CN104977416B - 用于预测抗c-met抗体的效果的生物标志物 - Google Patents

用于预测抗c-met抗体的效果的生物标志物 Download PDF

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Abstract

提供了预测抗c‑Met抗体的效果和/或为抗c‑Met抗体应用选择受试者的方法，其包括测量生物学样品中生物标志物的水平。

Description

用于预测抗C-MET抗体的效果的生物标志物
对相关申请的交叉引用
本申请要求在2014年4月3日韩国知识产权局提交的韩国专利申请No.10-2014-0040146的权益，其全部内容在此通过提及并入。
发明背景
1.发明领域
提供了用于预测抗c-Met抗体的效果和/或为抗c-Met抗体应用选择受试者的生物标志物，用于比较基因表达水平的参照(或对照)标志物，预测抗c-Met抗体的效果和/或为抗c-Met抗体应用选择受试者的方法(该方法包括测量生物学样品中的生物标志物的水平)，以及预测和/或治疗癌症的方法(该方法包括对选择的受试者施用抗c-Met抗体)。
2.相关技术的描述
在美国食品药物管理局(U.S.Food&Drug Association,FDA)批准赫赛汀(Herceptin)(一种由Genentech Inc.生产的靶向药物)后，已经开发出各种个体疗法和用于选择可适用受试者的标志物。在赫赛汀的情况中，适合于应用的受试者可以经由癌细胞的细胞膜上表达的HER2生长因子受体的表达量选择。在开发出IHC(免疫组织化学)测定法后，已经采用多种测定法，诸如FISH(荧光原位杂交)，CISH(生色原位杂交)等来选择合适的受试者。此后，FDA已经批准EGFR突变作为用于厄洛替尼(Erlotinib)应用的受试者(肺和胰腺癌患者)的选择标志物，KRAS突变作为用于Vectibix和Erbitux应用的受试者(结肠直肠癌)的选择标志物，等等。
对于靶向c-Met蛋白的抗癌剂，已经研究了针对c-Met靶向剂可以充分展现其效果的受试者的标志物。目前，c-Met靶向剂MetMab是一项III期临床试验的主题，其中ventanaIHC测定法(sp44：c-met一抗，兔单克隆)已经用作用于选择合适的受试者的共诊断方法。然而，此类诊断方法由于较低的准确性在其作为通用诊断的用途方面是受限的。另外，此类IHC测定法具有如下的 弱点，即结果取决于个体特性、损伤、病理学家的倾向，等等。
为了提高c-Met靶向性抗癌剂的效果，需要开发用于预测靶向性抗癌剂的效果或选择适合于靶向性抗癌剂应用的受试者的生物标志物。
发明概述
一个实施方案提供了用于预测抗c-Met抗体对受试者的影响或为抗c-Met抗体应用(例如，抗c-Met抗体的施用或治疗)选择受试者的生物标志物。
另一个实施方案提供了用于预测抗c-Met抗体对受试者的影响或为抗c-Met抗体应用选择受试者的组合物和试剂盒，其包含用于检测生物标志物的分子或试剂。
另一个实施方案提供了组合物用于预测抗c-Met抗体对受试者的影响或为抗c-Met抗体应用选择受试者的用途，其中所述组合物包含用于检测生物标志物的分子或试剂。
另一个实施方案提供了用于比较生物标志物的水平的参照(或对照)标志物，从而用于预测抗c-Met抗体对受试者的影响或为抗c-Met抗体应用选择受试者。
另一个实施方案提供了预测抗c-Met抗体对受试者的影响或为抗c-Met抗体应用(例如，抗c-Met抗体的施用或治疗)选择受试者的方法，其包括测定来自受试者的生物学样品中生物标志物的存在和/或水平(例如生物标志物的存在和/或量)。在一个实施方案中，所述方法包括测定来自受试者的生物学样品中生物标志物的表达水平，并比较所述生物标志物的水平与参照标志物的水平，其中生物标志物是选自下组的至少一种：THSD7A，MET，RAB31，FAM126A，PHC1，CHML，ST8SIA4，和CAV1，且参照标志物是选自下组的至少一种：EEF1A1，RPL23A，TPT1，HUWE1，MATR3，SRSF3，HNRNPC，SMARCA4，WDR90，和TUT1；并确定所述抗c-Met抗体或其抗原的施用在如下情况时对受试者会具有效果或是合适的：在CAV1，FAM126A，MET，RAB31，ST8SIA4，和/或THSD7A的情况中，所述生物标志物的水平高于所述参照标志物的水平；和/或在CMHL和/或PHC1的情况中，所述生物标志物的水平低于所述参照标志物的水平。
另一个实施方案提供了生物标志物用于预测抗c-Met抗体对受试者的影响或为抗c-Met抗体应用(例如，抗c-Met抗体的施用或治疗)选择受试者的用 途。
另一个实施方案提供了预防和/或治疗癌症的方法，其包括对选择的受试者施用抗c-Met抗体。
又一个实施方案提供了c-Met抑制的方法，其包括对选择的受试者施用抗c-Met抗体。
附图简述
图1A包括通过Ventana MET IHC测定法对小鼠异种移植物模型获得的图像。
图1B的图显示了通过RT-PCR获得的相对Ct值，其指示哪个模型是非响应(非效力)组或响应(效力)组(Y轴：相对Ct值，X轴：IHC得分，◆：非响应(非效力)组，●：响应(效力)组)。
图2A的图显示了参照标志物(对照基因)和生物标志物(标志物候选物)的表达水平。
图2B的图显示了内部参照标志物(对照基因)的表达水平。
图3A的图显示了使用特定引物测量的内部参照标志物(对照基因)的表达水平。
图3B的图显示了使用特定引物测量的选择的参照标志物(对照基因)的表达水平。
发明详述
比较抗c-Met抗体具有效果的组(下文为响应或效力组)或抗c-Met抗体没有效果的组(下文为非响应或非效力组)中的基因的表达水平，并且选择在响应组和非响应组之间显示较大的表达水平差异的基因。提出选择的基因或由该基因编码的蛋白质为用于预测c-Met抗体效果的生物标志物。另外，选择在相同细胞系的不同细胞或个别细胞间显示较小的表达水平差异或不显示表达水平差异的基因，并且提出选择的基因或由该基因编码的蛋白质为用于比较靶基因和/或靶蛋白的表达水平的参照或对照标志物。
一个实施方案提供了至少一种基因作为生物标志物用于预测抗c-Met抗体对受试者的影响或为抗c-Met抗体应用选择受试者的用途，所述基因在抗c-Met抗体的响应组和非响应组之间显示表达水平差异。
在一个实施方案中，生物标志物可以是选自下组的至少一种：THSD7A，MET，RAB31，FAM126A，PHC1，CHML，ST8SIA4，和CAV1。生物标志物可以是选自下组的至少一种：上文描述的基因的全长(整个)DNA，cDNA，和mRNA和由基因编码的蛋白质。下文表1汇总了可用作生物标志物的基因的信息：
【表1】
生物标志物可以从在表达水平上显示较大差异的基因到显示不太大的差异的基因以下降次序如下排列：THSD7A>MET>RAB31>FAM126A>PHC1>CHML>ST8SIA4>CAV1。为了实施更准确的效果预测或可适用受试者的选择，在基因间，可以更优先选择显示较大表达水平差异的基因用作生物标志物。因此，在一个实施方案中，生物标志物可以包含如上优先选择的基因或在优先选择的基因外，进一步包含选自剩余基因的至少一种。
在一个实施方案中，生物标志物可以包含：
1)THSD7A；
2)THSD7A和选自下组的至少一种的组合：MET，RAB31，FAM126A，PHC1，CHML，ST8SIA4，和CAV1；
3)MET；
4)MET和选自下组的至少一种的组合：THSD7A，RAB31，FAM126A，PHC1，CHML，ST8SIA4，和CAV1；
5)THSD7A和MET的组合；
6)i)THSD7A和MET的组合(THSD7A+MET)和ii)选自由RAB31，FAM126A，PHC1，CHML，ST8SIA4，和CAV1组成的组的至少一种的组合；
7)RAB31；
8)RAB31和选自下组的至少一种的组合：THSD7A，MET，FAM126A，PHC1，CHML，ST8SIA4，和CAV1；
9)选自下组的至少两种：THSD7A，MET，和RAB31(其中可以排除THSD7A和MET的组合)；
10)i)选自由THSD7A，MET，和RAB31组成的组的至少两种和ii)选自由FAM126A，PHC1，CHML，ST8SIA4，和CAV1组成的组的至少一种的组合；
11)FAM126A；
12)FAM126A和选自下组的至少一种的组合：THSD7A，MET，RAB31，PHC1，CHML，ST8SIA4，和CAV1；
13)选自下组的至少两种：THSD7A，MET，RAB31和FAM126A(其中可以排除选自下组的至少两种：THSD7A，MET，和RAB31)；或
14)i)选自由THSD7A，MET，RAB31和FAM126A组成的组的至少两种和ii)选自由PHC1，CHML，ST8SIA4，和CAV1组成的组的至少一种的组合。
在另一个实施方案中，找到了在不同类型的细胞种类或相同细胞种类的个别细胞间在表达水平上显示略微差异或不显示差异的基因。该基因可以用作参照(或对照)标志物以用于将靶基因的表达水平与参照(或对照)比较。靶基因可以是测量其表达水平的任何基因。例如，靶基因可以是选择用于预测抗c-Met抗体对受试者的影响或为抗c-Met抗体应用选择受试者的生物标志物。在此情况中，参照标志物可以在预测抗c-Met抗体对受试者的影响或为抗c-Met抗体应用选择受试者中用作参照以比较靶基因的表达水平。
在测量靶基因的表达水平中，若作为参照用于比较的基因的表达水平随细胞种类或相同细胞种类的个别细胞而改变，则不能实现靶基因的表达水平的准确测量；因此，合适的参照标志物的选择对于精确测量靶基因的表达水平是非常重要的。
在一个实施方案中，参照标志物可以选自对于细胞存活必需的内源基因。例如，参照标志物可以包含选自下组的至少一种：EEF1A1，RPL23A，TPT1，HUWE1，MATR3，SRSF3，HNRNPC，SMARCA4，WDR90，和TUT1。在一个实施方案中，由于RPL23A，TPT1，MATR3，SRSF3，和HNRNPC的表达量以非常恒定的水平维持(参见实施例1)，参照标志物可以基本上包含选自下组的至少一种：RPL23A，TPT1，MATR3，SRSF3，和HNRNPC，且任选进一步包含选自下组的至少一种：EEF1A1，HUWE1，SMARCA4，WDR90，和TUT1，但不限于此。在一个实施方案中，参照标志物可以包含RPL23A，TPT1，MATR3，SRSF3，和HNRNPC。或者，参照标志物可以包含TPT1、EEF1M、TUT1、MATR3和SMARCA4。
参照标志物可以包含选自下组的至少一种：上文描述的基因的全长DNA，cDNA，和mRNA，和由基因编码的蛋白质。在此情况中，要在测量表达水平中使用的细胞可以是肺癌细胞，例如，肺癌腺癌细胞，非小细胞肺癌细胞，等等，但不限于此。下文表2中汇总了可用作参照标志物的基因的信息：
【表2】
另一个实施方案提供了使用参照标志物作为比较参照测定(或估测)靶 基因表达水平的方法，其中参照标志物可以是选自下组的至少一种：EEF1A1、RPL23A、TPT1、HUWE1、MATR3、SRSF3、HNRNPC、SMARCA4、WDR90和TUT1。测定(或估测)靶基因表达水平的方法可以包括测量生物学样品中靶基因的表达水平，并比较靶基因的表达水平与参照标志物的表达水平。测量基因表达水平的方法可以进一步包括测量参照标志物的表达水平。可以在自活体分离(分开)的细胞或组织，或从细胞或组织提取的基因(DNA或RNA)或蛋白质中测量表达水平。可以通过测量从活体分离的生物学样品中基因(例如全长DNA，cDNA，mRNA，等等)或由基因编码的蛋白质的量实施表达水平的测量。另一个实施方案提供选自EEF1A1、RPL23A、TPT1、HUWE1、MATR3、SRSF3、HNRNPC、SMARCA4、WDR90和TUT1的至少一种作为参照标志物用于测定(或估测)从活体分离的生物学样品中靶基因的表达水平的用途。
另一个实施方案提供了用于预测抗c-Met抗体对受试者的影响(或受试者对抗c-Met抗体的应答性或敏感性)或为抗c-Met抗体应用选择受试者的组合物，其包含用于检测生物标志物或由生物标志物编码的蛋白质的分子或试剂。用于预测抗c-Met抗体对受试者的影响或为抗c-Met抗体应用选择受试者的组合物可以进一步包含用于检测参照标志物基因(全长DNA、cDNA或mRNA)或由参照标志物基因编码的蛋白质的分子或试剂。
