CN102216331A

CN102216331A - 治疗方法

Info

Publication number: CN102216331A
Application number: CN200980141429XA
Authority: CN
Inventors: 布兰登·C·本德; 史蒂夫·艾普勒; 普里蒂·赫格德; 尼尔森·L·琼布; 马克·麦钱特; 埃米·C·彼得森; 亚瑟·E·雷耶斯二世; 项洪
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2008-10-17
Filing date: 2009-10-14
Publication date: 2011-10-12
Also published as: RU2011119638A; US20110262436A1; KR20110069092A; BRPI0915240A2; TW201022214A; AR073853A1; EP2344543A2; WO2010045345A2; IL212348A0; CA2739302A1; AU2009303392A1; MX2011004050A; JP2012505904A; WO2010045345A3

Abstract

本发明一般涉及分子生物学和生长因子调节领域。更具体地，本发明涉及治疗病理的病症如癌症的疗法。

Description

治疗方法

相关申请

本申请根据35USC 119(e)要求2008年10月17日提交的美国临时专利申请号61/106,495，和2009年2月13日提交的美国临时专利申请号61/152,570的优先权，上述临时申请的内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明一般涉及分子生物学和生长因子调节领域。更具体地，本发明涉及治疗病理的病症如癌症的组合疗法。

背景

癌症是对人类健康而言最致命的威胁之一。仅在美国，癌症的每年新发患者为近1300000，并且是仅次于心血管病的第二号致死原因，在所有死亡中约占1/4。实体瘤导致那些死亡的大部分。尽管在某些癌症的医学治疗中有明显的进展，所有癌症的总体5年生存率在过去的20年中仅仅提高了约10％。癌症，或恶性肿瘤，以不受控制的方式转移并快速生长，导致及时检出和治疗非常困难。

HGF是间质衍生的多效性因子，对许多不同细胞类型具有促有丝分裂、促运动和促形态发生活性。HGF作用是通过特定的酪氨酸激酶c-met介导的，而且在多种肿瘤中经常观察到异常的HGF和c-met表达。参见例如Maulik等，Cytokine & Growth Factor Reviews(细胞因子和生长因子综述)(2002)，13：41-59；Danilkovitch-Miagkova和Zbar，J.Clin.Invest.(临床研究杂志)(2002)，109(7)：863-867。在肿瘤进展和转移中牵涉HGF/c-Met信号传导途径的调控。参见例如Trusgolino和Comoglio，Nature Rev.(自然综述)(2002)，2：289-300)。

HGF结合Met受体酪氨酸激酶(RTK)的胞外域并调控多种多样的生物学过程，诸如细胞分散、增殖和存活。HGF-Met信号传导对于正常胚胎发育而言是至关重要的，尤其是在肌肉祖细胞迁移及肝和神经系统发育中(Bladt等，Nature(自然)(1995)，376，768-771.；Hamanoue等，Faseb J(2000)，14，399-406；Maina等，Cell(细胞)(1996)，87，531-542；Schmidt等，Nature(自然)(1995)，373，699-702；Uehara等，Nature(自然)(1995)，373，702-705)。敲除Met和HGF的小鼠的发育表型非常相似，这说明HGF是Met受体的关联配体(Schmidt等，1995，同上：Uehara等，1995，同上)。HGF-Met还在肝再生、血管发生和伤口愈合中发挥作用(Bussolino等，J Cell Biol(1992)，119，629-641；Matsumoto和Nakamura，Exs(1993)，65，225-249；Nusrat等，J Clin Invest(临床研究杂志)(1994)93，2056-2065)。Met受体前体经蛋白酶剪切切割成由二硫键连接的胞外α亚基和跨膜β亚基(Tempest等，Br J Cancer(英国癌症杂志)(1988)，58，3-7)。β亚基包含胞质激酶结构域，而且在C末端包含多底物停靠位点，在此处衔接物(adapter)蛋白结合并起动信号传导(Bardelli等，Oncogene(癌基因)(1997)，15，3103-3111；Nguyen等，J Biol Chem(生物化学杂志)(1997)，272，20811-20819；Pelicci等，Oncogene(癌基因)(1995)，10，1631-1638；Ponzetto等，Cell(细胞)(1994)，77，261-271；Weidner等，Nature(自然)(1996)，384，173-176)。HGF结合后，Met激活，分别经由Gab1和Grb2/Sos介导的PI3激酶和Ras/MAPK激活而导致了酪氨酸磷酸化和下游信号传导，它驱动细胞运动和增殖(Furge等，Oncogene(癌基因)(2000)，19，5582-5589；Hartmann等，J Biol Chem(生物化学杂志)(1994)，269，21936-21939；Ponzetto等，J Biol Chem(生物化学杂志)(1996)，271，14119-14123；Royal和Park，J Biol Chem(生物化学杂志)(1995)，270，27780-27787)。

据显示，Met可在经致癌原处理的骨肉瘤细胞系中转化(Cooper等，Nature(自然)(1984)，311，29-33；Park等，Cell(细胞)(1986)，45，895-904)。已在多种人癌症中观察到了Met的过表达或基因扩增。例如，Met蛋白在结肠直肠癌中过表达至少5倍，且据报道在肝转移中有基因扩增(Di Renzo等，Clin Cancer Res(临床癌症研究)(1995)，1，147-154；Liu等，Oncogene(癌基因)(1992)，7，181-185)。据报道，Met蛋白还在口腔鳞状细胞癌、肝细胞癌、肾细胞癌、乳腺癌和肺癌中过表达(Jin等，Cancer(癌症)(1997)，79，749-760；Morello等，J Cell Physiol(细胞生理学杂志)(2001)，189，285-290；Natali等，Int J Cancer(国际癌症杂志)(1996)，69，212-217；Olivero等，Br J Cancer(英国癌症杂志)(1996)，74，1862-1868；Suzuki等，Br J Cancer(英国癌症杂志)(1996)，74，1862-1868)。此外，在肝细胞癌、胃癌和结肠直肠癌中观察到mRNA的过表(Boix等，Hepatology(肝脏病学)(1994)，19，88-91；Kuniyasu等，Int J Cancer(国际癌症杂志)(1993)，55，72-75；Liu等，Oncogene(癌基因)(1992)，7，181-185)。

在肾乳头状癌中发现了Met激酶结构域中的许多突变，它们导致组成性受体激活(Olivero等，Int J Cancer(国际癌症杂志)(1999)，82，640-643；Schmidt等，Nat Genet(自然：遗传)(1997)，16，68-73；Schmidt等，Oncogene(癌基因)(1999)，18，2343-2350)。这些激活突变造成组成性Met酪氨酸磷酸化，并导致MAPK激活、病灶形成和肿瘤发生(Jeffers等，Proc Natl Acad Sci U S A(美国科学院院刊)(1997)，94，11445-11450)。此外，这些突变增强细胞运动和侵入(Giordano等，Faseb J(2000)，14，399-406；Lorenzato等，Cancer Res(癌症研究)(2002)，62，7025-7030)。转化细胞中的HGF依赖性Met激活介导运动、分散和迁移的增加，最终导致侵入性肿瘤生长和转移(Jeffers等，Mol Cell Biol(分子细胞生物学)(1996)，16，1115-1125；Meiners等，Oncogene(癌基因)(1998)，16，9-20)。

Met已显示出与驱动受体激活、转化和侵入的其它蛋白质相互作用。在肿瘤细胞中，据报道，Met与α6β4整联蛋白(诸如层粘连蛋白的胞外基质(ECM)组分的受体)相互作用，以促进HGF依赖性的侵入生长(Trusolino等，Cell(细胞)(2001)，107，643-654)。此外，Met胞外域已显示出与脑信号蛋白(semaphorin)家族的成员丛蛋白B1相互作用，以增强侵入生长(Giordano等，Nat Cell Biol(自然：细胞生物学)(2002)，4，720-724)。而且，已知牵涉肿瘤发生和转移的CD44v6据报道也与Met和HGF形成复合物并导致Met受体激活(Orian-Rousseau等，Genes Dev(基因和发育)(2002)，16，3074-3086)。

Met是受体酪氨酸激酶(RTK)亚家族的成员，该家族包括Ron和Sea(Maulik等，Cytokine Growth Factor Rev(细胞因子生长因子综述)(2002)，13，41-59)。Met胞外域的结构预测表明它与脑信号蛋白和丛蛋白同源。Met的N末端包含约500个氨基酸的Sema结构域，其在所有脑信号蛋白和丛蛋白中是保守的。脑信号蛋白和丛蛋白属于一个分泌的和膜结合的蛋白质大家族，首先因其在神经发育中的作用而被记载(Van Vactor和Lorenz，Curr Bio(现代生物学)(1999)，19，R201-204)。不过，近来将脑信号蛋白的过表达与肿瘤的侵入和转移联系起来了。在丛蛋白、脑信号蛋白和整联蛋白中发现的富含半胱氨酸PSI结构域(也称为Met相关序列结构域)邻近Sema结构域，随后是4个IPT重复片段，其是在丛蛋白和转录因子中发现的免疫球蛋白样区域。近来的研究表明Met Sema结构域足以使HGF和肝素结合(Gherardi等，Proc Natl Acad Sci U S A(美国科学院院刊)(2003)，100(21)：12039-44)。

如上所述，Met受体酪氨酸激酶由其关联配体HGF激活，而且受体磷酸化激活下游MAPK、PI-3激酶和PLC-γ途径(L.Trusolino和P.M.Comoglio，Nat Rev Cancer(自然综述：癌症)2，289(2002)；C.Birchmeier等，Nat Rev Mol Cell Biol(自然综述：分子细胞生物学)4，915(2003))。激酶结构域内的Y1234/Y1235磷酸化对于Met激酶激活来说是关键的，而多底物停靠位点中的Y1349和Y1356对于结合src同源体-2(SH2)、磷酸酪氨酸结合(PTB)、和Met结合结构域(MBD)蛋白来说是重要的(C.Ponzetto等，Cell(细胞)77，261(1994)；K.M.Weidner等，Nature(自然)384，173(1996)；G.Pelicci等，Oncogene(癌基因)10，1631(1995))，用以介导下游信号传导途径的激活。另一个近膜磷酸化位点Y1003已经很好地表征了其与Cbl E3连接酶的酪氨酸激酶结合(TKB)结构域的结合(P.Peschard等，Mol Cell(分子细胞)8，995(2001)；P.Peschard，N.Ishiyama，T.Lin，S.Lipkowitz，M.Park，J Biol Chem(生物化学杂志)279，29565(2004))。据报道，Cbl的结合驱动吞蛋白(endophilin)介导的受体内吞、泛素化及随后的受体降解(A.Petrelli等，Nature(自然)416，187(2002))。该受体下调的机制以前在也具有相似Cbl结合位点的EGFR家族中有记载(K.Shtiegman，Y.Yarden，Semin Cancer Biol(癌症生物学讲座)13，29(2003)；M.D.Marmot，Y.Yarden，Oncogene(癌基因)23，2057(2004)；P.Peschard，M.Park，Cancer Cell(癌细胞)3，519(2003))。多种肿瘤中据报道有Met和HGF失调。在数种癌中观察到配体驱动的Met激活。在肺、乳腺癌、和多发性骨髓瘤中观察到升高的血清和肿瘤内HGF(J.M.Siegfried等，Ann Thorac Surg 66，1915(1998)；P.C.Ma等，Anticancer Res(抗癌研究)23，49(2003)；B.E.Elliott等Can J Physiol Pharmacol 80，91(2002)；C.Seidel，等，Med Oncol 15，145(1998))。在多种癌中，诸如在结肠直肠、肺、胃、和肾癌中，据报道有Met和/或HGF的过表达、Met扩增或突变，而且认为这驱动配体依赖性受体激活(C.Birchmeier等，Nat Rev Mol Cell Biol(自然综述：分子细胞生物学)4，915(2003)；G.Maulik等，Cytokine Growth Factor Rev(细胞因子生长因子综述)13，41(2002))。另外，肝小鼠模型中诱导性Met过表达引起了肝细胞癌，这证明了受体过表达驱动配体非依赖性肿瘤发生(R.Wang，等，J Cell Biol 153，1023(2001))。Met参与癌的最引人注目的证据据报道是在家族性和散发性肾乳头状癌(RPC)患者中，Met激酶结构域中造成受体组成性激活的突变在RPC中被鉴定为种系和体细胞突变(L.Schmidt等，Nat Genet(自然：遗传)16，68(1997))。将这些突变导入转基因小鼠模型造成肿瘤发生和转移(M.Jeffers等，Proc Natl Acad Sci U S A(美国科学院院刊)94，11445(1997))。

表皮生长因子受体(EGFR)家族包括参与细胞应答如分化和增殖的四种密切相关的受体(HER1/EGFR，HER2，HER3和HER4)。过表达EGFR激酶或其配体TGF-α常常与许多癌症相关，包括乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、肾细胞癌、膀胱癌、头和颈癌、成胶质细胞瘤和星形细胞瘤，并且认为促进这些肿瘤的恶性生长。也已经发现EGFR基因(EGFRvIII)中的特异性缺失突变增加细胞致肿瘤性。激活EGFR刺激的信号传导途径促进多个可能促癌的过程，例如增殖、血管发生、细胞运动性和侵袭、降低细胞凋亡和诱导药物抗性。增加的HER1/EGFR表达经常与重病、转移和差的预后相关联。例如，在NSCLC和胃癌中，已经显示增加的HER1/EGFR表达与高转移率、差的肿瘤分化和增加的肿瘤增殖相关。

在NSCLC和成胶质细胞瘤中已经观察到激活受体的内在性蛋白酪氨酸激酶活性和/或增加下游信号传导的突变。然而，突变作为赋予对EGF受体抑制剂(例如厄洛替尼(erlotinib)(TARCEVA

)或吉非替尼(gefitinib))的敏感性的主要机制的作用存在争议。已经报道全长EGF受体的突变形式预测了对EGF受体酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼的反应性(Paez，J.G.等(2004)Science(科学)304：1497-1500；Lynch，T.J.等(2004)N.Engl.J.Med.(新英格兰医学杂志)350：2129-2139)。细胞培养研究已经显示表达EGF受体的此类突变形式的细胞系(即H3255)对EGF受体酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼的生长抑制更敏感，需要高得多的浓度的吉非替尼来抑制表达野生型EGF受体的肿瘤细胞系。这些观察表明特定突变形式的EGF受体可能反应对EGF受体抑制剂的更大的敏感性，但没有鉴定完全无反应的表型。

直接抑制EGFR的激酶活性的化合物以及通过阻断EGFR激活降低EGFR激酶活性的抗体开发用作抗肿瘤试剂是强烈努力研究的领域(de Bono J.S.和Rowinsky，E.K.(2002)Trends in Mol.Medicine(分子医学发展趋势)8：S19-S26；Dancey，J.和Sausville，E.A.(2003)Nature Rev.Drug Discovery(自然综述.药物发现)2：92-313)。数个研究已经证明、公开或表明一些EGFR激酶抑制剂当与某些其它抗癌或化疗试剂或治疗组合使用时可能改善对肿瘤细胞或瘤形成的杀伤(例如Herbst，R.S.等(2001)Expert Opin.Biol.Ther.(生物学理论专家观点)1：719-732；Solomon，B.等(2003)Iht.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.55：713-723；Krishnan，S.等(2003)Frontiers in Bioscience(生命科学前沿)8，e1-13；Grunwald，V.和Hidalgo，M.(2003)J.Nat.Cancer Inst.95：851-867；Seymour L.(2003)Current Opin.Investig.Drugs(药物研究现代观点)4(6)：658-666；Khalil，M.Y.等(2003)Expert Rev.Anticancer Ther.(抗癌理论专家综述)3：367-380；Bulgaru，A.M.等(2003)Expert Rev.Anticancer Ther.(抗癌理论专家综述)3：269-279；Dancey，J.和Sausville，E.A.(2003)Nature Rev.Drug Discovery(自然综述.药物发现)2：92-313；Ciardiello，F.等(2000)Clin.Cancer Res.(临床癌症研究)6：2053-2063；和专利公开No：US 2003/0157104)。

厄洛替尼(例如盐酸厄洛替尼，也称为TARCEVA

或OSI-774)是可口服的EGFR激酶抑制剂。在体外，厄洛替尼已经证明在很多人肿瘤细胞系(包括结肠直肠癌和乳腺癌)中对EGFR激酶有重要抑制活性(Moyer J.D.等(1997)Cancer Res(癌症研究).57：4838)，并且临床前评价已经证明有抵抗很多表达EGFR的人肿瘤异种移植物的活性(Pollack，V.A.等(1999)J.Pharmacol.Exp.Ther.291：739)。厄洛替尼在很多适应症的临床试验中已经证明有活性，包括头和颈癌(Soulieres，D.，等(2004)J.Clin.Oncol.(临床肿瘤学)22：77)，NSCLC(Perez-Soler R，等(2001)Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.20：310a，文摘1235)，CRC(Oza，M.，等(2003)Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.22：196a，文摘785)和MBC(Winer，E.，等(2002)Breast Cancer Res.Treat.(乳腺癌研究治疗)76：5115a，文摘445；Jones，R.J.，等(2003)Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.22：45a，文摘180)。在III期试验中，在患有晚期、治疗-顽抗的NSCLC患者中，厄洛替尼单一疗法显著延长存活、延迟疾病进展并且延迟肺癌相关症状的恶化(Shepherd，F.等(2004)J.Clin.Oncology(临床肿瘤学)，22：14S(7月15日增刊)，文摘7022)。在2004年11月美国食品药品管理局(U.S.Food and Drug Administration(FDA))批准TARCEVA

用于在至少一次在先化学治疗方案失败后治疗患有局部进展的或转移的非小细胞肺癌(NSCLC)的患者。

尽管在癌症治疗中有重大进展，仍然在寻求改进的疗法。

本文引用的所有参考文献，包括专利申请和公开，其全文通过引用并入本文。

发明概述

本发明提供用于治疗病理的病症如癌症的疗法，其中抗c-met抗体提供显著的抗肿瘤活性。本发明还提供用于治疗病理的病症如癌症的组合疗法，其中抗c-met抗体与EGFR拮抗剂组合，由此提供显著的抗肿瘤活性。

一方面，本发明提供治疗受试者中癌症的方法，包括向该受试者以每三周大约15mg/kg的剂量施用抗c-met抗体。

另一方面，本发明提供治疗受试者中癌症的方法，包括向该受试者施用(a)每三周大约15mg/kg的剂量的抗c-met抗体；和(b)EGFR拮抗剂。

一方面，本发明提供用于在患有非小细胞肺癌的受试者中延长疾病进展时间(time to disease progression，TTP)或存活的方法，该方法包括向该受试者施用(a)每三周大约15mg/kg的剂量的抗c-met抗体；和(b)EGFR拮抗剂。

在一些实施方案中，抗-c-met抗体以足以获得15微克/ml或高于15微克/ml的血清谷浓度(serum trough concentration)的量施用。在一些实施方案中，抗-c-met抗体以总剂量大约15mg/kg在三周的期间中施用。

在一个实施方案中，EGFR拮抗剂是厄洛替尼。在某些实施方案中，厄洛替尼在三周的周期中每天以150mg的剂量施用。在某些实施方案中，厄洛替尼在三周的周期中每天以100mg的剂量施用。在某些实施方案中，厄洛替尼在三周的周期中每天以50mg的剂量施用。

在一个实施方案中，本发明提供用于在患有非小细胞肺癌的受试者中延长疾病进展时间(TTP)、无进展存活、或存活的方法，该方法包括向该受试者施用(a)每三周大约15mg/kg的剂量的抗-c-met抗体(如MetMAb)；和(b)在三周的周期中每天150mg剂量的厄洛替尼(N-(3-乙炔基苯基)-6，7-二(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺)。

本申请第一次公开了在人中施用包含Fc区的单价单臂抗体，与包含所述抗原结合臂的Fab分子相比，该Fc区增加了所述抗体片段的稳定性。参见，例如WO2005/063816。在一些情况下全长抗体在结合目标抗原时显示出激动效应(其可能是不想要的)，即使作为Fab片段其是拮抗性抗体。参见，例如美国专利No.6,468,529。当拮抗性效应是想要的治疗功能时这种现象是不利的。单臂抗体的单价特性(即抗体包含单抗原结合臂)在该抗体结合目标分子时产生和/或保证拮抗功能，适合用于治疗需要拮抗功能且抗体的双价产生不利激动效应的病理的病症。另外，本文描述的包含Fc区的单臂抗体的特征在于，与具有相似/基本相同抗原结合特性的Fab形式相比具有优异的药物代谢动力学属性(如体内增强的半衰期和/或降低的清除率)，因此克服了使用常规单价Fab抗体中的主要缺点。

因此，在一些实施方案中，抗-c-met抗体是包含Fc区的单臂抗体(即重链可变结构域和轻链可变结构域形成单抗原结合臂)，其中该Fc区包含第一和第二Fc多肽，其中第一和第二Fc多肽存在于复合物中并形成Fc区，与包含所述抗原结合臂的Fab分子相比较而言，该Fc区增加了所述抗体片段的稳定性。

在一些实施方案中，该抗-c-met抗体包含(a)第一多肽，其包含具有下述序列的重链可变结构域：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWLHWVRQAPGKGLEWVGMIDPSNSDTRFNPNFKDRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCATYR

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYAYPWTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：11)，和CL1序列；和(c)第三多肽，其包含第二Fc多肽，其中重链可变结构域和轻链可变结构域以复合物存在并形成单抗原结合臂，其中第一和第二Fc多肽存在于复合物中并形成Fc区，与包含所述抗原结合臂的Fab分子相比较而言，该Fc区增加了所述抗体片段的稳定性。在一些实施方案中，第一多肽包含图1中所描述的Fc序列(SEQ ID NO：12)并且第二多肽包含图2中所述的Fc序列(SEQ ID NO：13)。在一些实施方案中，第一多肽包含图2中所述的Fc序列(SEQ ID NO：13)并且第二多肽包含图1中所描述的Fc序列(SEQ ID NO：12)。

在一些实施方案中，该抗-c-met抗体包含(a)包含重链可变结构域的第一多肽，所述多肽包含序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWLHWVRQAPGKGLEWVGMIDPSNSDTRFNPNFKDRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCATYRSYVTPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：14)；(b)包含轻链可变结构域的第二多肽，该多肽包含序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYAYPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：15)；和包含Fc序列的第三多肽，该多肽包含序列：

CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：13)，其中重链可变结构域和轻链可变结构域以复合物存在并形成单抗原结合臂，其中第一和第二Fc多肽存在于复合物中并形成Fc区，与包含所述抗原结合臂的Fab分子相比较而言，该Fc区增加了所述抗体片段的稳定性。

在一个实施方案中，该抗-c-met抗体包含重链可变结构域，该重链可变结构域包含图1中所描述的CDR1-HC，CDR2-HC和CDR3-HC序列(SEQ ID NO：4，5，和/或9)中的一条或多条。在一些实施方案中，该抗体包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含图1中所描述的CDR1-LC，CDR2-LC和CDR3-LC序列(SEQID NO：1，2，和/或3)中的一条或多条。在一些实施方案中，该重链可变结构域包含图1中所描述的FR1-HC，FR2-HC，FR3-HC和FR4-HC序列(SEQ ID NO：21-24)。在一些实施方案中，该轻链可变结构域包含图1中所描述的FR1-LC，FR2-LC，FR3-LC和FR4-LC序列(SEQ ID NO：16-19)。

适用于本发明的方法的其它抗-c-met抗体在本文中描述并且是本领域中已知的。

一方面，抗-c-met抗体包括至少一个特性，其促进抗体片段内的Fc序列的异二聚化而使同二聚化最小。这样的一种或多种特性改善了免疫球蛋白群体的产量和/或纯度和/或同质性。在一个实施方案中，该抗体包含Fc突变，其构成“凸起(″knobs″)”和“孔洞”(″holes″)，如WO2005/063816中描述。例如孔洞突变可以是Fc多肽中T366A，L368A和/或Y407V中的一种或多种，并且空腔(cavity)突变可以是T366W。

本发明的方法可用于影响任何适当的病理状态。例如，本发明的方法可用于治疗不同癌症，实体瘤和软组织肿瘤等均可。本发明的治疗可改善的癌症的非限制性实例包括乳腺癌(breast cancer)、结肠直肠癌(colorectal cancer)、直肠癌(rectal cancer)、非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer)、非-霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkins lymphoma(NHL))、肾细胞癌(renal cell cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、肝癌(liver cancer)、胰腺癌(pancreatic cancer)、软组织肉瘤(soft-tissue sarcoma)、卡波济肉瘤(kaposi′s sarcoma)、类癌瘤的癌瘤(carcinoid carcinoma)、头和颈癌(head and neck cancer)、黑素瘤(melanoma)、卵巢癌(ovarian cancer)、胃癌(gastric cancer)、间皮瘤(mesothelioma)、和多发性骨髓瘤(multiple myeloma)。在某些方面，癌症是转移的。在其它方面，癌症是非转移的。

在一些实施方案中，该癌症是非小细胞肺癌、肾细胞癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌(bladder cancer)、食管癌(esophageal cancer)、间皮瘤、黑素瘤、乳腺癌、甲状腺癌(thyroid cancer)、结肠直肠癌、头和颈癌、骨肉瘤(osteosarcoma)、前列腺癌、或成胶质细胞瘤(glioblastoma)。

在一些实施方案中，受试者的癌表达c-met。在一些实施方案中，受试者的癌表达EGFR。在一些实施方案中，受试者的癌显示c-met和/或EGFR表达、扩增、或激活。

在一些实施方案中，来自于受试者的血清表达高水平的IL8(显示高水平的IL8表达，如IL8蛋白表达)。在一些实施方案中，来自于受试者的血清表达高于大约150pg/ml的IL8，或在一些实施方案中，高于大约50pg/ml的IL8。在一些实施方案中，来自于受试者的血清表达高于大约10pg/ml，20pg/ml，30pg/ml或更高的IL8。测量IL8血清浓度的方法是本领域已知的并且一种方法在本实施例中描述。

在一些实施方案中，来自于受试者的血清表达高水平的HGF(显示高水平的HGF表达，如HGF蛋白表达)。在一些实施方案中，来自于受试者的血清表达高于大约5,000，10,000，或50,000pg/ml的HGF。

抗-c-met抗体可连续施用或与EGFR拮抗剂组合在相同组合物中或作为单独的组合物施用。抗-c-met抗体和EGFR拮抗剂的施用可同时进行，例如作为单一组合物或作为两种或多种不同组合物，使用相同或不同的施用途径。备选地或另外地，可以任何顺序连续进行施用。备选地或另外地，该步骤可作为以任何顺序的连续和同时的组合实施。在某些实施方案中，两种或多种组合物的施用之间可存在的间隔范围在数分钟至数天-数周至数月。例如，可以首先施用EGFR拮抗剂，随后是抗-c-met抗体。然而，也涵盖了同时施用或首先施用抗-c-met抗体。

取决于待治疗的具体癌症适应症，本发明的组合治疗可与另外的治疗剂进行组合，如化疗剂、VEGF拮抗剂，或与另外的疗法如放射性疗法或手术进行组合。许多已知的化疗剂可在本发明的组合治疗中使用。优选地将使用治疗具体适应症的标准的那些化疗剂。在组合中将使用的每种治疗剂的剂量或频率优选地与当该相应药剂不与其它一种或多种药剂一起使用时的剂量或频率相同或更低。

本发明也提供预后的方法。因此，公开的方法可提供用于方便、有效并可能经济的方式获得对评估病症将来的进程(包括对正在治疗的患者选择适当的疗法)有用的数据和信息。

另一方面，本发明提供评价患有或怀疑患有癌症的患者的方法，该方法包括：基于来自于该患者生物学样品中的IL8的表达与对照样品中IL8的表达的比较预测该患者癌症的预后；其中患者生物学样品中相对于对照样品中的IL8的表达对该患者的癌症是预后性的。在一些实施方案中，该方法还包括(a)从患者获得生物学样品(例如在治疗前和/或治疗过程中)；和(b)检测在该生物学样品(一个或多个)中的IL8的表达。在一些实施方案中，患者生物学样品中相对于对照样品中IL8表达的增加对该患者的癌症是预后性的。在一些实施方案中，患者生物学样品中相对于对照样品中IL8表达的降低对该患者的癌症是预后性的。

另一方面，本发明提供用于评价正在进行癌症治疗的患者的方法，该方法包括：基于来自于该患者的生物学样品(例如血清)中的IL8的表达与在治疗前采集的该患者生物学样品中IL8的表达的比较预测该患者的癌症预后，其中正在进行治疗的患者血清中IL8的表达相对于治疗前样品中表达而言降低对该患者的癌症是预后性的。

在一些实施方案中，癌症的预后包括对下述任何一个或多个提供预言或预测(预后)：对治疗(例如，用c-met拮抗剂(如抗c-met抗体)或用c-met拮抗剂和EGFR拮抗剂)的反应，c-met拮抗剂(如抗-c-met抗体)或c-met拮抗剂和EGFR拮抗剂的活性，对治疗(例如，用c-met拮抗剂或用c-met拮抗剂和EGFR拮抗剂)的反应，治疗(例如，用c-met拮抗剂或用c-met拮抗剂和EGFR拮抗剂)的活性，易患癌症或诊断为癌症的患者的存活时间，无复发存活时间，易患癌症或诊断为癌症的患者的无进展存活时间，易患癌症或诊断为癌症的一组患者的反应率，易患癌症或诊断为癌症的一组患者的反应时间，和/或易患癌症或诊断为癌症的患者中转移的可能性。在一些实施方案中，存活时间预言或预测为增加。在一些实施方案中，存活时间预言或预测为降低。在一些实施方案中，无复发存活时间预言或预测为增加。在一些实施方案中，无复发存活时间预言或预测为减少。在一些实施方案中，反应率预言或预测为增加。在一些实施方案中，反应率预言或预测为减少。在一些实施方案中，反应时间预言或预测为增加。在一些实施方案中，反应时间预言或预测为降低。在一些实施方案中，转移可能性预言或预测为增加。在一些实施方案中，转移可能性预言或预测为降低。

另一方面，本发明提供选择对于患有或怀疑患有癌症的患者的治疗的方法，该方法包括：(a)基于来自于该患者生物学样品中的IL8的表达与对照样品中IL8的表达的比较预测该患者癌症的预后，其中患者生物学样品中相对于对照样品中的IL8的表达对该患者的癌症是预后性的，和(b)步骤(a)之后，选择对于该患者的癌症治疗，其中该治疗的选择基于在步骤(a)中确定的患者的预后。在一些实施方案中，该方法还包括(c)获得患者的生物学样品；(d)检测在该生物学样品中的IL8的表达，其中在该患者生物学样品中IL8的表达对癌症是预后性的。在一些实施方案中，患者生物学样品中相对于对照样品中IL8表达的增加对该患者的癌症是预后性的。在一些实施方案中，患者生物学样品中相对于对照样品中IL8表达的降低对该患者的癌症是预后性的。

另一方面，本发明提供选择对于正在进行癌症治疗的患者的治疗的方法，该方法包括：(a)基于来自于该患者生物学样品(例如血清)中的IL8的表达与治疗前采集的该患者生物学样品中IL8的表达的比较预测该患者癌症的预后，其中正在进行治疗的患者血清中IL8的表达相对于治疗前样品中表达而言对该患者的癌症是预后性的，和(b)步骤(a)之后，选择对于该患者的癌症治疗，其中该治疗的选择基于在步骤(a)中确定的患者的预后。在一些实施方案中，该方法还包括(c)获得患者的生物学样品；(d)检测在该生物学样品中的IL8的表达，其中在该患者生物学样品中IL8的表达对癌症是预后性的。在一些实施方案中，患者生物学样品中相对于对照样品中IL8表达的增加对该患者的癌症是预后性的。在一些实施方案中，患者生物学样品中相对于对照样品中IL8表达的降低对该患者的癌症是预后性的。

附图简述

图1：描述了MetMAb(OA5D5v2)的构架(FR)、CDR、第一恒定结构域(CL或CH1)和Fc区(Fc)的氨基酸序列。所描述的Fc序列包含“孔洞”(空腔)突变T366S，L368A和Y407V，如WO 2005/063816中所描述。

图2：描述了包含“凸起”(″knob″)(隆凸)突变T366W的Fc多肽的序列，如WO 2005/063816中所描述。在一个实施方案中，包含这种序列的Fc多肽与包含图1的Fc序列的Fc多肽形成复合物从而产生Fc区。

图3：在小鼠、大鼠和食蟹猴(cynomolgus monkey)中进行单次IV或IP推注剂量的MetMAb后平均血清MetMAb浓度-时间曲线图。如图所示MetMAb在第0天给药。

图4：在KP4胰腺癌异种移植物模型中在多种剂量水平的单次IV推注剂量的MetMAb后平均肿瘤体积-时间曲线图。如图所示MetMAb在第0天给药。

图5：平均肿瘤体积-剂量曲线图。在第21天的组平均肿瘤体积＝∑(第21天肿瘤体积-相同动物在第0天的肿瘤体积)/n。

图6：在KP4异种移植物模型中不同给药方案的IV推注剂量的MetMAb之后平均肿瘤体积-时间曲线图。箭头表示剂量组的给药时间如下(从顶排到底排)：顶部箭头：MetMAb 0.825mg/kg每周一次(Q1W)；中间箭头：MetMAb 1.25mg/kg每两周一次(Q2W)；底部箭头：MetMAb 2.5mg/kg每三周一次(Q3W)。在该图中″OA5D5″是指MetMAb。菱形表示PBS对照。

图7：在KP4异种移植物模型中单次IV推注剂量或IV输注MetMAb后平均肿瘤体积-时间曲线图。MetMAb如图所示进行给药。

图8：在携带H596非小细胞肺癌肿瘤huHGF-SCID转基因小鼠中在IV推注剂量之后平均肿瘤体积-时间曲线图。MetMAb如图所示进行给药。

图9：说明对于MetMAb的理论人群PK/PD肿瘤进展模型，由直接KP4肿瘤生长抑制的两区室(two-compartment)非线性PK模型构成。CL＝总清除率的非饱和清除部分；CLd＝区室间清除率；Km₁₀＝在50％V_max10的MetMAb血清浓度；V_max10＝总清除的饱和清除部分的最大药物去除；V1＝表观中心分布体积；V2＝表观外周分布体积；IC₅₀＝Michaelis-Menten常数，代表导致50％细胞生长抑制的MetMAb血清浓度；IMax＝最大MetMAb肿瘤生长抑制效应常数；KGN＝KP4肿瘤细胞系体内净生长率；C＝MetMAb血清浓度。

图10：来自于15mg/kg Q3WMetMAb模拟实验的代表性PK曲线图和MTC值。PK＝药物代谢动力学特征曲线(pharmacokinetic profile)；MTC＝最小肿瘤稳定MetMAb浓度。

