CN108853514A - 具有两种不同药物的抗体药物偶联物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有两种不同药物的抗体药物偶联物，本发明将一种药物以定点偶联方式连接到抗体的半胱氨酸残基上，并将第二种不同作用机制的细胞毒性药物以非定点偶联的方式连接到抗体的半胱氨酸残基上。

Description

具有两种不同药物的抗体药物偶联物
技术领域
本发明涉及一种具有两种不同药物的抗体药物偶联物.
背景技术
抗体偶联药物(ADC)作为新型的靶向药物，一般由三部分组成：抗体或抗体类配体，小分子药物以及将配体和药物偶联起来的连接子。抗体偶联药物利用抗体对抗原的特异性识别，将药物分子运输至靶细胞附近并有效释放药物分子，达到治疗目的。2011年8月，美国食品药品监督管理局(FDA)批准西雅图基因公司研制的用于治疗霍奇金淋巴瘤以及复发性变性大细胞淋巴瘤(ALCL)的ADC新药AdecteisTM上市，临床应用证明了此类药物的安全性和有效性。
ADC药物抗体主要作用为靶向传递功能，最终发挥药效为所偶联的药物分子。目前应用于ADC领域的药物分子根据作用机制不同分为：微管抑制剂、DNA损伤剂、拓扑异构酶抑制剂、RNA聚合酶抑制剂、蛋白翻译抑制剂等。
在ADC药物中，抗体将药物分子靶向携带至肿瘤细胞附近，在肿瘤细胞周围或细胞内释放药物分子。然而同时，肿瘤在此治疗过程中也发展出对抗药物分子的不同机制，包括以PgP 蛋白泵将毒素分子泵出细胞，从而逃避被杀灭。当前，ADC药物开发主要集中于单个抗体连接单一作用机制药物，现代医学已经证明，化疗过程中的不同药物联合用药可明显增强药效。但是ADC药物随着所带药物数量及种类的增加，分子的脂溶性增大，在血浆中稳定性会明显降低，药效不仅没得到提高，还会带来副作用。
在当前已知文献中，美国索伦托治疗有限公司专利CN106132431(A)通过分别利用抗体分子中赖氨酸上氨基残基(又称K-LOCK技术)和半胱氨酸巯基残基(C-LOCK技术)实现将不同药物与抗体连接。由于其偶联方式的局限性，C-LOCK技术往往得到的DAR是2-4，而且K-LOCK技术也具有明显的局限性：在赖氨酸连接药物抗体偶联比(DAR)＞2时，由于单个抗体分子中含有赖氨酸约88个，如此多数量的赖氨酸导致氨基偶联选择性差，偶联数量和偶联位置难以确定，虽然可以通过偶联条件进行一定程度的控制，但是在制备带有两种不同药物的复杂的抗体偶联物时会带来极大的挑战。并且专利CN106132431并未给出动物体内药效数据及血浆稳定性的报道。
在ADC药物中，亟需一种创新的偶联方法以获得血浆稳定，偶联了两种不同药物的抗体偶联药物，并且实现药物数量更方便的组合。本发明惊人的满足了以上需求。
发明内容
本发明旨在提供一种具有两种不同药物的抗体-药物偶联物。通过设计偶联物，将两种不同药物分子连接至同一抗体。由于不同作用机制药物的联合使用，偶联物可有效提高药效。
具体的，本发明提供了一种如式I的包括不同药物的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐
其中Ab为抗体部分；
L1、L2为任选的可连接至药物的连接单元；
D1、D2为药物单元；
m、n为2-8的整数。
优选的，药物D1、D2为作用机制不同的抗肿瘤药物。
更优选的，药物D1、D2分别优选自微管蛋白结合剂、DNA烷化剂、DNA嵌入剂、酶抑制剂、免疫调控剂、肽和核苷酸。
在一些优选例中，所述的m优选为2、4。
本发明的一个方面，药物D1优选以定点偶联方式，D2以非定点偶联方式连接至抗体
在一些实施例中，药物D1优选的定点偶联方式为定点突变抗体原有氨基酸至半胱氨酸或通过插入一个半胱氨酸或一段含半胱氨酸的多肽，通过以上方法引入的半胱氨酸巯基与 linker-毒素相偶联。D2优选的非定点偶联方式为通过抗体原有的链间二硫键与linker-毒素相偶联。
优选的，本发明中L1、L2具有下式二：
其中C是末端任选的可延伸单元，E为任选的可断裂单元，F为间隔单元,下标e，f为0 或1。波浪线表示到丁二酰亚胺和药物单元的连接位点。
较优选的，所述的抗体药物偶联物，可断裂单元E在e＝0时不存在，在e＝1时存在。当存在时，E所述的可断裂单元通过肿瘤相关蛋白酶或酸性PH实现与药物单元D或间隔单元F 间的断裂。
较优选的，所述的抗体药物偶联物，间隔单元F在f＝0时不存在，在f＝1时存在。当F 存在时，F选自对氨基苯甲醇或与乙二胺单元及其衍生物组成的组。
较优选的，本发明任一项所述的药物-配体偶联物化合物包含其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的稀释剂运载体或赋形剂的药物组合物。
