ES2921531T3 - Formulaciones para vacunas contra la neoplasia - Google Patents

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Abstract

La presente invención se relaciona con la vacuna contra la neoplasia o la formulación de composición inmunogénica para el tratamiento o prevención de neoplasia en un sujeto. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Formulaciones para vacunas contra la neoplasia
SOLICITUDES RELACIONADAS
[0001] Esta solicitud reivindica el beneficio y la prioridad de la solicitud de patente provisional de EE. UU. de número de serie 61/913,172, presentada el 6 de diciembre de 2013.
CAMPO DE LA PRESENTE INVENCIÓN
[0002] La presente invención se refiere a formulaciones para el tratamiento de neoplasias. Más particularmente, la presente invención se refiere a las formulaciones de vacunas contra tumores para el tratamiento de neoplasias en un sujeto.
ANTECEDENTES DE LA PRESENTE INVENCIÓN
[0003] Aproximadamente 1,6 millones de de Estados Unidos son diagnosticados con neoplasia cada año, y se espera que aproximadamente 580.000 personas en los Estados Unidos mueran a causa de la enfermedad en 2013. Durante las últimas décadas ha habido mejoras significativas en la detección, diagnóstico y tratamiento de neoplasia, que han aumentado significativamente la tasa de supervivencia para muchos tipos de neoplasia. Sin embargo, solo alrededor del 60% de las personas diagnosticadas con neoplasia siguen vivas 5 años después del inicio del tratamiento, lo que convierte a la neoplasia en la segunda causa principal de muerte en los Estados Unidos.
[0004] Actualmente, hay una serie de diferentes terapias contra el cáncer existentes, que incluyen técnicas de ablación (por ejemplo, procedimientos quirúrgicos, tratamiento criogénico/térmico, ultrasonido, radiofrecuencia y radiación) y técnicas químicas (por ejemplo, agentes farmacéuticos, agentes citotóxicos/quimioterapéuticos, anticuerpos monoclonales, y varias combinaciones de los mismos). Desafortunadamente, dichas terapias se asocian con frecuencia con un riesgo grave, efectos secundarios tóxicos y costes extremadamente altos, así como con una eficacia incierta.
[0005] Existe un interés creciente en las terapias contra el cáncer que buscan dirigirse a las células cancerosas con el propio sistema inmunitario del paciente (por ejemplo, vacunas contra el cáncer) porque tales terapias pueden mitigar/eliminar algunas de las desventajas aquí descritas. Las vacunas contra el cáncer suelen estar compuestas por antígenos tumorales y moléculas inmunoestimuladoras (por ejemplo, citoquinas o ligandos TLR) que trabajan juntas para inducir células T citotóxicas específicas de antígeno que atacan y destruyen las células tumorales. Las vacunas contra el cáncer actuales contienen típicamente antígenos tumorales compartidos, que son proteínas nativas (es decir, proteínas codificadas por el ADN de todas las células normales del individuo) que se expresan selectivamente o se sobreexpresan en tumores que se encuentran en muchos individuos. Si bien tales antígenos tumorales compartidos son útiles para identificar tipos particulares de tumores, no son ideales como inmunógenos para dirigir una respuesta de células T a un tipo de tumor en particular porque están sujetos a los efectos de amortiguamiento inmunológico de la autotolerancia. Las vacunas que contienen neoantígenos específicos de tumor y específicos de paciente pueden superar algunas de las desventajas de las vacunas que contienen antígenos tumorales compartidos.
[0006] En general, cualquier vacuna debe tener una vida útil lo suficientemente larga para garantizar que la vacuna no se degrade o deteriore antes de su uso. La estabilidad durante el almacenamiento también requiere que los componentes de la vacuna no precipiten de la solución durante el almacenamiento. Sin embargo, lograr una estabilidad de almacenamiento adecuada puede ser difícil. En consecuencia, se necesitan nuevas formulaciones para vacunas.
[0007] El documento WO 2010/045345 A2 se refiere a terapias y composiciones farmacéuticas para el tratamiento de estados patológicos, tales como el cáncer. Luciana et al. (2006) Protein Sci Jun; 15(6); 1476-1488 se refiere a una estrategia para la disolución de péptidos insolubles.
CARACTERÍSTICAS DE LA PRESENTE INVENCIÓN
[0008] Basándose en la divulgación contenida en el presente documento, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende: (a) al menos un péptido neoantigénico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que al menos un péptido neoantigénico tiene una longitud que varía de 5 a 50 aminoácidos; (b) un modificador de pH que es una base, en el que el modificador de pH es succinato o citrato y en el que el modificador de pH está presente en la composición a una concentración de 1 mM a 10 mM; y (c) un portador farmacéuticamente aceptable que comprende i. agua: ii. dextrosa, sacarosa o trehalosa; y iii. 1-4% de dimetilsulfóxido.
[0009] En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar una solución de péptido neoantigénico para una vacuna contra la neoplasia, comprendiendo el procedimiento: (a) preparar una solución que comprende al menos un péptido neoantigénico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que el al menos un péptido neoantigénico tiene una longitud que varía de 5 a 50 aminoácidos; y (b) combinar la solución que comprende al menos un péptido neoantigénico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo con una solución que comprende una sal farmacéuticamente aceptable de ácido succínico o ácido cítrico, preparando así una solución peptídica para una vacuna contra la neoplasia, en la que la sal farmacéuticamente aceptable de ácido succínico o ácido cítrico está presente en la solución peptídica a una concentración de 1 mM a 10 mM y en la que la solución peptídica comprende agua; dextrosa, sacarosa o trehalosa; y 1-4% de dimetilsulfóxido; y preferiblemente (i) en la que la solución que comprende al menos un péptido neoantigénico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo comprende al menos dos o al menos tres, cuatro o cinco péptidos neoantigénicos: (ii) en la que la solución peptídica para una vacuna contra la neoplasia comprende agua, dextrosa, succinato de 1 mM a 10 mM y 1-4% de dimetilsulfóxido; o (iii) que comprende además, después de la etapa de combinación, filtrar la solución peptídica para una vacuna contra la neoplasia; y preferiblemente en la que la solución peptídica para una vacuna contra la neoplasia es liofilizable.
[0010] En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar una vacuna contra la neoplasia, comprendiendo el procedimiento: (a) preparar una solución de péptido neoantigénico según la presente invención: y (b) combinar la solución de péptido neoantigénico con una solución de un inmunomodulador o adyuvante, preparando así una vacuna contra la neoplasia, preferiblemente en la que el inmunomodulador o adyuvante se selecciona del grupo que consiste en 1018 ISS, sales de aluminio, Amplivax, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, Imiquimod, ImuFact IMP321, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, JuvImmune, LipoVac, MF59, monofosforil lípido A, Montanide IMS 1312. Montanide ISA 206. Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MPEC, ONTAK, PepTel®, sistema vectorial, micropartículas de PLGA, resiquimod, SRL172, virosomas y otras partículas similares a virus, YF-17D, VEGF trap, R848, beta-glucano, Pam3Cys y estímulo QS21 de Aquila.
[0011] En otro aspecto más, la presente invención proporciona una composición farmacéutica según la presente invención para su uso en el tratamiento de una neoplasia, en la que dicho tratamiento comprende administrar la composición farmacéutica a un sujeto diagnosticado con una neoplasia, preferiblemente comprendiendo además administrar una segunda, tercera o cuarta composición farmacéutica según la presente invención al sujeto.
[0012] En otro aspecto más, la presente invención proporciona un kit de vacunación o inmunización que comprende: (a) una composición según la presente invención, en la que la composición se envasa por separado y se liofiliza; y (b) una solución para la reconstitución de la composición liofilizada, preferiblemente en la que la solución contiene un adyuvante.
La presente invención y sus realizaciones se exponen en las reivindicaciones adjuntas.
[0013] La presente invención se refiere a vacunas contra la neoplasia o composiciones inmunogénicas para el tratamiento de la neoplasia, y más particularmente a las formulaciones de vacunas que comprenden un conjunto de neoantígenos específicos de tumor y específicos de paciente para el tratamiento de tumores en un sujeto.
[0014] En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica es una composición de vacuna.
[0015] En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica comprende al menos dos péptidos neoantigénicos. En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica comprende al menos tres péptidos neoantigénicos. En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica comprende al menos cuatro péptidos neoantigénicos. En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica comprende al menos cinco péptidos neoantigénicos. La vacuna o la composición inmunogénica contra la neoplasia comprende ventajosamente al menos cuatro neoantígenos diferentes (y por antígenos diferentes se pretende que cada antígeno tenga un neoepítopo diferente), por ejemplo, al menos 4 o 5 o 6 o 7 o 8 o 9 o 10 o 11 o 12 o 13 o 14 o 15 o 16 o 17 o 18 o 19 o 20 o 21 o 22 o 23 o 24 o 25 o 26 o 27 o 28 o 29 o 30 o 31 o 32 o 33 o 34 o 35 o 36 o 37 o 38 o 39 o 40 o más neoantígenos diferentes puden estar en la vacuna o la composición inmunogénica contra la neoplasia.
[0016] Según la presente invención, el péptido neoantigénico varía de 5 a 50 aminoácidos de longitud. En otra realización relacionada, el péptido neoantigénico varía de aproximadamente 15 a aproximadamente 35 aminoácidos de longitud. Típicamente, la longitud es mayor que aproximadamente 15 o 20 aminoácidos, por ejemplo, de 15 a 50 o aproximadamente 75 aminoácidos.
[0017] En un caso, la vacuna o la composición inmunogénica contra la neoplasia comprende además un modificador del pH y un portador farmacéuticamente aceptable.
[0018] Según la presente invención, el modificador de pH es una base. En ciertos casos, el modificador de pH es una sal de dicarboxilato o tricarboxilato. Según la presente invención, el modificador de pH es succinato o citrato.
[0019] En ciertos casos, el ácido succínico o una de sus sales farmacéuticamente aceptables comprende succinato disódico.
[0020] En ciertos casos, el succinato está presente en la formulación a una concentración de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 10 mM. En determinadas realizaciones, el succinato está presente en la formulación a una concentración de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 5 mM.