图11：对应于图10中所示PK曲线图和MTC值的肿瘤质量模拟实验。AUC＝曲线下MetMAb血清面积；MTC＝最小肿瘤稳定MetMAb浓度。

图12：I期剂量渐增(dose escalation)研究设计。

图13：I期剂量渐增研究中患者诊断、治疗组和施用周期。在剂量-渐增阶段中每个患者的MetMAb暴露周期。除非另有注明，所有患者由于进展性疾病脱离研究。

图14：每个剂量组中每个药物代谢动力学时间点的MetMAb血清浓度在所有患者中进行平均。对每个组用均值(±SD)MetMAb浓度相对于时间进行作图。

图15：使用PK/PD建模来确定人中MTC中值(median)，其是基于临床前肿瘤异种移植物研究和种间比例确定来进行。人中血清中MetMAb的MTC确定为15ug/mL。使用基于来自这种1期研究观察到的PK数据的模拟实验来鉴定15mg/kg Q3W剂量(箭头)，其在90％的患者中获得大于或等于MTC的稳态谷浓度。MTC＝最小肿瘤稳定浓度，PK＝药物代谢动力学，PD＝药效学；SS＝稳态，Q3W＝每三周一次。

图16：Met的抑制可能影响循环配体HGF的水平。通过基于ELISA的方法测量血清HGF水平。数据以基线HGF表达降序呈现。总体而言，用MetMAb处理时似乎有很小或没有HGF表达的增加。然而显示最高水平的基线HGF表达的两个患者表现出显著的HGF表达降低。对于患者11009，药物治疗后HGF水平降低70％并且保持低水平。C＝周期，D＝天，HGF＝肝细胞生长因子，M＝男性，F＝女性，C1D1，C2D1，C3D1：给药前；C1D2：给药后24h。

图17：血清IL8水平的评价。数据以基线IL8表达的降序呈现。总体而言，具有高于正常对照的基线血清IL8水平的大部分患者在MetMAb输注后有血清IL8的降低。在4周期间健康志愿者IL8的受试者内变异是～3-10pg/ml。IL8＝白细胞介素8，MSD＝中间测量发现(meso scale discovery)，C＝周期，D＝天，M＝男性，F＝女性，C1D1，C2D1，C3D1：给药前；C1D2：给药后24h。

图18：参与剂量渐增阶段的所有患者的最佳肿瘤反应。一位患者未进行评价，因为该患者在第一评价时间点之前有进展；另一位患者的CT评价在这些数据收集的时间不能获得。标明了患者数目和肿瘤类型。SLD＝最长直径的总和。

图19：患者11009的CT和MRI扫描。左上组：患者11009在2007年8月的CT扫描。右上组：患者11009的CT扫描，这使得她有资格登记进入MetMAbI期试验。左下组：CT扫描显示完全反应。右下组：MRI扫描确认了完全反应。圆圈标明了肿瘤的位点。

图20：患者11009的标本组织的免疫组织化学染色。患者11009的标本胃腺癌样本的免疫组织化学染色揭示肿瘤细胞中有中度的膜和胞质c-met表达和胞质和膜周边HGF表达。

详细描述

I.定义

术语″肝细胞生长因子″或″HGF″，用于本文时，除非另有说明，是指任何天然或变体(天然的或合成的)HGF多肽，其能够在允许此类过程发生的条件下激活HGF/c-met信号传导途径。术语″野生型HGF″一般是指包含天然存在HGF蛋白的氨基酸序列的多肽。术语″野生型HGF序列″一般是指在天然存在的HGF中发现的氨基酸序列。c-met是HGF的已知受体，通过c-met在生物学上完成HGF的细胞内信号传导。

术语″HGF变体″用于本文时是指这样的HGF多肽，其包括天然HGF序列中一个或多个氨基酸突变。任选地，一个或多个氨基酸突变包括氨基酸置换(一个或多个)。

“天然序列”多肽包含与来自自然的多肽具有相同的氨基酸序列的多肽。因此，天然序列多肽可以具有来自任何哺乳动物的天然存在的多肽的氨基酸序列。所述天然序列多肽可以从自然分离或可以通过重组或合成方式产生。术语“天然序列”多肽具体地包括多肽的天然存在的截短或分泌形式(例如，细胞外结构域序列)，天然存在的变体形式(例如，可变剪接形式)和多肽的天然存在的等位基因变体。

多肽“变体”指与天然序列多肽具有至少约80％氨基酸序列同一性的生物学活性多肽。此类变体包括例如其中在多肽的N末端或C末端添加或缺失一个或多个氨基酸残基的多肽。通常，变体将会与天然序列多肽具有至少约80％氨基酸序列同一性，更优选地至少约90％氨基酸序列同一性，以及甚至更优选地至少约95％氨基酸序列同一性。

″EGFR″是指受体酪氨酸激酶多肽表皮生长因子受体，其在Ullrich等，Nature(自然)(1984)309：418425中描述，另外也称为Her-1和c-erbB基因产物，以及其变体如EGFRvIII。EGFR的变体也包括缺失、置换和插入变体，例如在Lynch等(New England Journal of Medicine(新英格兰医学杂志)2004，350：2129)，Paez等(Science(科学)2004，304：1497)，Pao等(PNAS 2004，101：13306)中描述的那些。

″生物学样品″(可相互替换地称为“样品”或“组织或细胞样品”)涵盖从个体获得的多种样品类型并可用于诊断或检测测定中。该定义涵盖生物学来源的血和其它液体样品，实体组织样品如活组织检查样品或组织培养物或由其衍生的细胞，以及其后代。该定义也包括在它们获得后以任何方式操作的样品，如用试剂处理，增溶，或富集某些成分如蛋白或多核苷酸，或包埋在半固体或固体基质中用于切片的目的。术语″生物学样品″涵盖临床样品，并也包括培养物中的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物学液体和组织样品。生物学样品的来源可以是实体组织，来自于新鲜、冷冻和/或储存的器官或组织样品或活组织检查或抽吸；血液或任何血液成分；体液如脑脊液、羊水、腹水或间质液；来自于受试者怀孕或发育的任何时间的细胞。在一些实施方案中，生物学样品从原发或转移肿瘤中获得。生物学样品可含有本身与组织不天然混合的化合物如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养素、抗生素、或诸如此类的。

″抗-c-met抗体″是以足够亲和力和特异性结合c-met的抗体。所选择的抗体通常具有针对c-met的足够强的结合亲和力，例如所述抗体可以以介于100nM-1pM之间的K_d值结合人c-met。抗体亲和力可以通过例如基于表面等离子共振(surface plasmon resonance)的测定法(诸如BIAcore测定法，如PCT申请公开号WO2005/012359所记载的)；酶联免疫吸附测定法(ELISA)；和竞争测定法(例如RIA)来测定。在某些实施方案中，该抗-c-met抗体可在靶向和介入其中涉及c-met活性的疾病或病症中用作治疗剂。另外，所述抗体可以进行其它生物学活性测定法，例如为了评估其作为治疗剂的效力。此类测定法是本领域已知的，而且依赖于所述抗体的靶抗原和预期用途。

″c-met激活″是指c-met受体的激活或磷酸化。通常，c-met激活导致信号转导(例如由c-met受体的细胞内激酶结构域磷酸化c-met或底物多肽中的酪氨酸残基所导致)。c-met激活可由c-met配体(HGF)结合感兴趣的c-met受体来介导。HGF结合c-met可激活c-met的激酶结构域并由此导致c-met中酪氨酸残基的磷酸化和/或另外的底物多肽(一个或多个)中的酪氨酸残基的磷酸化。

“EGFR拮抗剂”(互换地称为“EGFR抑制剂”)是干扰EGFR激活或功能的药剂。EGFR抑制剂的实例包括EGFR抗体；EGFR配体的抗体；小分子EGFR拮抗剂；EGFR酪氨酸激酶抑制剂；反义和抑制性RNA(例如，shRNA)分子(见例如，WO2004/87207)。优选地，EGFR抑制剂是结合EGFR的抗体或小分子。在一些实施方案中，EGFR抑制剂是靶向EGFR的药物。在特定实施方案中，EGFR抑制剂与EGFR的结合亲和力(解离常数)约为1,000nM以下。在另一个实施方案中，EGFR抑制剂与EGFR的结合亲和力约为100nM以下。在另一个实施方案中，EGFR抑制剂与EGFR的结合亲和力约为50nM以下。在一个特定的实施方案中，EGFR抑制剂与EGFR共价结合。在一个特定的实施方案中，EGFR抑制剂以1,000nM以下的IC50抑制EGFR细胞传导。在另一个实施方案中，EGFR抑制剂以500nM以下的IC50抑制EGFR信号传导。在另一个实施方案中，EGFR抑制剂以50nM以下的IC50抑制EGFR信号传导。在某些实施方案中，EGFR拮抗剂降低或抑制，至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或更高的EGFR的表达水平或生物学活性。

“EGFR激活”指EGFR的激活或磷酸化。一般情况下，EGFR激活导致信号转导(例如，其由EGFR受体的细胞内激酶结构域磷酸化EGFR或底物多肽中的酪氨酸残基所导致)。EGFR激活可以由结合包含EGFR的EGFR二聚体的EGFR配体所介导。EGFR配体与EGFR二聚体的结合可以激活二聚体中的一个或多个EGFR的激酶结构域并且由此导致在一个或多个EGFR中的酪氨酸残基的磷酸化和/或在另外的底物多肽(一个或多个)中的酪氨酸残基的磷酸化。

用于本文时，术语″EGFR-靶向药物″是指结合EGFR并抑制EGFR激活的治疗剂。此类药剂的实例包括结合EGFR的抗体和小分子。结合EGFR的抗体的实例包括MAb 579(ATCC CRL HB 8506)，MAb 455(ATCC CRL HB8507)，MAb 225(ATCC CRL 8508)，MAb 528(ATCC CRL 8509)(参见美国专利No.4,943,533，Mendelsohn等)及其变体，如嵌合的225(C225或西妥昔单抗(Cetuximab)；ERBUTIX

)和改型的人225(H225)(参见，WO 96/40210，Imclone Systems Inc.)；IMC-11F8，其是全人的、EGFR-靶向抗体(Imclone)；结合II型突变的EGFR的抗体(美国专利No.5,212,290)；结合EGFR的人源化和嵌合抗体，如美国专利No.5,891,996中所描述；和结合EGFR的人抗体，如ABX-EGF(参见WO98/50433，Abgenix)；EMD 55900(Stragliotto等Eur.J.Cancer 32A：636-640(1996))；EMD7200(matuzumab)，其是针对EGFR的人源化EGFR抗体，与EGF和TGF-α两者竞争EGFR的结合；和mAb 806或人源化mAb 806(Johns等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)279(29)：30375-30384(2004))。抗-EGFR抗体可与细胞毒性剂缀合，从而产生免疫缀合物(参见，例如EP659,439A2，Merck Patent GmbH)。结合EGFR的小分子的实例包括ZD1839或吉非替尼(IRESSA；Astra Zeneca)；CP-358774或厄洛替尼(TARCEVA^TM；Genentech/OSI)；和AG1478，AG1571(SU 5271；Sugen)；EMD-7200。

短语″基因扩增″是指这样的过程，通过该过程多拷贝的基因或基因片段在特定细胞或细胞系中形成。被复制的区(一段扩增的DNA)常常被称为“扩增子”。通常，所产生的信使RNA(mRNA)的量，即基因表达的水平，也与该特定基因表达产生的拷贝数成比例的增加。

″酪氨酸激酶抑制剂″是这样的分子，其在一些程度上抑制酪氨酸激酶如c-met受体的酪氨酸激酶活性。

“显示c-met和/或EGFR表达、扩增或激活”的癌症或生物学样品是在诊断测试中，表达(包括过表达)c-met和/或EGFR，具有扩增的c-met和/或EGFR基因，和/或其它证明c-met和/或EGFR激活或磷酸化的癌症或生物学样品。

“不显示c-met和/或EGFR表达、扩增或激活”的癌症或生物学样品是在诊断测试中，不表达(包括过表达)c-met和/或EGFR，不具有扩增的c-met和/或EGFR基因，和/或其它未证明c-met和/或EGFR激活或磷酸化的癌症或生物学样品。

″显示c-met和/或EGFR激活″的癌症或生物学样品是在诊断测试中，证明c-met和/或EGFR的激活或磷酸化的癌症或生物学样品。此类激活可直接确定(例如通过ELISA测量c-met和/或EGFR磷酸化)或间接确定。

″不显示c-met和/或EGFR激活″的癌症或生物学样品是在诊断测试中，未证明c-met和/或EGFR的激活或磷酸化的癌症或生物学样品。此类激活可直接确定(例如通过ELISA测量c-met和/或EGFR磷酸化)或间接确定。

″显示c-met和/或EGFR扩增″的癌症或生物学样品是在诊断测试中具有扩增的c-met和/或EGFR基因的癌症或生物学样品。

″不显示c-met和/或EGFR扩增″的癌症或生物学样品是在诊断测试中不具有扩增的c-met和/或EGFR基因的癌症或生物学样品。

“磷酸-ELISA测定(phospho-ELISA assay)”在本文中指在酶联免疫吸附测定法(ELISA)中评估一种或多种c-met和/或EGFR的磷酸化的测定，其中使用检测磷酸化的c-met和/或EGFR的试剂(通常是抗体)、底物或下游信号传导分子。优选的是，使用检测磷酸化c-met和/或EGFR的抗体。该测定可对细胞裂解物、优选来自新鲜的或冷冻的生物学样品的细胞裂解物进行。

“c-met和/或EGFR过表达或扩增”的癌细胞指与同一组织类型的非癌细胞相比，具有显著更高水平的c-met和/或EGFR蛋白质或基因的癌细胞。此类过表达可以是由基因扩增或者转录或翻译增加引起的。可在诊断或预后测定中通过评估细胞表面上存在的c-met和/或EGFR蛋白质水平的升高(例如通过免疫组化测定，IHC)来测定c-met和/或EGFR的过表达或扩增。备选地/另外地，可测量细胞中编码c-met和/或EGFR的核酸的水平，例如通过荧光原位杂交(FISH；参见1998年10月公布的WO98/45479)、Southern印迹或聚合酶链反应(PCR)技术，诸如定量实时PCR(qRT-PCR)。在上述测定法之外，熟练从业人员还可利用多种体内测定法。例如，可将患者体内细胞暴露于任选用可检测标记物例如放射性同位素标记的抗体，并且可评估该抗体与患者体内细胞的结合，例如通过外部扫描放射性或通过分析取自事先已暴露于所述抗体的患者的活组织检查。

″不过表达或扩增c-met和/或EGFR″的癌症细胞是指与同一组织类型的非癌细胞相比，不具有高于正常水平的c-met和/或EGFR蛋白质或基因的癌症细胞。

术语“突变”在用于本文时指特定蛋白质或核酸(基因，RNA)分别相对于野生型蛋白质或核酸的氨基酸或核酸序列的差异。突变的蛋白质或核酸可以由基因的一个等位基因(杂合的)或两个等位基因(纯合的)表达或者在其中找到，而且它可以是体细胞的或种系的。在本发明中，突变一般是体细胞的。突变包括序列重排，诸如插入、缺失、和点突变(包括单核苷酸/氨基酸多态性)。

蛋白质“表达”指基因中所编码的信息转换成信使RNA(mRNA)，然后转换成蛋白质。

在本文中，“表达”目的蛋白质(诸如HER受体或HER配体)的样品或细胞指其中测定出存在编码该蛋白质的mRNA，或蛋白质(包括其片段)的样品或细胞。

术语″白细胞介素8″或″IL8″或″IL-8″，用于本文时，除非另外指明，是指任何天然或变体(天然的或合成的)IL8多肽，其能够在允许此类过程发生的条件下激活IL8信号传导途径。术语″野生型IL8″一般是指包含天然存在IL8蛋白的氨基酸序列的多肽。术语″野生型IL8序列″一般是指在天然存在的IL8中发现的氨基酸序列。

术语“VEGF”或“VEGF-A”用于指165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子及相关的121个、189个和206个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子，如Leung等科学(Science)，246：1306(1989)；和Houck等分子内分泌学(Mol.Endocrin.)，5：1806(1991)，所记载的，及其天然存在等位基因形式和加工形式。VEGF-A是包括VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F和PlGF的基因家族的一部分。VEGF-A主要结合两种高亲和力受体酪氨酸激酶，即VEGFR-1(Flt-1)和VEGFR-2(Flk-1/KDR)，后者是VEGF-A血管内皮细胞有丝分裂信号的主要递质。另外，已经鉴定出neuropilin-1作为肝素-结合VEGF-A同种型受体，并可能在血管发育中发挥作用。术语“VEGF”或“VEGF-A”还指来自非人物种(诸如小鼠、大鼠或灵长类动物)的VEGF。有时，来自特定物种的VEGF用如下术语表示，诸如hVEGF表示人VEGF或mVEGF表示鼠VEGF。术语“VEGF”还用于指包含165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子的氨基酸第8-109位或第1-109位的多肽截短形式或片段。在本申请中可通过例如″VEGF(8-109)，″″VEGF(1-109)″或″VEGF₁₆₅″表示对任何此类形式的VEGF的引述。“截短的”天然VEGF的氨基酸位置如天然VEGF序列中所示的编号。例如，截短的天然VEGF中的第17位氨基酸(甲硫氨酸)也是天然VEGF中的第17位(甲硫氨酸)。截短的天然VEGF具有与天然VEGF相当的对KDR和Flt-1受体的结合亲和力。

术语″VEGF变体″用于本文时是指在天然VEGF序列中包括一个或多个氨基酸突变的VEGF多肽。任选地，该一个或多个氨基酸突变包括氨基酸置换(一个或多个)。为了对本文描述的VEGF变体速记命名的目的，请注意数字是指根据推定的天然VEGF的氨基酸序列(在Leung等，见上文和Houck等，见上文中提供)的氨基酸残基位置。

“VEGF生物学活性”包括与任何VEGF受体的结合或任何VEGF信号传导活性如调节正常和异常血管发生和血管生成二者(Ferrara和Davis-Smyth(1997)内分泌综述(Endocrine Rev.)18：4-25；Ferrara(1999)分子医学杂志(J.Mol.Med.)77：527-543)；促进胚胎血管发生和血管生成(Carmeliet等.(1996)自然(Nature)380：435-439；Ferrara等.(1996)自然(Nature)380：439-442)；和调节雌性生殖道的周期性血管增殖，以及骨生长和软骨形成(Ferrara等.(1998)自然医学(Nature Med.)4：336-340；Gerber等.(1999)自然医学(Nature Med.)5：623-628)。除了作为血管发生和血管生成中的生血管因子之外，VEGF还作为多效生长因子在其它生理过程中显示了多种生物学效应，如内皮细胞存活，血管渗透性和血管舒张，单核细胞趋化作用和钙流入(Ferrara和Davis-Smyth(1997)，见上文，和Cebe-Suarez等，细胞分子生命科学(Cell.Mol.Life.Sci).63：601-615(2006)。而且，最近的研究已经报道了VEGF对于数种非内皮细胞类型，如视网膜色素上皮细胞、胰管细胞和许旺细胞的促有丝分裂作用。Guerrin等.(1995)细胞生理学杂志(J.Cell Physiol.)164：385-394；Oberg-Welsh等(1997).分子细胞内分泌学(Mol.Cell.Endocrinol).126：125-132(1997)；Sondell等.神经科学杂志(J.Neurosci.)19：5731-5740(1999)。

“血管发生抑制剂”或“抗血管发生剂”指直接或是间接抑制血管发生、血管生成、或不想要的血管通透性的小分子量物质、多核苷酸、多肽、分离的蛋白质、重组蛋白、抗体、或其缀合物或融合蛋白。应当理解抗血管发生剂包括结合和阻断血管发生因子或其受体的血管发生活性的那些药剂。例如，抗血管发生剂是上文定义的血管发生剂的抗体或其它拮抗剂，例如VEGF-A、或VEGF-A受体(例如KDR受体或Flt-1受体)的抗体，抗-PDGFR抑制剂如GLEEVEC

(甲磺酸伊马替尼(Imatinib Mesylate))。抗血管发生剂还包括天然血管发生抑制剂，例如制管张素、内皮生长抑素等。参见例如Klagsbrun和D’Amore生理学年评(Annu.Rev.Physiol.)53：217-39(1991)；Streit和Detmar癌基因(Oncogene)22：3172-3179(2003)(例如列举恶性黑素瘤中抗血管发生疗法的表3)；Ferrara和Alitalo自然药物(Nature Medicine)5：1359-1364(1999)；Tonini等癌基因(Oncogene)22：6549-6556(2003)(例如列举已知抗血管发生因子的表2)；及Sato，Int.J.Clin.Oncol.8：200-206(2003)(例如列举临床试验中所使用的抗血管发生药剂的表1)。

“VEGF拮抗剂”指能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF活性(包括其与一种或多种VEGF受体的结合)的分子(肽基或非肽基)。在某些实施方案中，VEGF拮抗剂将VEGF的表达水平或生物学活性降低或抑制至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在一个实施方案中，受到VEGF拮抗剂抑制的VEGF是VEGF(8-109)、VEGF(1-109)或VEGF₁₆₅。可用于本发明方法的VEGF拮抗剂包括特异性结合VEGF的肽基或非肽基化合物，诸如抗VEGF抗体及其抗原结合片段、特异性结合VEGF的多肽或其片段；和特异性结合VEGF由此使其隔绝与一种或多种受体(例如可溶性VEGF受体蛋白质或其VEGF结合片段、或嵌合VEGF受体蛋白质)结合的受体分子及衍生物；至少与编码VEGF多肽的核酸分子的片段互补的反义核碱基(nucleobase)寡聚物；至少与编码VEGF多肽的核酸分子的片段互补的小RNA；靶向VEGF的核酶；针对VEGF的肽体(peptibody)；及VEGF适配体。

术语“抗VEGF抗体”指以足够亲和力和特异性结合VEGF的抗体。所选择的抗体通常具有针对VEGF的足够强的结合亲和力，例如所述抗体可以以介于100nM-1pM之间的K_d值结合hVEGF。抗体亲和力可以通过例如基于表面等离子共振的测定法(诸如BIAcore测定法，如PCT申请公开号WO2005/012359所记载的)；酶联免疫吸附测定法(ELISA)；和竞争测定法(例如RIA)来测定。在某些实施方案中，本发明的抗-VEGF抗体可在靶向或干扰其中涉及VEGF活性的疾病或病症中用作治疗剂。另外，该抗体可以进行其它生物学活性测定法，例如为了评估其作为治疗剂的效力。此类测定法是本领域已知的，而且依赖于所述抗体的靶抗原和预期用途。实例包括HUVEC抑制测定法(如在下文实施例中描述的)；肿瘤细胞生长抑制测定法(如例如WO89/06692所描述的)；抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和补体介导的细胞毒性(CDC)测定法(美国专利5,500,362)；及激动性活性或造血测定法(参见WO95/27062)。抗VEGF抗体通常不会结合其它VEGF同源物，诸如VEGF-B、或VEGF-C，也不结合其它生长因子，诸如PlGF、PDGF或bFGF。

在某些实施方案中，抗VEGF抗体包括与杂交瘤ATCC HB 10709所生成的单克隆抗VEGF抗体A4.6.1结合相同表位的单克隆抗体；重组人源化抗-VEGF单克隆抗体(根据Presta等癌症研究(CancerRes.)57：4593-4599(1997)产生)。在一个实施方案中，该抗-VEGF抗体是“贝伐珠单抗(Bevacizumab，BV)”、也称为“rhuMAb VEGF”或“AVASTIN

”。其包含突变的人IgG1构架区和来自鼠抗hVEGF单克隆抗体A.4.6.1(其阻断人VEGF结合其受体)的抗原结合互补性决定区。贝伐珠单抗大约93％的氨基酸序列(包括大部分构架区)衍生自人IgG1，而大约7％的序列衍生自鼠抗体A4.6.1。贝伐珠单抗具有约149,000道尔顿的分子量，而且是糖基化的。贝伐珠单抗已经被FDA批准用于联合其它化学治疗方案来治疗转移性结肠直肠癌(metastatic colorectal cancer(CRC))和非小细胞肺癌(NSCLC)。Hurwitz等，N.Engl.J.Med.(新英格兰医学杂志)350：2335-42(2004)；Sandler等，N.Engl.J.Med.(新英格兰医学杂志)355：2542-50(2006)。目前，贝伐珠单抗在许多正在进行的临床试验中进行研究以用于治疗多种癌症适应症。Kerbel，J.Clin.Oncol.(临床肿瘤学)19：45S-51S(2001)；De Vore等，Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.19：485a.(2000)；Hurwitz等，Clin.Colorectal Cancer 6：66-69(2006)；Johnson等，Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.20：315a(2001)；Kabbinavar等J.Clin.Oncol.(临床肿瘤学)21：60-65(2003)；Miller等，Breast Can.Res.Treat.94：Suppl 1：S6(2005)。

贝伐珠单抗和其它人源化抗VEGF抗体进一步记载于2005年2月26日授权的美国专利号6,884,879。另外的抗体包括G6或B20系列抗体(例如G6-31、B20-4.1)，如PCT公开号WO2005/012359，PCT公开号WO2005/044853，和美国专利申请60/991,302所记载的，这些专利申请的内容通过引用明确地并入本文。另外的抗体参见美国专利号7,060,269，6,582,959，6,703,020；6,054,297；WO98/45332；WO96/30046；WO94/10202；EP0666868B1；美国专利申请公开号2006009360，20050186208，20030206899，20030190317，20030203409和20050112126；及Popkov等，免疫学方法杂志(Journal of Immunological Methods)288：149-164(2004)。其它抗体包括结合人VEGF上的功能表位的那些，该表位包含残基F17，M18，D19，Y21，Y25，Q89，I91，K101，E103，和C104，或备选地包含残基F17，Y21，Q22，Y25，D63，I83和Q89。

根据本发明的″G6系列抗体″是这样的抗VEGF抗体，其衍生自根据PCT公开号WO2005/012359的图7，24-26，和34-35中任一幅图的G6抗体或G6-衍生抗体的序列，该PCT的全部公开通过引用明确并入本文。也参见PCT公开号WO2005/044853，其全部公开通过引用明确并入本文。在一个实施方案中，G6系列抗体结合人VEGF上包含残基F17，Y21，Q22，Y25，D63，I83和Q89的功能表位。

根据本发明的″B20系列抗体″是这样的抗VEGF抗体，其衍生自根据PCT公开号WO2005/012359的图27-29中任一幅图的B20抗体或B20-衍生抗体的序列，该PCT的全部公开通过引用明确并入本文。也参见PCT公开号WO2005/044853和美国专利申请60/991,302，这些专利申请的内容通过引用明确并入本文。在一个实施方案中，B20系列抗体结合人VEGF上包含残基F17，M18，D19，Y21，Y25，Q89，I91，K101，E103，和C104的功能表位。

根据本发明的“功能表位”指对于结合抗体起积极作用的抗原的氨基酸残基。抗原的起积极作用的任一残基的突变(例如，通过丙氨酸或同系物突变的野生型VEGF突变)会破坏与抗体的结合，从而抗体的相对亲合比率(突变体VEGF的IC50/野生型VEGF的IC50)会大于5(见WO2005/012359的实施例2)。在一个实施方案中，相对亲合比率通过结合噬菌体展示ELISA的方案来确定。简而言之，用在PBS中以2ug/ml浓度的待测抗体的Fab形式在4℃过夜包被96-孔的Maxisorp免疫平板(NUNC)，并用PBS，0.5％BSA，和0.05％Tween20(PBT)在室温阻断2h。首先在PBT中将展示hVEGF丙氨酸点突变体(残基8-109形式)或野生型hVEGF(8-109)的噬菌体的连续稀释物在Fab-包被的平板上于室温温育15min，然后用PBS，0.05％Tween20(PBST)洗涤所述平板。结合的噬菌体用在PBT中1∶5000稀释的抗-M13单克隆抗体辣根过氧化物酶(Amersham Pharmacia)缀合物来检测，用3，3’，5，5’-N四甲联苯胺(3，3’，5，5’-tetramethylbenzidine，TMB，Kirkegaard & Perry Labs，Gaithersburg，MD)底物显色大约5分钟，用1.0M H3PO4猝灭，并在450nm用分光光度法读数。IC50值的比率(IC50，ala/IC50，wt)代表结合亲和力的减少倍数(相对结合亲和力)。

“免疫缀合物”(可互换地称为“抗体-药物缀合物”或“ADC”)，是指偶联至一种或多种细胞毒性剂的抗体，所述细胞毒性剂诸如化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白毒素、细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射缀合物)。

在本文说明书和权利要求书全文中，免疫球蛋白重链中的残基的编号方式是如Kabat等，免疫目的蛋白序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版.Public Health Service，国家健康研究所(National Institutes of Health)，Bethesda，MD.(1991)中的EU索引的编号方式，该文通过引用明确并入本文。“如Kabat中的EU索引”指人IgG1 EU抗体的残基编号方式。

术语“抗体”以最广义使用，具体地涵盖单克隆抗体(包括全长的单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、单价抗体、多价抗体、及抗体片段，只要它们展现出期望的生物学活性。

“抗体片段”只包含完整抗体的一部分，其中所述部分优选保留该部分存在于完整抗体中时通常与之有关的至少一项、优选大多数或所有功能。在一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点，如此保留结合抗原的能力。在另一个实施方案中，抗体片段，例如包含Fc区的抗体片段，保留与Fc区存在于完整抗体中时通常与之有关的至少一项生物学功能，诸如FcRn结合、抗体半衰期调控、ADCC功能和补体结合。在一个实施方案中，抗体片段是体内半衰期与完整抗体基本上相似的单价抗体。例如，这样的抗体片段可包含一个抗原结合臂且其与能够赋予该片段以体内稳定性的Fc序列相连。在一个实施方案中，本发明的抗体是如WO2005/063816中描述的单臂抗体。在一个实施方案中，单臂抗体包含Fc突变构成“凸起”和“孔洞”，如WO2005/063816中所描述。例如，孔洞突变可以是Fc多肽中T366A，L368A和/或Y407V中的一个或多个，且空腔突变可以是T366W。

“阻断性”抗体或“拮抗性”抗体指抑制或降低其所结合的抗原的生物学活性的抗体。在一些实施方案中，阻断性抗体或拮抗性抗体完全抑制抗原的生物学活性。

除非另有说明，表述“多价抗体”贯穿本说明书用于指包含三个或更多抗原结合位点的抗体。多价抗体优选地被改造成具有三个或更多抗原结合位点，而且一般不是天然序列IgM或IgA抗体。

“Fv”片段是包含完整的抗原识别和结合位点的抗体片段。此区域由一个重链的和一个轻链的可变区紧密连接的二聚体组成，该连接(如在scFv中)可以是共价性质的。在此构型中，每个可变结构域的三个CDR相互作用来定义V_H-V_L二聚体表面上的抗原结合位点。共同地，六个CDR或其亚组(subset)赋予所述抗体的抗原结合特异性。然而，即使单一可变结构域(或仅包含三个对抗原特异的CDR的Fv的一半)也具有识别并结合抗原的能力，虽然通常与完整的结合位点相比其亲合力较低。

本文所用的术语“抗体可变区”指抗体分子的轻链和重链的部分，其包括互补决定区(CDRs：即CDR1、CDR2和CDR3)和构架区(FRs)的氨基酸序列。V_H指重链的可变结构域。V_L指轻链的可变结构域。根据本发明所用方法，CDRs和FRs指定的氨基酸位点可以根据Kabat来定义(免疫目的蛋白序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，国家健康研究所(National Institutes of Health)，Bethesda，Md.1987和1991)。抗体或抗原结合片段的氨基酸编号也是根据Kabat编号。

本文所用的术语“互补决定区”(CDRs：即CDR1，CDR2和CDR3)是指抗体可变结构域的氨基酸残基，其存在对于抗原结合是必需的。每个可变结构域通常具有鉴定为CDR1、CDR2和CDR3的三个CDR区。每个互补决定区可包含来自Kabat所定义的“互补决定区”的氨基酸残基(即大约为轻链可变结构域中的残基24-34(L1)，50-56(L2)和89-97(L3)以及重链可变结构域中的31-35(H1)，50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，免疫目的蛋白序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版.Public Health Service，国家健康研究所(National Institutes of Health)，Bethesda，MD.(1991)和/或来自“高变环(hypervariable loop)”的那些残基(即大致为轻链可变结构域中的残基26-32(L1)，50-52(L2)和91-96(L3)，及重链可变结构域中的26-32(H1)，53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。有些情况下，互补决定区能包括来自根据Kabat定义的CDR区和高变环的氨基酸。例如，抗体4D5的重链的CDRH1包括氨基酸26-35。

“构架区”(后文是FR)是CDR残基之外的那些可变结构域残基。每个可变结构域通常具有鉴定为FR1，FR2，FR3和FR4的四个FR。如果所述CDR根据Kabat来定义，轻链FR残基大致位于残基1-23(LCFR1)，35-49(LCFR2)，57-88(LCFR3)，和98-107(LCFR4)，并且重链FR残基大致位于重链残基的残基1-30(HCFR1)，36-49(HCFR2)，66-94(HCFR3)，和103-113(HCFR4)。如果所述CDR包含来自高变环的氨基酸残基，轻链FR残基大致位于轻链中的残基1-25(LCFR1)，33-49(LCFR2)，53-90(LCFR3)，和97-107(LCFR4)，且重链FR残基大致位于重链残基的残基1-25(HCFR1)，33-52(HCFR2)，56-95(HCFR3)，和102-113(HCFR4)。有些情况下，当CDR包含来自根据Kabat定义的CDR和高变环的那些氨基酸时，FR残基会相应调节。例如，当CDRH1包括氨基酸H26-H35时，重链FR1残基在位点1-25且FR2残基在位点36-49。

“Fab”片段包括轻链的可变结构域和恒定结构域以及重链的可变结构域和第一恒定结构域(CH1)。F(ab′)₂抗体片段包含一对Fab片段，其通常在它们的羧基末端附近通过它们之间的铰链半胱氨酸来共价连接。抗体片段的其它化学偶联法也是本领域已知的。

短语“抗原结合臂”当用于本文时是指本发明抗体片段的组成部分，其具有特异性结合感兴趣的目标分子的能力。一般和优选地，抗原结合臂是免疫球蛋白多肽序列(例如CDR和/或免疫球蛋白轻链和重链的可变结构域序列)的复合物。

短语“N末端截短的重链”当用于本文时是指这样的多肽，其包含部分但非全长免疫球蛋白重链，其中缺少的部分是正常位于该重链N末端区的那些。缺少的部分可包括但不限于可变结构域、CH1、和部分或全部铰链序列。一般地，如果不存在野生型铰链序列，N末端截短的重链中剩余的恒定结构域(一个或多个)将包含能够连接到另一个Fc序列(即本文描述的“第一”Fc序列)的组分。例如，所述组分可以是修饰的残基或添加的能够形成二硫键的半胱氨酸残基。

