JP2585475B2

JP2585475B2 - Ｃｄ２５結合分子

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Publication number: JP2585475B2
Application number: JP3076743A
Authority: JP
Inventors: ピーター・ロイド・アムロット; アーネ・ナルポン・アクバール; ギュンター・ハインリッヒ; サルバトーレ・カミスリ
Original assignee: ROIYARU FURII HOSUPITARU SUKUURU OBU MEDEISUN; SANDO AG
Current assignee: ROIYARU FURII HOSUPITARU SUKUURU OBU MEDEISUN; SANDO AG
Priority date: 1990-03-16
Filing date: 1991-03-15
Publication date: 1997-02-26
Anticipated expiration: 2012-02-26
Also published as: US6383487B1; HU910761D0; FI103131B; DK0449769T3; HK53797A; MY106161A; IL97545A0; PL170321B1; SA92120358B1; FI103131B1; AU7290991A; FI19991788A; ES2061216T3; IL97545A; NL990008I1; NL990008I2; DE69100768D1; IE910867A1; FI104047B; CY1977A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、免疫抑制に関するもの
であり、さらに特定すれば、モノクローナル抗体および
ＣＤ２５抗原に対する他の結合分子を提供する。

【０００２】

【発明が解決しようとする課題】臓器移植手術、特に腎
臓、肝臓、心臓、肺および骨髄移植手術では、移植体受
容者の免疫系を抑制して、手術後の移植体拒絶の可能性
を最小限に抑える必要がある。これを目的とした様々な
免疫抑制剤が提案されているが、ある種の免疫抑制剤の
使用により生ずる望ましくない副作用に加えて、免疫抑
制作用の結果、移植体受容者はまた、正常免疫系により
制御されていた細菌またはウイルス感染に特にかかりや
すくなるため、それらの使用は慎重に制御されなければ
ならない。臨床的実践においてうまく使用されている免
疫抑制剤には、ステロイド類、アザチオプリンおよびシ
クロスポリンＡがある。臨床的実践では、移植体拒絶症
状発現の阻止または処置に必要な免疫抑制程度と、他の
感染源と戦うと同時に生じ得る望ましくない副作用を制
御下に維持するためのある量の受容者免疫系の保持とを
つり合わせる試みが必要である。また、免疫抑制剤の使
用に加えて、免疫反応を抑制するためのある種のモノク
ローナル抗体(ＭＡbs)の使用が注目されており、特にＴ
細胞の様々な表面抗原を認識するモノクローナル抗体が
注目されている。この場合もまた、臨床的実践におい
て、先行技術による抗体ではあまりに強力すぎるか、ま
たは充分には有効でなく、深刻な副作用、例えば高熱を
誘発することもあるという問題に直面している。

【０００３】これらのモノクローナル抗体は、一般に連
続的白血球類型研究会(ＬeucocyteＴyping Ｗorkshops)
により割り当てられたＣＤ(クラスターデターミネーシ
ョン)番号により明示される。例えばＣＤ３という語は
現在細胞表面抗原に対して頻繁に適用されており、この
抗原に対するＭＡbは「抗ＣＤ３」と記載されることも多
いが、以下の記載において、例えばＣＤ３、ＣＤ２５等
といった語はモノクローナル抗体に適用され、対応する
細胞表面抗原は「ＣＤ３抗原」等と記載される。特に、全
Ｔ細胞上に存在する膜抗原(パンＴ細胞抗原とも呼ばれ
ている)、例えばＣＤ３抗原に対するモノクローナル抗
体は、それらが免疫系に対して全体的な抑制活性を有す
る点で非常に強力な抗体である。従って、一旦感染が生
じると、記憶Ｔ細胞が通常仲介する即時免疫応答が人体
から剥奪され得る。移植体拒絶症状発現の治療ではなく
予防を試みている場合、これは必ずしも望ましいことで
はない。予防での使用に適した処置は本質的に選択的で
あるべきである、すなわち、記憶Ｔ細胞のプールを無傷
の状態に保つべきであり、かつ拒絶事象に直接関与し得
る範ちゅうのＴ細胞(活性化Ｔ細胞)は不活化されるべき
である。

【０００４】

【課題を解決するための手段】この望ましい目標は、活
性化Ｔ細胞に対する抗体を用いて達成され得る。これら
のＴ細胞は、それらの膜表面における高親和性ＩＬ−２
レセプターの存在を特徴とする。高親和性ＩＬ−２レセ
プターは、少なくとも２つの相異なるポリペプチド鎖、
すなわちＣＤ２５抗原としても知られているα−鎖およ
びβ−鎖により構成される。残りのＴ細胞は、この高親
和性レセプターを発現しないが、α−およびβ−鎖ホモ
２量体から成る低および中程度の親和性レセプターを発
現する。高親和性レセプターに対するＩＬ−２の結合を
妨害するため、選択的に免疫応答を抑制するＣＤ２５抗
体は、移植体拒絶発現症状の予防に優れた抗体である。

【０００５】天然免疫グロブリンまたは抗体は、各上部
アームの最後に抗原結合部位を有する一般にＹ形状のマ
ルチマー分子を含む。この構造の残り、特にＹの幹は、
免疫グロブリンと関連したエフェクター機能を伝達す
る。ＩgＧクラスの抗体の一般的構造を図１Ａに概略的
に示す。重および軽鎖は両方とも可変ドメインおよび不
変部分を含む。抗原結合部位は、軽鎖の可変ドメインを
随伴した重鎖の可変ドメインにより構成される。重およ
び軽鎖の可変ドメインは、図１Ｂに示されている同じ一
般的構造を有する。さらに特定すれば、抗体の抗原結合
特性は、高可変領域または相補性決定領域(ＣＤＲ)と呼
ばれる重および軽鎖の可変ドメインにおける３つの特異
領域により本質的に決定される。図１Ｂに示されている
通り、これらの３つの高可変領域は、配列が比較的保存
されており、結合に直接は関与しない４つのフレーム構
造領域(ＦＲ)と交互に存在する。ＣＤＲはループを形成
し、大きくβ-シート立体配座を採るフレーム構造領域
により極めて近い位置で保持される。重鎖のＣＤＲは関
連した軽鎖のＣＤＲと一緒になって、抗体分子の抗原結
合部位を構成する。ＦＲまたはＣＤＲ領域を構成するも
のについては、通常、同じ種類で産生される若干の抗体
のアミノ酸配列を比較することにより決定される。ＣＤ
ＲおよびＦＲ領域の一般的同定規則を表１に示す。

【０００６】さらに、最近では、結合エネルギー論に対
する軽鎖可変ドメインの分担度合は、関連した重鎖可変
ドメインの場合と比べて小さいこと、および単離された
重鎖可変ドメインはそれら自体で抗原結合活性を有する
ことが見出された。それらの分子は、共通して現在単一
ドメイン抗体と呼ばれている。幾つかのネズミＣＤ２５
モノクローナル抗体は既に存在しており、３３Ｂ３−１
(イムノテク-メリュー)、ＢＤαＩＬ−２Ｒ(ベクトン-
ディッキンソン)、２Ｃ８(アマーシャム)、キャンパス
６(ＭＲＣ、キャンブリッジ)およびＡＴＨ２０７(フリ
ー・ユニバーシティー、ベルリン)がある。しかしなが
ら、ＩgＧ２aアイソタイプの新規マウスＣＤ２５抗体
(以後、ＲＦＴ５−ＩgＧ２aと称す)は、特に結合親和力
に関して先行技術のＣＤ２５抗体よりも優れた特性を有
すること、およびＲＦＴ５−ＩgＧ２aと同じ高可変領域
を有する他のＣＤ２５結合分子の構築も可能であること
が見出された。

【０００７】

【発明の構成】従って、本発明は、高可変領域ＣＤＲ
１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を配列中にまたは順次(in
sequence)含む少なくとも１つのドメインを含む少なく
とも１つの抗原結合部位またはその直接的均等物を含む
ＣＤ２５結合分子であって、前記ＣＤＲ１がアミノ酸配
列Ａrg−Ｔyr−Ｔrp−Ｍet−Ｈisを有し、前記ＣＤＲ２
がアミノ酸配列Ａla−Ｉle−Ｔyr−Ｐro−Ｇly−Ａsn−
Ｓer−Ａsp−Ｔhr−Ｓer−Ｔyr−Ａsn−Ｇln−Ｌys−Ｐ
he−Ｇlu−Ｇlyを有し、前記ＣＤＲ３がアミノ酸配列Ａ
sp−Ｔyr−Ｇly−Ｔyr−Ｔyr−Ｐhe−Ａsp−Ｐheを有す
るＣＤ２５結合分子を提供する。発明の第１態様におい
て、ＣＤ２５結合分子は、単一ドメインを含む単一抗原
結合部位を含む。発明の第２態様において、ＣＤ２５結
合分子は、 a)高可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を配列
中にまたは順次(in sequence)含み、前記ＣＤＲ１がア
ミノ酸配列Ａrg−Ｔyr−Ｔrp−Ｍet−Ｈisを有し、前記
ＣＤＲ２がアミノ酸配列Ａla−Ｉle−Ｔyr−Ｐro−Ｇly
−Ａsn−Ｓer−Ａsp−Ｔhr−Ｓer−Ｔyr−Ａsn−Ｇln−
Ｌys−Ｐhe−Ｇlu−Ｇlyを有し、前記ＣＤＲ３がアミノ
酸配列Ａsp−Ｔyr−Ｇly−Ｔyr−Ｔyr−Ｐhe−Ａsp−Ｐ
heを有するものである、第１ドメイン、および b)高可変領域ＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'およびＣＤＲ３'を
配列中にまたは順次(insequence)含み、前記ＣＤＲ１'
がアミノ酸配列Ｓer−Ａla−Ｓer−Ｓer−Ｓer−Ｉle−
Ｓer−Ｔyr−Ｍet−Ｇlnを有し、前記ＣＤＲ２'がアミ
ノ酸配列Ａsp−Ｔhr−Ｓer−Ｌys−Ｌeu−Ａla−Ｓerを
有し、前記ＣＤＲ３'がアミノ酸配列Ｈis−Ｇln−Ａrg
−Ｓer−Ｓer−Ｔyr−Ｔhrを有するものである、第２ド
メインを含む少なくとも１つの抗原結合部位またはそれ
らの直接的均等物を含む。特記しない場合、以後、ポリ
ペプチド鎖は全て、Ｎ−末端の先端部(Ｎ−terminal ex
tremity)から出発し、Ｃ−末端の先端部で終わるアミノ
酸配列を有するものとして記載する。抗原結合部位が第
１および第２ドメインを両方とも含む場合、これらは同
じポリペプチド分子上に位置し得るか、または好ましく
は、各ドメインは異なる鎖に存在し得、第１ドメインは
免疫グロブリン重鎖またはそのフラグメントの一部分で
あり、第２ドメインは免疫グロブリン軽鎖またはそのフ
ラグメントの一部分であり得る。

