JPH04316600A - Cd25結合分子 - Google Patents
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Abstract
め要約のデータは記録されません。
Description
であり、さらに特定すれば、モノクローナル抗体および
CD25抗原に対する他の結合分子を提供する。
臓、肝臓、心臓、肺および骨髄移植手術では、移植体受
容者の免疫系を抑制して、手術後の移植体拒絶の可能性
を最小限に抑える必要がある。これを目的とした様々な
免疫抑制剤が提案されているが、ある種の免疫抑制剤の
使用により生ずる望ましくない副作用に加えて、免疫抑
制作用の結果、移植体受容者はまた、正常免疫系により
制御されていた細菌またはウイルス感染に特にかかりや
すくなるため、それらの使用は慎重に制御されなければ
ならない。臨床的実践においてうまく使用されている免
疫抑制剤には、ステロイド類、アザチオプリンおよびシ
クロスポリンAがある。臨床的実践では、移植体拒絶症
状発現の阻止または処置に必要な免疫抑制程度と、他の
感染源と戦うと同時に生じ得る望ましくない副作用を制
御下に維持するためのある量の受容者免疫系の保持とを
つり合わせる試みが必要である。また、免疫抑制剤の使
用に加えて、免疫反応を抑制するためのある種のモノク
ローナル抗体(MAbs)の使用が注目されており、特
にT細胞の様々な表面抗原を認識するモノクローナル抗
体が注目されている。この場合もまた、臨床的実践にお
いて、先行技術による抗体ではあまりに強力すぎるか、
または充分には有効でなく、深刻な副作用、例えば高熱
を誘発することもあるという問題に直面している。
続的白血球類型研究会(LeucocyteTypin
g Workshops)により割り当てられたCD(
クラスターデターミネーション)番号により明示される
。例えばCD3という語は現在細胞表面抗原に対して頻
繁に適用されており、この抗原に対するMAbは「抗C
D3」と記載されることも多いが、以下の記載において
、例えばCD3、CD25等といった語はモノクローナ
ル抗体に適用され、対応する細胞表面抗原は「CD3抗
原」等と記載される。特に、全T細胞上に存在する膜抗
原(パンT細胞抗原とも呼ばれている)、例えばCD3
抗原に対するモノクローナル抗体は、それらが免疫系に
対して全体的な抑制活性を有する点で非常に強力な抗体
である。従って、一旦感染が生じると、記憶T細胞が通
常仲介する即時免疫応答が人体から剥奪され得る。移植
体拒絶症状発現の治療ではなく予防を試みている場合、
これは必ずしも望ましいことではない。予防での使用に
適した処置は本質的に選択的であるべきである、すなわ
ち、記憶T細胞のプールを無傷の状態に保つべきであり
、かつ拒絶事象に直接関与し得る範ちゅうのT細胞(活
性化T細胞)は不活化されるべきである。
性化T細胞に対する抗体を用いて達成され得る。これら
のT細胞は、それらの膜表面における高親和性IL−2
レセプターの存在を特徴とする。高親和性IL−2レセ
プターは、少なくとも2つの相異なるポリペプチド鎖、
すなわちCD25抗原としても知られているα−鎖およ
びβ−鎖により構成される。残りのT細胞は、この高親
和性レセプターを発現しないが、α−およびβ−鎖ホモ
2量体から成る低および中程度の親和性レセプターを発
現する。高親和性レセプターに対するIL−2の結合を
妨害するため、選択的に免疫応答を抑制するCD25抗
体は、移植体拒絶発現症状の予防に優れた抗体である。
アームの最後に抗原結合部位を有する一般にY形状のマ
ルチマー分子を含む。この構造の残り、特にYの幹は、
免疫グロブリンと関連したエフェクター機能を伝達する
。IgGクラスの抗体の一般的構造を図1Aに概略的に
示す。重および軽鎖は両方とも可変ドメインおよび不変
部分を含む。抗原結合部位は、軽鎖の可変ドメインを随
伴した重鎖の可変ドメインにより構成される。重および
軽鎖の可変ドメインは、図1Bに示されている同じ一般
的構造を有する。さらに特定すれば、抗体の抗原結合特
性は、高可変領域または相補性決定領域(CDR)と呼
ばれる重および軽鎖の可変ドメインにおける3つの特異
領域により本質的に決定される。図1Bに示されている
通り、これらの3つの高可変領域は、配列が比較的保存
されており、結合に直接は関与しない4つのフレーム構
造領域(FR)と交互に存在する。CDRはループを形
成し、大きくβ−シート立体配座を採るフレーム構造領
域により極めて近い位置で保持される。重鎖のCDRは
関連した軽鎖のCDRと一緒になって、抗体分子の抗原
結合部位を構成する。FRまたはCDR領域を構成する
ものについては、通常、同じ種類で産生される若干の抗
体のアミノ酸配列を比較することにより決定される。C
DRおよびFR領域の一般的同定規則を表1に示す。
する軽鎖可変ドメインの分担度合は、関連した重鎖可変
ドメインの場合と比べて小さいこと、および単離された
重鎖可変ドメインはそれら自体で抗原結合活性を有する
ことが見出された。それらの分子は、共通して現在単一
ドメイン抗体と呼ばれている。幾つかのネズミCD25
モノクローナル抗体は既に存在しており、33B3−1
(イムノテク−メリュー)、BDαIL−2R(ベクト
ン−ディッキンソン)、2C8(アマーシャム)、キャ
ンパス6(MRC、キャンブリッジ)およびATH20
7(フリー・ユニバーシティー、ベルリン)がある。し
かしながら、IgG2aアイソタイプの新規マウスCD
25抗体(以後、RFT5−IgG2aと称す)は、特
に結合親和力に関して先行技術のCD25抗体よりも優
れた特性を有すること、およびRFT5−IgG2aと
同じ高可変領域を有する他のCD25結合分子の構築も
可能であることが見出された。
、CDR2およびCDR3を配列中にまたは順次(in
sequence)含む少なくとも1つのドメインを
含む少なくとも1つの抗原結合部位またはその直接的均
等物を含むCD25結合分子であって、前記CDR1が
アミノ酸配列Arg−Tyr−Trp−Met−His
を有し、前記CDR2がアミノ酸配列Ala−Ile−
Tyr−Pro−Gly−Asn−Ser−Asp−T
hr−Ser−Tyr−Asn−Gln−Lys−Ph
e−Glu−Glyを有し、前記CDR3がアミノ酸配
列Asp−Tyr−Gly−Tyr−Tyr−Phe−
Asp−Pheを有するCD25結合分子を提供する。 発明の第1態様において、CD25結合分子は、単一ド
メインを含む単一抗原結合部位を含む。発明の第2態様
において、CD25結合分子は、 a)高可変領域CDR1、CDR2およびCDR3を配
列中にまたは順次(in sequence)含み、前
記CDR1がアミノ酸配列Arg−Tyr−Trp−M
et−Hisを有し、前記CDR2がアミノ酸配列Al
a−Ile−Tyr−Pro−Gly−Asn−Ser
−Asp−Thr−Ser−Tyr−Asn−Gln−
Lys−Phe−Glu−Glyを有し、前記CDR3
がアミノ酸配列Asp−Tyr−Gly−Tyr−Ty
r−Phe−Asp−Pheを有するものである、第1
ドメイン、およびb)高可変領域CDR1’、CDR2
’およびCDR3’を配列中にまたは順次(inseq
uence)含み、前記CDR1’がアミノ酸配列Se
r−Ala−Ser−Ser−Ser−Ile−Ser
−Tyr−Met−Glnを有し、前記CDR2’がア
ミノ酸配列Asp−Thr−Ser−Lys−Leu−
Ala−Serを有し、前記CDR3’がアミノ酸配列
His−Gln−Arg−Ser−Ser−Tyr−T
hrを有するものである、第2ドメインを含む少なくと
も1つの抗原結合部位またはそれらの直接的均等物を含