术语“Fc区”用于本文时一般是指包含免疫球蛋白重链C末端的多肽序列的二聚体复合物，其中C末端多肽序列是可以通过木瓜蛋白酶消化完整抗体获得的序列。Fc区可以包括天然或变异Fc序列。虽然免疫球蛋白重链Fc序列的边界可以变化，但是人IgG重链Fc序列通常定义为Fc序列自大约Cys226位置或大约Pro230位置的氨基酸残基至羧基末端的区段。免疫球蛋白的Fc序列一般包含两个恒定结构域，即CH2结构域和CH3结构域，任选包含CH4结构域。本文中“Fc多肽”的意思是构成Fc区的多肽之一。Fc多肽可从任何适当的免疫球蛋白(如IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4亚型，IgA，IgE，IgD或IgM)获得。在一些实施方案中，Fc多肽包含部分或全部野生型铰链序列(一般在其N末端)。在一些实施方案中，Fc多肽不包含功能的或野生型铰链序列。

术语“Fc受体”和“FcR”用于描述结合抗体Fc区的受体。例如，FcR可以是天然序列人FcR。一般而言，FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在于其胞质结构域。其它同种型的免疫球蛋白也可被某些FcR结合(参见，例如，Janeway等，免疫生物学：健康和疾病中的免疫系统(Immuno Biology：the immune system in health and disease)，(Elsevier Science Ltd.，NY)(第四版.，1999))。激活受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(在

免疫学年评(Annu.Rev.Immunol).15：203-234(1997)中进行了综述)。FcR的综述参见Ravetch和Kinet，免疫学年评(Annu.Rev.Immunol.)9：457-492(1991)；Capel等，免疫方法(Immunomethods)4：25-34(1994)；及de Haas等，实验室临床医学杂志(J.Lab.Clin.Med.126)：330-41(1995)。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR，包括那些未来将会鉴定的。该术语还包括新生儿受体，FcRn，它负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer等，免疫学杂志(J.Immunol.)117：587(1976)和Kim等，免疫学杂志(J.Immunol.)24：249(1994))。

“铰链区”、“铰链序列”及其变体用于本文时包括本领域中已知的含义，其在例如Janeway等，免疫生物学：健康和疾病中的免疫系统(Immuno Biology：the immune system in health and disease)，(Elsevier Science Ltd.，NY)(第四版.，1999)；Bloom等，蛋白科学(Protein Science)(1997)，6：407-415；Humphreys等，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)(1997)，209：193-202中说明。

“激动性抗体”用于本文时是模拟感兴趣的多肽(例如HGF)的至少一种功能活性的抗体。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的V_H和V_L结构域，其中这些结构域存在于单条多肽链中。一般而言，Fv多肽在V_H和V_L结构域之间还包含多肽接头，使得scFv形成期望的抗原结合结构。关于scFv的综述参见Pluckthun于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies(单克隆抗体药理学)，vol.113，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994)。

术语“双抗体(diabodies)”是指带有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含在相同多肽链(V_H和V_L)中连接到轻链可变结构域(V_L)的重链可变结构域(V_H)。通过使用太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对的接头，迫使结构域与另一个链上的互补的结构域配对，并产生两个抗原结合位点。双抗体在例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，90：6444-6448(1993)中有更充分的描述。

“线性抗体”的表述是指Zapata等，Protein Eng.(蛋白质工程)，8(10)：1057-1062(1995)描述的抗体。简言之，这些抗体包含一对串联的Fd片段(V_H-C_H1-V_H-C_H1)，其与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的或单特异性的。

修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，将依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括例如杂交瘤法(例如Kohler和Milstein，自然(Nature)256：495-97(1975)；Hongo等，杂交瘤(Hybridoma)，14(3)：253-260(1995)；Harlow等，抗体：实验室手册(Antibodies：A Laboratory Manual)，冷泉港实验室出版社，第2版.1988；Hammerling等，于：单克隆抗体和T-细胞杂交瘤(Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas)，563-681，Elsevier，N.Y.，1981)、重组DNA法(参见例如美国专利No.4,816,567)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson等，自然(Nature)352：624-628(1991)；Marks等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)222：581-597(1992)；Sidhu等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)338(2)：299-310(2004)；Lee等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，美国国家科学院学报(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)101(34)：12467-12472(2004)；及Lee等，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)284(1-2)：119-132(2004))、及用于在具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体的技术(参见例如WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO1991/10741；Jakobovits等，美国国家科学院学报(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)90：2551(1993)；Jakobovits等，自然(Nature)362：255-258(1993)；Bruggemann等，Year in Immuno.7：33(1993)；美国专利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016；Marks等，生物/技术(Bio/Technology)10：779-783(1992)；Lonberg等，自然(Nature)368：856-859(1994)；Morrison，自然(Nature)368：812-813(1994)；Fishwild等，自然生物技术(Nature Biotechnol.)14：845-851(1996)；Neuberger，自然生物技术(Nature Biotechnol.)14：826(1996)；及Lonberg和Huszar，国际免疫学综述(Intern.Rev.Immunol.)13：65-93(1995))。

单克隆抗体在本文中具体地包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(参见，例如美国专利No.4,816,567和Morrison等，美国国家科学院学报(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)USA 81：6851-6855(1984))。嵌合抗体包括PRIMATIZED

抗体，其中该抗体的抗原结合区衍生自例如用感兴趣的抗原免疫猕猴(macaque monkeys)产生的抗体。

非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指这样的人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的高变区残基用具有期望特异性、亲和性和能力的非人物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)的高变区残基替换。在有些情况中，将人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个、典型地两个可变结构域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，典型地是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones等，自然(Nature)321：522-525(1986)；Riechmann等，自然(Nature)332：323-329(1988)；及Presta，现代结构生物学观点(Curr.Op.Struct.Biol.)2：593-596(1992)。

“人抗体”指这样的抗体，其具有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术产生。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成。在一个实施方案中，人抗体选自噬菌体文库，其中该噬菌体文库表达人抗体(Vaughan等，自然生物技术(Nature Biotechnology)14：309-314(1996)；Sheets等，Proc.Natl.Acad.Sci.95：6157-6162(1998)；Hoogenboom和Winter，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)227：381(1991)；Marks等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)222：581(1991))。人抗体还可通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物来产生，所述转基因动物例如是其中内源免疫球蛋白基因已经部分或完全灭活的小鼠。在受到激发时，观察到人抗体产生，它在所有方面与在人中看到的极其相似，包括基因重排、装配和抗体所有组成成分。这种方法记载于例如美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016，及以下科学出版物中：Marks等，生物/技术(Bio/Technology)10：779-783(1992)；Lonberg等，自然(Nature)368：856-859(1994)；Morrison，自然(Nature)368：812-13(1994)；Fishwild等，自然生物技术(Nature Biotechnology)14：845-51(1996)；Neuberger，自然生物技术(Nature Biotechnology)14：826(1996)；Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。或者，人抗体可通过产生针对靶抗原的抗体的人B淋巴细胞的永生化来制备(此类B淋巴细胞可从个体回收，或者可在体外免疫)。参见例如Cole等，单克隆抗体和癌症治疗(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)，Alan R.Liss，p.77(1985)；Boerner等，免疫学杂志(J.Immunol.)147(1)：86-95(1991)；及美国专利号5,750,373。

“裸抗体(naked antibody)”是没有缀合异源分子，如细胞毒性部分或放射性标记的抗体。

“亲和力成熟的”抗体指在抗体的一个或多个CDR中具有一处或多处改变、导致该抗体对抗原的亲和性与没有这些改变的母体抗体相比有所提高的抗体。优选的亲和力成熟的抗体将具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和性。亲和力成熟的抗体可通过本领域已知方法来生成。Marks等，生物/技术(Bio/Technology)10：779-783(1992)记载了通过VH和VL结构域改组进行的亲和性成熟。以下文献记载了CDR和/或构架残基的随机诱变：Barbas等，美国国家科学院学报(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)91：3809-3813(1994)；Schier等，基因(Gene)169：147-155(1995)；Yelton等，免疫学杂志(J.Immunol.)155：1994-2004(1995)；Jackson等，免疫学杂志(J.Immunol.)154(7)：3310-9(1995)；及Hawkins等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)226：889-896(1992)。

具有指定抗体的“生物学特征”的抗体指具有该指定抗体区别于其它结合相同抗原的抗体的一项或多项生物学特征的抗体。

为了筛选这样的抗体，其结合由目的抗体结合的抗原的表位，可以实施常规交叉阻断测定法，诸如抗体，实验室手册(Antibodies，A Laboratory Manual)，冷泉港实验室，Ed Harlow和David Lane(1988)中所记载的。

抗体的“功能性抗原结合位点”指能够结合靶抗原的位点。抗原结合位点的抗原结合亲和性不必像衍生该抗原结合位点的母体抗体那样强，但是结合抗原的能力必须是使用已知用于评估抗体对抗原结合的多种方法之任一可测量到的。此外，本文中多价抗体的每个抗原结合位点的抗原结合亲和性不必定量相同。对于本文中的多聚体抗体，功能性抗原结合位点的数目可以使用超速离心分析来评估，如美国专利申请公开号20050186208的实施例2中所描述的。依照这种分析方法，将靶抗原与多聚体抗体以不同比例混合，并计算复合物的平均分子量，其中假设不同数目的功能性结合位点。将这些理论值与得到的实际实验值进行比较以评估功能性结合位点的数目。

“物种依赖性抗体”是这样的抗体，其对于来自第一哺乳动物物种的抗原比其对于来自第二哺乳动物物种的该抗原的同源物具有更强的结合亲和力。正常地，该物种依赖性抗体“特异性地”结合至人抗原(即具有不超过大约1x 10^-7M，优选不超过大约1x 10^-8M且最优选不超过大约1x 10^-9M的结合亲和力(Kd)值)，但对来自第二非人哺乳动物物种的该抗原的同源物具有的结合亲和力比其对该人抗原的结合亲和力弱至少大约50倍，或至少大约500倍，或至少大约1000倍。物种依赖性抗原可以是上文定义的多种抗体类型的任何一种。在一个实施方案中，该物种依赖性抗体是人源化的或人抗体。

用于本文时，“抗体突变体”或“抗体变体”指物种-依赖性抗体的氨基酸序列变体，其中所述物种-依赖性抗体的一或多个氨基酸残基已经被修饰。这些突变体必然与所述物种-依赖性抗体具有不足100％的序列同一性或相似性。在一个实施方案中，所述抗体突变体具有如下氨基酸序列，其与所述物种-依赖性抗体的重链或轻链可变结构域的氨基酸序列具有至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％的氨基酸序列同一性或相似性。对于此序列的同一性或相似性在本文定义为，在序列比对后，与物种-依赖性抗体残基相同(即相同残基)或类似(即基于共同侧链性质来自相同组的氨基酸残基，见下)的氨基酸残基在候选序列中的百分比，并且必要的话，引入缺口(gap)来获得最大百分比的序列同一性。N-末端，C-末端，或向可变结构域外的抗体序列内部的延伸(internal extension)，缺失，或插入都不应影响序列的同一性或相似性。

“嵌合VEGF受体蛋白”是这样的VEGF受体分子，其具有衍生自至少两种蛋白质(其中至少一种是VEGF受体蛋白)的氨基酸序列。在某些实施方案中，该嵌合VEGF受体蛋白能够结合并抑制VEGF的生物学活性。

为增加包含本发明氨基酸序列的抗体或多肽的半衰期，可将拯救受体(salvage receptor)结合表位连接到抗体(尤其是抗体片段)，如例如美国专利5,739,277所述。例如，在阅读框架内，可将编码拯救受体结合表位的核酸分子与编码本发明多肽序列的核酸连接，从而使改造的核酸分子所表达的融合蛋白包含拯救受体结合表位和本发明的多肽序列。本文所用的术语“拯救受体结合表位”指IgG分子(例如IgG₁，IgG₂，IgG₃，或IgG₄)的Fc区的表位，其负责增加IgG分子的体内血清半衰期(例如Ghetie等，Ann.Rev.Immunol.(免疫学年评)18：739-766(2000)，表1)。在其Fc区具有取代并且血清半衰期增加的抗体也见WO00/42072，WO 02/060919；Shields等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)276：6591-6604(2001)；Hinton，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)279：6213-6216(2004))的描述。另一个实施方案中，例如通过连接其它多肽序列，也可以增加血清半衰期。例如，本发明的方法中有用的抗体或其它多肽可与血清白蛋白或血清白蛋白的结合FcRn受体的部分或血清白蛋白结合肽连接，从而使所述血清白蛋白结合所述抗体或多肽，例如这样的多肽序列见WO01/45746公开。一个优选的实施方案中，所连接的血清白蛋白肽包含氨基酸序列DICLPRWGCLW(SEQ ID NO：29)。另一个实施方案中，Fab的半衰期是通过这些方法增加的。血清白蛋白结合肽序列也见Dennis等，生物化学杂(J.Biol.Chem.)277：35035-35043(2002)。

“分离的”多肽或“分离的”抗体是已经从其天然环境的组分鉴定和分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染组分是会干扰多肽或抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶，激素，及其它蛋白质或非蛋白质的溶质。优选的实施方案中，纯化多肽或抗体，(1)来产生用劳里方法(Lowry method)测定的超过95％(重量)的多肽或抗体，最优选超过99％(重量)的抗体，(2)到通过使用转杯式序列分析仪(spinning cup sequenator)足够获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)在还原或非还原条件使用考马斯蓝，或优选银染色，通过SDS-PAGE达到同质性(homogeneity)。分离的多肽或抗体包括重组细胞内的原位多肽或抗体，因为所述多肽的天然环境中的至少一个组分将不存在。但是，一般分离的多肽或抗体将通过至少一步纯化步骤来制备。

“治疗”是治疗性处理和预防或防范措施。需要治疗的那些人包括已经患有良性、癌前或非转移性肿瘤的那些人，以及那些其中将要预防癌症的发生或复发的人。

术语“治疗有效量”指治疗或预防哺乳动物中疾病或病症的治疗剂的量。对于癌症，治疗剂的治疗有效量可减少癌细胞数量；减小原发性肿瘤大小；抑制(即减慢到一定程度并优选停止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即减慢到一定程度并优选停止)肿瘤转移；在一定程度抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解一或多种与病症相关的症状。药物在达到可以预防现存癌细胞生长和/或杀死现存癌细胞的程度时，其可为细胞生长抑制性和/或细胞毒性的。对于癌症治疗，体内效力可以通过，例如评价存活期、疾病进展时间(TTP)、反应率(RR)、反应期、和/或生活质量来测量。

术语“癌症”和“癌的”是指或者描述哺乳动物中一般特征在于细胞生长不受调控生长的生理学状态。包含于这种定义的是良性和恶性癌症。“癌症早期”或“肿瘤早期”的意思是无侵袭性或转移性的癌症，或分期为0、I、或II期的癌症。癌症的例子包括，但不限于，癌瘤(carcinoma)、淋巴瘤(lymphoma)、母细胞瘤(blastoma)(包括髓母细胞瘤(medulloblastoma)和视网膜母细胞瘤(retinoblastoma))、肉瘤(sarcoma)(包括脂肉瘤(liposarcoma)和滑膜细胞肉瘤(synovial cell sarcoma))、神经内分泌肿瘤(neuroendocrine tumors)(包括类癌肿瘤(carcinoid tumors)、胃泌素瘤(gastrinoma)和胰岛细胞癌(islet cell cancer))、间皮瘤(mesothelioma)、神经鞘瘤(schwannoma)(包括听神经瘤(acoustic neuroma))、脑膜瘤(meningioma)、腺癌(adenocarcinoma)、黑素瘤(melanoma)、和白血病(leukemia)或淋巴样恶性肿瘤(lymphoid malignancies)。这类癌症的更具体的例子包括鳞状细胞癌(squamous cell cancer)(例如上皮鳞状细胞癌(epithelial squamous cell cancer))、肺癌(lung cancer)包括小细胞肺癌(SCLC，small-cell lung cancer)、非小细胞肺癌(NSCLC，non-small cell lung cancer)、肺腺癌(adenocarcinoma of the lung)和肺鳞癌(squamous carcinoma of the lung)、腹膜癌(cancer of the peritoneum)、肝细胞癌(hepatocellular cancer)、胃的或胃癌(gastric or stomach cancer)包括胃肠癌(gastrointestinal cancer)、胰腺癌(pancreatic cancer)、成胶质细胞瘤(glioblastoma)、宫颈癌(cervical cancer)、卵巢癌(ovarian cancer)、肝癌(liver cancer)、膀胱癌(bladder cancer)、肝细胞瘤(hepatoma)、乳腺癌(breast cancer)(包括转移性乳腺癌(metastatic breast cancer))、结肠癌(colon cancer)、直肠癌(rectal cancer)、结肠直肠癌(colorectal cancer)、子宫内膜或子宫癌(endometrial or uterine carcinoma)、唾液腺癌(salivary gland carcinoma)、肾癌或肾的癌(kidney or renal cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、外阴癌(vulval cancer)、甲状腺癌(thyroid cancer)、肝癌(hepatic carcinoma)、肛门癌(anal carcinoma)、阴茎癌(penile carcinoma)、睾丸癌(testicular cancer)、食道癌(esophagael cancer)、胆管肿瘤(tumors of the biliary tract)、及头和颈癌(head and neck cancer)。

在本文中“疾病进展时间”(time to disease progression)或“TTP”指自初始治疗(例如使用抗-cmet抗体，如MetMAb)时起，到癌症进展(progress)或恶化为止时间，一般以周或月计。这样的进展可以由熟练临床医师来评估。例如，在非小细胞肺癌的情况中，可以通过RECIST来评估。

“延长TTP”意味着使接受治疗的患者的病情进展的时间相对于未接受治行的患者(即相对于未用抗-cmet抗体如metMAb治疗的惑者)，和/或相对于用已获批准的抗肿瘤剂治疗的患者有延长。

“存活”(survival)指患者保持存活，包括总体存活(overall survival)和无进展存活(progress free survival)。

“总体存活”指保持一定时期诸如1年、5年等存活的患者，自诊断或治疗时起。

“无进展存活”指保持存活且癌症没有进展或恶化的患者。

“延长存活”意味着使接受治疗的患者的总体存活或无进展存活相对于未接受治疗的患者(即相对于未用抗-cmet抗体如MetMAb治疗的患者)，和/或相对于用已获批准的抗肿瘤剂治疗的患者有延长。

“客观反应”(objective response)指可测量的反应，包括完全反应(CR)或部分反应(PR)。

“完全反应”(complete response)或“CR”指癌症的所有体征响应治疗而消失。这并不总是意味着癌症已经治愈。

“部分反应”(partial response)或“PR”指一处或多处肿瘤或损害的大小或体内癌症的程度响应治疗而减小。

术语“癌前”是指一般在癌症之前或发展成癌症的状态或生长。“癌前”生长将具有特征为异常细胞周期调节、增殖或分化的细胞，其可通过细胞周期调节、细胞增殖或分化的标记来确定。

“发育异常”的意思是组织、器官或细胞任何异常生长或发育。优选地，该发育异常是高级别的(high grade)或癌前的。

“转移”的意思是癌症从其原发位点扩散到体内的其它位置。癌细胞可从原发肿瘤脱离，穿透淋巴和血管，通过血流循环，并在体内别处的正常组织中的远处病灶生长(转移)。转移可以是局部的或远处的。转移是连续的过程，依赖于肿瘤细胞从原发肿瘤脱离，在血流中运行，并在远处位点停留。在新的位点，该细胞建立血液供应并能生长成威胁生命的团块。

肿瘤细胞内刺激的和抑制的分子途径均调节这种行为，并且肿瘤细胞和远处宿主细胞的相互作用也是重要的。

“非转移性”的意思是癌症是良性的，或保持在原发位点并且未侵入淋巴或血管系统或原发位点以外的其它组织。一般而言，非转移性癌症是0、I、或II期癌症中的任何癌症，并且有时是III期癌症。

“原发肿瘤”或“原发癌症”的意思是最初的癌症，不是位于受试者的体内的另一个组织、器官或位置的转移病灶。

“良性肿瘤”或“良性癌症”的意思是位于最初的位点并且不具有浸润、侵袭或转移到远处位点的肿瘤。

“肿瘤负荷(tumor burden)”的意思是体内癌细胞的数量、肿瘤的大小或癌症的数量。肿瘤负荷也称为肿瘤负载(tumor load)。

“肿瘤数量”的意思是肿瘤的数量。

“受试者”的意思是哺乳动物，包括，但不限于：人或非人哺乳动物，如牛、马、犬、羊或猫。优选地，受试者是人。

术语“抗癌疗法”指用于治疗癌症的疗法。抗癌治疗剂的实例包括但不限于例如化疗剂、生长抑制剂、细胞毒性剂、放射疗法中所使用的药剂、抗生血管药剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂、和其它用于治疗癌症的药剂、抗CD20抗体、血小板衍生生长因子抑制剂(例如Gleevec^TM(甲磺酸伊马替尼(Imatinib Mesylate)))、COX-2抑制剂(例如塞来考昔(celecoxib))、干扰素、细胞因子、与下述靶标ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-β，BlyS，APRIL，BCMA或VEGF受体中的一种或多种结合的拮抗剂(例如中和抗体)、TRAIL/Apo2、及其它生物活性和有机化学剂等。本发明还包括它们的组合。

术语“细胞毒性剂”用于本文时指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素(例如I¹³¹，I¹²⁵，Y⁹⁰和Re¹⁸⁶)、化疗剂和毒素如细菌、真菌、植物或动物起源的酶促活性毒素，或其片段。

“化疗剂”是用于治疗癌症的化合物。化疗剂的实例包括用于治疗癌症的化合物。化疗剂的实例包括烷化剂(alkylating agents)，如塞替哌(thiotepa)和CYTOXAN

环磷酰胺(cyclosphosphamide)；烷基磺酸酯(alkyl sulfonates)如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；吖丙啶类(aziridines)如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙烯亚胺(ethylenimines)和methylamelamines，包括六甲蜜胺(altretamine)、曲他胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰(acetogenins)(特别是bullatacin和bullatacinone)；喜树碱(camptothecin)(包括合成的类似物托泊替康(topotecan))；苔藓抑素(bryostatin)；海绵(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；念珠藻环肽(cryptophycins)(特别是念珠藻环肽1和念珠藻环肽8)；多拉司他汀(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成的类似物、KW-2189和CB1-TM1)；艾肿瘤素(eleutherobin)；pancratistatin；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵素(spongistatin)；氮芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、乌拉莫司汀(uracil mustard)；亚硝基脲(nitrosureas)如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素如烯二炔类(enediyne)抗生素(例如，卡奇霉素(calicheamicin)、特别是卡奇霉素γ1I和卡奇霉素ωI1(参见，例如，Agnew，Chem Intl.Ed.Engl.，33：183-186(1994))；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；二膦酸盐(bisphosphonates)如氯膦酸盐(clodronate)；烯二炔蒽环类抗生素(esperamicin)；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)生色团和相关色素蛋白烯二炔类抗生素生色团(related chromoprotein enediyne antibiotic chromophores))、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、蒽霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycins)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、去甲柔红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸(6-diazo-5-oxo-L-norleucine)、ADRIAMYCIN

多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代-多柔比星(morpholino-doxorubicin)、氰基吗啉代-多柔比星(cyanomorpholino-doxorubicin)、2-吡咯啉-多柔比星(2-pyrrolino-doxorubicin)和去氧多柔比星(deoxydoxorubicin))、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、马塞罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycins)如丝裂霉素C、麦考酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物如甲氨喋呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)(5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸(denopterin)、甲氨喋呤(methotrexate)、喋罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类诸如卡普睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸盐(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺药(anti-adrenals)如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补偿物如frolinic acid；醋葡醛内酯(aceglatone)；羟醛磷酰胺配糖(aldophosphamide glycoside)；5-氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；epothilone；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓(gallium nitrate)；羟基脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美坦生类化合物(maytansinoids)如美坦生(maytansine)和美登木素(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；尼曲吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；异丙嗪(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多糖复合物(JHS Natural Products(JHS天然产品)，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；利索新(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细格孢氮杂酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2’，2”-三氯三乙胺(2，2’，2”-trichlorotriethylamine)；单端孢霉烯(trichothecenes)(特别是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素A(roridin A)和anguidine)；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；塞替哌(thiotepa)；紫杉烷类(taxoids)，例如，TAXOL

紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，新泽西)ABRAXANE^TM无克列莫佛(Cremophor-free)、紫杉醇的白蛋白改造的纳米颗粒制剂(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，伊利诺伊州)；和TAXOTERE

多西他赛(doxetaxel)(

Rorer、Antony、法国)；chloranbucil；GEMZAR吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)；巯嘌呤(mercaptopurine)；甲氨喋呤；铂类似物如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；NAVELBINE长春瑞滨(vinorelbine)；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；柔红霉素(daunomycin)；氨基喋呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(Camptosar，CPT-11)(包括伊立替康与5-FU和亚叶酸(leucovorin)的治疗方案)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(difluoromethylornithine)(DMFO)；维甲类(retinoids)如视黄酸(retinoic acid)；卡培他滨(capecitabine)；考布他汀(combretastatin)；亚叶酸(leucovorin)(LV)；奥沙利铂(oxaliplatin)，包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX)；PKC-α的抑制剂、Raf的抑制剂、H-Ras的抑制剂、EGFR的抑制剂(例如厄洛替尼(erlotinib)(Tarceva^TM))和VEGF-A的抑制剂，这些抑制剂降低细胞增殖，和任何上述物质的药用盐、酸或衍生物。

该定义还包括作用为调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，诸如：抗雌激素类和选择性雌激素受体调控物(SERM)，包括，例如，他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和FARESTON托瑞米芬(toremifene)；抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、MEGASE

醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、AROMASIN

依西美坦(exemestane)、福美坦(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR伏氯唑(vorozole)、FEMARA

来曲唑(letrozole)和ARIMIDEX

阿那曲唑(anastrozole)；和抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)、和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是那些抑制牵涉异常(abherant)细胞增殖的信号传导途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf和H-Ras；核酶诸如VEGF表达抑制剂(例如，ANGIOZYME核酶)和HER2表达抑制剂；疫苗，诸如基因疗法疫苗，例如ALLOVECTIN

疫苗、LEUVECTIN

疫苗和VAXID疫苗；PROLEUKIN

rIL-2；LURTOTECAN

拓扑异构酶1抑制剂；ABARELIXrmRH；长春瑞滨(vinorelbine)和埃斯波霉素类(Esperamicins)(参见美国专利号4,675,187)，及任何上述物质的药用盐、酸或衍生物。

术语“药物前体”用在本申请中是指药物活性物质的前体或衍生物形式，其较亲本药物对肿瘤细胞的细胞毒性更小并且能够被酶促活化或转化为更具活性的亲本形式。参见，例如，Wilman，″Prodrugs in Cancer Chemotherapy(癌症化疗中的药物前体)″Biochemical Society Transactions(生物化学学会学报)，14，第375-382页，615th Meeting Belfast(1986)和Stella等，″Prodrugs：A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery，(药物前体：靶向药物递送的化学方法)″Directed Drug Delivery(定向药物递送)，Borchardt等，(编辑)，第247-267页，Humana Press(1985)。本发明的药物前体包括，但不限于，含磷酸盐的药物前体，含硫代磷酸盐的药物前体，含硫酸盐的药物前体，含肽的药物前体，D-氨基酸修饰的药物前体，糖基化药物前体，含β-内酰胺的药物前体，任选取代的含苯氧基乙酰胺的药物前体或任选取代的含苯基乙酰胺的药物前体，可以被转化为更具活性的无细胞毒性的药物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟胞嘧啶药物前体。可以被衍生成用于本发明的药物前体形式的细胞毒性药物的实例包括，但不限于，上述那些化疗剂。

通过“放射性疗法”意指定向γ射线或β射线对细胞诱导足以限制其起正常功能的能力的破坏或使细胞完全破坏的用途。应该理解本领域中已知许多用于确定治疗的剂量和持续时间的方式。典型的治疗作为一次施用和典型剂量范围10-200单位(Grays)/日来提供。

“降低或抑制”是指导致20％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，或更高总体下降的能力。降低或抑制可以用来指正在治疗的病症的症状，转移灶的存在或大小，或原发肿瘤的大小。

治疗剂

本发明的特征在于抗-c-met拮抗性抗体(如MetMAb)在治疗受试者中病理的病症(如肿瘤)的疗法中的用途。本发明的特征还在于抗-c-met抗体和EGFR拮抗剂在治疗受试者中病理的病症(如肿瘤)的组合疗法中的用途。

C-met拮抗性抗体

本发明的方法中有用的抗-c-met抗体包括任何以足够亲和力和特异性结合c-met并能够降低或抑制一种或多种c-met活性的抗体。抗-c-met抗体可用于调节HGF/c-met-相关效应中的一个或多个方面，包括但不限于c-met激活、下游分子信号传导(例如有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)磷酸化)、细胞增殖、细胞迁移、细胞存活、细胞形态发生和血管发生。这些效应可通过任何生物学相关机制调节，包括破坏配体(例如HGF)与c-met的结合，c-met磷酸化和/或c-met多聚化。

所选择的抗体通常具有针对c-met的足够强的结合亲和力，例如所述抗体可以以介于100nM-1pM之间的K_d值结合人c-met。抗体亲和力可以通过例如基于表面等离子共振的测定法(诸如BIAcore测定法，如PCT申请公开号WO2005/012359所记载的)；酶联免疫吸附测定法(ELISA)；和竞争测定法(例如RIA)来测定。优选地，本发明的抗-c-met抗体可在靶向和介入其中涉及c-met/HGF活性的疾病或病症中用作治疗剂。另外，所述抗体可以进行其它生物学活性测定法，例如为了评估其作为治疗剂的效力。此类测定法是本领域已知的，而且依赖于所述抗体的靶抗原和预期用途。

本申请第一次公开了在人中施用MetMAb(其是包含Fc区的单臂抗体)。MetMAb的序列显示于图1和2中。MetMAb(也称为OA5D5v2)也在例如WO2006/015371；Jin等，Cancer Res(癌症研究)(2008)68：4360中描述。

因此，本发明提供单臂形式的本文描述的或本领域已知的抗-c-met抗体的用途。因此，一方面，抗-c-met抗体是包含Fc区的单臂抗体(即重链可变结构域和轻链可变结构域形成单抗原结合臂)，其中该Fc区包含第一和第二Fc多肽，其中第一和第二Fc多肽存在于复合物中并形成Fc区，与包含所述抗原结合臂的Fab分子相比较而言，该Fc区增加了所述抗体片段的稳定性。对于治疗需要拮抗功能且抗体的双价产生不利激动效应的病理的病症而言，单臂抗体(即抗体包含单抗原结合臂)的单价特性在该抗体结合目标分子时产生和/或保证拮抗功能。另外，包含Fc区的单臂抗体的特征在于，与具有相似/基本相同抗原结合特性的Fab形式相比具有优异的药物代谢动力学属性(如体内增强的半衰期和/或降低的清除率)，因此克服了使用常规单价Fab抗体中的主要缺点。单臂抗体在例如WO2005/063816；Martens等，Clin Cancer Res(临床癌症研究)(2006)，12：6144中公开。

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWLHWVRQAPGKGLEWVGMIDPSNSDTRFNPNFKDRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCATYRSYVTPLDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：10)，CH1序列，和第一Fc多肽；(b)第二多肽，其包含具有下述序列的轻链可变结构域：

抗-c-met抗体(其可以单臂抗体提供)是本领域已知的(参见，例如Martens，T，等(2006)Clin Cancer Res(临床癌症研究)12(20 Pt 1)：6144；US6,468,529；WO2006/015371；WO2007/063816。在一个实施方案中，该抗-c-met抗体包含重链可变结构域，该重链可变结构域包含图1中所描述的CDR1-HC，CDR2-HC和CDR3-HC序列(SEQ ID NO：4，5，和/或9)中的一条或多条。在一些实施方案中，该抗体包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含图1中所描述的CDR1-LC，CDR2-LC和CDR3-LC序列(SEQIDNO：1，2，和/或3)中的一条或多条。在一些实施方案中，该重链可变结构域包含图1中所描述的FR1-HC，FR2-HC，FR3-HC和FR4-HC序列(SEQ ID NO：21-24)。在一些实施方案中，该轻链可变结构域包含图1中所描述的FR1-LC，FR2-LC，FR3-LC和FR4-LC序列(SEQ ID NO：16-19)。

在其它实施方案中，该抗体包含在美国典型培养物中心(American Type Culture Collection)保藏号为ATCC HB-11894(杂交瘤1A3.3.13)或HB-11895(杂交瘤5D5.11.6)中保藏的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体的一条或多条CDR序列。

一方面，该抗-c-met抗体包含：

(a)选自由下述各项组成的组的至少一个、两个、三个、四个或五个高变区(CDR)序列：

(i)CDR-L1，其包含序列A1-A17，其中A1-A17是

KSSQSLLYTSSQKNYLA(SEQ ID NO：1)

(ii)CDR-L2，其包含序列B1-B7，其中B1-B7是

WASTRES(SEQ ID NO：2)

(iii)CDR-L3，其包含序列C1-C9，其中C1-C9是QQYYAYPWT(SEQ ID NO：3)

(iv)CDR-H1，其包含序列D1-D10，其中D1-D10是GYTFTSYWLH(SEQ ID NO：4)

(v)CDR-H2，其包含序列E1-E18，其中E1-E18是

GMIDPSNSDTRPNPNFKD(SEQ ID NO：5)和

(vi)CDR-H3，其包含序列F1-F11，其中F1-F11是XYGSYVSPLDY(SEQ ID NO：6)并且X不是R；

和(b)至少一个变体CDR，其中该变体CDR序列包含SEQ ID NOs：1，2，3，4，5或6中所描述的序列的至少一个残基的修饰。在一个实施方案中，本发明的抗体的CDR-L1包含序列SEQ ID NO：1。在一个实施方案中，本发明的抗体的CDR-L2包含序列SEQ ID NO：2。在一个实施方案中，本发明的抗体的CDR-L3包含序列SEQ ID NO：3。在一个实施方案中，本发明的抗体的CDR-H1包含序列SEQ ID NO：4。在一个实施方案中，本发明的抗体的CDR-H2包含序列SEQ ID NO：5。在一个实施方案中，本发明的抗体的CDR-H3包含序列SEQ ID NO：6。在一个实施方案中，CDR-H3包含TYGSYVSPLDY(SEQ ID NO：7)。在一个实施方案中，CDR-H3包含SYGSYVSPLDY(SEQ ID NO：8)。在一个实施方案中，包含这些序列(如本文所描述的进行组合)的本发明的抗体是人源化的或人的。