【０００８】「ＣＤ２５結合分子」は、単独または他の分
子と共に高親和性ＩＬ−２レセプターを形成した形でＣ
Ｄ２５抗原に結合し得る分子を全て包含する。この結合
反応は、非関連的特異性を有する抗体、例えば抗リソチ
ーム抗体を使用する陰性対照試験を参考にした、例えば
レセプターに対するＩＬ−２結合の阻害を測定するため
のバイオアッセイまたは任意の種類の結合検定を含む標
準的方法(定性的検定)により示され得る。有利には、Ｃ
Ｄ２５抗原に対する本発明分子の結合は、きっ抗物質と
してＡＨＴ２０７、ＢＤαＩＬ−２−Ｒまたは３３Ｂ３
−１抗体を用いたきっ抗的結合検定で示され得る。好ま
しくは、ＡＨＴ２０７またはＢＤαＩＬ−２−Ｒ抗体が
きっ抗物質として選択される。結合検定の特定例を下記
に示す。ひと末梢血単核細胞(ＨＰＢＭ)を、２ミリモル
のＬ−グルタミン、１００単位／mlのペニシリン、１０
０μg／mlのストレプトマイシン、２５ミリモルの重炭
酸ナトリウムおよび１０％牛胎児血清(ＦＣＳ)を補った
培養培地ＲＰＭＩ１６４０において生長させる。１μg
／mlのフィトヘマグルチニン(ＰＨＡ)を用いてＨＰＢＭ
を刺激する。３日後、芽細胞を、２％牛血清アルブミン
(ＢＳＡ)および２％アジドを補った燐酸緩衝食塩水に
３.１０⁶／mlの濃度で再懸濁する。この懸濁液の５０μ
l試料を、非キャッピング条件下、１〜１００μg／mlの
勾配濃度の遮断抗体(きっ抗物質)と１０分間２０℃でイ
ンキュベーションする。次いで、１μg／mlの割合で本
発明のビオチニル化抗体を細胞に加え、インキュベーシ
ョンを１０分間続行する。細胞を洗浄し、さらに１０分
間フルオレセイン標識ストレプトアビジンとインキュベ
ーションする。細胞を再洗浄し、ホルマリンにより固定
し、ビオチニル化抗体の結合を検出するフルオロ-細胞
測定器により分析する。平行して、陰性対照として非関
連的特異性を有するビオチニル化抗体を用いた実験を行
う。抗原結合分子の例としては、Ｂ細胞またはハイブリ
ドーマにより産生された抗体およびキメラもしくはヒュ
ーマナイズド抗体もしくはそのフラグメント、例えばＦ
(ab')₂およびＦabフラグメント、並びに１本鎖または単
一ドメイン抗体がある。１本鎖抗体は、通常１０〜３０
個のアミノ酸、好ましくは１５〜２５個のアミノ酸から
成るペプチド・リンカーにより共有結合した抗体重およ
び軽鎖の可変ドメインにより構成される。従って、上記
構造は重および軽鎖の不変部分を含まず、小ペプチド・
スペーサーは全不変部分よりも抗原性を低くすべきであ
ると考えられている。「キメラ抗体」は、重または軽鎖ま
たは両方の不変領域がヒトに由来し、両重および軽鎖の
可変ドメインがヒト以外(例、ネズミ)に由来する抗体を
意味する。「ヒューマナイズド抗体」は、高可変領域(Ｃ
ＤＲ)がヒト以外(例、ネズミ)に由来し、免疫グロブリ
ンの他の全部または実質的に全部の部分、例えば不変領
域および可変ドメインの高保存部分、すなわちフレーム
構造領域がヒトに由来する抗体を意味する。しかしなが
ら、ヒューマナイズド抗体は、高可変領域に隣接したフ
レーム構造領域の部分にネズミ配列の数個のアミノ酸を
保持し得る。高可変領域は、あらゆる種類、好ましくは
ネズミまたはヒト起源のフレーム構造領域を随伴し得
る。適当なフレーム構造領域は、「シークエンシーズ・
オブ・プロテインズ・オブ・イミュノロジカル・インタ
レスト」(Ｓequences of proteins of immunological in
terest)(キャバット等、アメリカ合衆国厚生省、パブリ
ック・ヘルス・サービス、ナショナル・インスティテュ
ート・オブ・ヘルス)に記載されている。しかしなが
ら、好ましい重鎖フレーム構造は、配列番号１に示され
ているＲＦＴ５−ＩgＧ２aのフレーム構造である。それ
は、順にＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４領域によ
り構成される。同様に、配列番号２は、ＦＲ１'、ＦＲ
２'、ＦＲ３'およびＦＲ４'領域により順に構成される
好ましいＲＦＴ５−ＩgＧ２a軽鎖フレーム構造を示す。

【０００９】従って、本発明はまた、１位のアミノ酸か
ら出発し、１１７位のアミノ酸で終わる配列番号１に示
された配列と実質的に等しいアミノ酸配列を有する第１
ドメインまたは上記第１ドメイン、および１位のアミノ
酸から始まり、１０４位のアミノ酸で終わる配列番号２
に示された配列と実質的に等しいアミノ酸配列を有する
第２ドメインを含む少なくとも１つの抗原結合部位を含
むＣＤ２５結合分子を提供する。全部のひとにおいて天
然で見出される蛋白質に対して産生したモノクローナル
抗体は、必ずやひと以外の系、例えばマウスにおいて開
発されなければならない。この直接的結果として、ハイ
ブリドーマにより産生された異種抗体が、ひとに投与さ
れると、異種免疫グロブリンの不変部分が主として伝達
する望ましくない免疫応答を発する。これにより、上記
抗体は長期間にわたっては投与され得ないため、それら
の使用は明らかに制限される。従って、１本鎖、単一ド
メイン、ひとに投与された場合に実質的な異型的応答を
発するとは考えられないキメラまたはヒューマナイズド
抗体の使用が特に好ましい。前述したことから、本発明
のさらに好ましいＣＤ２５結合分子は、少なくとも a)(i)高可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を
配列中にまたは順次(insequence)含む可変ドメインおよ
び(ii)ひと重鎖の不変部分またはそのフラグメントを含
み、前記ＣＤＲ１がアミノ酸配列Ａrg−Ｔyr−Ｔrp−Ｍ
et−Ｈisを有し、前記ＣＤＲ２がアミノ酸配列Ａla−Ｉ
le−Ｔyr−Ｐro−Ｇly−Ａsn−Ｓer−Ａsp−Ｔhr−Ｓer
−Ｔyr−Ａsn−Ｇln−Ｌys−Ｐhe−Ｇlu−Ｇlyを有し、
前記ＣＤＲ３がアミノ酸配列Ａsp−Ｔyr−Ｇly−Ｔyr−
Ｔyr−Ｐhe−Ａsp−Ｐheを有する、１つの免疫グロブリ
ン重鎖またはそのフラグメント、および b)(i)高可変領域ＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'およびＣＤＲ３'
を配列中にまたは順次(in sequence)含む可変ドメイン
および(ii)ひと軽鎖の不変部分またはそのフラグメント
を含み、前記ＣＤＲ1'がアミノ酸配列Ｓer−Ａla−Ｓer
−Ｓer−Ｓer−Ｉle−Ｓer−Ｔyr−Ｍet−Ｇlnを有し、
前記ＣＤＲ２'がアミノ酸配列Ａsp−Ｔhr−Ｓer−Ｌys
−Ｌeu−Ａla−Ｓerを有し、前記ＣＤＲ３'がアミノ酸
配列Ｈis−Ｇln−Ａrg−Ｓer−Ｓer−Ｔyr−Ｔhrを有す
る、１つの免疫グロブリン軽鎖またはそのフラグメント
を含むキメラ抗ＣＤ２５抗体およびそれらの直接的均等
物から選択される。