む。特記しない場合、以後、ポリペプチド鎖は全て、N
−末端の先端部(N−terminal extrem
ity)から出発し、C−末端の先端部で終わるアミノ
酸配列を有するものとして記載する。抗原結合部位が第
1および第2ドメインを両方とも含む場合、これらは同
じポリペプチド分子上に位置し得るか、または好ましく
は、各ドメインは異なる鎖に存在し得、第1ドメインは
免疫グロブリン重鎖またはそのフラグメントの一部分で
あり、第2ドメインは免疫グロブリン軽鎖またはそのフ
ラグメントの一部分であり得る。
分子と共に高親和性IL−2レセプターを形成した形で
CD25抗原に結合し得る分子を全て包含する。この結
合反応は、非関連的特異性を有する抗体、例えば抗リソ
チーム抗体を使用する陰性対照試験を参考にした、例え
ばレセプターに対するIL−2結合の阻害を測定するた
めのバイオアッセイまたは任意の種類の結合検定を含む
標準的方法(定性的検定)により示され得る。有利には
、CD25抗原に対する本発明分子の結合は、きっ抗物
質としてAHT207、BDαIL−2−Rまたは33
B3−1抗体を用いたきっ抗的結合検定で示され得る。 好ましくは、AHT207またはBDαIL−2−R抗
体がきっ抗物質として選択される。結合検定の特定例を
下記に示す。ひと末梢血単核細胞(HPBM)を、2ミ
リモルのL−グルタミン、100単位/mlのペニシリ
ン、100μg/mlのストレプトマイシン、25ミリ
モルの重炭酸ナトリウムおよび10%牛胎児血清(FC
S)を補った培養培地RPMI1640において生長さ
せる。1μg/mlのフィトヘマグルチニン(PHA)
を用いてHPBMを刺激する。3日後、芽細胞を、2%
牛血清アルブミン(BSA)および2%アジドを補った
燐酸緩衝食塩水に3.106/mlの濃度で再懸濁する
。この懸濁液の50μl試料を、非キャッピング条件下
、1〜100μg/mlの勾配濃度の遮断抗体(きっ抗
物質)と10分間20℃でインキュベーションする。次
いで、1μg/mlの割合で本発明のビオチニル化抗体
を細胞に加え、インキュベーションを10分間続行する
。細胞を洗浄し、さらに10分間フルオレセイン標識ス
トレプトアビジンとインキュベーションする。細胞を再
洗浄し、ホルマリンにより固定し、ビオチニル化抗体の
結合を検出するフルオロ−細胞測定器により分析する。 平行して、陰性対照として非関連的特異性を有するビオ
チニル化抗体を用いた実験を行う。抗原結合分子の例と
しては、B細胞またはハイブリドーマにより産生された
抗体およびキメラもしくはヒューマナイズド抗体もしく
はそのフラグメント、例えばF(ab’)2およびFa
bフラグメント、並びに1本鎖または単一ドメイン抗体
がある。1本鎖抗体は、通常10〜30個のアミノ酸、
好ましくは15〜25個のアミノ酸から成るペプチド・
リンカーにより共有結合した抗体重および軽鎖の可変ド
メインにより構成される。従って、上記構造は重および
軽鎖の不変部分を含まず、小ペプチド・スペーサーは全
不変部分よりも抗原性を低くすべきであると考えられて
いる。「キメラ抗体」は、重または軽鎖または両方の不
変領域がヒトに由来し、両重および軽鎖の可変ドメイン
がヒト以外(例、ネズミ)に由来する抗体を意味する。 「ヒューマナイズド抗体」は、高可変領域(CDR)が
ヒト以外(例、ネズミ)に由来し、免疫グロブリンの他
の全部または実質的に全部の部分、例えば不変領域およ
び可変ドメインの高保存部分、すなわちフレーム構造領
域がヒトに由来する抗体を意味する。しかしながら、ヒ
ューマナイズド抗体は、高可変領域に隣接したフレーム
構造領域の部分にネズミ配列の数個のアミノ酸を保持し
得る。高可変領域は、あらゆる種類、好ましくはネズミ
またはヒト起源のフレーム構造領域を随伴し得る。適当
なフレーム構造領域は、「シークエンシーズ・オブ・プ
ロテインズ・オブ・イミュノロジカル・インタレスト」
(Sequences of proteins of
immunological interest)(
キャバット等、アメリカ合衆国厚生省、パブリック・ヘ
ルス・サービス、ナショナル・インスティテュート・オ
ブ・ヘルス)に記載されている。しかしながら、好まし
い重鎖フレーム構造は、配列番号1に示されているRF
T5−IgG2aのフレーム構造である。それは、順に
FR1、FR2、FR3およびFR4領域により構成さ
れる。同様に、配列番号2は、FR1’、FR2’、F
R3’およびFR4’領域により順に構成される好まし
いRFT5−IgG2a軽鎖フレーム構造を示す。
ら出発し、117位のアミノ酸で終わる配列番号1に示
された配列と実質的に等しいアミノ酸配列を有する第1
ドメインまたは上記第1ドメイン、および1位のアミノ
酸から始まり、104位のアミノ酸で終わる配列番号2
に示された配列と実質的に等しいアミノ酸配列を有する
第2ドメインを含む少なくとも1つの抗原結合部位を含
むCD25結合分子を提供する。全部のひとにおいて天
然で見出される蛋白質に対して産生したモノクローナル
抗体は、必ずやひと以外の系、例えばマウスにおいて開
発されなければならない。この直接的結果として、ハイ
ブリドーマにより産生された異種抗体が、ひとに投与さ
れると、異種免疫グロブリンの不変部分が主として伝達
する望ましくない免疫応答を発する。これにより、上記
抗体は長期間にわたっては投与され得ないため、それら
の使用は明らかに制限される。従って、1本鎖、単一ド
メイン、ひとに投与された場合に実質的な異型的応答を
発するとは考えられないキメラまたはヒューマナイズド
抗体の使用が特に好ましい。前述したことから、本発明
のさらに好ましいCD25結合分子は、少なくともa)
(i)高可変領域CDR1、CDR2およびCDR3を
配列中にまたは順次(insequence)含む可変
ドメインおよび(ii)ひと重鎖の不変部分またはその
フラグメントを含み、前記CDR1がアミノ酸配列Ar
g−Tyr−Trp−Met−Hisを有し、前記CD
R2がアミノ酸配列Ala−Ile−Tyr−Pro−
Gly−Asn−Ser−Asp−Thr−Ser−T
yr−Asn−Gln−Lys−Phe−Glu−Gl
yを有し、前記CDR3がアミノ酸配列Asp−Tyr
−Gly−Tyr−Tyr−Phe−Asp−Pheを
有する、1つの免疫グロブリン重鎖またはそのフラグメ
ント、およびb)(i)高可変領域CDR1’、CDR
2’およびCDR3’を配列中にまたは順次(in s
equence)含む可変ドメインおよび(ii)ひと
軽鎖の不変部分またはそのフラグメントを含み、前記C
DR1’がアミノ酸配列Ser−Ala−Ser−Se
r−Ser−Ile−Ser−Tyr−Met−Gln
を有し、前記CDR2’がアミノ酸配列Asp−Thr
−Ser−Lys−Leu−Ala−Serを有し、前
記CDR3’がアミノ酸配列His−Gln−Arg−
Ser−Ser−Tyr−Thrを有する、1つの免疫
グロブリン軽鎖またはそのフラグメントを含むキメラ抗
CD25抗体およびそれらの直接的均等物から選択され
る。
、 a)高可変領域CDR1、CDR2およびCDR3を配
列中にまたは順次(in sequence)含み、前
記高可変領域が配列番号1に示されたアミノ酸配列を有
するものである、第1ドメイン、 b)高可変領域CDR1’、CDR2’およびCDR3
’を配列中にまたは順次(insequence)含み
、前記高可変領域が配列番号2に示されたアミノ酸配列
を有するものである、第2ドメイン、および c)第1ドメインのN−末端の先端部および第2ドメイ
ンのC−末端の先端部または第1ドメインのC−末端の
先端部および第2ドメインのN−末端の先端部に結合し