一方面，本发明提供包含一个、两个、三个、四个、五个或六个CDRs的抗体，其中每个CDR包含选自由SEQ ID NOs：1，2，3，4，5，6，7，和8组成的组的序列、由这样的序列组成或基本由这样的序列组成，并且其中SEQ ID NO：1对应于CDR-L1，SEQ ID NO：2对应于CDR-L2，SEQ ID NO：3对应于CDR-L3，SEQ ID NO：4对应于CDR-H1，SEQ ID NO：5对应于CDR-H2，并且SEQ ID NOs：6，7或8对应于CDR-H3。在一个实施方案中，本发明的抗体包含CDR-L1，CDR-L2，CDR-L3，CDR-H1，CDR-H2，和CDR-H3，其中每个，按照顺序，包含SEQ ID NO：1，2，3，4，5和7。在一个实施方案中，本发明的抗体包含CDR-L1，CDR-L2，CDR-L3，CDR-H1，CDR-H2，和CDR-H3，其中每个，按照顺序，包含SEQ ID NO：1，2，3，4，5和8。

本发明的抗体的变体CDRs可具有CDR内的一个或多个残基的修饰。在一个实施方案中，CDR-L2变体包含下述位点的任何组合的1-5(1，2，3，4或5)个置换：B1(M或L)，B2(P，T，G或S)，B3(N，G，R或T)，B4(I，N或F)，B5(P，I，L或G)，B6(A，D，T或V)和B7(R，I，M或G)。在一个实施方案中，CDR-H1变体包含下述位点的任何组合的1-5(1，2，3，4或5)个置换：D3(N，P，L，S，A，I)，D5(I，S或Y)，D6(G，D，T，K，R)，D7(F，H，R，S，T或V)和D9(M或V)。在一个实施方案中，CDR-H2变体包含下述位点的任何组合的1-4(1，2，3或4)个置换：E7(Y)，E9(I)，E10(I)，E14(T或Q)，E15(D，K，S，T或V)，E16(L)，E17(E，H，N或D)和E18(Y，E或H)。在一个实施方案中，CDR-H3变体包含下述位点的任何组合的1-5(1，2，3，4或5)个置换：F1(T，S)，F3(R，S，H，T，A，K)，F4(G)，F6(R，F，M，T，E，K，A，L，W)，F7(L，I，T，R，K，V)，F8(S，A)，F10(Y，N)和F11(Q，S，H，F)。每个位点后括号内的字母(一个或多个)表示示例性置换(即替换)氨基酸；对于本领域技术人员显然的是，在本文描述的环境中其它氨基酸作为置换氨基酸的适宜性可使用本领域已知的和/或本文描述的技术常规地评估。在一个实施方案中，CDR-L1包含序列SEQ ID NO：1。在一个实施方案中，F1在变体CDR-H3中是T。在一个实施方案中，F1在变体CDR-H3中是S。在一个实施方案中，F3在变体CDR-H3中是R。在一个实施方案中，F3在变体CDR-H3中是S。在一个实施方案中，F7在变体CDR-H3中是T。在一个实施方案中，本发明的抗体包含变体CDR-H3，其中F1是T或S，F3是R或S，并且F7是T。

在一个实施方案中，本发明的抗体包含变体CDR-H3，其中F1是T，F3是R并且F7是T。在一个实施方案中，本发明的抗体包含变体CDR-H3，其中F1是S。在一个实施方案中，本发明的抗体包含变体CDR-H3，其中F1是T，并且F3是R。在一个实施方案中，本发明的抗体包含变体CDR-H3，其中F1是S，F3是R并且F7是T。在一个实施方案中，本发明的抗体包含变体CDR-H3，其中F1是T，F3是S，F7是T，并且F8是S。在一个实施方案中，本发明的抗体包含变体CDR-H3，其中F1是T，F3是S，F7是T，并且F8是A。在一些实施方案中，所述变体CDR-H3抗体还包含CDR-L1，CDR-L2，CDR-L3，CDR-H1和CDR-H2，其中每个按照顺序包含SEQ ID NOs：1，2，3，4和5中描述的序列。在一些实施方案中，这些抗体还包含人亚型III重链构架一致序列。在这些抗体的一个实施方案中，该构架一致序列在位点71，73和/或78包含置换。在这些抗体的一些实施方案中，位点71是A，位点73是T和/或位点78是A。在这些抗体的一个实施方案中，这些抗体还包含人κI轻链构架一致序列。

在一个实施方案中，本发明的抗体包含变体CDR-L2，其中B6是V。在一些实施方案中，所述变体CDR-L2抗体还包含CDR-L1，CDR-L3，CDR-H1，CDR-H2和CDR-H3，其中每个按照顺序包含SEQ ID NOs：1，3，4，5和6中描述的序列。在一些实施方案中，所述变体CDR-L2抗体还包含CDR-L1，CDR-L3，CDR-H1，CDR-H2和CDR-H3，其中每个按照顺序包含SEQ ID NOs：1，3，4，5和7中描述的序列。在一些实施方案中，所述变体CDR-L2抗体还包含CDR-L1，CDR-L3，CDR-H1，CDR-H2和CDR-H3，其中每个按照顺序包含SEQ ID NOs：1，3，4，5和8中描述的序列。在一些实施方案中，这些抗体还包含人亚型III重链构架一致序列。在这些抗体的一个实施方案中，该构架一致序列在位点71，73和/或78包含置换。在这些抗体的一些实施方案中，位点71是A，位点73是T和/或位点78是A。在这些抗体的一个实施方案中，这些抗体还包含人κI轻链构架一致序列。

在一个实施方案中，本发明的抗体包含变体CDR-H2，其中E14是T，E15是K和E17是E。在一个实施方案中，本发明的抗体包含变体CDR-H2，其中E17是E。在一些实施方案中，所述变体CDR-H3抗体还包含CDR-L1，CDR-L2，CDR-L3，CDR-H1，和CDR-H3，其中每个按照顺序包含SEQ ID NOs：1，2，3，4和6中描述的序列。在一些实施方案中，所述变体CDR-H2抗体还包含CDR-L1，CDR-L2，CDR-L3，CDR-H1，和CDR-H3，其中每个按照顺序包含SEQ ID NOs：1，2，3，4，和7中描述的序列。在一些实施方案中，所述变体CDR-H2抗体还包含CDR-L1，CDR-L2，CDR-L3，CDR-H1，和CDR-H3，其中每个按照顺序包含SEQ ID NOs：1，2，3，4，和8中描述的序列。在一些实施方案中，这些抗体还包含人亚型III重链构架一致序列。在这些抗体的一个实施方案中，该构架一致序列在位点71，73和/或78包含置换。在这些抗体的一些实施方案中，位点71是A，位点73是T和/或位点78是A。在这些抗体的一个实施方案中，这些抗体还包含人κI轻链构架一致序列.

在其它实施方案中，本发明的c-met抗体特异性结合c-met Sema结构域或其变体的至少一部分。在一个实例中，本发明的拮抗性抗体特异性结合选自由下述各项组成的组的至少一条序列：LDAQT(SEQ ID NO：25)(例如c-met的残基269-273)，LTEKRKKRS(SEQ ID NO：26)(例如c-met的残基300-308)，KPDSAEPM(SEQ ID NO：27)(例如c-met的残基350-357)和NVRCLQHF(SEQ ID NO：28)(例如c-met的残基381-388)。在一个实施方案中，本发明的拮抗性抗体特异性结合构象表位(conformational epitope)，该构象表位由选自由下述各项组成的组的至少一条序列的部分或全部形成：LDAQT(SEQ ID NO：25)(例如c-met的残基269-273)，LTEKRKKRS(SEQ ID NO：26)(例如c-met的残基300-308)，KPDSAEPM(SEQ ID NO：27)(例如c-met的残基350-357)和NVRCLQHF(SEQ ID NO：28)(例如c-met的残基381-388)。在一个实施方案中，本发明的拮抗性抗体特异性结合与序列LDAQT(SEQ ID NO：25)，LTEKRKKRS(SEQ ID NO：26)，KPDSAEPM(SEQ ID NO：27)和/或NVRCLQHF(SEQ ID NO：28)具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，98％的序列同一性或相似性的氨基酸序列。

一方面，该抗-c-met抗体包含促进抗体片段内Fc序列的异二聚化而使同二聚化最小的至少一个特性。此类特性(一个或多个)改善免疫球蛋白群体的产量和/或纯度和/或同质性。在一个实施方案中，该抗体包含构成“凸起”和“孔洞”的Fc突变，如WO2005/063816；Ridgeway，J等，Prot Eng(1996)9：617-21；Zhu Z等Prot Sci(1997)6：781-8中所描述。例如孔洞突变可以是Fc多肽中T366A，L368A和/或Y407V的一个或多个，并且空腔突变可以是T366W。

EGFR拮抗剂

EGFR拮抗剂包括这样的抗体，如已知为尼妥珠单抗(nimotuzumab)(YM Biosciences)的人源化单克隆抗体，全长人ABX-EGF(帕尼单抗(panitumumab)，Abgenix Inc.)以及已知为E1.1，E2.4，E2.5，E6.2，E6.4，E2.11，E6.3和E7.6.3并在US 6,235,883中描述的全长人抗体；MDX-447(Medarex Inc)。培妥珠单抗(Pertuzumab)(2C4)是人源化抗体，其直接结合HER2但干扰HER2-EGFR二聚化由此抑制EGFR信号传导。结合EGFR的抗体的其它实例包括MAb 579(ATCC CRL HB 8506)，MAb 455(ATCC CRL HB8507)，MAb 225(ATCC CRL 8508)，MAb 528(ATCC CRL 8509)(参见，美国专利No.4,943,533，Mendelsohn等)及其变体，如嵌合化225(C225或西妥昔单抗(Cetuximab)；ERBUTIX)和改型人225(H225)(参见，WO 96/40210，Imclone Systems Inc.)；IMC-11F8，一种全长人的EGFR靶向抗体(Imclone)；结合II型突变体EGFR的抗体(美国专利No.5,212,290)；结合EGFR的人源化和嵌合抗体，如美国专利No.5,891,996中所描述的；及结合EGFR的人抗体，如ABX-EGF(参见WO98/50433，Abgenix)；EMD55900(Stragliotto等Eur.J.Cancer(欧洲癌症杂志)32A：636-640(1996))；EMD7200(马妥珠单抗(matuzumab))，一种针对EGFR的人源化EGFR抗体，其与EGF和TGF-α二者竞争EGFR结合；及mAb 806或人源化mAb 806(Johns等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)279(29)：30375-30384(2004))。抗-EGFR抗体可缀合细胞毒性剂，从而产生免疫缀合物(参见，例如EP659,439A2，Merck Patent GmbH)。

本发明的方法中有用的抗-EGFR抗体包括以足够亲和力和特异性结合EGFR并能够降低或抑制EGFR活性的任何抗体。所选择的抗体通常具有针对EGFR的足够强的结合亲和力，例如所述抗体可以以介于100nM-1pM之间的K_d值结合人c-met。抗体亲和力可以通过例如基于表面等离子共振的测定法(诸如BIAcore测定法，如PCT申请公开号WO2005/012359所记载的)；酶联免疫吸附测定法(ELISA)；和竞争测定法(例如RIA)来测定。优选地，本发明的抗-c-met抗体可在靶向和介入其中涉及EGFR/EGFR配体活性的疾病或病症中用作治疗剂。另外，所述抗体可以进行其它生物学活性测定法，例如为了评估其作为治疗剂的效力。此类测定法是本领域已知的，而且依赖于所述抗体的靶抗原和预期用途。

双特异性抗体指具有对至少两种不同表位的结合特异性的抗体，示例性的双特异性抗体可结合EGFR并结合c-met。在另一个实例中，示例性双特异性抗体可结合相同蛋白(例如c-met蛋白)的两种不同表位。或者，可将c-met或EGFR的臂与结合白细胞上触发分子诸如T细胞受体分子(例如CD2或CD3)或IgG的Fc受体IgG(FcγR)，诸如FcγRI(CD64)，FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的臂组合在一起，使得细胞防御机制聚焦于表达c-met或EGFR的细胞。双特异性抗体还可用于将细胞毒剂定位于表达EGFR或c-met的细胞。这些抗体拥有EGFR或c-met结合臂和结合细胞毒性剂(例如皂草素(saporin)、抗干扰素-α(anti-interferon-α)，长春花生物碱(vinca alkaloid)、蓖麻毒蛋白A链(ricin A chain)、甲氨喋呤(methotrexate)或放射性同位素半抗原(radioactive isotope hapten))的臂。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab′)₂双特异性抗体)。

EGFR拮抗剂还包括小分子，诸如US5616582，US5457105，US5475001，US5654307，US5679683，US6084095，US6265410，US6455534，US6521620，US6596726，US6713484，US5770599，US6140332，US5866572，US6399602，US6344459，US6602863，US6391874，WO9814451，WO9850038，WO9909016，WO9924037，WO9935146，WO0132651，US6344455，US5760041，US6002008，US5747498中所述的化合物。具体的小分子EGFR拮抗剂包括OSI-774(CP-358774，厄洛替尼(erlotinib)，OSI制药公司(OSI Pharmaceuticals))；PD 183805(CI 1033，2-丙烯酰胺，N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[3-(4-吗啉基)丙氧基]-6-喹唑啉基]-，二盐酸盐，辉瑞公司(Pfizer Inc.))；易瑞沙(Iressa)

(ZD1839，吉非替尼(gefitinib)，阿斯利康(AstraZeneca))；ZM 105180((6-氨基-4-(3-甲基苯基-氨基)-喹唑啉，Zeneca)；BIBX-1382(N8-(3-氯-4-氟-苯基)-N2-(1-甲基-哌啶-4-基)-嘧啶并[5，4-d]嘧啶-2，8-二胺，Boehringer Ingelheim)；PKI-166((R)-4-[4-[(1-苯基乙基)氨基]-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-6-基]-苯酚)；(R)-6-(4-羟基苯基)-4-[(1-苯基乙基)氨基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶)；CL-387785(N-[4-[(3-溴苯基)氨基]-6-喹唑啉基]-2-丁炔酰胺(butynamide))；EKB-569(N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-3-氰基-7-乙氧基-6-喹啉基]-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺)；拉帕替尼(1apatinib)(Tykerb，葛兰素史克(GlaxoSmithKline))；ZD6474(Zactima，阿斯利康(AstraZeneca))；CUDC-101(Curis)；卡奈替尼(canertinib)(CI-1033)；AEE788(6-[4-[(4-乙基-1-哌嗪基)甲基]苯基]N-[(1R)-1-苯基乙基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-胺，WO2003013541，Novartis)和PKI1664-[4-[[(1R)-1-苯基乙基]氨基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-6-基]-苯酚，WO9702266 Novartis)。

在具体的实施方案中，根据通过引用合并入本文的US 5,757,498，EGFR拮抗剂具有通式I：

其中：

m为1、2或3；

每个R¹独立地选自由下列各项组成的组：氢、卤素、羟基、羟基氨基、羧基、硝基、胍基、脲基、氰基、三氟甲基和-(C₁-C₄亚烷基)-W-(苯基)，其中W为单键、O、S或NH；

或每个R¹独立地选自R⁹和被氰基取代的C₁-C₄烷基，其中R⁹选自由下列各项组成的组：R⁵、-OR⁶、-NR⁶R⁶、-C(O)R⁷、-NHOR⁵、-OC(O)R⁶、氰基、A和-YR⁵；R⁵为C₁-C₄烷基；R⁶独立地为氢或R⁵；R⁷为R⁵、-OR⁶或-NR⁶R⁶；A选自哌啶子基、吗啉代、吡咯烷基、4-R⁶-哌嗪-1-基、咪唑-1-基、4-吡啶酮-1-基、-(C₁-C₄亚烷基)(CO2H)、苯氧基、苯基、苯基硫烷基、C₂-C₄烯基、和-(C₁-C₄亚烷基)C(O)NR⁶R⁶；和Y为S、SO、或SO₂；其中R⁵、-OR⁶和-NR⁶R⁶中的烷基结构部分任选地被一个至三个卤素取代基取代，且R⁵、-OR⁶和-NR⁶R⁶中的烷基结构部分任选地被1个或2个R⁹基团取代，且其中所述任选的取代基的烷基结构部分任选地被卤素或R⁹取代，条件是两个杂原子不与同一个碳原子连接；

或每个R¹独立地选自-NHSO₂R⁵、苯二甲酰亚氨基-(C₁-C₄)-烷基磺酰基氨基，苯甲酰氨基、苯磺酰基氨基、3-苯基脲基、2-氧代吡咯烷-1-基、2，5-二氧代吡咯烷-1-基、和R¹⁰-(C₂-C₄)-烷酰基氨基，其中R¹⁰选自卤素、-OR⁶、C₂-C₄烷酰基氧基、-C(O)R⁷和-NR⁶R⁶；且其中所述-NHSO₂R⁵、苯二甲酰亚氨基-(C₁-C₄-烷基磺酰基氨基、苯甲酰氨基、苯磺酰基氨基、3-苯基脲基、2-氧代吡咯烷-1-基、2，5-二氧代吡咯烷-1-基，和R¹⁰-(C₂-C₄)-烷酰基氨基R¹基团任选地被1个或2个取代基取代，所述取代基独立地选自卤素、C₁-C₄烷基、氰基、甲磺酰基和C₁-C₄烷氧基；

或两个R¹基团与它们连接的碳一起形成5-8元环，所述环包含1个或2个选自O、S和N的杂原子；

R²为氢或任选地被1-3个取代基取代的C₁-C₆烷基，所述取代基独立地选自卤素、C₁-C₄烷氧基、-NR⁶R⁶和-SO₂R⁵；

n为1或2且每个R³独立地选自氢、卤素、羟基、C₁-C₆烷基、-NR⁶R⁶和C₁-C₄烷氧基，其中所述R³基团的烷基结构部分任选地被1-3个取代基取代，所述取代基独立地选自卤素、C₁-C₄烷氧基、-NR⁶R⁶和-SO₂R；和

R⁴为叠氮基或-(乙炔基)-R¹¹，其中R¹¹为氢或任选地被羟基、-OR⁶、或-NR⁶R⁶取代的C₁-C₆烷基。

在具体的实施方案中，所述EGFR拮抗剂是根据式I的化合物，其选自由下列各项组成的组：

(6，7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺；(6，7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-[3-(3′-羟基丙炔-1-基)苯基]-胺；[3-(2′-(氨基甲基)-乙炔基)苯基]-(6，7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-胺；(3-乙炔基苯基)-(6-硝基喹唑啉-4-基)-胺；(6，7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-(4-乙炔基苯基)-胺；(6，7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基-2-甲基苯基)-胺；(6-氨基喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺；(3-乙炔基苯基)-(6-甲磺酰基氨基喹唑啉-4-基)-胺；(3-乙炔基苯基)-(6，7-亚甲二氧基喹唑啉-4-基)-胺；(6，7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基-6-甲基苯基)-胺；(3-乙炔基苯基)-(7-硝基喹唑啉-4-基)-胺；(3-乙炔基苯基)-[6-(4′-甲苯磺酰基氨基)喹唑啉-4-基]-胺；(3-乙炔基苯基)-{6-[2′-苯二甲酰亚氨基-乙-1′-基-磺酰基氨基]喹唑啉-4-基}-胺；(3-乙炔基苯基)-(6-胍基喹唑啉-4-基)-胺；(7-氨基喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺；(3-乙炔基苯基)-(7-甲氧基喹唑啉-4-基)-胺；(6-甲酯基喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺；(7-甲酯基喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺；[6，7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基苯基)-胺；(3-叠氮基苯基)-(6，7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-胺；(3-叠氮基-5-氯苯基)-(6，7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-胺；(4-叠氮基苯基)-(6，7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-胺；(3-乙炔基苯基)-(6-甲磺酰基-喹唑啉-4-基)-胺；(6-乙硫基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺；(6，7-二甲氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基-4-氟-苯基)-胺；(6，7-二甲氧基-喹唑啉-4-基)-[3-(丙炔-1’-基)-苯基]-胺；[6，7-二-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(5-乙炔基-2-甲基-苯基)-胺；[6，7-二-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基-4-氟-苯基)-胺；[6，7-二-(2-氯-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基-苯基)-胺；[6-(2-氯-乙氧基)-7-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基-苯基)-胺；[6，7-二-(2-乙酰氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基-苯基)-胺；2-[4-(3-乙炔基-苯基氨基)-7-(2-羟基-乙氧基)-喹唑啉-6-基氧基]-乙醇；[6-(2-乙酰氧基-乙氧基)-7-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基-苯基)-胺；[7-(2-氯-乙氧基)-6-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基-苯基)-胺；[7-(2-乙酰氧基-乙氧基)-6-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基-苯基)-胺；2-[4-(3-乙炔基-苯基氨基)-6-(2-羟基-乙氧基)-喹唑啉-7-基氧基]-乙醇；2-[4-(3-乙炔基-苯基氨基)-7-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-6-基氧基]-乙醇；2-[4-(3-乙炔基-苯基氨基)-6-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-7-基氧基]-乙醇；[6-(2-乙酰氧基-乙氧基)-7-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基-苯基)-胺；(3-乙炔基-苯基)-{6-(2-甲氧基-乙氧基)-7-[2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-乙氧基]-喹唑啉-4-基}-胺；(3-乙炔基-苯基)-[7-(2-甲氧基-乙氧基)-6-(2-吗啉-4-基)-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-胺；(6，7-二乙氧基喹唑啉-1-基)-(3-乙炔基苯基)-胺；(6，7-二丁氧基喹唑啉-1-基)-(3-乙炔基苯基)-胺；(6，7-二异丙氧基喹唑啉-1-基)-(3-乙炔基苯基)-胺；(6，7-二乙氧基喹唑啉-1-基)-(3-乙炔基-2-甲基-苯基)-胺；[6，7-二-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-1-基]-(3-乙炔基-2-甲基-苯基)-胺；(3-乙炔基苯基)-[6-(2-羟基-乙氧基)-7-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-1-基]-胺；[6，7-二-(2-羟基-乙氧基)-喹唑啉-1-基]-(3-乙炔基苯基)-胺；2-[4-(3-乙炔基-苯基氨基)-6-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-7-基氧基]-乙醇；(6，7-二丙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基-苯基)-胺；(6，7-二乙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基-5-氟-苯基)-胺；(6，7-二乙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基-4-氟-苯基)-胺；(6，7-二乙氧基-喹唑啉-4-基)-(5-乙炔基-2-甲基-苯基)-胺；(6，7-二乙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基-4-甲基-苯基)-胺；(6-氨基甲基-7-甲氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基-苯基)-胺；(6-氨基甲基-7-甲氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺；(6-氨基羰基甲基-7-甲氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺；(6-氨基羰基乙基-7-甲氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺；(6-氨基羰基甲基-7-乙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺；(6-氨基羰基乙基-7-乙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺；(6-氨基羰基甲基-7-异丙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺；(6-氨基羰基甲基-7-丙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺；(6-氨基羰基甲基-7-甲氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺；(6-氨基羰基乙基-7-异丙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺；和(6-氨基羰基乙基-7-丙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺；(6，7-二乙氧基喹唑啉-1-基)-(3-乙炔基苯基)-胺；(3-乙炔基苯基)-[6-(2-羟基-乙氧基)-7-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-1-基]-胺；[6，7-二-(2-羟基-乙氧基)-喹唑啉-1-基]-(3-乙炔基苯基)-胺；[6，7-二-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-1-基]-(3-乙炔基苯基)-胺；(6，7-二甲氧基喹唑啉-1-基)-(3-乙炔基苯基)-胺；(3-乙炔基苯基)-(6-甲磺酰基氨基-喹唑啉-1-基)-胺；和(6-氨基-喹唑啉-1-基)-(3-乙炔基苯基)-胺。

在具体的实施方案中，式I的EGFR拮抗剂为N-(3-乙炔基苯基)-6，7-二(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺。在具体的实施方案中，EGFR拮抗剂N-(3-乙炔基苯基)-6，7-二(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺为盐酸盐的形式。在另一个具体的实施方案中，EGFR拮抗剂N-(3-乙炔基苯基)-6，7-二(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺为基本上均相的晶体多晶形物形式(在WO 01/34,574中描述为多晶形物B)，其显示具有在大约6.26，12.48，13.39，16.96，20.20，21.10，22.98，24.46，25.14和26.91以2-θ度数表示的特征峰的X-射线粉末衍射图。N-(3-乙炔基苯基)-6，7-二(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺的所述多晶形物形式称为Tarceva^TM以及OSI-774，CP-358774和厄洛替尼。

式I化合物，其药用盐和前药(此后称为活性化合物)可以通过已知适用于制备化学相关化合物的任何方法制备。通常活性化合物可以使用适当取代的胺由适当取代的喹唑啉制备，如US 5,747,498中公开的通用路线图I中所示：

路线图I

如路线图I中所示，适当4-取代的喹唑啉2(其中X为合适的可替换的离去基团诸如卤素、芳氧基、烷基亚硫酰基、烷基磺酰基诸如三氟甲磺酰基氧基、芳基亚硫酰基、芳基磺酰基、甲硅烷氧基、氰基、吡唑并、三唑并或四唑并，优选4-氯喹唑啉)与合适的胺或胺盐酸盐4或5在溶剂中反应，其中R⁴如上所述且Y为Br、I或三氟甲烷-磺酰基氧基，所述溶剂诸如(C₁-C₆)醇、二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷-2-酮、氯仿、乙腈、四氢呋喃(THF)、1-4二噁烷、吡啶或其他非质子溶剂。反应可以在碱的存在下实现，所述碱优选碱金属或碱土金属碳酸盐或氢氧化物或叔胺碱，诸如吡啶、2，6-二甲基吡啶、可力丁、N-甲基-吗啉、三乙胺、4-二甲基氨基-吡啶或N，N-二甲基苯胺。这些碱以后称为合适的碱。反应混合物在大约环境温度至大约溶剂的回流温度，优选大约35℃至大约回流温度的温度下保持，直至基本上检测不到残留的4-卤代喹唑啉，典型地约2小时至约24小时。优选地，反应在惰性气氛诸如干燥氮气中进行。

通常反应物以化学计量合并。当对于其中使用胺4或5的盐(典型地为盐酸盐)的那些化合物使用胺碱时，优选使用过量的胺碱，通常额外当量的胺碱。(备选地，如果不使用胺碱，则可以使用过量的胺4或5)。

对于其中使用位阻胺4(诸如2-烷基-3-乙炔基苯胺)或非常活泼的4-卤代喹唑啉的那些化合物，优选使用叔丁醇或极性非质子溶剂诸如DMF或N-甲基吡咯烷-2-酮作为溶剂。

备选地，4-取代的喹唑啉2(其中X为羟基或氧代(和2-氮被氢化))与四氯化碳和任选取代的三芳基膦在溶剂中反应，所述三芳基膦任选地负载在惰性聚合物上(例如，聚合物负载的三苯基膦，Aldrich目录编号36，645-5，其是每克树脂含有3mmol磷的2％二乙烯基苯交联的聚苯乙烯)，所述溶剂诸如四氯化碳，氯仿，二氯乙烷，四氢呋喃，乙腈或其他的非质子溶剂或其混合物。反应混合物在大约环境温度至大约回流温度，优选大约35℃至回流温度的温度下保持2小时至24小时。此混合物与合适的胺或胺盐酸盐4或5直接反应或在例如通过真空蒸发移除溶剂后反应，并且加入适当的备选溶剂诸如(C₁-C₆)醇、DMF、N-甲基吡咯烷-2-酮、吡啶或1-4二噁烷。然后，反应混合物在大约环境温度至溶剂的回流温度，优选大约35℃至大约回流温度的温度下保持，直至基本上达到产物的完全形成，典型地约2小时至约24小时。优选地，反应在惰性气氛诸如干燥氮气中进行。

当化合物4(其中Y为Br、I或三氟甲磺酰基氧基)用作与喹唑啉2的反应中的起始物质时，形成式3化合物(其中R¹，R²，R³和Y如上所述)。化合物3通过与适当的钯试剂(诸如四(三苯基膦)钯或二(三苯基膦)二氯化钯)在适当的路易斯酸(诸如氯化亚铜)和适当的炔烃(诸如三甲基甲硅烷基乙炔、丙炔醇或3-(N，N-二甲基氨基)-丙炔)的存在下在溶剂(诸如二乙胺或三乙胺)中反应转变成式1化合物(其中R⁴为R¹¹乙炔基，且R¹¹如上所定义)。化合物3(其中Y为NH₂)可以通过用重氮化试剂(诸如酸和亚硝酸盐(例如，乙酸和NaNO₂))处理化合物3，紧接着用叠氮化物(诸如NaN₃)处理得到的产物而转变为化合物1(其中R⁴为叠氮化物)。

对于那些式I化合物(其中R¹为氨基或羟基氨基)的制备，采用对相应式I化合物(其中R¹为硝基)的还原。

还原可以适宜地通过已知用于这类转化的许多方法中的任一种来进行。还原可以例如通过在对反应惰性的溶剂中在适当的金属催化剂(诸如钯、铂或镍)的存在下氢化硝基化合物的来进行。另外适合的还原剂是，例如，活化金属诸如活化铁(通过用酸诸如盐酸的稀溶液洗涤铁粉来制备)。因此，例如，还原可以通过将硝基化合物和活化金属的混合物与浓盐酸在溶剂中加热至例如，50°-150℃的范围内，适宜地在70℃或70℃附近，的温度来进行，所述溶剂诸如水和醇(例如，甲醇或乙醇)的混合物。另一合适类型的还原剂是碱金属连二亚硫酸盐诸如连二亚硫酸钠，其可以用于(C₁-C₄)链烷酸、(C₁-C₆)烷醇、水或其混合物中。

对于那些式I化合物(其中R²或R³结合伯氨基或仲氨基结构部分(其不是预期与喹唑啉反应的氨基))的制备，所述游离氨基在上述反应之前优选地被保护，紧接着脱保护，随后进行与4-(取代)喹唑啉2的上述反应。

可以使用几种熟知的氮保护基团。这样的基团包括(C₁-C₆)烷氧基羰基、任选取代的苄氧基羰基、芳氧基羰基、三苯甲基、乙烯基氧基羰基、O-硝基苯基磺酰基、二苯基氧膦基、对甲苯磺酰基和苄基。氮保护基的添加可以在氯代烃溶剂(诸如二氯甲烷或1，2-二氯乙烷)或醚性溶剂(诸如甘醇二甲醚、二甘醇二甲醚或THF)中在存在或缺少叔胺碱(诸如三乙胺、二异丙基乙胺或吡啶，优选三乙胺)的条件下在约0℃至约50℃的温度，优选大约环境温度下进行。备选地，使用Schotten-Baumann条件适宜地连接保护基。

在化合物2和5的上述偶联反应后，可以通过本领域技术人员已知的脱保护方法去除保护基，诸如在二氯甲烷中用三氟乙酸处理用于叔丁氧基羰基保护的产物。

对于保护基和它们的应用的描述，参见T.W.Greene和P.G.M.Wuts，″Protective Groups in Organic Synthesis(有机合成中的保护基)″第二版，John Wiley & Sons，New York，1991。

对于式I化合物(其中R¹或R²为羟基)的制备，优选裂解式I化合物(其中R¹或R²为(C₁-C₄)烷氧基)。

裂解反应可以适宜地通过已知用于此类转化的许多方法中的任一种来进行。用熔化的吡啶盐酸盐(20-30当量)在150°-175℃下处理受保护的式I衍生物可以用于O-脱烷基化。备选地，裂解反应可以例如通过用碱金属(C₁-C₄)烷基硫化物诸如乙硫醇钠处理受保护的喹唑啉衍生物或用碱金属二芳基磷化物诸如二苯基磷化锂处理来进行。裂解反应也可以适宜地通过用三卤化硼或三卤化铝诸如三溴化硼处理受保护的喹唑啉衍生物来进行。这样的反应优选地在对反应惰性的溶剂的存在下在合适的温度下进行。

式I化合物(其中R¹或R²为(C₁-C₄)烷基亚硫酰基或(C₁-C₄)烷基磺酰基)优选地通过式I化合物(其中R¹或R²为(C₁-C₄)烷基硫烷基)的氧化来制备。合适的氧化剂在本领域中已知用于在铂的存在下将硫烷基氧化为亚硫酰基(sulphinyl)和/或磺酰基，例如，过氧化氢，过酸(诸如3-氯过氧化苯甲酸或过氧乙酸)、碱金属过氧硫酸盐(诸如过一硫酸氢钾复合盐(potassium peroxymonosulphate))、三氧化铬或气态氧。氧化通常在尽可能温和的条件下使用化学计算量的氧化剂进行以便减小过度氧化的危险和对其他官能团的损害。通常，反应在合适的溶剂(诸如二氯甲烷，氯仿，丙酮，四氢呋喃或叔丁基甲基醚)中和在约-25°至50℃，优选在环境温度或环境温度附近，即15°-35℃的范围内的温度下进行。当需要带有亚硫酰基的化合物时，应该使用较温和的氧化剂诸如偏高碘酸钠或偏高碘酸钾，适宜地在极性溶剂诸如乙酸或乙醇中。含有(C₁-C₄)烷基磺酰基的式I化合物可以通过氧化相应的(C₁-C₄)烷基亚硫酰基化合物以及相应的(C₁-C₄)烷基硫烷基化合物来获得。

式I化合物(其中R¹为任选取代的(C₂-C₄)烷酰基氨基，脲基，3-苯基脲基，苯甲酰氨基或亚磺酰氨基)可以通过相应化合物(其中R¹为氨基)的酰化作用或磺酰化作用来制备。合适的酰化剂可以是本领域中已知用于在合适的碱的存在下将氨基酰化为酰基氨基的任何试剂，例如，酰基卤，例如，(C₂-C₄)烷酰氯或烷酰溴或苯甲酰氯或苯甲酰溴，链烷酸酐或混合酐(例如，乙酸酐或由链烷酸和(C₁-C₄)烷氧基碳酰卤例如(C₁-C₄)烷氧基碳酰氯的反应形成的混合酐)。对于那些式I化合物(其中R¹为脲基或3-苯基脲基)的制备，合适的酰化剂为，例如，氰酸盐，例如，碱金属氰酸盐诸如氰酸钠或异氰酸酯(盐)诸如异氰酸苯酯。N-磺酰化作用可以用合适的磺酰卤或磺酰酐在叔胺碱的存在下来进行。通常，酰化作用或磺酰化作用在对反应惰性的溶剂中和在约-30°至120℃的范围内，适宜地在环境温度或环境温度附近的温度下进行。

式I化合物(其中R¹为(C₁-C₄)烷氧基或取代的(C₁-C₄)烷氧基或R¹为(C₁-C₄)烷基氨基或取代的单-N-或二-N，N-(C₁-C₄)烷基氨基)优选地在合适的碱的存在下通过相应化合物(其中R¹分别为羟基或氨基)的烷基化来制备。合适的烷化剂包括烷基卤或取代的烷基卤，例如，任选取代的(C₁-C₄)烷基氯，烷基溴或烷基碘，在合适的碱的存在下在对反应惰性的溶剂中和在约10°至140℃的范围内，适宜地在环境温度或环境温度附近的温度下进行。