【００１０】別法として、本発明のＣＤ２５結合分子
は、 a)高可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を配列
中にまたは順次(in sequence)含み、前記高可変領域が
配列番号１に示されたアミノ酸配列を有するものであ
る、第１ドメイン、 b)高可変領域ＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'およびＣＤＲ３'を
配列中にまたは順次(insequence)含み、前記高可変領域
が配列番号２に示されたアミノ酸配列を有するものであ
る、第２ドメイン、および c)第１ドメインのＮ−末端の先端部および第２ドメイン
のＣ−末端の先端部または第１ドメインのＣ−末端の先
端部および第２ドメインのＮ−末端の先端部に結合して
いるペプチド・リンカーを含む抗原結合部位を含む１本
鎖結合分子およびそれらの直接的均等物から選択され得
る。よく知られている通り、アミノ酸配列の小さな変
化、例えば１個または幾つかのアミノ酸の欠失、付加ま
たは置換により、実質的に同じ特性を有する元の蛋白質
の対立遺伝子形態が誘導され得る。すなわち、「その直
接的均等物」という語は、(i)全体としての高可変領域Ｃ
ＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、配列番号１に示さ
れた高可変領域と少なくとも８０％の相同性、好ましく
は少なくとも９０％の相同性、さらに好ましくは少なく
とも９５％の相同性を示し、そして(ii)分子Ｘの場合と
同一のフレーム構造領域を有するが、配列番号１に示さ
れたものと同一の高可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および
ＣＤＲ３を有するレファレンス分子と実質的に同じ程度
までレセプターへのＩＬ−２の結合を阻害し得る単一ド
メインＣＤ２５結合分子(分子Ｘ)か、または(i)全体と
してのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲ１'、Ｃ
ＤＲ２'およびＣＤＲ３'が、配列番号１および２に示さ
れた高可変領域と少なくとも８０％の相同性、好ましく
は少なくとも９０％の相同性、さらに好ましくは少なく
とも９５％の相同性を示し、そして(ii)分子Ｘ'と同一
のフレーム構造領域および不変部分を有するが、配列番
号１および２に示されたものと同一の高可変領域ＣＤＲ
１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'および
ＣＤＲ３'を有するレファレンス分子と実質的に同じ程
度までレセプターへのＩＬ−２の結合を阻害し得る、１
結合部位に対し少なくとも２つのドメインを有するＣＤ
２５結合分子(分子Ｘ')を全て包含する。この最後の特
徴は、好都合にはリンパ球混合反応(ＭＬＲ)生物検定、
抗原特異的ＨＰＢＭ応答生物検定およびＩＬ−２依存性
Ｔリンパ芽球増殖生物検定を含む様々な検定で試験され
得る。それらの検定法は、この明細書に後述されてい
る。「同じ程度まで」という語は、レファレンスおよび均
等分子が、上記で引用された生物検定の一つにおいて、
統計的方法で本質的に同一のＩＬ−２結合阻害曲線を呈
することを意味する。最も好ましくは、キメラＣＤ２５
抗体は、少なくとも a)１位のアミノ酸から出発し、１１７位のアミノ酸で終
わる配列番号１に示された配列と実質的に同じアミノ酸
配列を有する可変ドメインおよびヒト重鎖の不変部分を
含む１個の重鎖、および b)１位のグルタミン酸から出発し、１０４位のグルタミ
ン酸で終わる配列番号２に示された配列と実質的に同じ
アミノ酸配列を有する可変ドメインおよびヒト軽鎖の不
変部分を含む軽鎖を含む。ヒト重鎖の不変部分は、
γ₁、γ₂、γ₃、γ₄、μ、α₁、α₂、δまたはεタイ
プ、好ましくはγタイプ、さらに好ましくはγ₁タイプ
に属し得、ヒト軽鎖の不変部分は、κまたはλタイプ
(これはλ₁、λ₂およびλ₃サブタイプを包含する)に属
し得るが、好ましくはκタイプに属する。これら全ての
不変部分のアミノ酸配列はキャバット等(前出)により与
えられている。本発明のＣＤ２５結合分子のコンジュゲ
ート、例えば酵素または毒素または放射性同位元素のコ
ンジュゲートもまた、本発明の範囲内に包含される。本
発明のＣＤ２５結合分子は組換えＤＮＡ技術により製造
され得る。このためには、結合分子をコードする１個ま
たはそれ以上のＤＮＡ分子を構築し、適当な制御配列下
に置き、発現に適した宿主生物に導入しなければならな
い。

【００１１】従って、非常に総括的には、本発明は、
(i)本発明の単一ドメインＣＤ２５結合分子、本発明の
１本鎖ＣＤ２５結合分子、本発明のＣＤ２５結合分子の
重もしくは軽鎖またはそれらのフラグメントをコードす
るＤＮＡ分子、および(ii)組換え手段による本発明ＣＤ
２５結合分子の製造における本発明ＤＮＡ分子の用途を
提供する。当技術分野の現状として、熟練した者であれ
ば、この明細書で提供されている情報、すなわち高可変
領域のアミノ酸配列およびそれらをコードするＤＮＡ配
列が与えられれば、本発明のＤＮＡ分子を合成すること
ができる。可変ドメイン遺伝子の構築方法は、例えばＥ
ＰＡ２３９４００に記載されており、次の通り短く要約
され得る。何等かの特異性を有するＭＡbの可変ドメイ
ンをコードする遺伝子をクローン化する。フレーム構造
および高可変領域をコードするＤＮＡセグメントを決定
し、高可変領域をコードするＤＮＡセグメントを除去す
ることにより、フレーム構造領域をコードするＤＮＡセ
グメントを接合部分で適当な制限部位と融合させる。制
限部位は、標準的方法によるＤＮＡ分子の突然変異誘発
により適当な位置で生成され得る。２本鎖合成ＣＤＲカ
セットは、配列番号１または２に与えられた配列に従い
ＤＮＡ合成により製造される。これらのカセットには接
着末端が加えられ、その結果、それらはフレーム構造の
接合部分でライゲーションされ得る。免疫グロブリン可
変ドメインをコードするＤＮＡ分子を得るためのプロト
コルを図５に示す。さらに、本発明のモノクローナル抗
体をコードするＤＮＡ構築物を得るのに、生産性ハイブ
リドーマ・セルラインからmＲＮＡに接近することは必
要ではない。すなわち、ＰＣＴ出願ＷＯ９０／０７８６
１は、遺伝子のヌクレオチド配列に関して書かれた情報
しか与えられていない組換えＤＮＡ技術によるＭＡbの
製造について充分な指示を与えている。この方法は、若
干のオリゴヌクレオチドの合成、ＰＣＲ方法によるそれ
らの増幅および所望のＤＮＡ配列を得るためのそれらの
スプライシングを含む。重および軽鎖不変部分をコード
する適当なプロモーターまたは遺伝子を含む発現ベクタ
ーは、一般に入手可能である。すなわち、一旦本発明の
ＤＮＡ分子が製造されると、それは、好都合には適当な
発現ベクターへ導入され得る。また、１本鎖抗体をコー
ドするＤＮＡ分子は、標準的方法、例えばＷＯ８８／１
６４９の記載に従い製造され得る。前述したこと、およ
びハイブリドーマにより天然に分泌されるマウスＭＡb
は好ましいタイプのＭＡbではないことから、記載の基
準に充分に応じる必要のあるハイブリドーマ寄託物は無
いと考えられる。

【００１２】本発明の特定態様において、ＣＤ２５結合
分子を製造するための組換え手段は、下記の通り、第１
および第２ＤＮＡ構築物を含む。第１ＤＮＡ構築物は、
重鎖またはそのフラグメントをコードし、 a)択一的または交互に(alternatively)フレーム構造お
よび高可変領域を含む可変ドメインをコードし、前記高
可変領域が順にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３であ
り、それらのアミノ酸配列が配列番号１に示されている
第１部分であって、可変ドメインの最初のアミノ酸をコ
ードするコドンから出発し、可変ドメインの最後のアミ
ノ酸をコードするコドンで終わる第１部分、および b)重鎖の不変部分の最初のアミノ酸をコードするコドン
から出発し、不変部分またはそのフラグメントの最後の
アミノ酸をコードするコドン、次いでナンセンスコドン
で終わる重鎖不変部分またはそのフラグメントをコード
する第２部分を含む。好ましくは、この第１部分は、１
位のアミノ酸から出発し、１１７位のアミノ酸で終わる
配列番号１に示されたアミノ酸配列と実質的に同じアミ
ノ酸配列を有する可変ドメインをコードする。さらに好
ましくは、第１部分は、１４２位のヌクレオチドから出
発し、４９２位のヌクレオチドで終わる配列番号１に示
されたヌクレオチド配列を有する。また好ましくは、第
２部分は、ヒト重鎖の不変部分、さらに好ましくはヒト
γ１鎖の不変部分をコードする。この第２部分は、ゲノ
ム起源のＤＮＡフラグメント(イントロンを含む)または
cＤＮＡフラグメント(イントロンを含まず)であり得
る。第２ＤＮＡ構築物は、軽鎖またはそのフラグメント
をコードし、 a)択一的または交互に(alternatively)フレーム構造お
よび高可変領域を含む可変ドメインをコードし、前記高
可変領域が順にＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'およびＣＤＲ３'
であり、それらのアミノ酸配列が配列番号２に示されて
いる第１部分であって、可変ドメインの最初のアミノ酸
をコードするコドンから出発し、可変ドメインの最後の
アミノ酸をコードするコドンで終わる第１部分、および b)軽鎖の不変部分の最初のアミノ酸をコードするコドン
から出発し、不変部分またはそのフラグメントの最後の
アミノ酸をコードするコドン、次いでナンセンスコドン
で終わる軽鎖不変部分またはそのフラグメントをコード
する第２部分を含む。好ましくは、この第１部分は、１
位のアミノ酸から出発し、１０４位のアミノ酸で終わる
配列番号２に示されたアミノ酸配列と実質的に同じアミ
ノ酸配列を有する可変ドメインをコードする。さらに好
ましくは、第１部分は、２４４位のヌクレオチドから出
発し、５５５位のヌクレオチドで終わる配列番号２に示
されたヌクレオチド配列を有する。また好ましくは、第
２部分は、ヒト軽鎖の不変部分、さらに好ましくはヒト
κ鎖の不変部分をコードする。第１および第２ＤＮＡ構
築物において、第１および第２部分は、好ましくはイン
トロンにより分離される。第１および第２分離間に位置
するイントロンに、好ましくはエンハンサーを挿入す
る。転写されるが翻訳されないこの遺伝子要素の存在
は、第２部分の有効な転写に必要とされ得る。さらに好
ましくは、第１および第２ＤＮＡ構築物は、有利にはヒ
トに由来する重鎖遺伝子のエンハンサーを含む。第１ま
たは第２ＤＮＡ構築物は、有利には第１部分の上流に位
置し、誘導ペプチドの部分をコードする第３部分を含
む。この第３部分は、最初のアミノ酸をコードするコド
ンから出発し、誘導ペプチドの最後のアミノ酸で終わ
る。このペプチドは、それらが発現される宿主生物によ
る鎖の分泌に必要とされ、続いて宿主生物により除去さ
れる。好ましくは、第１ＤＮＡ構築物の第３部分は、−
１９位のアミノ酸から出発し、−１位のアミノ酸で終わ
る、配列番号１に示されたアミノ酸配列と実質的に同じ
アミノ酸配列を有する誘導ペプチドをコードする。また
好ましくは、第２ＤＮＡ構築物の第３部分は、−２２位
のアミノ酸から出発し、−１位のアミノ酸で終わる、配
列番号２に示されたアミノ酸配列を有する誘導ペプチド
をコードする。ＤＮＡ構築物の各々を、適当な制御配列
の制御下、特に適当なプロモーターの制御下に置く。Ｄ
ＮＡ構築物が発現を目的として導入される宿主生物に適
合するものであれば、いかなる種類のプロモーターでも
使用され得る。しかしながら、発現がほ乳類細胞で行な
われる場合、免疫グロブリン遺伝子のプロモーターの使
用が特に好ましい。所望の抗体は、細胞培養またはトラ
ンスジェニック動物において製造され得る。適当なトラ
ンスジェニック動物は、適当な制御配列下に置かれた第
１および第２ＤＮＡ構築物を卵へマイクロ-インジェク
ションし、こうして製造された卵を適当な擬妊娠してい
る雌に導入し、所望の抗体を発現する子孫を選択するこ
とを含む標準的方法に従い得られる。抗体鎖を細胞培養
中で製造しなければならない場合、まずＤＮＡ構築物を
単一発現ベクターまたは２種の別々ではあるが適合性の
ある発現ベクターへ挿入しなければならず、後者の候補
が好ましい。従って、本発明はまた、上記ＤＮＡ構築物
のうちの少なくとも一つを含む、原核生物または真核生
物セルラインにおいて複製可能な発現ベクターを提供す
る。次いで、ＤＮＡ構築物を含む各発現ベクターを、適
当な宿主生物へ導入する。ＤＮＡ構築物を２種の発現ベ
クターにおいて別々に挿入する場合、それらは別々に導
入されるか(すなわち１細胞に対し１タイプのベクタ
ー)、または同時導入され得、後者の候補が好ましい。
適当な宿主生物は、細菌、酵母またはほ乳類セルライン
であり得、この後者が好ましい。さらに好ましくは、ほ
乳類セルラインは、リンパ様起源、例えばミエローマ、
ハイブリドーマまたは正常不死化Ｂ細胞に由来するが、
内在性抗体重または軽鎖を全く発現しない。また、宿主
生物は、１細胞当たり多数のコピーのベクターを含むの
が好ましい。宿主生物がほ乳類セルラインである場合、
この望ましい目標は、標準的方法に従いコピー数を増幅
することにより達成され得る。増幅方法は、通常、高め
られた薬剤耐性に関する選択により構成され、前記耐性
は発現ベクターによりコードされる。