[0021] Según la presente invención, el portador farmacéuticamente aceptable comprende agua. Según la presente invención, el portador farmacéuticamente aceptable comprende dextrosa, sacarosa o trehalosa.
[0022] En ciertas realizaciones, el portador farmacéuticamente aceptable comprende dextrosa.
[0023] En ciertas realizaciones, el portador farmacéuticamente aceptable comprende trehalosa
[0024] En ciertas realizaciones, el portador farmacéuticamente aceptable comprende sacarosa.
[0025] Según la presente invención, el portador farmacéuticamente aceptable comprende dimetilsulfóxido.
[0026] En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica comprende además un inmunomodulador o adyuvante. En un caso, el procedimiento comprende además la administración de un inmunomodulador o adyuvante. En otra realización relacionada, el inmunomodulador o adyuvante se selecciona del grupo que consiste en poli-ICLC, 1018 ISS, sales de aluminio, Amplivax, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, Gm -CSF, IC30, IC31, Imiquimod, ImuFact IMP321, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, JuvImmune, LipoVac, MF59, monofosforil lípido A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, PEPTEL, sistema vectorioal, micropartículas de PLGA, resiquimod, SRL172, Virosomas y otras partículas similares a virus, YF-17D, VEGF trap, R848, beta-glucano, Pam3Cys y estímulo QS21 de Aquila. En otra realización adicional, el inmunomodulador o adyuvante es poli-ICLC.
[0027] La disolución de estos polímeros en agua da lugar a una solución ácida que se neutraliza, preferentemente a pH fisiológico, para dar la solución de adyuvante en la que se incorpora la vacuna o composición inmunogénica o antígeno(s) o vector(es) de la misma. Los grupos carboxilo del polímero están entonces parcialmente en COO'.
[0028] Preferentemente, se prepara una solución de adyuvante según la presente invención, especialmente de carbómero, en agua destilada, preferentemente en presencia de cloruro sódico, siendo la solución obtenida a pH ácido. Esta solución madre se diluye añadiéndola a la cantidad necesaria (para obtener la concentración final deseada), o a una parte sustancial de la misma, de agua cargada con sal, tal como NaCl, preferentemente suero fisiológico (NaCl 9 g/l), todo de una sola vez o en varias porciones, con neutralización concomitante o posterior (pH 7,3 a 7,4), preferentemente con una base, tal como NaOH. Esta solución a pH fisiológico se utiliza tal cual para reconstituir la vacuna, especialmente almacenada en forma liofilizada.
[0029] La concentración de polímero en la composición de vacuna final es de 0,01 % a 2 % p/v, más particularmente de 0,06 a 1 % p/v, preferiblemente de 0,1 a 0,6 % p/v.
[0030] En otra realización, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que es una vacuna contra la neoplasia, que comprende: de uno a cinco péptidos neoantigénicos o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos; 1-3% de dimetilsulfóxido; 3,6- 3,7 % de dextrosa en agua; ácido succinato 3,6-3,7 mM o una de sus sales; 0,5 mg/ml de poli I:poli C; 0,375 mg/ml de poli-L-lisina; 1,25 mg/ml de carboximetilcelulosa sódica; y 0,225% de cloruro de sodio. En ciertas realizaciones, cada uno de los uno a cinco péptidos neoantigénicos o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos están presentes en una concentración de aproximadamente 300 pg/ml.
[0031] En otro caso, la divulgación proporciona un procedimiento para preparar una solución de péptido neoantigénico para una vacuna contra la neoplasia, comprendiendo el procedimiento: proporcionar una solución que comprende al menos un péptido neoantigénico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y combinar la solución que comprende al menos un péptido neoantigénico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo con una solución que comprende ácido succínico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, preparando así una solución peptídica para una vacuna contra la neoplasia.
[0032] En ciertas realizaciones, la solución que comprende al menos un péptido neoantigénico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo comprende al menos dos (o 3, 4 o 5) péptidos neoantigénicos. En determinadas realizaciones, la solución peptídica para una vacuna contra la neoplasia comprende agua, dextrosa o trehalosa o sacarosa, succinato y dimetilsulfóxido. En ciertas realizaciones, el procedimiento comprende además, después del paso de combinación, filtrar la solución peptídica para una vacuna contra la neoplasia.
[0033] En otro caso, la divulgación proporciona un procedimiento para preparar una vacuna contra la neoplasia, comprendiendo el procedimiento: proporcionar una solución peptídica para una vacuna contra la neoplasia; y combinar la solución peptídica con una solución de un inmunomodulador o adyuvante, preparando así una vacuna contra la neoplasia.
[0034] En otro caso, la divulgación proporciona una vacuna contra la neoplasia fabricada mediante cualquier procedimiento descrito en el presente documento (por ejemplo, el procedimiento descrito anteriormente).
[0035] En otro caso, la divulgación proporciona una solución de péptido neoantigénico para una vacuna contra la neoplasia, que comprende: al menos un péptido neoantigénico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y ácido succínico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
[0036] En otro caso, la divulgación proporciona un procedimiento para tratar a un sujeto al que se le ha diagnosticado una neoplasia, comprendiendo el procedimiento: administrar una composición farmacéutica de la presente invención al sujeto, tratando así la neoplasia.
[0037] En ciertos casos, el procedimiento comprende además administrar una segunda composición farmacéutica de la presente invención al sujeto.
[0038] En ciertos casos, el procedimiento comprende además administrar una tercera composición farmacéutica de la presente invención al sujeto.
[0039] En ciertos casos, el procedimiento comprende además administrar una cuarta composición farmacéutica de la presente invención al sujeto.
[0040] La administración de la vacuna o la composición inmunogénica contra la neoplasia puede realizarse en una programación de tiempo, por ejemplo, semanal, quincenal, cada tres semanas, mensual, bimensual, cada trimestre del año (cada tres meses), cada tercio de año (cada cuatro meses), cada cinco meses, dos veces al año (cada seis meses), cada siete meses, cada ocho meses, cada nueve meses, cada diez meses, cada once meses, anualmente o similar.
[0041] La vacuna o la composición inmunogénica contra la neoplasia se puede administrar a través de subcomposiciones, cada una de las cuales contiene una parte de los neoantígenos, y las subcomposiciones se pueden administrar en diferentes lugares del sujeto o paciente; por ejemplo, una composición que comprende 20 neoantígenos diferentes, puede administrarse en cuatro (4) subcomposiciones, cada una de las cuales conteniendo 5 de los 20 neoantígenos diferentes, y las cuatro (4) subcomposiciones pueden administrarse para tratar de administrar cada subcomposición en o cerca de un ganglio linfático de drenaje del paciente, por ejemplo, a cada uno de los brazos y piernas (por ejemplo, muslo o parte superior del muslo o cerca de las nalgas o parte inferior de la espalda a cada lado del paciente) para tratar de administrar cada subcomposición en o cerca de un punto de drenaje ganglio linfático del paciente o sujeto. Por supuesto, el número de ubicaciones y, por lo tanto, el número de subcomposiciones puede variar, por ejemplo, el experto en la materia puede considerar la administración en o cerca del bazo para tener un quinto punto de administración, y el experto en la materia puede variar las ubicaciones de manera que solo se utilizan uno, dos o tres (por ejemplo, cada brazo y una pierna, cada una de las piernas y un brazo, cada una de las piernas y ningún brazo, o solo ambos brazos)
[0042] La vacuna o composición inmunogénica administrada en los diversos intervalos antes mencionados pueden ser formulaciones diferentes, y las subcomposiciones administradas en diferentes lugares del sujeto o paciente durante una única administración pueden ser composiciones diferentes. Por ejemplo, una primera administración puede ser de una vacuna o una composición inmunogénica de antígeno completo y una administración siguiente o posterior puede ser de un vector (por ejemplo, vector viral o plásmido) que tiene expresión de antígeno(s) in vivo. Asimismo, en la administración de diferentes subcomposiciones a diferentes lugares del paciente o sujeto, algunas de las subcomposiciones pueden comprender un antígeno completo y algunas de las subcomposiciones pueden comprender un vector (por ejemplo, vector viral o plásmido) que tiene expresión de antígeno(s) in vivo. Y algunas composiciones y subcomposiciones pueden comprender tanto vector(es) (por ejemplo, vector viral o plásmido) que tiene/tienen expresión de antígeno(s) in vivo como antígenos completos. Algunos vectores (por ejemplo, poxvirus) que tienen expresión de antígeno(s) in vivo pueden tener un efecto inmunoestimulador o adyuvante y, por lo tanto, las composiciones o subcomposiciones que contienen tales vectores pueden ser autoadyuvantes. Además, al cambiar la naturaleza de cómo se presentan los antígenos al sistema inmunitario, las administraciones pueden "sensibilizar" y a continuación "reforzar" el sistema inmunitario. Y en este texto, cuando se menciona una "vacuna" se pretende que la presente invención comprenda composiciones inmunogénicas, y cuando se menciona un paciente o sujeto se pretende que dicho individuo sea un paciente o sujeto que necesita tratamientos, administraciones, composiciones y en general la invención en cuestión divulgados en este documento.
[0043] Además, la presente invención se aplica al uso de cualquier tipo de vector de expresión, como un vector de expresión viral, por ejemplo, poxvirus (por ejemplo, ortopoxvirus o avipoxvirus como el virus vaccinia, incluyendo Vaccinia Ankara modificada o MVA, m Va -BN, n Yv AC según WO-A-92/15672, viruela aviar, por ejemplo, TROVAX, viruela del canario, por ejemplo, ALVAC (WO-A-95/27780 y WO-A-92/15672) viruela de paloma, viruela porcina y similares), adenovirus, Aa V herpesvirus y lentivirus; o un vector de molécula de plásmido o ADN o ácido nucleico. Algunos vectores que son citoplasmáticos, como los vectores de poxvirus, pueden ser ventajosos. Sin embargo, el uso de adenovirus, AAV y lentivirus también puede resultar ventajoso en la práctica de la presente invención.
[0044] En una vacuna o composición inmunogénica lista para usar, especialmente reconstituida, el vector, por ejemplo, un vector viral, está presente en las cantidades dentro del alcance del experto a partir de esta divulgación y el conocimiento en la técnica, (tal como como en la literatura científica y de patentes citada en este documento).
