CN112739386A - 用于dota-预靶向放射免疫疗法的n-乙酰半乳糖氨基树枝状物清除剂 - Google Patents

用于dota-预靶向放射免疫疗法的n-乙酰半乳糖氨基树枝状物清除剂 Download PDF

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Abstract

本公开文本提供了用于治疗癌症的组合物和方法。具体地，本发明技术的组合物包含可用于预靶向放射免疫疗法中的新型清除剂。

Description

用于DOTA-预靶向放射免疫疗法的N-乙酰半乳糖氨基树枝状 物清除剂
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年7月13日提交的美国临时申请号62/697,956的权益和优先权，将其公开内容通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本发明技术总体上涉及包含新型N-乙酰半乳糖氨基树枝状物清除剂的组合物及其在预靶向放射免疫疗法中的使用方法。
政府支持声明
本发明是在由美国国立卫生研究院授予的CA86438下在美国政府支持下完成的。美国政府享有本发明的某些权利。
背景技术
下文提供对本发明技术背景的说明仅仅是为了帮助理解本发明技术，并且不承认所述说明描述或构成针对本发明技术的现有技术。
放射性标记的药剂用作将电离辐射递送至特定疾病部位的媒介物已有50多年(Larson SM.Cancer 67:1253-1260(1991)；Britton KE.Nucl Med Commun.18:992-1007(1997))。已经考虑到大量分子可用于放射性同位素的靶向递送，所述分子包括放射性标记的抗体、抗体片段、替代支架和小分子(Tolmachev V等人Cancer Res.67:2773-2782(2007)；Birchler MT等人,Otolaryngol Head Neck Surg.136:543-548(2007)；Reubi JC,Maecke HR.J Nucl Med.49:1735-1738(2008))。部分地由于次最佳的肿瘤剂量和治疗指数(TI)，使用抗体将毒素靶向至肿瘤，例如用直接缀合的抗体的放射免疫疗法(RIT)一直具有挑战性。此外，由于正常组织的旁观者毒性，剂量递增是不可行的，因此这种疗法导致有限的抗肿瘤效果。此外，抗体在血液中展现出长的半衰期，导致低的肿瘤与背景比率。抗体片段和其他更小的结合支架展现出更快的血液清除，但是导致高的肾脏和/或肝脏摄取。与抗体和抗体片段相比，放射性标记的小分子配体通常展现出更快的血液清除和更低的背景，但是由于对期望靶标的亲和力相对较低，通常会导致特异性差。
在预靶向放射免疫疗法(PRIT)中，施用对肿瘤抗原和小分子半抗原二者均具有特异性的非放射性双功能抗体并允许其定位至一种或多种肿瘤。在所述抗体的充分血液清除后，施用放射性标记的小分子，并且通过预靶向的抗体将其捕获。然而，PRIT系统中使用的许多小肽和金属螯合半抗原展现出显著的全身滞留，这导致不希望的背景活性，从而限制了成像的信号与背景比率；以及促成非特异性放射，从而限制了疗法应用的最大耐受剂量(Orcutt等人,Mol Imaging Biol 13:215-221(2011))。
因此，需要如下新型分子，所述新型分子允许(a)体内实体瘤的高效预靶向放射免疫疗法和(b)从非肿瘤组织快速清除放射性标记的小分子。
发明内容
在一方面，本发明技术提供了一种化合物，所述化合物为
Figure BDA0002966156640000021
Figure BDA0002966156640000031
Figure BDA0002966156640000041
Figure BDA0002966156640000051
或其药学上可接受的盐和/或溶剂化物，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19和X20各自独立地是H或孤对电子(即提供氧阴离子)；Y1、Y2、Y3、Y4和Y5各自独立地是O或S；x是1、2或3；并且y是1、2、3或4。
在本文的任何实施方案中，所述化合物可以是清除剂，所述清除剂为
Figure BDA0002966156640000061
Figure BDA0002966156640000071
Figure BDA0002966156640000081
Figure BDA0002966156640000091
或其药学上可接受的盐和/或溶剂化物，其中M1、M2、M3、M4和M5各自独立地是Lu3+、Sc3+、Ga3+、Y3+、In3+、La3+、Ce3+、Eu3+、Tb3+或Gd3+；X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19和X20各自独立地是H或孤对电子(即提供氧阴离子)；Y1、Y2、Y3、Y4和Y5各自独立地是O或S；x是1、2或3；并且y是1、2、3或4。
在本文的任何实施方案中，M1、M2、M3、M4和M5可以各自独立地不是放射性核素。在本文的任何实施方案中，Y1、Y2、Y3、Y4和Y5可以各自独立地是S。在本文的任何实施方案中，x可以是1或2。在本文的任何实施方案中，y可以是2或3。
在相关方面，提供了一种组合物，所述组合物包含如上所述的化合物的任何实施方案中的一种或多种以及药学上可接受的载体。
在另一方面，本公开文本提供了一种用于在诊断患有癌症的受试者中提高肿瘤对放射疗法的敏感性的方法，所述方法包括(a)向所述受试者施用有效量的抗DOTA双特异性抗体，其中所述抗DOTA双特异性抗体被配置为定位至表达肿瘤抗原靶标的肿瘤；(b)向所述受试者施用有效量的本发明技术的清除剂；以及(c)向所述受试者施用有效量的放射性标记的DOTA半抗原，其中所述DOTA半抗原被配置为与所述抗DOTA双特异性抗体形成复合物。
在另一方面，本公开文本提供了一种用于在有需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括(a)向所述受试者施用有效量的抗DOTA双特异性抗体，其中所述抗DOTA双特异性抗体被配置为定位至表达肿瘤抗原靶标的肿瘤；(b)向所述受试者施用有效量的本发明技术的清除剂；以及(c)向所述受试者施用有效量的放射性标记的DOTA半抗原，其中所述DOTA半抗原被配置为与所述抗DOTA双特异性抗体形成复合物。用于治疗癌症的所述方法还可以包括向所述受试者依次、分开或同时施用选自以下的至少一种化疗剂：氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲、吉西他滨、三氮烯、叶酸类似物、蒽环类药物、紫杉烷、COX-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗生素、酶抑制剂、表鬼臼毒素、铂配位复合物、长春花生物碱、取代的脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、激素拮抗剂、内皮抑素、紫杉醇、喜树碱、SN-38、阿霉素、阿霉素类似物、抗代谢物、烷化剂、抗有丝分裂剂、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂、mTOR抑制剂、热休克蛋白(HSP90)抑制剂、蛋白酶体抑制剂、HDAC抑制剂、促凋亡剂、甲氨蝶呤和CPT-11。
另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，所述肿瘤抗原靶标选自GPA33、HER2/neu、GD2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、MUM-1、CDK4、N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、p15、gp75、β-连环蛋白、ErbB2、癌症抗原125(CA-125)、癌胚抗原(CEA)、RAGE、MART(黑色素瘤抗原)、MUC-1、MUC-2、MUC-3、MUC-4、MUC-5ac、MUC-16、MUC-17、酪氨酸酶、Pmel 17(gp100)、GnT-V内含子V序列(N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V内含子V序列)、前列腺癌psm、PRAME(黑色素瘤抗原)、β-连环蛋白、EBNA(爱泼斯坦-巴尔病毒核抗原)1-6、p53、肺耐药蛋白(LRP)Bcl-2、前列腺特异性抗原(PSA)、Ki-67、CEACAM6、结肠特异性抗原-p(CSAp)、HLA-DR、CD40、CD74、CD138、EGFR、EGP-1、EGP-2、VEGF、PlGF、胰岛素样生长因子(ILGF)、腱生蛋白、血小板源性生长因子、IL-6、CD20、CD19、PSMA、CD33、CD123、MET、DLL4、Ang-2、HER3、IGF-1R、CD30、TAG-72、SPEAP、CD45、L1-CAM、Lewis Y(Ley)抗原、E-钙粘蛋白、V-钙粘蛋白和EpCAM。
另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、脑室内、口服或鼻内施用所述抗DOTA双特异性抗体、所述清除剂和/或所述放射性标记的DOTA半抗原。
另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，所述癌症选自乳腺癌、结直肠癌、宫颈癌、卵巢癌、肝脏癌症、膀胱癌、肝癌、肝细胞癌、脑癌、肺癌、胃部癌症或胃癌、胰腺癌、甲状腺癌、肾脏癌症或肾癌、前列腺癌、黑色素瘤、肉瘤、癌、肾母细胞瘤、子宫内膜癌、胶质母细胞瘤、鳞状细胞癌、星形细胞瘤、唾液腺癌、外阴癌、阴茎癌和头颈癌。所述脑癌可以是垂体腺瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤或颅咽管瘤。
另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，所述放射性标记的DOTA半抗原包含以下中的一种或多种：Proteus-DOTA、S-2-(R-氨基苄基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷四乙酸(DOTA-Bn)、DOTA-Bn-生物素、BAD(((S)-2-(4-(2-溴)-乙酰胺基)-苄基)-DOTA)、NBD((S)-2-(4-硝基苄基)-DOTA)、DOTA-RGD、DOTA-PEG-E(c(RGDyK))2、DOTA-8-AOC-BBN、p-NO2-Bn-DOTA、DOTA-PESIN、DOTA-生物素-肌氨酸(DOTA-生物素)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸单(N-羟基琥珀酰亚胺酯)(DOTA-NHS)或DOTATyrLysDOTA。所述放射性标记的DOTA半抗原可以用选自以下的放射性核素标记：213Bi、211At、225Ac、152Dy、212Bi、223Ra、219Rn、215Po、211Bi、221Fr、217At、255Fm、86Y、90Y、89Sr、165Dy、186Re、188Re、177Lu、67Cu、111In、67Ga、51Cr、58Co、99mTc、103mRh、195mPt、119Sb、161Ho、189mOs、192Ir、201Tl、203Pb、68Ga、227Th和64Cu。
另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，在施用所述放射性标记的DOTA半抗原后4至24小时之间检测由放射性标记的DOTA半抗原-抗DOTA双特异性抗体复合物发射的放射性水平。所述复合物发射的放射性水平可以表示为每克组织的注射剂量百分比(％ID/g)。参考值可通过如下方法来计算：测量存在于非肿瘤(正常)组织中的放射性水平，并且计算存在于非肿瘤(正常)组织中的平均放射性水平±标准差。在一些实施方案中，所述参考值是标准摄取值(SUV)。参见Thie JA,J Nucl Med.45(9):1431-4(2004)。可以通过计算曲线下面积(AUC)肿瘤:AUC正常组织比率来确定这种复合物的治疗有效性。在一些实施方案中，所述复合物的AUC肿瘤:AUC正常组织比率为约2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1或100:1。另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，肿瘤与正常组织之间的放射性水平的比率为约2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1或100:1。