较优选的，本发明包括向所述患者给予前述权利要求中任一项所述的药物-配体偶联物，其中所述患者患有肿瘤、自身免疫疾病或感染性疾病，并且所述的药物-配体偶联物的抗体特异性结合至所述癌症、自身免疫疾病的靶细胞
附图说明
图1为Payload S MS-TOF检测结果图。
图2为Payload E MS-TOF检测结果图。
图3显示了为带不同药物的ADC和对照ADC检测结果图。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，惊奇的发现具有两种不同作用机制药物的抗体-药物偶联物相比于传统的单一作用机制的ADC药物具有更好的体内外药效。
具体的，本发明提供的如下式所示的抗体药物偶联物
缩写和定义
除非另有说明，否则如本文所用的以下术语和短语旨在具有以下含义。当本文中使用商标名称时，除非上下文中另有指明，否则商标名称包括所述商标名称产品的产品配方、通用药物和活性药物成分。
除非本文中另有说明，文中所用的化合物的“衍生物”是指具有与化合物相似的化学结构但还含有至少一个化合物中不存在的化学基团和/或缺少至少一个化合物中存在的化学基团的物质。衍生物所比较的化合物被称为“母体”化合物。通常，“衍生物”可在一个或多个化学反应步骤中由母体化合物产生。
如本文所用，“抗体”或“抗体单元”在其所属的范围内，包括抗体结构的任何部分。这一单元可以结合，反应性关联，或者络合一个受体，抗原，或者靶向细胞群体具有的其它受体单元。抗体可以是任何蛋白或蛋白类分子，它可以结合，络合，或者与待治疗或生物改造的细胞群体的一部分发生反应。在一些实施方式中，连接子共价连接至抗体的硫原子。在一些方面中，硫原子是半胱氨酸残基的硫原子，其形成抗体的链间二硫键。在另一方面中，硫原子是已经导入配体单元的半胱氨酸残基的硫原子，其形成抗体的链间二硫键。在另一方面中，硫原子是已经导入配体单元的半胱氨酸残基的硫原子(例如，通过定点诱变或化学反应)。在其他方面中，连接子结合的硫原子选自形成抗体的链间二硫键的半胱氨酸残基或已经引入配体单元的额半胱氨酸残基(例如，通过定点诱变或化学反应)。在一些实施方式中，按照Kabat(Kabat E.A等，(1991))《免疫学感兴趣的蛋白质序列》(Sequences ofproteins of Immunological Interest),第五版，NIH出版物91-3242)中的EU索引编号系统。
本发明中组成抗体药物偶联物的抗体最好保持其原有野生状态时的抗原结合能力。因此，本发明中的抗体能够，最好专一性的与抗原结合。涉及的抗原包括，例如，肿瘤相关抗原 (TAA)，细胞表面受体蛋白和其他细胞表面分子，细胞存活调节因子，细胞增殖调节因子，与组织生长与分化相关的分子(如已知或预知的具有功能性的)，淋巴因子，细胞因子，参与细胞循环调节的分子，参与血管生成的分子，以及与血管生成有关的分子(如已知或预知的具有功能性的)。肿瘤相关因子可以是簇分化因子(如CD蛋白)。
本文所述应用在抗体药物偶联物中的抗体包括，但不局限于，针对细胞表面受体和肿瘤相关抗原的抗体。这样的肿瘤相关抗原是业内所熟知的，可以通过业内熟知的抗体制备方法和信息来制备。为了开发可用于癌症诊断与治疗的有效的细胞水平目标物，研究人员力图找寻跨膜或其他肿瘤相关多肽。这些目标物能够特异性的表达在一种或多种癌细胞表面，而在一种或多种非癌细胞表面表达很少或不表达。通常，相对于非癌细胞表面而言，这样的肿瘤相关多肽在癌细胞表面更加过度表达。确认这样的肿瘤相关因子，可大大提高基于抗体治疗癌症的专一靶向特性。
肿瘤相关抗原包括但不局限于业内所熟知的肿瘤相关抗原。与肿瘤相关抗原对应的核酸和蛋白序列可参见公开数据库，例如Genbank。抗体靶向对应的肿瘤相关抗原包括所有的氨基酸序列变种和同种，与参考文献中确认的序列具有至少70％，80％，85％，90％，或者95％的同源性，或者具备与引用文献中的肿瘤相关抗原序列具有完全一致的生物性质和特征。
术语“抑制”或“的抑制”指，减少了可检测的量，或完全阻止。
术语“癌症”指的是以失调的细胞生长为特征的生理病症或疾病。“肿瘤”包括癌细胞。
术语“自身免疫疾病”是源自针对个体自身的组织或蛋白质的疾病或紊乱。
本文中所用“定点偶联”优选为定点突变抗体原有氨基酸至半胱氨酸或在抗体中插入一个半胱氨酸或一段含半胱氨酸的多肽，通过以上方法引入的半胱氨酸巯基与连接子中的丁二酰亚胺相偶联。“非定点偶联”方式为通过利用抗体原有的链间二硫键与连接子-毒素相偶联。