[0045] El antígeno completo o el vector, por ejemplo, las vacunas vivas recombinantes existen generalmente en forma liofilizada que permite su almacenamiento y se reconstituyen inmediatamente antes de su uso en un disolvente o excipiente, que pueden incluir un adyuvante, tal como se describe aquí.
[0046] Por lo tanto, el objeto de la divulgación también es un equipo o kit de vacunación o inmunización que comprende, envasados por separado, vacuna liofilizada y una solución, que incluye ventajosamente un compuesto adyuvante, tal como se describe aquí, para la reconstitución de la vacuna liofilizada.
[0047] El objeto de la divulgación también es un procedimiento de vacunación o inmunización que comprende o consiste esencialmente en administrar, por ejemplo, por vía parenteral, preferiblemente subcutánea, intramuscular o intradérmica, o por vía mucosa, una vacuna o composición inmunogénica, según la presente invención a una tasa de una o más administraciones. Opcionalmente, este procedimiento incluye un paso preliminar de reconstitución de la vacuna o composición inmunogénica liofilizada (por ejemplo, si se liofilizó el antígeno completo o el vector) en una solución, incluyendo ventajosamente también un adyuvante.
[0048] En una realización, el sujeto sufre una neoplasia seleccionada del grupo que consiste en: linfoma no Hodgkin (NHL), carcinoma de células renales de células claras (ccRCC), melanoma, sarcoma, leucemia o cáncer de vejiga, colon, cerebro, mama, cabeza y cuello, endometrio, pulmón, ovario, páncreas o próstata. En otra realización, la neoplasia es metastásica. En una realización adicional, el sujeto no tiene neoplasia detectable, pero tiene un alto riesgo de recurrencia de la enfermedad. En otra realización relacionada, el sujeto se ha sometido previamente a un trasplante autólogo de células madre hematopoyéticas (AHSCT).
[0049] En una realización, la administración de la vacuna o la composición inmunogénica contra la neoplasia se realiza en un régimen de dosificación primaria/refuerzo. En otra realización, la administración de la vacuna o la composición inmunogénica contra la neoplasia se realiza en las semanas 1, 2, 3 o 4 como preparación de sensibilización. En otra realización adicional, la administración de la vacuna o la composición inmunogénica contra la neoplasia es a los 2, 3, 4 o 5 meses como refuerzo.
[0050] En una realización, la vacuna o composición inmunogénica se administra en una dosis de aproximadamente 10 |jg-1 mg por individuo de 70 kg en cuanto a cada péptido neoantigénico. En otra realización, la vacuna o composición inmunogénica se administra a un nivel de dosis semanal promedio de aproximadamente 10 jg-2000 jg por individuo de 70 kg en cuanto a cada péptido neoantigénico.
[0051] En una realización, la vacuna o composición inmunogénica se administra por vía intravenosa o subcutánea.
[0052] En otro caso, la divulgación proporciona una solución de péptido neoantigénico para una vacuna contra la neoplasia, que comprende: al menos un péptido neoantigénico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y ácido succínico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
[0053] La presente invención comprende realizar procedimientos como en la solicitud de patente de Estados Unidos No. 20110293637, por ejemplo, un procedimiento para identificar una pluralidad de al menos 4 péptidos específicos del sujeto y preparar una composición inmunogénica específica del sujeto que, tras la administración, presenta la pluralidad de al menos 4 péptidos específicos del sujeto para el sistema inmunitario del sujeto, en el que el sujeto tiene un tumor y los péptidos específicos del sujeto son específicos del sujeto y del tumor del sujeto, comprendiendo dicho procedimiento:
(i) identificar, incluyendo
la secuenciación de ácidos nucleicos de una muestra del tumor del sujeto y
la secuenciación de ácidos nucleicos de una muestra no tumoral del sujeto,
una pluralidad de al menos 4 mutaciones no silenciosas específicas del tumor no presentes en la muestra no tumoral muestra; y
(ii) seleccionar de las mutaciones no silenciosas identificadas la pluralidad de al menos 4 péptidos específicos del sujeto, cada uno con un neoepítopo tumoral diferente que es un epítopo específico del tumor del sujeto, a partir de la pluralidad identificada de mutaciones específicas del tumor,
donde cada neoepítopo es un producto de expresión de una mutación no silenciosa específica de tumor que no está presente en la muestra no tumoral, cada neoepítopo se une a una proteína HLA del sujeto, y la selección incluye determinar la unión de los péptidos específicos del sujeto a la proteína HLA, y
(iii) formular la composición inmunogénica específica del sujeto para la administración al sujeto de modo que, tras la administración, se presente la pluralidad de al menos 4 péptidos específicos del sujeto al sistema inmunitario del sujeto,
donde la selección o formulación comprende al menos uno de:
incluir en la composición inmunogénica específica del sujeto un péptido específico del sujeto que incluye un producto de expresión de un neo-ORF identificado, en el que un neo-ORF es una mutación no silenciosa específica del tumor no presente en la muestra no tumoral que crea un nuevo marco de lectura abierto, e incluir en la composición inmunogénica específica del sujeto un péptido específico del sujeto que incluye un producto de expresión de una mutación puntual identificada y tiene una unión determinada a la proteína HLA del sujeto con una IC50 inferior a 500 nM, mediante lo cual se identifica la pluralidad de al menos 4 péptidos específicos del sujeto, y se prepara la composición inmunogénica específica del sujeto que, tras la administración, presenta la pluralidad de al menos 4 péptidos específicos del sujeto al sistema inmunitario del sujeto, en la que los péptidos específicos del sujeto son específicos del sujeto y del tumor del sujeto; o un procedimiento para identificar un neoantígeno que comprende:
a. identificar una mutación específica de tumor en un gen expresado de un sujeto que tiene cáncer; b. en donde cuando dicha mutación identificada en la etapa (a) es una mutación puntual:
i. identificar un péptido mutante que tenga la mutación identificada en la etapa (a), en el que dicho péptido mutante se une a una proteína HLA de clase I con mayor afinidad que un péptido de tipo salvaje; y tiene una IC50 inferior a 500 nm;
c. en donde cuando dicha mutación identificada en la etapa (a) es una mutación de sitio de empalme, desplazamiento de marco, lectura completa o de fusión génica:
i. identificar un polipéptido mutante codificado por la mutación identificada en la etapa (a), donde dicho polipéptido mutante se une a una proteína HLA de clase I; o un procedimiento para inducir una respuesta inmune específica de tumor en un sujeto que comprende administrar uno o más péptidos o polipéptidos identificados y un adyuvante; o un procedimiento para vacunar o tratar a un sujeto contra el cáncer que comprende:
a. identificar una pluralidad de mutaciones específicas de tumores en un gen expresado del sujeto, en el que cuando dicha mutación identificada es una: i. mutación puntual que identifica adicionalmente un péptido mutante que tiene la mutación puntual; y/o
ii. mutación de sitio de empalme, desplazamiento de marco, lectura completa o fusión génica que identifica adicionalmente un polipéptido mutante codificado por la mutación;
b. seleccionar uno o más péptidos o polipéptidos mutantes identificados en la etapa (a) que se une a una proteína HLA de clase I;
c. seleccionar el uno o más péptidos o polipéptidos mutantes identificados en la etapa (b) que es capaz de activar las células T CD8 antitumorales; y d. administrar al sujeto el uno o más péptidos o polipéptidos, células dendríticas autólogas o células presentadoras de antígeno pulsadas con uno o más péptidos o polipéptidos seleccionados en la etapa (c); o preparar una composición farmacéutica que comprende uno o más péptidos identificados y llevar a cabo el o los procedimientos descritos en el presente documento. Por lo tanto, la vacuna o la composición inmunogénica contra la neoplasia del presente documento pueden ser como en la solicitud de patente de Estados Unidos n.° 20110293637.
[0054] En consecuencia, es un objeto de la presente invención no abarcar dentro de la presente invención ningún producto, proceso de fabricación del producto o procedimiento de uso del producto previamente conocido, de modo que los solicitantes se reserven el derecho y por la presente divulguen una eención de cualquier producto, proceso o procedimiento previamente conocido. Se observa además que la presente invención no pretende abarcar dentro del alcance de la presente invención ningún producto, proceso o fabricación del producto o procedimiento de uso del producto, que no cumpla con la descripción escrita y requisitos de suficiencia de la USPTo (35 USC §112, primer párrafo) o la EPO (Artículo 83 de la EPC), de modo que los Solicitantes se reserven el derecho y por la presente divulguen una exención de cualquier producto, proceso de fabricación o procedimiento de uso del producto descrito anteriormente.
[0055] Cabe indicar que en esta divulgación y particularmente en las reivindicaciones y/o párrafos, términos, tales como "comprende", "comprendido", "que comprende" y similares pueden tener el significado que se les atribuye en la ley de Patentes de los Estados Unidos; por ejemplo, pueden significar "incluye", "incluido", "que incluye" y similares; y que términos tales como "que consiste esencialmente en" y "consiste esencialmente en" tienen el significado que se les atribuye en la ley de patentes de los Estados Unidos, por ejemplo, permiten elementos no citados expresamente, pero excluyen elementos que se encuentran en la técnica anterior o que afectan a una característica básica o novedosa de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0056] El expediente de patente o solicitud contiene al menos un dibujo ejecutado en color. La Oficina proporciona copias de esta publicación de patente o solicitud de patente con dibujos en color previa solicitud y pago de la tarifa necesaria.
[0057] La siguiente descripción detallada, proporcionada a modo de ejemplo, pero que no pretende limitar la presente invención únicamente a las realizaciones específicas descritas, puede entenderse mejor junto con los dibujos adjuntos, en los que:
La figura 1 representa un proceso de flujo para fabricar una vacuna o una composición inmunogénica contra el cáncer personalizada.
La Figura 2 muestra un proceso de flujo para las etapas de pretratamiento para generar una vacuna o una composición inmunogénica contra el cáncer para un paciente con cáncer.