本文还公开了含有适合于在患者中治疗癌症的组分的试剂盒。在一方面，所述试剂盒包含本发明技术的清除剂和使用说明书。本发明技术的试剂盒还可以包含至少一种抗DOTA BsAb和/或任选地用一种或多种放射性核素标记的DOTA半抗原。合适的放射性核素的例子包括但不限于213Bi、211At、225Ac、152Dy、212Bi、223Ra、219Rn、215Po、211Bi、221Fr、217At、255Fm、86Y、90Y、89Sr、165Dy、186Re、188Re、177Lu、67Cu、111In、67Ga、51Cr、58Co、99mTc、103mRh、195mPt、119Sb、161Ho、189mOs、192Ir、201Tl、203Pb、68Ga、227Th和64Cu。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述至少一种抗DOTA BsAb与选自以下的肿瘤抗原靶标结合：GPA33、HER2/neu、GD2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、MUM-1、CDK4、N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、p15、gp75、β-连环蛋白、ErbB2、癌症抗原125(CA-125)、癌胚抗原(CEA)、RAGE、MART(黑色素瘤抗原)、MUC-1、MUC-2、MUC-3、MUC-4、MUC-5ac、MUC-16、MUC-17、酪氨酸酶、Pmel 17(gp100)、GnT-V内含子V序列(N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V内含子V序列)、前列腺癌psm、PRAME(黑色素瘤抗原)、β-连环蛋白、EBNA(爱泼斯坦-巴尔病毒核抗原)1-6、p53、肺耐药蛋白(LRP)Bcl-2、前列腺特异性抗原(PSA)、Ki-67、CEACAM6、结肠特异性抗原-p(CSAp)、HLA-DR、CD40、CD74、CD138、EGFR、EGP-1、EGP-2、VEGF、PlGF、胰岛素样生长因子(ILGF)、腱生蛋白、血小板源性生长因子、IL-6、CD20、CD19、PSMA、CD33、CD123、MET、DLL4、Ang-2、HER3、IGF-1R、CD30、TAG-72、SPEAP、CD45、L1-CAM、Lewis Y(Ley)抗原、E-钙粘蛋白、V-钙粘蛋白和EpCAM。
附图说明
图1显示了本文公开的清除剂对体内循环131I-BsAb的影响。向正常无胸腺(无肿瘤)小鼠在t＝0时静脉内注射131I-BsAb(19-21μCi；250μg，1.19nmol)，然后在t＝24小时时静脉内注射媒介物(盐水)或树枝状物清除剂(25μg；2.76nmol)。在t＝1-28小时的各个时间点进行连续血液采样。数据呈现为平均值±均值的标准误差。
图2显示了用本发明技术的清除剂CCA-16-DOTA-Y3+实现的肿瘤预靶向结果。
图3显示了CCA-16-DOTA-Y3+对肿瘤摄取的剂量依赖性影响。与25μg组相比，**P<0.01。
图4显示了用本发明技术的清除剂的实施方案与没有清除剂(媒介物)以及用500kD葡聚糖-DOTA半抗原缀合物清除剂相比所实现的肿瘤预靶向结果的比较。
图5(A)显示了在注射后24h时在携带SW1222肿瘤的无胸腺裸鼠组中示踪剂预靶向的[225Ac]Proteus-DOTA(n＝3)或[111In]Proteus-DOTA(n＝5)的生物分布的比较。在静脉内(经由侧尾静脉)注射huA33-C825抗体(0.25mg，1.19nmol)、清除剂和放射性标记的DOTA-半抗原后，24h后对动物实施安乐死以进行器官收集和放射活性测定。*P<0.05，***P<0.001。数据呈现为均值±SEM。
图5(B)显示了预靶向的放射性标记的DOTA半抗原在注射后24h时的绝对肿瘤摄取，绘制为施用的示踪剂的摩尔量的函数；对于每个数据点，n＝1-7。
图6(A)显示了在注射172pmol/1.67MBq[45μCi]的[111In]Proteus-DOTA(n＝4)或790pmol/7.66MBq[207μCi]的[111In]Proteus-DOTA(n＝1)的动物中实现的肿瘤预靶向结果。
图6(B)显示了用抗GPA33-DOTA-PRIT进行[225Ac]Proteus-DOTA和[111In]Proteus-DOTA预靶向的统计比较。
图7显示了在携带SW1222人结直肠癌(CRC)肿瘤的无胸腺裸鼠中注射预靶向的[111In]Proteus-DOTA后大约24h时的SPECT/CT图像。SW1222异种移植物可以在侧腹中清楚地描绘出。对肿瘤、肾脏(左侧)、心脏和肝脏的基于图像的目的区域分析揭示了活性浓度(表示为平均值±1SD；每克的注射剂量百分比)分别为6.89±4.68、0.46±0.47、0.20±0.24和0.22±0.27。
图8显示了Proteus-DOTA的结构(化学式：C50H80LuN11O19S3-；精确质量：1345.48；分子量：1346.28)。所述分子的加框部分是非放射性苄基-DOTA(Lu)半抗原，其以Kd＝10pM被抗DOTA-半抗原抗体单链可变片段C825识别。所述分子的空三臂DOTA部分可以容纳与疗法和/或成像相关的多种放射性金属，包括225Ac、68Ga和64Cu。
图9显示了在用huA33-C825(0.25mg/小鼠)和树枝状物清除剂CCA-16-DOTA-Y3+(25μg；2.76nmol)和3.7MBq(20pmol)的177Lu-氨基苄基DOTA([177Lu]LuDOTA-Bn)进行PRIT后，使用生物分布测定确定的肿瘤和多种正常组织中的177Lu活性。n＝5只动物/组；数据呈现为％ID/g，平均值±1SD。
图10显示了在注射huA33-C825 PRIT+[177Lu]LuDOTA-Bn(3.7MBq,20pmol)与树枝状物清除剂CCA-16-DOTA-Y3+(25μg；2.76nmol)之后1至48小时，SW1222肿瘤以及选择的正常组织的经衰减校正的177Lu活性生物分布曲线。数据呈现为％ID/g，平均值±1SD。
图11显示了在携带皮下GPA33(+)SW1222肿瘤的裸鼠中对于预靶向采用树枝状物清除剂CCA-16-DOTA-Y3+的[177Lu]LuDOTA-Bn抗GPA33-DOTA-PRIT的吸收剂量。治疗指数定义为估计的肿瘤/正常组织吸收剂量比率。
具体实施方式
应理解，下文以不同详细程度描述了本发明方法的某些方面、模式、实施方案、变化形式和特征，以提供对本发明技术的实质理解。
在实践本发明方法时，使用了分子生物学、蛋白质生物化学、细胞生物学、微生物学和重组DNA中的许多常规技术。参见例如，Sambrook和Russell编辑(2001)MolecularCloning:A Laboratory Manual,第3版；Ausubel等人编辑(2007)Current Protocols inMolecular Biology丛书；Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.,纽约州)丛书；MacPherson等人(1991)PCR 1:A Practical Approach(IRL Press at Oxford UniversityPress)；MacPherson等人(1995)PCR 2:A Practical Approach；Harlow和Lane编辑(1999)Antibodies,A Laboratory Manual；Freshney(2005)Culture of Animal Cells:A Manualof Basic Technique,第5版；Gait编辑(1984)Oligonucleotide Synthesis；美国专利号4,683,195；Hames和Higgins编辑(1984)Nucleic Acid Hybridization；Anderson(1999)Nucleic Acid Hybridization；Hames和Higgins编辑(1984)Transcription andTranslation；Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press(1986))；Perbal(1984)APractical Guide to Molecular Cloning；Miller和Calos编辑(1987)Gene TransferVectors for Mammalian Cells(Cold Spring Harbor Laboratory)；Makrides编辑(2003)Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells；Mayer和Walker编辑(1987)Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(Academic Press,伦敦)；以及Herzenberg等人编辑(1996)Weir’s Handbook of Experimental Immunology。
清除剂(CA)是这样一类化合物，其被设计为在将放射性同位素预靶向至肿瘤抗原期间从循环中快速去除靶向生物分子。基于葡聚糖的清除剂通常用于高治疗指数的基于DOTA的预靶向放射免疫疗法(DOTA PRIT)。尽管作为清除剂支架非常有效，但由于其固有的多分散性和体内酶促降解的动力学，葡聚糖带来了给药挑战。
本文公开的DOTA-PRIT平台需要三步预靶向策略，包括施用(1)IgG-单链可变片段(scFv)双特异性抗体构建体(IgG-scFv)，其包含对抗肿瘤抗原抗体(IgG部分)和抗DOTA-半抗原单链可变片段scFv(例如，“C825”)具有高亲和力的抗体序列；(2)本发明技术的清除剂，其用于在给予足够的时间使BsAb积聚在抗原阳性肿瘤后快速降低循环BsAb；和(3)放射性标记的DOTA半抗原组合物(例如，177Lu-DOTA-Bn)。
本发明技术的组合物包含可用于PRIT(例如，α粒子放射免疫疗法)的新型N-乙酰半乳糖氨基树枝状物清除剂。本文公开的清除剂组合物在DOTA-PRIT期间展现出增强的DOTA-PRIT放射性标记的双特异性抗体(BsAb)的血液清除并改善治疗指数(TI)。例如，在施用单剂量的过量的本发明技术的树枝状物清除剂(注射的131I-BsAb与CA的摩尔比为1:2.3)的5分钟内，血液中的131I活性下降64％，从基线的6.7％ID/g下降至2.4％ID/g。在人结直肠癌的小鼠异种移植模型中的DOTA-PRIT研究显示出在注射177Lu活性后24小时177Lu-DOTA-Bn的CA剂量依赖性肿瘤与血液摄取比率(例如，对于0μg(媒介物)、15μg或20μg的树枝状物CA，平均肿瘤与血液比率分别为2.9、26和59)。25μg剂量的树枝状物CA导致的平均肿瘤与血液比率为76，与先前优化的葡聚糖CA给药(平均肿瘤与血液比率为77)几乎相同。总而言之，这些结果表明，本发明技术的树枝状物清除剂适用于高TIDOTA-PRIT。
定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科技术语通常均具有与本发明技术所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。如在本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一种/一个”(“a”)、“一种/一个”(“an”)和“所述”(“the”)包括复数指示物，除非上下文另外明确规定。例如，对“一种/一个细胞”的提及包括两种/个或更多种/个细胞的组合，等等。通常，本文所用的命名和下文所述的细胞培养、分子遗传学、有机化学、分析化学和核酸化学和杂交中的实验室程序是本领域中熟知的和常用的那些。
如本文所用，关于数字的术语“约”通常视为包括落在所述数字任一方向(大于或小于)的1％、5％或10％范围内的数字，除非上下文另外说明或另外明显(这样的数字低于可能值的0％或超过可能值的100％的情况除外)。
本文所述的化合物的药学上可接受的盐在本发明技术的范围内，并且包括保留所需的药理活性并且不是生物学上不希望的酸或碱加成盐(例如，所述盐没有过度毒性、致敏性或刺激性，并且是可生物利用的)。当本发明技术的化合物具有碱性基团(例如像氨基)时，药学上可接受的盐可以是用如下酸形成：无机酸(如盐酸、氢硼酸、硝酸、硫酸和磷酸)、有机酸(例如，海藻酸、甲酸、乙酸、苯甲酸、葡萄糖酸、富马酸、草酸、酒石酸、乳酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、甲磺酸、苯磺酸、萘磺酸和对甲苯磺酸)或酸性氨基酸(如天冬氨酸和谷氨酸)。当本发明技术的化合物具有酸性基团(例如像羧酸基团)时，它可以用以下形成盐：金属(如碱金属和碱土金属(例如，Na+、Li+、K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+))、氨或有机胺(例如，二环己胺、三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺)或碱性氨基酸(例如，精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸)。可以在化合物的分离和纯化期间原位制备此类盐，或者通过分开地使经纯化的化合物(以其游离碱或游离酸形式)分别与合适的酸或碱反应，并且分离由此形成的盐来制备此类盐。
如本文所用，向受试者“施用”药剂或药物包括向受试者引入或递送化合物以执行其预期功能的任何途径。施用可以通过任何合适的途径进行，所述途径包括口服、鼻内、肠胃外(静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下)、直肠或局部。施用包括自我施用和由另一个人施用。