【００１３】本発明の別の態様では、(i)本発明の第１
および第２ＤＮＡ構築物により形質転換された生物を培
養し、(ii)培養物から活性ＣＤ２５結合分子採取するこ
とを含む、マルチ鎖ＣＤ２５結合分子の製造方法が提供
される。別法として、重および軽鎖は、別々に採取さ
れ、インビトロ再生後に活性結合分子中へ再構成され得
る。再構成方法は当業界ではよく知られている。方法の
例は、特にＥＰＡ１２０６７４またはＥＰＡ１２５０２
３に記載されている。従って、方法はまた、(i) 本発
明の第１ＤＮＡ構築物により形質転換された第１生物を
培養し、重鎖またはそのフラグメントを培養物から採取
し、そして(ii) 本発明の第２ＤＮＡ構築物により形質
転換された第２生物を培養し、軽鎖またはそのフラグメ
ントを培養物から採取し、そして(iii)(i)で得られた重
鎖またはそのフラグメントおよび(ii)で得られた軽鎖ま
たはそのフラグメントから活性ＣＤ２５結合分子をイン
ビトロで再構成することを含み得る。同様に、また、
(i)本発明の１本鎖または単一ドメインＣＤ２５結合分
子を各々コードするＤＮＡ構築物により形質転換された
生物を培養し、(ii)培養物から前記分子を採取すること
を含む、１本鎖または単一ドメインＣＤ２５結合分子の
製造方法が提供される。

【００１４】本発明のＣＤ２５結合分子は、例えばリン
パ球混合反応(ＭＬＲ)生物検定(アクバル等、「ジャーナ
ル・オブ・イミュノロジー」(Ｊ．Immunol.)、１４０、
２１７１−８)に示されている通り、非常に優れた免疫
調節活性を呈する。ＭＬＲは、一般に、インビボ拒絶に
導く異型的移植体応答のインビトロ均等反応であると考
えられている。１．ＭＬＲの阻害。第１ドナーのＨＰＢＭ製品から、１０⁵ＨＰＢＭを含む
１００μl試料のアリコートをとり、０〜３００ng／ml
の範囲(これらの限界値を含む)における様々な濃度の本
発明分子を加える。次いで、各試料を、第２ドナーの１
０⁵個のＨＬＡ−不適合Ｘ線照射−ＨＰＢＭまたはＴ細
胞こ渇ＨＰＢＭを含む１００μlアリコートと混合す
る。混合物を６日間３７℃でインキュベーションし、次
いで１０μl容量中１μＣiのメチル・³Ｈ−チミジン(³
Ｈ−Ｔdr)を加える。６時間後、放射能取り込みにより
細胞増殖を測定する。この特定検定では、本発明分子
は、図６に示されている通り０.３ng／ml〜の濃度でイ
ンビトロ免疫調節活性を示す。細胞生長の５０％は約３
ng／mlで阻害される。また、本発明分子の免疫調節活性
は、下記の要領で抗原特異的ＨＰＢＭ応答の阻害または
ＩＬ−２依存性Ｔリンパ芽球増殖の阻害を測定すること
により評価され得る。２．抗原特異的ＨＰＢＭ応答の阻害。本発明分子は、ＰＰＤ(ツベルクリン)特異的、ＨＬＡク
ラスII制限Ｔ細胞応答の発生を有効に阻害し、このこと
は、レセプターに対する内在的に生成されたＩＬ−２の
結合阻害能力を示している。インビボでこれらの抗原特
異的応答は、自己免疫性および移植拒絶の開始において
重大な役割を演じると予測される。ＨＰＢＭの製品か
ら、１０⁵ＨＰＢＭ含有１００μl試料のアリコートをと
り、０〜３００ng／mlの範囲(これらの限界値を含む)に
おける様々な濃度の本発明分子およびツベルクリン(Ｐ
ＰＤ)を３０μg／mlの最終濃度で加える。試料を、６日
間３７℃でインキュベーションし、次いで１０μl容量
中１μＣiのメチル・³Ｈ−チミジンを加える。６時間の
インキュベーション後、放射能取り込みにより細胞増殖
を測定する。この特定検定において、本発明分子は、図
７に示されている通り約１０ng／ml〜の免疫調節活性を
示す。細胞生長の５０％は、約５０ng／mlで阻害され
る。３．ＩＬ−２依存性Ｔリンパ芽球増殖の阻害。本発明分子は、ＭＬＲまたはＰＰＤ刺激により誘発され
たヒトＴ芽細胞のＩＬ−２依存性生長を有効に阻害す
る。これらの細胞は、自己免疫性および拒絶症状発現の
慢性化において主たる役割を演じると予想される。２０
０μlの最終容量中２０×１０³の５日令ＰＰＤまたはＭ
ＬＲ刺激ＨＰＢＭを含むトリプリケイト培養物を、５、
１０または２０ng／mlの組換えＩＬ−２および０〜１０
μg／ml(これらの限界値を含む)の範囲における様々な
濃度の本発明分子の存在下３７℃で４８時間インキュベ
ーションする。次いで、³Ｈ−Ｔdrを加える。６時間
後、放射能取り込みにより細胞増殖を測定する。この特
定検定において、本発明分子は、図８Ａおよび８Ｂ、８
Ｃおよび８Ｄに示されている通り０.１μg／ml〜の濃度
で免疫調節活性を示す。従って、本発明はまた、(i)
ヒト免疫系の免疫抑制における本発明のＣＤ２５結合分
子の用途、(ii) 処置を必要とする患者に対し、本発明
のＣＤ２５結合分子の免疫抑制有効量を投与することを
含む、ヒト免疫系の免疫抑制方法、(iii)本発明のＣＤ
２５結合分子および医薬的に許容し得る担体または希釈
剤を含む、ヒト免疫系の免疫抑制を目的とする医薬組成
物を提供する。特に、本発明のＣＤ２５結合分子は、移
植体拒絶症状発現の予防に有用である。

【００１５】これらの適応症の場合、適当な用量は、勿
論、例えば使用される特定の本発明分子、宿主、投与方
法並びに処置される状態の性質および重症度により変化
する。しかしながら、予防用途の場合、体重１キログラ
ム当たり約０.１mg〜約１mgの一日用量で一般に満足す
べき結果の得られることが示されている。拒絶事象が実
際に生じた場合、それを処置するためには、これらの用
量を４以下の係数により増加させるべきである。本発明
分子は、好都合には、非経口的、通常例えば前肘静脈ま
たは他の末梢静脈へ静脈内投与される。予防処置として
は、典型的には、移植当日、好ましくは移植の数時間前
から始め、２〜４週間１日１回〜１週間に１回本発明分
子を投与する。また、本発明分子は、ＣＤ２５抗原を発
現する細胞の悪性腫ようの処置、例えばＴ細胞白血病お
よびある種の他の白血病およびリンパ腫の処置に有用で
あり得る。この用途の場合、ＣＤ２５結合分子は、分子
をアルファ-放出性放射性核種に結合させた放射性コン
ジュゲート形態で使用され得る。また、本発明分子は、
ＨＩＶ感染の処置または予防に有用であり得る。ＨＩＶ
ウイルスは、増殖するために増殖性Ｔ細胞を必要とする
と思われるため、ＣＤ２５抗原の遮断によりＴ細胞の増
殖を阻害すると、当然、ウイルス増殖も阻害される。本
発明の医薬組成物は常法で製造され得る。本発明による
組成物は、好ましくは凍結乾燥形態を呈する。即時投与
の場合、適当な水性担体、例えば注射用滅菌水または滅
菌緩衝食塩水にそれを溶かす。ボーラス注射としてでは
なく注入投与用に大量の溶液の調製が望ましいと考えら
れる場合、製剤時にヒト血清アルブミンまたは患者自身
のヘパリンで凝血防止した血液を食塩水に混入させるの
が有利である。過剰の上記生理学的不活性蛋白質が存在
すると、注入溶液と共に使用されている容器および管の
壁に吸着することによりモノクローナル抗体の喪失が阻
止される。アルブミンを使用する場合、適当な濃度は食
塩水溶液の０.５〜４.５重量％である。本発明の別の態
様によると、活性化Ｔ細胞に対する少なくとも２種の抗
原結合分子であって、活性化Ｔ細胞に特有の少なくとも
２種の異なる抗原を認識する結合分子を組み合わせて使
用することにより、特に有益な結果が得られることが見
出された。好ましくは、各々異なる抗原を認識する２種
の異なる抗原結合分子の組み合わせを使用する。すなわ
ち、抗原結合分子は両方とも活性化Ｔ細胞表面抗原を認
識するが、それらは、活性化Ｔ細胞上の同じ結合部位に
対して互いに争うことはない。好ましくは、抗原結合分
子の一方はＣＤ２５結合分子である。従って、本発明は
また、少なくとも１個のＣＤ２５結合分子、および活性
化Ｔ細胞に特有なＣＤ２５以外の少なくとも１個の抗原
に対する少なくとも１個の抗原結合分子から成る混合物
を含む免疫抑制組成物を提供する。