La Figura 3 ilustra un programa de inmunización basado en una estrategia de sensibilización-refuerzo según una realización de ejemplo de la presente invención. Se pueden realizar múltiples inmunizaciones durante las primeras 3 semanas para mantener una exposición temprana alta al antígeno durante la fase de sensibilización de la respuesta inmunitaria. A continuación, los pacientes pueden descansar durante ocho semanas para permitir que se desarrollen las células T de memoria y estas células T a continuación se reforzarán para mantener una respuesta fuerte y continua. La figura 4 muestra una línea de tiempo que indica el punto final primario inmunológico según un aspecto de ejemplo de la presente invención.
La figura 5 muestra un esquema que representa el procesamiento de productos farmacéuticos de péptidos neoantigénicos individuales en grupos de 4 subgrupos según una realización de ejemplo de la presente invención. La figura 6 muestra los resultados de la PCR cuantitativa para evaluar los niveles de inducción de una serie de marcadores inmunitarios clave tras la estimulación de células dendríticas de ratón utilizando una formulación neoantigénica.
La figura 7 muestra
Figure imgf000008_0001
análisis MDSC de dextrosa al 5 % y DMSO al 0,8 %.
La figura 8 muestra
Figure imgf000008_0002
análisis MDSC de trehalosa al 10 % y DMSO al 0,8 %.
La figura 9 muestra el análisis MDSC de sacarosa al 10 % y DMSO al 0,8 %.
La figura 10 muestra el perfil de presión de un ejemplo de liofilización.
La figura 11 muestra el perfil de temperatura de un ejemplo de liofilización.
La figura 12 muestra el aspecto físico de la torta liofilizada usando ejemplos de formulaciones de la divulgación.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Definiciones
[0058] Para facilitar la comprensión de la presente invención, se definen aquí varios términos y frases:
[0059] A menos que se indique específicamente o sea obvio por el contexto, tal como se usa en este documento, el término "aproximadamente" se entiende dentro de un intervalo de tolerancia normal en la técnica, por ejemplo, dentro de 2 desviaciones estándar de la media. Aproximadamente puede entenderse como dentro del 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 % , 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05% o 0,01% del valor indicado. A menos que sea claro a partir del contexto, todos los valores numéricos proporcionados en este documento se modifican por el término aproximadamente.
[0060] A menos que se indique específicamente o sea obvio por el contexto, tal como se usa en este documento, se entiende que el término "o" es inclusivo. A menos que se indique específicamente o sea obvio por el contexto, tal como se usa en este documento, los términos "un", "una" y "el/la" se entienden en singular o plural.
[0061] Por "agente" se entiende cualquier compuesto químico de molécula pequeña, anticuerpo, molécula de ácido nucleico o polipéptido, o fragmentos de los mismos.
[0062] Por "mejorar" se entiende disminuir, suprimir, atenuar, detener o estabilizar el desarrollo o la progresión de una enfermedad (por ejemplo, una neoplasia, un tumor, etc.).
[0063] Por "alteración" se entiende un cambio (aumento o disminución) en los niveles de expresión o actividad de un gen o polipéptido detectado por procedimientos estándar conocidos en la técnica, tales como los descritos en este documento. Tal como se usa aquí, una alteración incluye un cambio del 10 % en los niveles de expresión, preferiblemente un cambio del 25 %, más preferiblemente, un cambio del 40 % y, lo más preferiblemente, un cambio del 50 % o más en los niveles de expresión.
[0064] Por "análogo" se entiende una molécula que no es idéntica, pero que tiene características funcionales o estructurales análogas. Por ejemplo, un análogo de polipéptido de neoantígeno específico de tumor retiene la actividad biológica de un polipéptido de neoantígeno específico de tumor de origen natural correspondiente, mientras que tiene ciertas modificaciones bioquímicas que mejoran la función del análogo en relación con un polipéptido de origen natural. Tales modificaciones bioquímicas podrían aumentar la resistencia a la proteasa, la permeabilidad de la membrana o la vida media del análogo, sin alterar, por ejemplo, la unión del ligando. Un análogo puede incluir un aminoácido no natural.
[0065] El término "neoantígeno" o "neoantigénico" significa una clase de antígenos tumorales que surge de una mutación o mutaciones específicas de tumor que alteran la secuencia de aminoácidos de las proteínas codificadas por el genoma.
[0066] Por “neoplasia” se entiende cualquier enfermedad que es causada por o da como resultado niveles inapropiadamente altos de división celular, niveles inapropiadamente bajos de apoptosis, o ambos. Por ejemplo, el cáncer es un ejemplo de neoplasia. Los ejemplos de cáncer incluyen, sin limitación, leucemia (por ejemplo, leucemia aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mieloblástica aguda, leucemia promielocítica aguda, leucemia mielomonocítica aguda, leucemia monocítica aguda, eritroleucemia aguda, leucemia crónica, leucemia mielocítica crónica, leucemia linfocítica), policitemia vera, linfoma (por ejemplo, enfermedad de Hodgkin, enfermedad no Hodgkin), macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de cadenas pesadas y tumores sólidos, tales como sarcomas y carcinomas (por ejemplo, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma del conducto del nilo, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilm, cáncer cervical, cáncer uterino, cáncer testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodenroglioma, schwannoma, meningioma, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma). Los trastornos linfoproliferativos también se consideran enfermedades proliferativas.
[0067] El término "vacuna contra neoplasia" se refiere a una muestra agrupada de neoantígenos específicos de neoplasia/tumor, por ejemplo, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o más péptidos neoantigénicos. Por "vacuna" se entiende una composición para generar inmunidad para la profilaxis y/o tratamiento de enfermedades (por ejemplo, neoplasia/tumor). En consecuencia, las vacunas son medicamentos que comprenden antígenos y están destinados a ser utilizados en seres humanos o animales para generar defensa específica y sustancia protectora mediante vacunación. Una "composición de vacuna contra la neoplasia" puede incluir un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
[0068] El término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a aprobado o aprobable por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o enumerado en la Farmacopea de Ee . UU. u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en animales, incluidos los seres humanos.
[0069] Un "excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable" se refiere a un excipiente, portador o diluyente que se puede administrar a un sujeto, junto con un agente, y que no destruye la actividad farmacológica del mismo y no es tóxico cuando se administra en dosis suficiente para administrar una cantidad terapéutica del agente.
[0070] Una "sal farmacéuticamente aceptable" de neoantígenos específicos de tumores agrupados tal como se indica en el presente documento puede ser una sal ácida o básica que generalmente se considera en la técnica adecuada para usar en contacto con los tejidos de seres humanos o animales sin excesiva toxicidad, irritación, reacciones alérgicas u otro problema o complicación. Dichas sales incluyen sales de ácidos minerales y orgánicos de residuos básicos, tales como aminas, así como sales alcalinas u orgánicas de residuos ácidos, tales como ácidos carboxílicos. Las sales farmacéuticas específicas incluyen, pero sin limitación, sales de ácidos, tales como clorhídrico, fosfórico, bromhídrico, málico, glicólico, fumárico, sulfúrico, sulfámico, sulfanílico, fórmico, toluenosulfónico, metanosulfónico, bencenosulfónico, etanodisulfónico, 2-hidroxietilsulfónico, nítrico, benzoico, 2-acetoxibenzoico, cítrico, tartárico, láctico, esteárico, salicílico, glutámico, ascórbico, pamoico, succínico, fumárico, maleico, propiónico, hidroximaleico, yodhídrico, fenilacético, alcanoico tal como acético, HOOC-(CH2)n-COOH donde n es 0-4, y similares. De manera similar, los cationes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, sodio, potasio, calcio, aluminio, litio y amonio. Los expertos en la técnica reconocerán a partir de esta divulgación y el conocimiento en la técnica que existen otras sales farmacéuticamente aceptables para los neoantígenos específicos de tumores combinados que se proporcionan en el presente documento, incluidas las enumeradas por Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, pág. 1418 (1985). En general, una sal de ácido o base farmacéuticamente aceptable se puede sintetizar a partir de un compuesto original que contiene un resto básico o ácido mediante cualquier procedimiento químico convencional. Brevemente, dichas sales se 'pueden preparar mediante la reacción de las formas de ácido o base libre de estos compuestos con una cantidad estequiométrica de la base o ácido apropiados en una disolvente apropiado.
[0071] Por un "polipéptido" o "péptido" se entiende un polipéptido que se ha separado de los componentes que lo acompañan de forma natural. Típicamente, el polipéptido se aísla cuando está al menos en un 60%, en peso, libre de proteínas y moléculas orgánicas naturales con las que está asociado de forma natural. Preferiblemente, la preparación es al menos el 75%, más preferiblemente al menos el 90% y lo más preferiblemente al menos el 99%, en peso, de un polipéptido. Se puede obtener un polipéptido aislado, por ejemplo, por extracción de una fuente natural, por expresión de un ácido nucleico recombinante que codifica dicho polipéptido; o sintetizando químicamente la proteína. La pureza se puede medir mediante cualquier procedimiento apropiado, por ejemplo, cromatografía en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida o mediante análisis HPLC.
[0072] Tal como se usa en este documento, los términos "prevenir", "que previene", "prevención", "tratamiento profiláctico" y similares, se refieren a reducir la probabilidad de desarrollar una enfermedad o afección en un sujeto que no tiene, pero está en riesgo o es susceptible de desarrollar una enfermedad o afección.
[0073] El término "primario/refuerzo" o "régimen de dosificación primaria/refuerzo" se refiere a las administraciones sucesivas de una vacuna o composiciones inmunogénicas o inmunológicas. La administración primaria (“sensibilización”) es la administración de una primera vacuna o composición de tipo inmunogénica o inmunológica y puede comprender una, dos o más administraciones. La administración de refuerzo es la segunda administración de una vacuna o composición de tipo inmunogénica o inmunológica y puede comprender una, dos o más administraciones y, por ejemplo, puede comprender o consistir esencialmente en administraciones anuales. En ciertas realizaciones, la administración de la vacuna contra la neoplasia o la composición inmunogénica se realiza en un régimen de dosificación primaria/refuerzo.