本文中所用的短语“药学上可接受的盐”指的是，化合物(例如，药物，药物-接头或配体-接头-药物偶联物)的药学上可接收到有机或无机盐。该化合物可含有至少一个氨基或羧基，并且因此可与相应的酸或碱形成加成盐。示例性的盐包括但不限于：硫酸盐、三氟乙酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸性磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸性柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、单宁酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、水杨酸盐、甲酸盐、本甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐，钾盐、钠盐等。另外，药学上可接受的盐在结构中具有超过一个的带点原子。其中多个带电原子是药学上可接受的盐的一部分的示例能有多个抗衡例子。例如，药学上可接受的盐具有一个或多个带电原子和/或一个或多个抗衡原子。
药物是指：一种用于癌症治疗的细胞毒性药物,高活性药物包括但不局限于美登素或类美登素,海兔毒素10(Dolastatin10)的类似物，卡奇霉素类药物阿霉素类吡咯并苯二氮唑类 (pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodi-azepines,PBDs)或者PBD二聚体类(PBDdimmers)以及衍生物鹅膏毒素或者其衍生物，中等活性药物包括但不局限于苯并二吡咯类抗生素(duocarmycins， CC-1065等)喜树碱类化合物包括喜树碱，羟基喜树碱，SN-38，依喜替康，伊立替康等。
另一方面，药物并不仅仅局限于上述提到的类别，还包括所有可用于抗体药物偶联物的药物。
按照在细胞内药物释放的机制，如本文所用，“连接单元”或“抗体药物偶联物的连接单元”可被分为两类：不可断裂连接单元和可断裂连接单元。
对于含有不可断裂连接单元的抗体药物偶联物，其药物释放机制为：偶联物与抗原结合并被细胞内吞后，抗体在溶酶体中被酶解，释放出由小分子药物，连接子，和抗体氨基酸残基共同组成的活性分子。由此带来的药物分子结构改变并不减弱其细胞毒性，但由于活性分子是带电荷的(氨基酸残基)，从而导致其不能渗入邻近细胞。因此，此类活性药物不能杀死邻近不表达靶向抗原(抗原阴性细胞)的肿瘤细胞(旁观者效应，bystandereffect)(Ducry 等，2010，Bioconjugate Chem.21:5-13)。
可断裂连接单元，顾名思义，可以在目标细胞内断裂并释放出活性药物(小分子药物本身)。可断裂连接子可分为两个主要的类别：化学不稳定连接子和酶不稳定连接子。
化学不稳定连接子可以由于血浆和细胞质性质的不同而选择性的断裂。这样的性质包括 pH值，谷胱甘肽浓度等。
对pH值敏感的连接子，通常又称为酸断裂连接子。这样的连接子在血液的中性环境下相对稳定(pH7.3-7.5)，但是在弱酸性的内涵体(pH5.0-6.5)和溶酶体(pH4.5-5.0)内将会被水解。第一代的抗体药物偶联物大多应用这类连接子，例如腙，碳酸酯，缩醛，缩酮类。由于酸断裂连接子有限的血浆稳定性，基于此类连接子的抗体药物偶联物通常具有较短的半衰期(2-3天)。这种较短的半衰期在一定程度上限制了pH敏感连接子在新一代抗体药物偶联物中的应用。
对于谷胱甘肽敏感的连接子，又称二硫键连接子。药物释放是基于细胞内谷胱甘肽的高浓度(毫摩尔范围)与血液中相对较低的谷胱甘肽浓度(微摩尔范围)差异引起的。对于肿瘤细胞而言尤其如此，其低含氧量导致还原酶的活性增强，因而导致更高的谷胱甘肽浓度。二硫键具有热力学稳定性，因此在血浆中具有较好的稳定性。
酶不稳定连接子，如肽连接子，能够更好的控制药物释放。肽连接子能够被溶酶体内蛋白酶，如组织蛋白酶(Cathepsin B)或纤溶酶(在一些肿瘤组织中此类酶含量增加)，有效的切断。这种肽连接被认为在血浆循环中非常稳定，这是因为细胞外不合宜的pH值及血清蛋白酶抑制剂导致蛋白酶通常不具备活性。鉴于较高的血浆稳定性和良好的细胞内断裂选择性和有效性，酶不稳定连接子被广泛用做抗体药物偶联物的可断裂连接子。典型的酶不稳定性连接子包括Val-Cit(vc)，Phe-Lys等。
自杀式连接子一般嵌合在可断裂连接子与活性药物之间，或者本身就是可断裂连接子的一部分。自杀式连接子的作用机制是：当可断裂连接子在合宜的条件下断裂后，自杀式连接子能够自发的进行结构重排，进而释放与之连接的活性药物。常见的自杀式连接子包括对氨基苄醇类(PAB)和β-葡萄糖醛酸苷类(β-Glucuronide)等。