另一个实施方案提供了用于预测抗c-Met抗体对受试者的影响(或受试者对抗c-Met抗体的应答性或敏感性)或为抗c-Met抗体应用选择受试者的试剂盒，其包含用于检测生物标志物或由生物标志物编码的蛋白质的分子或试剂。用于预测抗c-Met抗体对受试者的影响或为抗c-Met抗体应用选择受试者的试剂盒可以进一步包含用于检测参照标志物基因(全长DNA、cDNA或mRNA)或由参照标志物基因编码的蛋白质的分子或试剂。
另一个实施方案提供了用于测量(测定或估测)靶基因的表达水平的参照组合物或试剂盒，其包含用于检测参照标志物基因(全长DNA、cDNA或mRNA)或由参照标志物基因编码的蛋白质的分子或试剂。在一个实施方案中，在靶基因是如上文描述的生物标志物时，组合物或试剂盒可以用于预测抗c-Met抗体对受试者的影响或为抗c-Met抗体应用选择受试者。
用于检测生物标志物或参照标志物的分子或试剂可以是通常用于基因或蛋白质检测测定法的任何类型。例如，可以经由普通的酶反应、荧光、发 光、和/或放射性检测实施基因或蛋白质检测测定法。更具体地，可以通过选自下组的方法检测蛋白质：免疫层析，免疫组织化学，酶联免疫吸附法(ELISA)，放射性免疫测定法(RIA)，酶免疫测定法(EIA)，荧光免疫测定法(FIA)，发光免疫测定法(LIA)，Western印迹，微阵列，表面等离振子共振(SPR)，流式细胞术测定等，但不限于此。另外，可以通过使用与基因可杂交的引物或探针使用任何普通的基因(DNA或RNA)检测方法，包括但不限于普通的聚合酶链式反应(PCR；例如qPCR、RT-PCR等)，FISH(荧光原位杂交)和/或微阵列来检测基因。例如，用于检测生物标志物或参照标志物的分子或试剂可以是能够与基因结合(杂交)的引物、探针或适体，特异性识别和/或结合由基因编码的蛋白质的抗体或适体，或其任何组合。引物、探针、适体或抗体可以是合成或重组的。引物可以能够检测生物标志物基因或参照标志物基因(全长DNA，cDNA，或mRNA)的完整基因或基因内的约5至约1000bp，约10至约500bp，约20至约200bp，或约50至约200bp的基因片段，并且可以包含或组成基本上为与完整基因或基因片段的3’-端和/或5’-端的约5至约100bp，约5至约50bp，约5至约30bp，或约10至约25bp的区域可杂交(例如互补)的核苷酸序列。能够与基因或其片段杂交的探针或适体可以包含或组成基本上为具有约5至约100bp，约5至约50bp，约5至约30bp，或约5至约25bp的大小的核苷酸序列，其能够与生物标志物或参照标志物(全长DNA，cDNA或mRNA)的片段(约5至约100bp，约5至约50bp，约5至约30bp，或约5至约25bp)杂交(或互补)。如本文中使用的，术语“能够杂交”可以指以在引物、探针或适体和基因区之间的80％或更高，例如90％或更高，95％或更高，98％或更高，99％或更高，或100％序列互补性与基因的特定区互补性结合。
下文表3-5中例示了可用于检测生物标志物或参照标志物的探针和引物的例子：
【表3】
基因 探针序列(5'-3')
THSD7A CCTCTTGAACTTGCGTGCCTG(SEQ ID NO:109)
MET CTTCACTTCGCAGGCAGATTCC(SEQ ID NO:143)
RAB31 ATACGCTGAATCCATAGGTGCCA(SEQ ID NO:155)
FAM126A TCTCTGCTGACCTGATTGATGCT(SEQ ID NO:178)
PHC1 ACCTCCTCACCTGTTGTAGCC(SEQ ID NO:201)
ST8SIA4 ACTGCTCTTGACCACTGACACA(SEQ ID NO:236)
CHML CCTCTGGCTGCTTATCATCACC(SEQ ID NO:213)
CAV1 TAGATAACAAGACCTCAGTGCCTTCC(SEQ ID NO:248)
RPL23A ACTGGCTCCTGATTACGATGCTT(SEQ ID NO:260)
TPT1 CATAACTGGCTTCTGCTTGTCATCC(SEQ ID NO:261)
EEF1A1 CCAGCAGCAACAATCAGGACAG(SEQ ID NO:262)
SRSF3 TTCCACTCTTACACGGCAGC(SEQ ID NO:263)
TUT1 CCTGTGGTCAAGTTCTGTCATCG(SEQ ID NO:264)
HNRNPC CTGCTGCTCTGCTCCTCTTCT(SEQ ID NO:265)
HUWE1 TCCTCTTCCTCCTCATCCTCACT(SEQ ID NO:266)
WDR90 TGGTCACTCAGCACACGGAA(SEQ ID NO:267)
MATR3 TGACCAGACAGAGCAGGAACC(SEQ ID NO:268)
SMARCA4 CCTTCCTCATCATCGTGCCTCT(SEQ ID NO:269)
【表4】
【表5】
在一个实施方案中，用于检测生物标志物THSD7A的探针可以是选自下组的至少一种：SEQ ID NO:109至142，例如，选自下组的至少一种：SEQ ID NO:109的探针，包含SEQ IDNO:110至120的探针组，包含SEQ ID NO:121至131的探针组，和包含SEQ ID NO:132至142的探针组。用于检测生物标志 物THSD7A的引物可以是SEQ ID NO:270的引物，SEQ ID NO:271的引物，或包含两种引物的引物对，但不限于此。
用于检测生物标志物MET的探针可以是选自下组的至少一种：SEQ ID NO:143至154，例如，SEQ ID NO:143的探针，包含SEQ ID NO:144至154的探针组，或其组合。用于检测生物标志物MET的引物可以是SEQ ID NO:272的引物，SEQ ID NO:273的引物，或包含这两种引物的引物对，但不限于此。
用于检测生物标志物RAB31的探针可以是选自下组的至少一种：SEQ ID NO:155至177，例如，选自下组的至少一种：SEQ ID NO:155的探针，包含SEQ ID NO:156至166的探针组，和包含SEQ ID NO:167至177的探针组。用于检测生物标志物RAB31的引物可以是SEQ IDNO:278的引物，SEQ ID NO:279的引物，或包含这两种引物的引物对，但不限于此。
用于检测生物标志物FAM126A的探针可以是选自下组的至少一种：SEQ ID NO:178至200和225至235，例如，选自下组的至少一种：SEQ ID NO:178的探针，包含SEQ ID NO:179至189的探针组，包含SEQ ID NO:190至200的探针组，和包含SEQ ID NO:225至235的探针组。用于检测生物标志物FAM126A的引物可以是SEQ ID NO:274的引物，SEQ ID NO:275的引物，或包含这两种引物的引物对，但不限于此。
用于检测生物标志物PHC1的探针可以是选自下组的至少一种：SEQ ID NO:201至212，例如，SEQ ID NO:201的探针，包含SEQ ID NO:202至212的探针组，或其组合。用于检测生物标志物PHC1的引物可以是SEQ ID NO:276的引物，SEQ ID NO:277的引物，或包含这两种引物的引物对，但不限于此。
用于检测生物标志物CHML的探针可以是选自下组的至少一种：SEQ ID NO:213至224，例如，SEQ ID NO:213的探针，包含SEQ ID NO:214至224的探针组，或其组合。用于检测生物标志物CHML的引物可以是SEQ ID NO:282的引物，SEQ ID NO:283的引物，或包含这两种引物的引物对，但不限于此。
用于检测生物标志物ST8SIA4的探针可以是选自下组的至少一种：SEQ ID NO:236至247，例如，SEQ ID NO:236的探针，包含SEQ ID NO:237至247的探针组，或其组合。用于检测生物标志物ST8SIA4的引物可以是SEQ ID NO: 280的引物，SEQ ID NO:281的引物，或包含这两种引物的引物对，但不限于此。
用于检测生物标志物CAV1的探针可以是选自下组的至少一种：SEQ ID NO:248至259，例如，SEQ ID NO:248的探针，包含SEQ ID NO:249至259的探针组，或其组合。用于检测生物标志物CAV1的引物可以是SEQ ID NO:284的引物，SEQ ID NO:285的引物，或包含这两种引物的引物对，但不限于此。
用于检测参照标志物EEF1A1的探针可以是SEQ ID NO:262的探针，但不限于此。用于检测参照标志物EEF1A1的引物可以是SEQ ID NO:290的引物，SEQ ID NO:291的引物或包含这两种引物的引物对，但不限于此。
用于检测参照标志物RPL23A的探针可以是SEQ ID NO:260的探针，但不限于此。用于检测参照标志物RPL23A的引物可以是SEQ ID NO:286的引物，SEQ ID NO:287的引物或包含这两种引物的引物对，但不限于此。
用于检测参照标志物TPT1的探针可以是SEQ ID NO:261的探针，但不限于此。用于检测参照标志物TPT1的引物可以是SEQ ID NO:288的引物，SEQ ID NO:289的引物或包含这两种引物的引物对，但不限于此。
用于检测参照标志物HUWE1的探针可以是SEQ ID NO:266的探针，但不限于此。用于检测参照标志物HUWE1的引物可以是SEQ ID NO:298的引物，SEQ ID NO:299的引物或包含这两种引物的引物对，但不限于此。
用于检测参照标志物MATR3的探针可以是SEQ ID NO:268的探针，但不限于此。用于检测参照标志物MATR3的引物可以是SEQ ID NO:302的引物，SEQ ID NO:303的引物或包含这两种引物的引物对，但不限于此。
用于检测参照标志物SRSF3的探针可以是SEQ ID NO:263的探针，但不限于此。用于检测参照标志物SRSF3的引物可以是SEQ ID NO:292的引物，SEQ ID NO:293的引物或包含这两种引物的引物对，但不限于此。
用于检测参照标志物HNRNPC的探针可以是SEQ ID NO:265的探针，但不限于此。用于检测参照标志物HNRNPC的引物可以是SEQ ID NO:296的引物，SEQ ID NO:297的引物或包含这两种引物的引物对，但不限于此。
用于检测参照标志物SMARCA4的探针可以是SEQ ID NO:269的探针，但不限于此。用于检测参照标志物SMARCA4的引物可以是SEQ ID NO:304的引物，SEQ ID NO:305的引物或包含这两种引物的引物对，但不限于此。
用于检测参照标志物WDR90的探针可以是SEQ ID NO:267的探针，但不限于此。用于检测参照标志物WDR90的引物可以是SEQ ID NO:300的引物，SEQ ID NO:301的引物或包含这两种引物的引物对，但不限于此。
用于检测参照标志物TUT1的探针可以是SEQ ID NO:264的探针，但不限于此。用于检测参照标志物TUT1的引物可以是SEQ ID NO:294的引物，SEQ ID NO:295的引物或包含这两种引物的引物对，但不限于此。
另一个实施方案提供了预测抗c-Met抗体对受试者的影响(或受试者对抗c-Met抗体的应答性或敏感性)或为抗c-Met抗体应用(例如，抗c-Met抗体的施用或治疗)选择(或鉴定)受试者的方法，其包括测定(或测量)来自受试者的生物学样品中生物标志物的存在和/或水平(例如生物标志物的存在和/或量)。在该方法中，可以使用参照标志物作为比较参照实施生物标志物的存在和/或水平的测定或测量。
例如，在CAV1，FAM126A，MET，RAB31，ST8SIA4，和/或THSD7A的情况中，在基因的表达水平较高时，可以确定(或预测)抗c-Met抗体能展现出效果(即使用抗c-Met抗体的治疗是有效的)或生物学样品或获得(分离或分开)生物学样品的受试者适合于应用抗c-Met抗体。另外，在CMHL和/或PHC1的情况中，在表达水平较低时，可以确定(或预测)抗c-Met抗体能展现出效果(即使用抗c-Met抗体的治疗是有效的)或生物学样品或获得(分离或分开)生物学样品的受试者适合于应用抗c-Met抗体。
生物标志物的表达水平可以通过将其与参照标志物的表达水平比较评估。例如，可以参考表6，使用聚合酶链式反应(PCR；例如竞争PCR，实时PCR(RT-PCR)，等等)实施生物标志物表达的评估和抗c-Met抗体的效果和/或适用性的确定(或预测)。
【表6】