[0074] Se entiende que los intervalos proporcionados en este documento son abreviaturas de todos los valores dentro del intervalo. Por ejemplo, se entiende que un intervalo de 1 a 50 incluye cualquier número, combinación de números o subintervalo del grupo que consiste en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36,37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50, así como todos los valores decimales intermedios entre los enteros antes mencionados como, por ejemplo, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8 y 1,9. Con respecto a los subintervalos, se contemplan específicamente los "subintervalos anidados" que se extienden desde cualquiera de los extremos del intervalo contemplado específicamente. Por ejemplo, un subintervalo anidado de un intervalo de ejemplo de 1 a 50 puede comprender 1 a 10, 1 a 20, 1 a 30 y 1 a 40 en una dirección, o 50 a 40, 50 a 30, 50 a 20 o 50 a 10 en la otra dirección.
[0075] Por "receptor" debe entenderse una molécula biológica o una agrupación de moléculas capaces de unirse a un ligando. Un receptor puede servir para transmitir información en una célula, una formación celular o un organismo. El receptor comprende al menos una unidad receptora y frecuentemente contiene dos o más unidades receptoras, donde cada unidad receptora puede consistir en una molécula de proteína, en particular una molécula de glicoproteína. El receptor tiene una estructura que complementa la estructura de un ligando y puede formar un complejo con el ligando como compañero de unión. La información de señalización puede transmitirse mediante cambios conformacionales del receptor tras la unión con el ligando en la superficie de una célula. Según la divulgación, un receptor puede referirse a proteínas particulares de las clases I y II del MHC capaces de formar un complejo receptor/ligando con un ligando, en particular un péptido o fragmento de péptido de longitud adecuada.
[0076] Un "complejo de receptor/ligando" también debe entenderse como un "complejo de receptor/péptido" o "complejo de receptor/fragmento de péptido", en particular una molécula de MHC presentadora de péptido o fragmento de péptido de clase I o de clase II.
[0077] Por "reduce" se entiende una alteración negativa de al menos 10%, 25%, 50%, 75% o 100%.
[0078] Por "referencia" se entiende una condición estándar o de control.
[0079] Una "secuencia de referencia" es una secuencia definida que se utiliza como base para la comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la totalidad de una secuencia específica; por ejemplo, un segmento de una secuencia genómica o de ADNc de longitud completa, o la secuencia genómica o de ADNc completa. Para polipéptidos, la longitud de la secuencia polipeptídica de referencia generalmente será de al menos aproximadamente 10-2000 aminoácidos, 10-1500, 10-1000, 10-500 o 10-100. Preferiblemente, la longitud de la secuencia polipeptídica de referencia puede ser de al menos aproximadamente 10-50 aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 10-40 aminoácidos, e incluso más preferiblemente aproximadamente 10­ 30 aminoácidos, aproximadamente 10-20 aminoácidos, aproximadamente 15-25 aminoácidos, o aproximadamente 20 aminoácidos. Para los ácidos nucleicos, la longitud de la secuencia de ácido nucleico de referencia será generalmente de al menos aproximadamente 50 nucleótidos, preferiblemente al menos aproximadamente 60 nucleótidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 75 nucleótidos e incluso más preferiblemente aproximadamente 100 nucleótidos o aproximadamente 300 nucleótidos o cualquier entero aproximadamente entre los mismos o entre los mismos.
[0080] Por "se une específicamente" se entiende un compuesto o anticuerpo que reconoce y se une a un polipéptido, pero que sustancialmente no reconoce ni se une a otras moléculas en una muestra, por ejemplo, una muestra biológica.
[0081] Las moléculas de ácido nucleico útiles en los procedimientos de la presente invención incluyen cualquier molécula de ácido nucleico que codifique un polipéptido de la divulgación o un fragmento del mismo. No es necesario que dichas moléculas de ácido nucleico sean 100% idénticas a una secuencia de ácido nucleico endógeno, pero típicamente mostrarán una identidad sustancial. Los polinucleótidos que tienen una "identidad sustancial" con una secuencia endógena normalmente pueden hibridarse con al menos una cadena de una molécula de ácido nucleico de doble cadena. Por "hibridar" se entiende emparejar para formar una molécula de doble cadena entre secuencias de polinucleótidos complementarias (por ejemplo, un gen descrito en el presente documento), o porciones de las mismas, en diversas condiciones de rigurosidad. (Véase, por ejemplo, Wahl, GM y SL Berger (1987) Methods Enzymol.
152:399; Kimmel, AR (1987) Methods Enzymol. 152: 399; Kimmel A.R. (1987) Methods Enymiol. 152: 507).
[0082] Por ejemplo, la concentración salina estricta normalmente será inferior a aproximadamente 750 mM de NaCI y 75 mM de citrato trisódico, preferiblemente inferior a aproximadamente 500 mM de NaCl y 50 mM de citrato trisódico, y más preferiblemente inferior a aproximadamente 250 mM de NaCl y 25 mM de citrato trisódico. La hibridación de baja rigurosidad puede obtenerse en ausencia de disolvente orgánico, por ejemplo, formamida, mientras que la hibridación de alta rigurosidad puede obtenerse en presencia de al menos un 35% de formamida, y más preferiblemente al menos un 50% de formamida. Las condiciones de temperatura estrictas normalmente incluirán temperaturas de al menos aproximadamente 30°C, más preferiblemente de al menos aproximadamente 37°C, y lo más preferiblemente de al menos aproximadamente 42°C. Parámetros adicionales variables, tales como el tiempo de hibridación, la concentración de detergente, por ejemplo, dodecilsulfato de sodio (SDS), y la inclusión o exclusión de ADN portador, son bien conocidos por los expertos en la técnica. Se logran varios niveles de rigurosidad combinando estas diversas condiciones, según sea necesario. En un caso preferido, la hibridación se producirá a 30°C en NaCl 750 mM, citrato trisódico 75 mM y SDS al 1%. En un caso más preferido, la hibridación se producirá a 37°C en NaCl 500 mM, citrato trisódico 50 mM, SDS al 1 %, formamida al 35 % y 100 pg/ml de Ad N de esperma de salmón desnaturalizado (ADNss). En el caso más preferido, la hibridación se producirá a 42°C en NaCl 250 mM, citrato trisódico 25 mM, SDS al 1 %, formamida al 50 % y 200 pg/ml de ADNss. Las variaciones útiles de estas condiciones serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica.
[0083] Para la mayoría de las aplicaciones, las etapas de lavado que siguen a la hibridación también variarán en la rigurosidad. Las condiciones de rigurosidad del lavado se pueden definir por la concentración de sal y por la temperatura. Tal como se indicó anteriormente, la rigurosidad del lavado se puede aumentar disminuyendo la concentración de sal o aumentando la temperatura. Por ejemplo, la concentración salina estricta para las etapas de lavado será preferentemente inferior a aproximadamente NaCl 30 mM y citrato trisódico 3 mM, y lo más preferentemente inferior a aproximadamente NaCl 15 mM y citrato trisódico 1,5 mM. Las condiciones de temperatura estrictas para las etapas de lavado normalmente incluirán una temperatura de al menos aproximadamente 25°C, más preferiblemente de al menos aproximadamente 42°C, e incluso más preferiblemente de al menos aproximadamente 68°C. En un caso preferido, las etapas de lavado se realizarán a 25 °C en NaCl 30 mM, citrato trisódico 3 mM y SDS al 0,1 %. En un caso más preferido, las etapas de lavado se producirán a 42°C en NaCl 15 mM, citrato trisódico 1,5 mM y SDS al 0,1%. En un caso más preferido, las etapas de lavado se producirán a 68 °C en NaCl 15 mM, citrato trisódico 1,5 mM y SDS al 0,1 %. Las variaciones adicionales de estas condiciones serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica. Las técnicas de hibridación son bien conocidas por los expertos en la materia y se describen, por ejemplo, en Benton y Davis (Science 196:180, 1977); Grunstein y Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975); Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, Nueva York, 2001); Berger y Kimmel (Guide to Molecular Cloning Technique, 1987, Academic Press, Nueva York); y Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York.
[0084 El término "sujeto" se refiere a un animal que es objeto de tratamiento, observación o experimento. Solo a modo de ejemplo, un sujeto incluye, pero no se limita a, un mamífero, incluidos, pero no se limita a, un humano o un mamífero no humano, tal como un primate no humano, bovino, equino, canino, ovino o felino.
[0085] Por "sustancialmente idéntico" se entiende un polipéptido o molécula de ácido nucleico que presenta al menos un 50 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de referencia (por ejemplo, cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en el presente documento) o una secuencia de ácidos nucleicos (por ejemplo, cualquiera de las secuencias de ácido nucleico descritas en este documento). Preferiblemente, dicha secuencia es al menos 60%, más preferiblemente 80% u 85%, y más preferiblemente 90%, 95% o incluso 99% idéntica al nivel de aminoácidos o ácido nucleico a la secuencia utilizada para la comparación.
[0086] La identidad de la secuencia generalmente se mide utilizando software de análisis de secuencias (por ejemplo, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, programas BLAST, BESTFIT, GAP o PILEUP/PRETTYBOX). Dicho software empareja secuencias idénticas o similares asignando grados de homología a varias sustituciones, eliminaciones y/u otras modificaciones. Las sustituciones conservadoras típicamente incluyen sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina. En un enfoque de ejemplo para determinar el grado de identidad, se puede usar un programa BLAST, con una puntuación de probabilidad entre e-3y e-100 que indica una secuencia estrechamente relacionada.
[0087] Por "epítopo de células T" debe entenderse una secuencia peptídica que puede unirse a moléculas MHC de clase I o II en forma de una molécula MHC o complejo MHC presentador de péptidos y a continuación, en esta forma, es reconocido y se une a células T sin tratar, linfocitos T citotóxicos o células T auxiliares.
[0088] Los términos "tratar'1, "tratado", "que trata", "tratamiento" y similares se refieren a reducir o mejorar un trastorno y/o síntomas asociados con el mismo (por ejemplo, una neoplasia o un tumor). "Tratar" incluye los conceptos de "aliviar", que se refiere a disminuir la frecuencia de aparición o recurrencia, o la gravedad, de cualquier síntoma u otros efectos nocivos relacionados con un cáncer y/o los efectos secundarios asociados con la terapia del cáncer. El término "tratar" también abarca el concepto de "manejar" que se refiere a reducir la gravedad de una enfermedad o trastorno particular en un paciente o retrasar su recurrencia, por ejemplo, alargando el período de remisión en un paciente que ha padecido la enfermedad. Se entiende que, aunque no se excluye, tratar un trastorno o una afección no requiere que el trastorno, afección o síntomas asociados con los mismos sean eliminados completamente.
