酸的结合多肽的6-氨基是可用的(游离的)氨基。

上述缀合物可以更具体地由式(II)表示：P-NHCO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR(II)，其中P是如本文所述的结合多肽的基团，即没有氨基或与式(II)中所示的羰基形成酰胺键的氨基；其中R是低级烷基；x是2或3；m是约450至约950并且选择m以使得缀合物的分子量减去结合多肽的分子量为约10至约40kDa。如本文所用，给定范围的“如本具有取向含义。在任何情况下，确切地说，通过PEG基团的分子量，确定“定的的范围。

本领域的技术人员可以为PEG选择合适的分子质量，例如，基于聚乙二醇化的结合多肽会在治疗上如何使用、所期望的剂量、循环时间、对蛋白水解的抗性、免疫原性和其它考虑。关于PEG及其用于增强蛋白质性质的用途的讨论，参见Katre,Advanced DrugDelivery Reviews 10:91-114(1993)。

在一种实施方式中，PEG分子可被活化以与例如具有赖氨酸的结合多肽上的氨基反应(Bencham et al.,Anal.Biochem.,131,25(1983)；Veronese et al.,Appl.Biochem.,11,141(1985).；Zalipsky et al.,Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems,adrs9-110ACS Symposium Series 469(1999)；Zalipsky et al.,Europ.Polym.J.,19,1177-1183(1983)；Delgado et al.,Biotechnology and Applied Biochemistry,12,119-128(1990))。

在一个特别的实施方式中，PEG的碳酸酯用于形成PEG结合多肽缀合物。N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)可以用于与PEG形成活性混合的PEG-琥珀酰亚胺基碳酸酯的反应，所述PEG-琥珀酰亚胺基碳酸酯随后可以与连接子的亲核基团或结合多肽的氨基反应(参见美国专利第5,281,698和5,932,462号)。在类似类型的反应中，1,1'-(二苯并三唑基)碳酸酯和二(2-吡啶基)碳酸酯可以与PEG反应以分别形成PEG-苯并三唑基和PEG-吡啶基混合碳酸酯(美国专利第5,382,657号)。

^10Fn3多肽的聚乙二醇化可以根据本领域的方法进行，例如通过结合多肽与亲电活性的PEG(供应商：Shearwater Corp.,USA,www.shearwatercorp.com)的反应。本发明的优选的PEG试剂是例如N-羟基琥珀酰亚胺基丙酸酯(PEG-SPA)、丁酸酯(PEG-SBA)、PEG-琥珀酰亚胺基丙酸酯或支化N-羟基琥珀酰亚胺(如mPEG2-NHS)(Monfardini et al.,Bioconjugate Chem.6(1995)62-69)。这些方法可用于在结合多肽赖氨酸的f-氨基处或结合多肽的N末端氨基处进行聚乙二醇化。

在另一种实施方式中，PEG分子可以与结合多肽上的巯基偶合(Sartore et al.,Appl.Biochem.Biotechnol.,27,45(1991)；Morpurgo et al.,Biocon.Chem.,7,363-368(1996)；Goodson et al.,Bio/Technology(1990)8,343；美国专利第5,766,8977号)。美国专利第6,610,281和5,766,897号描述了可以与巯基偶联的示例性反应性PEG物质。

在一些实施方式中，其中PEG分子与结合多肽上的半胱氨酸残基缀合，半胱氨酸残基是该结合多肽的原生残基，而在其他实施方式中，一个或多个半胱氨酸残基被工程化到结合多肽中。可以将突变引入结合多肽编码序列以产生半胱氨酸残基。这可以通过例如将一个或多个氨基酸残基突变为半胱氨酸来实现。用于突变为半胱氨酸残基的优选氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸和其他亲水残基。优选地，待突变为半胱氨酸的残基是表面暴露的残基。本领域熟知用于基于一级序列或蛋白质预测残基的表面可及性的算法。供选择地，可以通过比较结合多肽的氨基酸预测表面残基，因为基于结合多肽的设计和发展，已解决了骨架的晶体结构(参见Himanen et al.,Nature.(2001)20-27；414(6866):933-8)，并因此鉴定了表面暴露的残基。在一种实施方式中，半胱氨酸残基被引入结合性多肽的N端和/或C端或其附近，或引入环区中。。

在一些实施方式中，聚乙二醇化结合多肽包含共价连接至N末端氨基酸的α氨基的PEG分子。Pepinsky et al.,(2001)JPET,297,1059和美国专利第5,824,784号中描述了位点特异性N末端还原胺化。美国专利第4,002,531号和Wieder et al.,(1979)J.Biol.Chem.254,12579和Chamow et al.,(1994)Bioconjugate Chem.5,133中描述了使用PEG-醛来还原胺化利用其它可用的亲核氨基的蛋白质。

在另一种实施方式中，聚乙二醇化结合多肽包含共价连接于连接子的一个或多个PEG分子，所述连接子又与结合多肽的N末端上的氨基酸残基的α氨基连接。这种方法在美国专利公开第2002/0044921号和第WO094/01451号中公开。

在一种实施方式中，结合多肽在C末端聚乙二醇化。在一个特定的实施方式中，通过引入C末端叠氮基-甲硫氨酸并随后通过施陶丁格反应缀合甲基-PEG-三芳基膦化合物，在C末端将蛋白质聚乙二醇化。Cazalis et al.,Bioconjug.Chem.2004；15(5):1005-1009中描述了这种C末端缀合方法。

也可以根据WO 94/01451中描述的一般方法产生对结合多肽的单聚乙二醇化。WO94/01451描述了一种制备具有修饰的末端氨基酸α-碳反应性基团的重组多肽的方法。该方法的步骤包括形成重组多肽并用N末端α-胺和C末端α-羧基上的一个或多个生物学添加的保护基保护它。然后多肽可以与化学保护剂反应以选择性地保护反应性侧链基团，从而防止侧链基团被修饰。然后用对生物保护基团特异的切割试剂切割多肽，形成未保护的末端氨基酸α-碳反应性基团。用化学改性剂修饰未保护的末端氨基酸α-碳反应性基团。然后将侧链保护的末端修饰的单拷贝多肽在侧链基团去保护，以形成末端修饰的重组单拷贝多肽。可以改变该方法中步骤的数量和顺序，以实现多肽的N末端和/或C末端氨基酸的选择性修饰。

缀合反应中结合多肽与活化PEG的比例可为约1:0.5至1:50，约1:1至1:30，或约1:5至1:15。在本方法中可以使用各种水性缓冲液来催化PEG与结合多肽的共价加成。在一种实施方式中，所用缓冲液的pH为约7.0至9.0。在另一种实施方式中，pH在略微碱性范围内，例如约7.5至8.5。可以使用具有接近中性pH范围的pKa的缓冲液，例如磷酸盐缓冲液。

可以使用本领域已知的诸如大小排阻(例如凝胶过滤)和离子交换色谱的常规分离和纯化技术来纯化PEG化的结合多肽。也可以使用SDS-PAGE分离产物。可以分离的产物包括单聚乙二醇化、二聚乙二醇化、三聚乙二醇化和多聚乙二醇化的结合多肽，以及游离的PEG。单PEG缀合物的百分比可以通过在洗脱峰周围汇集更宽的级分以增加组合物中单PEG的百分比来控制。约90％的单PEG缀合物表示产率和活性的良好平衡。其中例如缀合物中至少92％或至少96％是单PEG类的组合物可能是期望的。在本发明的实施方式中，单PEG缀合物的百分比为90％至96％。