(ΔCt＝参照标志物的Ct值(循环阈值)(如果使用两种或更多种参照标志物，该术语意指“参照标志物的Ct值的平均值”)–生物标志物的Ct值)
在表6中，参照标志物可以是选自下组的至少一种：EEF1A1，RPL23A，TPT1，HUWE1，MATR3，SRSF3，HNRNPC，SMARCA4，WDR90，和TUT1，如上文描述的。
本文中描述的方法可以进一步包括对于每种生物标志物，测定可以与生物标志物比较的参照标准表达值，如表6中列出的。可以如下测定参照标准表达值，例如(i)在(a)已知为抗-c-Met抗体敏感的受试者群体(亦称为“效力组”)和(b)已知为抗-c-Met抗体不敏感(例如抗性)的受试者群体(亦称为“非效力组”)中对每种生物标志物测定ΔCt；并(ii)将来自(a)和(b)的ΔCt取平均值以提供参照表达值。如上文解释的，ΔCt是一种或多种参照标志物(EEF1A1，RPL23A，TPT1，HUWE1，MATR3，SRSF3，HNRNPC，SMARCA4，WDR90，和TUT1)的平均Ct值–计算标准表达值的给定生物标志物的Ct值。效力组和非效力组可以通过确认抗-c-Met抗体效力(例如抗癌效力，如抑制癌细胞增殖等)的在前体内测试(例如临床测试)或离体测试(例如细胞测试)来确定。
或者，可以通过比较来自受试者的生物学样品中生物标志物的表达水平与参照样品中生物标志物的表达水平测定“低或高表达水平”。参照样品可以是抗c-Met抗体没有效果(如抗-c-Met抗体不敏感组)或对抗c-Met抗体具有抗性(例如抗-c-Met抗体非效力组或抗-c-Met抗体抗性组)的任何细胞或组织。例如，参照样品可以是选自下组的至少一种：细胞系H1373(ATCC,CRL-5866)，HCC1806(ATCC,CRL-2335)，Caki-1(ATCC,HTB-46)，SKBR3(ATCC,HTB-30)，BT474(ATCC,HTB-20)，HT-29(ATCC,HTB-38)，LoVo(ATCC,CCL-229)，HCT116(ATCC,CCL-247)，SW620(ATCC,CCL-227)， Ls174T(ATCC,CL-188)，和由于抗c-Met抗体的重复和/或持续施用而对抗c-Met抗体获得抗性的细胞。因此，预测抗c-Met抗体对受试者的影响或为抗c-Met抗体应用(例如，抗c-Met抗体的施用或治疗)选择(或鉴定)受试者的方法可以进一步包括如下的步骤，即比较生物学样品中生物标志物的表达水平与参照样品中生物标志物的表达水平，如上文描述的。在此情况中，所述方法可以进一步包括测量参照样品中生物标志物的表达水平的步骤。所述方法可以进一步包括如下的步骤，即确定(预测或选择)在生物标志物(选自下组的至少一种：CAV1，FAM126A，MET，RAB31，ST8SIA4，和THSD7A)的表达水平高于参照样品的表达水平时或者在生物标志物(CMHL，PHC1，或其组合)的表达水平低于参照样品的表达水平时，抗c-Met抗体对生物学样品或获得(分离)生物学样品的受试者具有影响或者生物学样品或获得(分离)生物学样品的受试者适合于应用抗c-Met抗体。
测量生物标志物或参照标志物的水平可包括i)用用来检测生物标志物或参照标志物的分子或试剂来处理生物学样品(与其反应或接触)；并ii)定量分析反应混合物以测定生物标志物或参照标志物的水平。在一个实施方案中，在步骤i)之前，可以进一步实施提供生物学样品的步骤，其中该制备步骤可以包括从患者获得(分离)生物学样品或获得已从患者分离的生物学样品。在步骤i)中，用来检测生物标志物或参照标志物的分子或试剂可以是如上文描述的。在一个实施方案中，用来检测生物标志物或参照标志物的分子或试剂可以与通用标记物缀合，所述标记物如荧光、二抗、珠(例如磁性珠或聚苯乙烯珠)、染料、或其任意组合。步骤i)可以配置为通过向生物学样品添加用来检测生物标志物或参照标志物的分子或试剂以形成复合物。在步骤ii)中，反应混合物可以是得自生物标志物或参照标志物与用来检测生物标志物或参照标志物的分子或试剂之间的相互作用(结合)的复合物，其可以在步骤i)中获得。定量分析可包括在将复合物从生物学样品分离后量化复合物、缀合于复合物的标记物、或从复合物分离的生物标志物或参照标志物。
测量生物标志物或参照标志物的水平可包括i)用用来检测生物标志物或参照标志物的分子或组合物来处理生物学样品(与其反应或接触)；并ii)定量分析反应混合物以测定生物标志物或参照标志物的水平。在一个实施方案中，在步骤i)之前，可以进一步实施提供生物学样品的步骤，其中该制备步骤可以包括从患者获得(分离)生物学样品或获得已从患者分离的生物学样 品。在步骤i)中，用来检测生物标志物或参照标志物的分子或组合物可以是如上文描述的。在一个实施方案中，用来检测生物标志物或参照标志物的分子或组合物可以与通用标记物缀合，所述标记物如荧光、二抗、珠(例如磁性珠或聚苯乙烯珠)、染料、或其任意组合。步骤i)可以配置为通过向生物学样品添加用来检测生物标志物或参照标志物的分子或组合物以形成复合物。在步骤ii)中，反应混合物可以是得自生物标志物或参照标志物与用来检测生物标志物或参照标志物的分子或组合物之间的相互作用(结合)的复合物，其可以在步骤i)中获得。定量分析可包括在将复合物从生物学样品分离后量化复合物、缀合于复合物的标记物、或从复合物分离的生物标志物或参照标志物。
受试者可以指适合于用抗c-Met抗体的疗法应用的任何患者。受试者可以是任何哺乳动物，例如，灵长类诸如人或猴，啮齿类(大鼠或小鼠)，等等。例如，受试者可以是患有癌症的患者。生物学样品可以是选自下组的至少一种：细胞、组织、体液(例如血液、血清、血浆等)，等等，其从受试者(例如任何哺乳动物，例如，灵长类，诸如人或猴，啮齿类(大鼠或小鼠)，等等)分离，或人工培养。例如，生物学样品可以是癌细胞或癌组织，或从细胞或组织提取的DNA或RNA，或从细胞或组织分离的蛋白质。生物学样品可以是未加工的样品或经加工的样品(例如RRPE(经福尔马林固定的经石蜡包埋的)样品)。
在一个实施方案中，受试者可以是癌症患者。癌症可以与c-Met的过表达和/或异常活化有关。癌症可以是实体瘤或血液癌症。癌症可以是原发性癌症或转移性癌症。例如，癌症可以是但不限于选自下组的一种或多种：鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma)，小细胞肺癌(small-cell lung cancer)，非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer)，肺腺癌(adenocarcinoma of the lung)，鳞状细胞肺癌(squamous cell carcinoma of thelung)，腹膜癌(peritoneal carcinoma)，皮肤癌(skin cancer)，皮肤或眼球中的黑素瘤，直肠癌(rectal cancer)，肛门附近的癌症，食管癌(esophagus cancer)，小肠肿瘤(smallintestinal tumor)，内分泌腺癌(endocrine gland cancer)，甲状旁腺癌(parathyroidcancer)，肾上腺癌(adrenal cancer)，软组织肉瘤(soft-tissue sarcoma)，尿道癌(urethral cancer)，慢性或急性白血病，淋巴细胞性淋巴瘤(lymphocytic lymphoma)，肝细胞瘤(hepatoma)，胃癌(gastric cancer)，胃肠癌(gastrointestinal cancer)，胰腺癌(pancreatic cancer)，成胶质细胞瘤(glioblastoma)，宫颈癌(cervical cancer)，卵巢癌(ovarian cancer)，肝癌(liver cancer)，膀胱癌(bladder cancer)，肝细胞腺瘤(hepatocellular adenoma)，乳腺癌(breast cancer)，结肠癌(colon cancer)，大肠癌(large intestine cancer)，子宫内膜癌(endometrial carcinoma)或子宫癌(uterinecarcinoma)，唾液腺肿瘤(salivary gland tumor)，肾癌(kidney cancer)，前列腺癌(prostate cancer)，外阴癌(vulvar cancer)，甲状腺癌(thyroid cancer)，头或颈癌(head or neck cancer)，脑癌(brain cancer)，骨肉瘤(osteosarcoma)，等等。在一个实施方案中，受试者可以是患有肺癌(例如肺癌腺癌、非小细胞腺癌，等等)的患者。
可以通过使用能够与基因杂交的引物、探针或适体的任何通用基因测定法，例如但不限于通过聚合酶链式反应(PCR；例如q PCR或RT-PCR)，荧光原位杂交(FISH)，或微阵列测定法实施生物标志物和/或参照标志物的存在和/或表达水平的测量。在一个实施方案中，可以通过通用基因量化测定法，例如通过PCR测量生物标志物和/或参照标志物的存在和/或表达水平。或者，可以通过通用测序鉴定生物标志物的存在。在一个实施方案中，引物可以设计为检测生物标志物或参照标志物基因(全长DNA，cDNA或mRNA)的完整基因或基因内的连续核苷酸的片段，例如约5至约100bp，例如约10至约500bp，约20至约200bp，或约50至约200bp的片段。引物可以是包含或组成基本上为(consisting essentially of)核苷酸序列的引物对，所述核苷酸序列分别能够与大小范围为约5至约100bp，例如约5至约50bp，约5至约30bp，或约10至25bp的3’-和5’-端区杂交(例如互补)。能够与基因杂交的探针或适体可以包含或组成基本上为具有约5至约100bp，约5至约50bp，约5至约30bp，或约5至约25bp的大小的核苷酸序列，其能够与生物标志物或参照标志物基因(全长DNA，cDNA或mRNA)的片段(约5至约100bp，约5至约50bp，约5至约30bp，或约5至约25bp)杂交(或互补)。如本文中使用的，术语“能够杂交”可以指以在引物、探针或适体和基因区之间的80％或更高，例如90％或更高，95％或更高，98％或更高，99％或更高，或100％序列互补性与基因的特定区互补性结合。
生物标志物和/或参照标志物的存在和/或表达水平可以通过量化由其编码的蛋白质测量。可以通过使用特异性结合蛋白质的化学品、抗体、和/或适体检测酶促反应、荧光、发光和/或放射性实施蛋白质量化。例如，可以使用 选自但不限于下组的分析技术实施蛋白质量化：免疫层析，免疫组织化学染色，酶联免疫吸附法(ELISA)，放射性免疫测定法(RIA)，酶免疫测定法(EIA)，荧光免疫测定法(FIA)，发光免疫测定法(LIA)，Western印迹，微阵列，流式细胞术，免疫组织化学(IHC)，表面等离振子共振(SPR)，等等。
另一个实施方案提供了抑制c-Met或预防和/或治疗癌症的方法，其包括对具有高水平的CAV1、FAM126A、MET、RAB31、ST8SIA4、和/或THSD7A，和/或低水平的CMHL和/或PHC1的受试者施用抗c-Met抗体，其中术语“高水平”和“低水平”可以如上文所述测定。在一个实施方案中，受试者可以是如上选择的受试者。
抑制c-Met或预防和/或治疗癌症的方法可以进一步包括在施用步骤前为抗c-Met抗体应用鉴定的受试者的步骤。鉴定步骤可以是鉴定通过用于抗c-Met抗体应用的受试者的方法选择的生物学样品或受试者的步骤，并且可以通过实施选择方法中描述的步骤或者通过确认通过选择方法选择感兴趣的受试者或生物学样品实施。
在一个实施方案中，抑制c-Met或预防和/或治疗癌症的方法可以包括：
为抗c-Met抗体应用鉴定受试者；并
对所述受试者施用抗c-Met抗体。
或者，抑制c-Met或预防和/或治疗癌症的方法可以包括：
通过测量生物标志物的存在和/或水平为抗c-Met抗体应用选择受试者；并
对选择的受试者施用抗c-Met抗体。
在上述方法中，可以以对于抑制c-Met或预防和/或治疗癌症有效的量施用抗c-Met抗体。
在一个实施方案中，抗c-Met抗体可以是将c-Met蛋白识别为抗原的任何抗体和/或其抗原结合片段。例如，抗c-Met抗体可以将c-Met的特定区，例如SEMA域中的特定区识别为表位。它可以是作用于c-Met以诱导c-Met胞内内在化和降解的任何抗体或抗原结合片段。
如本文中使用的，除非另有叙述，术语“抗c-Met抗体”可以用于不仅包括抗体的完整形式，而且还包括其抗原结合片段。