[0089] El término "efecto terapéutico" se refiere a cierto grado de alivio de uno o más de los síntomas de un trastorno (por ejemplo, una neoplasia o un tumor) o su patología asociada. "Cantidad terapéuticamente eficaz", como se usa en el presente documento, se refiere a una cantidad de un agente que es eficaz, tras la administración de dosis única o múltiple a la célula o sujeto, para prolongar la capacidad de supervivencia del paciente con tal trastorno, reduciendo uno o más signos o síntomas del trastorno, prevenir o retrasar, y similares más allá de lo esperado en ausencia de dicho tratamiento. "Cantidad terapéuticamente eficaz" pretende calificar la cantidad requerida para lograr un efecto terapéutico. Un médico o veterinario con conocimientos ordinarios en la materia puede determinar y prescribir fácilmente la "cantidad terapéuticamente eficaz" (por ejemplo, ED50) de la composición farmacéutica requerida. Por ejemplo, el médico o veterinario podría comenzar con dosis de los compuestos de la divulgación empleados en una composición farmacéutica a niveles más bajos que los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosis hasta que se logre el efecto deseado.
[0090] Las composiciones farmacéuticas normalmente deberían proporcionar una dosificación de aproximadamente 0,0001 mg a aproximadamente 200 mg de compuesto por kilogramo de peso corporal por día. Por ejemplo, las dosis para la administración sistémica a un paciente humano pueden oscilar entre 0,01 y 10 pg/kg, 20 y 80 pg/kg, 5 y 50 |jg/kg, 75 y 150 pg/kg, 100 y 500 pg/kg, 250 -750 pg/kg, 500-1000 pg/kg, 1-10 mg/kg, 5-50 mg/kg, 25-75 mg/kg, 50­ 100 mg/kg, 100-250 mg/kg, 50- 100 mg/kg, 250-500 mg/kg, 500-750 mg/kg, 750-1000 mg/kg, 1000-1500 mg/kg, 1500­ 2000 mg/kg, 5 mg/kg, 20 mg/kg, 50 mg/kg, 100 mg/kg, de 200 mg/kg. Las formas unitarias de dosificación farmacéuticas se preparan para proporcionar desde aproximadamente 0,001 mg hasta aproximadamente 5000 mg, por ejemplo, desde aproximadamente 100 hasta aproximadamente 2500 mg del compuesto o una combinación de ingredientes esenciales por forma unitaria de dosificación.
[0091] Por "vacuna" se entiende una composición para generar inmunidad para la profilaxis y/o tratamiento de enfermedades (por ejemplo, neoplasia/tumor). En consecuencia, las vacunas son medicamentos que comprenden antígenos y están destinados a ser utilizados en seres humanos o animales para generar defensa específica y sustancia protectora mediante vacunación.
[0092] La enumeración de una lista de grupos químicos en cualquier definición de una variable en este documento incluye definiciones de esa variable como cualquier grupo individual o combinación de grupos enumerados. La enumeración de una realización para una variable o aspecto en el presente documento incluye esa realización como cualquier realización individual o en combinación con cualquier otra realización o parte de la misma.
[0093] Cualquier composición o procedimiento proporcionado en este documento se puede combinar con una o más de cualquiera de las otras composiciones y procedimientos proporcionados en este documento.
[0094] La presente descripción se refiere a vacunas y procedimientos para el tratamiento de neoplasias, y más particularmente de tumores, mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica (por ejemplo, una vacuna contra el cáncer) que comprende una pluralidad de neoantígenos específicos de neoplasias/tumores a un sujeto (por ejemplo, un mamífero tal como un ser humano). Como se describe con más detalle en este documento, la secuenciación del genoma completo/exoma se puede usar para identificar todos, o casi todos, los neoantígenos mutados que están presentes de forma única en una neoplasia/tumor de un paciente individual, y que esta colección de neoantígenos mutados se puede analizar para identificar un subconjunto optimizado específico de neoantígenos para su uso como una vacuna personalizada contra el cáncer o una composición inmunogénica para el tratamiento de la neoplasia/tumor del paciente. Por ejemplo, una población de neoantígenos específicos de neoplasia/tumor puede identificarse secuenciando la neoplasia/tumor y el a Dn normal de cada paciente para identificar mutaciones específicas de tumor, y puede identificarse el alotipo HLA del paciente. La población de neoantígenos específicos de neoplasia/tumor y sus antígenos nativos afines pueden a continuación estar sujetos a análisis bioinformático utilizando algoritmos validados para predecir qué mutaciones específicas de tumor crean epítopos que podrían unirse al alotipo HLA del paciente. En base a este análisis, una pluralidad de péptidos correspondientes a un subconjunto de estas mutaciones pueden diseñarse y sintetizarse para cada paciente y combinarse para su uso como vacuna contra el cáncer o composición inmunogénica para inmunizar al paciente. Los péptidos neoantígenos pueden combinarse con un adyuvante (por ejemplo, poli-ICLC) u otro agente antineoplásico.
[0095] El sistema inmunitario se puede clasificar en dos subsistemas funcionales: el sistema inmunitario innato y el adquirido. El sistema inmunitario innato es la primera línea de defensa contra las infecciones, y la mayoría de los patógenos potenciales son rápidamente neutralizados por este sistema antes de que puedan causar, por ejemplo, una infección evidente. El sistema inmunitario adquirido reacciona a las estructuras moleculares, denominadas antígenos, del organismo intruso. Hay dos tipos de reacciones inmunitarias adquiridas, que incluyen la reacción inmunitaria humoral y la reacción inmunitaria mediada por células. En la reacción inmunitaria humoral, los anticuerpos secretados por las células B en los fluidos corporales se unen a antígenos derivados de patógenos, lo que lleva a la eliminación del patógeno a través de una variedad de mecanismos, por ejemplo, lisis mediada por complemento. En la reacción inmunitaria mediada por células, Se activan las células T capaces de destruir otras células. Por ejemplo, si las proteínas asociadas con una enfermedad están presentes en una célula, se fragmentan proteolíticamente en péptidos dentro de la célula. Las proteínas celulares específicas a continuación se adhieren al antígeno o péptido formado de esta manera y los transportan a la superficie de la célula, donde se presentan a los mecanismos de defensa moleculares, en particular las células T, del cuerpo. Las células T citotóxicas reconocen estos antígenos y matan las células que albergan los antígenos, donde se presentan a los mecanismos de defensa moleculares, en particular las células T, del cuerpo. Las células T citotóxicas reconocen estos antígenos y matan las células que albergan los antígenos, donde se presentan a los mecanismos de defensa moleculares, en particular las células T, del cuerpo. Las células T citotóxicas reconocen estos antígenos y matan las células que albergan los antígenos.
[0096] Las moléculas que transportan y presentan péptidos en la superficie celular se denominan proteínas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Las proteínas MHC se clasifican en dos tipos, denominados MHC clase I y MHC clase II. Las estructuras de las proteínas de las dos clases de MHC son muy similares; sin embargo, tienen funciones muy diferentes. Las proteínas del MHC de clase I están presentes en la superficie de casi todas las células del cuerpo, incluidas la mayoría de las células tumorales. Las proteínas MHC de clase I están cargadas con antígenos que generalmente se originan a partir de proteínas endógenas o de patógenos presentes dentro de las células, y a continuación se presentan a los linfocitos T vírgenes o citotóxicos (CTL). Las proteínas MHC de clase II están presentes en las células dendríticas, los linfocitos B, los macrófagos y otras células presentadoras de antígenos. Presentan principalmente péptidos, que se procesan a partir de fuentes de antígeno externas, es decir, fuera de las células, a células T auxiliares (Th). La mayoría de los péptidos unidos por las proteínas MHC de clase I se originan a partir de proteínas citoplásmicas producidas en las células huésped sanas de un organismo mismo, y normalmente no estimulan una reacción inmunitaria. En consecuencia, los linfocitos T citotóxicos que reconocen tales moléculas MHC autopresentadoras de péptidos de clase I se eliminan en el timo (tolerancia central) o, después de su liberación del timo, se eliminan o inactivan, es decir, se toleran (tolerancia periférica). Las moléculas del MHC son capaces de estimular una reacción inmunitaria cuando presentan péptidos a los linfocitos T no tolerados. Los linfocitos T citotóxicos tienen receptores de células T (TCR) y moléculas CD8 en su superficie.
[0097] Los antígenos peptídicos se unen a las moléculas del MHC de clase I mediante unión por afinidad competitiva dentro del retículo endoplásmico, antes de que se presenten en la superficie celular. Aquí, la afinidad de un antígeno peptídico individual está directamente relacionada con su secuencia de aminoácidos y la presencia de motivos de unión específicos en posiciones definidas dentro de la secuencia de aminoácidos. Si se conoce la secuencia de dicho péptido, es posible manipular el sistema inmunitario contra las células enfermas utilizando, por ejemplo, vacunas peptídicas.
[0098] Una de las barreras críticas para desarrollar inmunoterapia curativa y específica de tumor es la identificación y selección de antígenos tumorales altamente específicos y restringidos para evitar la autoinmunidad. Los neoantígenos tumorales, que surgen como resultado de un cambio genético (por ejemplo, inversiones, translocaciones, deleciones, mutaciones scon cambio de sentido, mutaciones en el sitio de empalme, etc.) dentro de las células malignas, representan la clase de antígenos más específicos de tumores. Rara vez se han usado neoantígenos en vacunas contra el cáncer o composiciones inmunogénicas debido a las dificultades técnicas para identificarlos, seleccionar neoantígenos optimizados y producir neoantígenos para usar en una vacuna o composición inmunogénica. Estos problemas pueden ser abordados por:
- identificar todas, o casi todas, las mutaciones en la neoplasia/tumor a nivel de ADN utilizando el genoma completo, el exoma completo (por ejemplo, solo los exones capturados) o la secuenciación de ARN del tumor frente a muestras de línea germinal coincidentes de cada paciente;
- analizar las mutaciones identificadas con uno o más algoritmos de predicción de unión de péptido-MHC para generar una pluralidad de epítopos de células T neoantígeno candidatos que se expresan dentro de la neoplasia/tumor y pueden unirse a los alelos HLA del paciente; y
- sintetizar la pluralidad de péptidos neoantígenos candidatos seleccionados de los conjuntos de todos los péptidos neoORF y péptidos de unión previstos para su uso en una vacuna contra el cáncer o una composición inmunogénica.