在一种实施方式中，本发明的PEG化结合多肽含有一个、两个或更多个PEG部分。在一种实施方式中，PEG部分与蛋白质表面上和/或与靶配体接触的表面远离的氨基酸残基结合。在一种实施方式中，PEG结合多肽中PEG的组合或总分子量为约3,000Da至60,000Da，任选地为约10,000Da至36,000Da。在一种实施方式中，聚乙二醇化结合多肽中的PEG是基本上线性的直链PEG。

在一种实施方式中，在8至16小时内在室温下使用羟胺测定(例如450mM羟胺(pH6.5))，聚乙二醇化结合多肽中的PEG不会由聚乙二醇化氨基酸残基水解，因此是稳定的。在一种实施方式中，该组合物的大于80％是稳定的单PEG结合多肽，更优选为至少90％，最优选为至少95％。

在另一种实施方式中，本发明的聚乙二醇化结合多肽优选保留与未修饰蛋白相关的生物活性中的至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或100％。在一种实施方式中，生物活性是指其结合PD-L1的能力，如通过KD、k_on或k_off所评估。在一种特定的实施方式中，聚乙二醇化结合多肽蛋白相对于未聚乙二醇化的结合多肽显示出与PD-L1结合的增加。

相对于未修饰的结合多肽的清除率，PEG修饰多肽的血清清除率可降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或甚至90％。PEG修饰的多肽可具有相对于未修饰蛋白质的半衰期提高的半衰期(t_1/2)。相对于未修饰的结合多肽的半衰期，PEG结合多肽的半衰期可以增强至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、400％或500％、或甚至1000％。在一些实施方式中，在体外测定蛋白质半衰期，例如在缓冲盐水溶液或血清中测定。在其他实施方式中，蛋白质半衰期是体内的半衰期，例如动物的血清或其他体液中的蛋白质的半衰期。

治疗方法、制剂和给药模式

本文提供的某些方法包括将PD-L1结合抗原结合蛋白给药于对象，从而减少在特定病症中起作用的PD-L1诱导的生物反应。在具体的实施方式中，本发明的方法包括例如通过向对象给药或在离体(ex vivo)程序中，使内源性PD-L1与PD-L1结合的抗原结合蛋白接触。

术语“治疗”包括减轻或预防疾病的至少一种症状或其他方面，或降低疾病严重程度等。抗原结合蛋白不需要达到完全治愈的效果，或根除疾病的每种症状或表现，以构成可行的治疗剂。如在相关领域中所认识到的，用作治疗剂的药物可以降低给定疾病状态的严重性，但是不需要消除疾病的每种表现以被视为有用的治疗剂。类似地，预防性给药的治疗不必完全有效地预防病症的发作以构成可行的预防剂。简单地减少疾病的影响(例如，通过减少疾病症状的数量或严重程度、或通过增加另一种治疗的有效性、或通过产生另一种有益效果)，或降低对象的疾病发生或恶化的可能性，就是足够的。本发明的一种实施方式涉及一种包括将PD-L1拮抗剂以足以诱导反映具体疾病严重性的指标相对于基线而持续改善的量和时间给药于患者的方法。

本发明的特征在于治疗病症或预防响应于PD-L1生物活性抑制的先兆病症(precondition)的方法。优选的实例是以炎症或细胞过度增殖为特征的病症。给药的技术和剂量根据特定多肽的类型和所治疗的特定病症而变化，但是可以由本领域技术人员容易地确定。通常，管理机构要求配制用作治疗剂的蛋白质试剂以便具有可接受的低水平的热原。因此，治疗制剂通常与其它制剂的区别在于它们基本上无热原，或至少含有不超过如由适当的管理机构(例如，FDA)确定的可接受水平的热原。

如在相关领域中所理解的，将包含本发明的抗体及其片段的药物组合物以适合于适应症的方式给药于对象。因此，本发明包括包含本文公开的抗PD-L1抗体(或片段)和药学上可接受的载体的药物组合物。

药物组合物可以通过任何合适的技术来给药，包括但不限于肠胃外、局部或通过吸入。如果注射，药物组合物可以例如通过关节内、静脉内、肌内、病灶内、腹膜内或皮下途径、通过弹丸注射或连续输注来给药。局部给药(例如考虑在疾病或损伤部位)是透皮递送以及从植入物持续释放。通过吸入递送包括例如鼻腔或口腔吸入、使用喷雾器、以气溶胶形式吸入拮抗剂等。其他供选择的方式包括滴眼液；口服制剂，包括药丸、糖浆、锭剂或口香糖；和局部制剂，如乳液、凝胶、喷雾剂和药膏。

有利地，抗原结合蛋白以包含一种或多种另外的组分的组合物的形式给药，所述另外的组分例如生理学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。任选地，组合物另外包含一种或多种生理活性剂，例如，第二炎症或免疫抑制物质、抗血管生成物质、镇痛物质等，本文提供了其非排他性的实例。在各种具体实施方式中，除PD-L1结合抗原结合蛋白外，该组合物还包含一种、两种、三种、四种、五种或六种生理活性剂。

本发明的治疗组合物可以与单位剂量形式的药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂一起给药。作为非限制性实例，给药可以是肠胃外(例如静脉内、皮下)、口服或局部给药。另外，可以采用任何使用编码本发明多肽的核酸的基因治疗技术，例如裸DNA递送、重组基因和载体、基于细胞的递送，包括患者细胞的离体操作等。

该组合物可以是用于口服给药的丸剂、片剂、胶囊剂、液体剂或缓释片剂的形式；或用于静脉内、皮下或肠胃外给药的液体；用于局部给药的凝胶、洗剂、软膏、乳膏或聚合物或其它持续释放载体。

制备制剂的本领域熟知的方法见于例如"Remington:The Science and Practiceof Pharmacy"(20th ed.,ed.A.R.Gennaro A R.,2000,Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA)。用于肠胃外给药的制剂可以例如含有赋形剂、无菌水、盐水、聚亚烷基二醇(如聚乙二醇)、植物油或氢化萘。可生物相容的、可生物降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可用于控制化合物的释放。纳米颗粒制剂(例如可生物降解的纳米颗粒、固体脂质纳米颗粒、脂质体)可用于控制化合物的生物分布。其他可能有用的肠胃外递送系统包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入的输注系统和脂质体。制剂中化合物的浓度根据包括待给药药物的剂量和给药途径的许多因素而变化。

多肽可以任选地作为药学上可接受的盐而给药，所述盐例如通常用于制药工业的无毒的酸加成盐或金属络合物。酸加成盐的实例包括：有机酸，如乙酸、乳酸、双羟萘酸、马来酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、琥珀酸、苯甲酸、棕榈酸、辛二酸、水杨酸、酒石酸、甲磺酸、甲苯磺酸或三氟乙酸等；聚合酸，如鞣酸、羧甲基纤维素等；和无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸等。金属络合物包括锌、铁等。在一个实例中，在乙酸钠存在下配制多肽以增加热稳定性。