如本文所用，术语“抗体”共同地指代免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子，包括例如但不限于IgA、IgD、IgE、IgG和IgM、其组合、以及在任何脊椎动物中例如在哺乳动物(如人、山羊、兔和小鼠)以及非哺乳动物物种中在免疫应答期间产生的类似分子(如鲨鱼免疫球蛋白)。如本文所用，“抗体”(包括“完整免疫球蛋白”)和“抗原结合片段”与目的分子(或一组高度类似的目的分子)特异性地结合，而基本上排除与其他分子的结合(例如，对目的分子的结合常数是对生物样品中的其他分子的结合常数的约103M-1倍、约104M-1倍或约105M-1倍的抗体和抗体片段)。术语“抗体”还包括基因工程化形式如嵌合抗体(例如，人源化鼠抗体)、异源缀合抗体(如双特异性抗体)。还参见Pierce Catalog和Handbook,1994-1995(Pierce Chemical Co.,伊利诺伊州罗克福德)；Kuby,J.,Immunology,第3版,W.H.Freeman&Co.,纽约,1997。
更具体地，抗体是指特异性地识别并结合抗原表位的至少包含轻链免疫球蛋白可变区或重链免疫球蛋白可变区的多肽配体。抗体由重链和轻链构成，它们各自具有可变区，称为重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区。VH区和VL区共同负责结合由抗体识别的抗原。通常，免疫球蛋白具有通过二硫键相互连接的重(H)链和轻(L)链。有两种类型的轻链，即λ(lambda)和κ(kappa)。有五种主要的重链类别(或同种型)：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，它们决定了抗体分子的功能活性。每条重链和轻链均含有恒定区和可变区(所述区域也称为“结构域”)。组合起来，重链可变区和轻链可变区特异性地结合抗原。轻链可变区和重链可变区含有被三个高变区(也称为“互补决定区”或“CDR”)打断的“框架”区。已经定义了框架区和CDR的范围(参见Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of Health and Human Services,1991，将其通过引用特此并入)。Kabat数据库目前在线上维护。不同轻链或重链的框架区的序列在物种内相对保守。抗体的框架区(即组成性轻链和重链的组合框架区)主要采用β-折叠构象，并且CDR形成连接β-折叠结构的环，并且在一些情况下所述环形成β-折叠结构的一部分。因此，框架区起到形成支架的作用，所述支架通过链间非共价相互作用使CDR以正确取向定位。
CDR主要负责与抗原表位的结合。每条链的CDR通常称为CDR1、CDR2和CDR3，从N末端开始依次编号，并且通常还依据其中定位特定CDR的链来标识。因此，VH CDR3位于发现它所在的抗体的重链的可变结构域中，而VL CDR1是来自发现它所在的抗体的轻链的可变结构域的CDR1。结合靶蛋白(例如，GPA33)或分子(例如，DOTA或DOTA半抗原)的抗体将具有特异性VH区和VL区序列，因此具有特异性CDR序列。具有不同特异性(即，针对不同抗原的不同结合位点)的抗体具有不同的CDR。尽管CDR因抗体而异，但CDR内仅有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。CDR内的这些位置称为特异性决定残基(SDR)。抗体的例子包括单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、多特异性抗体、双特异性抗体和抗体片段。抗体与抗原特异性地结合。
“双特异性抗体”是可以同时与两种不同抗原结合的抗体。双特异性抗体(BsAb)和双特异性抗体片段(BsFab)可以具有与例如肿瘤相关抗原(例如，GPA33)特异性地结合的至少一个臂和与携带治疗剂或诊断剂的可靶向缀合物(例如，与放射性核素缔合的DOTA半抗原)特异性地结合的至少另一个臂。多种不同的双特异性抗体结构是本领域已知的。在一些实施方案中，双特异性抗体中的每个结合部分包含来自不同单克隆抗体的VH和/或VL区。在一些实施方案中，所述双特异性抗体包含免疫球蛋白分子，其具有含有来自第一单克隆抗体的CDR的VH和/或VL区；和抗体片段(例如，Fab、F(ab')、F(ab')2、Fd、Fv、dAB、scFv等)，其具有含有来自第二单克隆抗体的CDR的VH和/或VL区。
如本文所用，术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包含在同一多肽链中与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)(VH VL)。通过使用过短而不允许在同一链上的两个结构域之间配对的接头，迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对，并且产生两个抗原结合位点。双抗体更全面地描述于例如EP 404,097；WO93/11161；和30Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中。
如本文所用，术语“单链抗体”或“单链Fv(scFv)”是指Fv片段的两个结构域VL和VH的抗体融合分子。单链抗体分子可以包含具有多个单独分子的聚合物，例如二聚体、三聚体或其他聚合物。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头来连接，从而使得它们能够成为单条蛋白质链，在其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv))。Bird等人(1988)Science 242:423-426和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad Sci.USA 85:5879-5883。此类单链抗体可以通过重组技术或完整抗体的酶促切割或化学切割来制备。
如本文所用，术语“完整抗体”或“完整免疫球蛋白”意指具有通过二硫键相互连接的至少两个重(H)链多肽和两个轻(L)链多肽的抗体或免疫球蛋白。每条重链由重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3构成。每条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区可以进一步细分为具有高变性的区域，称为互补决定区(CDR)，散布有更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。
如本文所用，“抗原”是指抗体可以选择性地结合的分子。所述靶抗原可以是蛋白质(例如，抗原肽)、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其他天然存在或合成的化合物。也可以向动物受试者施用抗原以在所述受试者中产生免疫应答。
如本文所用，术语“抗原结合片段”是指整个免疫球蛋白结构的片段，其具有多肽中负责与抗原结合的一部分。可用于本发明技术的抗原结合片段的例子包括scFv、(scFv)2、scFvFc、Fab、Fab′和F(ab′)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
“结合亲和力”意指分子(例如，抗体)的单个结合位点与所述分子的结合配偶体(例如，抗原)之间的总非共价相互作用的强度。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(Kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的标准方法(包括本文所述的那些)测量。低亲和力复合物含有通常倾向于容易从抗原解离的抗体，而高亲和力复合物含有通常倾向于更长时间地保持与抗原结合的抗体。
如本文所用，“清除剂”是与存在于受试者血液隔室中的过量双功能抗体结合以促进经由肾脏的快速清除的药剂。在施用基于DOTA的放射治疗剂之前使用所述清除剂促进PRIT系统中更好的肿瘤与背景比率。
如本文所用，“对照”是实验中出于比较目的使用的替代样品。对照可以是“阳性的”或“阴性的”。例如，在实验目的是确定用于治疗特定类型疾病或病症的治疗剂的功效相关性的情况下，通常采用阳性对照(已知展现出所需治疗效果的化合物或组合物)和阴性对照(不接受疗法或接受安慰剂的受试者或样品)。
如本文所用，术语组合物的“有效量”是足以实现所需预防或治疗效果的量，例如导致与所治疗的疾病(例如，与靶多肽相关的疾病或医学病症(例如，乳腺癌、结直肠癌、脑癌等))相关的症状减少的量。向受试者施用的本发明技术的组合物的量将取决于所述疾病的程度、类型和严重性以及个体的特征，如总体健康、年龄、性别、体重和对药物的耐受性。技术人员将能够根据这些和其他因素确定适当的剂量。也可以将本发明技术的组合物与一种或多种另外的治疗化合物组合施用。
如本文所用，术语“表位”意指能够与抗体特异性地结合的抗原决定簇。表位通常由分子的化学活性表面基团组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。
如本文所用，术语“样品”是指从受试者获得的临床样品或分离的微生物。在某些实施方案中，从生物来源获得样品(即，“生物样品”)，如从受试者收集的组织、体液或微生物。样品来源包括但不限于粘液、痰液、支气管肺泡灌洗液(BAL)、支气管洗涤液(BW)、全血、体液、脑脊液(CSF)、尿液、血浆、血清或组织。
如本文所用，术语“分开”治疗使用是指通过不同途径同时或基本上同时施用至少两种活性成分。
如本文所用，术语“依次”治疗使用是指在不同时间施用至少两种活性成分，施用途径相同或不同。更具体地，依次使用是指一种活性成分的整个施用在另外一种或多种活性成分的施用开始之前。因此，可以在施用另外一种或多种活性成分之前几分钟、几小时或几天内施用一种活性成分。在这种情况下，没有同时治疗。
如本文所用，术语“同时”治疗使用是指通过相同途径并且同时或基本上同时施用至少两种活性成分。
如本文所用，“特异性地结合”是指分子(例如，抗体)识别并结合另一个分子(例如，抗原)，但是基本上不识别并结合其他分子。如本文所用，术语“特异性结合”特定分子(例如，抗原或抗原上的表位)、与所述特定分子“特异性地结合”或对所述特定分子具有“特异性”可以例如通过分子对其所结合的分子的Kd为约10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M来展现。
如本文所用，术语“受试者”、“个体”或“患者”可互换使用，并且是指单个生物体、脊椎动物、哺乳动物或人。在某些实施方案中，所述个体、患者或受试者是人。
如本文所用，术语“治疗剂”旨在意指当以有效量存在时对有需要的受试者产生所需治疗效果的化合物。
如本文所用的“治疗”(“treating”或“treatment”)涵盖治疗受试者如人的本文所述疾病或障碍，并且包括：(i)抑制疾病或障碍，即阻止其发展；(ii)缓解疾病或障碍，即引起所述障碍的消退；(iii)减缓所述障碍的进展；和/或(iv)抑制、缓解或减缓所述疾病或障碍的一种或多种症状的进展。“治疗癌症”意指与所述癌症相关的症状例如被缓和、减轻、治愈或处于缓解状态。
还应理解，如本文所述的疾病的各种治疗方式旨在意指“基本上的”，其包括完全治疗但也不到完全治疗，并且其中获得了一些生物学上或医学上相关的结果。所述治疗可以是针对慢性疾病的连续延长治疗，或者是针对急性病症治疗的单次或几次施用。
在预靶向放射免疫疗法(PRIT)中使用清除剂
放射免疫疗法(RIT)的治疗指数(TI)应该最大化以有效治疗实体瘤(Larson SM等人,Nature Reviews Cancer 15:347-60(2015))。用放射性标记的IgG抗体进行RIT由于IgG载体的缓慢药代动力学而具有低TI，因此在可耐受的剂量下通常无效。
替代方案是使用针对RIT的预靶向方法(PRIT)。在PRIT期间，缓慢的抗体介导的肿瘤靶向步骤与放射性的施用是分开的。预靶向是解决靶向肿瘤的抗体的缓慢血液清除的多步骤过程，所述缓慢血液清除促成了对正常组织(如骨髓)的不希望的毒性。在预靶向时，将放射性核素或其他诊断剂或治疗剂附接至具有更有利的药代动力学的载体(例如，具有快速肾脏清除以及低的正常组织摄取和全身清除的低分子量化合物(Orcutt KD等人,Molecular imaging and biology 13:215-21(2011))，如DOTA-半抗原)，并且在靶向肿瘤的同时使正常组织的剂量最小化。为了将放射性靶向至肿瘤，循环治疗剂(例如，DOTA-半抗原)被肿瘤内定位的BsAb捕获或以其他方式经由肾脏途径被有效清除。
清除剂可以通过在循环中形成大的复合物来快速降低循环生物分子的浓度，所述大的复合物被网状内皮系统(RES)识别或使用适当的糖半抗原靶向肝去唾液酸糖蛋白受体(ASPGR)(Rossin R等人,Journal Nuclear Medicine 54:1989-95(2013))。DOTA-PRIT的TI根据清除剂给药而高度可变，因为循环BsAb保留结合放射性标记的DOTA半抗原的能力。为了使放射性标记的DOTA半抗原的肿瘤靶向最大化，通常使用饱和剂量的BsAb，以确保最大浓度的抗DOTA抗体结构域用于结合随后施用的放射性标记的DOTA半抗原。这一步骤带来了挑战，即在施用细胞毒性放射性标记的DOTA半抗原之前去除过量的循环未结合BsAb以最大化TI。尽管可以使用长时间间隔以允许BsAb的内源性清除，但这可能影响在肿瘤处BsAb对放射性半抗原的结合能力，因为根据BsAb-抗原复合物的分子药理学，BsAb可能降解和/或内化。
500kD葡聚糖-DOTA半抗原缀合物(Orcutt KD等人,Molecular CancerTherapeutics 11:1365-72(2012))先前已用于基于DOTA的癌胚抗原的预靶向。葡聚糖CA被设计为经由展示在葡聚糖支架上的DOTA(Y)部分与循环BsAb的抗DOTA(M)-scFv结构域结合，并且经由网状内皮系统(RES)的识别和分解代谢从血液中去除未结合的BsAb。由于其巨大的尺寸，葡聚糖CA与肿瘤相关BsAb的结合因不佳的肿瘤内溢出而受到限制