ているペプチド・リンカーを含む抗原結合部位を含む1
本鎖結合分子およびそれらの直接的均等物から選択され
得る。よく知られている通り、アミノ酸配列の小さな変
化、例えば1個または幾つかのアミノ酸の欠失、付加ま
たは置換により、実質的に同じ特性を有する元の蛋白質
の対立遺伝子形態が誘導され得る。すなわち、「その直
接的均等物」という語は、(i)全体としての高可変領
域CDR1、CDR2およびCDR3が、配列番号1に
示された高可変領域と少なくとも80%の相同性、好ま
しくは少なくとも90%の相同性、さらに好ましくは少
なくとも95%の相同性を示し、そして(ii)分子X
の場合と同一のフレーム構造領域を有するが、配列番号
1に示されたものと同一の高可変領域CDR1、CDR
2およびCDR3を有するレファレンス分子と実質的に
同じ程度までレセプターへのIL−2の結合を阻害し得
る単一ドメインCD25結合分子(分子X)か、または
(i)全体としてのCDR1、CDR2、CDR3、C
DR1’、CDR2’およびCDR3’が、配列番号1
および2に示された高可変領域と少なくとも80%の相
同性、好ましくは少なくとも90%の相同性、さらに好
ましくは少なくとも95%の相同性を示し、そして(i
i)分子X’と同一のフレーム構造領域および不変部分
を有するが、配列番号1および2に示されたものと同一
の高可変領域CDR1、CDR2、CDR3、CDR1
’、CDR2’およびCDR3’を有するレファレンス
分子と実質的に同じ程度までレセプターへのIL−2の
結合を阻害し得る、1結合部位に対し少なくとも2つの
ドメインを有するCD25結合分子(分子X’)を全て
包含する。この最後の特徴は、好都合にはリンパ球混合
反応(MLR)生物検定、抗原特異的HPBM応答生物
検定およびIL−2依存性Tリンパ芽球増殖生物検定を
含む様々な検定で試験され得る。それらの検定法は、こ
の明細書に後述されている。「同じ程度まで」という語
は、レファレンスおよび均等分子が、上記で引用された
生物検定の一つにおいて、統計的方法で本質的に同一の
IL−2結合阻害曲線を呈することを意味する。最も好
ましくは、キメラCD25抗体は、少なくとも a)1位のアミノ酸から出発し、117位のアミノ酸で
終わる配列番号1に示された配列と実質的に同じアミノ
酸配列を有する可変ドメインおよびヒト重鎖の不変部分
を含む1個の重鎖、および b)1位のグルタミン酸から出発し、104位のグルタ
ミン酸で終わる配列番号2に示された配列と実質的に同
じアミノ酸配列を有する可変ドメインおよびヒト軽鎖の
不変部分を含む軽鎖を含む。ヒト重鎖の不変部分は、γ
1、γ2、γ3、γ4、μ、α1、α2、δまたはεタ
イプ、好ましくはγタイプ、さらに好ましくはγ1タイ
プに属し得、ヒト軽鎖の不変部分は、κまたはλタイプ
(これはλ1、λ2およびλ3サブタイプを包含する)
に属し得るが、好ましくはκタイプに属する。これら全
ての不変部分のアミノ酸配列はキャバット等(前出)に
より与えられている。本発明のCD25結合分子のコン
ジュゲート、例えば酵素または毒素または放射性同位元
素のコンジュゲートもまた、本発明の範囲内に包含され
る。本発明のCD25結合分子は組換えDNA技術によ
り製造され得る。このためには、結合分子をコードする
1個またはそれ以上のDNA分子を構築し、適当な制御
配列下に置き、発現に適した宿主生物に導入しなければ
ならない。
i)本発明の単一ドメインCD25結合分子、本発明の
1本鎖CD25結合分子、本発明のCD25結合分子の
重もしくは軽鎖またはそれらのフラグメントをコードす
るDNA分子、および(ii)組換え手段による本発明
CD25結合分子の製造における本発明DNA分子の用
途を提供する。当技術分野の現状として、熟練した者で
あれば、この明細書で提供されている情報、すなわち高
可変領域のアミノ酸配列およびそれらをコードするDN
A配列が与えられれば、本発明のDNA分子を合成する
ことができる。可変ドメイン遺伝子の構築方法は、例え
ばEPA239400に記載されており、次の通り短く
要約され得る。何等かの特異性を有するMAbの可変ド
メインをコードする遺伝子をクローン化する。フレーム
構造および高可変領域をコードするDNAセグメントを
決定し、高可変領域をコードするDNAセグメントを除
去することにより、フレーム構造領域をコードするDN
Aセグメントを接合部分で適当な制限部位と融合させる
。制限部位は、標準的方法によるDNA分子の突然変異
誘発により適当な位置で生成され得る。2本鎖合成CD
Rカセットは、配列番号1または2に与えられた配列に
従いDNA合成により製造される。これらのカセットに
は接着末端が加えられ、その結果、それらはフレーム構
造の接合部分でライゲーションされ得る。免疫グロブリ
ン可変ドメインをコードするDNA分子を得るためのプ
ロトコルを図5に示す。さらに、本発明のモノクローナ
ル抗体をコードするDNA構築物を得るのに、生産性ハ
イブリドーマ・セルラインからmRNAに接近すること
は必要ではない。すなわち、PCT出願WO90/07
861は、遺伝子のヌクレオチド配列に関して書かれた
情報しか与えられていない組換えDNA技術によるMA
bの製造について充分な指示を与えている。この方法は
、若干のオリゴヌクレオチドの合成、PCR方法による
それらの増幅および所望のDNA配列を得るためのそれ
らのスプライシングを含む。重および軽鎖不変部分をコ
ードする適当なプロモーターまたは遺伝子を含む発現ベ
クターは、一般に入手可能である。すなわち、一旦本発
明のDNA分子が製造されると、それは、好都合には適
当な発現ベクターへ導入され得る。また、1本鎖抗体を
コードするDNA分子は、標準的方法、例えばWO88
/1649の記載に従い製造され得る。前述したこと、
およびハイブリドーマにより天然に分泌されるマウスM
Abは好ましいタイプのMAbではないことから、記載
の基準に充分に応じる必要のあるハイブリドーマ寄託物
は無いと考えられる。
分子を製造するための組換え手段は、下記の通り、第1
および第2DNA構築物を含む。第1DNA構築物は、
重鎖またはそのフラグメントをコードし、a)択一的ま
たは交互に(alternatively)フレーム構
造および高可変領域を含む可変ドメインをコードし、前
記高可変領域が順にCDR1、CDR2およびCDR3
であり、それらのアミノ酸配列が配列番号1に示されて
いる第1部分であって、可変ドメインの最初のアミノ酸
をコードするコドンから出発し、可変ドメインの最後の
アミノ酸をコードするコドンで終わる第1部分、および
b)重鎖の不変部分の最初のアミノ酸をコードするコド
ンから出発し、不変部分またはそのフラグメントの最後
のアミノ酸をコードするコドン、次いでナンセンスコド
ンで終わる重鎖不変部分またはそのフラグメントをコー
ドする第2部分を含む。好ましくは、この第1部分は、
1位のアミノ酸から出発し、117位のアミノ酸で終わ
る配列番号1に示されたアミノ酸配列と実質的に同じア
ミノ酸配列を有する可変ドメインをコードする。さらに
好ましくは、第1部分は、142位のヌクレオチドから
出発し、492位のヌクレオチドで終わる配列番号1に
示されたヌクレオチド配列を有する。また好ましくは、
第2部分は、ヒト重鎖の不変部分、さらに好ましくはヒ
トγ1鎖の不変部分をコードする。この第2部分は、ゲ
ノム起源のDNAフラグメント(イントロンを含む)ま
たはcDNAフラグメント(イントロンを含まず)であ
り得る。第2DNA構築物は、軽鎖またはそのフラグメ
ントをコードし、 a)択一的または交互に(alternatively
)フレーム構造および高可変領域を含む可変ドメインを