【００１６】さらに本発明は、ほ乳類系の免疫抑制に使
用される互いに組み合わせた活性化Ｔ細胞に対する少な
くとも２つの抗原結合分子であって、活性化Ｔ細胞に特
有な少なくとも２つの異なる抗原(ただし、これらのう
ち１つはＣＤ２５抗原である)を認識する結合分子を提
供する。「活性化Ｔ細胞に対する抗原結合分子」という語
は、活性化Ｔ細胞と強く反応するが残りのＴ細胞とは弱
くしか、または全く反応しない結合分子を意味する。好
ましくは、抗原結合分子は完全な免疫グロブリン分子、
さらに好ましくはネズミ、キメラまたはヒューマナイズ
ド抗体、特にキメラ・モノクローナル抗体である。好ま
しいＣＤ２５モノクローナル抗体は、上記アミノ酸配列
を有するＣＤＲ'類を有する抗体である。有利には、本
発明組成物はまた、免疫抑制剤、例えばシクロスポリン
Ａを含み得るか、またはそれと組み合わせて使用され得
る。ＣＤ２５以外の活性化Ｔ細胞抗原に対する好ましい
モノクローナル抗体は、典型的には、ボストン・ワーク
ショップにより確立され、ラインヘルツ、ハイネス、ナ
ドラーおよびベルスタインにより「ロイコサイト・タイ
ピングII、ボリュームＩ・ヒューマンＴリンフォサイ
ツ」(Leucpcyte Typing II, Vol．I human T lymphocyte
s)(スプリンガー・フェルラーク、１９８５)に報告され
ているＣＤ７クラスターに分類されるものである。ＣＤ
７抗原は、残りのＴ細胞の約８０％で異種的に発現され
る。しかしながら、この発現は、活性化時に強く増強さ
れる(強度は２−３倍上昇)。従って、抗体の好ましい組
み合わせは、ＣＤ７とＣＤ２５抗体との組み合わせであ
る。従って、本発明組成物は、好ましくは少なくとも１
個のＣＤ２５抗体と一緒に少なくとも１個のＣＤ７抗体
から成る、さらに好ましくは１個のＣＤ２５抗体と１個
のＣＤ７抗体から成る混合物を含む。また好ましくは、
両抗体はＩgＧアイソタイプに属する。所望により免疫
抑制剤と一緒に使用され得る２つの抗体は、様々な方法
で臨床的実践において使用され得る。好ましくは、それ
らを一緒に混合し、物理的混合物を患者に投与する。別
法として、別々のレザーバーから受容者に抗体および所
望による免疫抑制剤を任意の順序ではあるが同時に投与
する。組成物は、単一ＣＤ２５抗体に関する上記要領に
従い製造および非経口投与され得る。別法として、免疫
抑制剤を経口投与し、モノクローナル抗体を別々または
混合物として非経口投与する。適当な組成物の調製を助
けるため、モノクローナル抗体および所望による免疫抑
制剤は、混合または同時投与に関する使用説明書と共
に、同一容器内で別々にパッケージ化され得る。キット
の例には、活性化Ｔ細胞に対する少なくとも２つの抗体
であって、活性化Ｔ細胞に特有の少なくとも２つの異な
る抗原(ただし、これらのうち１つはＣＤ２５抗原であ
る)を認識する抗体の個別単位用量形態を含む例えばマ
ルチバレルド注射器またはツイン・パックがある。

【００１７】これまでの研究は、抗体を互いに、そして
所望により免疫抑制剤と組み合わせて投与すると、使用
されている用量レベルでの許容し得ない副作用が回避さ
れること、および個々の抗体により観察される副作用の
強化が存在しないことを示している。予防用途の場合、
適当な用量は、通常、患者の体重１キログラム当たり
０.０５−０.５ミリグラム程度の第１抗体(例、ＣＤ２
５抗体)および体重１キログラム当たり０.０５−０.５
ミリグラム程度の第２抗体(例、ＣＤ７抗体)の投与を必
要とする。免疫抑制剤がシクロスポリンである場合、所
望により使用され得る免疫抑制剤の推奨量は、非経口投
与の場合体重１キログラム当たり２〜５ミリグラムおよ
び経口投与の場合体重１キログラム当たり１０−１５mg
である。本発明組成物は、日毎または週毎、好ましくは
週毎に投与され得る。本発明組成物は特に移植体拒絶症
状発現の予防用に設計されているが、その用途は、好都
合には拒絶事象が実際に生じたときのその処置をも包含
し得る。この場合、用量を４の係数以下により増加させ
るべきである。この発明での使用に適したネズミ・モノ
クローナル抗体は自体公知である。活性化Ｔ細胞表面抗
原に対する多くのモノクローナル抗体は、世界の様々な
国々にあるカルチャー・コレクションから入手可能であ
り、具体的にはアメリカ合衆国、メリーランド、ロック
ビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
は、適当なモノクローナル抗体または前記抗体を分泌す
るハイブリドーマを提供し得る。本発明で使用され得、
ＡＴＣＣから入手可能なＣＤ７モノクローナル抗体を分
泌するハイブリドーマの一例は、Ｔ３−３Ａ１である。
他のＣＤ７抗体は、ＲＦＴ−２およびＣＨＨ３８０(キ
メラ抗体)である。ＣＤ２５抗体としては、上述の好ま
しいＲＦＴ−５およびそのキメラ誘導体に加えて、Ｍ７
／２(ガウルトン等、「クリニカル・イミュノロジー・ア
ンド・イミュノパソロジー」(Ｃlin．Immunol．and Immu
nopath.)(１９８５)３６:１８)、抗−tac抗体(内山等、
「ジャーナル・オブ・イミュノロジー」(J．Immunol.)(１
９８１)１２６(４):１３９３)およびキャンパス６モノ
クローナル抗体が含まれる。ＣＤ２５およびＣＤ７モノ
クローナル抗体の組み合わせの相乗効果は、上記ＭＬＲ
生物検定によりインビトロで、またヒト患者に関する臨
床試験によりインビボで立証される。ＭＬＲ生物検定に
おいて、³Ｈ−ＴdＲ取り込みの阻害は、ＣＤ７(ＲＦＴ
２)またはＣＤ２５(ＲＦＴ５)モノクローナル抗体が単
独に加えられた培養物中で観察され、これらの抗体の両
方を同じ総濃度で一緒に使用すると、かなり大きな程度
の阻害が行なわれる。ＭＬＲは、インビボ拒絶に至る同
種間移植体応答のインビトロ均等反応であるが、上記阻
害はインビボ免疫抑制と均等内容である。ＣＤ７または
ＣＤ２５モノクローナル抗体の存在下、１０ナノグラム
／ml〜１００μg／mlの用量範囲でシクロスポリンが加
えられたＭＬＲでは、全用量範囲においてシクロスポリ
ン単独の場合と比べて³Ｈ−ＴdＲ阻害の増加が観察され
る。ＣＤ７、ＣＤ２５およびシクロスポリンの組み合わ
せは、他の組み合わせよりも大きな阻害効果を示す。臨
床試験において、腎臓、肝臓または心臓移植を受ける予
定の患者を予防的治療用に選択する。移植当日、手術の
２時間前、実施例５のキメラＣＤ２５抗体をキメラＣＤ
７抗体(ＣＨＨ３８０)と一緒に用いた初回静脈内注入
を、体重１kg当たり各抗体０.２mgの用量で実施する。
手術の２日後、体重１kg当たり０.４mgでの２つの抗体
の同一注入を実施し、次いで１週間隔で１か月間反復す
る。静脈内注入液は次の要領で製造される。凍結乾燥抗
体を一緒に混合し、４.５重量％のヒト・アルブミンを
含む１００ml滅菌緩衝食塩水中に分散させる。この食塩
水分散液を３０分間かけて患者に投与する。患者はま
た、標準的シクロスポリン療法も受けている。１箇月の
治療期間中、拒絶症状が発現した患者はいない。