尽管高度有效，但葡聚糖CA的使用具有缺点。作为天然存在的葡萄糖聚合物，葡聚糖支架固有地是多分散的，因此带来了与可重复的批量生产和体内使用有关的挑战。此外，RES葡聚糖-1,6-葡糖苷酶进行的酶促降解可能导致其半抗原片段被引入循环中，从而可能与放射性半抗原竞争被肿瘤-BsAb结合。在临床链霉亲和素-生物素PRIT期间，在基于白蛋白的CA的情况下也发现了类似的问题(Knox SJ等人,Clinical Cancer Research 6:406-14(2000)；Breitz HB等人,Journal Nuclear Medicine 41:131-40(2000))。
本发明技术的组合物
在一方面，本发明技术提供了化合物，所述化合物为
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或其药学上可接受的盐和/或溶剂化物，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19和X20各自独立地是H或孤对电子(即提供氧阴离子)；Y1、Y2、Y3、Y4和Y5各自独立地是O或S；x是1、2或3；并且y是1、2、3或4。
在本文的任何实施方案中，所述化合物可以是清除剂(在本文中也称为本发明技术的“树枝状物清除剂”、本发明技术的“树枝状物CA”等)，所述清除剂为
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或其药学上可接受的盐和/或溶剂化物，其中M1、M2、M3、M4和M5各自独立地是Lu3+、Sc3+、Ga3+、Y3+、In3+、La3+、Ce3+、Eu3+、Tb3+或Gd3+；X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19和X20各自独立地是H或孤对电子(即提供氧阴离子)；Y1、Y2、Y3、Y4和Y5各自独立地是O或S；x是1、2或3；并且y是1、2、3或4。
在本文的任何实施方案中，M1、M2、M3、M4和M5可以各自独立地不是放射性核素。在本文的任何实施方案中，Y1、Y2、Y3、Y4和Y5可以各自独立地是S。在本文的任何实施方案中，x可以是1或2。在本文的任何实施方案中，y可以是2或3。
在相关方面，提供了组合物，所述组合物包含如上所述的化合物的任何实施方案中的一种或多种以及药学上可接受的载体(除非使用更具体的术语，否则此类载体、赋形剂、填充剂等将统称为“药学上可接受的载体”)。所述组合物可以用于本文所述的方法和成像中。本发明技术还提供了药物组合物和药物，所述药物组合物和药物包含如上所述的化合物的任何实施方案中的一种或多种和药学上可接受的载体。此类药物组合物可以包装在单位剂型中。所述药物组合物和药物可以通过如下方法来制备：将本发明技术的一种或多种化合物、其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物与药学上可接受的载体、赋形剂、粘结剂、稀释剂等混合。此类组合物可以例如呈以下形式：颗粒、粉末、片剂、胶囊、糖浆、栓剂、注射剂、乳剂、酏剂、混悬剂或溶液。本发明组合物可以被配制用于多种施用途径，例如通过口服、肠胃外或直肠施用。肠胃外或全身施用包括但不限于皮下、静脉内、腹膜内和肌肉内注射。以下剂型是作为例子给出的，而不应该解释为限制本发明技术。
对于口服、经颊和舌下施用，粉末、混悬剂、颗粒、片剂、丸剂、胶囊、软胶囊和囊片作为固体剂型是可接受的。这些可以例如通过如下方法来制备：将本发明技术的一种或多种化合物或其药学上可接受的盐或互变异构体与至少一种添加剂(如淀粉或其他添加剂)混合。合适的添加剂是蔗糖、乳糖、纤维素糖、甘露醇、麦芽糖醇、葡聚糖、淀粉、琼脂、海藻酸盐、几丁质、壳聚糖、果胶、黄芪胶、阿拉伯胶、明胶、胶原蛋白、酪蛋白、白蛋白、合成或半合成聚合物或甘油酯。任选地，口服剂型可以含有有助于施用的其他成分，如惰性稀释剂、或润滑剂(如硬脂酸镁)、或防腐剂(如对羟基苯甲酸酯或山梨酸)、或抗氧化剂(如抗坏血酸、生育酚或半胱氨酸)、崩解剂、粘结剂、增稠剂、缓冲剂、甜味剂、调味剂或香料。片剂和丸剂可以用本领域已知的合适包衣材料进一步处理。
用于口服施用的液体剂型可以呈以下形式：药学上可接受的乳剂、糖浆、酏剂、混悬剂和溶液，其可以含有惰性稀释剂(如水)。可以使用无菌液体(如但不限于油、水、醇和这些的组合)将药物配制品和药物制备成液体混悬剂或溶液。可以添加药学上合适的表面活性剂、助悬剂、乳化剂用于口服或肠胃外施用。
如上所述，混悬剂可以包括油。此类油包括但不限于花生油、芝麻油、棉籽油、玉米油和橄榄油。混悬剂制剂还可以含有脂肪酸酯，如油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、脂肪酸甘油酯和乙酰化脂肪酸甘油酯。混悬剂配制品可以包含醇，如但不限于乙醇、异丙醇、十六醇、丙三醇和丙二醇。醚(如但不限于聚(乙二醇)、石油烃(如矿物油和矿脂))和水也可以用于混悬剂配制品中。
可注射剂型通常包括水性混悬剂或油混悬剂，其可以使用合适的分散剂或润湿剂和助悬剂来制备。可注射形式可以在溶液相中或呈用溶剂或稀释剂制备的混悬剂的形式。可接受的溶剂或媒介物包括无菌水、林格氏溶液或等渗水性盐溶液。等渗溶液将被理解为与受试者是等渗的。可替代地，可以将无菌油用作溶剂或助悬剂。通常，所述油或脂肪酸是非挥发性的，包括天然或合成油、脂肪酸、单甘油酯、二甘油酯或三甘油酯。
对于注射，所述药物配制品和/或药物可以是适合于用如上所述的适当溶液重构的粉末。这些的例子包括但不限于冷冻干燥、旋转干燥或喷雾干燥的粉末、无定形粉末、颗粒、沉淀物或微粒。对于注射，所述配制品可以任选地含有稳定剂、pH调节剂、表面活性剂、生物利用度调节剂和这些的组合。
除了上述那些代表性剂型之外，药学上可接受的赋形剂和载体是本领域技术人员通常已知的，因此被包括在本发明技术中。此类赋形剂和载体描述于例如“RemingtonsPharmaceutical Sciences”Mack Pub.Co.,新泽西州(1991)中，将其通过引用并入本文。
如下所述，本发明技术的配制品可以被设计为短效、快速释放、长效和持续释放。因此，所述药物配制品也可以被配制用于控制释放或缓慢释放。
本发明组合物还可以包含例如胶束或脂质体、或一些其他胶囊化形式，或者可以以延长释放的形式施用以提供延长的储存和/或递送作用。因此，可以将所述药物配制品和药物压缩成微丸或圆柱体，并且作为贮库型注射剂或作为植入物(如支架)肌肉内或皮下植入。此类植入物可以采用已知的惰性材料，如硅酮和可生物降解的聚合物。
可以根据受试者的疾病状况、年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食，药物的剂量间隔、施用途径、排泄率和组合来调节具体剂量。含有有效量的任何上述剂型都完全在常规实验的范围之内，因此也完全在本发明技术的范围之内。
本发明技术的治疗方法
在一方面，本公开文本提供了用于在诊断患有癌症的受试者中提高肿瘤对放射疗法的敏感性的方法，所述方法包括(a)向所述受试者施用有效量的抗DOTA双特异性抗体，其中所述抗DOTA双特异性抗体被配置为定位至表达肿瘤抗原靶标的肿瘤；(b)向所述受试者施用有效量的本发明技术的清除剂；以及(c)向所述受试者施用有效量的放射性标记的DOTA半抗原，其中所述DOTA半抗原被配置为与所述抗DOTA双特异性抗体形成复合物。
在另一方面，本公开文本提供了用于在有需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括(a)向所述受试者施用有效量的抗DOTA双特异性抗体，其中所述抗DOTA双特异性抗体被配置为定位至表达肿瘤抗原靶标的肿瘤；(b)向所述受试者施用有效量的本发明技术的清除剂；以及(c)向所述受试者施用有效量的放射性标记的DOTA半抗原，其中所述DOTA半抗原被配置为与所述抗DOTA双特异性抗体形成复合物。用于治疗癌症的所述方法还可以包括向所述受试者依次、分开或同时施用选自以下的至少一种化疗剂：氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲、吉西他滨、三氮烯、叶酸类似物、蒽环类药物、紫杉烷、COX-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗生素、酶抑制剂、表鬼臼毒素、铂配位复合物、长春花生物碱、取代的脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、激素拮抗剂、内皮抑素、紫杉醇、喜树碱、SN-38、阿霉素、阿霉素类似物、抗代谢物、烷化剂、抗有丝分裂剂、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂、mTOR抑制剂、热休克蛋白(HSP90)抑制剂、蛋白酶体抑制剂、HDAC抑制剂、促凋亡剂、甲氨蝶呤和CPT-11。
另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，在施用所述放射性标记的DOTA半抗原后4至24小时之间检测由放射性标记的DOTA半抗原-抗DOTA双特异性抗体复合物发射的放射性水平。所述复合物发射的放射性水平可以表示为每克组织的注射剂量百分比(％ID/g)。参考值可通过如下方法来计算：测量存在于非肿瘤(正常)组织中的放射性水平，并且计算存在于非肿瘤(正常)组织中的平均放射性水平±标准差。在一些实施方案中，所述参考值是标准摄取值(SUV)。参见Thie JA,J Nucl Med.45(9):1431-4(2004)。可以通过计算曲线下面积(AUC)肿瘤:AUC正常组织比率来确定这种复合物的治疗有效性。在一些实施方案中，所述复合物的AUC肿瘤:AUC正常组织比率为约2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1或100:1。另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，肿瘤与正常组织之间的放射性水平的比率为约2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1或100:1。
另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，所述肿瘤抗原靶标选自GPA33、HER2/neu、GD2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、MUM-1、CDK4、N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、p15、gp75、β-连环蛋白、ErbB2、癌症抗原125(CA-125)、癌胚抗原(CEA)、RAGE、MART(黑色素瘤抗原)、MUC-1、MUC-2、MUC-3、MUC-4、MUC-5ac、MUC-16、MUC-17、酪氨酸酶、Pmel 17(gp100)、GnT-V内含子V序列(N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V内含子V序列)、前列腺癌psm、PRAME(黑色素瘤抗原)、β-连环蛋白、EBNA(爱泼斯坦-巴尔病毒核抗原)1-6、p53、肺耐药蛋白(LRP)Bcl-2、前列腺特异性抗原(PSA)、Ki-67、CEACAM6、结肠特异性抗原-p(CSAp)、HLA-DR、CD40、CD74、CD138、EGFR、EGP-1、EGP-2、VEGF、PlGF、胰岛素样生长因子(ILGF)、腱生蛋白、血小板源性生长因子、IL-6、CD20、CD19、PSMA、CD33、CD123、MET、DLL4、Ang-2、HER3、IGF-1R、CD30、TAG-72、SPEAP、CD45、L1-CAM、Lewis Y(Ley)抗原、E-钙粘蛋白、V-钙粘蛋白和EpCAM。
另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、脑室内、口服或鼻内施用所述抗DOTA双特异性抗体、所述清除剂和/或所述放射性标记的DOTA半抗原。
另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，所述癌症选自乳腺癌、结直肠癌、宫颈癌、卵巢癌、肝脏癌症、膀胱癌、肝癌、肝细胞癌、脑癌、肺癌、胃部癌症或胃癌、胰腺癌、甲状腺癌、肾脏癌症或肾癌、前列腺癌、黑色素瘤、肉瘤、癌、肾母细胞瘤、子宫内膜癌、胶质母细胞瘤、鳞状细胞癌、星形细胞瘤、唾液腺癌、外阴癌、阴茎癌和头颈癌。所述脑癌可以是垂体腺瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤或颅咽管瘤。
另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，所述放射性标记的DOTA半抗原包含以下中的一种或多种：Proteus-DOTA、S-2-(R-氨基苄基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷四乙酸(DOTA-Bn)、DOTA-Bn-生物素、BAD(((S)-2-(4-(2-溴)-乙酰胺基)-苄基)-DOTA)、NBD((S)-2-(4-硝基苄基)-DOTA)、DOTA-RGD、DOTA-PEG-E(c(RGDyK))2、DOTA-8-AOC-BBN、p-NO2-Bn-DOTA、DOTA-PESIN、DOTA-生物素-肌氨酸(DOTA-生物素)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸单(N-羟基琥珀酰亚胺酯)(DOTA-NHS)或DOTATyrLysDOTA。可替代地，可以在本文公开的方法中采用本领域已知的任何放射性标记的DOTA半抗原。所述放射性标记的DOTA半抗原可以用选自以下的放射性核素标记：213Bi、211At、225Ac、152Dy、212Bi、223Ra、219Rn、215Po、211Bi、221Fr、217At、255Fm、86Y、90Y、89Sr、165Dy、186Re、188Re、177Lu、67Cu、111In、67Ga、51Cr、58Co、99mTc、103mRh、195mPt、119Sb、161Ho、189mOs、192Ir、201Tl、203Pb、68Ga、227Th和64Cu。