コードし、前記高可変領域が順にCDR1’、CDR2
’およびCDR3’であり、それらのアミノ酸配列が配
列番号2に示されている第1部分であって、可変ドメイ
ンの最初のアミノ酸をコードするコドンから出発し、可
変ドメインの最後のアミノ酸をコードするコドンで終わ
る第1部分、およびb)軽鎖の不変部分の最初のアミノ
酸をコードするコドンから出発し、不変部分またはその
フラグメントの最後のアミノ酸をコードするコドン、次
いでナンセンスコドンで終わる軽鎖不変部分またはその
フラグメントをコードする第2部分を含む。好ましくは
、この第1部分は、1位のアミノ酸から出発し、104
位のアミノ酸で終わる配列番号2に示されたアミノ酸配
列と実質的に同じアミノ酸配列を有する可変ドメインを
コードする。さらに好ましくは、第1部分は、244位
のヌクレオチドから出発し、555位のヌクレオチドで
終わる配列番号2に示されたヌクレオチド配列を有する
。また好ましくは、第2部分は、ヒト軽鎖の不変部分、
さらに好ましくはヒトκ鎖の不変部分をコードする。第
1および第2DNA構築物において、第1および第2部
分は、好ましくはイントロンにより分離される。第1お
よび第2分離間に位置するイントロンに、好ましくはエ
ンハンサーを挿入する。転写されるが翻訳されないこの
遺伝子要素の存在は、第2部分の有効な転写に必要とさ
れ得る。さらに好ましくは、第1および第2DNA構築
物は、有利にはヒトに由来する重鎖遺伝子のエンハンサ
ーを含む。第1または第2DNA構築物は、有利には第
1部分の上流に位置し、誘導ペプチドの部分をコードす
る第3部分を含む。この第3部分は、最初のアミノ酸を
コードするコドンから出発し、誘導ペプチドの最後のア
ミノ酸で終わる。このペプチドは、それらが発現される
宿主生物による鎖の分泌に必要とされ、続いて宿主生物
により除去される。好ましくは、第1DNA構築物の第
3部分は、−19位のアミノ酸から出発し、−1位のア
ミノ酸で終わる、配列番号1に示されたアミノ酸配列と
実質的に同じアミノ酸配列を有する誘導ペプチドをコー
ドする。また好ましくは、第2DNA構築物の第3部分
は、−22位のアミノ酸から出発し、−1位のアミノ酸
で終わる、配列番号2に示されたアミノ酸配列を有する
誘導ペプチドをコードする。DNA構築物の各々を、適
当な制御配列の制御下、特に適当なプロモーターの制御
下に置く。DNA構築物が発現を目的として導入される
宿主生物に適合するものであれば、いかなる種類のプロ
モーターでも使用され得る。しかしながら、発現がほ乳
類細胞で行なわれる場合、免疫グロブリン遺伝子のプロ
モーターの使用が特に好ましい。所望の抗体は、細胞培
養またはトランスジェニック動物において製造され得る
。適当なトランスジェニック動物は、適当な制御配列下
に置かれた第1および第2DNA構築物を卵へマイクロ
−インジェクションし、こうして製造された卵を適当な
擬妊娠している雌に導入し、所望の抗体を発現する子孫
を選択することを含む標準的方法に従い得られる。抗体
鎖を細胞培養中で製造しなければならない場合、まずD
NA構築物を単一発現ベクターまたは2種の別々ではあ
るが適合性のある発現ベクターへ挿入しなければならず
、後者の候補が好ましい。従って、本発明はまた、上記
DNA構築物のうちの少なくとも一つを含む、原核生物
または真核生物セルラインにおいて複製可能な発現ベク
ターを提供する。次いで、DNA構築物を含む各発現ベ
クターを、適当な宿主生物へ導入する。DNA構築物を
2種の発現ベクターにおいて別々に挿入する場合、それ
らは別々に導入されるか(すなわち1細胞に対し1タイ
プのベクター)、または同時導入され得、後者の候補が
好ましい。 適当な宿主生物は、細菌、酵母またはほ乳類セルライン
であり得、この後者が好ましい。さらに好ましくは、ほ
乳類セルラインは、リンパ様起源、例えばミエローマ、
ハイブリドーマまたは正常不死化B細胞に由来するが、
内在性抗体重または軽鎖を全く発現しない。また、宿主
生物は、1細胞当たり多数のコピーのベクターを含むの
が好ましい。宿主生物がほ乳類セルラインである場合、
この望ましい目標は、標準的方法に従いコピー数を増幅
することにより達成され得る。増幅方法は、通常、高め
られた薬剤耐性に関する選択により構成され、前記耐性
は発現ベクターによりコードされる。
1および第2DNA構築物により形質転換された生物を
培養し、(ii)培養物から活性CD25結合分子採取
することを含む、マルチ鎖CD25結合分子の製造方法
が提供される。別法として、重および軽鎖は、別々に採
取され、インビトロ再生後に活性結合分子中へ再構成さ
れ得る。再構成方法は当業界ではよく知られている。方
法の例は、特にEPA120674またはEPA125
023に記載されている。従って、方法はまた、(i)
本発明の第1DNA構築物により形質転換された第
1生物を培養し、重鎖またはそのフラグメントを培養物
から採取し、そして(ii) 本発明の第2DNA構築
物により形質転換された第2生物を培養し、軽鎖または
そのフラグメントを培養物から採取し、そして(iii
)(i)で得られた重鎖またはそのフラグメントおよび
(ii)で得られた軽鎖またはそのフラグメントから活
性CD25結合分子をインビトロで再構成することを含
み得る。同様に、また、(i)本発明の1本鎖または単
一ドメインCD25結合分子を各々コードするDNA構
築物により形質転換された生物を培養し、(ii)培養
物から前記分子を採取することを含む、1本鎖または単
一ドメインCD25結合分子の製造方法が提供される。
パ球混合反応(MLR)生物検定(アクバル等、「ジャ
ーナル・オブ・イミュノロジー」(J.Immunol
.)、140、2171−8)に示されている通り、非
常に優れた免疫調節活性を呈する。MLRは、一般に、
インビボ拒絶に導く異型的移植体応答のインビトロ均等
反応であると考えられている。 1.MLRの阻害。 第1ドナーのHPBM製品から、105HPBMを含む
100μl試料のアリコートをとり、0〜300ng/
mlの範囲(これらの限界値を含む)における様々な濃
度の本発明分子を加える。次いで、各試料を、第2ドナ
ーの105個のHLA−不適合X線照射−HPBMまた
はT細胞こ渇HPBMを含む100μlアリコートと混
合する。混合物を6日間37℃でインキュベーションし
、次いで10μl容量中1μCiのメチル・3H−チミ
ジン(3H−Tdr)を加える。6時間後、放射能取り
込みにより細胞増殖を測定する。この特定検定では、本
発明分子は、図6に示されている通り0.3ng/ml
〜の濃度でインビトロ免疫調節活性を示す。細胞生長の
50%は約3ng/mlで阻害される。また、本発明分
子の免疫調節活性は、下記の要領で抗原特異的HPBM
応答の阻害またはIL−2依存性Tリンパ芽球増殖の阻
害を測定することにより評価され得る。 2.抗原特異的HPBM応答の阻害。 本発明分子は、PPD(ツベルクリン)特異的、HLA
クラスII制限T細胞応答の発生を有効に阻害し、この
ことは、レセプターに対する内在的に生成されたIL−
2の結合阻害能力を示している。インビボでこれらの抗
原特異的応答は、自己免疫性および移植拒絶の開始にお
いて重大な役割を演じると予測される。HPBMの製品
から、105HPBM含有100μl試料のアリコート
をとり、0〜300ng/mlの範囲(これらの限界値
を含む)における様々な濃度の本発明分子およびツベル
クリン(PPD)を30μg/mlの最終濃度で加える
。試料を、6日間37℃でインキュベーションし、次い
で10μl容量中1μCiのメチル・3H−チミジンを
加える。6時間のインキュベーション後、放射能取り込