术语“c-Met”或“c-Met蛋白”指一种结合肝细胞生长因子(HGF)的受体酪氨酸激酶(RTK)。c-Met可以是来自任何物种，特别是哺乳动物，例如灵 长类的c-Met蛋白，诸如人c-Met(例如NP_000236)或猴c-Met(例如猕猴(Macaca mulatta)，NP_001162100)，或啮齿类诸如小鼠c-Met(例如NP_032617.2)或大鼠c-Met(例如NP_113705.1)。c-Met蛋白可以包括由标识为GenBank登录号NM_000245的核苷酸序列编码的多肽，具有标识为GenBank登录号NP_000236的氨基酸序列的多肽或其胞外域。受体酪氨酸激酶c-Met参与各种机制，诸如癌症形成，转移，癌细胞的迁移，癌细胞的浸入，和血管发生。
c-Met(一种针对肝细胞生长因子(HGF)的受体)可以分成三个部分：胞外，跨膜和胞内。胞外部分由经由二硫键彼此连接的α(alpha)-亚基和β(beta)-亚基构成，并且含有负责结合HGF的SEMA域、PSI域(丛蛋白-脑信号蛋白(semaphorin)-整联蛋白同源域)和IPT域(丛蛋白和转录因子域共享的免疫球蛋白样折叠)。c-Met蛋白的SEMA域可以具有SEQ IDNO:79的氨基酸序列，并且是发挥功能以结合HGF的胞外域。SEMA域的特定区(即，具有SEQID NO:71的氨基酸序列的区域，其对应于c-Met蛋白的SEMA域的氨基酸序列(SEQ ID NO:79)的氨基酸残基106至124的范围)是SEMA域的表位内的第二个和第三个推进物(propeller)之间的环区。该区的作用为本公开内容的特异性抗c-Met抗体的表位。
如本文中使用的，术语“表位”指抗原决定簇，即抗原中被抗体识别的部分。在一个实施方案中，表位可以是包含c-Met蛋白的SEMA域(SEQ ID NO:79)内的5个或更多个连续氨基酸残基，例如SEQ ID NO:71的氨基酸序列内的5至19个连续氨基酸残基的区域。连续的氨基酸可以是线性序列中的连续氨基酸，或者在表位的三维构造中连续的，而不必在线性序列中是连续的。例如，表位可以是具有选自SEQ ID NO:71的氨基酸序列的部分组合的5至19个邻接(或连续)氨基酸的多肽，其中多肽基本上包含充当表位的必需元件的SEQ ID NO:73(EEPSQ)的氨基酸序列。例如，表位可以是包含，组成基本上为，或组成为SEQ ID NO:71，SEQID NO:72，或SEQ ID NO:73的氨基酸序列的多肽。
具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的表位对应于c-Met蛋白的SEMA域内第二个和第三个推进物之间的环的最外部分。具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的表位是依照一个实施方案的抗体或抗原结合片段最特异性结合的位点。
如此，抗c-Met抗体可以特异性结合具有选自SEQ ID NO:71的氨基酸序列的5至19个邻接(或连续)氨基酸，且包含SEQ ID NO:73(EEPSQ)作为必需元件的表位。例如，抗c-Met抗体可以特异性结合包含SEQ ID NO:71，SEQ ID NO:72，或SEQ ID NO:73的氨基酸序列的表位。
在一个实施方案中，抗c-Met抗体或其抗原结合片段可以包含：
至少一种选自下组的重链互补决定区(CDR)：(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或包含SEQ ID NO:2内的8-19个连续氨基酸且包含SEQ ID NO:2的第3至第10位的氨基酸残基的氨基酸序列；和(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:85的氨基酸序列，或包含SEQ ID NO:85内的6-13个连续氨基酸且包含SEQ ID NO:85的第1至第6位的氨基酸残基的氨基酸序列；或包含至少一种重链互补决定区的重链可变区；
至少一种选自下组的轻链互补决定区(CDR)：(a)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，(b)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，和(c)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:86的氨基酸序列，或包含SEQ ID NO:89内的9-17个连续氨基酸且包含SEQ ID NO:89的第1至第9位的氨基酸残基的氨基酸序列；或包含至少一种轻链互补决定区的轻链可变区；
至少一种重链互补决定区和至少一种轻链互补决定区的组合；
重链可变区和轻链可变区的组合。
在本文中，SEQ ID NO:4至9的氨基酸残基在下文分别以如下的式I至VI表示：
式I
Xaa1-Xaa2-Tyr-Tyr-Met-Ser(SEQ ID NO:4)，
其中Xaa1是缺乏的或为Pro或Ser，且Xaa2是Glu或Asp，
式II
Arg-Asn-Xaa3-Xaa4-Asn-Gly-Xaa5-Thr(SEQ ID NO:5),
其中Xaa3是Asn或Lys，Xaa4是Ala或Val，且Xaa5是Asn或Thr，
式III
Asp-Asn-Trp-Leu-Xaa6-Tyr(SEQ ID NO:6),
其中Xaa6是Ser或Thr，
式IV
Lys-Ser-Ser-Xaa7-Ser-Leu-Leu-Ala-Xaa8-Gly-Asn-Xaa9-Xaa10-Asn-Tyr-Leu-Ala(SEQ ID NO:7)
其中Xaa7是His，Arg，Gln，或Lys，Xaa8是Ser或Trp，Xaa9是His或Gln，且Xaa10是Lys或Asn，
式V
Trp-Xaa11-Ser-Xaa12-Arg-Val-Xaa13(SEQ ID NO:8)
其中Xaa11是Ala或Gly，Xaa12是Thr或Lys，且Xaa13是Ser或Pro，和
式VI
Xaa14-Gln-Ser-Tyr-Ser-Xaa15-Pro-Xaa16-Thr(SEQ ID NO:9)
其中Xaa14是Gly，Ala，或Gln，Xaa15是Arg，His，Ser，Ala，Gly，或Lys，且Xaa16是Leu，Tyr，Phe，或Met。
在一个实施方案中，CDR-H1可以包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1，22，23，和24。CDR-H2可以包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2，25，和26。CDR-H3可以包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:3，27，28，和85。
CDR-L1可以包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:10，29，30，31，32，33，和106。CDR-L2可以包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:11，34，35，和36。CDR-L3可以包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:12，13，14，15，16，37，86和89。
在另一个实施方案中，抗体或抗原结合片段可以包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有包含选自下组的氨基酸序列的多肽(CDR-H1)：SEQ ID NO:1，22，23，和24，包含选自下组的氨基酸序列的多肽(CDR-H2)：SEQ ID NO:2，25，和26，和包含选自下组的氨基酸序列的多肽(CDR-H3)：SEQ ID NO:3，27，28，和85；所述轻链可变区含有包含选自下组的氨基酸序列的多肽(CDR-L1)：SEQ ID NO:10，29，30，31，32，33和106，包含选自下组的氨基酸序列的多肽(CDR-L2)：SEQ ID NO:11，34，35，和36，和包含选自下组的氨基酸序列的多肽(CDR-L3)：SEQ ID NO 12，13，14，15，16，37，86，和89。
在抗c-Met抗体或抗原结合片段的一个实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO:17，74，87，90，91，92，93，或94的氨基酸序列，并且轻链可变区 包含SEQ ID NO:306、18，19，20，21，75，88，95，96，97，98，99，或107的氨基酸序列。
通过用期望的抗原免疫非免疫动物生成的动物衍生抗体为了医学治疗目的对人注射时一般引发免疫原性，并且如此已经开发出嵌合抗体以抑制此类免疫原性。通过遗传工程用人抗体的恒定区替换引起抗同种型应答的动物衍生抗体的恒定区，从而制备嵌合抗体。与动物衍生抗体相比，嵌合抗体就抗同种型应答而言是改善得相当多的，但是可变区仍具有动物衍生的氨基酸序列，从而嵌合抗体就潜在的抗独特型应答而言具有副作用。已经开发出人源化抗体以降低此类副作用。通过将在嵌合抗体的可变区中在抗原结合中发挥重要作用的互补决定区(CDR)嫁接到人抗体框架中生成人源化抗体。
在使用CDR嫁接以生成人源化抗体中，选择使用哪些优化的人抗体来接受动物衍生抗体的CDR是至关重要的。使用抗体数据库，晶体结构的分析，和分子建模的技术。然而，即使在将动物衍生抗体的CDR嫁接到最优化的人抗体框架时，也存在位于动物衍生的CDR的框架中影响抗原结合的氨基酸。因此，在许多情况中，抗原结合亲和力没有得到维持，并且如此应用别的抗体工程化技术以恢复抗原结合亲和力是必需的。
抗c-Met抗体可以是但不限于小鼠衍生的抗体，小鼠-人嵌合抗体，人源化抗体，或人抗体。抗体或其抗原结合片段可以自活体分离或非天然存在的。抗体或其抗原结合片段可以是合成的或重组的。
完整的抗体包含两条全长轻链和两条全长重链，其中每条轻链通过二硫键与重链连接。抗体具有重链恒定区和轻链恒定区。重链恒定区属于gamma(γ)，mu(μ)，alpha(α)，delta(δ)，或epsilon(ε)型，其可以进一步分类为gamma1(γ1)，gamma 2(γ2)，gamma 3(γ3)，gamma 4(γ4)，alpha 1(α1)，或alpha 2(α2)。轻链恒定区属于kappa(κ)或lambda(λ)型。
如本文中使用的，术语“重链”指全长重链，及其片段，其包括包含足以提供针对抗原的特异性的氨基酸序列的可变区VH，和3个恒定区CH1，CH2，和CH3，以及铰链。术语“轻链”指全长轻链及其片段，包括包含足以提供针对抗原的特异性的氨基酸序列的可变区VL和恒定区CL。
术语“互补决定区(CDR)”指存在于免疫球蛋白的重链或轻链的超变区中的氨基酸序列。重链和轻链可以分别包含3个CDR(CDRH1，CDRH2，和CDRH3；和CDRL1，CDRL2，和CDRL3)。CDR可以提供接触残基，其在抗 体对抗原或表位的结合中发挥重要的作用。术语“特异性结合”和“特异性识别”是本领域普通技术人员公知的，并且指示抗体和抗原彼此特异性相互作用以导致免疫学活性。
本文中使用的术语“抗原结合片段”指完整免疫球蛋白中包含含有抗原结合区的多肽部分的片段，所述抗原结合区具有特异性结合抗原的能力。在具体的实施方案中，抗原结合片段可以是scFv，(scFv)2，scFvFc，Fab，Fab’，或F(ab’)2，但不限于此。
在抗原结合片段中，包含轻链和重链可变区，轻链恒定区，和第一重链恒定区CH1的Fab具有1个抗原结合位点。
Fab’片段与Fab片段的不同之处在于Fab’包含在CH1的C端具有至少一个半胱氨酸残基的铰链区。
F(ab’)2抗体经由Fab’片段的铰链区中的半胱氨酸残基的二硫化物桥接形成。
Fv是仅具有重链可变区和轻链可变区的最小抗体片段。生成Fv片段的重组技术是本领域中公知的。
两链Fv包含通过非共价键连接的重链可变区和轻链可变区。单链Fv一般包含经由肽接头通过共价键连接或在C端连接以具有二聚体结构，如两链Fv的重链可变区和轻链可变区。肽接头可以与上文的描述相同，包括但不限于那些具有1至100，2至50，特别是5至25个的氨基酸长度的，并且可以包括但不限于任何种类的氨基酸。
抗原结合片段可以使用蛋白酶获得(例如，可以通过用木瓜蛋白酶对全抗体的限制性切割获得Fab片段，并且可以通过用胃蛋白酶切割获得F(ab')2片段)，或者可以通过使用遗传重组技术制备。