在本文公开的方法的上述实施方案中的任何一个中，所述受试者是人。在如下条件下施用所述抗DOTA双特异性抗体并持续如下时间段(例如，根据给药方案)，所述条件和时间段对于所述抗DOTA双特异性抗体而言足以使肿瘤细胞饱和，并且在施用所述抗DOTA双特异性抗体后，将任何未结合的抗DOTA双特异性抗体从血流中去除。在一些实施方案中，在可以足以允许清除未结合的抗DOTA双特异性抗体的时间段后施用所述放射性标记的DOTA半抗原。
另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，在不进一步施用所述抗DOTA双特异性抗体的情况下，施用所述清除剂和所述放射性标记的DOTA半抗原。例如，在一些实施方案中，根据如下方案施用抗DOTA双特异性抗体，所述方案包括以下的至少一个循环：(i)施用抗DOTA双特异性抗体(任选地使得相关肿瘤细胞饱和)；(ii)施用本发明技术的清除剂和放射性标记的DOTA半抗原；以及(iii)在不另外施用所述抗DOTA双特异性抗体的情况下，任选地另外施用所述放射性标记的DOTA半抗原和/或所述清除剂。在一些实施方案中，所述方法可以包括多个这样的循环(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个循环)。
可以在施用所述抗DOTA双特异性抗体后1分钟至4天或更多天之间的任何时间施用所述放射性标记的DOTA半抗原。例如，在一些实施方案中，在施用所述抗DOTA双特异性抗体后1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、1小时、1.25小时、1.5小时、1.75小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时、5.5小时、6小时、6.5小时、7小时、7.5小时、8小时、8.5小时、9小时、9.5小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、48小时、72小时、96小时或其中的任何范围，施用所述放射性标记的DOTA半抗原。可替代地，可以在施用所述抗DOTA双特异性抗体后4天或更多天之后的任何时间施用所述放射性标记的DOTA半抗原。
另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，可以在施用所述清除剂后1分钟至4天或更多天之间的任何时间施用所述放射性标记的DOTA半抗原。例如，在一些实施方案中，在施用所述清除剂后1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、1小时、1.25小时、1.5小时、1.75小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时、5.5小时、6小时、6.5小时、7小时、7.5小时、8小时、8.5小时、9小时、9.5小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、48小时、72小时、96小时或其中的任何范围，施用所述放射性标记的DOTA半抗原。可替代地，可以在施用所述清除剂后4天或更多天之后的任何时间施用所述放射性标记的DOTA半抗原。
试剂盒
本发明技术提供了含有适合于在患者中治疗癌症的组分的试剂盒。在一方面，所述试剂盒包含本发明技术的清除剂和使用说明书。所述试剂盒还可以包含至少一种抗DOTABsAb。在一些实施方案中，所述至少一种抗DOTA BsAb与选自以下的肿瘤抗原靶标结合：GPA33、HER2/neu、GD2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、MUM-1、CDK4、N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、p15、gp75、β-连环蛋白、ErbB2、癌症抗原125(CA-125)、癌胚抗原(CEA)、RAGE、MART(黑色素瘤抗原)、MUC-1、MUC-2、MUC-3、MUC-4、MUC-5ac、MUC-16、MUC-17、酪氨酸酶、Pmel 17(gp100)、GnT-V内含子V序列(N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V内含子V序列)、前列腺癌psm、PRAME(黑色素瘤抗原)、β-连环蛋白、EBNA(爱泼斯坦-巴尔病毒核抗原)1-6、p53、肺耐药蛋白(LRP)Bcl-2、前列腺特异性抗原(PSA)和Ki-67。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述至少一种抗DOTA BsAb与选自以下的肿瘤抗原靶标结合：CEACAM6、结肠特异性抗原-p(CSAp)、HLA-DR、CD40、CD74、CD138、EGFR、EGP-1、EGP-2、VEGF、PlGF、胰岛素样生长因子(ILGF)、腱生蛋白、血小板源性生长因子、IL-6、CD20、CD19、PSMA、CD33、CD123、MET、DLL4、Ang-2、HER3、IGF-1R、CD30、TAG-72、SPEAP、CD45、L1-CAM、Lewis Y(Ley)抗原、E-钙粘蛋白、V-钙粘蛋白和EpCAM。可以以含有所述抗体的无菌液体配制品或冻干制剂的预填充注射器或自动注射笔的形式提供所述至少一种抗DOTA BsAb(例如，Kivitz等人,Clin.Ther.28:1619-29(2006))。
另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述试剂盒还包含DOTA半抗原，其任选地用一种或多种放射性核素标记。DOTA半抗原的例子包括但不限于Proteus-DOTA、S-2-(R-氨基苄基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷四乙酸(DOTA-Bn)、DOTA-Bn-生物素、BAD(((S)-2-(4-(2-溴)-乙酰胺基)-苄基)-DOTA)、NBD((S)-2-(4-硝基苄基)-DOTA)、DOTA-RGD、DOTA-PEG-E(c(RGDyK))2、DOTA-8-AOC-BBN、p-NO2-Bn-DOTA、DOTA-PESIN、DOTA-生物素-肌氨酸(DOTA-生物素)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸单(N-羟基琥珀酰亚胺酯)(DOTA-NHS)、DOTATyrLysDOTA等。另外地或可替代地，在本发明技术的试剂盒的一些实施方案中，所述一种或多种放射性核素选自213Bi、211At、225Ac、152Dy、212Bi、223Ra、219Rn、215Po、211Bi、221Fr、217At和255Fm。另外地或可替代地，在某些实施方案中，所述一种或多种放射性核素选自86Y、90Y、89Sr、165Dy、186Re、188Re、177Lu、67Cu、111In、67Ga、51Cr、58Co、99mTc、103mRh、195mPt、119Sb、161Ho、189mOs、192Ir、201Tl、203Pb、68Ga、227Th和64Cu。
如果所述试剂盒组分不是被配制用于口服施用，则可以包含能够通过某种其他途径递送所述试剂盒组分的装置。此类装置的例子包括注射器(用于肠胃外施用)或吸入装置。
所述试剂盒组分可以包装在一起或分开在两个或更多个容器中。在一些实施方案中，所述容器可以是小瓶，其含有本文公开的清除剂、DOTA半抗原和/或抗DOTA BsAb组合物的适合于重构的无菌冻干配制品。试剂盒还可以含有一种或多种适合于重构和/或稀释其他试剂的缓冲液。可以使用的其他容器包括但不限于小袋、托盘、盒、管等。试剂盒组分可以无菌地包装并维持在所述容器内。
实施例
实施例1：本发明技术的化合物的示例性合成
概述。DOTA-Bn-异硫氰酸酯(p-SCN-Bn-DOTA)购自Macrocyclics,Inc.(得克萨斯州普莱诺)，并且胺-PEG4-DOTA购自CheMatech(法国第戎)。OptimaTM级盐酸购自ThermoFisher Scientific(马萨诸塞州沃尔瑟姆)。Chelex-100树脂(200-400目)购自Bio-RadLaboratories(加利福尼亚州赫拉克勒斯)。PD-10凝胶过滤尺寸排阻柱(含有8.3mL的SephadexTM G-25树脂/柱)购自GE Healthcare Life Sciences(宾夕法尼亚州匹兹堡)。所有其他试剂和合成级化学制品均购自Sigma-Aldrich(密苏里州圣路易斯)并且无需进一步纯化即可使用。用于HPLC分析(HPLC级)和化合物纯化的所有溶剂也均购自Thermo FisherScientific(马萨诸塞州沃尔瑟姆)。所有缓冲液和溶液均使用超纯水(电阻率为18MΩ-cm)制备。
使用包括以下仪器的Waters Autopure系统(马萨诸塞州米尔福德)获得所有液相色谱质谱法(LC/MS)数据：2767样品管理器、2545二元梯度模块、系统流体管理器、2424蒸发光散射检测器、2998光电二极管阵列检测器、3100质量检测器。在使用之前，将HPLC溶剂(溶剂A，在水中的0.05％TFA；溶剂B，在乙腈中的0.05％TFA)过滤。分析方法是在10min内溶剂B从5％-25％，流速为1.2mL/min。分析柱：Waters XBridge BEH300(马萨诸塞州米尔福德)，C4、3.5μm、4.6x50mm和C18、4μm、4.6x50mm。制备方法：在30min内溶剂B从5％-25％，流速为20mL/min。制备柱：Waters XBridge Prep(马萨诸塞州米尔福德)C18、4μm、最佳床密度、19x150mm。
所有NMR数据均是用Bruker AV500或AV600仪器(Bruker，马萨诸塞州比勒利卡)在环境温度下获得的。使用以下缩写：单峰(s)、宽单峰(bs)、双峰(d)、三重峰(t)、四重峰(q)、五重峰(p)、双二重峰(dd)、多重峰(m)。
所有涉及具有高金属复合能力的分子(如DOTA)的实验均在玻璃器皿中进行，将所述玻璃器皿用无金属的HCl预洗涤，用高纯水(例如，玻璃蒸馏水)冲洗，并且用烘箱干燥。色谱法是在手动填充的玻璃柱上进行的，以避免加载复合剂时从金属柱壁浸出或提取出金属。在用松散的C-18硅胶手动填充的干净、无金属的玻璃柱上进行反相纯化。没有测量最终复合物中的水含量。
CCA-16-甲基酯-NHBoc(下文说明)和5-((叔丁氧基羰基)氨基)戊基-2-乙酰胺基-2-脱氧-1-硫代-3,4,6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃半乳糖苷(“单-全乙酰基-糖-NHBoc”)是按照如下文献中所述的类似方法和方案制备的：Yoo,B.等人“N-AcetylgalactosaminoDendrons as Clearing Agents to Enhance Liver Targeting of Model Antibody-Fusion Protein,”Bioconjugate Chem.2013,24,2088-2103(以及所附支持信息)和Cheal,S.M.等人“Evaluation of Glycodendron and Synthetically Modified DextranClearing Agents for Multistep Targeting of Radioisotopes for MolecularImaging and Radioimmunotherapy,”Mol.Pharmaceutics 2014,11,400-16(以及所附支持信息)，将其各自通过引用并入本文。下文提供了CCA-16-甲基酯-NHBoc和单-全乙酰基-糖-NHBoc的相关表征数据。
CCA-16-甲基酯-NHBoc：
Figure BDA0002966156640000401
1H NMR(600MHz,D2O)δ:3.68,3.66(2s,48H,OCH3),3.30-3.26(m,32H),3.22-3.19(m,32H),2.83(bs,NCH3),2.35-2.25(m,64H),1.69-1.51(m,128H),1.44(s,9H,C(CH3)3),1.34-1.29(m,64H)。13C NMR(125MHz,D2O)δ:174.10,173.87,172.10,51.57,51.48,47.86,47.79,45.78,45.70,33.95,33.84,33.83,33.05,32.89,29.21,28.90,28.50,27.70,27.48,27.46,26.99,26.84,26.55,26.42,25.23,25.13,24.68,24.64。