对于那些式I化合物(其中R¹为氨基-，氧基-或氰基-取代的(C₁-C₄)烷基取代基)的制备，带有可被氨基-、烷氧基-或氰基替换的基团的相应化合物(其中R¹为(C₁-C₄)烷基取代基)与合适的胺、醇或氰化物在合适的碱的存在下反应。反应优选地在对反应惰性的溶剂或稀释剂中和在约10°至100℃的范围内，优选在环境温度或环境温度附近的温度下进行。

式I化合物(其中R¹为羧基取代基或包含羧基的取代基)通过相应化合物(其中R¹为(C₁-C₄)烷氧基羰基取代基或包含(C₁-C₄)烷氧基羰基的取代基)的水解来制备。水解可以适宜地例如，在碱性条件下，例如在碱金属氢氧化物的存在下进行。

式I化合物(其中R¹为氨基，(C₁-C₄)烷基氨基，二-[(C₁-C₄)烷基]氨基，吡咯烷-1-基，哌啶子基，吗啉代，哌嗪-1-基，4-(C₁-C₄)烷基哌嗪-1-基或(C₁-C₄)烷基硫烷基)可以通过在合适的碱的存在下相应化合物(其中R¹为胺或硫醇可替换基团)与合适的胺或硫醇的反应来制备。反应优选地在对反应惰性的溶剂或稀释剂中和在约10°至180℃的范围内，适宜地在100°至150℃的范围内的温度下进行。

式I化合物(其中R¹为2-氧代吡咯烷-1-基或2-氧代哌啶-1-基)通过在合适的碱的存在下相应化合物(其中R¹为卤代-(C₂-C₄)烷酰基氨基)的环化作用来制备。反应优选地在对反应惰性的溶剂或稀释剂中和在约10°至100℃的范围内，优选在环境温度或环境温度附近的温度下进行。

对于式I化合物(其中R¹为氨基甲酰基，取代的氨基甲酰基，烷酰基氧基或取代的烷酰基氧基)的制备，适宜使用相应化合物(其中R¹为羟基)的氨基甲酰化作用或酰化作用。

合适的酰化剂在本领域中已知用于典型地在合适的碱的存在下，将羟基芳基结构部分酰化为烷酰基氧基芳基，包括，例如，如上所述的(C₂-C₄)烷酰卤，(C₂-C₄)烷酰酐和混合酐，并且可以采用其适当取代的衍生物。备选地，(C₂-C₄)链烷酸或其适当取代的衍生物可以与式I化合物(其中R¹为羟基)在缩合剂诸如碳二亚胺的辅助下偶联。对于那些式I化合物(其中R¹为氨基甲酰基或取代的氨基甲酰基)的制备，合适的氨基甲酰化剂为，例如，氰酸酯(盐)或异氰酸烷基酯或异氰酸芳基酯，典型地在合适的碱的存在下进行。备选地，可以例如，通过用碳酰氯(或碳酰氯等价物)或羰基二咪唑处理所述衍生物生成合适的中间体诸如式I化合物(其中R¹为羟基)的氯甲酸酯或羰基咪唑基衍生物。得到的中间体然后可以与合适的胺或取代的胺反应以生成所需的氨基甲酰基衍生物。

式I化合物(其中R¹为氨基羰基或取代的氨基羰基)可以通过合适的中间体(其中R¹为羧基)的氨解来制备。

式I化合物(其中R¹为羧基)的活化和偶联可以通过本领域技术人员已知的多种方法来进行。合适的方法包括将羧基活化为酸性卤化物、叠氮化合物、对称酸酐或混合酐，或具有适当的与所需胺偶联的反应性的活性酯。此类中间体和它们的制备以及它们在与胺的偶联中的应用可以在文献中广泛地见到；例如，M.Bodansky和A.Bodansky，″The Practice of Peptide Synthesis(肽合成实践)″，Springer-Verlag，New York，1984。得到的式I化合物可以通过标准方法分离和纯化，诸如溶剂移除和重结晶或色谱法。

用于所述反应路线图I的起始物质(例如，胺，喹唑啉和胺保护基团)容易获得或可以容易地由本领域技术人员使用有机合成的常规方法来合成。例如，2，3-二氢-1，4-苯并噁嗪衍生物的制备描述在R.C.Elderfield，W.H.Todd，S.Gerber，Ch.12于″Heterocyclic Compounds(杂环化合物)″，Vol.6，R.C.Elderfield编辑，John Wiley and Sons，Inc.，N.Y.，1957中。取代的2，3-二氢苯并噻嗪基化合物由R.C.Elderfield和E.E.Harris在Elderfield″Heterocyclic Compounds(杂环化合物)″书籍的第6卷第13章中描述。

在另一个具体实施方案中，EGFR拮抗剂具有如US 5,457,105中所述的通式II，该专利通过引用合并入本文中：

其中：

m为1，2或3和

每个R¹独立地为6-羟基，7-羟基，氨基，羧基，氨基甲酰基，脲基，(1-4C)烷氧基羰基，N-(1-4C)烷基氨基甲酰基，N，N-二-[(1-4C)烷基]氨基甲酰基，羟基氨基，(1-4C)烷氧基氨基，(2-4C)烷酰基氧基氨基，三氟甲氧基，(1-4C)烷基，6-(1-4C)烷氧基，7-(1-4C)烷氧基，(1-3C)亚烷基二氧基，(1-4C)烷基氨基，二-1[(1-4C)烷基]氨基，吡咯烷-1-基，哌啶子基，吗啉代，哌嗪-1-基，4-(1-4C)烷基哌嗪-1-基，(1-4C)烷硫基，(1-4C)烷基亚硫酰基，(1-4C)烷基磺酰基，溴甲基，二溴甲基，羟基-(1-4C)烷基，(2-4C)烷酰基氧基-(1-4C)烷基，(1-4C)烷氧基-(1-4C)烷基，羧基-(1-4C)烷基，(1-4C)烷氧基羰基-(1-4C)烷基，氨基甲酰基-(1-4C)烷基，N-(1-4C)烷基氨基甲酰基-(1-4C)烷基，N，N-二-[(1-4C)烷基]氨基甲酰基-(1-4C)烷基，氨基-(1-4C)烷基，(1-4C)烷基氨基-(1-4C)烷基，二-[(1-4C)烷基]氨基-(1-4C)烷基，哌啶子基-(1-4C)烷基，吗啉代-(1-4C)烷基，哌嗪-1-基-(1-4C)烷基，4-(1-4C)烷基哌嗪-1-基-(1-4C)烷基，羟基-(2-4C)烷氧基-(1-4C)烷基，(1-4C)烷氧基-(2-4C)烷氧基-(1-4C)烷基，羟基-(2-4C)烷基氨基-(1-4C)烷基，(1-4C)烷氧基-(2-4C)烷基氨基-(1-4C)烷基，(1-4C)烷硫基-(1-4C)烷基，羟基-(2-4C)烷硫基-(1-4C)烷基，(1-4C)烷氧基-(2-4C)烷硫基-(1-4C)烷基，苯氧基-(1-4C)烷基，苯胺基-(1-4C)烷基，苯硫基-(1-4C)烷基，氰基-(1-4C)烷基，卤代-(2-4C)烷氧基，羟基-(2-4C)烷氧基，(2-4C)烷酰基氧基-(2-4C)烷氧基，(1-4C)烷氧基-(2-4C)烷氧基，羧基-(1-4C)烷氧基，(1-4C)烷氧基羰基-(1-4C)烷氧基，氨基甲酰基-(1-4C)烷氧基，N-(1-4C)烷基氨基甲酰基-(1-4C)烷氧基，N，N-二-[(1-4C)烷基]氨基甲酰基-(1-4C)烷氧基，氨基-(2-4C)烷氧基，(1-4C)烷基氨基-(2-4C)烷氧基，二-[(1-4C)烷基]氨基-(2-4C)烷氧基，(2-4C)烷酰基氧基，羟基-(2-4C)烷酰基氧基，(1-4C)烷氧基-(2-4C)烷酰基氧基，苯基-(1-4C)烷氧基，苯氧基-(2-4C)烷氧基，苯胺基-(2-4C)烷氧基，苯硫基-(2-4C)烷氧基，哌啶子基-(2-4C)烷氧基，吗啉代-(2-4C)烷氧基，哌嗪-1-基-(2-4C)烷氧基，4-(1-4C)烷基哌嗪-1-基-(2-4C)烷氧基，卤代-(2-4C)烷基氨基，羟基-(2-4C)烷基氨基，(2-4C)烷酰基氧基-(2-4C)烷基氨基，(1-4C)烷氧基-(2-4C)烷基氨基，羧基-(1-4C)烷基氨基，(1-4C)烷氧基羰基-(1-4C)烷基氨基，氨基甲酰基-(1-4C)烷基氨基，N-(1-4C)烷基氨基甲酰基-(1-4C)烷基氨基，N，N-二-[(1-4C)烷基]氨基甲酰基-(1-4C)烷基氨基，氨基-(2-4C)烷基氨基，(1-4C)烷基氨基-(2-4C)烷基氨基，二-1(1-4C)烷基]氨基-(2-4C)烷基氨基，苯基-(1-4C)烷基氨基，苯氧基-(2-4C)烷基氨基，苯胺基-(2-4C)烷基氨基，苯硫基-(2-4C)烷基氨基，(2-4C)烷酰基氨基，(1-4C)烷氧基羰基氨基，(1-4C)烷基磺酰基氨基，苯甲酰氨基，苯磺酰胺基，3-苯基脲基，2-氧代吡咯烷-1-基，2，5-二氧代吡咯烷-1-基，卤代-(2-4C)烷酰基氨基，羟基-(2-4C)烷酰基氨基，(1-4C)烷氧基-(2-4C)烷酰基氨基，羧基-(2-4C)烷酰基氨基，(1-4C)烷氧基羰基-(2-4C)烷酰基氨基，氨基甲酰基-(2-4C)烷酰基氨基，N-(1-4C)烷基氨基甲酰基-(2-4C)烷酰基氨基，N，N-二-[(1-4C)烷基]氨基甲酰基-(2-4C)烷酰基氨基，氨基-(2-4C)烷酰基氨基，(1-4C)烷基氨基-(2-4C)烷酰基氨基或二-[(1-4C)烷基]氨基-(2-4C)烷酰基氨基，且其中所述苯甲酰氨基或苯磺酰胺基取代基或R¹取代基中的任何苯胺基，苯氧基或苯基可以任选地带有一个或两个卤代，(1-4C)烷基或(1-4C)烷氧基取代基；

n为1或2且

每个R²独立地为氢，羟基，卤代，三氟甲基，氨基，硝基，氰基，(1-4C)烷基，(1-4C)烷氧基，(1-4C)烷基氨基，二-[(1-4C)烷基]氨基，(1-4C)烷硫基，(1-4C)烷基亚硫酰基或(1-4C)烷基磺酰基；或其药用盐；4-(4′-羟基苯胺基)-6-甲氧基喹唑啉，4-(4’-羟基苯胺基)-6，7-亚甲二氧基喹唑啉，6-氨基-4-(4′-氨基苯胺基)喹唑啉，4-苯胺基-6-甲基喹唑啉或其盐酸盐和4-苯胺基-6，7-二甲氧基喹唑啉或其盐酸盐被排除在外。

在具体的实施方案中，EGFR拮抗剂是根据式II的化合物，其选自由下列各项组成的组：4-(3’-氯-4’-氟苯胺基)-6，7-二甲氧基喹唑啉；4-(3’，4’-二氯苯胺基)-6，7-二甲氧基喹唑啉；6，7-二甲氧基-4-(3’-硝基苯胺基)-喹唑啉；6，7-二乙氧基-4-(3’-甲基苯胺基)-喹唑啉；6-甲氧基-4-(3’-甲基苯胺基)-喹唑啉；4-(3’-氯苯胺基)-6-甲氧基喹唑啉；6，7-亚乙基二氧基-4-(3’-甲基苯胺基)-喹唑啉；6-氨基-7-甲氧基-4-(3’-甲基苯胺基)-喹唑啉；4-(3’-甲基苯胺基)-6-脲基喹唑啉；6-(2-甲氧基乙氧基甲基)-4-(3’-甲基苯胺基)-喹唑啉；6，7-二-(2-甲氧基乙氧基)-4-(3’-甲基苯胺基)-喹唑啉；6-二甲基氨基-4-(3’-甲基苯胺基)喹唑啉；6-苯甲酰氨基-4-(3’-甲基苯胺基)喹唑啉；6，7-二甲氧基-4-(3’-三氟甲基苯胺基)-喹唑啉；6-羟基-7-甲氧基-4-(3’-甲基苯胺基)-喹唑啉；7-羟基-6-甲氧基-4-(3’-甲基苯胺基)-喹唑啉；7-氨基-4-(3’-甲基苯胺基)-喹唑啉；6-氨基-4-(3’-甲基苯胺基)喹唑啉；6-氨基-4-(3’-氯苯胺基)-喹唑啉；6-乙酰胺基-4-(3’-甲基苯胺基)-喹唑啉；6-(2-甲氧基乙基氨基)-4-(3’-甲基苯胺基)-喹唑啉；7-(2-甲氧基乙酰胺基)-4-(3’-甲基苯胺基)-喹唑啉；7-(2-羟基乙氧基)-6-甲氧基-4-(3’-甲基苯胺基)-喹唑啉；7-(2-甲氧基乙氧基)-6-甲氧基-4-(3’-甲基苯胺基)-喹唑啉；6-氨基-4-(3’-甲基苯胺基)-喹唑啉。

式II的喹唑啉衍生物或其药用盐可以通过已知适用于制备化学相关化合物的任何方法制备。合适的过程例如由US 4,322,420中所用的那些说明。必要的起始物质可以是商购的或通过有机化学的标准步骤获得。

(a)适宜地在合适的碱的存在下喹唑啉(其中Z为可替换基团)(i)与苯胺(ii)的反应。

合适的可替换基团Z是例如，卤代，烷氧基，芳氧基或磺酰基氧基，例如，氯，溴，甲氧基，苯氧基，甲磺酰基氧基或甲苯对磺酰基氧基。

合适的碱是，例如，有机胺碱诸如，例如，吡啶，2，6-二甲基吡啶，可力丁，4-二甲基氨基吡啶，三乙胺，吗啉，N-甲基吗啉或二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯，或例如，碱金属或碱土金属碳酸盐或氢氧化物，例如，碳酸钠，碳酸钾，碳酸钙，氢氧化钠或氢氧化钾。

反应优选地在合适的惰性溶剂或稀释剂的存在下进行，例如，烷醇或酯诸如甲醇、乙醇、异丙醇或乙酸乙酯，卤化溶剂诸如二氯甲烷，氯仿或四氯化碳，醚诸如四氢呋喃或1，4-二噁烷，芳烃溶剂诸如甲苯，或两极性非质子溶剂诸如N，N-二甲基甲酰胺，N，N-二甲基乙酰胺，N-甲基吡咯烷-2-酮或二甲基亚砜。反应适宜地在例如，10°至150℃，优选20°至80℃的范围内的温度下进行。

式II的喹唑啉衍生物可以由此方法以游离碱的形式获得，或备选地其可以使用式H-Z的酸以盐的形式获得，其中Z具有前面限定的含义。当需要从该盐获得游离碱时，该盐可以用如前面所定义的合适的碱使用常规步骤处理。

(b)对于那些式II化合物(其中R¹或R²为羟基)的制备，裂解式II的喹唑啉衍生物(其中R¹或R²为(1-4C)烷氧基)。

裂解反应可以适宜地通过已知用于此类转化的许多方法中的任一种来进行。反应可以例如，通过用碱金属(1-4C)烷基硫化物诸如乙硫醇钠处理喹唑啉衍生物或，例如，用碱金属二芳基磷化物诸如二苯基磷化锂处理来进行。备选地，裂解反应可以适宜地通过，例如，用三卤化硼或三卤化铝诸如三溴化硼处理喹唑啉衍生物来进行。这样的反应优选地在如前面所定义的合适的惰性溶剂或稀释剂的存在下和在合适的温度下进行。

(c)对于那些式II化合物(其中R¹或R²为(1-4C)烷基亚硫酰基或(1-4C)烷基磺酰基)的制备，氧化式II的喹唑啉衍生物(其中R¹或R²为(1-4C)烷硫基)。

合适的氧化剂是例如，本领域中已知用于在铂的存在下将硫代氧化为亚硫酰基和/或磺酰基的任何试剂，例如，过氧化氢，过酸(诸如3-氯过氧化苯甲酸或过氧乙酸)、碱金属过氧硫酸盐(诸如过一硫酸氢钾复合盐)、三氧化铬或气态氧。氧化通常在尽可能温和的条件下和使用必需的化学计算量的氧化剂进行以便减小过度氧化的危险和对其他官能团的损害。通常，反应在合适的溶剂或稀释剂(诸如二氯甲烷，氯仿，丙酮，四氢呋喃或叔丁基甲基醚)中和在例如-25°至50℃，便利地在环境温度或环境温度附近，即15°-35℃的范围内的温度下进行。当需要带有亚硫酰基的化合物时，也可以使用较温和的氧化剂，例如，偏高碘酸钠或偏高碘酸钾，适宜地在极性溶剂诸如乙酸或乙醇中。要理解的是，当需要含有(1-4C)烷基磺酰基的式II化合物时，其可以通过氧化相应的(1-4C)烷基亚硫酰基化合物以及相应的(1-4C)烷基硫烷基化合物来获得。

(d)对于那些式II化合物(其中R¹为氨基)的制备，还原式I的喹唑啉衍生物(其中R¹为硝基)。

还原可以适宜地通过已知用于这类转化的许多方法中的任一种来进行。还原可以例如通过在对如前面所定义的惰性溶剂或稀释剂中在适当的金属催化剂(诸如钯或铂)的存在下氢化硝基化合物的溶液来进行。更适合的还原剂是，例如，活化金属诸如活化铁(通过用酸诸如盐酸的稀溶液洗涤铁粉来制备)。因此，例如，还原可以通过将硝基化合物和活化金属的混合物在合适的溶剂或稀释剂中加热至例如，50°-150℃的范围内，适宜地在70℃或70℃附近，的温度来进行，所述溶剂或稀释剂诸如水和醇(例如，甲醇或乙醇)的混合物。

(e)对于那些式II化合物(其中R¹为(2-4C)烷酰基氨基或取代的(2-4C)烷酰基氨基，脲基，3-苯基脲基或苯甲酰氨基，或R²为乙酰胺基或苯甲酰氨基)的制备，酰化式II的喹唑啉衍生物(其中R¹或R²为氨基)。

合适的酰化剂为例如，本领域中已知用于将氨基酰化为酰基氨基的任何试剂，例如，酰基卤，例如，(2-4C)烷酰氯或烷酰溴或苯甲酰氯或苯甲酰溴，适宜地在如前面所定义的合适的碱的存在下，链烷酸酐或混合酐(例如，(2-4C)链烷酸酐诸如乙酸酐或由链烷酸和(1-4C)烷氧基碳酰卤例如(1-4C)烷氧基碳酰氯的反应形成的混合酐，在存在如前面定义的合适的碱的条件下。对于那些式II化合物(其中R¹为脲基或3-苯基脲基)的制备，合适的酰化剂为，例如，氰酸盐，例如，碱金属氰酸盐诸如氰酸钠，或例如，异氰酸酯(盐)诸如异氰酸苯酯。通常，酰化作用在如前面所定义的合适的惰性溶剂或稀释剂中和在例如-30°至120℃的范围内，适宜地在环境温度或环境温度附近的温度下进行。

(f)对于那些式II化合物(其中R¹为(1-4C)烷氧基或取代的(1-4C)烷氧基或R¹为(1-4C)烷基氨基或取代的(1-4C)烷基氨基)的制备，优选在如前面所定义的合适的碱的存在下烷基化式II的喹唑啉衍生物(其中R¹当合适时为羟基或氨基)。

合适的烷化剂是例如，本领域中已知用于下列反应的任何试剂：在如前面所定义的合适的碱的存在下在如前面所定义的合适的惰性溶剂或稀释剂中和在例如10°至140℃的范围内，适宜地在环境温度或环境温度附近的温度下，将羟基烷基化为烷氧基或取代的烷氧基，或将氨基烷基化为烷基氨基或取代的烷基氨基，例如，烷基卤或取代的烷基卤，例如，(1-4C)烷基氯、烷基溴或烷基碘，或取代的(1-4C)烷基氯、烷基溴或烷基碘。

(g)对于那些式II化合物(其中R¹为羧基取代基或包含羧基的取代基)的制备，水解式II的喹唑啉衍生物(其中R¹为(1-4C)烷氧基羰基取代基或包含(1-4C)烷氧基羰基的取代基)。

水解可以适宜地例如，在碱性条件下进行。

(h)对于那些式II化合物(其中R¹为氨基-，氧基-，硫代-或氰基-取代的(1-4C)烷基取代基)的制备，带有如前面所定义的可替换基团的式II的喹唑啉衍生物(其中R¹为(1-4C)烷基取代基)与合适的胺、醇、硫醇或氰化物优选地在如前面所定义的合适的碱的存在下反应。

反应优选地在如前面所定义的合适的惰性溶剂或稀释剂中和在例如10°至100℃的范围内，优选在环境温度或环境温度附近的温度下进行。

当需要式II的喹唑啉衍生物的药用盐时，其可以例如，通过所述化合物与，例如，合适的酸反应使用常规步骤来获得。

在具体的实施方案中，EGFR拮抗剂是根据如US 5,770,599中所公开的式II’的化合物，该专利通过引用合并入本文中：

其中：

n为1，2或3；

每个R²独立地为卤代或三氟甲基

R³为(1-4C)烷氧基；和

R¹为二-[(1-4C)烷基]氨基-(2-4C)烷氧基，吡咯烷-1-基-(2-4C)烷氧基，哌啶子基-(2-4C)烷氧基，吗啉代-(2-4C)烷氧基，哌嗪-1-基-(2-4C)烷氧基，4-(1-4C)烷基哌嗪-1-基-(2-4C)烷氧基，咪唑-1-基-(2-4C)烷氧基，二-[(1-4C)烷氧基-(2-4C)烷基]氨基-(2-4C)烷氧基，硫代吗啉代-(2-4C)烷氧基，1-氧代硫代吗啉代-(2-4C)烷氧基或1，1-二氧代硫代吗啉代-(2-4C)烷氧基，且其中上面提及的任一个包含不与N或O原子连接的CH₂(亚甲基)基团的R¹取代基任选地在所述CH₂基团上带有羟基取代基；

或其药用盐。

在具体的实施方案中，EGFR拮抗剂是根据式II’的化合物，其选自由下列各项组成的组：4-(3’-氯-4’-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(2-吡咯烷-1-基乙氧基)-喹唑啉；4-(3’-氯-4’-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(2-吗啉基乙氧基)-喹唑啉；4-(3’-氯-4’-氟苯胺基)-6-(3-二乙基氨基丙氧基)-7-甲氧基喹唑啉；4-(3’-氯-4’-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(3-吡咯烷-1-基丙氧基)-喹唑啉；4-(3’-氯-4’-氟苯胺基)-6-(3-二甲基氨基丙氧基)-7-甲氧基喹唑啉；4-(3’，4’-二氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉基丙氧基)-喹唑啉；4-(3’-氯-4’-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(3-哌啶子基丙氧基)-喹唑啉；4-(3’-氯-4’-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉基丙氧基)-喹唑啉；4-(3’-氯-4’-氟苯胺基)-6-(2-二甲基氨基乙氧基)-7-甲氧基喹唑啉；4-(2’，4’-二氟苯胺基)-6-(3-二甲基氨基丙氧基)-7-甲氧基喹唑啉；4-(2’，4’-二氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉基丙氧基)-喹唑啉；4-(3’-氯-4’-氟苯胺基)-6-(2-咪唑-1-基乙氧基)-7-甲氧基喹唑啉；4-(3’-氯-4’-氟苯胺基)-6-(3-咪唑-1-基丙氧基)-7-甲氧基喹唑啉；4-(3’-氯-4’-氟苯胺基)-6-(2-二甲基氨基乙氧基)-7-甲氧基喹唑啉；4-(2’，4’-二氟苯胺基)-6-(3-二甲基氨基丙氧基)-7-甲氧基喹唑啉；4-(2’，4’-二氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉基丙氧基)-喹唑啉；4-(3’-氯-4’-氟苯胺基)-6-(2-咪唑-1-基乙氧基)-7-甲氧基喹唑啉；和4-(3’-氯-4’-氟苯胺基)-6-(3-咪唑-1-基丙氧基)-7-甲氧基喹唑啉。

在具体的实施方案中，EGFR拮抗剂是根据式II’的化合物，其为4-(3’氯-4’-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉基丙氧基)-喹唑啉，可选地称为ZD1839，吉非替尼和易瑞沙。

式II’的喹唑啉衍生物或其药用盐可以通过已知适用于制备化学相关化合物的任何方法制备。合适的过程包括，例如，由US5616582，US5580870，US 5475001和US5569658中所说明的那些。除非另外说明，n，R²，R³和R¹具有前面为式II’的喹唑啉衍生物所定义的任一种含义。必要的起始物质可以是商购的或通过有机化学的标准步骤获得。

(a)适宜地在合适的碱的存在下喹唑啉(其中Z为可替换基团)(iii)与苯胺(iv)的反应。

合适的可替换基团Z是例如，卤代，烷氧基，芳氧基或磺酰基氧基，例如，氯，溴，甲氧基，苯氧基，甲磺酰基氧基或甲苯-4-磺酰基氧基。

合适的碱是，例如，有机胺碱诸如，例如，吡啶，2，6-二甲基吡啶，可力丁，4-二甲基氨基吡啶，三乙胺，吗啉，N-甲基吗啉或二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯，或例如，碱金属或碱土金属碳酸盐或氢氧化物，例如，碳酸钠，碳酸钾，碳酸钙，氢氧化钠或氢氧化钾。备选地，合适的碱为，例如，碱金属或碱土金属氨化物，例如，氨基钠或二(三甲基甲硅烷基)氨基钠。

式II’的喹唑啉衍生物可以由此方法以游离碱的形式获得，或备选地其可以使用式H-Z的酸以盐的形式获得，其中Z具有前面限定的含义。当需要从该盐获得游离碱时，该盐可以用如前面所定义的合适的碱使用常规步骤处理。

(b)对于那些式II’化合物(其中R¹为氨基-取代的(2-4C)烷氧基)的制备，适宜地在如前面所定义的合适的碱的存在下烷基化式II’的喹唑啉衍生物(其中R¹为羟基)。

合适的烷化剂是例如，本领域中已知用于下列反应的任何试剂：在如前面所定义的合适的碱的存在下在如前面所定义的合适的惰性溶剂或稀释剂中和在例如10°至140℃的范围内，适宜地在80°或80°附近的温度下，将羟基烷基化为氨基取代的烷氧基，例如氨基取代的烷基卤，例如，氨基取代的(2-4C)烷基氯、烷基溴或烷基碘。

(c)对于那些式II’化合物(其中R¹为氨基取代的(2-4C)烷氧基)的制备，式II’的化合物(其中R¹为羟基-(2-4C)烷氧基)或其反应性衍生物与合适的胺适宜地在如前面所定义的合适的碱的存在下反应。

式II’的化合物的合适的反应性衍生物(其中R¹为羟基-(2-4C)烷氧基)为，例如，卤代-或磺酰基氧基-(2-4C)烷氧基诸如溴-或甲磺酰基氧基-(2-4C)烷氧基。

反应优选地在如前面所定义的合适的惰性溶剂或稀释剂的存在下和在例如10°至150℃的范围内，适宜地在50°或50℃附近的温度下进行。

(d)对于那些式II’化合物(其中R¹为羟基-氨基-(2-4C)烷氧基)的制备，式II’的化合物(其中R¹为2，3-环氧丙氧基或3，4-环氧丁氧基)与合适的胺反应。

反应优选地在如前面所定义的合适的惰性溶剂或稀释剂的存在下和在例如10°至150℃的范围内，适宜地在70°或70℃附近的温度下进行。

当需要式II’的喹唑啉衍生物的药用盐，例如，式II’的喹唑啉衍生物的单-或二-酸加成盐时，其可以例如，通过所述化合物与，例如，合适的酸反应使用常规步骤来获得。

在具体的实施方案中，EGFR拮抗剂是根据如WO9935146(该专利通过引用合并入本文)中所公开的式III的化合物：

或其盐或溶剂合物；其中

X为N或CH；

Y为CR¹且V为N；

或Y为N且V为CR¹；

或Y为CR¹且V为CR²；

或Y为CR²且V为CR¹；

R¹代表基团CH₃SO₂CH₂CH₂NHCH₂-Ar-，其中Ar选自苯基，呋喃，噻吩，吡咯和噻唑，它们中的每一个可以任选地被一个或两个卤素，C_1-4烷基或G_1-4烷氧基取代；

R²选自包括氢，卤素，羟基，C_1-4烷基，C_1-4烷氧基，C_1-4烷基氨基和二[C_1-4烷基]氨基的组；

U代表苯基，吡啶基，3H-咪唑基，吲哚基，异吲哚基，二氢吲哚基，异二氢吲哚基，1H-吲唑基，2，3-二氢-1H-吲唑基，1H-苯并咪唑基，2，3-二氢-1H-苯并咪唑基或1H-苯并三唑基，其被R³基团取代和任选地被至少一个独立地选择的R⁴基团取代；

R³选自包括苄基，卤代-苄基，二卤代苄基-和三卤代苄基，苯甲酰基，吡啶基甲基，吡啶基甲氧基，苯氧基，苄氧基，卤代-苄氧基，二卤代-苄氧基和三卤代苄氧基和苯磺酰基的组；或R³代表三卤代甲基苄基或三卤代甲基苄氧基；

或R³代表下式的基团

其中每个R⁵独立地选自卤素，C_1-4烷基和C_1-4烷氧基；且n为0至3；和

每个R⁴独立地为羟基，卤素，C_1-4烷基，C_2-4烯基，C_2-4炔基，C_1-4烷氧基，氨基，C_1-4烷基氨基，二[C_1-4烷基]氨基，C_1-4烷硫基，C_1-4烷基亚硫酰基，C_1-4烷基磺酰基，C_1-4烷基羰基，羧基，氨基甲酰基，C_1-4烷氧基羰基，C_1-4烷酰基氨基，N-(C_1-4烷基)氨基甲酰基，N，N-二(C_1-4烷基)氨基甲酰基，氰基，硝基和三氟甲基。

在具体的实施方案中，式III的EGFR拮抗剂不包括：(1-苄基-1H-吲唑-5-基)-(6-(5-((2-甲磺酰基-乙基氨基)-甲基)-呋喃-2-基)-吡啶并[3，4-d]嘧啶-4-基-胺；(4-苄氧基-苯基)-(6-(5-((2-甲磺酰基-乙基氨基)-甲基)-呋喃-2-基)-吡啶并[3，4-d]嘧啶-4-基-胺；(1-苄基-1H-吲唑-5-基)-(6-(5-((2-甲磺酰基-乙基氨基)-甲基)-呋喃-2-基)-喹唑啉-4-基-胺；(1-苄基H-吲唑-5-基)-(7-(5-((2-甲磺酰基-乙基氨基)-甲基)-呋喃-2-基)-喹唑啉-4-基-胺；和(1-苄基-1H-吲唑-5-基)-(6-(5-((2-甲磺酰基-乙基氨基)-甲基)-1-甲基-吡咯-2-基)-喹唑啉-4-基-胺。

在具体的实施方案中，式III的EGFR拮抗剂选自由下列各项组成的组：4-(4-氟苄氧基)-苯基)-(6-(5-((2-甲磺酰基-乙基氨基)甲基)-呋喃-2-基)-吡啶并[3，4-d]嘧啶-4-基)-胺；(4-(3-氟苄氧基)-苯基)-(6-(5-((2-甲磺酰基-乙基氨基)甲基)呋喃-2-基)-吡啶并[3，4-d]嘧啶-4-基)-胺；(4-苯磺酰基-苯基)-(6-(5-((2-甲磺酰基-乙基氨基)-甲基)-呋喃-2-基)-吡啶并[3，4-d]嘧啶-4-基)-胺；(4-苄氧基-苯基)-(6-(3-((2-甲磺酰基-乙基氨基)-甲基)-苯基)-吡啶并[3，4-d]嘧啶-4-基)-胺；(4-苄氧基-苯基)-(6-(5-((2-甲磺酰基-乙基氨基)-甲基)-呋喃-2-基)喹唑啉-4-基)-胺；(4-(3-氟苄氧基-苯基)-(6-(4-((2-甲磺酰基-乙基氨基)-甲基)-呋喃-2-基)-吡啶并[3，4-d]嘧啶-4-基)-胺；(4-苄氧基-苯基)-(6-(2-((2-甲磺酰基乙基氨基)-甲基)-噻唑-4-基)喹唑啉-4-基)-胺；N-{4-[(3-氟苄基)氧基]苯基}-6-[5-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基}甲基)-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺；N-{4-[(3-氟苄基)氧基]-3-甲氧基苯基}-6-[5-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基}甲基)-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺；N-[4-(苄氧基)苯基]-7-甲氧基-6-[5-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基}甲基)-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺；N-[4-(苄氧基)苯基]-6-[4-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基}甲基)-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺；N-{4-[(3-氟苄基)氧基]-3-甲氧基苯基}-6-[2-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基}甲基)-1，3-噻唑-4-基]-4-喹唑啉胺；N-{4-[(3-溴苄基)氧基]苯基}-6-[2-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基}甲基)-1，3-噻唑-4-基]-4-喹唑啉胺；N-{4-[(3-氟苄基)氧基]苯基)-6-[2-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基}甲基)1，3-噻唑-4-基]-4-喹唑啉胺；N-[4-(苄氧基)-3-氟苯基]-6-[2-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基)甲基)-1，3-噻唑-4-基]-4-喹唑啉胺；N-(1-苄基-1H-吲唑-5-基)-7-甲氧基-6-[5-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基)甲基)-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺；6-[5-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基)甲基)-2-呋喃基]-N-(4-{[3-(三氟甲基)苄基]氧基)苯基)-4-喹唑啉胺；N-{3-氟-4-[(3-氟苄基)氧基]苯基}-6-[5-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基)甲基)-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺；N-{4-[(3-溴苄基)氧基]苯基)-6-[5-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基)甲基)-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺；N-[4-(苄氧基)苯基]-6-[3-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基}甲基)-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺；N-[1-(3-氟苄基)-1H-吲唑-5-基]-6-[2-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基}甲基)-1，3-噻唑-4-基]-4-喹唑啉胺；6-[5-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基)甲基)-2-呋喃基]-N-[4-(苯磺酰基)苯基]-4-喹唑啉胺；6-[2-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基)甲基)-1，3-噻唑-4-基]-N-[4-(苯磺酰基)苯基]-4-喹唑啉胺；6-[2-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基}甲基)-1，3-噻唑-4-基]-N-(4-{[3-(三氟甲基)苄基]氧基)苯基)-4-喹唑啉胺；N-{3-氟-4-[(3-氟苄基)氧基]苯基)-6-[2-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基}甲基)-1，3-噻唑-4-基]-4-喹唑啉胺；N-(1-苄基-1H-吲唑-5-基)-6-[2-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基)甲基)-1，3-噻唑-4-基]-4-喹唑啉胺；N-(3-氟-4-苄氧基苯基)-6-[2-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基)甲基)-1，3-噻唑-4-基]-4-喹唑啉胺；N-(3-氯-4-苄氧基苯基)-6-[2-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基)甲基)-1，3-噻唑-4-基]-4-喹唑啉胺；N-{3-氯-4-[(3-氟苄基)氧基]苯基}-6-[5-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基)甲基)-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺；6-[5-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基)甲基)-2-呋喃基]-7-甲氧基-N-(4-苯磺酰基)苯基-4-喹唑啉胺；N-[4-(苄氧基)苯基]-7-氟-6-[5-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基)甲基)-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺；N-(1-苄基-1H-吲唑-5-基)-7-氟-6-[5-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基}甲基)-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺；N-[4-(苯磺酰基)苯基]-7-氟-6-[5-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基}甲基)-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺；N-(3-三氟甲基-4-苄氧基苯基)-6-[5-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基)甲基)-4-呋喃基]-4-喹唑啉胺；和其盐和溶剂合物。