如本文中使用的，术语“铰链区”指抗体重链内的CH1和CH2域之间发挥功能以为抗原结合位点提供柔性的区域。
在动物抗体经历嵌合化过程时，将动物起源的IgG1铰链用人IgG1铰链或IgG2铰链替换，同时两条重链之间的二硫化物桥在数目上自3个减少到2个。另外，动物衍生的IgG1铰链短于人IgG1铰链。因而，铰链的刚性是改变的。如此，铰链区的修饰可以引起人源化抗体的抗原结合效力的改善。经由氨基酸缺失、添加、或取代的铰链区修饰是本领域技术人员公知的。
在一个实施方案中，可以通过铰链区的氨基酸序列上的至少一个氨基酸 残基的缺失、插入、添加、或取代的任何组合修饰抗c-Met抗体或其抗原结合片段，从而其展现出增强的抗原结合效力。例如，抗体可以含有包含SEQ ID NO:100(U7-HC6)，101(U6-HC7)，102(U3-HC9)，103(U6-HC8)，或104(U8-HC5)的氨基酸序列的铰链区，或包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列的铰链区(非修饰的人铰链)。具体地，铰链区具有SEQ ID NO:100或101的氨基酸序列。
在一个实施方案中，抗c-Met抗体可以是单克隆抗体。可以由以登录号KCLRF-BP-00220，微生物分类命名为SAIT-MET-AbF46保藏的杂交瘤细胞系生成单克隆抗体，其特异性结合c-Met蛋白的胞外区(参考韩国专利公开文本No.2011-0047698，其内容通过提及完整并入本文)。抗c-Met抗体可以包括韩国专利公开文本No.2011-0047698中限定的所有抗体。
在抗c-Met抗体中，除了如上文定义的CDR或轻链可变区和重链可变区外的轻链和重链部分的剩余部分，例如轻链恒定区和重链恒定区可以是那些来自免疫球蛋白的任何亚型(例如IgA，IgD，IgE，IgG(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)，IgM，等等)的。
作为进一步的例子，抗c-Met抗体或抗体片段可以包括：
包含选自下组的氨基酸序列的重链：SEQ ID NO:62的氨基酸序列(其中从第1至第17位的氨基酸残基的氨基酸序列是信号肽)，或SEQ ID NO:62的第18至第462位的氨基酸序列，SEQ ID NO:64的氨基酸序列(其中从第1至第17位的氨基酸残基的氨基酸序列是信号肽)，SEQ ID NO:64的第18至第461位的氨基酸序列，SEQ ID NO:66的氨基酸序列(其中从第1至第17位的氨基酸残基的氨基酸序列是信号肽)，和SEQ ID NO:66的第18至第460位的氨基酸序列；和
包含选自下组的氨基酸序列的轻链：SEQ ID NO:68的氨基酸序列(其中从第1至第20位的氨基酸残基的氨基酸序列是信号肽)，SEQ ID NO:68的第21至第240位的氨基酸序列，SEQ ID NO:70的氨基酸序列(其中从第1至第20位的氨基酸残基的氨基酸序列是信号肽)，SEQ ID NO:70的第21至第240位的氨基酸序列，和SEQ ID NO:108的氨基酸序列。
例如，抗c-Met抗体可以选自下组：
包含重链和轻链的抗体，所述重链包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列或SEQ ID NO:62的第18至第462位的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列或SEQ IDNO:68的第21至第240位的氨基酸序列；
包含重链和轻链的抗体，所述重链包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列或SEQ ID NO:64的第18至第461位的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列或SEQ IDNO:68的第21至第240位的氨基酸序列；
包含重链和轻链的抗体，所述重链包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列或SEQ ID NO:66的第18至第460位的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列或SEQ IDNO:68的第21至第240位的氨基酸序列；
包含重链和轻链的抗体，所述重链包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列或SEQ ID NO:62的第18至第462位的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列或SEQ IDNO:70的第21至第240位的氨基酸序列；
包含重链和轻链的抗体，所述重链包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列或SEQ ID NO:64的第18至第461位的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列或SEQ IDNO:70的第21至第240位的氨基酸序列；
包含重链和轻链的抗体，所述重链包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列或SEQ ID NO:66的第18至第460位的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列或SEQ IDNO:70的第21至第240位的氨基酸序列；
包含重链和轻链的抗体，所述重链包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列或SEQ ID NO:62的第18至第462位的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列；
包含重链和轻链的抗体，所述重链包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列或SEQ ID NO:64的第18至第461位的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列；和
包含重链和轻链的抗体，所述重链包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列或SEQ ID NO:66的第18至第460位的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列。
依照一个实施方案，抗c-Met抗体可以含有包含SEQ ID NO:66的第18至第460位的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:68的第21至第240位的序列的轻链，或包含SEQ IDNO:66的第18至第460位的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:108的序列的轻链。
SEQ ID NO:70的多肽是包含人kappa(κ)恒定区的轻链，并且具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的多肽是通过用酪氨酸替换具有SEQ ID NO:70的氨 基酸序列的多肽的第62位(对应于依照kabat编号方式的SEQ ID NO:68的第36位)的组氨酸获得的多肽。可以通过替换提高抗体的生成产量。具有SEQ ID NO:108的氨基酸序列的多肽是通过用色氨酸替换第32位(SEQ ID NO:68的氨基酸残基21至240的氨基酸序列中依照kabat编号方式的27e位；位于CDR-L1内)的第32位丝氨酸获得的多肽。通过此类替换，包含此类序列的抗体和抗体片段展现出升高的活性，诸如c-Met结合亲和力，c-Met降解活性，和Akt磷酸化抑制。
可以将抗c-Met抗体用药学可接受载体配制。要包含在混合物或药物组合物中的药学可接受载体可以是那些通常用于配制抗体的载体，其可以是选自下组的一种或多种：乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯(methylhydroxy benzoate)、羟基苯甲酸丙酯(propylhydroxy benzoate)、滑石、硬脂酸镁、和矿物油，但是不限于此。抗c-Met抗体可以进一步包括选自下组的一种或多种：滑润剂、润湿剂、增甜剂、风味增强剂、乳化剂、悬浮剂、和防腐剂。
可以口服或胃肠外施用抗c-Met抗体。胃肠外施用可以包括静脉内注射，皮下注射，肌肉注射，腹膜内注射，内皮施用，局部施用，鼻内施用，肺内施用，和直肠施用。由于口服施用导致蛋白质或肽的消化，必须包被或配制口服施用的组合物中的活性成分以阻止胃中的消化。另外，可以使用任选装置施用组合物，所述任选装置使活性物质能够被投递至靶细胞。
可以使用抗c-Met抗体来预防和/或治疗癌症。癌症可以与c-Met的过表达和/或(异常)活化有关。癌症可以是实体癌症或血液癌症。例如，癌症可以是选自下组的至少一种：鳞状细胞癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺腺癌，鳞状细胞肺癌，腹膜癌，皮肤癌，皮肤或眼球中的黑素瘤，直肠癌，肛门附近的癌症，食管癌，小肠肿瘤，内分泌腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，慢性或急性白血病，淋巴细胞性淋巴瘤，肝细胞瘤，胃肠癌，胃癌，胰腺癌，成胶质细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝细胞腺瘤，乳腺癌，结肠癌，大肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺肿瘤，肾癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，头和颈癌，脑癌，和骨肉瘤，但是不限于此。
癌症的预防和/或治疗效果可以包括不仅抑制癌细胞的生长，而且还抑制 由于其迁移、侵入和转移所致的癌症进展的效果。因此，癌症可以包括原发性癌症或转移性癌症。
由本说明书提出的生物标志物和/或参照标志物可以用于以高准确性选择适合于应用抗c-Met抗体的受试者，由此实现个体疗法，从而抗c-Met抗体能对个体患者展现出最大的效果。生物标志物和/或参照标志物还可以用于抗c-Met抗体的临床测试。
实施例
在下文中，本发明会通过实施例详细描述。
以下实施例仅意图例示本发明，而并不解释为限制本发明。
参照例1：抗c-Met抗体的构建
1.1.“AbF46”(一种针对c-Met的小鼠抗体)的生成
1.1.1.小鼠的免疫
为了获得开发杂交瘤细胞系必需的免疫小鼠，给5只BALB/c小鼠(Japan SLC,Inc.)(4至6周龄)中的每只腹膜内注射100μg人c-Met/Fc融合蛋白(R&DSystems)和1个体积完全弗氏佐剂的混合物。注射后2周，用50μg人c-Met/Fc蛋白和1个体积的不完全弗氏佐剂的混合物对相同小鼠进行第二次腹膜内注射。第二次免疫后1周，最终加强免疫应答。3天后，从小鼠的尾部采集血液，并且将血清在PBS中以1/1000稀释，并且用于通过ELISA检查针对c-Met的抗体的效价。选择发现为具有足够抗体效价的小鼠以在细胞融合过程中使用。
1.1.2.细胞融合和杂交瘤的生成
细胞融合前3天，用50μg人c-Met/Fc融合蛋白和1个体积的PBS的混合物的腹膜内注射免疫BALB/c小鼠(Japan SLC,Inc.)。将经免疫的小鼠麻醉，之后从身体的左半边切出脾。将脾用网处理以分离脾细胞，然后将脾细胞在培养基(DMEM,GIBCO,Invitrogen)中悬浮。将细胞悬浮液离心以回收细胞层。将如此获得的脾细胞(1x108个细胞)与骨髓瘤细胞(Sp2/0)(1x108个细胞)混合，接着旋转以给出细胞团粒。将细胞团粒缓慢悬浮，用DMEM中的45％聚乙二醇(PEG)(1mL)于37℃处理1分钟，并且补充1mL DMEM。在10分钟里对细胞添加10mL DMEM，之后在37℃的水浴中进行温育5分钟。然后，将细胞体积调节至50mL，之后离心。将如此形成的细胞团粒在选择培养基(HAT培养基)中以1～2×105个细胞/mL的密度重悬，并将0.1mL细胞悬浮液分配至96孔 板的每孔，然后将所述96孔板于37℃在CO2培养箱中温育以建立杂交瘤细胞群体。