みにより細胞増殖を測定する。この特定検定において、
本発明分子は、図7に示されている通り約10ng/m
l〜の免疫調節活性を示す。細胞生長の50%は、約5
0ng/mlで阻害される。 3.IL−2依存性Tリンパ芽球増殖の阻害。 本発明分子は、MLRまたはPPD刺激により誘発され
たヒトT芽細胞のIL−2依存性生長を有効に阻害する
。これらの細胞は、自己免疫性および拒絶症状発現の慢
性化において主たる役割を演じると予想される。200
μlの最終容量中20×103の5日令PPDまたはM
LR刺激HPBMを含むトリプリケイト培養物を、5、
10または20ng/mlの組換えIL−2および0〜
10μg/ml(これらの限界値を含む)の範囲におけ
る様々な濃度の本発明分子の存在下37℃で48時間イ
ンキュベーションする。次いで、3H−Tdrを加える
。6時間後、放射能取り込みにより細胞増殖を測定する
。この特定検定において、本発明分子は、図8Aおよび
8B、8Cおよび8Dに示されている通り0.1μg/
ml〜の濃度で免疫調節活性を示す。従って、本発明は
また、(i) ヒト免疫系の免疫抑制における本発明
のCD25結合分子の用途、(ii) 処置を必要とす
る患者に対し、本発明のCD25結合分子の免疫抑制有
効量を投与することを含む、ヒト免疫系の免疫抑制方法
、(iii)本発明のCD25結合分子および医薬的に
許容し得る担体または希釈剤を含む、ヒト免疫系の免疫
抑制を目的とする医薬組成物を提供する。特に、本発明
のCD25結合分子は、移植体拒絶症状発現の予防に有
用である。
論、例えば使用される特定の本発明分子、宿主、投与方
法並びに処置される状態の性質および重症度により変化
する。しかしながら、予防用途の場合、体重1キログラ
ム当たり約0.1mg〜約1mgの一日用量で一般に満
足すべき結果の得られることが示されている。拒絶事象
が実際に生じた場合、それを処置するためには、これら
の用量を4以下の係数により増加させるべきである。本
発明分子は、好都合には、非経口的、通常例えば前肘静
脈または他の末梢静脈へ静脈内投与される。予防処置と
しては、典型的には、移植当日、好ましくは移植の数時
間前から始め、2〜4週間1日1回〜1週間に1回本発
明分子を投与する。また、本発明分子は、CD25抗原
を発現する細胞の悪性腫ようの処置、例えばT細胞白血
病およびある種の他の白血病およびリンパ腫の処置に有
用であり得る。この用途の場合、CD25結合分子は、
分子をアルファ−放出性放射性核種に結合させた放射性
コンジュゲート形態で使用され得る。また、本発明分子
は、HIV感染の処置または予防に有用であり得る。H
IVウイルスは、増殖するために増殖性T細胞を必要と
すると思われるため、CD25抗原の遮断によりT細胞
の増殖を阻害すると、当然、ウイルス増殖も阻害される
。本発明の医薬組成物は常法で製造され得る。本発明に
よる組成物は、好ましくは凍結乾燥形態を呈する。即時
投与の場合、適当な水性担体、例えば注射用滅菌水また
は滅菌緩衝食塩水にそれを溶かす。ボーラス注射として
ではなく注入投与用に大量の溶液の調製が望ましいと考
えられる場合、製剤時にヒト血清アルブミンまたは患者
自身のヘパリンで凝血防止した血液を食塩水に混入させ
るのが有利である。過剰の上記生理学的不活性蛋白質が
存在すると、注入溶液と共に使用されている容器および
管の壁に吸着することによりモノクローナル抗体の喪失
が阻止される。アルブミンを使用する場合、適当な濃度
は食塩水溶液の0.5〜4.5重量%である。本発明の
別の態様によると、活性化T細胞に対する少なくとも2
種の抗原結合分子であって、活性化T細胞に特有の少な
くとも2種の異なる抗原を認識する結合分子を組み合わ
せて使用することにより、特に有益な結果が得られるこ
とが見出された。好ましくは、各々異なる抗原を認識す
る2種の異なる抗原結合分子の組み合わせを使用する。 すなわち、抗原結合分子は両方とも活性化T細胞表面抗
原を認識するが、それらは、活性化T細胞上の同じ結合
部位に対して互いに争うことはない。好ましくは、抗原
結合分子の一方はCD25結合分子である。従って、本
発明はまた、少なくとも1個のCD25結合分子、およ
び活性化T細胞に特有なCD25以外の少なくとも1個
の抗原に対する少なくとも1個の抗原結合分子から成る
混合物を含む免疫抑制組成物を提供する。
用される互いに組み合わせた活性化T細胞に対する少な
くとも2つの抗原結合分子であって、活性化T細胞に特
有な少なくとも2つの異なる抗原(ただし、これらのう
ち1つはCD25抗原である)を認識する結合分子を提
供する。「活性化T細胞に対する抗原結合分子」という
語は、活性化T細胞と強く反応するが残りのT細胞とは
弱くしか、または全く反応しない結合分子を意味する。 好ましくは、抗原結合分子は完全な免疫グロブリン分子
、さらに好ましくはネズミ、キメラまたはヒューマナイ
ズド抗体、特にキメラ・モノクローナル抗体である。好
ましいCD25モノクローナル抗体は、上記アミノ酸配
列を有するCDR’類を有する抗体である。有利には、
本発明組成物はまた、免疫抑制剤、例えばシクロスポリ
ンAを含み得るか、またはそれと組み合わせて使用され
得る。CD25以外の活性化T細胞抗原に対する好まし
いモノクローナル抗体は、典型的には、ボストン・ワー
クショップにより確立され、ラインヘルツ、ハイネス、
ナドラーおよびベルスタインにより「ロイコサイト・タ
イピングII、ボリュームI・ヒューマンTリンフォサ
イツ」(Leucpcyte Typing II,
Vol.I human T lymphocytes
)(スプリンガー・フェルラーク、1985)に報告さ
れているCD7クラスターに分類されるものである。C
D7抗原は、残りのT細胞の約80%で異種的に発現さ
れる。しかしながら、この発現は、活性化時に強く増強
される(強度は2−3倍上昇)。従って、抗体の好まし
い組み合わせは、CD7とCD25抗体との組み合わせ
である。従って、本発明組成物は、好ましくは少なくと
も1個のCD25抗体と一緒に少なくとも1個のCD7
抗体から成る、さらに好ましくは1個のCD25抗体と
1個のCD7抗体から成る混合物を含む。また好ましく
は、両抗体はIgGアイソタイプに属する。所望により
免疫抑制剤と一緒に使用され得る2つの抗体は、様々な
方法で臨床的実践において使用され得る。好ましくは、
それらを一緒に混合し、物理的混合物を患者に投与する
。別法として、別々のレザーバーから受容者に抗体およ
び所望による免疫抑制剤を任意の順序ではあるが同時に
投与する。組成物は、単一CD25抗体に関する上記要
領に従い製造および非経口投与され得る。別法として、
免疫抑制剤を経口投与し、モノクローナル抗体を別々ま
たは混合物として非経口投与する。適当な組成物の調製
を助けるため、モノクローナル抗体および所望による免
疫抑制剤は、混合または同時投与に関する使用説明書と
共に、同一容器内で別々にパッケージ化され得る。キッ
トの例には、活性化T細胞に対する少なくとも2つの抗
体であって、活性化T細胞に特有の少なくとも2つの異
なる抗原(ただし、これらのうち1つはCD25抗原で
ある)を認識する抗体の個別単位用量形態を含む例えば
マルチバレルド注射器またはツイン・パックがある。
所望により免疫抑制剤と組み合わせて投与すると、使用
されている用量レベルでの許容し得ない副作用が回避さ
れること、および個々の抗体により観察される副作用の
強化が存在しないことを示している。予防用途の場合、
適当な用量は、通常、患者の体重1キログラム当たり0
.05−0.5ミリグラム程度の第1抗体(例、CD2
5抗体)および体重1キログラム当たり0.05−0.