在具体的实施方案中，EGFR拮抗剂为：N-[3-氯-4-[(3-氟苯基)甲氧基]苯基]-6-[5-[[[2-(甲磺酰基)乙基]氨基]甲基]-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺二甲苯磺酸盐(拉帕替尼(lapatinib))。

在具体的实施方案中，EGFR拮抗剂是根据如WO0132651中所公开的式IV的化合物，该专利通过引用合并入本文中：

其中：

m为1-3的整数；

R¹代表卤代或C_1-3烷基；

X¹代表-0-；

R²选自下列三种基团中的一种：

1)C_1-5烷基R³(其中R³为哌啶-4-基，其可以带有一个或两个取代基，所述取代基选自羟基，卤代，C_1-4烷基，C_1-4羟基烷基和C_1-4烷氧基；

2)C_2-5烯基R³(其中R³如本文所定义)；

3)C_2-5炔基R³(其中R³如本文所定义)，

和其中任何烷基，烯基或炔基可以带有一个或多个取代基，所述取代基选自羟基，卤代和氨基；或其盐。

在具体的实施方案中，EGFR拮抗剂选自由下列各项组成的组：4-(4-氯-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉；4-(2-氟-4-甲基苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉；4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉；4-(4-氯-2，6-二氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉；4-(4-溴-2，6-二氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉；4-(4-氯-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉；4-(2-氟-4-甲基苯胺基)-6-甲氧基-7-(哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉；4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉；4-(4-氯-2，6-二氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉；4-(4-溴-2，6-二氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉；和其药用盐和溶剂合物。

在具体的实施方案中，EGFR拮抗剂为4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(Zactima)和其盐。

VEGF拮抗剂

在临床前动物模型中，用c-met抗体(如MetMAb)、EGFR拮抗剂(如厄洛替尼)和VEGF拮抗剂(如抗-VEGF抗体)的组合治疗，与单独用MetMAb或厄洛替尼或单独用抗-VEGF抗体相比，在肿瘤生长抑制和肿瘤进展中产生显著改善。参见2008年10月17日提交的共有的、共同未决USSN 61/106,513)。因此，本发明提供用VEGF拮抗剂进一步治疗。

“VEGF拮抗剂”指这样的分子，其能够结合VEGF、降低VEGF表达水平、或中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF生物学活性，包括VEGF与一种或多种VEGF受体的结合和VEGF介导的血管发生和内皮细胞存活或增殖。作为可用于本发明的方法中的VEGF拮抗剂所包含的是特异性结合VEGF的多肽、抗VEGF抗体及其抗原结合片段、特异性结合VEGF由此使其隔绝与一种或多种受体结合的受体分子及衍生物、融合蛋白(例如VEGF-Trap(Regeneron))、和VEGF₁₂₁-白树毒素(VEGF121-gelonin，Peregine)。VEGF拮抗剂还包括VEGF多肽的拮抗性变体、和针对VEGF的RNA适配体和肽体(peptibodies)。这些中每个的实例在下文进行描述。

本发明的方法中有用的抗-VEGF抗体包括以足够亲和力和特异性结合VEGF并降低或抑制VEGF的生物学活性的任何抗体、或其抗原结合片段。抗VEGF抗体通常不会结合其它VEGF同源物，诸如VEGF-B或VEGF-C，也不结合其它生长因子，诸如PlGF、PDGF或bFGF。此类抗-VEGF抗体的实例包括但不限于本文在“定义”下提供的那些。

两种最佳表征的VEGF受体是VEGFR1(也称为Flt-1)和VEGFR2(关于鼠科同源物也称为KDR和FLK-1)。各受体关于各VEGF家族成员的特异性不同但是VEGF-A与Flt-1和KDR二者结合。全长Flt-1受体包括具有7个Ig结构域的胞外结构域、跨膜结构域和具有酪氨酸激酶活性的胞内结构域。胞外结构域参与VEGF的结合并且胞内结构域参与信号传导。

特异性结合VEGF的VEGF受体分子或其片段可以用于本发明的方法中来结合并由此隔绝VEGF蛋白，由此防止其信号传导。在某些实施方案中，VEGF受体分子或其VEGF结合片段是可溶形式，诸如sFlt-1。受体的可溶形式通过结合VEGF对VEGF蛋白的生物学活性发挥抑制性作用，由此防止其与靶细胞表面上存在的它的天然受体结合。还包括VEGF受体融合蛋白，其实例描述如下。

嵌合VEGF受体蛋白是具有源自至少两种不同蛋白的氨基酸序列的受体分子，所述蛋白的至少一种是VEGF受体蛋白(例如，flt-1或KDR受体)，其能够结合并抑制VEGF的生物学活性。在某些实施方案中，本发明的嵌合VEGF受体蛋白由源自仅两种不同VEGF受体分子的氨基酸序列组成；然而，包含来自flt-1和/或KDR受体的胞外配体结合区的1、2、3、4、5、6、或全部7个Ig样结构域的氨基酸序列可以与来自其他无关蛋白的氨基酸序列，例如免疫球蛋白序列相连。Ig样结构域连接的其他氨基酸序列应该是本领域中的普通技术人员容易清楚的。嵌合VEGF受体蛋白的实例包括可溶性Flt-1/Fc，KDR/Fc，或flt-1/KDR/Fc(也称为VEGF Trap)。(参见例如PCT申请公开号WO97/44453)。

本发明的可溶性VEGF受体蛋白或嵌合VEGF受体蛋白包括没有通过跨膜结构域固定在细胞表面上的VEGF受体蛋白。象这样，VEGF受体的可溶性形式，包括嵌合受体蛋白，尽管能够结合VEGF并使其失活，但不包括跨膜结构域并且由此通常不与表达所述分子的细胞的细胞膜相关。

适配体是形成与靶分子(如VEGF多肽)特异性结合的三级结构的核酸分子。适配体的产生和治疗性应用是本领域中充分建立的。见，例如，美国专利号5,475,096。VEGF适配体是聚乙二醇化修饰的寡核苷酸，其采用能够使其结合于细胞外VEGF的三维构象。用于治疗年龄相关的黄斑变性(age-related macular degeneration)的靶向VEGF的治疗有效的VEGF适配体的一个实例是培加他尼(pegaptanib)(Macugen^TM，OSI)。关于适配体的另外的信息可以见于美国专利申请公开号20060148748。

肽体是连接于编码免疫球蛋白分子的片段或部分的氨基酸序列的肽序列。多肽可以衍生自通过特异性结合的任何方法选择的随机序列，所述方法包括，但不限于：噬菌体展示技术。在一个实施方案中，可以将选定的多肽连接于编码免疫球蛋白的Fc部分的氨基酸序列。还将特异性结合并拮抗VEGF的肽体用于本发明的方法中。

疗法

本发明的特征在于作为特定治疗方案的一部分组合使用抗c-met抗体和EGFR拮抗剂，意图提供来自于这些治疗剂的组合活性的有益效果。该组合的有益效果包括但不限于由治疗剂的组合产生的药物代谢动力学或药效学的协同作用(co-action)。本发明在治疗多个阶段的多种类型的癌症中特别有用。

本发明的特征在于抗-c-met抗体作为特定治疗方案的一部分的用途，意图提供来自于这种治疗剂的活性的有益效果。

一方面，本发明提供用于在患有非小细胞肺癌的受试者中延长疾病进展时间(time to disease progression，TTP)、无进展存活或存活的方法，该方法包括向该受试者施用(a)每三周大约15mg/kg的剂量的抗c-met抗体；和(b)EGFR拮抗剂。

在一些实施方案中，抗-c-met抗体以足以获得15微克/ml或高于15微克/ml的血清谷浓度(serum trough concentration)的量施用。在一些实施方案中，抗-c-met抗体以每三周大约15mg/kg或更高的剂量施用。在一些实施方案中，抗-c-met抗体以每三周大约15-20mg/kg的剂量施用。

在一些实施方案中，抗-c-met抗体在三周的期间中以大约15mg/kg或更高的总剂量施用。

在一个实施方案中，EGFR拮抗剂是厄洛替尼。厄洛替尼在三周的周期中每天可以150mg的剂量施用。在一些实施方案中，厄洛替尼以100mg的剂量施用。在一些实施方案中，厄洛替尼以50mg的剂量施用。考虑到厄洛替尼的剂量降低(Dose reductions)标明在厄洛替尼标签上。

本发明考虑到多个剂量的系列可以施用。当施用一个系列的剂量时，这些可以是例如大约每周施用，大约每两周施用，大约每三周施用，或大约每四周施用。多个系列的剂量可以施用例如两个循环，三个循环，四个循环，或更多(5，6，7，8，9或更多循环)。

在一个实施方案中，本发明提供用于在患有非小细胞肺癌的受试者中延长疾病进展时间(TTP)、无进展存活、或存活的方法，该方法包括向该受试者施用(a)每三周大约15mg/kg的剂量的抗-c-met抗体；和(b)在三周的周期中每天150mg剂量的厄洛替尼(N-(3-乙炔基苯基)-6，7-二(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺)。

可用抗-c-met抗体和/或抗-c-met抗体与EGFR拮抗剂的组合治疗的多种癌症的实例在上文定义部分列举。在一些实施方案中，癌症适应症包括非小细胞肺癌、肾细胞癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、食管癌、间皮瘤、黑素瘤、乳腺癌、甲状腺癌、结肠直肠癌、头和颈癌、骨肉瘤、前列腺癌、或成胶质细胞瘤。

用抗-c-met抗体，如MetMAb(在一些实施方案中，与EGFR拮抗剂如厄洛替尼组合)的疗法延长TTP和/或无进展存活和/或存活。

术语癌症包括一组增殖性病症，包括但不限于癌前生长、良性肿瘤、和恶性肿瘤。良性肿瘤维持局限在原始位点并且没有浸润、侵袭或转移至远方位点的能力。恶性肿瘤将侵袭并破坏其周围的其它组织。它们也获得了从原始位点剥离并扩散至身体其它部分的能力(转移)，通常通过血流或通过淋巴结所在的淋巴系统转移。原发肿瘤通过它们所发生的组织类型进行分类；转移瘤通过衍生癌细胞的组织类型进行分类。经过一段时间，恶性肿瘤的细胞变得更加异常并显得更不像正常细胞。这种癌细胞的外观变化称为肿瘤分级，并且癌细胞被描述为良好分化的(低级别(low grade))、中度分化的、较差分化的或未分化的(高级别(high grade))。良好分化的细胞显得非常正常并且类似于它们所来源的正常细胞。未分化的细胞是变得如此异常的细胞以至于不能确定该细胞的来源。

癌症分期系统描述了癌症在解剖学上扩散多远并试图将具有相似预后和治疗的患者放在相同的分期组中。可进行数种测试以协助进行癌症分期，包括活检和某些显影测试如胸部X线、乳房X线照片、骨扫描、CT扫描和MRI扫描。还使用血液测试和临床评价来评价患者的总体健康并检测癌症是否扩散到某些器官。

为对癌症分期，美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer)首先将癌症特别是实体瘤放在使用TNM分类系统的字母类别中。癌症被指定为字母T(肿瘤大小)、N(可触及淋巴结)、和/或M(转移)。T1，T2，T3，和T4描述了原发损害的大小增加；N0，N1，N2，N3表明涉及淋巴结的进行性进展；M0和M1反映了远处转移的不存在或存在。

在第二种分期方法中，也已知为总体分期分组(Overall Stage Grouping)或罗马数字分期(Roman Numeral Staging)，癌症被分为0至IV期，包括原发损害的大小以及淋巴结扩散和远处转移的存在。在这种系统中，病例分组到有罗马数字I到IV表示的四个期，或分类为“复发”。对一些癌症，0期被称为“原位”或“Tis”，如对于乳腺癌的原位导管癌或原位小叶癌。高级别腺瘤也可分类为0期。一般而言，I期癌症是通常可治愈的小的局限性癌症，而IV期通常代表不可手术或转移的癌症。II期和III期癌症通常是局部进展和/或表现出局部淋巴结的参与。一般而言，更高分期数字表示更广泛的疾病，包括更大的肿瘤大小和/或癌症扩散到附近淋巴结和/或原发肿瘤邻近的器官。这些分期是精确定义的，但该定义对每种癌症不同并且是本领域技术人员已知的。

许多癌症登记，诸如国立癌症研究所的监测、流行病学和远期结果计划(NCI’s Surveillance，Epidemiology，and End Results Program(SEER))使用概括分期(summary staging)。这种系统用于所有类型的癌症。它将癌症病例分成五个主要类型的组：

原位(In situ)是早期癌，其仅在其发生的细胞层中存在。

局部(Localized)是局限于其发生的器官的癌症，无扩散证据。

区域(Regional)是已经从最初(原发)位点扩散到附近淋巴结或器官和组织的癌症。

远处(Distant)是已经从原发位点扩散到远处器官或远处淋巴结的癌症。

未知(Unknown)用于描述对于该病例没有足够的信息表明分期。

此外，癌症在原发肿瘤已经去除后数个月或数年返回是常见的。在所有可见的肿瘤切除后癌症复发称为复发性疾病。在原发肿瘤区域复发的疾病是局部复发，作为转移复发的疾病称为远处复发。

肿瘤可以是实体瘤或非实体瘤或软组织肿瘤。软组织肿瘤的实例包括白血病(例如，慢性髓细胞性白血病(chronic myelogenous leukemia)、急性髓细胞性白血病(acute myelogenous leukemia)、成人急性淋巴细胞性白血病(adult acute lymphoblastic leukemia)、急性髓性白血病(acute myelogenous leukemia)、成熟急性B细胞型淋巴细胞性白血病(mature B-cell acute lymphoblastic leukemia)、慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocytic leukemia)、前淋巴细胞性白血病(polymphocytic leukemia)、或毛细胞性白血病(hairy cell leukemia))、或淋巴瘤(lymphoma)(例如，非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin′s lymphoma)、皮肤T细胞淋巴瘤(cutaneous T-cell lymphoma)、或霍奇森病(Hodgkin′s disease)。实体瘤包括血液、骨髓、或淋巴系统之外的任何身体组织的癌症。实体瘤可进一步分为上皮细胞来源的那些和非上皮细胞来源的那些。上皮细胞实体瘤的实例包括胃肠道、结肠、乳房、前列腺、肺、肾、肝、胰、卵巢、头和颈、口腔、胃、十二指肠、小肠、大肠、肛门、胆囊、阴唇、鼻咽、皮肤、子宫、男性生殖器、泌尿器官、膀胱及皮肤的肿瘤。非上皮来源的实体瘤包括肉瘤(sarcomas)、脑肿瘤(brain tumors)、和骨肿瘤(bone tumors)。

还可联合其它治疗方案。例如，可施用第二(第三、第四等)化疗剂，其中第二种化疗剂或是另一种不同的抗代谢物化疗剂，或是非抗代谢物的化疗剂。例如，第二种化疗剂可以是紫杉烷(诸如泰索帝(taxotere)或紫杉醇(paclitaxel)或多西紫杉醇(docetaxel))、抗代谢药(诸如吉西他滨(gemcitabine)或5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil))、卡培他滨(capecitabine)或基于铂的化疗剂(诸如卡铂、顺铂或奥沙利铂(oxaliplatin))、蒽环类抗生素(anthracycline)(诸如多柔比星，包括多柔比星脂质体)、托泊替康(topotecan)、培美曲塞(pemetrexed)、长春花生物碱(vinca alkaloid)(诸如长春瑞滨(vinorelbine))和TLK 286。可以施用不同化疗剂的“鸡尾酒”。

可以与抗-c-met和EGFR拮抗剂组合的其它治疗剂包括以下任一种或多种：针对肿瘤相关抗原的抗体；抗激素化合物，例如抗雌激素化合物诸如他莫昔芬，或芳香酶抑制剂；保心药(以预防或减轻与治疗有关的任何心肌功能障碍)；细胞因子；抗血管发生剂(尤其是Genentech以商标AVASTIN^TM销售的贝伐单抗)；酪氨酸激酶抑制剂诸如sunutinib(SUTENT)和索拉非尼(sorafenib)；COX抑制剂(例如COX-1或COX-2抑制剂)；非甾体抗炎药，塞来考昔(celecoxib)(CELEBREX

)；法尼基转移酶抑制剂(例如可从Johnson和Johnson购买的替匹法尼(Tipifarnib)/ZARNESTRA

R115777或Schering-Plough购买的Lonafarnib SCH66336)；mTOR抑制剂诸如RAD001和temsirolimus；结合癌胚蛋白CA 125的抗体，诸如奥戈伏单抗(Oregovomab)(MoAb B43.13)；HER2疫苗(诸如Pharmexia的HER2 Auto Vac疫苗，或Dendreon的APC8024蛋白质疫苗，或GSK/Corixa的HER2肽疫苗)；其它HER靶向疗法(例如曲妥单抗(trastuzumab)，西妥昔单抗(cetuximab)，ABX-EGF，EMD7200，吉非替尼，厄洛替尼，帕尼单抗(panitumumab)，CP724714，CI1033，GW572016，IMC-11F8，TAK165等)；Raf和/或ras抑制剂(参见例如WO 2003/86467)；盐酸多柔比星脂质体注射液(DOXIL

)；拓扑异构酶I抑制剂诸如托泊替康；紫杉烷；HER2与EGFR双重酪氨酸激酶抑制剂诸如拉帕替尼(lapatinib)/GW572016；TLK286(TELCYTA

)；EMD-7200；治疗恶心的药物，诸如血清素拮抗剂、类固醇或苯并二氮卓(benzodiazepine)；预防或治疗皮疹的药物或标准痤疮疗法，包括局部或口服抗生素；治疗或预防腹泻的药物；降体温药物，诸如醋氨酚(acetaminophen)、苯海拉明(diphenhydramine)或麦啶(meperidine)；造血生长因子等。任何上述共施用药剂的合适剂量就是那些目前所使用的剂量，而且可以由于该药剂与抗-c-met抗体和EGFR拮抗剂的组合作用(协同作用)而降低，或可以例如根据治疗医师的确定而提高。

在某些实施方案中，当组合使用时，贝伐单抗的施用是约0.05mg/kg至约15mg/kg。在一个实施方案中，约0.5mg/kg，1.0mg/kg，2.0mg/kg，3.0mg/kg，4.0mg/kg，5.0mg/kg，6.0mg/kg，7.0mg/kg，7.5mg/kg，8.0mg/kg，9.0mg/kg，10mg/kg或15mg/kg(或其任何组合)的一种或多种剂量可施用给受试者。此类剂量可间歇地使用，例如每天、每三天、每周或每两到三周。在另一个实施方案中，当组合使用时，贝伐单抗以每隔一周10mg/kg或每三周15mg/kg静脉内施用给受试者。

在上述治疗方案之外，还可对患者进行手术去除癌细胞和/或放疗。

若抑制剂是抗体，优选的是，所施用的抗体是裸抗体。然而，所施用的抑制剂可以与细胞毒性剂缀合。优选的是，所缀合的抑制剂和/或其结合的抗原受到细胞的内在化，导致该缀合物杀伤其所结合的癌细胞的治疗功效提高。在一个优选的实施方案中，细胞毒性剂靶向或干扰癌细胞中的核酸。此类细胞毒性剂的例子包括美登木素生物碱类(maytansinoids)、加利车霉素(calicheamicin)、核糖核酸酶和DNA内切核酸酶。

在一些实施方案中，对本文的患者进行诊断测试，例如在治疗前和/或治疗中和/或治疗后。一般而言，如果进行诊断测试，可从需要治疗的患者获得样品。当受试者患有癌症，该样品可以是肿瘤样品，或其它生物学样品如生物学液体包括但不限于血液、尿液、唾液、腹水或衍生物如血清和血浆等等。

在一些实施方案中，该受试者的癌症表达c-met和/或EGFR。确定c-met或EGFR表达的方法是本领域已知的并且某些方法在本文进行描述。

在一些实施方案中，受试者的血清表达高水平的IL8。在一些实施方案中，受试者的血清表达高于约150pg/ml的IL8，或在一些实施方案中，高于约50pg/ml的IL8。在一些实施方案中，受试者的血清表达高于约10pg/ml，20pg/ml，30pg/ml或更高的IL8。测量血清IL8浓度的方法是本领域已知的并且一种方法在本实施例中描述。

在一些实施方案中，受试者的血清表达高水平的HGF。在一些实施方案中，受试者的血清表达高于约5,000，10,000，或50,000pg/ml的HGF。

在一些实施方案中，例如，来自于用c-met拮抗剂治疗的患者的肿瘤或血清的样品，和在一些实施方案中，用EGFR拮抗剂进一步治疗的患者的肿瘤或血清的样品中降低的mRNA或蛋白表达是预后性的，例如对于关于治疗的反应或关于c-met拮抗剂的活性是预后性的，在一些实施方案中，关于EGFR拮抗剂的活性是预后性的。在一些实施方案中，数种血管发生因子，诸如白细胞介素8(IL8)，血管内皮生长因子A(VEGFA)，EPH受体A2(EphA2)，血管生成素-样4(Angptl4)，和Ephrin B2(EFNB2)的降低的表达是预后性的，例如关于治疗的反应或关于c-met拮抗剂的活性(在一些实施方案中，关于EGFR拮抗剂的活性)是预后性的。降低的表达可如下测量，相对于未治疗的样品或参照正常值或相对于患者在用c-met拮抗剂治疗(或用c-met拮抗剂和EGFR拮抗剂的治疗)之前的表达水平进行测量。

在一些实施方案中，样品(例如来自于患者的肿瘤或血清)中降低的HGF或IL8表达是预后性的，例如关于对治疗的反应或关于c-met拮抗剂的活性(在一些实施方案中，关于EGFR拮抗剂的活性)是预后性的。在一个实施方案中，血清中IL8的表达高于50％的降低或高于70％的降低(例如相对于治疗前患者中IL8的表达水平)表明对治疗有反应。降低的表达可如下测量，相对于未治疗的样品或参照正常值或相对于患者在用c-met拮抗剂治疗(或用c-met拮抗剂和EGFR拮抗剂的治疗)之前的表达水平进行测量。

在一些实施方案中，例如，来自于用c-met拮抗剂治疗的患者的肿瘤或血清的样品，和在一些实施方案中，用EGFR拮抗剂进一步治疗的患者的肿瘤或血清的样品中增加的mRNA或蛋白表达是预后性的，例如关于对治疗的反应或关于c-met拮抗剂的活性(在一些实施方案中，关于EGFR拮抗剂的活性)是预后性的。降低的表达可如下测量，相对于未治疗的样品或参照正常值或相对于患者在用c-met拮抗剂治疗(或用c-met拮抗剂和EGFR拮抗剂的治疗)之前的表达水平进行测量。

在一些实施方案中，FDG-PET成像是预后性的，例如关于对治疗的反应或关于c-met拮抗剂的活性(在一些实施方案中，关于EGFR拮抗剂的活性)是预后性的。

本文的生物学样品可以是固定的样品，例如福尔马林固定的、石蜡包埋(FFPE)的样品或冷冻的样品。

用于测定mRNA或蛋白质表达的方法有多种，包括但不限于基因表达谱、聚合酶链式反应(PCR)包括定量实时-PCR(qRT-PCR)、微阵列分析、基因表达系列分析(serial analysis of gene expression，SAGE)、MassARRAY、通过大量平行签名测序(Massive Parallel Signiture Sequencing，MPSS)进行的基因表达分析、蛋白质组学、免疫组化(IHC)等。优选对mRNA定量。所述mRNA分析优选使用聚合酶链式反应(PCR)技术或通过微阵列分析来进行。若采用PCR，则优选的PCR形式是定量实时PCR(qRT-PCR)。在一个实施方案中，如果上文提到的一种或多种基因的表达处于中值或高于中值，例如与相同肿瘤类型的其它样品相比，那么认为是阳性表达。可以在与基因表达的测量同时测定中值表达水平，或者可以事先测定。

多篇已发表的期刊论文(例如Godfrey等J.Molec.Diagnostics(分子诊断杂志)2：84-91(2000)；Specht等，Am.J.Pathol.(美国病理学杂志)158：419-29(2001))中给出了使用固定的、石蜡包埋的组织作为RNA来源的代表性基因表达概况分析方案的步骤：包括mRNA分离、纯化、引物延伸和扩增。简单的说，一种代表性方法首先将石蜡包埋的肿瘤组织样品切成约10微米厚的切片。然后提取RNA并除去蛋白质和DNA。分析RNA浓度后，如果需要可以包括RNA修复和/或扩增步骤，并使用基因特异性启动子逆转录RNA，然后PCR。最后分析数据，根据所检验肿瘤样品中鉴定的特征性基因表达模式来确定患者可用的最佳治疗选项。

基因或蛋白表达的检测可以直接或间接确定。

人们可以测定癌症中的c-met和/或EGFR的表达或扩增(直接地或间接地)。对此，可利用多种诊断/预后测定法。在一个实施方案中，可通过IHC来分析c-met和/或EGFR的过表达。可将来自肿瘤活检的石蜡包埋组织切片进行IHC测定法并对照如下c-met和/或EGFR蛋白质染色强度标准：

得分0：未观察到染色或者在少于10％的肿瘤细胞中观察到膜染色。

得分1+：在超过10％的肿瘤细胞中检测到微弱的/刚刚可察觉的膜染色。所述细胞只在其部分膜中有染色。

得分2+：在超过10％的肿瘤细胞中观察到微弱至中等的完全膜染色。

得分3+：在超过10％的肿瘤细胞中观察到中等至强烈的完全膜染色。

在一些实施方案中，那些c-met和/或EGFR过表达评估得分为0或1+的肿瘤可表征为c-met和/或EGFR未过表达，而那些得分为2+或3+的肿瘤可表征为c-met和/或EGFR过表达。

在一些实施方案中，c-met和/或EGFR过表达的肿瘤可根据对应于每个细胞表达的c-met和/或EGFR分子拷贝数的免疫组化得分进行定级，并且可通过生化方法测定：

0＝0-10,000个拷贝/细胞，

1+＝至少约200,000个拷贝/细胞，

2+＝至少约500,000个拷贝/细胞，

3+＝至少约2,000,000个拷贝/细胞。

或者/另外，可对福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤组织进行FISH测定法来测定肿瘤中c-met和/或EGFR扩增的程度(如果有的话)。

c-met或EGFR激活可直接测定(例如通过磷酸-ELISA测试或其它检测磷酸化受体的方法)或间接测定(例如通过检测激活的下游信号传导途径组分，检测受体二聚物(例如同二聚体、异二聚体)，检测基因表达概况等等)。

相似地，c-met或EGFR组成性激活或不依赖于配体的EGFR或c-met的存在可直接或间接检测(例如通过检测与组成性活性相关的受体突变、通过检测与组成性活性相关的受体扩增等等)。

检测核酸突变的方法是本领域公知的。通常而非必需的是，扩增样品中的靶核酸以提供所希望的材料量，来确定是否存在突变。扩增技术是本领域公知的。例如，扩增产物可以涵盖或不涵盖所有编码感兴趣的蛋白质的核酸序列，只要该扩增产物包含怀疑突变所在的特定氨基酸/核酸序列位置。

在一个实施例中，通过将来自样品的核酸与能够与编码突变核酸的核酸特异性杂交的核酸探针接触，并检测所述杂交，由此确定突变的存在。在一个实施方案中，探针被可检测的标记，例如用放射性同位素(³H，³²P，³³P等)、荧光剂(若丹明、荧光素等)或发色剂标记。在有些实施方案中，探针是反义寡聚物，例如PNA、吗啉代-氨基磷酸酯、LNA或2′-烷氧基烷氧基。探针可以有约8个核苷酸至约100个核苷酸、或约10个至约75个、或约15个至约50个、或约20个至约30个。在另一个方面，本发明的核酸探针在试剂盒中提供，用以鉴定样品中的c-met突变，所述试剂盒包含特异杂交于或临近于编码c-met的核酸中的突变位点的寡核苷酸。试剂盒可进一步包括根据使用试剂盒的杂交测试的结果，用c-met拮抗剂治疗患包含c-met突变的肿瘤患者的说明书。

也可通过比较扩增的核酸的电泳迁移率和相应编码野生型c-met的核酸的电泳迁移率，由此来检测突变。迁移率差异表明扩增的核酸序列中存在突变。可通过任何合适的分子分离技术，例如在聚丙烯酰胺凝胶上，来确定电泳迁移率。

利用酶突变检测(EMD)，也可分析核酸来检测突变(Del Tito等，Clinical Chemistry(临床化学)44：731-739，1998)。EMD使用噬菌体解离酶T₄内切核酸酶VII，其扫描双链DNA直到它检测并裂解了由碱基对错配造成的结构变形，所述错配由核酸改变诸如点突变、插入和缺失造成。例如通过凝胶电泳，检测到两个由解离酶裂解形成的短片段，表明存在突变。EMD方法的益处是以单个方案直接从扩增反应中鉴定出所检验的点突变、缺失、和插入，不需要纯化样品，缩短了杂交时间，并提高了信噪比。包含比正常至多过量20倍的核酸的混合样品和大小至多4kb的片段可进行测试。可是，EMD扫描不能鉴定在突变阳性样品中发生的特定碱基改变，所以如果需要，通常要额外的测序规程来鉴定特定的突变。如美国专利No.5,869,245所证实的，相似地可用CEL I酶替代解离酶T₄内切核酸酶VII。

另一种用于检测突变的简单试剂盒是反向杂交测试条，其与用于检测HFE、TFR2和FPN1基因中造成血色病(Haemochromatosis)的多重突变的Haemochromatosis StripAssay^TM(Viennalabs http://www.bamburghmarrsh.com/pdf/4220.pdf)相似。这种测试基于PCR扩增后的序列特异性杂交。对于单突变测试，可使用基于微板的检测系统，而对于多重突变测试，可使用测试条作为“宏阵列(macro-arrays)”。试剂盒可包括可供样品制备、扩增和突变检测即时使用的试剂。多重扩增方案提供了便利，并允许以非常有限的体积来测试样品。利用直接StripAssay形式，可以在不超过5小时内完成二十个及更多突变的测试，而无需昂贵设备。从样品中分离DNA并体外扩增靶核酸(例如通过PCR)，并用生物素标记，一般可在单个(“多重”)扩增反应中进行。然后，扩增产物选择性地与固定在诸如测试条的固体支持物上的寡核苷酸探针(野生型和突变体特异的)杂交，其中探针固定为平行线或条带。利用链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶和有色底物，来检测结合的生物素化的扩增子。这样的测试能检测本发明的所有突变或其任意子集。对于特定的突变体探针条带，三种信号传导模式之一是有可能的：(i)仅针对野生型探针的条带，表明是正常的核酸序列，(ii)针对野生型和突变体探针的条带，表明是杂合基因型，和(iii)仅针对突变体探针的条带，表明是纯合突变体基因型。因此，在一个方面，本发明提供了检测本发明突变的方法，其包括从样品中分离和/或扩增靶c-met核酸序列，使得扩增产物包含配体，使扩增产物与包含该配体的可检测结合配偶体的探针接触，而且该探针能够与本发明的突变特异性杂交，然后检测所述探针与所述扩增产物的杂交。在一个实施方案中，配体是生物素，而结合配偶体包括抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白。在一个实施方案中，结合配偶体包括链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶，其可用有色底物检测。在一个实施方案中，探针固定于例如测试条上，其中与不同突变互补的探针彼此分开。可选地，扩增的核酸用放射性同位素标记，在该情况中，探针不必包含可检测标记物。

野生型基因的改变涵盖所有形式的突变，诸如插入、倒位、缺失、和/或点突变。在一个实施方案中，突变是体细胞的。体细胞突变是仅发生于某些组织中(例如在肿瘤组织中)且不在种系中遗传的那些。种系突变可以在任何身体组织中找到。

包含靶核酸的样品可通过本领域公知的方法获得，而且它们适于特定类型和位置的肿瘤。组织活检通常用于获得有代表性的肿瘤组织片。可选地，可以已知或认为包含感兴趣的肿瘤细胞的组织/流体的形式间接获取肿瘤细胞。例如，肺癌损伤的样品可通过切除术、支气管镜检、细针抽吸、支气管刷检、或从痰、胸膜液或血液中获得。可从肿瘤或从其它身体样品诸如尿、痰或血清中检测出突变的基因或基因产物。上述讨论的用于检测肿瘤样品中突变的靶基因或基因产物的同样技术可用于其它身体样品。癌细胞从肿瘤上脱落下来，并出现在这些身体样品中。通过筛选这些身体样品，可实现对于诸如癌的疾病的简单早期诊断。另外，通过对这些身体样品测试突变的靶基因或基因产物，可更容易地监测治疗的进程。

对组织制备物富集肿瘤细胞的手段是本领域已知的。例如，可以从石蜡或低温保存的切片中分离组织。癌细胞也可通过流式细胞术或激光捕捉显微解剖而与正常细胞分开。这些以及其它从正常细胞中分离肿瘤的技术是本领域公知的。如果肿瘤组织被正常细胞高度污染，那么检测突变可能更困难，尽管最小化污染和/或假阳/阴性结果的技术是已知的，其中一些在下文有描述。例如，也可以对样品评估生物标志物(包括突变)的存在情况，所述标志物已知与感兴趣的肿瘤细胞有关而与相应的正常细胞无关，反之亦然。