口服使用的制剂包括含有活性成分的片剂，所述活性成分在含有无毒的药学上可接受的赋形剂的混合物中。这些赋形剂可以是，例如惰性稀释剂或填充剂(例如，蔗糖和山梨糖醇)、润滑剂、助流剂和抗粘合剂(例如硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、二氧化硅、氢化植物油或滑石)。口服使用的制剂也可以作为可咀嚼片剂提供，或作为硬明胶胶囊(其中活性成分与惰性固体稀释剂混合)提供，或作为软明胶胶囊(其中活性成分与水或油介质混合)提供。

治疗有效剂量是指产生治疗效果的剂量。确切剂量将取决于待治疗的病症，并且可由本领域技术人员使用已知技术确定。一般地，所述多肽以每天约0.01μg/kg至约50mg/kg给药，优选以每天0.01mg/kg至约30mg/kg给药，最优选以每天0.1mg/kg至约20mg/kg给药。该多肽可以每天给药(例如每天一次、两次、三次或四次)或优选较不频繁地给药(例如每周、每两周、每三周、每月或每季度)。此外，如本领域所知，可能需要根据年龄以及体重、一般健康状况、性别、饮食、给药时间、药物相互作用和疾病的严重程度来调整，并且这种调整可以由本领域技术人员通过常规实验确定。

本文所述的PD-L1结合蛋白及其相关变体可用于许多治疗和诊断应用。这些包括通过竞争或阻断与PD-L1的结合，以及将细胞毒性或成像部分递送至细胞(优选为表达PD-L1的细胞)来抑制PD-L1的生物活性。对于药物的制造、针对需要快速清除的某些应用而从身体快速清除、或使用具有这种特点的分子配制成适合或改善的新型递送系统而言，这些分子的小尺寸和稳定结构是特别具有价值的。

在一个方面，本发明提供了治疗对象的方法。该方法可以例如对对象具有通常有益的效果，例如它可以增加对象的预期寿命。供选择地，该方法可以例如治疗、预防、治愈、缓解或改善疾病、失调、病症或病(“病症”)。待治疗的病症中包括以PD-L1的不适当的表达或活性为特征的病症。在一些这样的病症下，表达或活性水平太高，并且治疗包括给药如本文所述的PD-L1拮抗剂。这些失调或病症与癌症有关。特别地，那些癌症包括但不限于肺癌、卵巢癌和结肠癌以及各种骨髓瘤。

可以给药本发明的抗原结合蛋白来治疗或预防的特定的医学病症和疾病包括各种癌症。

基于它们作为PD-L1生物活性抑制剂的功效，本发明的多肽可有效对抗许多癌症病症以及由癌症引起的并发症，例如胸腔积液和腹水。优选地，本公开的PD-L1结合多肽可用于治疗或预防过度增殖性疾病或癌症和癌症的转移性扩散。所公开的抗PD-L1抗体的优选适应症包括结肠直肠癌，头颈癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌(NSCLC)和胰腺癌。癌症的非限制性实例包括膀胱癌、血癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、软骨癌、结肠肾癌、肝癌、肺癌、淋巴结癌、神经组织癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、骨骼肌癌、皮肤癌、脊髓癌、脾癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、气管癌、泌尿生殖道癌、输尿管癌、尿道癌、子宫或阴道癌。在某些实施方式中，待治疗的癌症选自卵巢癌、结肠癌、乳腺癌或肝癌、骨髓瘤、神经细胞来源的CNS肿瘤、单核细胞白血病、B细胞性白血病、T细胞性白血病、B细胞性淋巴瘤、T细胞性淋巴瘤、肥大细胞性肿瘤及其任意组合。

在某些实施方式中，待治疗的广谱的哺乳动物癌症选自卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、骨髓瘤、神经细胞性CNS肿瘤、单核细胞白血病、B细胞性白血病、T细胞性白血病、B细胞性淋巴瘤、T细胞性淋巴瘤、肥大细胞性肿瘤及其组合。优选地，自身免疫疾病或炎性疾病选自肠粘膜炎症、结肠炎相关的消耗病、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、病毒感染、类风湿性关节炎、骨关节炎、牛皮癣、克罗恩病和炎性肠病。

另外，可以用本文公开的抗PD-L1结合多肽治疗各种炎性病症。此类炎性病症包括例如肠粘膜炎症、结肠炎相关的消耗病、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、病毒感染、类风湿性关节炎、骨关节炎、牛皮癣和克罗恩病相关的疾病。

还考虑了在离体程序中使用抗原结合蛋白。例如，患者的血液或其他体液可以与结合PD-L1的抗原结合蛋白离体接触。抗原结合蛋白可以与合适的不溶性基质或固体支持材料结合。

PD-L1结合多肽可以单独给药或与一种或多种另外的疗法(例如化学疗法、放射疗法、免疫疗法、外科手术或这些的任何组合)组合给药。如上所述，在其他治疗策略的背景下，长期治疗同样可以是辅助治疗。

在另一种实施方式中，该方法包括给药一种或多种本文所述的PD-L1拮抗剂和一种或多种其他治疗(例如，治疗性或姑息性治疗)。当方法包括向对象给药一种以上的治疗时，应理解给药的顺序、时间、数量、浓度和体积仅受医疗要求和治疗限制的限制，即，两种治疗可以例如同时、连续、交替或根据任何其他方案给药于对象。

因此，在另一方面，本发明提供了用PD-L1抑制性抗原结合蛋白和一种或多种其他治疗来治疗对象的方法。在一种实施方式中，这种组合疗法通过例如攻击肿瘤中的多个部位或分子靶标来实现协同作用或累加效应。可以与本发明结合使用的组合疗法的类型包括抑制或激活(视情况而定)单个疾病相关途径中的多个节点、靶细胞中的多个途径和靶组织内的多个细胞类型。

在另一种实施方式中，组合治疗方法包括将本文所述的两种、三种、四种、五种、六种或更多种PD-L1激动剂或拮抗剂给药于对象。在另一种实施方式中，该方法包括给与对象两种或更多种一起抑制或激活(直接或间接)PD-L1介导的信号转导的治疗。此类方法的实例包括使用两种或更多种PD-L1抑制性抗原结合蛋白的组合，使用PD-L1抑制性抗原结合蛋白和一种或多种具有抗癌特性的其他治疗部分(例如，细胞毒性剂和/或免疫调节剂)的组合，或使用PD-L1抑制性抗原结合蛋白和一种或多种其他治疗(例如手术或放射)的组合。此外，一种或多种抗PD-L1抗体或抗体衍生物可以与一种或多种分子或其他治疗组合使用，其中其他分子和/或治疗不直接结合或影响PD-L1，但其组合对治疗或预防所治疗的病症有效。在一种实施方式中，一种或多种分子和/或疗法治疗或预防在治疗过程中由一种或多种其他分子或治疗引起的病症，例如恶心、疲劳、脱发、恶病质、失眠等。在使用分子和/或其他治疗的组合的每种情况下，可以以任何有效的顺序、在任何有效的时间长度内(例如同时、连续或交替)给药单独的分子和/或治疗。在一种实施方式中，治疗方法包括在开始第二疗程之前用一个分子或其他治疗完成第一疗程。从第一疗程结束到第二疗程开始之间的时间长度可以是允许整个疗程有效的任何时间长度，例如秒、分钟、小时、天、周、几个月甚至几年。