5ミリグラム程度の第2抗体(例、CD7抗体)の投与
を必要とする。免疫抑制剤がシクロスポリンである場合
、所望により使用され得る免疫抑制剤の推奨量は、非経
口投与の場合体重1キログラム当たり2〜5ミリグラム
および経口投与の場合体重1キログラム当たり10−1
5mgである。本発明組成物は、日毎または週毎、好ま
しくは週毎に投与され得る。本発明組成物は特に移植体
拒絶症状発現の予防用に設計されているが、その用途は
、好都合には拒絶事象が実際に生じたときのその処置を
も包含し得る。この場合、用量を4の係数以下により増
加させるべきである。この発明での使用に適したネズミ
・モノクローナル抗体は自体公知である。活性化T細胞
表面抗原に対する多くのモノクローナル抗体は、世界の
様々な国々にあるカルチャー・コレクションから入手可
能であり、具体的にはアメリカ合衆国、メリーランド、
ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ションは、適当なモノクローナル抗体または前記抗体を
分泌するハイブリドーマを提供し得る。本発明で使用さ
れ得、ATCCから入手可能なCD7モノクローナル抗
体を分泌するハイブリドーマの一例は、T3−3A1で
ある。 他のCD7抗体は、RFT−2およびCHH380(キ
メラ抗体)である。CD25抗体としては、上述の好ま
しいRFT−5およびそのキメラ誘導体に加えて、M7
/2(ガウルトン等、「クリニカル・イミュノロジー・
アンド・イミュノパソロジー」(Clin.Immun
ol.and Immunopath.)(1985)
36:18)、抗−tac抗体(内山等、「ジャーナル
・オブ・イミュノロジー」(J.Immunol.)(
1981)126(4):1393)およびキャンパス
6モノクローナル抗体が含まれる。CD25およびCD
7モノクローナル抗体の組み合わせの相乗効果は、上記
MLR生物検定によりインビトロで、またヒト患者に関
する臨床試験によりインビボで立証される。MLR生物
検定において、3H−TdR取り込みの阻害は、CD7
(RFT2)またはCD25(RFT5)モノクローナ
ル抗体が単独に加えられた培養物中で観察され、これら
の抗体の両方を同じ総濃度で一緒に使用すると、かなり
大きな程度の阻害が行なわれる。MLRは、インビボ拒
絶に至る同種間移植体応答のインビトロ均等反応である
が、上記阻害はインビボ免疫抑制と均等内容である。C
D7またはCD25モノクローナル抗体の存在下、10
ナノグラム/ml〜100μg/mlの用量範囲でシク
ロスポリンが加えられたMLRでは、全用量範囲におい
てシクロスポリン単独の場合と比べて3H−TdR阻害
の増加が観察される。CD7、CD25およびシクロス
ポリンの組み合わせは、他の組み合わせよりも大きな阻
害効果を示す。臨床試験において、腎臓、肝臓または心
臓移植を受ける予定の患者を予防的治療用に選択する。 移植当日、手術の2時間前、実施例5のキメラCD25
抗体をキメラCD7抗体(CHH380)と一緒に用い
た初回静脈内注入を、体重1kg当たり各抗体0.2m
gの用量で実施する。 手術の2日後、体重1kg当たり0.4mgでの2つの
抗体の同一注入を実施し、次いで1週間隔で1か月間反
復する。静脈内注入液は次の要領で製造される。凍結乾
燥抗体を一緒に混合し、4.5重量%のヒト・アルブミ
ンを含む100ml滅菌緩衝食塩水中に分散させる。こ
の食塩水分散液を30分間かけて患者に投与する。患者
はまた、標準的シクロスポリン療法も受けている。1箇
月の治療期間中、拒絶症状が発現した患者はいない。
遺伝子の構造を示す概略図である。図1Bは、フレーム
構造(FR)および高可変(CDR)領域に対する重ま
たは軽鎖の可変ドメインの配置を表す図である。図2A
および2Bは、ネズミ重鎖エンハンサー(図2A)をコ
ードするか、またはマウスCκおよび5つのJκ遺伝子
セグメント(図2B)をコードする、32P標識DNA
プローブを用いたサザーン・ブロットによる、マウス・
ハイブリドーマRFT5−IgG2a(1)、RFT5
−IgG1(2)、RFT4(3)およびNS−1(4
)のEcoRI−消化ゲノムDNAの分析を示す図であ
る。10μgのゲノムDNAをEcoRIで消化し、0
.8%アガロース・ゲルにおいてサイズ分画化する。次
に、フラグメントをニトロセルロース膜へ移し、プロー
ブとハイブリダイゼーションさせる。洗浄後、膜を一夜
コダックX−Oマット・フィルムに暴露する。図3Aお
よび3Bは、親発現ベクターpSV2−neo−huC
γ1およびpSV2−DHFR−Eμ−huCκを示す
図である。両プラスミドは、アンピシリン耐性遺伝子(
amp・R)並びにpBR322およびSV40の複製
開始点(pBR322oriおよびSV40ori)を
含む。pSV2−neo−huCγ1は、ネオマイシン
遺伝子(neo・R)およびヒトγ1不変部分をコード
する遺伝子(huCγ1)の存在を特徴とするが、pS
V2−DHFR−Eμ−huCκには、ジヒドロ葉酸還
元酵素(DHFR)遺伝子(メトトレキセイト耐性)お
よびヒトκ不変部分をコードする遺伝子(huCκ)が
挿入されている。キメラ重または軽鎖を発現させるため
の最終ベクターは、各々誘導ペプチド(L)、およびヒ
ト重鎖エンハンサーと一緒にRFT5−IgG2a重鎖
の可変ドメイン(VDJ2)をコードするDNAフラグ
メントを、pSV2−neo−huCγ1へ挿入し、誘
導ペプチド(L)およびRFT5−IgG2a軽鎖の可
変ドメイン(VJ2)をコードするDNAフラグメント
を、pSV2−DHFR−Eμ−huCκへ挿入するこ
とにより得られる。図4Aおよび4Bは、各々実施例5
記載の方法AおよびBに従い、増加濃度のメトトレキセ
イト(MTX)で生長させた個々の細胞プールの生産性
を示す図である。グラフのY軸は、72時間でmg/1
09細胞において生産されたモノクローナル抗体の量を
与える。図5は、4つのフレーム構造領域を一緒に融合
させた形で含むベクターへのCDRカセットの挿入によ
る、CDR置換物を構築するためのプロトコルを示す図
である。図6は、(x)RFT5−IgG2a(γ2a
、κ)および(o)本発明のネズミ−ヒト・キメラMA
b(γ1、κ)によるMLRの阻害を示す図である。両
モノクローナル抗体とも、配列番号1および2に示され
た可変ドメインを有する。図7は、(x)RFT5−I
gG2aおよび(o)同じネズミ−ヒト・キメラMAb
によるPPD特異的HPBM応答の阻害を示す図である
。図8は、5ng/ml(o)、10ng/ml(・)
および20ng/ml(x)のIL−2濃度における、
PPD Tリンパ芽球増殖(図8Bおよび8A)および
MLR Tリンパ芽球増殖(図8Dおよび8C)に対す
るRFT5−IgG2aおよび同じネズミ−ヒト・キメ
ラMAbの効果を示す図である。単に説明を目的として
、本発明のキメラCD25抗体の具体的な製造例を下記
に示す。
る遺伝子のクローニング。 ハイブリドーマRFT5−IgG2a(CD25、γ2
a、κ)、RFT5−IgG1(CD25、γ1、κ)
およびRFT4(CD4、γ1、κ)並びにハイブリド
ーマの親ミエローマ・セルライン、すなわちNS−1の
ゲノムDNAを単離し、EcoRIで消化する。次いで
、消化された各DNAを同じアガロース・ゲルにおいて
分画する。移動後、ネズミ重鎖エンハンサーをコードす
る32P−標識0.7kb XbaI−EcoRI D
NAフラグメントをプローブとして用いたサザーン・ブ
ロットによりアガロース・ゲルを分析する(ハインリッ
ヒ等、「ジャーナル・オブ・イミュノロジー」(J.o
f Immunol.)(1989)、143:358
9)。図2に示されている通り、ハイブリダイゼーショ
ン後、3タイプのバンドがゲル上に現れる。 6.5kbのEcoRIフラグメントは、NS−1、す
なわち親ミエローマ・セルラインを含む全セルラインの
DNA消化物に存在するため、興味の対象外である。2
.9kbのEcoRIフラグメントは、ハイブリドーマ