1.1.3.选择生成针对c-Met蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞
自参照例1.1.2中建立的杂交瘤细胞群体，通过使用人c-Met/Fc融合蛋白和人Fc蛋白作为抗原的ELISA筛选显示对c-Met蛋白的特异性应答的杂交瘤细胞。
将人c-Met/Fc融合蛋白以50μL(2μg/mL)/孔的量接种至微量滴定板，并且容许粘附至每孔的表面。通过清洗除去保持未结合的抗体。对于用于选择不结合c-Met但识别Fc的抗体，将人Fc蛋白以相同的方式附着于板表面。
将参照例1.1.2中获得的杂交瘤细胞培养物以50μL的量添加至板的每孔，并温育1小时。将保持未反应的细胞用足够量的Tris缓冲盐水和Tween 20(TBST)洗去。将山羊抗小鼠IgG-辣根过氧化物酶(HRP)添加至板，并于室温温育1小时。将板用足够量的TBST清洗，接着使过氧化物酶与底物(OPD)起反应。在ELISA读板仪上测量于450nm的吸光度。
将分泌特异性且强烈结合人c-Met而非人Fc的抗体的杂交瘤细胞系重复选择。自通过重复选择获得的杂交瘤细胞系，最终通过有限稀释分离出生成单克隆抗体的单个克隆。将该生成单克隆抗体的杂交瘤细胞系的单个克隆在2009年10月6日以保藏No.KCLRF-BP-00220，微生物分类命名为SAIT-MET-AbF46依照布达佩斯条约保藏于韩国细胞系研究基金会(Korean Cell Line Research Foundation)(一家位于韩国首尔钟路区(Jongno-Gu)Yungun-Dong的国际保藏单位)(参考韩国专利Laid-Open公开文本No.2011-0047698)。
1.1.4.单克隆抗体的生成和纯化
将参照例1.1.3中获得的杂交瘤细胞系在无血清的培养基中培养，并且自细胞培养物生成并纯化单克隆抗体(AbF46)。
首先，将在50mL补充有10％(v/v)FBS的培养基(DMEM)中培养的杂交瘤细胞离心，并将细胞团粒用20mL PBS清洗两次或更多次以自其除去FBS。然后，将细胞在50mL DMEM中重悬，并于37℃在CO2培养箱中温育3天。
在通过离心除去细胞后，将上清液在使用前于4℃贮存或者立即用于抗体的分离和纯化。使用装备有亲和柱(蛋白G琼脂糖柱；Pharmacia,USA)的AKTA系统(GE Healthcare)来从50至300mL上清液纯化抗体，接着用滤器(Amicon)浓缩。在用于以下实施例前，将PBS中的抗体贮存。
1.2.chAbF46(一种针对c-Met的嵌合抗体)的构建
小鼠抗体易于引发人的免疫原性。为了解决此问题，通过用人IgG1抗体的氨基酸序列替换恒定区，而非负责抗体特异性的可变区自实验例1.1.4中生成的小鼠抗体AbF46构建chAbF46(一种嵌合抗体)。
在这点上，将基因设计为包含“EcoRI-信号序列-VH-NheI-CH-TGA-XhoI”的核苷酸序列(SEQ ID NO:38)(对于重链)和“EcoRI-信号序列-VL-BsiWI-CL-TGA-XhoI”的核苷酸序列(SEQ ID NO:39)(对于轻链)，并合成。然后，用EcoRI(NEB,R0101S)和XhoI(NEB,R0146S)消化具有重链核苷酸序列(SEQ ID NO:38)的DNA片段和具有轻链核苷酸序列(SEQ ID NO:39)的DNA片段，之后将其分别克隆到封装于OptiCHOTM抗体表达试剂盒(产品目录编号12762-019,Invitrogen)中的pOptiVECTM-TOPO TA克隆试剂盒和pcDNATM3.3-TOPO TA克隆试剂盒(产品目录编号8300-01)中。
使用Qiagen Maxiprep试剂盒(产品目录编号12662)扩增每种构建的载体，并使用FreestyleTM MAX 293表达系统(Invitrogen)实施瞬时表达。使用293F细胞进行表达，并将其以悬浮培养形式在FreeStyleTM293表达培养基中培养。在瞬时表达前1天时，以5x105个细胞/ml的浓度提供细胞，并且在24小时后，在细胞数目达到1x106个细胞/ml时，实施瞬时表达。通过使用FreestyleTMMAX试剂(Invitrogen)的脂质体试剂方法实施转染，其中在15ml管中，将DNA以1:1(重链DNA:轻链DNA)的混合物比率提供，并与2ml OptiProTMSFM(invtrogen)混合(管A)，并在另一个15ml管中，将100ul(微升)FreestyleTM MAX试剂和2mlOptiProTMSFM混合(管B)，接着混合管A和管B，并温育15分钟。将获得的混合物与瞬时表达前1天提供的细胞缓慢混合。在完成转染后，将细胞在130rpm培养箱中在37℃，80％湿度，和8％CO2的条件下温育5天。
此后，将细胞在补充有10％(v/v)FBS的DMEM中于37℃在5％CO2条件下温育5小时，然后在无FBS的DMEM中于37℃在5％CO2条件下温育48小时。
在离心后，将上清液应用于AKTA Prime(GE Healthcare)以纯化抗体。在这点上，将100mL上清液以5mL/min的流速加载到装备有蛋白A柱(GE healthcare,17-0405-03)的AKTA Prime，接着用IgG洗脱缓冲液(Thermo Scientific,21004)洗脱。将缓冲液用PBS更换以纯化嵌合抗体AbF46(下文称为“chAbF46”)。
1.3.自嵌合抗体chAbF46构建人源化抗体huAbF46
1.3.1.重链人源化
为了设计两个域H1-重域和H3-重域，分析与参照例1.2中纯化的小鼠抗体AbF46的VH基因共享最高同一性/同源性的人种系基因。Ig BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)结果揭示了VH3-71在氨基酸水平上具有83％的同一性/同一性/同源性。依照Kabat编号方式限定小鼠抗体AbF46的CDR-H1，CDR-H2，和CDR-H3。进行设计以将小鼠抗体AbF46的CDR引入VH3-71的框架中。因此，在位置30(S→T)，48(V→L)，73(D→N)，和78(T→L)处进行向小鼠AbF46的氨基酸序列的回复突变。然后，将H1在位置83(R→K)和84(A→T)处进一步突变以最终建立H1-重(SEQ ID NO:40)和H3-重(SEQ ID NO:41)。
为了在设计H4-重中使用，通过BLAST搜索分析人抗体框架。结果揭示了VH3亚型(已知为最稳定的)是与小鼠抗体AbF46在框架和序列中非常相似。将小鼠抗体AbF46的CDR-H1，CDR-H2，和CDR-H3依照Kabat编号方式限定，并引入VH3亚型中以构建H4-重(SEQ ID NO:42)。
1.3.2.轻链人源化
为了设计两个域H1-轻域(SEQ ID NO:43)和H2-轻域(SEQ ID NO:44)，分析与小鼠抗体AbF46的VH基因共享最高同一性/同源性的人种系基因。IgBLAST搜索结果揭示了VK4-1在氨基酸水平上具有75％的同一性/同源性。依照Kabat编号方式限定小鼠抗体AbF46的CDR-L1，CDR-L2，和CDR-L3。进行设计以将小鼠抗体AbF46的CDR引入VK4-1的框架中。因此，在位置36(Y→H)，46(L→M)，和49(Y→I)处进行向小鼠AbF46的氨基酸序列的回复突变。仅在H2-轻上的位置49(Y→I)处进行一处回复突变。
为了设计H3-轻(SEQ ID NO:45)，通过BLAST搜索分析与小鼠抗体AbF46的VL基因共享最高同一性/同源性的人种系基因。因此，选择VK2-40。发现小鼠抗体AbF46的VL和VK2-40在氨基酸水平上具有61％的同一性/同源性。将小鼠抗体的CDR-L1，CDR-L2，和CDR-L3依照Kabat编号方式限定，并引入VK4-1的框架中。在H3-轻上的位置36(Y→H)，46(L→M)，和49(Y→I)处进行回复突变。
为了在设计H4-轻(SEQ ID NO:46)中使用，分析人抗体框架。Blast搜索揭示了Vk1亚型(已知为最稳定的)与小鼠抗体AbF46在框架和序列中非常相 似。将小鼠抗体AbF46的CDR-L1，CDR-L2，和CDR-L3依照Kabat编号方式限定，并引入Vk1亚型中。因此，在H4-轻上的位置36(Y→H)，46(L→M)，和49(Y→I)处进行回复突变。
此后，用EcoRI(NEB,R0101S)和XhoI(NEB,R0146S)消化具有重链核苷酸序列(H1-重：SEQ ID NO:47，H3-重：SEQ ID NO:48，H4-重：SEQ ID NO:49)的DNA片段和具有轻链核苷酸序列(H1-轻：SEQ ID NO:50，H2-轻：SEQ ID NO:51，H3-轻：SEQ ID NO:52，H4-轻：SEQ IDNO:53)的DNA片段，之后将其分别克隆到封装于OptiCHOTM抗体表达试剂盒(产品目录编号12762-019,Invitrogen)中的pOptiVECTM-TOPO TA克隆试剂盒和pcDNATM3.3-TOPO TA克隆试剂盒(产品目录编号8300-01)中，从而构建重组载体以表达人源化抗体。
使用Qiagen Maxiprep试剂盒(产品目录编号12662)扩增每种构建的载体，并使用FreestyleTM MAX 293表达系统(Invitrogen)实施瞬时表达。使用293F细胞进行表达，并将其以悬浮培养形式在FreeStyleTM293表达培养基中培养。在瞬时表达前1天时，以5x105个细胞/ml的浓度提供细胞，并且在24小时后，在细胞数目达到1x106个细胞/ml时，实施瞬时表达。通过使用FreestyleTMMAX试剂(Invitrogen)的脂质体试剂方法实施转染，其中在15ml管中，将DNA以1:1(重链DNA:轻链DNA)的混合物比率提供，并与2ml OptiProTMSFM(invtrogen)混合(管A)，并在另一个15ml管中，将100ul(微升)FreestyleTM MAX试剂和2mlOptiProTMSFM混合(管B)，接着混合管A和管B，并温育15分钟。将获得的混合物与瞬时表达前1天提供的细胞缓慢混合。在完成转染后，将细胞在130rpm培养箱中在37℃，80％湿度，和8％CO2的条件下温育5天。
在离心后，将上清液应用于AKTA Prime(GE Healthcare)以纯化抗体。在这点上，将100mL上清液以5mL/min的流速加载到装备有蛋白A柱(GE healthcare,17-0405-03)的AKTA Prime，接着用IgG洗脱缓冲液(Thermo Scientific,21004)洗脱。将缓冲液用PBS更换以纯化人源化抗体AbF46(下文称为“huAbF46”)。以下实施例中使用的人源化抗体huAbF46包含H4-重(SEQ ID NO:42)和H4-轻(SEQ ID NO:46)的组合。
1.4.huAbF46抗体的scFV文库的构建
为了用于自huAbF46抗体的重链和轻链可变区构建huAbF46抗体的scFv，对于重链和轻链可变区中的每种，基因设计为具有“VH-接头-VL”的结 构，其中接头具有氨基酸序列“GLGGLGGGGSGGGGSGGSSGVGS”(SEQ ID NO:54)。编码huAbF46的设计的scFv的多核苷酸序列(SEQ ID NO:55)在Bioneer合成，并且多核苷酸的表达载体具有SEQ ID NO:56的核苷酸序列。
在表达后，发现产物展现出对c-Met的特异性。
1.5.构建文库基因以进行亲和力成熟
1.5.1.靶CDR的选择和引物的合成
在以下步骤中实现huAbF46的亲和力成熟。首先，依照Kabat编号方式限定6个互补决定区(CDRs)。下文表7中给出CDR。
表7
CDR 氨基酸序列
CDR-H1 DYYMS(SEQ ID NO:1)
CDR-H2 FIRNKANGYTTEYSASVKG(SEQ ID NO:2)
CDR-H3 DNWFAY(SEQ ID NO:3)
CDR-L1 KSSQSLLASGNQNNYLA(SEQ ID NO:10)
CDR-L2 WASTRVS(SEQ ID NO:11)
CDR-L3 QQSYSAPLT(SEQ ID NO:12)
为了用于将随机序列引入抗体的CDR中，如下设计引物。常规地，利用N密码子以将相同比率的碱基(25％A，25％G，25％C，25％T)引入期望的突变位点中。在此实验中，以如下的方式进行随机碱基对huAbF46的CDR的引入，从而在编码每个CDR的野生型多核苷酸中每个密码子的三个核苷酸中，第一个和第二个核苷酸在整个序列的85％里是保守的，而其它三种核苷酸以相同的百分比(各5％)引入，并且对第三个核苷酸赋予相同概率(33％G，33％C，33％T)。