单-全乙酰基-糖-NHBoc(5-((叔丁氧基羰基)氨基)戊基-2-乙酰胺基-2-脱氧-1-硫代-3,4,6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃半乳糖苷)：1H NMR(600MHz,D2O)δ:5.57(d,1H,J＝7.4Hz),5.49(d,1H,J＝4.4Hz),5.38(d,1H,J＝2.4Hz),5.05(dd,1H,J＝2.4Hz,J＝7.4Hz),4.80-4.74(m,1H),4.58(bs,1H),4.54(t,1H,J＝5.4Hz),4.13(dd,1H,J＝9.6Hz,J＝5.4Hz),4.09(dd,1H,J＝9.6Hz,J＝5.4Hz),3.14-3.08(m,2H),2.66-2.55(m,2H),2.16,2.05,2.01,1.98(4s,12H,COCH3),1.67-1.61(m,2H),1.44(s,9H,C(CH3)3),1.41-1.38(m,2H)。13C NMR(125MHz,D2O)δ:171.00,170.39,170.28,170.15,155.98,84.93,68.54,67.34,67.24,61.83,48.33,40.38,30.97,29.62,29.28,28.43,25.94,23.34,20.75,20.71。
示例性合成
CCA-16-酸：
Figure BDA0002966156640000421
向在MeOH(60mL)中的CCA-16-甲基酯-NHBoc(2.1g，0.54mmol)中添加NaOH(10N，16mL)和水(16mL)。将得到的混合物在室温下搅拌1h。然后用2.0N HCl将pH调节至5.0，并且将溶液加载至分液漏斗中。用DCM/叔丁醇(3/1，v/v)萃取(150mL x 5)，并且将合并的有机层经Na2SO4短暂干燥。经硅藻土床过滤后，将滤液在减压下蒸发，并且将残余物在高真空下进一步干燥2h，以提供2.0g无色稠油。产物具有足够的纯度以直接呈递至下一步。
CCA-16-糖-NHBoc：
Figure BDA0002966156640000431
将CCA-16-酸(2.0g，0.54mmol)在DMF(80mL)中稀释，然后用HATU(4.0g，10.5mmol)和5-氨基-1-戊基-α-硫代四乙酰半乳糖胺(5.6g，9.9mmol)处理。将得到的混合物在室温下搅拌20min，然后添加DIPEA(8.0mL)。1h后，添加DCM(200mL)，并且将反应混合物用水洗涤(2X100mL)。然后将有机层经Na2SO4短暂干燥，经硅藻土床过滤，并且将滤液在真空下浓缩。使用在DCM中的0％至15％MeOH(v/v)梯度通过快速柱色谱法纯化得到了CCA-16-糖-NHBoc(4.9g，产率85％)。1H NMR(600MHz,D2O)δ:7.95(bs,12H,NH),5.64-5.61(m,16H),5.47-5.46(d,16H,J＝2.8Hz),5.06(dd,16H,J＝11.8Hz),4.64-4.60(m,32H),4.18-4.12(m,32H),3.35(m,32H),3.21-3.19(m,36H),3.02,2.88(2s,3H,NCH3),2.86-2.84(bs,4H),2.70-2.61(m,32H),2.41-2.38(m,36H),2.24(m,32H),2.21,2.06,1.98,1.97(4s,192H,COCH3),1.69-1.64(m,128H,1.59-1.53(m,70H),1.48(s,9H,OC(CH3),1.48-1.46(m,32),1.40-1.33(m,70H)。13C NMR(125MHz,D2O)δ:174.60,174.38,174.30,173.41,172.23,172.14,170.66,170.34,84.07,68.23,67.23,66.80,61.78,53.46,45.67,39.01,38.88,35.73,35.63,35.58,32.59,32.51,30.03,29.06,28.66,28.54,27.57,27.08,26.37,26.28,26.22,26.10,25.83,25.45,25.36,25.18,25.10,21.26,21.22,19.44,19.37,19.24。
CCA-16-全乙酰基-α-硫代半乳糖胺-NH2·TFA：
Figure BDA0002966156640000451
将0.8mL的在二氯甲烷中的20％TFA(v/v)中的20mg CCA-16-全乙酰基-α-硫代半乳糖胺-NHBoc(1.9μmol)在室温下搅拌60min，然后将混合物在减压下蒸发以去除TFA和DCM。通过LCMS监测反应进展，在使用C4(Xbridge，Waters，4.6X50mm)的Autopure System(Waters)上使用在水中的5％-95％(v/v)乙腈(含有0.05％TFA)梯度运行10min。通过伴行的质谱仪、二极管阵列和蒸发光散射检测来确保检测。将残余物(20mg)在高真空下进一步干燥过夜，并且直接用于下一步。
CCA-16-全乙酰基-α-硫代半乳糖胺-NHCSNMe-Bn-DOTA：
Figure BDA0002966156640000461
将粗铵盐(CCA-16-全乙酰基-α-硫代半乳糖胺-NH2·TFA)和P-SCN-Bn-DOTA(2.5mg，3.8μmol，2当量)溶于DMF(0.3mL)中并添加Et3N(6μmL)。将得到的均匀混合物在室温下搅拌4h，并且在室温下在高真空下去除挥发物，以给出具有足够纯度的泡沫以用于下一步。LCMS评估是在与先前步骤中所述相同的系统上运行的，但是不同的是使用XBridgeC18柱(4.6X150mm)以及使用在水中的40％-95％(v/v)乙腈(含有0.05％TFA)梯度。
CCA-16-α-硫代-全乙酰半乳糖胺-DOTA-Y3+：
Figure BDA0002966156640000471
将来自先前步骤的粗材料CCA-16-全乙酰基-α-硫代半乳糖胺-NHCSNMe-Bn-DOTA添加至YCl3·6H2O(6mg)在0.05M HCl(0.2mL)和0.5M NH4OAc(0.2mL)中的溶液。将混合物振荡4h。在这一阶段尝试通过HPLC进行纯化没有成功。然而，分析监测显示反应以合理的纯度完成。LCMS在XBridge C18柱上使用在水中的5％-95％(v/v)乙腈(两者均含有0.05％TFA)梯度系统运行10min。将残余物呈递至下一步也是最后一步。ESI-MS(m/z):[M+6H]6+计算值1,847.55,观察值1,847.86
CCA-16-DOTA-Y3+：
Figure BDA0002966156640000481
将粗CCA-16-α-硫代-全乙酰半乳糖胺-DOTA-Y3+溶于MeOH(0.5mL)中，并且将脱气的NaOH(0.2N，400μL)添加至溶液。30min后，将反应混合物蒸发至干并溶于最少量水中，并且加载到HPLC(XBridge C18，在水中的乙腈梯度为20％-70％(v/v)(两者均含有0.05％TFA)，10min)上。将适当的级分合并在一起并冻干，以得到总共22mg的呈白色泡沫的目标化合物，并且从CCA-16-甲基酯-NHBoc开始的总产率为64％。1H NMR(600MHz,D2O)δ:7.21-7.24(m,4H,Ph),5.43(d,16H,J＝5.2Hz,H糖-1),4.27(dd,16H,J＝5.2Hz,J＝11.2Hz,H糖-2),4.17-4.14(m,16H,H糖-5),3.96(d,16H,J＝2.7Hz,H糖-4),3.75(dd,16H,J＝2.7Hz,J＝11.2Hz,H糖-3),3.68(d,32H,J＝6.0Hz,H糖-6),3.23(bs,64H),3.15-3.08(m,36H),3.00和2.85(2s,3H,NCH3),2.58-2.47(m,34H),2.30(bs,32H),2.16-2.13(m,34H),1.96(s,48H,NHCOCH3),1.55-1.30(m,198H),1.23-1.15(m,102H)。13C NMR(125MHz,D2O)δ:175.94,174.24,163.04,162.81,117.31,115.38,83.84,71.62,68.46,67.77,61.07,50.29,48.22,45.86,39.19,35.78,32.74,30.26,28.77,28.24,27.13,26.90,26.22,25.86,25.80,25.51,25.39,22.09。ESI-MS(m/z):[M+5H]5+计算值1,812.2,观察值1,813.1；[M+6H]6+计算值1,510.3,观察值1,511.2。
实施例2：用于生物学研究的示例性实验材料和方法
材料。如先前在WO 2016/130539中所述制备抗GPA33 DOTA-PRIT BsAb(huA33-C825)。GPA33(+)人结直肠癌细胞系SW1222是从路德维希癌症免疫治疗研究所(LudwigInstitute for Cancer Immunotherapy，纽约州纽约)获得的，并且维持在补充有10％热灭活胎牛血清、2.0mM谷氨酰胺、100个单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素的最小必需培养基中。
BsAb的放射性碘化。131I接收自Nordion(加拿大安大略省渥太华)。预涂的iodogen管是从Thermo Fisher Scientific(马萨诸塞州沃尔瑟姆)获得的。预填充的Sephadex G-25柱(PD10柱)是从GE Healthcare Life Sciences(宾夕法尼亚州匹兹堡)获得的。根据IODO-GEN方法(Salacinski PR等人,Analytical biochemistry 117:136-46(1981)；Harlow E,Lane D.USING ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL.Cold Spring Harbor,纽约州(1999))将抗GPA33 BsAb的等分试样放射性碘化，接着使用商业预填充的PD10柱(由Sephadex G-25树脂组成)进行凝胶过滤纯化。使用尺寸排阻高压液相色谱法外加放射检测确定放射化学纯度>98％。简而言之，为了制备131I-huA33-C825，将100μg与80μL的0.2M磷酸钠(pH 7.4)在预涂的iodogen管中混合。接下来，添加400μCi的131I。在室温下5分钟后，将反应物转移至含有50μL的iodogen终止缓冲液[在PBS中的10mg/mL酪氨酸(饱和的)、10％甘油、0.1％二甲苯腈蓝]的新管中，并且使用用添加的盐水+1％(w/v)BSA预平衡和洗脱的PD10柱纯化。
动物模型。从Harlan(印第安纳州印第安纳波利斯)或Envigo(英国亨廷顿)获得雌性无胸腺裸鼠(6-8周龄)。允许小鼠适应最少1周。为了确定树枝状物清除剂CCA-16-DOTA-Y3+对131I-BsAb的血液清除的影响，使用了正常(未患肿瘤)小鼠。对于DOTA-PRIT生物分布实验，使用了携带皮下(s.c.)SW1222人结直肠癌异种移植物的小鼠组。为了建立SW1222肿瘤，经由皮下注射在下侧腹上用培养基与重构的基膜(BD Matrigel，CollaborativeBiomedical Products Inc.，马萨诸塞州贝德福德)的1:1混合物的200μL细胞悬浮液中的5.0×106个细胞接种小鼠，并且在7-10天内观察到建立的肿瘤(100-300mm3)。
131I-BsAb的血液清除。通过将131I-BsAb与另外的载体抗体混合以达到每剂量250μg(1.19nmol)，制备抗体示踪剂以进行注射。所有血液采样和注射均经由尾静脉进行。在t＝0时向正常小鼠(n＝15)静脉内施用250μg(1.19nmol)131I-BsAb并且在t＝24h时施用媒介物(盐水；n＝3)或25μg清除剂(在250μL盐水中配制；n＝12)。对于媒介物，在t＝1、2、3、4、24、25、26、27和28h时对血液采样(30-40μL；n＝3/时间点)。对于清除剂，在t＝1、2、3、4、24、24.1(注射CA后5min)、24.3(注射CA后15min)、24.5、25、26、27和28h时对血液采样(30-40μL；n＝3/时间点)。通过在γ计数器(PerkinElmer Life Sciences Wallac Wizard 3)中计数来确定每个样品的放射性浓度。对计数率进行背景校正和衰减校正，使用对同位素特定的系统校准因子将其转换为活性，相对于施用活性进行归一化，并且表示为注射剂量百分比/g(ID/g)。使用公式((y2-y1)/y1)*100计算从基线(即，恰在注射清除剂之前；y1)到注射清除剂之后(y2)的时间间隔内血液活性的百分比变化。
在DOTA-PRIT期间树枝状物清除剂CCA-16-DOTA-Y3+剂量优化。向荷瘤小鼠组(n＝4/组)注射BsAb(250μg，1.19nmol；t＝-28h)，接着注射不同量的CCA-16-DOTA-Y3+(0-25μg；0-2.76nmol；t＝-4h)。另一组患肿瘤动物被给予葡聚糖清除剂(62.5μg；0.125l；7.625nmol(Y)DOTA)代替树枝状物清除剂CCA-16-DOTA-Y3+以进行比较。施用清除剂后四小时，向小鼠注射177Lu-DOTA-Bn(150-167μCi；30-33pmol)。注射177Lu活性后48h处死小鼠，取出器官以如上所述测定放射性浓度。这些器官包括血液、肿瘤、心脏、肝脏、脾脏、胃、小肠、大肠、肾脏、肌肉、骨和尾(注射部位)。还计算了肿瘤与非肿瘤的注射剂量百分比/g比率。