在某些实施方式中，本发明的主题抗PD-L1抗体剂可以单独使用。供选择地，主题药剂可以与针对治疗或预防增殖性失调(例如肿瘤)的其他常规抗癌治疗方法组合使用。例如，这些方法可用于预防性癌症预防、对癌症复发和手术后转移的预防，以及作为其他常规癌症疗法的佐剂。本发明认识到通过使用主题多肽治疗剂可以提高常规癌症疗法(例如化学疗法、放射疗法、光疗法、免疫疗法和手术)的有效性。

在这些方法的某些实施方式中，可以一起(同时)或在不同时间(顺序)给药一种或多种多肽治疗剂。另外，多肽治疗剂可以与另一种类型的化合物一起给药以用于治疗癌症或抑制血管生成。

已显示多种常规化合物具有抗肿瘤活性。这些化合物已用作化学疗法中的药物以便缩小实体瘤、预防转移和进一步生长或减少白血病或骨髓恶性肿瘤中恶性细胞的数量。尽管化学疗法在治疗各种类型的恶性肿瘤方面是有效的，但许多抗肿瘤化合物会引起不希望的副作用。已经显示，当将两种或更多种不同的治疗组合时，所述治疗可以协同地起作用并且允许减少每种治疗的剂量，从而减少每种化合物在较高剂量下发挥的有害副作用。在其他情况下，难治的恶性肿瘤可以对两种或更多种不同治疗的组合疗法响应。

当本发明的多肽治疗剂与另一种常规抗肿瘤剂同时或顺序给药时，可以发现这种治疗剂增强抗肿瘤剂的治疗效果或克服细胞对这种抗肿瘤剂的抵抗力。这使得抗肿瘤剂的剂量减少，从而减少不希望的副作用或恢复抗肿瘤剂在抗性细胞中的有效性。

可以用于组合抗肿瘤治疗的药物化合物包括(仅用于说明)：氨鲁米特、安吖啶、阿那曲唑、天冬酰胺酶、卡介苗(bcg)、比卡鲁胺、博来霉素、布舍瑞林、白消安、喜树碱、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯膦酸盐、秋水仙碱、环磷酰胺、环丙孕酮、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、双烯雌酚、己烯雌酚、多西紫杉醇、多柔比星、表柔比星、雌二醇、雌莫司汀、依托泊苷、依西美坦、非格司亭、氟达拉滨、氟氢可的松、氟尿嘧啶、氟甲睾酮、氟他胺、吉西他滨、染料木黄酮、戈舍瑞林、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、干扰素、伊立替康、伊立替康、来曲唑、亚叶酸、亮丙瑞林、左旋咪唑、洛莫司汀、二氯甲基二乙胺、甲羟孕酮、甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、尼鲁米特、诺考达唑、奥曲肽、奥沙利铂、紫杉醇、帕米膦酸盐、喷司他丁、普卡霉素、卟吩姆钠、丙卡巴肼、雷替曲塞、利妥昔单抗、链脲佐菌素、苏拉明、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、睾酮、硫鸟嘌呤、噻替哌、二茂钛二氯化物、托泊替康、曲妥珠单抗、维甲酸、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。

某些化学治疗抗肿瘤化合物可根据其作用机理分为例如以下的组：抗代谢物/抗癌剂，如嘧啶类似物(5-氟尿嘧啶、氟尿苷、卡培他滨、吉西他滨和阿糖胞苷)和嘌呤类似物、叶酸拮抗剂和相关抑制剂(巯嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨))；抗增殖/抗有丝分裂剂，包括诸如长春花生物碱(长春碱、长春新碱和长春瑞滨)等天然产物，诸如紫杉烷(紫杉醇，多西紫杉醇)、长春花新碱、长春花碱，诺考达唑、埃博霉素和诺维本(navelbine)、表鬼臼毒素(依托泊苷、替尼泊苷)等微管破坏剂，DNA损伤药物(放线菌素、安吖啶、蒽环霉素、博来霉素、白消安、喜树碱、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、环磷酰胺、放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、表柔比星、六甲三聚氰胺(hexamethylmelamineoxaliplatin)、异环磷酰胺、美法仑、二氯甲基二乙胺、丝裂霉素、米托蒽醌、亚硝基脲、普卡霉素、丙卡巴肼、紫杉醇、泰索帝、替尼泊苷、三亚乙基硫代磷酰胺和依托泊苷(VP16))；抗生素，如更生霉素(放线菌素D)、柔红霉素、多柔比星(阿霉素)、伊达比星、蒽环霉素、米托蒽醌、博来霉素、普鲁霉素(光神霉素)和丝裂霉素；酶(全身代谢L-天冬酰胺并剥夺不具有合成自身天冬酰胺能力的细胞的L-天冬酰胺酶)；抗血小板药；抗增殖/抗有丝分裂烷化剂，如氮芥(二氯甲基二乙胺、环磷酰胺和类似物、美法仑、苯丁酸氮芥)、乙烯亚胺和甲基三聚氰胺(六甲基三聚氰胺和噻替哌)、烷基磺酸盐-白消安、亚硝基脲(卡莫司汀(BCNU)和类似物、链脲佐菌素)、曲秦-达卡巴嗪(trazenes-dacarbazinine)(DTIC)；抗增殖/抗有丝分裂抗代谢物，如叶酸类似物(甲氨蝶呤)；铂配位配合物(顺铂、卡铂)、丙卡巴肼、羟基脲、米托坦、氨基戊二酰亚胺；激素、激素类似物(雌激素、他莫昔芬、戈舍瑞林、比卡鲁胺、尼鲁米特)和芳香酶抑制剂(来曲唑、阿那曲唑)；抗凝血剂(肝素、合成肝素盐和其他凝血酶抑制剂)；纤维蛋白溶解剂(如组织纤溶酶原激活剂、链激酶和尿激酶)、阿司匹林、双嘧达莫、噻氯匹定、氯吡格雷、阿昔单抗；抗迁移剂；抗分泌剂(breveldin)；免疫抑制剂(环孢菌素、他克莫司(FK-506)、西罗莫司(雷帕霉素)、硫唑嘌呤、霉酚酸酯(mycophenolatemofetil))；抗血管生成化合物(TNP-470，染料木黄酮)和生长因子抑制剂(例如，VEGF抑制剂，成纤维细胞生长因子(FGF)抑制剂)；血管紧张素受体阻滞剂；一氧化氮供体；反义寡核苷酸；抗体(曲妥珠单抗)；细胞周期抑制剂和分化诱导剂(维甲酸)；mTOR抑制剂、拓扑异构酶抑制剂(多柔比星(阿霉素)、安吖啶、喜树碱、柔红霉素、更生霉素、靛蓝甙、表柔比星、依托泊苷、伊达比星和米托蒽醌、托泊替康、伊立替康)、皮质类固醇(可的松、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙、泼尼松和泼尼松龙)；生长因子信号转导激酶抑制剂；线粒体功能障碍诱导因子和半胱天冬酶激活因子；以及染色质干扰物。

根据组合疗法的性质，可以在给与其他疗法同时和/或之后继续给药本发明的抗PD-L1抗体(或其片段)。多肽治疗剂的给药可以以单剂量或多剂量进行。在一些情况下，在常规治疗之前至少几天开始给药多肽治疗剂，而在其他情况下，在常规治疗给药之前或同时开始给药。