RFT5−IgG1のDNA消化物において検出される
だけであり、異常な遺伝子配置の結果であると考えられ
る。従って、親セルラインNS−1のDNA消化物に存
在しない6.8kbのEcoRIフラグメントは、選り
抜きのフラグメントであるため、プレパラティブ・アガ
ロース・ゲル電気泳動によりこのフラグメントをさらに
精製する。約5−7kbのDNAフラグメントを、バク
テリオファージZAP(ストラタジーン)のEcoRI
制限部位でクローン化する。上記プローブを用いて、6
×106の組換えファージをスクリーニングすると、1
1のクローンがハイブリダイゼーションすることが判る
。11クローンのDNA挿入物を、ネズミJ2遺伝子を
コードする第1オリゴヌクレオチドおよびアミノ酸番号
7までのRFT5重鎖の開始をコードする第2オリゴヌ
クレオチド(既に決定された配列)をプライマーとして
用いたポリメラーゼ鎖反応(PCR)によりファージ・
プレート・リゼイトにおいて増幅した。第2プライマー
は、最頻出コドン使用遺伝子を考慮して設計される。1
1クローンの各々から得られたDNAフラグメントを、
同じく再頻出コドン使用に従い設計されたRFT5重鎖
のアミノ酸20ないし27を含むアミノ酸配列をコード
するオリゴヌクレオチドをプローブとして用いたサザー
ン・ブロットにより分析する。プローブを用いて、9つ
の同一ファージ・クローンが明らかにされる。ジデオキ
シ終結方法により可変ドメインをコードするDNA挿入
物の部分の配列決定を行うと、配列番号1に示した通り
であった。
により得られ、RFT5重鎖可変ドメイン(プロモータ
ーおよびエンハンサーを含む)の遺伝子を含む6kbの
EcoRIフラグメントを、図3Aに示されている真核
生物発現ベクターpSVneo−humanγ1不変部
分(ハインリッヒ等、前出)のEcoRI制限部位へク
ローン化する。次いで、RFT5重鎖可変ドメインをコ
ードする遺伝子のヌクレオチド配列を再決定することに
より、この遺伝子における突然変異がプラスミドの伸長
中に行なわれたという可能性を排除する。
ローニング。 ハイブリドーマRFT5、RFT5*およびRFT4並
びに親セルラインNS−1のゲノムDNAを単離し、E
coRIで消化する。次いで、消化された各DNAを同
じアガロース・ゲルにおいて分画する。移動後、5つの
マウスJκ遺伝子およびマウスCκ遺伝子を含む32P
標識DNAフラグメントをプローブとして用いたサザー
ン・ブロットにより、アガロース・ゲルを分析する。ハ
イブリダイゼーション後、図2Bに示されている通り、
約12、16および18kbの3つの主たるタイプのバ
ンドがゲル上で明らかにされる。最大フラグメントは、
RFT5ハイブリドーマに特異的なものだけである。約
18kbのサイズ分画されたEcoRIフラグメントを
、ファージEMBL4(ストラタジーン)においてクロ
ーン化する。 7×105の組換えファージ・クローンを上記プローブ
でスクリーニングした結果、各々同じ18kb挿入物を
含む2つのクローンがハイブリダイゼーションすること
が見出された。4.4kbのEcoRI−XbaIサブ
フラグメントは、RFT5軽鎖可変ドメインをコードす
る完全遺伝子を含むことが示されており、これらをプラ
スミドpGEM4(ストラタジーン)へクローン化する
。4.4kbフラグメントの配列を決定する。可変ドメ
インをコードする4.4kbのDNA挿入物の部分の配
列決定を行う。 配列は、配列番号2に示されている。
ードする1.1kbのXbaI−XbaIフラグメント
を、ヒトκ不変部分をコードするHindIII−Sp
hIフラグメントと一緒に、ファージmp18(ストラ
タジーン)においてサブクローニングする。突然変異誘
発により制限部位を分裂させた後、ネズミ重鎖エンハン
サー(Eμ)およびヒトκ不変部分(huCκ)の配列
を含む充填されたEcoRI−HindIIIフラグメ
ントを、pSV2−DHFRの充填されたEcoRI−
BamHI部位でクローン化する。pSV2−neoの
BamHI−HindIIIフラグメントを、DHFR
遺伝子をコードするBamHI−HindIIIフラグ
メントと置き換えることにより、pSV−DHFRが得
られる。。次いで、実施例3の4.4kbのEcoRI
−XbaIフラグメントを、pSV−DHFR−Eμ−
huckに挿入する。
製の遺伝子パルサー装置を用いたエレクトロポレーショ
ンにより、マウス・ミエローマ・セルラインSP2/O
(ATCC CRL1581)において同時トランス
フェクションする。この技術は、高頻度で安定したトラ
ンスフェクタントを作成することが知られている。SP
2/Oセルラインは、内在性重および軽鎖を製造し得ず
、0.8mg/lの濃度でジェネティシン(G418)
に感受性を示す。SP2/O細胞を、通常の生長培地(
RPMI+10%FCS+5×10−5β−メルカプト
エタノール)中で生長させ、生長中期で採取し、エレク
トロポレーション緩衝液(バイオ−ラド)で洗浄する。 細胞濃度を2×107細胞/mlに調節する。0.8m
lの細胞懸濁液に、15−20μgの各プラスミドを加
える。混合物を氷上に置き、10分間放置する。次いで
、細胞を電気パルス(280ボルト、25μF)にかけ
、再び15分間放置する。細胞を通常の生長培地へ移し
、CO2インキュベーター中37℃でインキュベーショ
ンする。3日間のインキュベーション後、G418耐性
に関する選択を始める。1.4mg/mlのG418を
含む新鮮な培地に細胞を再懸濁する。G418の存在下
10−14日間インキュベーションした後、培養物から
生長中の細胞が得られる。2週間のインキュベーション
後、サンドイッチ・タイプELISA(抗ヒトκ−軽鎖
/上清/抗ヒトIgG−アルカリ性ホスファターゼ・コ
ンジュゲート)におけるヒトIgG発現について全面生
長培養物の上清を試験する。この試験は、完全な抗体分
子が、50−500ng/mlの範囲の様々な濃度で全
培養物から分泌されることを示している。DHFR遺伝
子が増幅される細胞を選択し、それによって所望の抗体
を多量に分泌させるため、メトトレキセイト(MTX)
耐性に関する2つの選択方法を、下記要領で行う。この
目的のため、G418耐性細胞プールを各々分割し、方
法A(2または2.5の係数によるMTX増加)または
方法B(5の係数によるMTX増加)に従い、増幅を続
行させる。
択された濃度のMTXを補った通常の生長培地において
2×105細胞/mlの密度で細胞を接種する。72時
間のインキュベーション後、細胞および上清を分離する
。ELISAまたはプロテインAカラムを用いたHPL
Cにより抗体分泌をモニターする。図4Aおよび4Bは
、幾つかのトランスフェクタントのプールの抗体生産性
を示す。プールの大部分は、あるMTX濃度での最大の
特異的抗体生産状態に到達する。最良生産性プールを制
限希釈によりクローン化する。分析された数百のクロー
ンから、15の最良生産性クローンが選択される。クロ
ーンの生産性は、72時間で30〜50mgMAb/1
09細胞の範囲である。プロテインAアフィニティー・
カラムでの溶離により、培養上清から抗体を精製する。
ン 配列タイプ:ヌクレオチド配列およびその対応するアミ
ノ酸配列 分子タイプ:GenomicDNA 長さ:492ヌクレオチド 本来の供給源:ネズミ・ハイブリドーマヌクレオチド配
列の特徴: イントロンは、ヌクレオチド47〜130に位置する。 Vセグメント遺伝子: ヌクレオチド142〜435
Dセグメント遺伝子: ヌクレオチド436〜447
Jセグメント遺伝子: ヌクレオチド448〜492
アミノ酸配列の特徴: 誘導ペプチド: アミノ酸(a.a.)−19〜−1
FR1: a.a.1〜30 CDR1: a.a.31〜35 FR2: a.a.36〜49 CDR2: a.a.50〜66 FR3: a.a.67〜98 CDR3: a.a.99〜106 FR4: a.a.107〜117。
ン 配列タイプ:ヌクレオチド配列およびその対応するアミ
ノ酸配列 分子タイプ:GenomicDNA 長さ:455ヌクレオチド 本来の供給源:ネズミ・ハイブリドーマヌクレオチド配