1.5.2.构建huAbF46抗体的文库和针对c-Met的亲和力
使用以与参照例1.5.1中相同的方式合成的引物实施经由引入随机序列的抗体基因文库构建。使用覆盖huAbF46的scFV的多核苷酸作为模板获得两个PCR产物，并将其进行重叠延伸PCR以给出仅突变期望的CDR的huAbF46抗体的scFv文库基因。构建从scFV文库基因制备的靶向6个CDR中每个的文库。
将每个文库的针对c-Met的亲和力与野生型的针对c-Met的亲和力比较。 与野生型相比，大多数文库在针对c-Met的亲和力上更低。针对c-Met的亲和力在一些突变体中得到保持。
1.6.自文库选择具有改善的亲和力的抗体
在针对c-Met的构建文库的亲和力成熟后，分析来自每个克隆的scFv的核苷酸序列。如此获得的核苷酸序列汇总于表8，并转化成IgG形式。在随后的实验中使用分别自克隆L3-1，L3-2，L3-3，和L3-5生成的4种抗体。
表8
克隆 构建的文库 CDR序列
H11-4 CDR-H1 PEYYMS(SEQ ID NO:22)
YC151 CDR-H1 PDYYMS(SEQ ID NO:23)
YC193 CDR-H1 SDYYMS(SEQ ID NO:24)
YC244 CDR-H2 RNNANGNT(SEQ ID NO:25)
YC321 CDR-H2 RNKVNGYT(SEQ ID NO:26)
YC354 CDR-H3 DNWLSY(SEQ ID NO:27)
YC374 CDR-H3 DNWLTY(SEQ ID NO:28)
L1-1 CDR-L1 KSSHSLLASGNQNNYLA(SEQ ID NO:29)
L1-3 CDR-L1 KSSRSLLSSGNHKNYLA(SEQ ID NO:30)
L1-4 CDR-L1 KSSKSLLASGNQNNYLA(SEQ ID NO:31)
L1-12 CDR-L1 KSSRSLLASGNQNNYLA(SEQ ID NO:32)
L1-22 CDR-L1 KSSHSLLASGNQNNYLA(SEQ ID NO:33)
L2-9 CDR-L2 WASKRVS(SEQ ID NO:34)
L2-12 CDR-L2 WGSTRVS(SEQ ID NO:35)
L2-16 CDR-L2 WGSTRVP(SEQ ID NO:36)
L3-1 CDR-L3 QQSYSRPYT(SEQ ID NO:13)
L3-2 CDR-L3 GQSYSRPLT(SEQ ID NO:14)
L3-3 CDR-L3 AQSYSHPFS(SEQ ID NO:15)
L3-5 CDR-L3 QQSYSRPFT(SEQ ID NO:16)
L3-32 CDR-L3 QQSYSKPFT(SEQ ID NO:37)
1.7.将选择的抗体转化成IgG
将编码4种选择抗体的重链的相应多核苷酸设计为具有“EcoRI-信号序 列-VH-NheI-CH-XhoI”(SEQ ID NO:38)的结构。将huAbF46抗体的重链原样使用，因为其氨基酸在亲和力成熟过程中没有改变。然而，在铰链区的情况中，采用U6-HC7铰链(SEQ ID NO:57)替换人IgG1的铰链。对于轻链，还将基因设计为具有“EcoRI-信号序列-VL-BsiWI-CL-XhoI”的结构。编码亲和力成熟后选择的4种抗体的轻链可变区的多核苷酸在Bioneer合成。然后，用EcoRI(NEB,R0101S)和XhoI(NEB,R0146S)消化具有重链核苷酸序列(SEQ ID NO:38)的DNA片段和具有轻链核苷酸序列的DNA片段(包含L3-1-衍生的CDR-L3的DNA片段：SEQ ID NO:58，包含L3-2衍生的CDR-L3的DNA片段：SEQ ID NO:59，包含L3-3衍生的CDR-L3的DNA片段：SEQ ID NO:60，和包含L3-5衍生的CDR-L3的DNA片段：SEQ ID NO:61)，之后将其分别克隆到封装于OptiCHOTM抗体表达试剂盒(产品目录编号12762-019,Invitrogen)中的pOptiVECTM-TOPO TA克隆试剂盒和pcDNATM3.3-TOPO TA克隆试剂盒(产品目录编号8300-01)中，从而构建重组载体以表达亲和力成熟的抗体。
使用Qiagen Maxiprep试剂盒(产品目录编号12662)扩增每种构建的载体，并使用FreestyleTM MAX 293表达系统(Invitrogen)实施瞬时表达。使用293F细胞进行表达，并将其以悬浮培养形式在FreeStyleTM293表达培养基中培养。在启动瞬时表达前1天时，以5x105个细胞/ml的浓度提供细胞，并且在24小时后，在细胞数目达到1x106个细胞/ml时，实施瞬时表达。通过使用FreestyleTMMAX试剂(Invitrogen)的脂质体试剂方法实施转染，其中在15ml管中，将DNA以1:1(重链DNA:轻链DNA)的混合物比率提供，并与2ml OptiProTMSFM(invtrogen)混合(管A)，并在另一个15ml管中，将100ul(微升)FreestyleTM MAX试剂和2mlOptiProTMSFM混合(管B)，接着混合管A和管B，并温育15分钟。将获得的混合物与瞬时表达前1天提供的细胞缓慢混合。在完成转染后，将细胞在130rpm培养箱中在37℃，80％湿度，和8％CO2的条件下温育5天。
在离心后，将上清液应用于AKTA Prime(GE Healthcare)以纯化抗体。在这点上，将100mL上清液以5mL/min的流速加载到装备有蛋白A柱(GE healthcare,17-0405-03)的AKTA Prime，接着用IgG洗脱缓冲液(Thermo Scientific,21004)洗脱。将缓冲液用PBS更换以纯化4种亲和力成熟的抗体(下文分别称为“huAbF46-H4-A1(L3-1起源)，huAbF46-H4-A2(L3-2起源)，huAbF46-H4-A3(L3-3起源)，和huAbF46-H4-A5(L3-5起源)”)。
1.8.构建恒定区和/或铰链区替代的huAbF46-H4-A1
在参照例1.7中选择的4种抗体中，发现huAbF46-H4-A1在针对c-Met的亲和力上最高且在Akt磷酸化和c-Met降解程度上最低。在该抗体中，将铰链区，或恒定区和铰链区替代。
抗体huAbF46-H4-A1(U6-HC7)由重链和轻链构成，所述重链包含huAbF46-H4-A1的重链可变区，U6-HC7铰链，和人IgG1恒定区的恒定区，所述轻链包含huAbF46-H4-A1的轻链可变区和人kappa恒定区。抗体huAbF46-H4-A1(IgG2铰链)由重链和轻链组成，所述重链包含重链可变区，人IgG2铰链区，和人IgG1恒定区，所述轻链包含huAbF46-H4-A1的轻链可变区和人kappa恒定区。抗体huAbF46-H4-A1(IgG2Fc)由huAbF46-H4-A1的重链可变区，人IgG2铰链区，和人IgG2恒定区，和包含huAbF46-H4-A1的轻链可变区和人kappa恒定区的轻链构成。因此，轻链的人kappa恒定区上第36位的组氨酸残基在所有三种抗体中改变为酪氨酸以提高抗体生成。
为了用于构建三种抗体，编码由huAbF46-H4-A1的重链可变区，U6-HC7铰链区，和人IgG1恒定区构成的多肽(SEQ ID NO:62)的多核苷酸(SEQ ID NO:63)，编码由huAbF46-H4-A1的重链可变区，人IgG2铰链区，和人IgG1恒定区构成的多肽(SEQ ID NO:64)的多核苷酸(SEQ ID NO:65)，编码由huAbF46-H4-A1的重链可变区，人IgG2铰链区，和人IgG2恒定区构成的多肽(SEQ ID NO:66)的多核苷酸(SEQ ID NO:67)，和编码由huAbF46-H4-A1的轻链可变区(其中用酪氨酸残基替换第36位的组氨酸)和人kappa恒定区构成的多肽(SEQ IDNO:68)的多核苷酸(SEQ ID NO:69)在Bioneer合成。然后，将具有重链核苷酸序列的DNA片段插入封装于OptiCHOTM抗体表达试剂盒(产品目录编号12762-019,Invitrogen)中的pOptiVECTM-TOPO TA克隆试剂盒中，而将具有轻链核苷酸序列的DNA片段插入pcDNATM3.3-TOPO TA克隆试剂盒(产品目录编号8300-01)中，从而构建载体以表达抗体。
使用Qiagen Maxiprep试剂盒(产品目录编号12662)扩增每种构建的载体，并使用FreestyleTM MAX 293表达系统(Invitrogen)实施瞬时表达。使用293F细胞进行表达，并将其以悬浮培养形式在FreeStyleTM293表达培养基中培养。在瞬时表达前1天时，以5x105个细胞/ml的浓度提供细胞，并且在24小时后，在细胞数目达到1x106个细胞/ml时，实施瞬时表达。通过使用FreestyleTMMAX试剂(Invitrogen)的脂质体试剂方法实施转染，其中在15ml管中，将DNA以1:1(重链DNA:轻链DNA)的混合物比率提供，并与2ml OptiProTMSFM(invtrogen)混合(管A)，并在另一个15ml管中，将100ul(微升)FreestyleTM MAX试剂和2mlOptiProTMSFM混合(管B)，接着混合管A和管B，并温育15分钟。将获得的混合物与瞬时表达前1天提供的细胞缓慢混合。在完成转染后，将细胞在130rpm培养箱中在37℃，80％湿度，和8％CO2的条件下温育5天。
在离心后，将上清液应用于AKTA Prime(GE Healthcare)以纯化抗体。在这点上，将100mL上清液以5mL/min的流速加载到装备有蛋白A柱(GE healthcare,17-0405-03)的AKTA Prime，接着用IgG洗脱缓冲液(Thermo Scientific,21004)洗脱。将缓冲液用PBS更换以最终纯化3种抗体(huAbF46-H4-A1(U6-HC7)，huAbF46-H4-A1(IgG2铰链)，和huAbF46-H4-A1(IgG2Fc))。在三种抗体中，将huAbF46-H4-A1(IgG2Fc)代表性选出以用于以下的实施例，并且称为抗c-Met抗体L3-1Y/IgG2。
参照例2：异种移植物模型和测试样品的制备
经由腹膜内注射嫁接有患者衍生肿瘤组织(肿瘤：非小细胞肺癌(NSCLC))的14种小鼠异种移植物模型自Oncotest GmbH(Germany)获得。
分别对14种小鼠异种移植物模型施用候选药物最终形式(L3-1Y/IgG2：n(每个模型的)＝10)和空媒介物(对照：n(每个模型的)＝10)，并且测量每个模型中的肿瘤大小，由此测定对抗体的响应。
将L3-1Y/IgG2一周一次以5mg/kg的量施用(在对照的情况中，施用PBS缓冲液)，其中从在小鼠异种移植物模型中的肿瘤大小达到500mm3或更多时开始施用。将实验进行总共6周，并且在肿瘤大小达到2000mm3或更多时停止。
通过以下公式计算肿瘤大小：
肿瘤大小(mm3)＝(长径*短径*短径)/2
经由ANOVA分析实施效力组的测定，并且排除p-值是0.05或更小的情况。也就是说，通过ANOVA分析测试如下的假设，即抗体处理组中肿瘤大小的分布与抗体未处理组相比没有改变，其中在p-值是0.05或更小时，组确定为非效力组，且在p-值超过0.05时，组确定为效力组。
表9中显示了来自用于L3-1Y/IgG2处理的上述小鼠异种移植物模型的响应结果：
【表9】
在完成上述实验后自小鼠提取肿瘤组织，它们的一部分制备为仅福尔马林固定的经石蜡包埋的(FFPE)块，并且将剩余部分进行依照制造商的方案使用Qiagen RNeasy Mini试剂盒(产品目录编号74104)的总RNA提取。
使用Ventana MET IHC(免疫组织化学)(Roche；US2013089541A1)依照制造商的标准方案，使用制备的FFPE块以测量表面表达c-MET，并且使用提取的总RNA通过实时PCR(RT-PCR)(MET有义引物：CCTTGAACAGAATCACTG(SEQ ID NO:272)；MET反义引物：CCATGTTTCATGTATGGTA(SEQ ID NO:273))测量c-MET mRNA表达。
图1A中显示了从Ventana MET IHC获得的结果。在此测定法中，在IHC得分是2～3时，将样品确定为效力组。如图1A中显示的，甚至LXFA297，LXFA983，和LXFA1041(其是非效力组)具有2～3的IHC得分，这指示了IHC测定法没有提供效力或非效力组的高准确选择(准确性：约50％)。