本专利可以使用以下缩写并具有指定的定义：Boc，叔丁氧基羰基；DCC，环二己基碳二亚胺；DCM：二氯甲烷；DIPEA：二异丙基碳二亚胺；DMF：N、N-二甲基甲酰胺；DMAP:4- (N、N-二甲基氨基)吡啶；HATU:2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯；HPLC:高效液相色谱；PEG：聚乙二醇；TFA:三氟乙酸；THF:四氢呋喃；PBS:磷酸盐缓冲溶液(PH7.0-7.5)。
药学上可接受的赋形剂包括任何载体，稀释剂，佐剂或赋形剂，如防腐剂和抗氧剂，填充剂，崩解剂，湿润剂，乳化剂，悬浮剂，溶剂，分散介质，包衣剂，抗细菌剂和抗真菌剂和吸收延迟剂等。这样的介质和药剂用于药物活性物质的使用在本领域时公知的。除了任何常规的介质或试剂与活性成分不相容以外，其在治疗组合物中的用途也被考虑到。作为合适的治疗组合，还可以将补充的活性成分掺入组合物中。
本发明的主要优点在于：
1、本发明提供的具有两种不同药物的抗体药物偶联物，因为其药物不同作用机制，可有效增强药效，获得更好的治疗效果。
2、本发明提供的采用定点偶联与非定点偶联结合的方法，可简单易得的偶联获得含两种不同药物的抗体药物偶联物。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解，这些实施例只用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比例、比率、或份数按重量计。
除非另行定义，文中所使用的所有专业和科学用于与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明下列实施例中采用的通用步骤是：
通用步骤A抗体定点突变
按以下比例配制PCR反应体系(50μL)，充分混匀后瞬时离心，体系包含：
PCR扩增后，加入1μL DpnI(10U/μL)，37℃孵育3h；取1μL DpnI处理后的PCR产物，进行E.coli转化实验，如下：冰浴30min；热激42℃30sec；冰浴2min；加入150μL LB 液体培养基，37℃150rpm培养30min；3000×g RT离心3min后，去掉上清，留下50μL 培养上清悬浮菌体后，涂布于含Amp的LB固体培养基上；37℃培养16h；挑取单菌落，转接于5mL含Amp(pTT5)的LB液体培养基中，过夜培养后提取质粒；进行PCR测序鉴定。通用步骤B偶联不同毒素制备ADC
将通过初步的纯化后单体率大于95％的抗体分子，使用超滤离心管换液至含有EDTA的磷酸盐缓冲液中，浓度10mg/ml。加入10倍于抗体摩尔分子数的TCEP，室温下反应2h。使用超滤离心管换液至pH6.5的磷酸缓冲液中，再加入10倍于抗体摩尔分子数的DHAA，室温下反应2h。然后加入3倍于抗体摩尔分子数的payload 1，室温下反应4h。反应结束后，使用截留分子量为30KDa的超滤离心管换液至含有EDTA的磷酸盐缓冲液中，并去除未偶联的payload 1。加入10倍于抗体摩尔分子数的TCEP，室温下反应8h。打开抗体链间二硫键，并用Ellman方法测定游离巯基数，判断二硫键是否全部打开。然后加入10倍于抗体摩尔分子数的payload 2，室温下反应8h。反应结束后，使用截留分子量为30KDa的超滤离心管换液至PBS中，并去除未偶联的payload 2。
通用步骤C
药代动力学研究
检测血清中抗体的ELISA方法：抗抗体2ug/ml 4℃包被过夜，PBST洗板3次， 1％BSA+PBST 37℃封闭1hr；孵育血清样品，PBST洗板3次；37℃孵育检测抗体(抗Fc的单抗或多抗(HRP标记))1hr，PBST洗板3次，TMB显色，2M H2SO4终止，酶标仪读值。通用步骤D
疏水性相互作用色谱(HIC)测定
使用疏水性相互作用色谱(HIC)来进行对ADC的分析。通过0-100％流动相B(MPB)脱，其中流动相A(MPA)由1.5M硫酸铵和.025M磷酸钠组成，并且MPB由0.025M的磷酸钠、25％异丙醇组成。样品上样量约为20μg，梯度洗脱在15分钟完成。用UV280nm进行检测，输水性越强的样品越晚出峰。
通用步骤E
血浆稳定性研究
取一定量的ADC样品,加入到已去除人IgG的人血浆中,每种ADC重复三管，放置37℃水浴中孵育,分别孵育0h、72h后，取出ADC样品，每管加入ProteinA(MabSelect SuReTMLX Lot:#10221479GE，用取PBS洗涤过的)100ul，垂直混合仪晃动吸附2h,经过洗涤洗脱步骤,获得孵育后的ADC.对孵育特定时间的ADC样品进行RP-HPLC检测.判定样品的血浆稳定性。
实施例1-6
实施例1化合物1的合成