列の特徴: イントロンは、ヌクレオチド50〜226に位置する。 Vセグメント遺伝子: ヌクレオチド244〜519
J2セグメント遺伝子: ヌクレオチド520〜45
5アミノ酸配列の特徴: 誘導ペプチド: アミノ酸(a.a.)−22〜−1
FR1’: a.a.1〜23 CDR1’: a.a.24〜33 FR2’: a.a.34〜48CDR2’:
a.a.49〜55 FR3’: a.a.56〜87CDR3’:
a.a.88〜94 FR4’: a.a.95〜104。
軽鎖における位置FR1 アミノ
酸1〜30(0位に偶発的 アミノ酸1〜23(
λ鎖の0位に偶発的 残基を伴う)
残基および10
位に欠失を伴う)CDR1 アミノ酸31〜35(3
5A、35Bと アミノ酸24〜34(27A
、B、C、D、EおよびF 番号付
された挿入体が存在 と番号付された挿入体が
存在し得る) し得る) FR2 アミノ酸36〜49
アミノ酸35〜49CDR2 アミノ酸
50〜65(52A、Bお アミノ酸50
〜56 よびCと番号付された挿
入体が存在し得る)FR3
アミノ酸66〜94(82A、Bお アミ
ノ酸57〜88 よびCと番号付さ
れた挿入 体が存在し得る)CDR
3 アミノ酸95〜102(100A、B、C
アミノ酸89〜97(95A、B、C、D、Eおよび
F D、E、F、G、H、I、Jお
よびKと番 と番号付された挿入体が存在し得る
) 号付された挿入体が存在し
得る) FR4 アミノ酸103〜113
アミノ酸98〜107(106Aと番号付け
さ
れた挿入体が存在し得る
)
する遺伝子の構造を示す概略図である。Bは、フレーム
構造(FR)および高可変(CDR)領域に対する重ま
たは軽鎖の可変ドメインの配置を表す図である。
ー(A)をコードするか、またはマウスCκおよび5つ
のJκ遺伝子セグメント(B)をコードする、32P標
識DNAプローブを用いたサザーン・ブロットによる、
マウス・ハイブリドーマRFT5−IgG2a(1)、
RFT5−IgG1(2)、RFT4(3)およびNS
−1(4)のEcoRI−消化ゲノムDNAの分析を示
す図である。
2−neo−huCγ1(A)およびpSV2−DHF
R−Eμ−huCκ(B)を示す図である。
びBに従い、増加濃度のメトトレキセイト(MTX)で
生長させた個々の細胞プールの生産性を示す図である。
で含むベクターへのCDRカセットの挿入による、CD
R置換物を構築するためのプロトコルを示す図である。
よび(o)本発明のネズミ−ヒト・キメラMAb(γ1
、κ)によるMLRの阻害を示す図である。
ネズミ−ヒト・キメラMAbによるPPD特異的HPB
M応答の阻害を示す図である。
よび20ng/ml(x)のIL−2濃度における、P
PD Tリンパ芽球増殖(BおよびA)およびMLR
Tリンパ芽球増殖(DおよびC)に対するRFT5−I
gG2aおよび同じネズミ−ヒト・キメラMAbの効果
を示す図である。
Claims (11)
- 【請求項1】 高可変領域CDR1、CDR2および
CDR3を順に含む少なくとも1つのドメインを含む少
なくとも1つの抗原結合部位を含むCD25結合分子で
あって、前記CDR1がアミノ酸配列Arg−Tyr−
Trp−Met−Hisを有し、前記CDR2がアミノ
酸配列Ala−Ile−Tyr−Pro−Gly−As
n−Ser−Asp−Thr−Ser−Tyr−Asn
−Gln−Lys−Phe−Glu−Glyを有し、前
記CDR3がアミノ酸配列Asp−Tyr−Gly−T
yr−Tyr−Phe−Asp−Pheを有する、CD
25結合分子またはその直接的均等物。 - 【請求項2】a)高可変領域CDR1、CDR2および
CDR3を順に含み、前記CDR1がアミノ酸配列Ar
g−Tyr−Trp−Met−Hisを有し、前記CD
R2がアミノ酸配列Ala−Ile−Tyr−Pro−
Gly−Asn−Ser−Asp−Thr−Ser−T
yr−Asn−Gln−Lys−Phe−Glu−Gl
yを有し、前記CDR3がアミノ酸配列Asp−Tyr
−Gly−Tyr−Tyr−Phe−Asp−Pheを
有するものである、第1ドメイン、および b)高可変領域CDR1’、CDR2’およびCDR3
’を順に含み、前記CDR1’がアミノ酸配列Ser−
Ala−Ser−Ser−Ser−Ile−Ser−T
yr−Met−Glnを有し、前記CDR2’がアミノ
酸配列Asp−Thr−Ser−Lys−Leu−Al
a−Serを有し、前記CDR3’がアミノ酸配列Hi
s−Gln−Arg−Ser−Ser−Tyr−Thr
を有するものである、第2ドメインを含む少なくとも1
つの抗原結合部位を含む、請求項1記載のCD25結合
分子またはそれらの直接的均等物。 - 【請求項3】 少なくとも、 a)1位のアミノ酸から始まり、117位のアミノ酸で
終わる配列番号1に示された配列と実質的に等しいアミ
ノ酸配列を有する可変領域およびひと重鎖の不変部分を
含む1個の重鎖、および b)1位のグルタミン酸から始まり、104位のグルタ
ミン酸で終わる配列番号2に示された配列と実質的に等
しいアミノ酸配列を有する可変領域およびひと軽鎖の不
変部分を含む1個の軽鎖を含む、請求項2記載のCD2
5結合分子。 - 【請求項4】 重鎖またはそのフラグメントをコード
し、 a)交互にフレーム構造および高可変領域を含む可変ド
メインをコードし、前記高可変領域が順にCDR1、C
DR2およびCDR3であり、そのアミノ酸配列が配列
番号1に示されている第1部分であって、可変ドメイン
の最初のアミノ酸をコードするコドンから始まり、可変
領域の最終アミノ酸をコードするコドンで終わる第1部
分、および b)重鎖の不変部分の最初のアミノ酸をコードするコド
ンから始まり、不変部分またはそのフラグメントの最終
アミノ酸をコードするコドン、次いでナンセンスコドン
で終わる重鎖不変部分またはそのフラグメントをコード
する第2部分を含むDNA構築物。 - 【請求項5】 軽鎖またはそのフラグメントをコード
し、 a)交互にフレーム構造および高可変領域を含む可変ド
メインをコードし、前記高可変領域が順にCDR1’、
CDR2’およびCDR3’であり、そのアミノ酸配列
が配列番号2に示されている第1部分であって、可変ド
メインの最初のアミノ酸をコードするコドンから始まり
、可変領域の最終アミノ酸をコードするコドンで終わる
第1部分、および b)軽鎖の不変部分の最初のアミノ酸をコードするコド
ンから始まり、不変部分またはそのフラグメントの最終
アミノ酸をコードするコドン、次いでナンセンスコドン
で終わる軽鎖不変部分またはそのフラグメントをコード
する第2部分を含むDNA構築物。 - 【請求項6】 (i)請求項4記載のDNA構築物お
よび請求項5記載のDNA構築物により形質転換された
生物を培養し、(ii)培養物から活性CD25結合分
子を採取することを含む、マルチ鎖CD25結合分子の
製造方法。 - 【請求項7】 本発明のCD25結合分子および医薬
的に許容し得る担体または希釈剤を含む、ひと免疫系の
免疫抑制、またはCD25+細胞の悪性の処置、または
HIV感染の処置を目的とする医薬組成物。 - 【請求項8】 少なくとも1つのCD25結合分子お
よび活性化T細胞を特徴づけるCD25以外の少なくと
も1つの抗原に対する少なくとも1つの抗原結合分子か
ら成る混合物を含む、免疫抑制組成物。 - 【請求項9】 CD25結合分子が、請求項1〜3の
いずれか1項記載のCD25結合分子である、請求項8
記載の組成物。 - 【請求項10】 キメラCD7抗体と一緒に請求項3
記載のキメラCD25抗体を含む、請求項9記載の組成
物。 - 【請求項11】 混合または付随的投与に関する使用
説明書と一緒に、活性化T細胞に対する少なくとも2つ
の抗体の個別単位用量形態を含み、前記抗体が活性化T
細胞を特徴づける少なくとも2つの抗原を認識し、その
一方がCD25抗原であるツインパック。
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