【００１８】図面の説明図１Ａは、ＩgＧ分子並びに重および軽鎖をコードする
遺伝子の構造を示す概略図である。図１Ｂは、フレーム
構造(ＦＲ)および高可変(ＣＤＲ)領域に対する重または
軽鎖の可変ドメインの配置を表す図である。図２Ａおよ
び２Ｂは、ネズミ重鎖エンハンサー(図２Ａ)をコードす
るか、またはマウスＣκおよび５つのＪκ遺伝子セグメ
ント(図２Ｂ)をコードする、³²Ｐ標識ＤＮＡプローブを
用いたサザーン・ブロットによる、マウス・ハイブリド
ーマＲＦＴ５−ＩgＧ２a(１)、ＲＦＴ５−ＩgＧ１
(２)、ＲＦＴ４(３)およびＮＳ−１(４)のＥcoＲＩ−消
化ゲノムＤＮＡの分析を示す図である。１０μgのゲノ
ムＤＮＡをＥcoＲＩで消化し、０.８％アガロース・ゲ
ルにおいてサイズ分画化する。次に、フラグメントをニ
トロセルロース膜へ移し、プローブとハイブリダイゼー
ションさせる。洗浄後、膜を一夜コダックＸ−Ｏマット
・フィルムに暴露する。図３Ａおよび３Ｂは、親発現ベ
クターpＳＶ２−neo−huＣγ１およびpＳＶ２−ＤＨＦ
Ｒ−Ｅμ−huＣκを示す図である。両プラスミドは、ア
ンピシリン耐性遺伝子(amp・Ｒ)並びにpＢＲ３２２およ
びＳＶ４０の複製開始点(pＢＲ３２２oriおよびＳＶ４
０ori)を含む。pＳＶ２−neo−huＣγ１は、ネオマイシ
ン遺伝子(neo・Ｒ)およびヒトγ₁不変部分をコードする
遺伝子(huＣγ₁)の存在を特徴とするが、pＳＶ２−ＤＨ
ＦＲ−Ｅμ−huＣκには、ジヒドロ葉酸還元酵素(ＤＨ
ＦＲ)遺伝子(メトトレキセイト耐性)およびヒトκ不変
部分をコードする遺伝子(huＣκ)が挿入されている。キ
メラ重または軽鎖を発現させるための最終ベクターは、
各々誘導ペプチド(Ｌ)、およびヒト重鎖エンハンサーと
一緒にＲＦＴ５−ＩgＧ２a重鎖の可変ドメイン(ＶＤ
Ｊ₂)をコードするＤＮＡフラグメントを、pＳＶ２−neo
−huＣγ１へ挿入し、誘導ペプチド(Ｌ)およびＲＦＴ５
−ＩgＧ２a軽鎖の可変ドメイン(ＶＪ₂)をコードするＤ
ＮＡフラグメントを、pＳＶ２−ＤＨＦＲ−Ｅμ−huＣ
κへ挿入することにより得られる。図４Ａおよび４Ｂ
は、各々実施例５記載の方法ＡおよびＢに従い、増加濃
度のメトトレキセイト(ＭＴＸ)で生長させた個々の細胞
プールの生産性を示す図である。グラフのＹ軸は、７２
時間でmg／１０⁹細胞において生産されたモノクローナ
ル抗体の量を与える。図５は、４つのフレーム構造領域
を一緒に融合させた形で含むベクターへのＣＤＲカセッ
トの挿入による、ＣＤＲ置換物を構築するためのプロト
コルを示す図である。図６は、(x)ＲＦＴ５−ＩgＧ２a
(γ₂a、κ)および(o)本発明のネズミ-ヒト・キメラＭＡ
b(γ₁、κ)によるＭＬＲの阻害を示す図である。両モノ
クローナル抗体とも、配列番号１および２に示された可
変ドメインを有する。図７は、(x)ＲＦＴ５−ＩgＧ２a
および(o)同じネズミ-ヒト・キメラＭＡbによるＰＰＤ
特異的ＨＰＢＭ応答の阻害を示す図である。図８は、５
ng／ml(o)、１０ng／ml(・)および２０ng／ml(x)のＩＬ
−２濃度における、ＰＰＤＴリンパ芽球増殖(図８Ｂお
よび８Ａ)およびＭＬＲＴリンパ芽球増殖(図８Ｄおよ
び８Ｃ)に対するＲＦＴ５−ＩgＧ２aおよび同じネズミ-
ヒト・キメラＭＡbの効果を示す図である。単に説明を
目的として、本発明のキメラＣＤ２５抗体の具体的な製
造例を下記に示す。

【００１９】

【実施例】

実施例１ＲＦＴ５−ＩgＧ２aの重鎖の可変ドメインをコードする
遺伝子のクローニング。ハイブリドーマＲＦＴ５−ＩgＧ２a(ＣＤ２５、γ₂a、
κ)、ＲＦＴ５−ＩgＧ１(ＣＤ２５、γ₁、κ)およびＲ
ＦＴ４(ＣＤ４、γ₁、κ)並びにハイブリドーマの親ミ
エローマ・セルライン、すなわちＮＳ−１のゲノムＤＮ
Ａを単離し、ＥcoＲＩで消化する。次いで、消化された
各ＤＮＡを同じアガロース・ゲルにおいて分画する。移
動後、ネズミ重鎖エンハンサーをコードする³²Ｐ−標識
０.７kb ＸbaＩ−ＥcoＲＩＤＮＡフラグメントをプロ
ーブとして用いたサザーン・ブロットによりアガロース
・ゲルを分析する(ハインリッヒ等、「ジャーナル・オブ
・イミュノロジー」(Ｊ．of Immunol.)(１９８９)、１４
３:３５８９)。図２に示されている通り、ハイブリダイ
ゼーション後、３タイプのバンドがゲル上に現れる。
６.５kbのＥcoＲＩフラグメントは、ＮＳ−１、すなわ
ち親ミエローマ・セルラインを含む全セルラインのＤＮ
Ａ消化物に存在するため、興味の対象外である。２.９k
bのＥcoＲＩフラグメントは、ハイブリドーマＲＦＴ５
−ＩgＧ１のＤＮＡ消化物において検出されるだけであ
り、異常な遺伝子配置の結果であると考えられる。従っ
て、親セルラインＮＳ−１のＤＮＡ消化物に存在しない
６.８kbのＥcoＲＩフラグメントは、選り抜きのフラグ
メントであるため、プレパラティブ・アガロース・ゲル
電気泳動によりこのフラグメントをさらに精製する。約
５−７kbのＤＮＡフラグメントを、バクテリオファージ
ＺＡＰ(ストラタジーン)のＥcoＲＩ制限部位でクローン
化する。上記プローブを用いて、６×１０⁶の組換えフ
ァージをスクリーニングすると、１１のクローンがハイ
ブリダイゼーションすることが判る。１１クローンのＤ
ＮＡ挿入物を、ネズミＪ₂遺伝子をコードする第１オリ
ゴヌクレオチドおよびアミノ酸番号７までのＲＦＴ５重
鎖の開始をコードする第２オリゴヌクレオチド(既に決
定された配列)をプライマーとして用いたポリメラーゼ
鎖反応(ＰＣＲ)によりファージ・プレート・リゼイトに
おいて増幅した。第２プライマーは、最頻出コドン使用
遺伝子を考慮して設計される。１１クローンの各々から
得られたＤＮＡフラグメントを、同じく再頻出コドン使
用に従い設計されたＲＦＴ５重鎖のアミノ酸２０ないし
２７を含むアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチ
ドをプローブとして用いたサザーン・ブロットにより分
析する。プローブを用いて、９つの同一ファージ・クロ
ーンが明らかにされる。ジデオキシ終結方法により可変
ドメインをコードするＤＮＡ挿入物の部分の配列決定を
行うと、配列番号１に示した通りであった。

【００２０】実施例２キメラＲＦＴ５重鎖遺伝子の構築。９つのファージ・クローンのうちの一つのＤＮＡの消化
により得られ、ＲＦＴ５重鎖可変ドメイン(プロモータ
ーおよびエンハンサーを含む)の遺伝子を含む６kbのＥc
oＲＩフラグメントを、図３Ａに示されている真核生物
発現ベクターpＳＶneo−humanγ₁不変部分(ハインリッ
ヒ等、前出)のＥcoＲＩ制限部位へクローン化する。次
いで、ＲＦＴ５重鎖可変ドメインをコードする遺伝子の
ヌクレオチド配列を再決定することにより、この遺伝子
における突然変異がプラスミドの伸長中に行なわれたと
いう可能性を排除する。

【００２１】実施例３ＲＦＴ５の軽鎖の可変ドメインをコードする遺伝子のク
ローニング。ハイブリドーマＲＦＴ５、ＲＦＴ５＊およびＲＦＴ４並
びに親セルラインＮＳ−１のゲノムＤＮＡを単離し、Ｅ
coＲＩで消化する。次いで、消化された各ＤＮＡを同じ
アガロース・ゲルにおいて分画する。移動後、５つのマ
ウスＪκ遺伝子およびマウスＣκ遺伝子を含む³²Ｐ標識
ＤＮＡフラグメントをプローブとして用いたサザーン・
ブロットにより、アガロース・ゲルを分析する。ハイブ
リダイゼーション後、図２Ｂに示されている通り、約１
２、１６および１８kbの３つの主たるタイプのバンドが
ゲル上で明らかにされる。最大フラグメントは、ＲＦＴ
５ハイブリドーマに特異的なものだけである。約１８kb
のサイズ分画されたＥcoＲＩフラグメントを、ファージ
ＥＭＢＬ４(ストラタジーン)においてクローン化する。
７×１０⁵の組換えファージ・クローンを上記プローブ
でスクリーニングした結果、各々同じ１８kb挿入物を含
む２つのクローンがハイブリダイゼーションすることが
見出された。４.４kbのＥcoＲＩ−ＸbaＩサブフラグメ
ントは、ＲＦＴ５軽鎖可変ドメインをコードする完全遺
伝子を含むことが示されており、これらをプラスミドp
ＧＥＭ４(ストラタジーン)へクローン化する。４.４kb
フラグメントの配列を決定する。可変ドメインをコード
する４.４kbのＤＮＡ挿入物の部分の配列決定を行う。
配列は、配列番号２に示されている。

【００２２】実施例４キメラＲＦＴ５軽鎖遺伝子の構築。ネズミ重鎖エンハンサー(ハインリッヒ等、前出)をコー
ドする１.１kbのＸbaＩ−ＸbaＩフラグメントを、ヒト
κ不変部分をコードするＨindIII−ＳphＩフラグメント
と一緒に、ファージmp１８(ストラタジーン)においてサ
ブクローニングする。突然変異誘発により制限部位を分
裂させた後、ネズミ重鎖エンハンサー(Ｅμ)およびヒト
κ不変部分(huＣκ)の配列を含む充填されたＥcoＲＩ−
ＨindIIIフラグメントを、pＳＶ２−ＤＨＦＲの充填さ
れたＥcoＲＩ−ＢamＨＩ部位でクローン化する。pＳＶ
２−neoのＢamＨＩ−ＨindIIIフラグメントを、ＤＨＦ
Ｒ遺伝子をコードするＢamＨＩ−ＨindIIIフラグメント
と置き換えることにより、pＳＶ−ＤＨＦＲが得られ
る。。次いで、実施例３の４.４kbのＥcoＲＩ−ＸbaＩ
フラグメントを、pＳＶ−ＤＨＦＲ−Ｅμ−huckに挿入
する。