单口瓶中加入Fmoc-Lys(mmt)-OH(2g，3.2mmol，1eq)，PABA(788.16mg，6.4mmol，2eq)，HATU(1.34g，3.52mmol，1.1eq)，DIEA(1.24g，9.6mmol，3eq)及20mlDMF，搅拌溶解后氮气保护，25℃反应；点板检测，赖氨酸反应完全。向反应液中加入200ml水，有大量固体析出，EA(60mlx3)萃取，有机相用盐水洗涤三次，无水硫酸钠干燥，旋干得黄色油状物2.85g。将上步中间体用20ml二乙胺溶解，氮气保护，25℃反应；点板检测，原料反应完全。将溶剂旋干并加入100ml EA溶解，盐水洗涤三次，无水硫酸钠干燥，旋干得产品浅棕色油状物2.58g。柱层析纯化：以DCM：MeOH＝100:1至50:1为流动相剂进行梯度洗脱，得产品白色泡状固体750mg。
H1NMR(400MHz,CDCl3):8.01(s,1H),7.63-7.65(m,2H),7.32-7.40(m,6H),7.29-7.31(m,8H ),6.87-6.89(m,2H),4.62(s,2H),3.84(s,3H),3.37(t,1H),2.55(m,2H),1.89(m,2H),1.40(m, 2H),1.24(m,2H)。
实施例2化合物2的合成
单口瓶中加入化合物1(300mg，0.574mmol，1eq)N3PEG8COOH(350mg，0.631mmol，1.1eq)， HOBT(85mg，0.631mmol，1.1eq)DIEA(149mg，1.15mmol，2.0eq)及4ml干燥DMF，氮气保护，冰水浴降温搅拌溶清；加入HATU(240mg，0.631mmol，1.1eq)，25℃反应；点板检测，005反应完全，后处理。向反应液中加入50ml水，EA(50mlx3)萃取，有机相用盐水洗涤三次，无水硫酸钠干燥，旋干得浅黄色油状物920mg。薄层板制备纯化：用DCM：MeOH＝15:1为展开剂展开一次，纯化得产品淡黄色油状物500mg。
实施例3化合物3的合成
单口瓶中加入化合物2250mg，0.5mmol，1.5eq)、DMAP(183mg，1.5mmol，4.5eq)及重蒸的10ml DCM，溶清后氮气保护，加入三光气(52mg，0.175mmol，0.52eq)，室温反应，反应液变浑浊，搅拌30s后澄清；点板检测，002反应完全，加入EL-006(353mg，0.333mmol， 1.0eq)；点板检测，EL-006反应完全，加入3ml甲醇淬灭，旋干得黄色固体900mg。薄层板制备纯化：用DCM：MeOH＝10:1为展开剂展开一次，纯化得产品微黄色固体350mg。
实施例4化合物4的合成
单口瓶中加入化合物3(350mg，0.215mmol，1.0eq)及DCM，溶解后氮气保护；加入1M TBAF溶液(0.537ml，2.5eq)，反应液变为橙黄色，加入HAc(1.07mmol)后颜色变为金黄色，25℃反应；点板检测，007反应完全，后处理。反应液加入100mlDCM稀释，盐水洗涤三次，无水硫酸钠干燥，旋干得产品410mg。
实施例5化合物5的合成
单口瓶中加入化合物4(400mg，0.273mmol，1eq)、SMCC-氨基乙炔(186mg，0.682mmol， 2.5eq)及10mlDMSO，搅拌溶解后氮气保护，加入CuBr(78mg，0.546mmol，2eq)及2.5ml 水，25℃搅拌反应；
反应液中有胶体生成，附于瓶底；取胶体及反应液，DCM溶解，水洗后点板，008反应完全，后处理。
反应液倒入100ml水中，有大量固体析出，DCM(60mlx3)萃取，有机相用盐水洗涤三次，无水硫酸钠干燥旋干得黄色固体550mg。
实施例6化合物6(Payload S)的合成
单口瓶中加入550mg EL-009、1ml苯甲醚及10mlDCM，氮气保护，溶清，冰水浴降温；加入2ml二氯乙酸，保持冰水浴，反应液变为黄色；升至25℃反应；点板检测，EL-009反应完全。30℃旋去大部分溶剂，加入20ml甲叔醚析晶，有大量黄色固体析出，冰水浴降温固化1h，过滤，油泵干燥，得粗品黄色粉末350mg。HPLC制备：以乙腈-水(0.9％TFA)为流动相进行梯度洗脱，冻干后共得产品黄色粉末130mg(M+H＝1480.69)。
实施例7-12
实施例7化合物7的合成
于500mL三口瓶中加入10g Fmoc-甘氨酰-甘氨酸(SN-100,0.028mol，1eq)、四氢呋喃300mL，甲苯100mL，搅拌溶清，再加入17.5g四乙酸铅(0.0395mol，1.4eq)，氮气保护，室温搅拌至析出固体，加入2.7mL吡啶(0.0338mol，1.2eq)，升至回流反应(外温80℃)， TLC监测反应进程，约3h反应结束。反应液浓缩，残余物加入水，用乙酸乙酯萃取，合并有机层，用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩得粗品。经硅胶柱纯化(PE/EA＝5/1-1/1) 得白色固体8g。