[0099] Por ejemplo, traducir la información de secuenciación en una vacuna terapéutica puede incluir:
(1) Predicción de péptidos mutados personales que pueden unirse a moléculas HLA del individuo. La elección eficiente de qué mutaciones particulares utilizar como inmunógeno requiere la identificación del tipo de HLA del paciente y la capacidad de predecir qué péptidos mutados se unirían de manera eficiente a los alelos de HLA del paciente. Recientemente, los enfoques de aprendizaje basados en redes neuronales con péptidos vinculantes y no vinculantes validados han mejorado la precisión de los algoritmos de predicción para los principales alelos HLA-A y -B.
(2) Formular el fármaco como una vacuna multiepítopo de péptidos largos. Dirigirse a tantos epítopos mutados como sea posible en la práctica aprovecha la enorme capacidad del sistema inmunitario, evita la oportunidad de escape inmunológico mediante la modulación negativa de un producto génico dirigido inmunitario particular y compensa la inexactitud conocida de los enfoques de predicción de epítopos. Los péptidos sintéticos proporcionan un medio particularmente útil para preparar múltiples inmunógenos de manera eficiente y traducir rápidamente la identificación de epítopos mutantes en una vacuna eficaz. Los péptidos pueden sintetizarse fácilmente químicamente y purificarse fácilmente utilizando reactivos libres de bacterias contaminantes o sustancias animales. (3) Combinación con un adyuvante de vacuna fuerte. Las vacunas efectivas requieren un adyuvante fuerte para iniciar una respuesta inmune. Como se describe a continuación, poli-ICLC, un agonista de TLR3 y los dominios de ARN helicasa de MDA5 y RIG3, ha mostrado varias propiedades deseables como adyuvante de vacunas. Estas propiedades incluyen la inducción de la activación local y sistémica de las células inmunitarias in vivo, la producción de quimiocinas y citocinas estimulantes y la estimulación de la presentación de antígenos por parte de las d C. Además, poli-ICLC puede inducir respuestas duraderas de CD4+ y CD8+ en humanos. Es importante destacar que se observaron sorprendentes similitudes en la regulación positiva de las vías transcripcionales y de transducción de señales en sujetos vacunados con poli-ICLC y en voluntarios que habían recibido la vacuna contra la fiebre amarilla altamente eficaz y con capacidad de replicación. Además, > El 90 % de las pacientes con carcinoma de ovario inmunizadas con poli-ICLC en combinación con una vacuna peptídica NY-ES0-1 (además de Montanide) mostraron inducción de células T CD4+ y CD8+, así como respuestas de anticuerpos al péptido en una fase 1 reciente estudio. Al mismo tiempo, polyICLC ha sido ampliamente probado en más de 25 ensayos clínicos hasta la fecha y exhibió un perfil de toxicidad relativamente benigno. Las ventajas de la presente invención se describen más adelante en este documento.
[0100] El análisis del exoma del cáncer revela un mecanismo de inmunoedición del cáncer dependiente de las células T Nature 482:400 (2012); DuPage et al, Expression of tumor-specific antigens underlies cancer immunoediting Nature 482:405 (2012); y Sampson et al., Escape inmunológico después de una supervivencia libre de progresión prolongada con vacunación con péptido de la variante III del receptor del factor de crecimiento epidérmico en pacientes con glioblastoma recién diagnosticado J Clin Oncol. 28:4722-4729 (2010)). En una realización, se determinan los epítopos mutados de un paciente con cáncer. El análisis del exoma del cáncer revela un mecanismo de inmunoedición del cáncer dependiente de las células T Nature 482:400 (2012); DuPage et al, Expression of tumor-specific antigens underlies cancer immunoediting Nature 482:405 (2012); y Sampson et al., Escape inmunológico después de una supervivencia libre de progresión prolongada con vacunación con péptido de la variante III del receptor del factor de crecimiento epidérmico en pacientes con glioblastoma recién diagnosticado J Clin Oncol. 28:4722-4729 (2010)). En una realización, se determinan los epítopos mutados de un paciente con cáncer. 4722-4729 (2010)). En una realización, se determinan los epítopos mutados de un paciente con cáncer. 4722-4729 (2010)). En una realización, se determinan los epítopos mutados de un paciente con cáncer.
[0101] En una realización, los epítopos mutados se determinan secuenciando el genoma y/o el exoma del tejido tumoral y el tejido sano de un paciente con cáncer usando tecnologías de secuenciación de próxima generación. En otra realización, los genes que se seleccionan en función de su frecuencia de mutación y capacidad para actuar como un neoantígeno se secuencian usando tecnología de secuenciación de próxima generación. La secuenciación de próxima generación se aplica a la secuenciación del genoma, la resecuenciación del genoma, la elaboración de perfiles transcriptómicos (RNA-Seq), las interacciones ADN-proteína (secuenciación ChIP) y la caracterización del epigenoma (de Magalhaes JP, Finch CE, Janssens G (2010). "Next-generation sequencing in aging research: emerging applications, problems, pitfalls and possible solutions". Ageing Research Reviews 9 (3): 315-323; Hall N (May 2007). "Advanced sequencing technologies and their wider impact in microbiology". J. Exp. Biol.209 (Pt 9): 1518-1525; Church GM (Enero 2006). "Genomes for all". Sci. Am. 294 (1): 46-54; ten Bosch JR, Grody WW (2008). "Keeping Up with the Next Generation". The Journal of Molecular Diagnostics 10 (6): 484-492; Tucker T, Marra M, Friedman JM (2009). "Massively Parallel Sequencing: The Next Big Thing in Genetic Medicine". The American Journal of Human Genetics 85 (2): 142-154). La secuenciación de próxima generación ahora puede revelar rápidamente la presencia de mutaciones discretas, como mutaciones codificantes en tumores individuales, más comúnmente cambios de un solo aminoácido (por ejemplo, mutaciones de sentido erróneo) y con menos frecuencia nuevos tramos de aminoácidos generados por inserciones/eliminaciones/fusiones de genes de cambio de marco, mutaciones de lectura en parada codones y traducción de intrones empalmados incorrectamente (por ejemplo, neoORFs). Los NeoORF son particularmente valiosos como inmunógenos porque la totalidad de su secuencia es completamente nueva para el sistema inmunitario y, por lo tanto, son análogas a un antígeno extraño viral o bacteriano. Por lo tanto, los neoORF: (1) son muy específicos del tumor (es decir, no hay expresión en ninguna célula normal); y (2) puede eludir la tolerancia central, aumentando así la frecuencia de precursores de CTL específicos de neoantígeno. Por ejemplo, el poder de utilizar secuencias extrañas análogas en una vacuna terapéutica contra el cáncer o una composición inmunogénica se demostró recientemente con péptidos derivados del virus del papiloma humano (VPH). ~50% de los 19 pacientes con enfermedad inducida viralmente pre-neoplásica, que recibieron 3 - 4 vacunas de una mezcla de péptidos de VPH derivados de los oncogenes virales E6 y E7 mantuvieron una respuesta completa durante >24 meses (Kenter et al, Vaccination against HPV-16 Oncoproteins for Vulvar Intraepithelial Neoplasia NeJM 361:1838 (2009)).
[0102] La tecnología de secuenciación ha revelado que cada tumor contiene múltiples mutaciones específicas del paciente que alteran el contenido de codificación de proteínas de un gen. Tales mutaciones crean proteínas alteradas, que van desde cambios de un solo aminoácido (causados por mutaciones de sentido erróneo) hasta la adición de regiones largas de secuencias de aminoácidos novedosas debido a cambios de marco, lectura completa de codones de terminación o traducción de regiones de intrones (mutaciones de marco de lectura abierto novedosas; neoORF). Estas proteínas mutadas son objetivos valiosos para la respuesta inmunitaria del huésped al tumor ya que, a diferencia de las proteínas nativas, no están sujetas a los efectos de amortiguación inmunitaria de la autotolerancia. Por lo tanto, es más probable que las proteínas mutadas sean inmunogénicas y también más específicas para las células tumorales en comparación con las células normales del paciente.
[0103] Un procedimiento alternativo para identificar neoantígenos específicos de tumores es la secuenciación directa de proteínas. La secuenciación de proteínas de digeridos enzimáticos usando técnicas de MS multidimensional (MSn) que incluyen espectrometría de masas en tándem (MS/MS) también se puede usar para identificar los neoantígenos de la divulgación. Tales enfoques proteómicos permiten un análisis rápido y altamente automatizado (véase, por ejemplo, K. Gevaert y J. Vandekerckhove, Electrophoresis 21:1145-1154 (2000)). Se contempla además dentro del alcance de la presente invención que pueden usarse procedimientos de alto rendimiento para la secuenciación de novo de proteínas desconocidas para analizar el proteoma del tumor de un paciente para identificar neoantígenos expresados. Por ejemplo, la secuenciación de proteína meta escopeta puede usarse para identificar neoantígenos expresados (ver, por ejemplo, Guthals et al. (2012) Shotgun Protein Sequencing with Meta-contig Assembly, Molecular and Cellular Proteomics 11(10): 1084-96).
[0104] Los neoantígenos específicos de tumores también pueden identificarse usando multímeros de MHC para identificar respuestas de células T específicas de neoantígenos. Por ejemplo, el análisis de alto rendimiento de las respuestas de células T específicas de neoantígeno en muestras de pacientes se puede realizar utilizando técnicas de detección basadas en tetrámeros de MHC (ver, por ejemplo, Hombrink et al. (2011) Identificación de alto rendimiento de antígenos de histocompatibilidad menores potenciales por MHC Detección basada en tetrámeros: Viabilidad y limitaciones 6(8):1-11; Hadrup et al. (2009) Detección paralela de respuestas de células T específicas de antígeno mediante codificación multidimensional de multímeros MHC, Nature Methods, 6(7):520 -26; van Rooij et al. (2013) El análisis del exoma tumoral revela una reactividad de células T específica de neoantígeno en un melanoma que responde a ipilimumab, Journal of Clinical Oncology, 31:1-4; y Heemskerk et al. (2013) El cáncer antigenoma, EMBO Journal, 32(2): 194-203). Dichas técnicas de cribado basadas en tetrámeros pueden utilizarse para la identificación inicial de neoantígenos específicos de tumores o, alternativamente, como un protocolo de cribado secundario para evaluar a qué neoantígenos puede haber estado ya expuesto un paciente, facilitando así la selección de neoantígenos candidatos para la presente invención.