在诊断应用的一个实例中，将怀疑具有以不适当血管生成为特征的病症的患者的生物样品(例如血清或组织活检)与本发明的可检测标记的多肽接触以检测PD-L1的水平。然后将检测到的PD-L1水平与正常样品中检测到的PD-L1水平进行比较，所述正常样品也与标记多肽接触。PD-L1水平增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％可被认为是诊断指标。

在某些实施方式中，PD-L1结合多肽进一步与能够被检测的标记(例如标记可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)连接。活性部分可以是放射性试剂，例如：放射性重金属，例如铁螯合物、钆或锰的放射性螯合物、氧的正电子发射体、氮、铁、碳或镓、⁴³K、⁵²Fe、⁵⁷Co、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、¹²³I、¹²⁵I、¹³¹I、¹³²I或⁹⁹TC。可以使用固定在这种部分上的结合剂作为显像剂，并以针对用于哺乳动物(如人)的诊断用途有效的量给药，然后检测显像剂的定位和积累。可以通过放射闪烁成像、核磁共振成像、计算机断层扫描或正电子发射断层扫描来检测成像剂的定位和累积。使用针对PD-L1的PD-L1结合多肽进行的免疫闪烁成像可用于检测和/或诊断癌症和脉管系统。例如，针对用⁹⁹锝、¹¹¹铟或¹²⁵碘标记的PD-L1标记物的任何结合多肽可以有效地用于这种成像。对于本领域技术人员显而易见的是，待给药的放射性同位素的量取决于放射性同位素。本领域普通技术人员可以基于用作活性部分的给定放射性核素的比活性和能量，容易地配制待给药的成像剂的量。通常每剂量成像剂给药0.1至100毫居里，优选1至10毫居里，最常用2至5毫居里。因此，可用作包含与放射性部分缀合的靶向部分的成像剂的根据本发明的组合物包含0.1至100毫居里，在一些实施方式中优选包含1至10毫居里，在一些实施方式中优选包含2至5毫居里，在一些实施方式中更优选包含1至5毫居里。

本发明的抗PD-L1抗体(或其片段)也可用于向表达PD-L1的细胞或组织递送另外的治疗剂(包括但不限于药物化合物、化学治疗化合物和放射治疗化合物)。在一个实例中，将本发明的抗PD-L1抗体(或其片段)与化学治疗剂融合，以用于将化学治疗剂靶向递送至表达PD-L1的肿瘤细胞或组织。

本发明的抗PD-L1抗体(或其片段)可用于多种应用，包括研究、诊断和治疗应用。例如，它们可用于分离和/或纯化受体或其部分，并用于研究受体结构(例如构象)和功能。

在某些方面，各种结合多肽可用于例如在内皮细胞(例如静脉内皮细胞)上或在用PD-L1基因转染的细胞上检测或测量PD-L1的表达。因此，它们还可用于诸如细胞分选和成像(例如流式细胞术和荧光激活细胞分选)的应用中以用于诊断或研究目的。

在某些实施方式中，出于诊断目的，结合多肽或其片段可以是标记或未标记的。通常，诊断测定需要检测由结合多肽与PD-L1结合产生的复合物的形成。与抗体类似，可以直接标记结合多肽或片段。可以使用各种标记，包括但不限于放射性核素、荧光剂、酶、酶底物、酶辅助因子、酶抑制剂和配体(例如生物素，半抗原)。多种合适的免疫测定是本领域技术人员已知的(美国专利第3,817,827；3,850,752；3,901,654；和4,098,876号)。当未标记时，结合多肽可用于测定，例如凝集测定。未标记的结合多肽还可以与另外(一种或多种)可以用于检测结合多肽的合适的试剂组合使用，所述试剂例如与结合多肽反应的标记抗体或其他合适的试剂(例如标记蛋白A)。

在一种实施方式中，本发明的结合多肽可用于酶免疫测定，其中主题多肽与酶缀合。当包含PD-L1蛋白的生物样品与主题结合多肽组合时，结合多肽和PD-L1蛋白之间发生结合。在一种实施方式中，含有表达PD-L1蛋白的细胞(例如内皮细胞)的样品与主题抗体组合，并在结合多肽和带有由结合多肽识别的PD-L1蛋白的细胞之间发生结合。这些结合的细胞可以与未结合的试剂分离，并且，例如通过使样品与当酶起作用时产生颜色或其他可检测的变化的酶底物接触，可以确定与细胞特异性结合的结合多肽-酶缀合物的存在。在另一种实施方式中，主题结合多肽可以是未标记，并且可以添加识别主题结合多肽的第二标记多肽(例如抗体)。

在某些方面，还可以制备用于检测生物样品中PD-L1蛋白的存在的试剂盒。这类试剂盒包括与PD-L1蛋白或所述受体的一部分结合的PD-L1结合多肽，以及适于检测结合多肽与受体蛋白或其部分之间的复合物的存在的一种或多种辅助试剂。本发明的多肽组合物可以单独或与对其他表位特异的另外抗体组合的以冻干形式提供。可以在具有辅助成分(例如缓冲剂(如Tris、磷酸盐和碳酸盐)、稳定剂、赋形剂、杀生物剂和/或惰性蛋白质(例如牛血清白蛋白))的试剂盒中包含可以标记或未标记的结合多肽和/或抗体。例如，结合多肽和/或抗体可以作为具有辅助成分的冻干混合物提供，或者该辅助成分可以单独提供以供使用者组合。通常，基于活性结合多肽或抗体的量，这些辅助物质的含量小于约5重量％，并且基于多肽或抗体浓度，通常总含量为至少约0.001重量％。在使用能够与结合多肽的第二抗体结合的情况下，可以在试剂盒例如在单独的小瓶或容器中提供这样的抗体。如果存在，则第二抗体通常被标记，并且可以以与上述抗体制剂类似的方式配制。

类似地，本发明还提供了检测和/或定量PD-L1表达的方法，其中包含细胞或其部分(例如膜部分)的组合物与结合多肽接触，所述结合多肽在适于与PD-L1或受体的一部分结合的条件下与其结合，并监测该结合。结合多肽的检测，形成结合多肽和PD-L1或其部分之间复合物的指示，表明了受体的存在。多肽与细胞的结合可以通过标准方法确定，例如在工作实例中描述的方法。该方法可用于检测来自个体的细胞上PD-L1的表达。任选地，可以例如通过流式细胞术评估内皮细胞表面上PD-L1的定量表达，并且染色强度可以与疾病易感性、进展或风险有关。

本发明还提供了检测哺乳动物对某些疾病的易感性的方法。举例说明，该方法可用于检测哺乳动物对基于细胞上存在的PD-L1的量和/或哺乳动物中PD-L1阳性细胞的数量而发展的疾病的易感性。

使用标准的单字母或三字母缩写表示多肽序列。除非另有说明，否则每个多肽序列在左侧具有氨基末端，在右侧具有羧基末端；每个单链核酸序列和每个双链核酸序列的顶链在左侧具有5'末端，在右侧具有3'末端。特定的多肽序列也可以通过解释它与参考序列的不同之处来描述。