H1NMR(400MHz,CDCl3):8.11(s,1H),8.08(s,1H),7.87-7.89(m,2H),7.56-7.58(m,2H),7.2 8-7.33(m,4H),6.03(s,2H),4.70(d,2H),4.47(t,1H),3.86(s,2H),2.22(s,3H).
实施例8化合物8的合成
于250mL单口瓶中加入5gSN-101(13.6mmol，1eq)，150mLTHF，搅拌溶清，再加入4.5g羟乙酸苄酯(27.2mmol，2eq)及0.52g对甲苯磺酸一水合物(2.71mmol，0.2eq)，室温反应，TLC监测。反应结束，加入饱和碳酸氢钠溶液，用乙酸乙酯萃取，合并有机层，用无水硫酸钠干燥，浓缩得粗品。经硅胶柱纯化(PE/EA＝5/1-1/1)得白色固体2.8g。LC-MS： 474.1[M+H]+
H1NMR(400MHz,CDCl3):8.13(s,1H),8.10(s,1H),7.87-7.89(m,2H),7.56-7.58(m,4H),7.28-7. 36(m,7H),5.21(s,2H),4.70(d,2H),4.47(t,1H),4.35(s,2H),3.86(s,2H),3.82(s,2H)。
实施例9：化合物9的合成
于250mL单口瓶中加入5gFmoc-甘氨酰-甘氨酸(SN-100,14mmol，1eq)、5g对硝基酚(28mmol，2.5eq)、7.34gDCC(28mmol，2.5eq)及80mLTHF，室温搅拌，TLC监控。反应结束后，过滤，滤液减压浓缩得粗品，经硅胶纯化(DCM/MeOH＝500/1-100/1-50/1)得较纯品6.8g。
将上步得到的较纯品(14mmol，1eq)加入至250mL单口瓶中，再加入90mLTHF，碳酸钠水溶液(28mmol，2.4g，2eq，30mL水)，1.88gL-苯丙氨酸(11mmol，0.8eq)，氮气保护，室温反应，TLC监测。反应结束后，加入5％柠檬酸水溶液调节pH至3左右，用乙酸乙酯萃取，合并有机层，用无水硫酸钠干燥，浓缩得粗品。经硅胶柱纯化 (DCM/MeOH＝200/1-100/1-50/1)得白色固体1.5g。LC-MS：502.2[M+H]+
实施例10化合物13的合成
于50mL单口瓶中加入1.5gSN-102(0.032mol，1eq)，8mLDMF及哌啶0.8mL，室温反应约1h，TLC监控。反应结束，减压浓缩除去DMF及哌啶。向粗品中加入15DMF，1.58gSN-106(0.032mol，1eq)、3.29gPyBOP(0.064mol，2eq)及1mLDIEA(0.064mol，2eq)，室温反应， TLC监测。反应结束后，制备纯化，冻干，得白色固体1g。LC-MS：758.2[M+Na]+
实施例11化合物16的合成
于25mL单口瓶中加入150mg化合物13(0.2mmol，1eq)，8mL甲醇及1mLDMF，溶清，再加入45mg 5％Pd/C，氢化反应，TLC监控，约2h完成。过滤，滤液中加入1.8mL二乙胺，室温搅拌约2h，反应结束。减压浓缩得粗品。粗品中加入4mLDMF，溶清，加入62mgMC-OSu (0.2mmol，1eq)，66uLDIEA(0.4mmol，2e)，HPLC监测反应。制备纯化，冻干，得产品 30mg。LC-MS：512.2(碎片峰)
实施例12化合物17的合成
于25mL单口瓶中加入30mg化合物16(0.048mmol，1eq)、25mg依喜替康甲磺酸盐(0.048mmol，1eq)，50mgPyBOP(0.097mmol，2eq)，16uLDIEA(0.097mmol，2eq)及2mLDMF，室温反应。HPLC监测，反应结束，反应液直接半制备纯化，冻干得产品13mg。LC-MS： 1035.1[M+H]+
实施例13-17
实施例13化合物19(Fmoc-VC-PABA)合成：
将1.5g化合物18(Fmoc-Val-Cit)溶于14ml二氯甲烷和7ml甲醇混合溶剂中，加入4- 氨基苄醇(445.2mg，3.62mmol)，随后加入EEDQ(1.5g，6mmol)，将反应液室温搅拌过夜，溶剂浓缩除去后于残留物中加入异丙醚搅洗30min，将固体过滤后加入异丙醚再次搅洗30min，过滤，得Fmoc-VC-PABA 1.5g，收率82％。M(+1)＝602.6.