【００２３】実施例５ＲＦＴ５キメラ抗体の発現。実施例２および４で得られたプラスミドを、バイオラド
製の遺伝子パルサー装置を用いたエレクトロポレーショ
ンにより、マウス・ミエローマ・セルラインＳＰ２／Ｏ
(ＡＴＣＣＣＲＬ１５８１)において同時トランスフェ
クションする。この技術は、高頻度で安定したトランス
フェクタントを作成することが知られている。ＳＰ２／
Ｏセルラインは、内在性重および軽鎖を製造し得ず、
０.８mg／lの濃度でジェネティシン(Ｇ４１８)に感受性
を示す。ＳＰ２／Ｏ細胞を、通常の生長培地(ＲＰＭＩ
＋１０％ＦＣＳ＋５×１０-⁵β−メルカプトエタノー
ル)中で生長させ、生長中期で採取し、エレクトロポレ
ーション緩衝液(バイオ-ラド)で洗浄する。細胞濃度を
２×１０⁷細胞／mlに調節する。０.８mlの細胞懸濁液
に、１５−２０μgの各プラスミドを加える。混合物を
氷上に置き、１０分間放置する。次いで、細胞を電気パ
ルス(２８０ボルト、２５μＦ)にかけ、再び１５分間放
置する。細胞を通常の生長培地へ移し、ＣＯ₂インキュ
ベーター中３７℃でインキュベーションする。３日間の
インキュベーション後、Ｇ４１８耐性に関する選択を始
める。１.４mg／mlのＧ４１８を含む新鮮な培地に細胞
を再懸濁する。Ｇ４１８の存在下１０−１４日間インキ
ュベーションした後、培養物から生長中の細胞が得られ
る。２週間のインキュベーション後、サンドイッチ・タ
イプＥＬＩＳＡ(抗ヒトκ−軽鎖／上清／抗ヒトＩgＧ−
アルカリ性ホスファターゼ・コンジュゲート)における
ヒトＩgＧ発現について全面生長培養物の上清を試験す
る。この試験は、完全な抗体分子が、５０−５００ng／
mlの範囲の様々な濃度で全培養物から分泌されることを
示している。ＤＨＦＲ遺伝子が増幅される細胞を選択
し、それによって所望の抗体を多量に分泌させるため、
メトトレキセイト(ＭＴＸ)耐性に関する２つの選択方法
を、下記要領で行う。この目的のため、Ｇ４１８耐性細
胞プールを各々分割し、方法Ａ(２または２.５の係数に
よるＭＴＸ増加)または方法Ｂ(５の係数によるＭＴＸ増
加)に従い、増幅を続行させる。

【化１】各増幅段階では、１.４mg／kgのＧ４１８および選択さ
れた濃度のＭＴＸを補った通常の生長培地において２×
１０⁵細胞／mlの密度で細胞を接種する。７２時間のイ
ンキュベーション後、細胞および上清を分離する。ＥＬ
ＩＳＡまたはプロテインＡカラムを用いたＨＰＬＣによ
り抗体分泌をモニターする。図４Ａおよび４Ｂは、幾つ
かのトランスフェクタントのプールの抗体生産性を示
す。プールの大部分は、あるＭＴＸ濃度での最大の特異
的抗体生産状態に到達する。最良生産性プールを制限希
釈によりクローン化する。分析された数百のクローンか
ら、１５の最良生産性クローンが選択される。クローン
の生産性は、７２時間で３０〜５０mgＭＡb／１０⁹細胞
の範囲である。プロテインＡアフィニティー・カラムで
の溶離により、培養上清から抗体を精製する。

【００２４】（配列表）配列番号:１主対象:ＲＦＴ５抗体の免疫グロブリン重鎖可変ドメイ
ン配列タイプ:ヌクレオチド配列およびその対応するアミ
ノ酸配列分子タイプ:ＧenomicＤＮＡ長さ:４９２ヌクレオチド本来の供給源:ネズミ・ハイブリドーマヌクレオチド配列の特徴: イントロンは、ヌクレオチド４７〜１３０に位置する。Ｖセグメント遺伝子: ヌクレオチド１４２〜４３５Ｄセグメント遺伝子: ヌクレオチド４３６〜４４７Ｊセグメント遺伝子: ヌクレオチド４４８〜４９２アミノ酸配列の特徴: 誘導ペプチド: アミノ酸(a.a.)−１９〜−１ＦＲ１: a.a.１〜３０ＣＤＲ１: a.a.３１〜３５ＦＲ２: a.a.３６〜４９ＣＤＲ２: a.a.５０〜６６ＦＲ３: a.a.６７〜９８ＣＤＲ３: a.a.９９〜１０６ＦＲ４: a.a.１０７〜１１７。

【化２】

【００２５】（配列表）配列番号:２主対象:ＲＦＴ５抗体の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイ
ン配列タイプ:ヌクレオチド配列およびその対応するアミ
ノ酸配列分子タイプ:ＧenomicＤＮＡ長さ:４５５ヌクレオチド本来の供給源:ネズミ・ハイブリドーマヌクレオチド配列の特徴: イントロンは、ヌクレオチド５０〜２２６に位置する。Ｖセグメント遺伝子: ヌクレオチド２４４〜５１９Ｊ₂セグメント遺伝子: ヌクレオチド５２０〜４５５アミノ酸配列の特徴: 誘導ペプチド: アミノ酸(a.a.)−２２〜−１ＦＲ１': a.a.１〜２３ＣＤＲ１': a.a.２４〜３３ＦＲ２': a.a.３４〜４８ＣＤＲ２': a.a.４９〜５５ＦＲ３': a.a.５６〜８７ＣＤＲ３': a.a.８８〜９４ＦＲ４': a.a.９５〜１０４。

【化３】

【００２６】

【表１】領域重鎖における位置軽鎖における位置ＦＲ１アミノ酸1〜30(0位に偶発的アミノ酸１〜23(λ鎖の0位に偶発的残基を伴う) 残基および10位に欠失を伴う) ＣＤＲ１アミノ酸31〜35(35A、35Bとアミノ酸24〜34(27A、B、C、D、EおよびF 番号付された挿入体が存在と番号付された挿入体が存在し得る) し得る) ＦＲ２アミノ酸36〜49 アミノ酸35〜49 ＣＤＲ２アミノ酸50〜65(52A、Bおアミノ酸50〜56 よびCと番号付された挿入体が存在し得る) ＦＲ３アミノ酸66〜94(82A、Bおアミノ酸57〜88 よびCと番号付された挿入体が存在し得る) ＣＤＲ３アミノ酸95〜102(100A、B、C アミノ酸89〜97(95A、B、C、D、EおよびF D、E、F、G、H、I、JおよびKと番と番号付された挿入体が存在し得る) 号付された挿入体が存在し得る) ＦＲ４アミノ酸103〜113 アミノ酸98〜107(106Ａと番号付けされた挿入体が存在し得る)

【００２７】この発明によって下記の各事項が可能とな
る。 (１) 高可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を
順に含む少なくとも１つのドメインを含む少なくとも１
つの抗原結合部位を含むＣＤ２５結合分子であって、前
記ＣＤＲ１がアミノ酸配列Ａrg−Ｔyr−Ｔrp−Ｍet−Ｈ
isを有し、前記ＣＤＲ２がアミノ酸配列Ａla−Ｉle−Ｔ
yr−Ｐro−Ｇly−Ａsn−Ｓer−Ａsp−Ｔhr−Ｓer−Ｔyr
−Ａsn−Ｇln−Ｌys−Ｐhe−Ｇlu−Ｇlyを有し、前記Ｃ
ＤＲ３がアミノ酸配列Ａsp−Ｔyr−Ｇly−Ｔyr−Ｔyr−
Ｐhe−Ａsp−Ｐheを有する、ＣＤ２５結合分子またはそ
の直接的均等物。 (２) a)高可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を順に
含み、前記ＣＤＲ１がアミノ酸配列Ａrg−Ｔyr−Ｔrp−
Ｍet−Ｈisを有し、前記ＣＤＲ２がアミノ酸配列Ａla−
Ｉle−Ｔyr−Ｐro−Ｇly−Ａsn−Ｓer−Ａsp−Ｔhr−Ｓ
er−Ｔyr−Ａsn−Ｇln−Ｌys−Ｐhe−Ｇlu−Ｇlyを有
し、前記ＣＤＲ３がアミノ酸配列Ａsp−Ｔyr−Ｇly−Ｔ
yr−Ｔyr−Ｐhe−Ａsp−Ｐheを有するものである、第１
ドメイン、および b)高可変領域ＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'およびＣＤＲ３'を
順に含み、前記ＣＤＲ１'がアミノ酸配列Ｓer−Ａla−
Ｓer−Ｓer−Ｓer−Ｉle−Ｓer−Ｔyr−Ｍet−Ｇlnを有
し、前記ＣＤＲ２'がアミノ酸配列Ａsp−Ｔhr−Ｓer−
Ｌys−Ｌeu−Ａla−Ｓerを有し、前記ＣＤＲ３'がアミ
ノ酸配列Ｈis−Ｇln−Ａrg−Ｓer−Ｓer−Ｔyr−Ｔhrを
有するものである、第２ドメインを含む少なくとも１つ
の抗原結合部位を含む、１記載のＣＤ２５結合分子また
はそれらの直接的均等物。 (３) 少なくとも、 a)１位のアミノ酸から始まり、１１７位のアミノ酸で終
わる配列番号１に示された配列と実質的に等しいアミノ
酸配列を有する可変領域およびひと重鎖の不変部分を含
む１個の重鎖、および b)１位のグルタミン酸から始まり、１０４位のグルタミ
ン酸で終わる配列番号２に示された配列と実質的に等し
いアミノ酸配列を有する可変領域およびひと軽鎖の不変
部分を含む１個の軽鎖を含む、２記載のＣＤ２５結合分
子。 (４) 重鎖またはそのフラグメントをコードし、 a)交互にフレーム構造および高可変領域を含む可変ドメ
インをコードし、前記高可変領域が順にＣＤＲ１、ＣＤ
Ｒ２およびＣＤＲ３であり、そのアミノ酸配列が配列番
号１に示されている第１部分であって、可変ドメインの
最初のアミノ酸をコードするコドンから始まり、可変領
域の最終アミノ酸をコードするコドンで終わる第１部
分、および b)重鎖の不変部分の最初のアミノ酸をコードするコドン
から始まり、不変部分またはそのフラグメントの最終ア
ミノ酸をコードするコドン、次いでナンセンスコドンで
終わる重鎖不変部分またはそのフラグメントをコードす
る第２部分を含むＤＮＡ構築物。 (５) 軽鎖またはそのフラグメントをコードし、 a)交互にフレーム構造および高可変領域を含む可変ドメ
インをコードし、前記高可変領域が順にＣＤＲ１'、Ｃ
ＤＲ２'およびＣＤＲ３'であり、そのアミノ酸配列が配
列番号２に示されている第１部分であって、可変ドメイ
ンの最初のアミノ酸をコードするコドンから始まり、可
変領域の最終アミノ酸をコードするコドンで終わる第１
部分、および b)軽鎖の不変部分の最初のアミノ酸をコードするコドン
から始まり、不変部分またはそのフラグメントの最終ア
ミノ酸をコードするコドン、次いでナンセンスコドンで
終わる軽鎖不変部分またはそのフラグメントをコードす
る第２部分を含むＤＮＡ構築物。 (６) (i)４記載のＤＮＡ構築物および５記載のＤＮＡ構
築物により形質転換された生物を培養し、(ii)培養物か
ら活性ＣＤ２５結合分子を採取することを含む、マルチ
鎖ＣＤ２５結合分子の製造方法。 (７) 本発明のＣＤ２５結合分子および医薬的に許容し
得る担体または希釈剤を含む、ひと免疫系の免疫抑制、
またはＣＤ２５＋細胞の悪性の処置、またはＨＩＶ感染
の処置を目的とする医薬組成物。 (８) 少なくとも１つのＣＤ２５結合分子および活性化
Ｔ細胞を特徴づけるＣＤ２５以外の少なくとも１つの抗
原に対する少なくとも１つの抗原結合分子から成る混合
物を含む、免疫抑制組成物。 (９) ＣＤ２５結合分子が、１〜３のいずれか１項記載
のＣＤ２５結合分子である、８記載の組成物。 (１０) キメラＣＤ７抗体と一緒に３記載のキメラＣＤ
２５抗体を含む、９記載の組成物。 (１１) 混合または付随的投与に関する使用説明書と一
緒に、活性化Ｔ細胞に対する少なくとも２つの抗体の個
別単位用量形態を含み、前記抗体が活性化Ｔ細胞を特徴
づける少なくとも２つの抗原を認識し、その一方がＣＤ
２５抗原であるツインパック。