[111In]Proteus-DOTA的制备。图8显示了Proteus-DOTA的结构(化学式：C50H80LuN11O19S3-；精确质量：1345.48；分子量：1346.28)。还参见2018年7月5日提交的国际申请号PCT/US18/40911，通过引用并入本文。对于DOTA-PRIT研究，从[111In]氯化铟(153MBq[4.14mCi])和1μL的10mg/mL Proteus-DOTA(10μg；7.42nmole)制备[111In]Proteus-DOTA。[111In]Proteus-DOTA产率为44％，并且最终比活性(SA)为7178GBq/g[194Ci/g]或9.67 E6GBq/mol[2.61 E5 Ci/mol]。在向小鼠施用之前，使用StrataTM-X盒(33μm聚合物反相C-1830mg/1mL#8B-S100-TAK，
Figure BDA0002966156640000511
Inc.，美国加利福尼亚州托伦斯)来纯化[111In]Proteus-DOTA，并且使用用过量BsAb进行的体外结合测定或通过分析型反相HPLC外加放射检测验证放射化学纯度>98％。
统计分析。使用非配对学生t检验确定均值之间的差异。
SPECT/CT成像。对于用抗GPA33-DOTA-PRIT+[111In]Proteus-DOTA体内靶向之后的SPECT/CT成像和生物分布研究，向已经接受过huA33-C825 BsAb和CCA-16-DOTA-Y3+(25μg；2.76nmol)的携带SW1222肿瘤的小鼠注射172pmol/1.67MBq[45μCi]的[111In]1(n＝4)或790pmol/7.66MBq[207μCi]的[111In]1(n＝1)。第二天，在注射后20h时通过SPECT/CT对给予了较大施用活性的[111In]Proteus-DOTA的单只小鼠成像，并且在注射后24h时将所有动物处死以进行生物分布研究。
实施例3：本发明技术的清除剂增强体内放射性标记的双特异性抗体(BsAb)的血 液清除
对131I-BsAb(131I-huA33-C825)的血液清除的评价。使用正常(无肿瘤)裸鼠进行体内实验，以评价单剂量的过量的本发明技术的树枝状物CA对131I-BsAb的血液清除的影响。
最初向动物组注射250μg的131I-BsAb，这是先前针对DOTA-PRIT优化的BsAb剂量。二十四小时后，向小鼠注射本发明技术的树枝状物CA(25μg，2.76nmol)或媒介物对照。在注射CA后长达4小时(或注射131I-BsAb后28小时)的不同时间进行系列血液采集，并且通过在γ计数器中进行测定来确定每个样品中的131I活性浓度。
如下图1所示，CA组与媒介物组之间在基线时(注射后24h)的血液131I活性最初没有显著差异。CA有效降低循环131I-BsAb，因为注射后5分钟时的平均血液活性浓度显著下降了64％，从6.7％ID/g下降至2.4％ID/g。在注射CA或媒介物后1小时，平均血液活性分别为5.8(-13％)或1.3％ID/g(-81％)。
这些结果证明，本发明技术的清除剂可用于在有需要的受试者中提高肿瘤对放射疗法的敏感性和/或治疗癌症的方法。
实施例4：本发明技术的清除剂可用于DOTA PRIT方法
图2显示了用不同剂量的CCA-16-DOTA-Y3+实现的肿瘤预靶向结果。5-25μg剂量的树枝状物CA导致在注射177Lu活性后24h时的平均肿瘤177Lu-DOTA-Bn摄取为27-41％ID/g，这与在葡聚糖CA和媒介物组的情况下观察到的肿瘤177Lu-DOTA-Bn摄取(约35％ID/g)是可比较的。25μg剂量的树枝状物CA(CCA-16-DOTA-Y3+)导致与在62.5μg剂量的葡聚糖CA的情况下观察到的肿瘤:血液摄取比率可比较的肿瘤:血液摄取比率。N-乙酰半乳糖氨基树枝状物清除剂CCA-16-DOTA-Y3+对肿瘤摄取的影响是剂量依赖性的。参见图3。此外，图4显示了用本发明技术的清除剂与没有清除剂(媒介物)以及用500kD葡聚糖-DOTA半抗原缀合物清除剂(即，葡聚糖CA)相比所实现的肿瘤预靶向结果的比较。在CCA-16-DOTA-Y3+的情况下实现的肿瘤:正常组织摄取比率与在葡聚糖CA的情况下观察到的肿瘤:正常组织摄取比率是可比较的。
为了证明[225Ac]Proteus-DOTA可以与DOTA-PRIT组合使用以用于高效的体内肿瘤靶向，向一组携带表达GPA33的SW1222异种移植物的裸鼠在施用[225Ac]Proteus-DOTA(182pmol，1.85kBq[50nCi])之前28h静脉内注射BsAb huA33-C825(250μg；1.19nmol)，并且在施用[225Ac]Proteus-DOTA(182pmol，1.85kBq[50nCi])之前4h静脉内注射清除剂(62.5μg；0.125nmol葡聚糖；7.625nmol(Y)DOTA)。将这些小鼠在注射[225Ac]Proteus-DOTA后24h时处死以进行生物分布测定。还用[111In]Proteus-DOTA(172pmol/1.67MBq[45μCi]的[111In]Proteus-DOTA(n＝4)或790pmol/7.66MBq[207μCi]的[111In]Proteus-DOTA(n＝1)，使用CCA-16-DOTA-Y3+(25μg；2.76nmol))重复此项研究。第二天，在注射后20h时通过SPECT/CT对给予了较大施用活性的[111In]Proteus-DOTA的单只小鼠成像，并且在注射后24h时将所有动物处死以进行生物分布研究。
如图5(A)所示，对于经历用[225Ac]Proteus-DOTA进行的预靶向放射免疫疗法的那些动物，注射后24h时的血液、肿瘤和肾脏摄取(表示为每克组织的注射活性百分比；％IA/g)分别为0.94±0.26、16.71±2.95和1.08±0.55，分别对应于血液和肾脏的约18:1和16:1的肿瘤与器官活性比率。对于[111In]Proteus-DOTA，注射后24h时的血液、肿瘤和肾脏摄取分别为0.76±0.09、13.18±0.97和1.02±0.06，分别对应于血液和肾脏的约17:1和13:1的肿瘤与器官活性比率。在[225Ac]Proteus-DOTA与[111In]Proteus-DOTA之间没有观察到显著差异，但肝脏对[225Ac]Proteus-DOTA的摄取是约3倍高(对于[225Ac]Proteus-DOTA或[111In]Proteus-DOTA分别为1.40±0.47相比于0.46±0.05；P<0.05)，并且骨对[111In]Proteus-DOTA的摄取较高(对于[225Ac]Proteus-DOTA或[111In]Proteus-DOTA分别为不可检测相比于0.15±0.01；P<0.001)。这些肿瘤与器官活性比率与使用示踪剂177Lu-DOTA-Bn或86Y-DOTA-Bn在相同动物模型中用抗GPA33-DOTA-PRIT进行的先前的生物分布研究是相似的，其中在注射后24h时两种DOTA-半抗原的平均肿瘤摄取为约8％ID/g(1.85-8.8MBq；10-50pmol，对于任一种M-DOTA-Bn半抗原)(参见Cheal,S.M.等人Eur J Nucl Med Mol Imaging 43:925-937(2016))，这表明C825对[225Ac]Proteus-DOTA的亲和力是相似的。参见图5(B)。
图6(A)显示了在注射172pmol/1.67MBq[45μCi]的[111In]Proteus-DOTA(n＝4)或790pmol/7.66MBq[207μCi]的[111In]Proteus-DOTA(n＝1)的动物中实现的肿瘤预靶向结果。在接受较高剂量的[111In]Proteus-DOTA的动物中，肿瘤与正常组织比率总体上较高。参见图6(A)和图7。
如图6(B)所示，用[225Ac]Proteus-DOTA(与葡聚糖CA组合使用)和用[111In]Proteus-DOTA(与CCA-16-DOTA-Y3+组合使用)实现的抗GPA33-DOTA-PRIT结果是可比较的。
这些结果证明，本发明技术的清除剂可用于在有需要的受试者中提高肿瘤对放射疗法的敏感性和/或治疗癌症的方法。
实施例5：使用N-乙酰半乳糖氨基树枝状物清除剂进行DOTA-预靶向放射免疫疗法
测试了主要假说，即包括树枝状物CA即CCA-16-DOTA-Y3+的抗GPA33 PRIT+177Lu-氨基苄基DOTA([177Lu]LuDOTA-Bn)可以代替葡聚糖CA用于实现高治疗指数(TI)。治疗指数在本文中定义为估计的肿瘤/正常组织吸收剂量比率。
包括树枝状物CA即CCA-16-DOTA-Y3+的PRIT+[177Lu]LuDOTA-Bn的吸收剂量估计值：为了计算包括树枝状物CA(本发明技术的清除剂)的PRIT+[177Lu]LuDOTA-Bn的吸收剂量，向携带表达GPA33的SW1222异种移植物的裸鼠组(n＝5/组)在施用[177Lu]LuDOTA-Bn(20pmol，3.7MBq[100μCi])之前28h时静脉内注射BsAb huA33-C825(250μg；1.19nmol)并且在施用[177Lu]LuDOTA-Bn(20pmol，3.7MBq[100μCi])之前4h时静脉内注射树枝状物清除剂CCA-16-DOTA-Y3+(25μg；2.76nmol)。将这些小鼠在注射[177Lu]LuDOTA-Bn后1、4、24或48h时处死以进行生物分布测定。对于每种组织，视情况而定使用Excel将未经衰减校正的时间-活性浓度数据拟合至单分量、二分量或更复杂的指数函数，并且进行分析积分以得出每单位施用活性的累积活性浓度(MBq-h/g/MBq)。使用非穿透辐射的177Lu平衡剂量常数(8.49g-cGy/MBq-h)估计肿瘤与肿瘤和选择的器官与器官自吸收剂量，假设仅177Luβ射线的局部吸收是完全的，并且忽略γ射线和非自身剂量的贡献。图9显示了从这些研究获得的结果。
图10显示了在注射[177Lu]LuDOTA-Bn后长达48h肿瘤、血液、肝脏、脾脏、肾脏和肌肉的经衰减校正的时间-活性曲线。图11显示了多种组织的吸收剂量(cGy/MBq)和治疗指数。如图11所示，血液、肿瘤、肝脏、脾脏和肾脏的估计的[177Lu]LuDOTA-Bn吸收剂量分别为11.7、468.4、9.97、5.49和13.3cGy/MBq。肿瘤的吸收剂量估计值与选择的正常组织的吸收剂量估计值比率(即，TI)的范围为约40(例如，对于血液和肾脏)至对于肌肉的550(图11)。
对于包括葡聚糖CA的优化的PRIT+[177Lu]LuDOTA-Bn，单循环PRIT下肿瘤、血液、肝脏、脾脏和肾脏的估计吸收剂量(cGy/MBq)分别为65.8、0.9(TI 73)、6.3(TI 10)、6.6(TI10)和5.3(TI 12)。参见Cheal等人,Eur J Nucl Med Mol Imaging 43:925(2016)。证明了有效的治疗，其中没有观察到重大的治疗相关毒性(例如，分次剂量策略中递送的111.0MBq产生频率为100％的CR，包括九只小鼠中的两只存活超过140天；肿瘤、血液和肾脏的吸收剂量为7304、100和588cGy)。Cheal等人,Eur J Nucl Med Mol Imaging 43:925(2016)。
基于从临床观察得出的人正常组织辐射剂量耐受性估计值(Marks等人,Int JRadiat Oncol Biol Phys.76:S10-9(2010))，骨髓的最大耐受剂量(MTD)为250cGy，肺为1,500cGy，肝脏为3,000cGy，并且肾脏为2,000cGy。因此，对于包括葡聚糖CA的优化的PRIT+[177Lu]LuDOTA-Bn，最大耐受的预靶向的[177Lu]LuDOTA-Bn活性为278MBq，其中骨髓为剂量限制器官。在这种活性下，递送至肿瘤的估计吸收剂量将为18,292cGy(183Gy)，并且血液(骨髓)为250cGy且肾脏为1,473cGy。
对于包括树枝状物CA即CCA-16-DOTA-Y3+的PRIT+[177Lu]LuDOTA-Bn的上述例子，最大耐受的预靶向的[177Lu]LuDOTA-Bn活性为21MBq，其中骨髓为剂量限制器官。在这种活性下，递送至肿瘤的估计吸收剂量将为9836cGy(98Gy)，并且血液(骨髓)为246cGy且肾脏为280cGy。因此，由于约73Gy的肿瘤吸收剂量，预测在小鼠的异种移植物中有效且安全的CRC疗法，这可以用15.6MBq的施用活性来实现(并且血液(骨髓)为183cGy且肾脏为207cGy)。
最终，这些数据证明，与葡聚糖CA相比，树枝状物CA可以用于在较少施用的177Lu活性的情况下在人CRC的小鼠模型中实现治愈(例如，肿瘤为70Gy)，其中关键组织的剂量学具有差异(例如，降低肾脏的剂量)。
这些结果证明，本发明技术的清除剂可用于在有需要的受试者中提高肿瘤对放射疗法的敏感性和/或治疗癌症的方法。
等效物
本发明技术并非受限于本申请中描述的具体实施方案，所述实施方案旨在作为本发明技术的单独方面的单一说明。对于本领域技术人员将清楚的是，可以在不背离本发明技术的精神和范围的情况下，对本发明技术进行许多修改和改变。本领域技术人员根据前述描述将清楚，除了本文列举的方法和设备外，在本发明技术范围内的功能上等效的方法和设备。此类修改和改变旨在落入本发明技术的范围内。应理解，本发明技术不限于具体方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，当然它们可以改变。还应理解，本文所用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并不旨在是限制性的。