针对PD-L1的抗原结合蛋白可用于例如体外或体内用于检测PD-L1多肽存在的测定。抗原结合蛋白也可用于通过免疫亲和层析纯化PD-L1蛋白。阻断抗原结合蛋白可用于本文公开的方法中。这种起PD-L1拮抗剂作用的抗原结合蛋白可用于治疗任何PD-L1诱导的病症，包括但不限于各种癌症。

抗原结合蛋白可以在体外方法中使用，或在体内给药以抑制PD-L1诱导的生物活性。因此，可以治疗由PD-L1的蛋白水解活化引起或加剧(直接或间接)的疾病，该疾病的实例在本文中提供。在一种实施方式中，本发明提供了治疗方法，包括以有效降低PD-L1诱导的生物活性的量向有需要的哺乳动物体内给药PD-L1阻断性抗原结合蛋白。

具有肿瘤疫苗的本发明抗体的药物制剂

本发明的抗PD-L1抗体与治疗性疫苗的组合治疗产品或制剂提供协同的肿瘤治疗益处。例如，本发明提供了本发明的抗PD-L1抗体与“Neuvax”的组合，所述“Neuvax”是与作为佐剂的GM-CSF组合的从HER2/neu分离的E75衍生的9聚体合成肽，如美国专利第8,222,214号中所述，该专利的公开内容在此并入供参考。此外，本发明提供了本发明的抗PD-L1抗体与ALVAC-CEA疫苗的组合，所述ALVAC-CEA疫苗是与癌胚抗原组合的金丝雀痘病毒。

抗PD-L1抗原结合蛋白的产生

抗原结合蛋白可以通过许多常规技术中的任何一种制备。在一种实施方式中，本发明提供了与PD-L1结合的单克隆抗体。单克隆抗体可以例如从天然表达它们的细胞中纯化(例如，抗体可以从产生它的杂交瘤中纯化)，或者使用本领域已知的任何技术在重组表达系统中产生。参见，例如，Monoclonal Antibodies,Hybridomas:A New Dimension inBiological Analyses,Kennet et al.(eds.),Plenum Press,New York(1980)；和Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow and Land(eds.),Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1988)。

单克隆抗体可以使用本领域已知的任何技术产生，例如，通过使收获自完成免疫计划后的转基因动物的脾细胞永生化来产生。可以使用本领域已知的任何技术使脾细胞永生化，例如通过将它们与骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤。用于产生杂交瘤的融合方法的骨髓瘤细胞优选是不产生抗体的，具有高融合效率和酶缺陷，所述酶缺陷使得它们不能在仅支持所期望的融合细胞(杂交瘤)的生长的某些选择性培养基中生长。用于小鼠融合的合适的细胞系的实例包括Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 4 1、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7和S194/5XX0 Bul；用于大鼠融合的细胞系的实例包括R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F和48210。用于细胞融合的其它细胞系是U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6。

在一个实例中，通过重组DNA方法来产生多肽，所述重组DNA方法通过将编码多肽的核酸序列(例如cDNA)插入重组表达载体中并在促进表达的条件下表达DNA序列来进行。

为了抗PD-L1抗体的重组产生，分离编码抗体的核酸并将其插入一种或多种载体中，以用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。使用常规方法可以容易地将这种核酸分离和测序(例如，通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。

可以化学合成编码本文公开的任何抗PD-L1抗体(或片段)的核酸。可以选择密码子使用以改善在细胞中的表达。这种密码子使用将取决于所选择的细胞类型。已经为大肠杆菌和其他细菌以及哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞和昆虫细胞开发了专门的密码子使用模式。参见例如：Mayfield et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2003 100(2):438-42；Sinclair et al.Protein Expr.Purif.2002(1):96-105；Connell ND.Curr.Opin.Biotechnol.2001 12(5):446-9；Makrides et al.Microbiol.Rev.1996 60(3):512-38；和Sharp et al.Yeast.1991 7(7):657-78。

用于核酸操作的一般技术描述于例如Sambrook et al.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Vols.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2ed.,1989或F.Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology(Green Publishing andWiley-Interscience:New York,1987)和定期更新，在此并入供参考。编码多肽的DNA与衍生自哺乳动物、病毒或昆虫基因的合适的转录或翻译调节元件可操作地连接。这类调节元件包括转录启动子、控制转录的任选操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列、以及控制转录和翻译终止的序列。通常还并入了通常由复制起点赋予的在宿主中复制的能力以及用于促进转化体的识别的选择基因。

重组DNA还可包括可用于纯化蛋白质的任何类型的蛋白质标签序列。蛋白质标签的实例包括但不限于组氨酸标签、FLAG标签、myc标签、HA标签或GST标签。用于细菌、真菌、酵母菌和哺乳动物细胞宿主的适当克隆和表达载体可以在Cloning Vectors:ALaboratory Manual,(Elsevier,N.Y.,1985)中找到。

使用适合于宿主细胞的方法将表达构建体导入宿主细胞。用于将核酸引入宿主细胞的多种方法是本领域已知的，包括但不限于：电穿孔；使用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其他物质进行转染；微弹轰击(microprojectile bombardment)；脂质体转染；和感染(其中载体是感染因子)。如下文更详细描述的，合适的宿主细胞包括原核生物、酵母菌、哺乳动物细胞或细菌细胞。

可以使用本领域已知的任何表达系统来制备本发明的重组多肽(例如重组抗体)。通常，用包含编码所期望多肽的DNA的重组表达载体转化宿主细胞。可以使用的宿主细胞是原核生物、酵母菌或高等真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如大肠杆菌或芽孢杆菌(bacilli)。高等真核细胞包括昆虫细胞和已建立的哺乳动物细胞系。用于克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生抗体，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。为了在细菌中表达抗体片段和多肽，参见，例如，美国专利第5,648,237、5,789,199和5,840,523号(还参见Charlton,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,N.J.,2003),pp.245-254，描述了抗体片段在大肠杆菌中的表达。)。表达后，抗体可以从可溶性级分中的细菌细胞体中分离，并且可以进一步纯化。高等真核细胞包括昆虫细胞和已建立的哺乳动物源细胞系。合适的哺乳动物宿主细胞系的实例包括猴肾细胞的COS-7系(ATCC CRL1651)(Gluzman et al.,1981,Cell23:175)、L细胞、293细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCC CCL163)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、BHK(ATCC CRL 10)细胞系和如McMahan et al.,1991,EMBO J.10:2821所述的源自非洲绿猴肾细胞系CV1的CV1/EBNA细胞系(ATCC CCL70)。用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主的适当克隆和表达载体由Pouwels等人描述(Cloning Vectors:A Laboratory Manual,Elsevier,N.Y.,1985)。

在某些实施方式中，脊椎动物细胞可用作宿主以表达抗PD-L1抗体或其片段。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾细胞系(如在Graham et al.,J.GenVirol.36:59(1977)中所述的293或293细胞，)；小仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠睾丸支持细胞(例如，在Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中描述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如Mather etal.,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所述；MRC 5细胞；和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR.sup.-CHO细胞(Urlaub etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系，如Y0、NS0和Sp2/0。关于适用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如，Yazaki and Wu,Methodsin Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,N.J.),pp.255-268(2003)。合适的哺乳动物宿主细胞系的实例包括猴肾细胞的COS-7系(ATCC CRL 1651)(Gluzman et al.,1981,Cell 23:175)、L细胞、293细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCC CCL163)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、BHK(ATCC CRL 10)细胞系以及如McMahan etal.,1991,EMBO J.10:2821所述的来自非洲绿猴肾细胞系CV1的CV1/EBNA细胞系(ATCC CCL70)。