【図面の簡単な説明】

【図１】Ａは、ＩgＧ分子並びに重および軽鎖をコード
する遺伝子の構造を示す概略図である。Ｂは、フレーム
構造(ＦＲ)および高可変(ＣＤＲ)領域に対する重または
軽鎖の可変ドメインの配置を表す図である。

【図２】ＡおよびＢは、それぞれネズミ重鎖エンハンサ
ー(Ａ)をコードするか、またはマウスＣκおよび５つの
Ｊκ遺伝子セグメント(Ｂ)をコードする、³²Ｐ標識ＤＮ
Ａプローブを用いたサザーン・ブロットによる、マウス
・ハイブリドーマＲＦＴ５−ＩgＧ２a(１)、ＲＦＴ５−
ＩgＧ１(２)、ＲＦＴ４(３)およびＮＳ−１(４)のＥco
ＲＩ−消化ゲノムＤＮＡの分析を示す図である。

【図３】ＡおよびＢは、それぞれ親発現ベクターpＳＶ
２−neo−huＣγ１(Ａ)およびpＳＶ２−ＤＨＦＲ−Ｅμ
−huＣκ(Ｂ)を示す図である。

【図４】ＡおよびＢは、各々実施例５記載の方法Ａおよ
びＢに従い、増加濃度のメトトレキセイト(ＭＴＸ)で生
長させた個々の細胞プールの生産性を示す図である。

【図５】４つのフレーム構造領域を一緒に融合させた形
で含むベクターへのＣＤＲカセットの挿入による、ＣＤ
Ｒ置換物を構築するためのプロトコルを示す図である。

【図６】(x)ＲＦＴ５−ＩgＧ２a(γ₂a、κ)および(o)本
発明のネズミ-ヒト・キメラＭＡb(γ₁、κ)によるＭＬ
Ｒの阻害を示す図である。

【図７】(x)ＲＦＴ５−ＩgＧ２aおよび(o)同じネズミ-
ヒト・キメラＭＡbによるＰＰＤ特異的ＨＰＢＭ応答の
阻害を示す図である。

【図８】５ng／ml(o)、１０ng／ml(・)および２０ng／m
l(x)のＩＬ−２濃度における、ＰＰＤＴリンパ芽球増
殖(ＢおよびＡ)およびＭＬＲＴリンパ芽球増殖(Ｄおよ
びＣ)に対するＲＦＴ５−ＩgＧ２aおよび同じネズミ-ヒ
ト・キメラＭＡbの効果を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｐ 21/08 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 Ａ (73)特許権者 591072514 ロイヤル・フリー・ホスピタル・スクール・オブ・メディスンＲＯＹＡＬＦＲＥＥＨＯＳＰＩＴＡＬＳＣＨＯＯＬＯＦＭＥＤＩＣＩＮＥイギリス、イングランド、ロンドン・エヌダブリュー３・２ピーエフ、ローランド・ヒル・ストリート（番地の表示なし) (72)発明者ピーター・ロイド・アムロットイギリス、イングランド、ロンドン・エヌ９・９ビーエル、フェルメ・パーク・ロード270番 (72)発明者アーネ・ナルポン・アクバールイギリス、イングランド、サリー・ティダブリュー９・４エルディ、リッチモンド、ダンサー・ロード35エイ番 (72)発明者ギュンター・ハインリッヒスイス、ツェーハー−4125リーヘン、モルハルデンシュトラーセ166ベー番 (72)発明者サルバトーレ・カミスリスイス、ツェーハー−4153ライナッハ、アーホルンシュトラーセ２番 (56)参考文献特開昭62−281824（ＪＰ，Ａ) ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ，86，Ｐ．1029−10033 （1989)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】高可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣ
ＤＲ３(ただし、ＣＤＲ１はアミノ酸配列Ａrg−Ｔyr−
Ｔrp−Ｍet−Ｈisを有し、ＣＤＲ２はアミノ酸配列Ａla
−Ｉle−Ｔyr−Ｐro−Ｇly−Ａsn−Ｓer−Ａsp−Ｔhr−
Ｓer−Ｔyr−Ａsn−Ｇln−Ｌys−Ｐhe−Ｇlu−Ｇlyを有
し、ＣＤＲ３はアミノ酸配列Ａsp−Ｔyr−Ｇly−Ｔyr−
Ｔyr−Ｐhe−Ａsp−Ｐheを有する。)を順に含む少なく
とも１つのドメインを有する少なくとも１つの抗原結合
部位を含む、ＣＤ２５結合抗体(抗体フラグメントを含
む。)または高可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ
Ｒ３が全体で配列番号１に示された高可変領域と少なく
とも８０％の相同性を示し、ＣＤ２５結合抗体と同一の
フレーム構造領域および配列番号１に示されたものと同
一の高可変領域を有するレファレンス分子と実質的に同
じ程度までレセプターに対するＩＬ−２の結合を阻害で
きるＣＤ２５結合抗体。
【請求項２】重鎖またはそのフラグメントをコード
し、 a)交互にフレーム構造および高可変領域を含む可変ドメ
インをコードし、当該高可変領域が順にＣＤＲ１、ＣＤ
Ｒ２およびＣＤＲ３(それらが有するアミノ酸配列は請
求項１で定義のとおり。)であり、上記可変ドメインの
第１アミノ酸をコードするコドンから始まって上記可変
ドメインの最終アミノ酸をコードするコドンで終わる第
１部分、および b)重鎖の不変部分の第１アミノ酸をコードするコドンか
ら始まって当該不変部分またはそのフラグメントの最終
アミノ酸をコードするコドンで終わり、その後にナンセ
ンスコドンを有する重鎖不変部分またはそのフラグメン
トをコードする第２部分を含むＤＮＡ構築物。
【請求項３】軽鎖またはそのフラグメントをコード
し、 a)交互にフレーム構造および高可変領域を含む可変ドメ
インをコードし、当該高可変領域が順にＣＤＲ１'、Ｃ
ＤＲ２'およびＣＤＲ３'(ただし、ＣＤＲ１'はアミノ酸
配列Ｓer−Ａla−Ｓer−Ｓer−Ｓer−Ｉle−Ｓer−Ｔyr
−Ｍet−Ｇlnを有し、ＣＤＲ２'はアミノ酸配列Ａsp−
Ｔhr−Ｓer−Ｌys−Ｌeu−Ａla−Ｓerを有し、ＣＤＲ
３'はアミノ酸配列Ｈis−Ｇln−Ａrg−Ｓer−Ｓer−Ｔy
r−Ｔhrを有する。)であり、上記可変ドメインの第１ア
ミノ酸をコードするコドンから始まって上記可変領域の
最終アミノ酸をコードするコドンで終わる第１部分、お
よび b)軽鎖の不変部分の第１アミノ酸をコードするコドンか
ら始まって当該不変部分またはそのフラグメントの最終
アミノ酸をコードするコドンで終わり、その後にナンセ
ンスコドンを有する軽鎖不変部分またはそのフラグメン
トをコードする第２部分を含むＤＮＡ構築物。
【請求項４】 (i)請求項２記載のＤＮＡ構築物および
請求項３記載のＤＮＡ構築物により形質転換された生物
を培養し、(ii)培養物から活性ＣＤ２５結合抗体(抗体
フラグメントを含む。)を採取することを特徴とする、
マルチ鎖ＣＤ２５結合抗体(抗体フラグメントを含む。)
の製造方法。
【請求項５】請求項１記載のＣＤ２５結合抗体(抗体
フラグメントを含む。)および医薬的に許容し得る担体
または希釈剤を含むことを特徴とする、ひと免疫系の免
疫抑制、またはＣＤ２５＋悪性細胞の処置、もしくはＨ
ＩＶ感染の処置のための医薬組成物。
【請求項６】少なくとも１つの請求項１記載のＣＤ２
５結合抗体(抗体フラグメントを含む。)と活性化Ｔ細胞
の特徴を有しているＣＤ２５以外の少なくとも１つの抗
原に対する少なくとも１つの抗原結合分子の混合物を含
むことを特徴とする、免疫抑制組成物。
【請求項７】活性化Ｔ細胞に対する少なくとも２つの
抗体の個別単位用量形態を含み、当該抗体が活性化Ｔ細
胞の特徴を有している少なくとも２つの異なった抗原を
認識し、当該抗体の一つが請求項１記載のＣＤ２５結合
抗体(抗体フラグメントを含む。)であることを特徴とす
る、免疫抑制に使用するための二剤型製剤。