另外，在本公开文本的特征或方面按马库什群组(Markush group)来描述的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开文本因此也按马库什群组的任何单独成员或成员亚组来描述。
本领域技术人员将理解，出于任何和所有目的，特别是就提供书面描述而言，本文公开的所有范围还涵盖其任何和所有可能的子范围和子范围的组合。任何所列范围均可以容易地识别为充分描述相同范围并且使得相同范围能分解为至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性例子，本文讨论的每个范围可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。同样本领域技术人员将理解，诸如“高达”、“至少”、“大于”、“小于”等所有言辞均包括所述数字并且涉及随后可以分解为如上文所讨论的子范围的范围。最后，本领域技术人员将理解，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个细胞的组是指具有1、2或3个细胞的组。类似地，具有1-5个细胞的组是指具有1、2、3、4或5个细胞的组，等等。
本文所提到或引用的所有专利、专利申请、临时申请和公开案均通过引用以其整体而并入，包括所有图形和表格，至其与本说明书的明确教示一致的程度。

Claims (25)

1.一种化合物，所述化合物为
Figure FDA0002966156630000011
Figure FDA0002966156630000021
Figure FDA0002966156630000031
Figure FDA0002966156630000041
或其药学上可接受的盐和/或溶剂化物，其中
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19和X20各自独立地是H或孤对电子(即提供氧阴离子)；
Y1、Y2、Y3、Y4和Y5各自独立地是O或S；
x是1、2或3；并且
y是1、2、3或4。
2.一种清除剂化合物，所述清除剂化合物为
Figure FDA0002966156630000051
Figure FDA0002966156630000061
Figure FDA0002966156630000071
Figure FDA0002966156630000081
或其药学上可接受的盐和/或溶剂化物，其中
M1、M2、M3、M4和M5各自独立地是Lu3+、Sc3+、Ga3+、Y3+、In3+、La3+、Ce3+、Eu3+、Tb3+或Gd3+；
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19和X20各自独立地是H或孤对电子(即提供氧阴离子)；
Y1、Y2、Y3、Y4和Y5各自独立地是O或S；
x是1、2或3；并且
y是1、2、3或4。
3.根据权利要求2所述的化合物，其中M1、M2、M3、M4和M5各自独立地不是放射性核素。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中Y1、Y2、Y3、Y4和Y5各自独立地是S。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的化合物，其中x是1或2。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的化合物，其中y是2或3。
7.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求1-6中任一项所述的化合物和药学上可接受的载体。
8.一种用于在诊断患有癌症的受试者中提高肿瘤对放射疗法的敏感性的方法，所述方法包括
(a)向所述受试者施用有效量的抗DOTA双特异性抗体，其中所述抗DOTA双特异性抗体被配置为定位至表达肿瘤抗原靶标的肿瘤；
(b)向所述受试者施用有效量的根据权利要求2-7中任一项所述的清除剂；以及
(c)向所述受试者施用有效量的放射性标记的DOTA半抗原，其中所述DOTA半抗原被配置为与所述抗DOTA双特异性抗体形成复合物。
9.一种用于在有需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括
(a)向所述受试者施用有效量的抗DOTA双特异性抗体，其中所述抗DOTA双特异性抗体被配置为定位至表达肿瘤抗原靶标的肿瘤；
(b)向所述受试者施用有效量的根据权利要求2-7中任一项所述的清除剂；以及
(c)向所述受试者施用有效量的放射性标记的DOTA半抗原，其中所述DOTA半抗原被配置为与所述抗DOTA双特异性抗体形成复合物。
10.根据权利要求9所述的方法，所述方法还包括向所述受试者依次、分开或同时施用选自以下的至少一种化疗剂：氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲、吉西他滨、三氮烯、叶酸类似物、蒽环类药物、紫杉烷、COX-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗生素、酶抑制剂、表鬼臼毒素、铂配位复合物、长春花生物碱、取代的脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、激素拮抗剂、内皮抑素、紫杉醇、喜树碱、SN-38、阿霉素、阿霉素类似物、抗代谢物、烷化剂、抗有丝分裂剂、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂、mTOR抑制剂、热休克蛋白(HSP90)抑制剂、蛋白酶体抑制剂、HDAC抑制剂、促凋亡剂、甲氨蝶呤和CPT-11。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的方法，其中所述肿瘤抗原靶标选自GPA33、HER2/neu、GD2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、MUM-1、CDK4、N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、p15、gp75、β-连环蛋白、ErbB2、癌症抗原125(CA-125)、癌胚抗原(CEA)、RAGE、MART(黑色素瘤抗原)、MUC-1、MUC-2、MUC-3、MUC-4、MUC-5ac、MUC-16、MUC-17、酪氨酸酶、Pmel 17(gp100)、GnT-V内含子V序列(N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V内含子V序列)、前列腺癌psm、PRAME(黑色素瘤抗原)、β-连环蛋白、EBNA(爱泼斯坦-巴尔病毒核抗原)1-6、p53、肺耐药蛋白(LRP)Bcl-2、前列腺特异性抗原(PSA)、Ki-67、CEACAM6、结肠特异性抗原-p(CSAp)、HLA-DR、CD40、CD74、CD138、EGFR、EGP-1、EGP-2、VEGF、PlGF、胰岛素样生长因子(ILGF)、腱生蛋白、血小板源性生长因子、IL-6、CD20、CD19、PSMA、CD33、CD123、MET、DLL4、Ang-2、HER3、IGF-1R、CD30、TAG-72、SPEAP、CD45、L1-CAM、Lewis Y(Ley)抗原、E-钙粘蛋白、V-钙粘蛋白和EpCAM。
12.根据权利要求8-11中任一项所述的方法，其中静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、脑室内、口服或鼻内施用所述抗DOTA双特异性抗体。
13.根据权利要求8-12中任一项所述的方法，其中静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、脑室内、口服或鼻内施用所述放射性标记的DOTA半抗原。
14.根据权利要求8-13中任一项所述的方法，其中静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、脑室内、口服或鼻内施用所述清除剂。
15.根据权利要求8-14中任一项所述的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、结直肠癌、宫颈癌、卵巢癌、肝脏癌症、膀胱癌、肝癌、肝细胞癌、脑癌、肺癌、胃部癌症或胃癌、胰腺癌、甲状腺癌、肾脏癌症或肾癌、前列腺癌、黑色素瘤、肉瘤、癌、肾母细胞瘤、子宫内膜癌、胶质母细胞瘤、鳞状细胞癌、星形细胞瘤、唾液腺癌、外阴癌、阴茎癌和头颈癌。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述脑癌是垂体腺瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤或颅咽管瘤。
17.根据权利要求8-16中任一项所述的方法，其中所述复合物发射放射性水平，其表示为每克组织的注射剂量百分比(％ID/g)。
18.根据权利要求8-17中任一项所述的方法，其中所述受试者展现出的肿瘤与正常组织摄取比率为约2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1或100:1。
19.根据权利要求8-18中任一项所述的方法，其中所述放射性标记的DOTA半抗原用选自以下的放射性核素标记：213Bi、211At、225Ac、152Dy、212Bi、223Ra、219Rn、215Po、211Bi、221Fr、217At、255Fm、86Y、90Y、89Sr、165Dy、186Re、188Re、177Lu、67Cu、111In、67Ga、51Cr、58Co、99mTc、103mRh、195mPt、119Sb、161Ho、189mOs、192Ir、201Tl、203Pb、68Ga、227Th和64Cu。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述放射性标记的DOTA半抗原包含以下中的一种或多种：Proteus-DOTA、S-2-(R-氨基苄基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷四乙酸(DOTA-Bn)、DOTA-Bn-生物素、BAD(((S)-2-(4-(2-溴)-乙酰胺基)-苄基)-DOTA)、NBD((S)-2-(4-硝基苄基)-DOTA)、DOTA-RGD、DOTA-PEG-E(c(RGDyK))2、DOTA-8-AOC-BBN、p-NO2-Bn-DOTA、DOTA-PESIN、DOTA-生物素-肌氨酸(DOTA-生物素)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸单(N-羟基琥珀酰亚胺酯)(DOTA-NHS)或DOTATyrLysDOTA。
21.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1-7中任一项所述的化合物和使用说明书。
22.根据权利要求21所述的试剂盒，所述试剂盒还包含至少一种抗DOTA BsAb。
23.根据权利要求22所述的试剂盒，其中所述至少一种抗DOTA BsAb与选自以下的肿瘤抗原靶标结合：GPA33、HER2/neu、GD2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、MUM-1、CDK4、N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、p15、gp75、β-连环蛋白、ErbB2、癌症抗原125(CA-125)、癌胚抗原(CEA)、RAGE、MART(黑色素瘤抗原)、MUC-1、MUC-2、MUC-3、MUC-4、MUC-5ac、MUC-16、MUC-17、酪氨酸酶、Pmel 17(gp100)、GnT-V内含子V序列(N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V内含子V序列)、前列腺癌psm、PRAME(黑色素瘤抗原)、β-连环蛋白、EBNA(爱泼斯坦-巴尔病毒核抗原)1-6、p53、肺耐药蛋白(LRP)Bcl-2、前列腺特异性抗原(PSA)、Ki-67、CEACAM6、结肠特异性抗原-p(CSAp)、HLA-DR、CD40、CD74、CD138、EGFR、EGP-1、EGP-2、VEGF、PlGF、胰岛素样生长因子(ILGF)、腱生蛋白、血小板源性生长因子、IL-6、CD20、CD19、PSMA、CD33、CD123、MET、DLL4、Ang-2、HER3、IGF-1R、CD30、TAG-72、SPEAP、CD45、L1-CAM、Lewis Y(Ley)抗原、E-钙粘蛋白、V-钙粘蛋白和EpCAM。
24.根据权利要求21-23中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包含任选地用一种或多种放射性核素标记的DOTA半抗原。
25.根据权利要求24所述的试剂盒，其中所述一种或多种放射性核素选自213Bi、211At、225Ac、152Dy、212Bi、223Ra、219Rn、215Po、211Bi、221Fr、217At、255Fm、86Y、90Y、89Sr、165Dy、186Re、188Re、177Lu、67Cu、111In、67Ga、51Cr、58Co、99mTc、103mRh、195mPt、119Sb、161Ho、189mOs、192Ir、201Tl、203Pb、68Ga、227Th和64Cu。
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