同时，图1B中显示了在图1A中确定为效力组的6个模型(LXFA297、LXFA983、LXFA1041、LXFA623、LXFA526和LXFA1647)的获得的RT-PCR结果。在图1B中，Y轴是自RT-PCR测量的Ct值，X轴是上文获得的IHC得分，“◆”指非效力组，而“●”指效力组。如图1B中显示的，依照RT-PCR的结果，非效力组中的Ct值均是0或更多，且效力组中的Ct值均是小于0。因此，与先前存在的IHC测定法相比，依照RT-PCR结果的选择提供了非效力或效力组的更准确选择(准确性：约71％至约93％)。因此，若主要使用RT-PCR结果并且额外考虑IHC得分，则可以实现更准确的选择(例如，在RT-PCR的Ct值小于0且IHC得分是2至3时，可以选择样品作为效力组)。
实施例1：生物标志物的选择
使用参照例2中的异种移植物样品(14种临床前样品)以测试参照例1中制备的c-Met抗体L3-1Y/IgG2的效力，测量L3-1Y/IgG2效力和非效力组中的基因表达水平。使用获得的基因表达水平，测定效力和非效力组之间基因表达的差异(△log2(exp))，并且选择在效力和非效力组之间具有高度差异的基因。
使用Affymatrix人u133plus 2.0微阵列实验原始数据(cell文件)，并使用由Affymatrix提供的微阵列分析控制台测量基因表达的差异，测量每种探针的log2(探针强度)值以用作标准值。表10中汇总了使用的探针：
【表10】
基于效力组和非效力组之间测量的表达水平差异，从最大至最小列出基因。
表11中汇总了获得的结果(在表11中，delta expFold越大指效力和非效力 之间的表达水平差异越大)：
【表11】
基因 ΔexprFold 探针ID
THSD7A 4.29 213894_at
THSD7A 4.29 214920_at
THSD7A 3.73 230008_at
MET 2.64 213816_s_at
RAB31 2.46 217763_s_at
RAB31 2.30 217764_s_at
FAM126A 2.30 223625_at
PHC1 2.14 218338_at
CHML 2.00 2263S0_at
FAM126A 2.00 227239_at
ST8SIA4 2.00 242943_at
CAV1 1.62 212097_at
如表11中显示的，效力和非效力之间的表达水平差异以如下的次序列出：THSD7A＞MET＞RAB31＞FAM126A＞PHC1＞CHML＞ST8SIA4＞CAV1。
选择8种基因作为用于测定抗c-Met抗体的效力的生物标志物。
实施例2：参照标志物的选择
使用总共120个肺癌腺癌微阵列数据(公共DB-GEO：基因表达全集；ht中://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，选择在细胞间具有低表达水平变化的基因。
对于自GEO获得的NSCLC肿瘤衍生的总RNA，使用affymetrix U133plus2.0微阵列原始数据(cell文件)测量每个探针的log2(int)值，并列出在上述120个样品间具有低变异系数(CV)的基因。然后，选择与靶基因(实施例1中选择的8种生物标志物)具有相似的log2(int)值分布的基因。表12中汇总了使用的引物：
【表12】
图2A和2B中显示了获得的结果。如图2A中显示的，选择10种基因(其具有低基因表达变化)，即EEF1A1，RPL23A，TPT1，HUWE1，MATR3，SRSF3，HNRNPC，SMARCA4，WDR90，和TUT1作为参照标志物。
与先前存在的对照基因相比，测量选择的参照标志物的变化和分类性能差异(Oncotype DXTM；参见图2B)。
表13和14中汇总了用于选择的10种参照标志物的探针和引物：
【表13】
【表14】
使用参照例2中制备的14种NSCLC mRNA样品和上文描述的方法，测量 选择的10种参照标志物与对照基因的CV(变异系数)值的变化。
图3A(对照基因)和3B(选择的参照标志物)中显示了获得的结果。如图3A和3B中显示的，选择的10种参照标志物的平均CV值是11.770，其与先前存在的对照基因(OncotypeDXTM)的平均CV值(平均CV＝15.40335)相比降低得相当多。在10种参照标志物中，5种基因RPL23A，TPT1，MATR3，SRSF3，和HNRNPC展现出特别低的基因表达变化(5种基因的平均CV值＝8.39)。
实施例3：使用选择的生物标志物和参照标志物选择抗c-Met抗体的效力组
将选择的生物标志物和参照标志物应用于小鼠异种移植物模型，并且检查标志物的效力/非效力组选择准确性。
对此，将自小鼠异种移植物模型的肿瘤组织提取的总RNA进行使用表15的探针和表16的引物在表17的条件下的PCR，获得8种生物标志物和5种参照标志物(TPT1、EEF1M、TUT1、MATR3和SMARCA4)的Ct值。
【表15】
【表16】
【表17】
依照表18实施效力或非效力组的测定：
【表18】
在表18中：
“参照标准值”对于CAV1，FAM126A，MET，RAB31，ST8SIA4，和THSD7A，数值＝[Min(效力值(ΔCt))+Max(非效力值(ΔCt))]/2；
“参照标准值”对于CMHL和PHC1＝[Min(非效力值(ΔCt))+Max(效力值(ΔCt))]/2；
ΔCt：5种参照标志物(TPT1、EEF1M、TUT1、MATR3和SMARCA)的平均Ct值–每种生物标志物的Ct值)；
Min(效力值(ΔCt))：效力组的最小ΔCt；
Max(非效力值(ΔCt))：非效力组的最大ΔCt；
Min(非效力值(ΔCt))：非效力组的最小ΔCt；和
Max(效力值(ΔCt))：效力组的最大ΔCt；
将对每种生物标志物计算的ΔCt值与表18的数值比较。在CAV1，FAM126A，MET，RAB31，RAB31，ST8SIA4，和THSD7A的情况中，在单个生物标志物的ΔCt值高于表18的数值时，样品确定为效力组，并且在CMHL和PHC1的情况中，在单个生物标志物的ΔCt值低于表18的数值时，样品确定为效力组。
表19中显示了参照例2的14种小鼠异种移植物模型的效力/非效力组的测定准确性和Δ倍数数值。
【表19】
(准确性：使用每种生物标志物获得的预测抗体效力的准确性，随着数值越接近1(对应于100％)，准确性越高，且通过以下公式计算：
准确性＝{(TP+TN)/14}
(TP：在使用生物标志物的效力预测以及在使用L3-1Y/IgG2治疗的实际实验中(见表9)显示阳性结果的样品数)
(TN：在使用生物标志物的效力预测以及在使用L3-1Y/IgG2治疗的实际实验中(见表9)显示阴性结果的样品数)
Δ倍数：效力和非效力组之间的delta Ct(对照基因(参照标志物)Ct(如果参照标志物的数目是两种或更多种，则其意为“参照标志物的平均Ct值”)–靶基因(生物标志物)Ct)的差异，指示能够区别效力和非效力组的mRNA表达范围)。
如表19中显示的，选择的生物标志物和参照标志物可以实现抗c-Met抗体的效力和非效力组的高度准确测定，准确性为至少约60％，例如至少约80％。
应当理解，应当仅以描述性意义而非为了限制目的考虑本文中描述的例示性实施方案。每个实施方案内的特征或方面的描述应当通常认为可用于其它实施方案中的其它类似的特征或方面。
本文中引用的所有参考文献，包括出版物，专利申请，和专利在此通过提及并入，其程度就像每篇参考文献单独且明确指示为通过提及并入并且在本文中完整列出一样。
在描述本发明的背景中(尤其在所附权利要求书的背景中)使用术语“一个”和“一种”及“所述/该”和“至少一个/种”及类似的指示物应当解释为覆盖单数和复数两者，除非本文中另有指示或上下文明显矛盾。术语“至少一个/种”及伴随的一批一个或多个项(例如，“A和B中的至少一种”)的使用应当解释为意指选自列出项的一项(A或B)或两种或更多种列出项的任何组合(A和B)，除非本文中另有指示或上下文明显矛盾。术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应当解释为开放式术语(即意味着“包括但不限于”)，除非另有记录。本文中数值范围的叙述仅意图充当单独提及落入范围内的每个分开数值的简写方法，除非本文中另有指示，并且每个分开数值就像其单独在本文中叙述一样并入说明书。可以以任何合适的次序实施本文中描述的所有方法，除非本文中另有指示或上下文另外明显矛盾。本文中提供的任何 和所有例子，或例示性语言(例如“诸如”)的使用仅意图更好阐明本发明，并且不对本发明的范围造成限制，除非另有要求。说明书中的语言不应解释为指示任何不要求保护的要素为本发明的实践必需的。
本文中描述了本发明的优选实施方案，包括用于实施本发明的发明人已知的最佳模式。那些优选的实施方案的变型在阅读前述描述后对于本领域普通技术人员会变得显而易见。发明人预期熟练技术人员在适当时采用此类变型，并且发明人意图本发明以与本文中的明确描述不同的方式实施。因而，本发明包括可适用法律容许的所附权利要求书中叙述的主题的所有修改和等同方案。此外，本发明涵盖其所有可能变型中的上文描述的要素的任何组合，除非本文中另有指示或上下文另外明显矛盾。

Claims (4)

1.用于检测生物标志物的分子或试剂在制备一种用于预测抗c-Met抗体或其抗原结合片段在治疗非小细胞肺癌中的效力或为施用抗c-Met抗体或其抗原结合片段选择患有非小细胞肺癌受试者的组合物中的用途，其中所述生物标志物为
THSD7A，或
THSD7A和选自下组的至少一种的组合：MET，RAB31，FAM126A，PHC1，CHML，ST8SIA4，和CAV1，
其中所述抗c-Met抗体或其抗原结合片段特异性结合具有选自SEQ ID NO:71的氨基酸序列且包含SEQ ID NO:73的5至19个连续氨基酸的表位。
2.权利要求1的用途，其特征在于确定所述抗c-Met抗体或其抗原结合片段在如下情况时会有效或所述受试者适合应用所述抗c-Met抗体或其抗原结合片段：
在CAV1，FAM126A，MET，RAB31，ST8SIA4，和/或THSD7A的情况中，所述生物标志物在来自所述受试者的生物学样品中的水平高于参照标志物或参照样品的水平；或
在CMHL和/或PHC1的情况中，所述生物标志物在来自所述受试者的生物学样品中的水平低于参照标志物或参照样品的水平；
其中所述参照标志物是选自下组的至少一种：EEF1A1，RPL23A，TPT1，HUWE1，MATR3，SRSF3，HNRNPC，SMARCA4，WDR90，和TUT1，且所述参照样品是其中所述抗c-Met抗体或其抗原结合片段没有效力的样品。
3.权利要求1的用途，其中所述抗c-Met抗体或其抗原结合片段包含：
至少一种选自下组的重链互补决定区(CDR)：(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:4；(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:2，或包含SEQ ID NO:2的8-19个连续氨基酸且包含SEQID NO:2的第3至第10位的氨基酸序列；和(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:85，或包含SEQ ID NO:85的6-13个连续氨基酸且包含SEQ ID NO:85的第1至第6位的氨基酸序列；
至少一种选自下组的轻链互补决定区：(a)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:7，(b)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:8，和(c)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:86，或包含SEQ ID NO:89的9-17个连续氨基酸且包含SEQ ID NO:89的第1至第9位的氨基酸序列；或其组合。
4.权利要求1至3中任一项的用途，其中所述用于检测生物标志物的分子或试剂包含选自SEQ ID NO:109-259的至少一种探针，选自SEQ ID NO:270-285的至少一对引物，或其组合。
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