除原核生物外，真核微生物(如丝状真菌或酵母菌)是编码抗体的载体的合适的克隆或表达宿主，所述真核微生物包括其糖基化途径已经“人源化”的真菌和酵母菌株，使得产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004),and Li et al.,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。

用于表达糖基化抗体的合适宿主细胞也来源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了多种可以与昆虫细胞一起使用的杆状病毒毒株，所述毒株特别用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。

Pouwels等人描述了适用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主的克隆和表达载体(Cloning Vectors:A Laboratory Manual,Elsevier,N.Y.,1985)。

可以在促进多肽表达的条件下培养转化的细胞，并通过常规蛋白质纯化方法回收多肽。这样一种纯化方法包括例如在具有与基质结合的全部或部分PD-L1(例如胞外域)的基质上使用亲和层析。预期用于本文的多肽包括基本上不含污染性内源物质的基本上同质的重组哺乳动物抗PD-L1抗体多肽。因此，可以使用重组方法和组合物产生抗体，例如美国专利第4,816,567号所述。在一种实施方式中，提供了编码本文所述的抗PD-L1抗体的分离的核酸。这种核酸可以编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。在进一步的实施方式中，提供了包含这种核酸的一种或多种载体(例如表达载体)。在进一步的实施方式中，提供了包含这种核酸的宿主细胞。在这样一种实施方式中，宿主细胞包含(例如，已用以下转化)：(1)包含编码包含抗体VL的氨基酸序列和包含抗体VH的氨基酸序列的核酸的载体，或(2)包含编码包含抗体VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码包含抗体VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一种实施方式中，宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。在一种实施方式中，提供了制备抗PD-L1抗体的方法，其中该方法包括在适于表达抗体的条件下培养包含如上所述的编码所述抗体的核酸的宿主细胞，并任选地回收来自宿主细胞(或宿主细胞培养基)的抗体。

本文公开的蛋白质也可以使用细胞翻译系统产生。出于此目的，必须修饰编码多肽的核酸以允许体外转录产生mRNA，以及允许在所使用特定无细胞系统(无真核细胞(如无哺乳动物细胞或酵母细胞)翻译系统或无原核细胞(如无细菌细胞)翻译系统)中进行无细胞翻译mRNA。

PD-L1结合多肽也可以通过化学合成产生(例如通过Solid Phase PeptideSynthesis,2nd ed.,1984,The Pierce Chemical Co.,Rockford,Ill.中描述的方法)。蛋白质的修饰也可以通过化学合成产生。

可以通过蛋白质化学领域中通常已知的蛋白质分离/纯化方法纯化本发明的多肽。非限制性实例包括萃取、重结晶、盐析(例如用硫酸铵或硫酸钠)、离心、透析、超滤、吸附色谱、离子交换色谱、疏水色谱、正相色谱、反相色谱、凝胶过滤、凝胶渗透色谱、亲和色谱、电泳、逆流分布或这些的任意组合。纯化后，通过本领域已知的多种方法中任意一种，可以将多肽交换到不同的缓冲液中和/或浓缩，所述方法包括但不限于过滤和透析。纯化的多肽优选至少85％纯，更优选至少95％纯，最优选至少98％纯。无论纯度的确切数值如何，多肽都是足够纯以用作药物产品。抗原结合蛋白(例如抗体、抗体片段、抗体衍生物、抗体突变蛋白和抗体变体)是与PD-L1(优选人PD-L1)结合的多肽。抗原结合蛋白包括抑制PD-L1的生物活性的抗原结合蛋白。

可以通过许多已知技术中的任何一种制备抗原结合蛋白，并筛选所期望的性质。某些技术涉及分离编码感兴趣的抗原结合蛋白(例如抗PD-L1抗体)的多肽链(或其部分)的核酸，并通过重组DNA技术操作核酸。例如，核酸可以与另一种感兴趣的核酸融合，或者改变(例如通过诱变或其他常规技术)以添加、缺失或取代一个或多个氨基酸残基。

单链抗体可以通过经由氨基酸桥(短连接肽)连接重链和轻链可变域(Fv区)片段而形成，从而产生单个多肽链。通过在编码两个可变域多肽(V_L和V_H)的DNA之间融合编码连接肽的DNA，制备了这种单链Fv(scFv)。得到的多肽可以自身折回以形成抗原结合单体，或者它们可以形成多聚体(例如二聚体、三聚体或四聚体)，这取决于两个可变域之间的柔性连接子的长度(Kortt et al.,1997,Prot.Eng.10:423；Kortt et al.,2001,Biomol.Eng.18:95-108)。通过组合不同的含V_L和V_H的多肽，可以形成结合不同表位的多聚体scFv(Kriangkum et al.,2001,Biomol.Eng.18:31-40)。为产生单链抗体而开发的技术包括美国专利第4,946,778号；Bird,1988,Science 242:423；Huston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879；Ward et al.,1989,Nature 334:544,de Graaf etal.,2002,Methods Mol.Biol.178:379-87中所描述的那些。

已知用于从感兴趣的抗体衍生不同亚类或同种型的抗体的技术，即亚类转换。因此，IgG抗体可以源自例如IgM抗体，反之亦然。这些技术允许制备具有给定抗体(亲本抗体)的抗原结合特性但也显示出不同于亲本抗体的与抗体同种型或亚类相关的生物学特性的新抗体。可以使用重组DNA技术。编码特定抗体多肽的克隆DNA可用于此类方法，例如编码所期望的同种型抗体恒定域的DNA(Lantto et al.,2002,Methods Mol.Biol.178:303-16)。此外，如果IgG4是期望的，也可能期望在铰链区引入点突变(CPSCP->CPPCP)(Bloom etal.,1997,Protein Science 6:407)，以减轻形成H链内二硫键的趋势，该二硫键可导致IgG4抗体的异质性。

本发明提供的各个方面的实施方案也通过以下任意一个段落进行了描述。

实施方案1.一种IgG类的全人抗体，其与PD-L1表位结合，其特征在于，所述抗体包含重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域包含与SEQ ID NO.1中所示的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，所述轻链可变域包含如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3中所示的氨基酸序列。

实施方案2.一种IgG类的全人抗体，其与PD-L1表位结合，其特征在于，所述抗体包含重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域包含分别如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQID NO:7的氨基酸序列所示的CDR1域、CDR2域和CDR3域，所述轻链可变域包含如SEQ IDNO.2或SEQ ID NO.3中所示的氨基酸序列。

实施方案3.根据实施方案2所述的全人抗体，其特征在于，所述抗体具有SEQ IDNO.1/SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.3的重链/轻链可变域氨基酸序列组合。

实施方案4.根据实施方案1至3中任一项所述的全人抗体，其特征在于，所述全人抗体是IgG1或IgG4。

实施方案5.一种抗PD-L1的全人抗体Fab片段，具有来自重链的可变域和来自轻链的可变域，其特征在于，所述重链可变域包含与SEQ ID NO.1中所示的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，并且其中，所述轻链可变域包含如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3中所示的氨基酸序列。