实施例14化合物20合成
将2g Fmoc-VC-PABA溶于10mlDMF中，加入2ml哌啶，室温搅拌30min，TLC监测反应完全后以高真空油泵减压浓缩得黄色固体，不经纯化直接用于下一步反应。
实施例15化合物21合成
上步所得VC-PABA溶于干燥DMF中，加入McOSu，DIEA，室温搅拌2h，HPLC监控反应完全后加入异丙醚室温搅拌析晶2h，后降温至0℃继续搅拌1h，过滤，滤饼以异丙醚洗涤两次，减压干燥的
实施例16：化合物22的合成
将类白色固体Mc-VC-PABA(8g，14mmol)溶于120ml干燥DMF中，向所得溶液中加入双 (4-硝基苯基)碳酸酯(8.5g，28mmol，2eq)，DIEA(3.66ml，21.0mmol，1.5eq)。反应液室温搅拌1h，通过HPLC监控反应完全后反应液浓缩，以石油醚/乙酸乙酯析晶，过滤，减压干燥得产物9.7g棕黄色固体(94％)，不经进一步纯化直接用于下一步反应。
实施例17化合物23的合成
将上步所得500mg MC-VC-PAB-PNP溶于10ml干燥DMF中，向所得溶液中依次加入DIEA (0.2ml)及300mg MMAE，加完继续室温搅拌，HPLC监控反应至MMAE全部反应完全，HPLC制备纯化所得产品，冷冻干燥得白色固体300mg(M+1＝1302.3)，收率62％。
实施例18 Cet-4S-2M制备
以通法A制备得到单突变西妥昔抗体，并依照通法B完成payload M(DAR＝2)及payload S(DAR＝4)不同毒素ADC的制备编号Cet-4S-2M。
实施例20 Cet-8S-4M制备
以通法A制备得到单突变西妥昔抗体，后重复通法A操作，获得双突变西妥昔抗体。依照通法B完成payload M(DAR＝4)及payload S(DAR＝8)不同毒素ADC的制备编号Cet-8S-4M。
实施例21 Cet-8E-2M制备
以通法A制备得到单突变西妥昔抗体后依照通法B完成payload M(DAR＝2)及payload E (DAR＝8)不同毒素ADC的制备编号Cet-8E-2M。
实施例22 Cet-4M的制备
以通法A制备得到单突变西妥昔抗体，后重复通法A操作，获得双突变西妥昔抗体。依照通法B完成带payload M(DAR＝4)毒素ADC Cet-4M。
实施例23 Cet-8E的制备
将通过初步的纯化后单体率大于95％的西妥昔抗体，使用超滤离心管换液至含有EDTA的磷酸盐缓冲液中，浓度10mg/ml。加入10倍于抗体摩尔分子数的TCEP，室温下反应8h。打开抗体链间二硫键，并用Ellman方法测定游离巯基数，判断二硫键是否全部打开。然后加入10倍于抗体摩尔分子数的payload，室温下反应8h。反应结束后，使用截留分子量为30KDa的超滤离心管换液至PBS中，并去除未偶联的payload。制备得到非定点偶连payload E(DAR＝8)编号Cet-8E。
实施例24 Cet-8S的制备
依实施例23中方法完成制备得到非定点偶连payload E(DAR＝8)编号Cet-8E。
实施例25抗体药物偶联物DAR测定
ADC编号 非定点偶联平均DAR1 定点偶联平均DAR2
Cet-4S-2M 3.81(S) 1.78(M)
Cet-8S-4M 6.35(S) 2.97(M)
Cet-8E-2M 7.54(E) 1.78(M)
Cet-4M -- 3.67(M)
Cet-8S 7.56(S) --
Cet-8E 7.92(E) --
实施例26抗体药物偶联物SEC测定
依照通法对本发明中所述ADC完成SEC测定，数据总结如下表所示，从结果可知，带不同毒素的ADC药物与带单一毒素比较，单体率略有降低。
目标偶联物 单体率
Cet-4S-2M 84.60％
Cet-8S-4M 83.87％
Cet-8E-2M 92.91％
Cet-4M 99.82％
实施例27体外细胞实验
ADC编号 IC50(Fadu)(nm) IC50(A431)(nm)
Cet-8S-2M 1.85 4.23
Cet-8S-4M 1.18 0.15
Cet-8E-2M 200～1000 0.08
Cet-4M 200～1000 0.06
Cet-8S 1.02 8.49
Cet-8E ～200 >1000
实施例28体内药效实验
体外培养人咽鳞癌细胞Fadu，按细胞数量5×106接种于裸鼠背部皮下，待肿瘤长到 70～90mm3后，分组，单次给予ADC药物5mg/kg(尾静脉注射)，同时设溶媒对照组，定期称体重、测量肿瘤体积，通过考察ADC药物的抑瘤疗效等指标，来评价药物对于Fadu模型的药效。结果表明，带不同毒素的ADC药物相比于单一毒素ADC药物具有更好的体内药效。

Claims (17)

1.一种如式I的包括不同药物的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐
其中Ab为抗体部分；