可通过用本领域公知的技术来分子克隆靶核酸并测序该核酸，由此来完成靶核酸中点突变的检测。可选地，诸如聚合酶链式反应(PCR)的扩增技术可用于直接从肿瘤组织的基因组DNA制备物中扩增出靶核酸序列。然后确定扩增序列的核酸序列并鉴定其突变。扩增技术是本领域公知的，例如描述于Saiki等，Science(科学)239：487，1988；美国专利Nos.4,683,203和4,683,195中的聚合酶链式反应。

应当注意，设计并选择合适的引物是非常成熟的现有技术。

本领域已知的连接酶链式反应也可用于扩增靶核酸序列。参见例如Wu等，Genomics(基因组学)，Vol.4，pp.560-569(1989)。另外，称为等位基因特异性PCR的技术也可使用。参见例如Ruano和Kidd，Nucleic Acids Research(核酸研究)，Vol.17，p.8392，1989。根据该技术，使用的引物在其3′端与特定靶核酸突变杂交。如果不存在特定的突变，那么不会观察到扩增产物。也可以使用耐扩增突变系统(Amplification Refractory Mutation System，ARMS)，其如欧洲专利申请公开第0332435号和Newton等，Nucleic Acids Research(核酸研究)，Vol.17，p.7，1989所公开的。基因的插入和缺失也可通过克隆、测序和扩增来检测。另外，基因或周围标志基因的限制性片段长度多态性(RFLP)探针可用于对等位基因的改变或多态性片段的插入来评分。也可用单链构象多态性(SSCP)分析来检测等位基因的碱基变化变体。参见例如Orita等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)Vol.86，pp.2766-2770，1989，和Genomics(基因组学)，Vol.5，pp.874-879，1989。也可用其它用于检测插入和缺失的本领域已知技术。

根据基因野生型表达产物的改变，也可检测野生型基因的改变。这些表达产物包括mRNA以及蛋白质产物。通过扩增和测序mRNA或分子克隆由mRNA制备的cDNA，来检测点突变。利用本领域公知的DNA测序技术，来确定克隆的cDNA的序列。cDNA也可以通过聚合酶链式反应(PCR)来测序。

错配是并不100％互补的杂交核酸双链。缺乏完全的互补性可以是因为缺失、插入、倒位、置换或移码突变造成的。可用错配检测来检测靶核酸中的点突变。尽管这些技术可能不如测序灵敏，然而对大量组织样品来说更容易实施。错配裂解技术的实例是RNA酶保护方法，其在Winter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，Vol.82，p.7575，1985，和Meyers等，Science(科学)，Vol.230，p.1242，1985中有详细描述。例如，本发明的方法可包括使用标记的核糖核酸探针，其与人野生型靶核酸互补。衍生自组织样品的核糖核酸探针和靶核酸在一起退火(杂交)，然后用RNA酶A消化，其能够检测双链RNA结构中的一些错配。如果RNA酶A检测到错配，那么它在错配位点裂解。因此，当在电泳凝胶基质上分离退火的RNA制备物时，如果RNA酶A检测到错配并裂解，那么将见到此核糖核酸探针与mRNA或DNA的全长双链RNA小的RNA产物。考虑到它涵盖了怀疑突变了的位置，核糖核酸探针不需要是全长的靶核酸mRNA或基因，但可以是靶核酸的一部分。如果核糖核酸探针仅包含靶核酸mRNA或基因的一个区段，如果希望，那么可能希望使用大量这些探针来筛选整个靶核酸序列的错配。

以相似的方式，可用DNA探针检测错配，例如通过酶或化学裂解进行。参见例如Cotton等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，Vol.85，4397，1988；和Shenk等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，Vol.72，p.989，1975。可选地，通过错配双链体相对于匹配双链体的电泳迁移率变化，可检测错配。参见例如Cariello，Human Genetics，Vol.42，p.726，1988。用核糖核酸探针或DNA探针，可以在杂交前扩增可能包含突变的靶核酸mRNA或DNA。尤其是如果改变是总的重排，诸如缺失和插入，那么利用Southern杂交也可检测靶核酸DNA中的改变。

扩增出的靶核酸DNA序列也可用等位基因特异性探针筛选。这些探针是核酸寡聚物，每一个都包含靶核酸基因中包含已知突变的区域。例如，一个寡聚物的长度可以为约30个核苷酸，对应于部分靶基因序列。通过使用一组这样的等位基因特异性探针，可筛选靶核酸扩增产物，以鉴定靶基因中以前鉴定出的突变的存在。可以例如在尼龙膜上进行扩增的靶核酸序列与等位基因特异性探针的杂交。在严格杂交条件下与特定探针的杂交表明肿瘤组织中存在与等位基因特异性探针中相同的突变。

通过筛选相应野生型蛋白的改变，可检测野生型靶基因的改变。例如，与靶基因产物有免疫反应性的单克隆抗体可用于筛选组织，例如用已知与基因产物(蛋白质)的特定突变位置结合的抗体。例如，所用的抗体可以是结合缺失的外显子(例如外显子14)的抗体或结合包含靶蛋白缺失部分的构象表位的抗体。缺少关联抗原将表示有突变。突变等位基因产物的特异性抗体也可用于检测突变基因产物。可以从噬菌体展示文库中鉴定抗体。这些免疫学测定法可以以本领域已知的任何便利形式进行。这些包括Western印迹、免疫组织化学测定法和ELISA测定法。任何检测改变的蛋白质的方法都可用于检测野生型靶基因的改变。

利用核酸扩增技术，诸如聚合酶链式反应，引物对可用于确定靶核酸的核苷酸序列。单链DNA引物对可以与靶核酸序列之内或周围的序列退火，从而引发靶序列的扩增。也可使用等位基因特异性引物。该引物仅与特定的突变靶序列退火，因此仅在存在突变的靶序列作为模板的情况下才会扩增出产物。为了便于接下来克隆扩增的序列，引物可具有限制酶位点序列，该序列附加在这些引物的末端。这些酶和位点是本领域公知的。可以用本领域公知的技术来合成引物本身。一般而言，可用寡核苷酸合成仪制造引物，所述仪器可从商业渠道获得。设计特定引物完全在本领域技术范围内。

核酸探针可用于许多目的。它们可用于对基因组DNA的Southern杂交中，并可用于RNA酶保护方法中以检测上文已经讨论过的点突变。探针可用于检测靶核酸扩增产物。利用其它技术，它们也可用于检测野生型基因或mRNA的错配。利用酶(例如S1核酸酶)、化学药品(例如羟胺或四氧化锇和哌啶)、或错配杂交体相对于完全匹配杂交体的电泳迁移率变化，可检测错配。这些技术是本领域已知的。参见Novack等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，Vol.83，p.586，1986。一般而言，探针与激酶结构域外的序列互补。整组核酸探针可用于组成试剂盒来检测靶核酸中的突变。试剂盒容许进行对感兴趣的靶序列的大区域的杂交。探针可彼此交叠或毗邻。

如果用核糖核酸探针来检测mRNA的错配，那么它一般与靶基因的mRNA互补。因此，核糖核酸探针是反义探针，因为它不编码相应的基因产物，因为它与有义链互补。核糖核酸探针一般会用放射性、比色、或荧光材料来标记，这可以通过任何本领域已知方法来实现。如果用核糖核酸探针来检测DNA的错配，它可以是任一极性，即有义的或反义的。相似地，也可用DNA探针来检测错配。

在一些情况下，癌症过表达或不过表达c-met受体和/或EGFR。可在诊断或预后测定中通过评估细胞表面上存在的受体蛋白质水平的升高(例如通过免疫组化测定，IHC)来测定受体的过表达。或者/另外，可测量细胞中编码受体的核酸的水平，例如通过荧光原位杂交(FISH；参见1998年10月公布的WO98/45479)、Southern印迹或聚合酶链反应(PCR)技术，诸如实时定量PCR(RT-PCR)。在上述测定法之外，熟练从业人员还可利用多种体内测定法。例如，可将患者体内细胞暴露于任选用可检测标记物例如放射性同位素标记的抗体，并且可评估该抗体与患者体内细胞的结合，例如通过外部扫描放射性或通过分析取自事先已暴露于所述抗体的患者的活组织检查。

制剂、剂量和施用

可以与优良医学实践一致的方式配制、剂量给药和施用本发明中使用的治疗剂。在此内容中考虑的因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体受试者、患者个体的临床状态、病症的起因、投递药剂的部位、施药的方法、施药的日程安排、该药剂将要组合的药物-药物相互作用和医学从业人员知道的其它因素。

治疗用制剂可通过将具有期望纯度的活性成分与任选的生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington′s Pharmaceutical Sciences(第20版)，编辑A.Gennaro，2000，Lippincott，Williams & Wilkins，Philadelphia，PA)使用本领域已知的标准方法混合而制备。可接受的载体包括盐水或缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露醇、或山梨醇；成盐平衡离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或PEG。

任选地，但优选地，制剂含有药学上可接受的盐，优选为氯化钠，且优选大约为生理浓度。任选地，本发明的制剂可包含药学上可接受的防腐剂。在一些实施方案中，防腐剂浓度范围在0.1至2.0％，典型地为v/v。适当的防腐剂包括制药领域已知的那些。优选的防腐剂是苯甲醇、酚、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。任选地，本发明的制剂可包含浓度为0.005至0.02％的药学上可接受的表面活性剂。

本文中的制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性化合物，优选活性互补且彼此没有不利影响的那些。合适的是，此类分子以对于预定目的有效的量组合。

活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、包载在胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或包载在粗滴乳状液(macroemulsion)中。此类技术披露于例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，见上文。

可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够释放分子达100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当封装的抗体在体内长时间维持时，它们可能由于暴露于37℃的潮湿环境而变性或聚集，导致生物学活性损失和免疫原性可能改变。可以根据相关机制来设计合理的稳定化策略。例如，如果发现聚集机制是经由硫代-二硫化物互换的分子间S-S键形成，那么可通过修饰巯基残基、由酸性溶液冻干、控制湿度、采用适当添加剂和开发特定聚合物基质组合物来实现稳定。

本发明的治疗剂依照已知的方法施用给人患者，诸如，作为推注或通过一段时间的连续输注的静脉内施用，通过肌肉内的、腹膜内的、脑脊内的、皮下的、关节内的、滑膜内的、鞘内的、口腔的、局部的、或吸入途径。在VEGF拮抗剂的情况下，如果VEGF的拮抗作用与广泛的副作用或毒性相关，局部施用是特别期望的。先体外后体内(ex vivo)策略也可在治疗性应用中使用。先体外后体内策略涉及通过编码c-met或EGFR拮抗剂的多核苷酸转染或转导从受试者获得的细胞。该转染或转导的细胞然后回输至受试者。该细胞可以是许多类型的任一种，包括但不限于造血细胞(例如骨髓细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞、T细胞或B细胞)、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、角质细胞或肌细胞。

例如，如果c-met或EGFR拮抗剂是抗体，该抗体通过任何合适的手段施用，所述手段包括肠胃外、皮下、腹膜内、肺内和鼻内途径，并且如果希望局部免疫抑制治疗，进行损伤内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或者皮下施用。此外，通过脉冲输注，尤其施用降低剂量的抗体合适地施用抗体。优选地，给药通过注射给予，最优选地通过静脉内或皮下注射给予，这部分取决于施用是快速还是长期的。

在另一个实例中，当病症或肿瘤的位置允许时，c-met或EGFR拮抗剂化合物局部施用，例如通过直接注射，并且该注射可周期性地重复。c-met或EGFR拮抗剂也可全身投递给受试者或直接投递至肿瘤细胞，例如投递至肿瘤或手术切除肿瘤后的瘤床，以预防或降低局部复发或转移。

组合使用治疗剂典型地在限定的时间期间(根据所选的组合通常数分钟、数小时、数天或数周)进行。组合疗法意图涵盖以连续的方式施用这些治疗剂，即其中每种治疗剂在不同时间施用，以及涵盖以基本同时的方式施用这些治疗剂，或至少该治疗剂中的两种。

治疗剂可通过相同的途径或不同的途径施用。例如组合中的EGFR或c-met拮抗剂可通过静脉内注射施用，而组合中的蛋白激酶抑制剂可口服施用。备选地，例如，两种治疗剂均可口服施用，或两种治疗剂均可通过静脉内注射施用，取决于具体治疗剂。治疗剂施用的顺序也根据具体药剂而变化。

本申请设想通过基因疗法来施用c-met和/或EGFR拮抗剂。关于使用基因疗法来产生胞内抗体，参见例如1996年3月14日公开的WO 96/07321。

主要有两种方法使核酸(任选包含在载体中)进入患者的细胞：体内(in vivo)和先体外后体内(ex vivo)。对于体内投递，通常在需要抗体的部位将核酸直接注射入患者。对于先体外后体内治疗，采集患者的细胞，将核酸导入这些分离的细胞，并将经过修饰的细胞直接施用于患者，或是例如装入多孔膜再植入患者(参见例如美国专利号4,892,538和5,283,187)。有多种技术可用于将核酸引入活细胞。所述技术可根据核酸是在体外转移入培养的细胞还是在体内转移入预期宿主的细胞而变化。适于在体外将核酸转移入哺乳动物细胞的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸钙沉淀法等。先体外后体内(ex vivo)递送基因常用的载体是逆转录病毒。

当前优选的体内核酸转移技术包括用病毒载体(诸如腺病毒、I型单纯疱疹病毒、或腺伴随病毒)和基于脂质的系统(可用于脂质介导的基因转移的脂类有例如DOTMA、DOPE和DC-Chol)进行的转染。在有些情况中希望与靶向靶细胞的药剂(诸如对细胞表面膜蛋白或靶细胞特异性的抗体、针对靶细胞上受体的配体等)一起提供核酸来源。如果采用脂质体，则可以使用与胞吞作用有关的细胞表面膜蛋白结合的蛋白质靶向和/或促进摄取，例如对特定细胞类型有向性的衣壳蛋白或其片段、针对在循环中经历内在化的蛋白质的抗体、和靶向胞内定位并延长胞内半衰期的蛋白质。受体介导的胞吞作用的技术记载于例如Wu等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)262：4429-4432(1987)和Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)87：3410-3414(1990)。关于目前已知的基因标记和基因疗法方案的综述参见Anderson等，科学(Science)256：808-813(1992)。也参见WO 93/25673及其中引用的文献。

下述是本发明的方法和组合物的实例。应当理解考虑上文提供的一般描述可以实施多种其它实施方案。

实施例

实施例1：临床前MetMAb药物动力学(PK)和药效学(PD)

该实施例描述临床前药物动力学(PK)和功效数据确定关于c-met拮抗抗体MetMAb的临床剂量选择的应用。

材料和方法

PK研究。PK研究在小鼠、大鼠、和食蟹猴(cynomolgus monkeys)中进行。MetMAb在食蟹猴中结合c-met。MetMAb在小鼠和大鼠中不结合c-met。

对雌性裸鼠(nu/nu)(n＝3/时间点/组)给药3，10，或30mg/kg的单次静脉内(IV)MetMAb推注剂量和30mg/kg的腹膜内(IP)MetMAb剂量。对Sprague-Dawley大鼠(n＝6)给药30mg/kg的MetMAb单次IV推注剂量，并对食蟹猴(n＝4/组)给药0.5，3，10，或30mg/kg的MetMAb单次IV剂量。在不同时间点收集血清并利用以下所述的测定法来测定血清MetMAb浓度。

功效研究。进行了四种功效研究，以评估MetMAb功效的PK驱动子。

在剂量应答研究中，雌性裸(nu/nu)鼠(6-8周龄)皮下(SC)接种5x 10⁶个KP4人胰管细胞癌细胞。小鼠(n＝10/组)在肿瘤达到平均体积150-250mm³时，用0，1，3，7.5，15，30，60，或120mg/kg的MetMAb单次IV剂量来处理。

在剂量分级研究中，对KP4异种移植小鼠(n＝10/组)给药2.5mg/kg，7.5mg/kg，或30mg/kg的总MetMAb剂量，其分为每周一次(Q1W)，每两周一次(Q2W)，或Q3W方案。例如，30mg/kg总剂量作为10mg/kg Q1W，15mg/kg Q2W，或30mg/kg Q3W给药。

关于IV输注研究，MetMAb处理在平均KP4肿瘤体积为～300mm³时开始。动物接受0，1250或312.5ug/小鼠的MetMAb单次IV剂量，或接受17.36ug/小时，于20uL/hr或4.34ug/hr，于20uL/hr的1250或312.5ug/小鼠的MetMAb的IV输注到尾静脉中，持续3天，或接受7.44ug/hr，于20uL/hr或1.86ug/hr，于20uL/hr的1250或312.5ug/小鼠的MetMAb的IV输注到尾静脉中，持续7天。

由IV输注研究中的各组中所有小鼠收集一份血清样品，并利用下述测定法测定MetMAb血清浓度。基于非肿瘤携带小鼠的PK研究中确定的PK参数评估在血清样品收集时的预期血清浓度(上述)。非肿瘤携带小鼠中的MetMAb的血清分布是两阶段的，并表现出剂量-比例性。以下PK参数由针对剂量标准化、天然汇集观察数据的两区室模型拟合来计算：V₁＝48.8mL/kg，V₂＝90.7mL/kg，CL_t＝21.6mL/日/kg，CL_d＝190mL/日/kg，其中V₁是表观中心分布体积，V₂是表观外周分布体积，CL_t是总表观清除率，且CL_d是区室间清除率。使用这些PK参数，通过WinNonlin Enterprise版本5.0.1(Pharsight Corp.，Mountain View，CA)来评估IV输注研究中测试剂量的血清浓度。

人HGF转基因C3H-SCID小鼠(hu-HGF-Tg-SCID)(4-8周龄)(见USSN 61/044,438，2008年4月11日提交)SC接种0.5x 10⁶个NCI-H596人非小细胞肺癌(NSCLC)细胞。小鼠(n＝10/组)在肿瘤达到平均体积～120mm³时，用15，30，90，180，240，或360mg/kg的MetMAb单次IP注射来处理。对阳性对照组给药30mg/kg的MetMAb，每周两次。这项工作在Van Andel研究所[Grand Rapids，MI]中，按照它们的研究动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)的指导方针来完成。

在所有情形中，在整个研究过程中使用测径器来测定肿瘤。

小鼠血清和大鼠血清中MetMAb的药物动力学测定。开发两种ELISA法来量化MetMAb浓度。开发一种直接ELISA测定来量化小鼠血清和Sprague-Dawley大鼠血清中的MetMAb。平板包被以人c-Met-Fc融合蛋白，向其中加入样品、标准品、和给药溶液。使用山羊抗人F(Ab′)₂辣根过氧化物酶(HRP)来检测。加入四甲基联苯胺(Tetrapethyl benzidine)(TMB)过氧化物酶底物，以获得信号显色。使用磷酸终止底物反应。以450nm吸光度读板。关于裸鼠IV输注研究，使用用于测量食蟹猴PK样品(下述)的MetMAb的直接ELISA来测定小鼠血清，其具有下述改进：缓冲液标准曲线取代2％食蟹猴血清标准曲线，且最小样品稀释为1/1000。该测定中量化的下限是0.47ng/mL，且量化的上限是30ng/mL。关于裸鼠血清样品的最小稀释是1/10，这导致最小可量化浓度4.7ng/mL，其具有不确定的上限。关于大鼠血清样品的最小稀释是1/50，这导致最小可量化浓度23.5ng/mL，其具有不确定的上限。

关于食蟹猴血清中MetMAb的药物动力学测定。开发直接ELISA来量化食蟹猴血清中的MetMAb。平板包被以His标记的c-met胞外结构域片段，并将稀释的样品、标准品、和对照加入至包被的平板。加入F(Ab′)₂分段的，与HRP缀合的山羊抗人IgG Fc抗体，以进行测量。TMB过氧化物酶使用磷酸终止。以450nm和620/630nm的吸光度读板。

该测定的量化下限是1.0ng/ml且量化上限是32.0ng/ml。关于纯食蟹猴血清样品的最小稀释是1/50，这导致最小可量化浓度50ng/ml，其具有不确定的上限。

小鼠、大鼠和食蟹猴PK数据分析。利用额定(nominal)样品收集时间针对半对数图构建小组平均MetMAb血清浓度-时间特征曲线(Kaleidagraph版本3.6，Synergy Software，Reading PA，或Microsoft Excel 2003，Microsoft Corp.，Redmond WA)。PK参数利用WinNonlin Enterprise版本5.0.1(Pharsight Corp.，Mountain View，CA)来评估。使用对各组施用的额定剂量来建模。由于针对各组确定了小鼠的单浓度-时间特征曲线，所以获得各PK参数的一种评估，并与各PK参数拟合的标准误差(SE)一起报告。关于大鼠和猴，PK参数报告为平均值(+/- SD)。关于IV施用，使用具有IV推注输入和第一级消除的两区室消除模型来描述观察到的数据(WinNonlin模型7)。利用迭代再加权

和Nelder-Mead极小化算法来对浓度加权。使用下式计算模型7中随时间变化的浓度：

C(t)＝A·EXP(-α·t)+B·EXP(-β·t)

其中t＝以天数计的时间，A和B指各指数项的时间0时的截距，且α和β指关于A和B的指数系数。

以下PK参数利用模型7来报告：

t_1/2β＝与消除期相关的半衰期(β半衰期)

CL＝清除率

V₁＝中心区室的分布体积

V_ss＝稳态条件下的分布体积

关于各给药组，通过视觉检验关于各动物观察到的对比预测的血清浓度-时间特征曲线，检查加权剩余平方和，和关于各参数的检查标准误差(SE)和偏离系数(CV)，基于适合度，进行模型选择。

重复给药安全性研究。食蟹猴接受通过IV推注施用的13个每周一次的0，3，10，30，或100mg/kg MetMAb给药，12周(即13次给药)，以研究MetMAb的安全性和毒理动力学(toxocokinetics)。在最后一次每周一次的给药后，观察复原动物另外8周。

安全系数计算。安全系数作为在单次或重复给药安全性研究中观察到的最高非严重毒性剂量(HNSTD)与提议的I期起始剂量的比，关于剂量、AUC、C_max来计算。等式是：

安全系数(SF)_剂量＝剂量_cyno/剂量_人

SF_AUC＝AUC_cyno/AUC_人

SF_Cmax＝(C_max-Cyno)/(C_max-人)

体表面积计算：体重与表面积指数关于食蟹猴是12kg/m²，且关于人是37.5kg/m²。

评估人PK特征曲线。使用两种方法来预测人中的MetMAb PK分布，其基于在其他更小的物种(即，小鼠，大鼠，和食蟹猴)中观察到的数据。

一种方法是异速生长比例确定，其基于这样的假设，即许多物理和生理参数按照体重(BW)的数学函数变化

Y＝a x BWb

其中Y是目标变量，a是y轴截距，且b是斜率。

使用来自给药MetMAb单次IV推注剂量的小鼠、大鼠和食蟹猴的平均CL值，通过异速生长比例确定，来评估人的CL值。CL值对比体重、抑制、和R平方值的对数图通过KaleidaGraph(版本3.6)生成。

第二种方法是物种不变时间法(Gabrielsson，J和Weiner，D，药物动力学和药效学数据分析：概念和应用(Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Data Analysis：Concepts and Applications)，第3版，瑞典药物出版社(Swedish Pharmaceutical Press)，2000)。该方法需要使用″kallynochrons″将动物时间转化为人时间，″kallynochrons″是不同物种清除相同体积的血浆/千克BW²的药物动力学时间的单位。使用以下转化式来推论：

使用基于上式由食蟹猴获得的评估的人血清浓度-时间数据来评估关于人的预测群体PK参数。使用比例确定指数0.75来评估人CL和使用比例确定指数1来评估中心区室的体积(V₁)。关于CL的指数值0.75和关于V₁的1基于文献报告(Mahmoud I.J Pharm Sci(药物科学杂志)2004；93：177-85；Tabrizi等Drug Discov Today(今日药物发现)2006；11：81-8)。

结果

线性剂量范围内的MetMAb清除率(CL)在小鼠、大鼠和食蟹猴中分别为约22，19，和13mL/日/kg。在啮齿动物和食蟹猴中，MetMAb清除率是典型地关于二价糖基化抗体观察到的MetMAb清除率的2-3倍更快，所述二价糖基化抗体具有最小靶标-介导的清除率。小鼠、大鼠和食蟹猴中的MetMAb血清浓度-时间特征曲线显示在图3中，且平均PK参数显示在表1中。血清浓度-时间曲线下面积(AUC)和最大浓度(Cmax)与剂量范围3-30mg/kg处的剂量成比例增加。Beta半衰期范围是4-5天。

表1.MetMAb单次IV给药后的平均PK参数

CL＝清除率；V₁＝中心区室分布体积；Vss＝稳态分布体积

为了确定有效剂量20/50/80(ED_20/50/80)，进行单次剂量应答研究，以确定KP4自分泌异种移植模型中最小、中值和最大有效MetMAb剂量。图4显示该实验的结果。观察到最大有效MetMAb剂量大于或等于30mg/kg。

使用关于各MetMAb剂量的第21天的平均组肿瘤体积来生成效果vs.剂量特征曲线，显示在图5中。基于该特征曲线，将2.5，7.5和30mg/kg选为关于剂量分级研究的最小、中值、和最大有效剂量的代表。

如图6中所示，剂量分级研究证明关于不同剂量方案，处于相同剂量水平的功效相似。这些结果说明曲线下面积AUC是MetMAb功效的PK驱动子。给药时间表对测试的3种剂量水平的功效具有最小影响，这支持Q1W(每周一次)至Q3W(每三周一次)的临床给药方案。

为了验证AUC是MetMAb功效的关键驱动子，如材料和方法中所述地进行输注研究。该实验的结果显示在图7中。关于作为单次IV给药或IV输注施用于KP4胰腺肿瘤异种移植小鼠3天或7天的给定MetMAb剂量，AUC相似，但是高于最小有效血清浓度的C_max和时间不同。IV推注和IV输注MetMAb在KP4模型中，分别以1250ug/小鼠和312.5ug/小鼠剂量水平提供相似的功效。IV输注研究的结果支持这样的观察，即AUC是MetMAb功效的PK驱动子。肿瘤携带动物中观察到的MetMAb血清浓度与使用获自非肿瘤携带小鼠的PK参数预测的MetMAb血清浓度相似，并在该研究中验证了关于IV推注和IV输注组的预期的MetMAb暴露。

还使用MetMAb来治疗hu-HGF-Tg-SCID小鼠模型中的非小细胞肺癌(NSCLC)H596肿瘤。该实验的结果显示在图8中。与每周两次重复给药30mg/kg(三周内总共180mg/kg)相比较，在所有单次给药组中观察到类似的功效。因此，在旁分泌模型中，MetMAb剂量应答取决于总剂量，而非给药方案。在该实验中观察到的MetMAb剂量应答结果也支持以每周一次至每三周一次(Q1W-Q3W)的频率给药。

MetMAb清除率使用两种方法，即异速生长比例确定和物种不同时间来评估。利用异速生长比例确定在人中预测的MetMAb清除率是10mL/日/kg。利用物种不同时间在人中预测的MetMAb清除率和半衰期分别是6.0mL/日/kg和9天(表2)。

表2.通过物种不同时间法在人中预测的MetMAb清除率和半衰期

剂量(mg/kg)	清除率(mL/日/kg)	βHL(天)
			3	6.9	6.6
10	5.4	9.4
			30	5.6	11

βHL＝终端半衰期

良好的实验室实践毒理学研究确定100mg/kg是最高非严重毒性剂量。食蟹猴中的重复给药安全性研究为人I期中处于1mg/kg的起始IV剂量提供32-至115-倍安全性极限。

用于计算安全系数的人PK参数利用来自食蟹猴的PK数据来评估。单次给药和多次给药安全系数(表3)提供超过30倍的安全性极限，以支持人I期中处于1mg/kg的起始剂量。

表3.基于物种间MetMAb比例确定和体表面积计算的计划(planned)期Ia临床起始剂量的安全系数

AUC＝曲线下面积，C_max＝最大清除率

结论

MetMAb PK与使用二价糖基化抗体观察到的PK不同。在小鼠、大鼠和猴中单次IV推注给药后，MetMAb在3-30mg/kg剂量范围内表现出线性PK。MetMAb清除率是二价糖基化抗体的2-3倍更快，所述二价糖基化抗体具有有限的靶介导的清除率。

功效数据在临床设置中支持剂量灵活性。KP4自分泌异种移植模型中的剂量分级研究说明AUC是MetMAb功效的药物动力学驱动子，并且IV输注研究支持这样的观察。类似的功效在huHGF-Tg-SCID小鼠模型中的非小细胞肺癌肿瘤中观察到。

异速生长比例确定方法和物种不同时间方法预测MetMAb的清除率在临床设置中，应该在6.0-10mL/日/kg范围内。

食蟹猴中的重复给药安全性研究为基于单次给药的人中的1mg/kg的起始剂量提供32-至115-倍安全性极限，这已经被核准为临床安全的。

在该实施例以及在实施例2中所示的PK/PD建模方法总结的非临床PK和功效数据支持MetMAb临床剂量选择。

实施例2：利用临床前和临床数据预测临床MetMAb剂量方案

该实施例描述利用食蟹猴药物动力学(PK)和KP4异种移植小鼠抗肿瘤功效数据来预测目标应答的最小有效临床MetMAb剂量方案的建模和模拟分析的应用。

材料和方法

利用静脉内施用MetMAb(3.0，10.0，和30.0mg/kg；n＝9/组)的PK研究在非肿瘤携带小鼠中进行，以确定CL，V1，CLd，和V2PK参数：V₁＝48.8mL/kg，V₂＝90.7mL/kg，CL_t＝21.6mL/日/kg，CL_d＝190mL/日/kg，其中V₁是表观中心分布体积，V₂是表观外周分布体积，CL_t是总表观清除率，且CL_d是区室间清除率(实施例1)。使用这些PK参数评估值作为强制函数，从而在KP4异种移植小鼠中对肿瘤进展(PD)的药效学(PD)终点进行建模。

关于PD数据，对KP4异种移植小鼠(n＝10/组)给药单剂量IV MetMAb(1-120mg/kg)，如实施例1中所述。对另外的KP4异种移植小鼠(n＝10/组)给药总MetMAb剂量(2.5mg/kg，7.5mg/kg，和或30mg/kg)，其通过将给药剂量分为每周一次(Q1W)给药，每两周一次(Q2W)给药，和Q3W方案给药的方案来分级，如实施例1中所述。肿瘤测量通过使用测径器获得，并且肿瘤体积约200mm³的小鼠进入该研究。将直至21天的来自总共177只KP4小鼠的研究数据用于建模分析中。将肿瘤体积(mm³)转化为质量(mg)，假设1mm³＝1mg肿瘤组织。描述KP4异种移植小鼠中抗肿瘤功效的混合效果PK/药效学(PD)模型利用NONMEM软件(Double Precision，版本V，水平1.0UCSF，旧金山CA)，针对肿瘤数据来拟合。

为了在临床前预计人MetMAb血清浓度，对食蟹猴(n＝4/组)给药单次剂量IV MetMAb(0.5，3，10，和30mg/kg)，并绘制MetMAb浓度-时间曲线。利用食蟹猴数据(0.5，3，10，和30mg/kg MetMAb)的物种不同时间转化(见下式)，由食蟹猴浓度-时间曲线预计人MetMAb血清浓度：

其中H＝人且C＝食蟹猴

非线性混合效果模型针对预计的人PK数据来拟合。该人PK模型随后与确定的MetMAb暴露/抗肿瘤活性关系整合，从而以不同处理剂量方案模拟肿瘤应答(图9)。

Monte Carlo模拟，其利用人POP PK/PD模型结构、参数评估值和可变性，以由0-30mg/kg/wk开始的Q1W和Q3W MetMAb方案来进行，从而预计PK和肿瘤应答；1000个模拟/组。最小肿瘤稳定(Tumorostatic)浓度(MTC)，即产生肿瘤静止的MetMAb血清浓度，是肿瘤对药物灵敏性的测量值，并源自建模。MTC由描述肿瘤质量的不同等式计算，其中(dTM(t)/dt＝0)

0 = KGN \cdot (1 - \frac{IMax \cdot C (t)}{{IC}_{50} + C (t)}) \cdot TM (t)

1 = \frac{IMax \cdot MTC}{{IC}_{50} + MTC}

MTC = \frac{{IC}_{50}}{I \max - 1} = \frac{13.2 μg / mL}{1.86 - 1} = 15.3 μg / mL

\frac{dTM (t)}{dt} = KGN \cdot (1 - \frac{IMax \cdot C (t)}{{IC}_{50} + C (t)}) \cdot TM (t)

另外，无进展目标应答的暴露/靶标预测子，其为了本实验的目的定义为≤20％肿瘤质量增加，通过分类和回归树(CART)分析(JMP 5.1程序，SAS Institute，Cary NC)来确定。

结果

由建模结果，计算各MTC值(n＝177)并且中值MTC值是约15μg/mL；90％的MTC值低于110μg/mL。来自15mg/kg Q3W MetMAb模拟的25个代表性PK特征曲线和MTC值显示在图10中。相应的肿瘤质量模拟显示在图11中。

另外，无进展目标应答的暴露/靶标预测子，其为了本实验的目的定义为≤20％肿瘤质量增加，通过分类和回归树(CART)分析来确定。CART分析将曲线下面积/肿瘤稳定浓度(AUC/MTC)≥16确定为在第105天无进展应答(为了本实验的目的定义为≤20％肿瘤质量增加)的断点指示；注意到具有MetMAb AUC/MTC≥16的模拟肿瘤数据到第105天时没有进展(参见图11)。

最小肿瘤稳定浓度(MTC；肿瘤既不生长也不缩小时的MetMAb血清浓度)基于建模分析，对MetMAb进行评估，其数据来自利用KP4细胞系和按人比例确定的物种不变时间的临床前小鼠异种移植研究(实施例2)。预测该MetMAb血清浓度为15ug/mL。在I期试验(实施例3)中收集的药物动力学数据利用NONMEM V(Icon Development Solutions，Ellicott City，MD USA)来建模，从而生成PK评估值和围绕这些评估值的可变性。使用这些评估值和相关的可变性来模拟500名患者的特征曲线，从而预测处于不同剂量的稳态谷(steady-state trough)浓度。图15显示该分析的结果。15mg/kg Q3W的剂量显示出是这样的剂量和方案，其中稳态谷浓度在90％的模拟患者中大于MTC且其中获得AUC/MTC大于16。基于这些数据，将15mg/ml选为被推荐的II期剂量(也参见实施例3和4)。被推荐的II期剂量基于I期药物动力学分析，其目的是在90％患者中实现稳态谷浓度大于MTC。