实施方案6.根据实施方案5所述的全人抗体Fab片段，其特征在于，所述抗体具有SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.3的重链/轻链可变域氨基酸序列组合。

实施方案7.一种抗PD-L1单链人抗体，具有通过连接肽连接的重链可变域和轻链可变域，其特征在于，所述重链可变域包含与SEQ ID NO.1中所示的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，并且其中，所述轻链可变域包含SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3中所示的氨基酸序列。

实施方案8.根据实施方案7所述的单链全人抗体，其特征在于，所述单链全人抗体具有SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.3的重链/轻链可变域氨基酸序列组合。

实施方案9.一种治疗患有癌症或自身免疫疾病或炎性疾病的人对象的方法，所述方法包括将有效量的如实施方案1至3中任一项所述的全人抗体给药于所述人对象。

实施方案10.一种治疗患有癌症或自身免疫疾病或炎性疾病的人对象的方法，所述方法包括将有效量的如实施方案5或6所述的全人抗体Fab片段给药于所述人对象。

实施方案11.一种治疗患有癌症或自身免疫疾病或炎性疾病的人对象的方法，所述方法包括将有效量的如实施方案7或8所述的单链全人抗体给药于所述人对象。

实施方案12.根据实施方案9至11中任一项所述的方法，其特征在于，所述癌症选自卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、骨髓瘤、成神经细胞性CNS肿瘤、单核细胞白血病、B细胞性白血病、T细胞性白血病、B细胞性淋巴瘤、T细胞性淋巴瘤、以及肥大细胞性肿瘤。

实施方案13.根据实施方案9至11中任一项所述的方法，其特征在于，所述自身免疫性或炎性疾病选自肠粘膜炎症、结肠炎相关的消耗病、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、病毒感染、类风湿性关节炎、骨关节炎、牛皮癣、克罗恩病和炎性肠道疾病。

实施方案14.根据实施方案1至3中任一项所述的抗体，其特征在于，所述抗体在哺乳动物宿主细胞中产生。

实施方案15.根据实施方案14的所述抗体，其特征在于，所述哺乳动物宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

实施方案16.一种药物组合物，包含实施方案1至3中任一项所述的抗体和药学上可接受的载体。

在以下非限制性实施例中描述了其他实施方式。

实施例1：H6B1L抗体和变体抗体的对比亲和力

该实施例提供了Biacore数据，显示了三种全人抗体，即野生型(H6B1L)、H6B1L-EV和H6B1L-EM具有与人PD-L1相似的彼此亲和力，如下表1所示：

表1.亲本抗体H6B1L和变体H6B1L-EV和-EM的对比BIACORE数据

名称

ka(1/Ms)

kd(1/s)

Rmax(RU)

KA(1/M)

KD(M)

χ2

H6B1L

1.51E+06

2.80E-03

60.1

5.40E+08

1.85E-09

0.38

H6B1L-EV

1.57E+06

2.87E-03

57.3

5.48E+08

1.82E-09

0.496

H6B1L-EM

1.38E6

2.14E-03

248

6.44E+08

1.55E-09

7.93

因此，令人惊讶的是，改变轻链中的一个或两个氨基酸改善了以足够的量制备抗体的能力，而且不影响结合其靶标(人PD-L1)的结合能力。

实施例2：抗体H6B1L-EM的改进制造

该实施例说明了来自亲本野生型抗体H6B1L(SEQ ID NO.4)和H6B1L-EM轻链(SEQID NO.2)的两条轻链的质谱分析。每种抗体均在CHO细胞中产生。所达到的峰值的比较如图1A所示。此外，N末端埃德曼测序证实，SYELMXXX和LMXXX的轻链片段存在于野生型H6B1L轻链的质谱峰中。如图1B中所述，与亲本轻链相比，没有检测到H6B1LEM轻链的轻链(LC)片段。

序列表

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并入供参考本申请中引用的所有参考文献、专利和专利申请的内容均明确并入本文供参考。

Claims (18)

1.一种能够与PD-L1或其抗原结合片段结合的结合蛋白，其中所述结合蛋白或片段包含重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域包含分别如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQID NO:7的氨基酸序列所示的CDR1域、CDR2域和CDR3域，所述轻链可变域包含如SEQ ID NO:2的轻链可变域氨基酸序列中所示的CDR。

2.根据权利要求1所述的结合蛋白或片段，其中所述重链可变域包含与SEQ ID NO:1至少95％相同的氨基酸序列，并且所述轻链可变域包含与SEQ ID NO:2至少95％相同的氨基酸序列。

3.一种能够与PD-L1或其抗原结合片段结合的结合蛋白，其中所述结合蛋白或片段具有如SEQ ID NO:1所示的重链可变域序列和如SEQ ID NO:2所示的轻链可变域序列。

4.根据权利要求1所述的结合蛋白或片段，其中所述结合蛋白是IgG类的分离的全人抗PD-L1抗体。

5.根据权利要求1所述的结合蛋白或片段，其中所述结合蛋白是抗PD-L1全人抗体Fab片段。

6.根据权利要求1所述的结合蛋白或片段，其中所述结合蛋白是抗PD-L1单链人抗体，其中所述抗PD-L1单链人抗体的重链可变域和轻链可变域通过连接肽连接。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的结合蛋白或片段，其中所述结合蛋白或片段具有至少1x 10^-6M的结合亲和力。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的结合蛋白或片段在制备用于治疗患有癌症的对象的药物中的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其中所述癌症选自由以下组成的组：卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、骨髓瘤、成神经细胞性CNS肿瘤、单核细胞白血病、B细胞性白血病、T细胞性白血病、B细胞性淋巴瘤、T细胞性淋巴瘤和肥大细胞性肿瘤。

10.根据权利要求1至7中任一项所述的结合蛋白或片段在制备用于治疗自身免疫疾病或炎性疾病的药物中的用途。

11.根据权利要求10所述的用途，其中所述疾病选自由以下组成的组：肠粘膜炎症、结肠炎相关的消耗病、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、病毒感染、类风湿性关节炎、骨关节炎、牛皮癣、克罗恩病和炎性肠道疾病。

12.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的结合蛋白或片段和药学上可接受的载体。

13.一种或多种核酸，其编码根据权利要求1至7中任一项所述的结合蛋白或片段。

14.一种或多种表达载体，其包含根据权利要求13所述的一种或多种核酸。

15.一种宿主细胞，其包含根据权利要求13所述的一种或多种核酸或根据权利要求14所述的一种或多种表达载体。

16.一种产生根据权利要求1至7中任一项所述的结合蛋白或片段的方法，其包括在表达所述结合蛋白或片段的条件下培养根据权利要求15所述的宿主细胞。

17.根据权利要求16所述的方法，其还包括纯化所述结合蛋白或片段。

18.包含一种或多种核酸的一种或多种表达载体，所述核酸编码：

a)与PD-L1表位结合的IgG类全人抗体，其中所述抗体包含重链可变域和轻链可变域，其中所述重链可变域的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述轻链可变结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

b)抗PD-L1 Fab全人抗体片段，其具有来自重链的可变域和来自轻链的可变域，其中所述重链可变域的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，并且其中所述轻链可变域的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；或

c)抗PD-L1单链人抗体，其具有通过连接肽连接的重链可变域和轻链可变域，其中所述重链可变域的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，并且其中所述轻链可变域的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

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