L1、L2为任选的可连接至药物的连接单元；
D1、D2为药物单元；
m、n分别选自2-8的整数。
2.如权利要求1所述的包括不同药物的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐，其特征在于，D1、D2为不同的抗肿瘤药物。
3.如权利要求2所述的抗体药物偶联物，包括不同药物的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐，其特征在于，D1选自微管蛋白结合剂、DNA烷化剂、DNA嵌入剂、酶抑制剂、免疫调控剂、肽或核苷酸。
4.如权利要求2所述的包括不同药物的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐，其特征在于，D2选自微管蛋白结合剂、DNA烷化剂、DNA嵌入剂、酶抑制剂、免疫调控剂、肽或核苷酸。
5.如权利要求1所述包括不同药物的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐，其特征在于，药物D1以定点偶联方式，D2以非定点偶联方式连接至抗体。
6.如权利要求5所述包括不同药物的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐，其特征在于，药物D1的定点偶联方式为定点突变抗体原有氨基酸成为半胱氨酸或通过插入一个半胱氨酸或一段含半胱氨酸的多肽，通过以上方法引入的半胱氨酸巯基与linker-毒素相偶联；D2的非定点偶联方式为通过抗体原有的链间二硫键与linker-毒素相偶联。
7.如权利要求1所述的包括不同药物的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐，其特征在于，m优选为2、4、6、8；n优先为4、6、8。
8.如权利要求1所述的包括不同药物的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐，其特征在于，其特征在于，L1、L2是可裂解连接子或不可裂解连接子。
9.如权利要求1所述的包括不同药物的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐，其特征在于，L1、L2具有下式二：
其中D是丁二酰亚胺或水解开环丁二酰亚胺，C是末端任选的可延伸单元，E为任选的可断裂单元，F为间隔单元，下标e，f为0或1；左侧波浪线表示到抗体巯基的连接位点，右侧波浪线表示到药物单元的连接位点。
10.如权利要求9所述的包括不同药物的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐，其特征在于，可断裂单元E在e＝0时不存在，在e＝1时存在；当存在时，E所述的可断裂单元通过肿瘤相关蛋白酶或酸性PH实现与药物单元D1/D2或间隔单元F间的断裂。
11.如权利要求9所述的包括不同药物的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐，其特征在于，间隔单元F在f＝0时不存在，在f＝1时存在；当F存在时，F选自对氨基苯甲醇或与乙二胺单元及其衍生物组成的组。
12.如权利要求1所述的包括不同药物的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐，其特征在于，其中所述抗体轻链包括kappa或λ同种型。
13.如权利要求1所述的包括不同药物的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐，其特征在于，其中所述抗体重链包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
14.如权利要求12所述的包括不同药物的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐，其特征在于，半胱氨酸定点引入抗体，其中巯基(-SH)能够进行化学偶联。
15.一种包括权利要求1-13中任一项所述的包括不同药物的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的稀释剂运载体或赋形剂的药物组合物。
16.一种权利要求1-13中任一项所述的包括不同药物的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐，治疗肿瘤、自身免疫疾病或感染性疾病的用途。
17.如权利要求16用途，其特征在于，所述的包括不同药物的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐的抗体特异性结合至所述癌症、自身免疫疾病的靶细胞。
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