在另一个分析中，对MetMAb Q3W剂量模拟时间比进展的Kaplan-Meier(KM)曲线。为了该实验的目的，时间比进展定义为一旦肿瘤增大超过基线＞20％时的模拟的肿瘤进展的时间。对MetMAb Q1W剂量计算类似的KM曲线。该分析中使用的比较器SOC的中值时间比进展为105天并且模拟关于该数据组的Kaplan Meier曲线。解释该模拟实验的重要假设是对该实验使用模拟的SOC数据组和选择危害比≤0.75。由Cox成比例危害建模，预计MetMAb剂量≥12.5mg/kg Q1W和≥20.0mg/kg Q3W导致无进展疾病的超过比较器SOC的显著改善(为了该实验的目的先验(priori)定义为危害比≤0.75)。

实施例3：关于静脉内施用于局部患有晚期或转移性实体瘤的患者的MetMAb，即针对受体c-met的单价拮抗抗体的安全性和药理学的I期非盲(open-label)剂量增加研究

该实施例描述MetMAb的I期非盲剂量递增和剂量延伸(expansion)研究，所述MetMAb通过IV输注每3周一次施用于患有晚期实体恶性肿瘤的患者，所述患有晚期实体恶性肿瘤是难以控制的或对其不存在护理标准。

研究设计。对该研究存在两个阶段，即剂量增加阶段和延伸阶段。剂量递增阶段设计用于评价每3周一次递送的MetMAb的安全性、耐受性、和药物动力学。该研究的剂量递增阶段的设计显示在图12中。

一旦确定了被推荐的II期剂量，另外的患者参加到延伸阶段中，从而更好地表征该剂量的安全性、耐受性、和药物动力学(PK)可变性。进行处于剂量15mg/kg的延伸，从而在最多15名患者中更好地评价MetMAb的安全性、耐受性、和PK特征。延伸阶段的剂量考虑观察到的毒性、耐受性、和药物暴露。安全性、PK、和PD评估与剂量递增阶段中的那些相同。

约27-45名患者参加到该两阶段研究中，21-36名在剂量递增阶段中，和6-12名在延伸阶段中。向患者提供每3周一次的持续MetMAb给药(最大16个周期或1年)，所述患者得到进行中的益处并不经受显著毒性。这提供重复给药的MetMAb的安全性和耐受性的评估。

研究目的。该研究的主要目的是评价MetMAb在以每3周一次递送时的安全性、耐受性、和药物动力学，从而确定MetMAb在以每3周一次递送时的MTD，和确定被推荐的II期剂量(RP2D)。次要目的是预先评估MetMAb的抗肿瘤活性，以及评估针对MetMAb的抗治疗抗体应答。试探性目的包括评估MetMAb血清浓度与除去的(shed)c-met和可以受MetMAb影响的其他潜在血清标记物的血清水平之间的药物动力学/药效学和安全性关系，以及评估HGF/c-met轴和/或肿瘤或基质细胞中的其他途径的成分的表达(例如，通过免疫组织化学或FISH)，从而评估与抗肿瘤活性的相关性。

结果测量。MetMAb的安全性和耐受性利用以下测量来评估：剂量限制性毒性(DLTs)的频率和性质；有害事件的性质、严重性、和关系(其根据国家癌症研究所有害事件公共术语标准(National Cancer Institute Common Terminology Criteria for Adverse Events)，v3.0来评级)；生命体征的变化；和临床实验室参数的变化。

以下PK参数源自施用后的MetMAb的血清浓度-时间特征曲线：血清总暴露(AUC)，C_max，清除率，分布体积(中心区室V_c和在稳态V_ss)，和半衰期(t_1/2β)。

评估以下活性结果测量：目标应答(其定义为最初记录后被验证为≥4周的完整或部分应答)；目标应答持续时间；和无进展存活。目标应答和疾病进展利用RECIST来确定。针对MetMAb的ATA应答源自ATA应答的频率和ATA阳性样品中ATA应答的特征。

收集给药前和给药后血清，以评价可以受Met信号传导抑制影响的药效学(PD)生物标记物。另外，为了试探性诊断评估，获得标本组织(archival tissue)。

患者选择标准。成年患者如果具有不可治愈的、局部晚期或转移性实体恶性肿瘤(已经未能对至少一种以前的方案应答或对其不存在标准治疗)、可通过RECIST测量或评价的疾病的历史记录，预期寿命≥12周，并且ECOG表现状态为0-2，则符合参与该研究的条件。

排除在外的受试者包括患有原发性CNS恶性肿瘤或未治疗的/活性CNS转移的受试者。

研究治疗。关于每名患者的MetMAb总剂量取决于剂量水平分配和第1周期第1天时，或第1周期第1天前14天内的患者体重。I期中测试的剂量水平是1mg/kg，4mg/kg，10mg/kg，20mg/kg，和30mg/kg。

MetMAb作为IV输注来施用。关于每名患者最先的两个MetMAb剂量经过90分钟(±10分钟)输注。减慢或中断经历与输注相关的症状的患者的MetMAb输注。在最先的两个剂量后，观察患者的发烧、寒冷、或其他与输注相关的症状90分钟。随后的MetMAb剂量经过30±10分钟(关于剂量水平＜10mg/kg)或60±10minutes(关于剂量水平≥10mg/kg或当待输注的最终体积是500mL时)来施用，其对于所有剂量水平具有至少60分钟的观察期。

MetMAb。MetMAb是已知的针对人c-met的重组、人源化、单价单克隆抗体。MetMAb作为处于单次使用50-cc管中的冻干粉末(400mg)来提供。所有研究药物保存在2C-8C，直至即将使用前。用于重建的溶液是注射用无菌水，并且重建体积是20.0mL，从而产生20mg/mL MetMAb的终浓度，其处于10mM组氨酸琥珀酸盐(histidine succinate)，106mM(4％)二水合海藻糖，0.02％聚山梨醇20，pH 5.7中。关于每名患者的MetMAb总剂量取决于剂量水平分配和患者体重。

结果

21名患者参加该研究的剂量递增阶段。患者人口统计显示在表4中。

表4.患者人口统计

^*包括化学治疗、放射治疗和靶向/生物学治疗

患者接受剂量范围为1mg/kg-30mg/kg的MetMAb(IV Q3W)，直至疾病进展。在这五组(1，4，10，20和30mg/kg)中的每一组中最少3名患者参加并观察其毒性。大多数患者在第5周期前进展；一名患者(黑素瘤)经过8个治疗周期具有稳定的疾病并且一名患者(胃的；20mg/kg组)具有目标完整应答并继续参与该研究。图13显示剂量递增阶段中关于每名患者的患者诊断、治疗组和施药周期。

研究药物的药物动力学通过在观察该研究过程中连续监测血清样品的MetMAb来确定。各药物动力学时间点处的MetMAb血清浓度对各剂量组中的所有患者取平均值。来自第一周期(21天)的结果显示在图14中。

MetMAb在剂量范围4-30mg/kg中显示线性药物动力学。1mg/kg剂量与其他剂量组相比，具有稍微更快的清除率。血清浓度在处于各剂量水平的患者之间相似，具有小于30％的个体间可变性。在线性范围内的MetMAb施用后，清除率范围为7.4-9.8mL/日/kg。消除率是标准二价抗体的约2.5倍更快，并通过来自临床前物种的数据的异速生长比例确定来充分预测。AUC和C_max随剂量成比例增加，进一步提示MetMAb的PK在该剂量范围内是线性的。MetMAb的半衰期是约10天。

最小肿瘤稳定浓度(MTC；肿瘤既不生长也不缩小时的MetMAb血清浓度)基于建模分析，对MetMAb进行评估，其利用的数据来自利用KP4细胞系和按人比例确定的物种不变时间的临床前小鼠异种移植研究(实施例2)。预测该MetMAb血清浓度为15ug/mL。在I期试验(实施例3)中收集的药物动力学数据利用NONMEM V(Icon Development Solutions，Ellicott City，MD USA)来建模，从而生成PK评估值和围绕这些评估值的可变性。使用这些评估值和相关的可变性来模拟500名患者的特征曲线，从而预测处于不同剂量的稳态谷浓度。图15显示该分析的结果。15mg/kgQ3W的剂量显示出是这样的剂量和方案，其中稳态谷浓度在90％的模拟患者中大于MTC且其中获得AUC/MTC大于16。基于这些数据，将15mg/ml选为被推荐的II期剂量(也参见实施例3和4)。被推荐的II期剂量基于I期药物动力学分析，其目的是在90％患者中实现稳态谷浓度大于MTC。

3级发热(pyrexia)的单次剂量限制性毒性(DLT)在4mg/kg时发生；直到最大施用剂量30mg/kg没有观察到其他DLTs。没有观察到药物相关的4级毒性。在20mg/kg时，观察到一种腹痛的3级毒性。最普遍报告的有害事件是疲劳(1级、2级)。表5显示在研究的剂量递增阶段过程中观察到的全部药物相关有害事件。

MetMAb在作为单一试剂以最高30mg/kg，每三周一次的剂量施用时，似乎是安全的并通常充分耐受。似乎没有由MetMAb引起的毒性是剂量相关的。

表5.全部药物相关有害事件

^*不存在4级事件

^**剂量限制性毒性(DLT)

为了确定由MetMAb处理引起的c-met抑制影响循环HGF水平，在处理时期内确定血清HGF水平。血清HGF水平利用ELISA来确定。图16显示该分析的结果。一般地，使用MetMAb处理，似乎存在很少或不存在HGF表达的增加。然而，两名表现出最高基线HGF表达水平的患者在药物处理后24h时显示出HGF表达的显著减少。关于患者12007，HGF表达在后继的周期中增加至基线水平。关于患者11009，HGF水平在药物处理后减少70％并在研究期间内保持在很低。循环HGF可以具有作为针对MetMAb治疗应答的生物标记物的效用。

为了确定由MetMAb处理引起的c-met抑制影响循环IL-8水平，在处理时期内确定血清IL-8水平。血清IL-8水平(以1∶5稀释)利用基于电化学发光的方法，如由生产商(Meso Scale Discovery，Gaithersburg MD；Cat.No.K111ANC)指导来确定。

该实验的结果显示在图17中。研究组中的基线IL-8表达由4-107pg/ml显著变化。处理(24h)后，具有高生理学IL-8水平(＞50pg/ml)的受试者表现出大于50％的循环IL-8的减少。在具有小于50pg/ml基线IL-8的受试者中，MetMAb处理后表达不显著改变。循环IL-8水平可以具有作为针对MetMAb处理应答的标记物的效用。

图18显示参与剂量递增阶段的全部患者的最佳肿瘤应答。一名患者没有被评估，因为该患者在第一评价时间点之前疾病进展；另一名患者的CT评价在收集这些数据时不存在。在20mg/kg组中的一名胃癌患者中观察到完整目标应答。稳定疾病的最佳应答在21名患者中的15名中观察到。三名患者具有进行性疾病。

患者11009是50岁女性胃腺癌患者，其在可测量疾病位点处具有转移性肝病灶。该患者在2007年4月诊断(T1N1M1，在胆囊上浆膜植入)并从2007年5月29日至2007年8月13日接受FOLFOX6。该患者的疾病在2007年8月22日进展，然后从2007年10月18日至2007年1月31日使用研究的治疗法对她进行治疗。该患者的疾病再次进展，并且她在2008年3月以在螺旋CT上具有7x11mm病灶的条件，参见到MetMAbI期研究中。在该试验中，该患者在她的第一次评价时具有稳定的疾病(2008年4月29日)和在2008年6月13日具有完整应答。该CT应答使用另一次CT(2008年7月)来验证。MRI成像显示在2008年9月不存在疾病迹象。该患者的肿瘤样品显示出胞内HGF染色(通过IHC分析)，这提示该患者的肿瘤具有自分泌生物学。

图19显示MetMAb治疗之前和之后患者11009的CT和MRI扫描。上图(L和R)是MetMAb治疗之前。下图(L和R)是验证完整应答的CT和MRI扫描。在超过4周后验证所有靶病灶的消失。

图20显示来自患者11009的标本肿瘤组织的免疫组织化学染色。进行用于检测c-met蛋白的免疫组织化学分析，其揭示该肿瘤样品中存在的肿瘤细胞中的中度膜和胞质c-Met表达和胞质和膜周HGF表达。

FISH分析针对来自患者11009的标本肿瘤样品进行。FISH分析揭示与染色体7对照相比，c-met基因的高多体性。

实施例4：用于确定与TARCEVA

(厄洛替尼(erlotinib))(OAM4558g)组合静脉内施用于患有非小细胞肺癌的患者的MetMAb，即针对受体c-met的单价拮抗抗体的安全性和活性的II期研究

肺癌保持为全世界癌症死亡主要原因之一；它在男性和女性中均是第二普遍的癌症，并占全部新癌症的约15％。在2008年中，估计存在约215,000个新肺癌病例并估计160,000个死亡。仅约15％的诊断患有肺癌的人5年后保持存活。NSCLC是两种主要肺癌类型之一，占全部肺癌病例的约85％。

该实施例提供使用抗c-met抗体和EGFR抑制剂的组合治疗NSCLC的方法，所述方法可以导致有意义的临床益处，通过向受试者施用有效剂量的抗c-met拮抗抗体和EGFR抑制剂实现。例如，在某些实施方案中，向受试者施用：(1)MetMAb，15mg/kg(例如，基于第1天时受试者的体重)，在21天周期的第1天；和(2)厄洛替尼，典型地口服施用，剂量为150mg，在21天周期的每一天。

在临床前动物模型中，使用MetMAb和厄洛替尼的组合处理，相对于使用MetMAb或厄洛替尼单独处理，导致肿瘤生长抑制和肿瘤进展的高度显著改善。参见共同拥有的同时待审美国专利公开号2009/0226443。

流程大纲。设计盲性、II期、随机化、多通道试验，以在NSCLC中评价使用MetMAb加厄洛替尼对比厄洛替尼加安慰剂处理的初级活性和安全性。

目标。该研究的主要目标是在具有Met阳性肿瘤的患者(如通过免疫组织化学确定地)，以及所有患者(即包括具有Met阴性肿瘤的患者)中相对于厄洛替尼加安慰剂，评价MetMAb加厄洛替尼的无进展存活(PFS)。

该研究的次要目标是：(a)为了确定具有c-met阳性肿瘤的患者，以及全部患者中的总RECIST应答速率和应答持续时间；(b)为了表征患有NSCLC的患者中的MetMAb加厄洛替尼的安全性和耐受性；和(c)为了评价患有NSCLC的患者中的MetMAb和厄洛替尼二者的最小浓度(Cmin)和最大浓度(Cmax)。

本研究的另外的目标是(a)为了评价在具有c-met阳性肿瘤的患者，以及全部肿瘤的患者中的总存活；(b)为了评价由处理组引起的和在具有c-met阳性肿瘤的患者，以及全部肿瘤的患者中的FDG-PET应答速率；(c)为了评价由处理组引起的和在Met阳性肿瘤，以及全部肿瘤的FDG-PET应答者对比非应答者中的无进展存活(PFS)；(d)为了评价实体瘤应答评价标准之间的关系(在第一肿瘤评估时的RECIST应答和PFS；(e)为了评价与HGF/Met和/或EGFR信号传导途径相关的生物标记物(包括但不仅限于IL8和血清HGF)的应答和变化(或基线表达)之间的关系；(f)为了评价进展的患者中针对研究的抗性的潜在机制；和(g)为了评价在具有c-met阳性肿瘤的患者，以及全部肿瘤的患者中的直至进展时间。

研究设计。该研究是II期、双盲、随机化、多通道试验，其设计用于评价在第二系和第三系NSCLC中使用MetMAb加厄洛替尼对比厄洛替尼加安慰剂处理的初级活性和安全性。来自约60个位点的约120名患者以1∶1的比例随机化到两个处理组之一中：MetMAb加厄洛替尼vs.厄洛替尼加安慰剂。随机化通过吸烟状态(非吸烟者和戒烟超过10年的吸烟者对比当前的吸烟者和戒烟少于10年的吸烟者)、表现状态和病史(鳞状，非鳞状，不另外指明)来满足。各组中的处理持续直至达到疾病的进展、不受欢迎的毒性、或任何其他终止标准。当疾病进展时，对随机化至厄洛替尼加安慰剂组中的患者提供接受MetMAb(除持续厄洛替尼以外)的选项，条件是它们继续达到符合条件的标准。为了产生假说的目的，总结由该交叉收集的安全性数据。

在该研究过程中，收集关于肿瘤测量和存在状态的数据，以评价PFS、总存活(OS)和总应答速率(ORR)。CT扫描在基线处和关于以约每六周一次的时间间隔(即每两个三周的MetMAb/安慰剂周期)的前4个周期获得。4个周期后，约每9周(每3个MetMAb/安慰剂周期)进行常规CT扫描。FDG-PET成像在基线处和在第1周期的第10-14天获得。当随机化60名患者并对它们进行12周跟踪后，进行过渡分析，以确定总活性。基于该过渡分析的结果，该研究可以改进为富含特异性NSCLC亚型或可以终止一些评估。

在一些患者中，收集试探性血清和血浆样品，以确定MetMAb加厄洛替尼对活性的潜在标记物，包括但不仅限于IL-8和HGF的循环水平的影响。使这些和其他标记物与临床结果相关联有助于确定预测性生物标记物，例如循环中可以反映药物活性或针对治疗的应答的标记物。关于血清和血浆的血液在预先指定的时刻由同意的患者中抽出，并评价这些试探性标记物的水平。

c-met和/或EGFR的表达在肿瘤的预处理样品中确定。c-met和/或EGFR表达通过IHC和/或FISH分析来确定。

因为在用EGFR-定向的治疗处理时东亚人的充分确定的存活益处，所以该研究应该不容许超过20％的可评价研究群体为东亚人。

结果测量。该研究的主要结果测量是最后处理的30天内，由实体瘤应答评价标准(RECIST)定义的无进展存活(PFS)和由任何原因引起的死亡。

关于该研究的次要结果测量如下：

(a)如利用RECIST在Met阳性肿瘤和全部中确定的总应答(OR)(部分应答加完整应答)；和

(b)OR的持续时间。

试探性结果测量包括以下：

(a)FDG-PET应答速率，其基于欧洲癌症研究机构(European Organization for Research of Cancer(EORTC))的定义确定；

(b)监测有害事件和严重有害事件的发生率、性质和严重性，和生命体征变化，身体发现，和研究药物施用过程中和之后的临床实验室结果；和

(c)总存活(在具有c-met阳性肿瘤的患者和全部肿瘤的患者中由随机化直至由任何原因引起的死亡的时间)。

收集血清样品，从而分析MetMAb和厄洛替尼药物动力学和药效学。

患者选择标准。成年患者如果具有不宜动手术的、局部晚期或转移性(IIIb/IV期)NSCLC(例如，如通过组织学研究确定地)并接受至少一种，但不超过两种先前的关于IIIb/IV期NSCLC疾病的方案，则符合参与该研究的条件。在该研究中，癌症分期遵从美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer)的AJCC癌症分期手册(AJCC Cancer Staging Manual)。在其一线方案(关于IIIb/IV期)前接受关于I-IIIa期疾病的新辅助治疗和/或辅助治疗的患者符合研究参与的条件，条件是它们还接受关于IIIb/IV期疾病的一线治疗。在一些实施方案中，至少一种包含化学治疗的方案(关于任何期)必须基于铂。患者必须患有可测量的疾病，如通过RECIST确定的。在一些实施方案中，患者必须在处理前FDG-PET扫描上具有至少一个可测量的病灶，所述病灶也是根据RECIST的CT上的靶病灶。在一些实施方案中，患者必须提供处理前肿瘤样本，并在处理前FDG-PET扫描上具有至少一个可测量的病灶，所述病灶也是根据RECIST的CT上的靶病灶。

在一些实施方案中，被排除的受试者是已经进行超过两个先前的关于IIIB/IV期的治疗的受试者。在一些实施方案中，被排除的受试者包括暴露于处于研究中的或市售的可以通过EGFR抑制起作用的试剂，或暴露于导致剂量改变的已知EGFR相关毒性超过30天的受试者。EGFR抑制剂包括(但不仅限于)吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼、和西妥昔单抗(cetuximab)。在一些实施方案中，被排除的受试者包括在随机化前28天内已经接受化学治疗，生物治疗，放射治疗或处于研究的药物的受试者(除了可以在随机化前两周内使用激酶抑制剂以外，条件是任何药物相关毒性已经充分解决)，受试者，或具有未处理和/或活性的(进展或需要抗惊厥药或皮质类固醇，以用于症状控制)CNS转移的受试者。在一些实施方案中，具有脑转移病史的受试者可以符合研究参与的条件，条件是它们达到以下标准：(a)CNS外的可测量的疾病，如通过RECIST定义的；(b)完成CNS定向的治疗和筛选X光照片研究之间无过渡进展的X光照片证据；(c)CNS定向的治疗，其可以包括神经外科或立体定位性放射外科手术；(d)筛选CNSX光照片研究由放射性治疗完成开始≥4周和由抗惊厥药和皮质类固醇终止开始≥2周；(e)放射性治疗和立体定位性放射外科手术必须在第1天前≥4周完成；和(f)神经外科手术必须在第1天前≥24周完成；且脑活检术必须在第1天前≥12周完成。

在一些实施方案中，被排除的受试者还包括这样的患者，所述患者具有在随机化前最后6个月内严重全身性疾病，包括心肌梗死病史，不受控的高血压(药物处理时血压＞150/100mmHg)，不稳定的心绞痛，纽约心脏协会(New York Heart Association(NYHA))II级或更高级充血性心力衰竭，需要药物处理的不稳定的症状性心律失常(arrhythmia)(患有慢性房性心律失常(atrial arrhythmia)，即心房颤动(atrial fibrillation)或阵发性室上性心动过速(paroxysmal supraventricular tachycardia)的患者是符合条件的)，或II级或更高级外周血管病(peripheral vascular disease)；不受控的糖尿病(如通过禁食血清葡萄糖水平＞200mg/dL证明的)；随机化前28天内的主要手术程序或显著外伤损伤；预期在研究过程中需要主要手术；在随机化前7或14天内的局部治标性放射性治疗或来自放射性治疗的持久的有害影响(尚未在随机化前对II级或更低级解决了)；不能进行口服药物处理或需要IV营养或具有脂质的总肠胃外营养，或先前的手术程序影响胃与肠的吸收。在一些实施方案中，被排除的受试者包括在RBC输液后具有任一以下异常血液值(随机化前2周内)的受试者：ANC＜1,500细胞/μL，血小板计数＜100,000细胞/μL，血红蛋白＜9.0g/dL。其他基线实验室值(随机化前2周内)，血清胆红素＞1.5xULN，血清肌酸酐＞1.5xULN，不受控的高钙血症(＞11.5mg/dL或＞1.5离子化钙)。在一些实施方案中，被排除的受试者包括具有不受控的糖尿病的受试者和具有需要连续使用二碳磷酸盐治疗的症状性高钙血症的受试者。

在一些实施方案中，被排除的受试者包括怀孕或哺乳女性；具有在随机化前5年内已经经历推定的手术治疗的其他恶性肿瘤(即，子宫颈子宫上皮内癌，前列腺切除术后的局部化前列腺癌，或皮肤的基底细胞癌/鳞状细胞癌)的受试者可以用医学监视器讨论；或证明具有混乱或定向障碍，或具有主要精神病学疾病病史。还参见关于厄洛替尼标记的另外的排除。

试验药物。MetMAb是已知的针对c-met的重组、人源化、单价单克隆抗体。MetMAb作为处于单次使用15-cc管中的无菌液体来提供。各管装有10ml浓度为60mg/ml的600mg MetMAb，其处于10mM组氨酸乙酸盐(histidine acetate)，120nM海藻糖，0.02％聚山梨醇20，pH 5.4中。MetMAb管冷藏在2C-8C，并保持冷藏直至即将使用前。在正常盐水(0.9％)中稀释后，静脉内施用MetMAb。

厄洛替尼(TARCEVA

)作为常规立即释放片剂提供，所述片剂含有作为盐酸盐的厄洛替尼。除活性成分厄洛替尼外，片剂含有乳糖(含水的)、微晶纤维素、淀粉羟乙酸钠、十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁。可获得含有25mg，100mg和150mg厄洛替尼的片剂。

安慰剂由250cc 0.9％NSS(盐水IV溶液，0.9％)组成。

研究处理。MetMAb的剂量是在3周周期的第1天静脉内15mg/kg。使用筛选时的体重确定MetMAb的精确剂量。厄洛替尼的剂量是3周周期的每一天口服150mg。厄洛替尼的剂量水平可以降低至100mg(第一次降低)或50mg(第二次降低)，这归因于可能由厄洛替尼引起的毒性(例如，皮疹、腹泻)。

结果

向患有非小细胞癌的受试者施用(1)MetMAb，15mg/kg(例如，基于第1天时或筛选时的受试者体重)，在21天周期的第1天；和(2)厄洛替尼，典型口服施用，以150mg的剂量，在21天周期的每一天，延长时间至疾病进展(TTP)和/或无进展存活，和存活。

实施例5：利用c-met拮抗抗体治疗成胶质细胞瘤(glioblastoma)

该实施例提供使用抗c-met抗体治疗成胶质细胞瘤的方法，所述方法可以导致临床有意义的益处，通过向受试者施用有效剂量的抗c-met拮抗抗体实现。例如，在某些实施方案中，向受试者施用：MetMAb，15mg/kg(例如，基于第1天时受试者的体重)，在21天周期的第1天。在某些实施方案中，MetMAb与标准护理和/或其他批准的治疗组合施用。

实施例6：利用c-met拮抗抗体治疗胰腺癌

该实施例提供使用抗c-met抗体治疗胰腺癌的方法，所述方法可以导致临床有意义的益处，通过向受试者施用有效剂量的抗c-met拮抗抗体实现。例如，在某些实施方案中，向受试者施用：MetMAb，15mg/kg(例如，基于第1天时受试者的体重)，在21天周期的第1天。在某些实施方案中，MetMAb与标准护理和/或其他批准的治疗组合施用。

实施例7：利用c-met拮抗抗体治疗肉瘤(sarcoma)

该实施例提供使用抗c-met抗体治疗肌肉瘤(myosarcoma)的方法，所述方法可以导致临床有意义的益处，通过向受试者施用有效剂量的抗c-met拮抗抗体实现。例如，在某些实施方案中，向受试者施用：MetMAb，15mg/kg(例如，基于第1天时受试者的体重)，在21天周期的第1天。在某些实施方案中，MetMAb与标准护理和/或其他批准的治疗组合施用。

实施例8：利用c-met拮抗抗体治疗肾细胞癌(renal cell carcinoma)

该实施例提供使用抗c-met抗体治疗肾细胞癌的方法，所述方法可以导致临床有意义的益处，通过向受试者施用有效剂量的抗c-met拮抗抗体实现。例如，在某些实施方案中，向受试者施用：MetMAb，15mg/kg(例如，基于第1天时受试者的体重)，在21天周期的第1天。在某些实施方案中，MetMAb与标准护理和/或其他批准的治疗组合施用。

实施例9：利用c-met拮抗抗体治疗胃癌

该实施例提供使用抗c-met抗体治疗胃癌的方法，所述方法可以导致临床有意义的益处，通过向受试者施用有效剂量的抗c-met拮抗抗体实现。例如，在某些实施方案中，向受试者施用：MetMAb，15mg/kg(例如，基于第1天时受试者的体重)，在21天周期的第1天。在某些实施方案中，MetMAb与标准护理和/或其他批准的治疗组合施用。

实施例10：利用c-met拮抗抗体治疗结肠直肠癌

该实施例提供使用抗c-met抗体治疗结肠直肠癌的方法，所述方法可以导致临床有意义的益处，通过向受试者施用有效剂量的抗c-met拮抗抗体实现。例如，在某些实施方案中，向受试者施用：MetMAb，15mg/kg(例如，基于第1天时受试者的体重)，在21天周期的第1天。在某些实施方案中，MetMAb与标准护理和/或其他批准的治疗组合施用。

实施例11：利用c-met拮抗抗体治疗乳腺癌

该实施例提供使用抗c-met抗体治疗乳腺癌的方法，所述方法可以导致临床有意义的益处，通过向受试者施用有效剂量的抗c-met拮抗抗体实现。例如，在某些实施方案中，向受试者施用：MetMAb，15mg/kg(例如，基于第1天时受试者的体重)，在21天周期的第1天。在某些实施方案中，MetMAb与标准护理和/或其他批准的治疗组合施用。

尽管前述本发明已经为了清楚理解的目的，通过图示和举例的方式详细描述，但是不应该将说明书和实施例解释为限制本发明的范围。

Claims

1.治疗受试者中癌症的方法，包括向该受试者以每三周大约15mg/kg的剂量施用抗-c-met抗体。

2.治疗受试者中癌症的方法，包括向该受试者施用(a)每三周大约15mg/kg的剂量的抗-c-met抗体；和(b)EGFR拮抗剂。

3.权利要求1或2的方法，其中该抗体包含单抗原结合臂并包含Fc区，其中该Fc区包含第一和第二Fc多肽，其中第一和第二Fc多肽存在于复合物中并形成Fc区，与包含所述抗原结合臂的Fab分子相比较而言，该Fc区增加了所述抗体片段的稳定性。

4.前述权利要求任一项的方法，其中该抗体包含(a)第一多肽，其包含具有下述序列的重链可变结构域：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYAYPWTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：11)，和CL1序列；和(c)第三多肽，其包含第二Fc多肽，其中重链可变结构域和轻链可变结构域以复合物存在并形成单抗原结合臂，其中第一和第二Fc多肽存在于复合物中并形成Fc区，与包含所述抗原结合臂的Fab分子相比较而言，该Fc区增加了所述抗体片段的稳定性。

5.权利要求4的方法，其中第一多肽包含图1中所描述的Fc序列(SEQ ID NO：12)并且第二多肽包含图2中所描述的Fc序列(SEQ ID NO：13)。

6.权利要求4的方法，其中第一多肽包含图2中所描述的Fc序列(SEQ ID NO：13)并且第二多肽包含图1中所描述的Fc序列(SEQ ID NO：12)。

7.权利要求1-6中任意一项的方法，其中该抗体是MetMAb。

8.权利要求2-7中任一项所述的方法，其中根据通过引用合并入本文的US 5,757,498，所述EGFR拮抗剂具有通式I：

其中：

m为1、2或3；

或每个R¹独立地选自-NHSO₂R⁵、苯二甲酰亚氨基-(C₁-C₄)-烷基磺酰基氨基，苯甲酰氨基、苯磺酰基氨基、3-苯基脲基、2-氧代吡咯烷-1-基、2，5-二氧代吡咯烷-1-基、和R¹⁰-(C₂-C₄)-烷酰基氨基，其中R¹⁰选自卤素、-OR⁶、C₂-C₄烷酰基氧基、-C(O)R⁷和-NR⁶R⁶；且其中所述-NHSO₂R⁵、苯二甲酰亚氨基-(C₁-C₄)-烷基磺酰基氨基、苯甲酰氨基、苯磺酰基氨基、3-苯基脲基、2-氧代吡咯烷-1-基、2，5-二氧代吡咯烷-1-基，和R¹⁰-(C₂-C₄)-烷酰基氨基R¹基团任选地被1个或2个取代基取代，所述取代基独立地选自卤素、C₁-C₄烷基、氰基、甲磺酰基和C₁-C₄烷氧基；

9.权利要求8所述的方法，其中所述EGFR拮抗剂是根据式I的化合物，其选自由下列各项组成的组：

10.权利要求8所述的方法，其中所述式I的EGFR拮抗剂是N-(3-乙炔基苯基)-6，7-二(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺。

11.权利要求8所述的方法，其中所述EGFR拮抗剂N-(3-乙炔基苯基)-6，7-二(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺为盐酸盐的形式。

12.权利要求8所述的方法，其中所述EGFR拮抗剂N-(3-乙炔基苯基)-6，7-二(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺为基本上均相的晶体多晶形物形式，其显示具有在大约6.26，12.48，13.39，16.96，20.20，21.10，22.98，24.46，25.14和26.91以2-θ度数表示的特征峰的X-射线粉末衍射图。

13.权利要求8所述的方法，其中所述EGFR拮抗剂为4-(3′-氯-4′-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉基丙氧基)喹唑啉。

14.权利要求8所述的方法，其中所述EGFR拮抗剂为N-[3-氯-4-[(3-氟苯基)甲氧基]苯基]-6-[5-[[[2-(甲磺酰基)乙基]氨基]甲基]-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺。

15.权利要求8所述的方法，其中所述EGFR拮抗剂为4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉。

16.权利要求1-15中任意一项的方法，其中该癌症选自由下述各项组成的组：非小细胞肺癌、肾细胞癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、食管癌、间皮瘤、黑素瘤、乳腺癌、甲状腺癌、结肠直肠癌、头和颈癌、骨肉瘤、前列腺癌、或成胶质细胞瘤。

17.权利要求16的方法，其中该癌症是非小细胞肺癌。

18.权利要求1或2的方法，其中该抗-cmet抗体是MetMAb，该EGFR拮抗剂是N-(3-乙炔基苯基)-6，7-二(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺并且该癌症是非小细胞肺癌，其中该EGFR拮抗剂以三周的周期每天150mg的剂量施用。

19.权利要求1-18中任意一项的方法，还包括向该受试者施用第三种治疗剂。

20.权利要求19的方法，其中该第三种治疗剂选自由下述各项组成的组：化疗剂、VEGF拮抗剂、抗代谢化合物、针对肿瘤相关抗原的抗体、抗激素化合物、保心药、细胞因子、抗血管发生剂、酪氨酸激酶抑制剂、COX抑制剂、非甾体抗炎药、法尼基转移酶抑制剂、结合癌胚蛋白CA 125的抗体、Raf或ras抑制剂、多柔比星脂质体、托泊替康、紫杉烷、双酪氨酸激酶抑制剂、TLK286、EMD-7200、治疗恶心的药物、预防或治疗皮疹的药物或标准痤疮疗法、治疗或预防腹泻的药物、降低体温的药物、和造血生长因子。

21.权利要求20的方法，其中该第三种治疗剂是VEGF拮抗剂。

22.权利要求21的方法，其中该VEGF拮抗剂是贝伐单抗。

23.权利要求1-22中任意一项的方法，其中该受试者的癌症显示c-met和/或EGFR表达、扩增或激活。

24.权利要求1-23中任意一项的方法，其中来自于该受试者的血清显示高水平的IL8表达。

25.评价正在进行癌症治疗的患者的方法，该方法包括：基于来自于该患者的生物学样品(例如血清)中的IL8的表达与治疗前采集的该患者生物学样品中IL8的表达的比较预测该患者的癌症预后，其中正在进行治疗的患者血清中IL8的表达相对于治疗前样品中表达而言降低对该患者的癌症是预后性的。

26.评价患有或怀疑患有癌症的患者的方法，该方法包括：基于来自于该患者生物学样品中的IL8的表达与对照样品中IL8的表达的比较预测该患者癌症的预后；其中该患者生物学样品中相对于对照样品中的IL8的表达对该患者的癌症是预后性的。