[0105] En una realización, los datos de secuenciación derivados de la determinación de la presencia de mutaciones en un paciente con cáncer se analizan para predecir los péptidos mutados personales que pueden unirse a las moléculas HLA del individuo. En una realización, los datos se analizan usando una computadora. En otra realización, los datos de la secuencia se analizan en busca de la presencia de neoantígenos. En una realización, los neoantígenos se determinan por su afinidad con las moléculas del MHC. La elección eficiente de qué mutaciones particulares utilizar como inmunógeno requiere la identificación del tipo de HLA del paciente y la capacidad de predecir qué péptidos mutados se unirían de manera eficiente a los alelos de HLA del paciente. Recientemente, los enfoques de aprendizaje basados en redes neuronales con péptidos vinculantes y no vinculantes validados han mejorado la precisión de los algoritmos de predicción para los principales alelos HLA-A y -B. Competencia de aprendizaje automático en inmunología - Predicción de péptidos de unión a HLA clase I J Immunol Methods 374:1 (2011); Lundegaard et al. Predicción de epítopos utilizando procedimientos basados en redes neuronales J Immunol Methods 374:26 (2011)). Competencia de aprendizaje automático en inmunología - Predicción de péptidos de unión a HLA clase I J Immunol Methods 374:1 (2011); Lundegaard et al. Predicción de epítopos utilizando procedimientos basados en redes neuronales J Immunol Methods 374:26 (2011)).
[0106] Dirigirse a tantos epítopos mutados como sea posible en la práctica aprovecha la enorme capacidad del sistema inmunitario, evita la oportunidad de escape inmunológico mediante la modulación negativa de un producto génico dirigido inmunitario particular y compensa la inexactitud conocida de los enfoques de predicción de epítopos. Los péptidos sintéticos proporcionan un medio particularmente útil para preparar múltiples inmunógenos de manera eficiente y traducir rápidamente la identificación de epítopos mutantes en una vacuna eficaz o composición inmunogénica. Los péptidos pueden sintetizarse fácilmente químicamente y purificarse fácilmente utilizando reactivos libres de bacterias contaminantes o sustancias animales. El tamaño pequeño permite un enfoque claro en la región mutada de la proteína y también reduce la competencia antigénica irrelevante de otros componentes (proteína no mutada o antígenos de vectores virales).
[0107] En una realización, la formulación del fármaco es una vacuna multiepítopo o una composición inmunogénica de péptidos largos. Dichos péptidos "largos" se someten a una internalización, procesamiento y presentación cruzada eficientes en células presentadoras de antígenos profesionales, como las células dendríticas, y se ha demostrado que inducen CTL en humanos (Melief y van der Burg, Immunotherapy of Established (pre)malign disease by vacunas sintéticas de péptido largo Nature Rev Cancer 8:351 (2008)). En una realización, se prepara al menos 1 péptido para la inmunización. En una realización preferida, se preparan 20 o más péptidos para la inmunización. Según la presente invención, el péptido neoantigénico varía de 5 a 50 aminoácidos de longitud. En otra realización, se sintetizan péptidos de aproximadamente 15 a aproximadamente 35 aminoácidos de longitud.
Producción de neoantígenos específicos de tumores
[0108] La presente invención se basa, al menos en parte, en la capacidad de presentar al sistema inmunitario del paciente una combinación de neoantígenos específicos de tumores. Un experto en la técnica a partir de esta descripción y el conocimiento en la técnica entenderá que hay una variedad de formas en las que producir tales neoantígenos específicos de tumores. En general, dichos neoantígenos específicos de tumores se pueden producir in vitro o in vivo. Los neoantígenos específicos de tumores pueden producirse in vitro como péptidos o polipéptidos, que a continuación pueden formularse en una vacuna de neoplasia personalizada o una composición inmunogénica y administrarse a un sujeto. Como se describe con más detalle en el presente documento, dicha producción in vitro puede ocurrir mediante una variedad de procedimientos conocidos por los expertos en la técnica, como, por ejemplo, síntesis de péptidos o expresión de un péptido/polipéptido a partir de una molécula de ADN o ARN en cualquiera de una variedad de sistemas de expresión recombinantes bacterianos, eucarióticos o virales, seguida de la purificación del péptido/polipéptido expresado. Alternativamente, los neoantígenos específicos de tumores pueden producirse in vivo introduciendo moléculas (por ejemplo, ADN, ARN, sistemas de expresión viral y similares) que codifican neoantígenos específicos de tumores en un sujeto, después de lo cual se expresan los neoantígenos específicos de tumores codificados. Los procedimientos de producción in vitro e in vivo de neoantígenos también se describen con más detalle en el presente documento en relación con las composiciones farmacéuticas y los procedimientos de administración.
Síntesis de péptidos/polipéptidos in vitro
[0109] Las proteínas o los péptidos pueden fabricarse mediante cualquier técnica conocida por los expertos en la materia, incluida la expresión de proteínas, polipéptidos o péptidos mediante técnicas estándar de biología molecular, el aislamiento de proteínas o péptidos de fuentes naturales, la traducción in vitro o la síntesis química de proteínas o péptidos. Las secuencias de nucleótidos y proteínas, polipéptidos y péptidos correspondientes a diversos genes se han descrito previamente y se pueden encontrar en bases de datos informatizadas conocidas por los expertos en la materia. Una de esas bases de datos es la base de datos Genbank y GenPept del Centro Nacional de Información Biotecnológica ubicada en el sitio web de los Institutos Nacionales de Salud. Las regiones codificantes de genes conocidos pueden amplificarse y/o expresarse usando las técnicas descritas en el presente documento o como sería conocido por los expertos en la materia. Alternativamente, los expertos en la técnica conocen diversas preparaciones comerciales de proteínas, polipéptidos y péptidos.
[0110] Los péptidos se pueden sintetizar fácilmente químicamente utilizando reactivos que no contengan sustancias bacterianas o animales contaminantes (Merrifield RB: síntesis de péptidos en fase sólida. I. La síntesis de un tetrapéptido. J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-54, 1963). En ciertas realizaciones, los péptidos neoantigénicos se preparan mediante (1) síntesis paralela en fase sólida en instrumentos multicanal usando condiciones uniformes de síntesis y escisión; (2) purificación sobre una columna de RP-HPLC con extracción de la columna; y volver a lavar, pero no reemplazar, entre péptidos; seguido de (3) análisis con un conjunto limitado de los ensayos más informativos. La huella de Buenas Prácticas de Fabricación (GMP) se puede definir en torno al conjunto de péptidos para un paciente individual, por lo que requiere procedimientos de cambio de conjunto solo entre síntesis de péptidos para diferentes pacientes.
[0111] Alternativamente, se puede usar un ácido nucleico (por ejemplo, un polinucleótido) que codifica un péptido neoantigénico de la descripción para producir el péptido neoantigénico in vitro. El polinucleótido puede ser, por ejemplo, ADN, ADNc, PNA, CNA, a Rn , formas de polinucleótidos de cadena simple y/o doble, o nativas o estabilizadas, como por ejemplo, polinucleótidos con un esqueleto de fosforotiato, o combinaciones de los mismos, y puede o puede no contener intrones siempre que codifique el péptido. En una realización, se usa la traducción in vitro para producir el péptido. Existen muchos ejemplos de sistemas que podría utilizar un experto en la técnica (por ejemplo, Retic Lysate IVT Kit, Life Technologies, Waltham, MA).
[0112] También se puede preparar un vector de expresión capaz de expresar un polipéptido. Los vectores de expresión para diferentes tipos de células son bien conocidos en la técnica y pueden seleccionarse sin experimentación indebida. Generalmente, el ADN se inserta en un vector de expresión, como un plásmido, con la orientación adecuada y el marco de lectura correcto para la expresión. Si es necesario, el ADN puede unirse a las secuencias de nucleótidos de control reguladoras transcripcionales y traduccionales apropiadas reconocidas por el huésped deseado (por ejemplo, bacterias), aunque tales controles generalmente están disponibles en el vector de expresión. A continuación, el vector se introduce en la bacteria huésped para la clonación utilizando técnicas estándar (véase, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
[0113] También se contemplan los vectores de expresión que comprenden los polinucleótidos aislados, así como las células huésped que contienen los vectores de expresión. Los péptidos neoantigénicos pueden proporcionarse en forma de moléculas de ARN o ADNc que codifican los péptidos neoantigénicos deseados. Uno o más péptidos neoantigénicos de la divulgación pueden estar codificados por un único vector de expresión.
[0114] El término "polinucleótido que codifica un polipéptido" abarca un polinucleótido que incluye solo secuencias codificantes para el polipéptido, así como un polinucleótido que incluye secuencias codificantes y/o no codificantes adicionales. Los polinucleótidos pueden estar en forma de ARN o en forma de ADN. El ADN incluye ADNc, ADN genómico y ADN sintético; y puede ser bicatenario o monocatenario, y si es monocatenario puede ser la cadena codificante o la cadena no codificante (antisentido).
[0115] En realizaciones, los polinucleótidos pueden comprender la secuencia codificante para el péptido neoantigénico específico del tumor fusionado en el mismo marco de lectura con un polinucleótido que ayuda, por ejemplo, en la expresión y/o secreción de un polipéptido de una célula huésped (por ejemplo, una secuencia líder que funciona como una secuencia secretora para controlar el transporte de un polipéptido desde la célula). El polipéptido que tiene una secuencia líder es una preproteína y la célula huésped puede escindir la secuencia líder para formar la forma madura del polipéptido.
[0116] En realizaciones, los polinucleótidos pueden comprender la secuencia codificante para el péptido neoantigénico específico del tumor fusionado en el mismo marco de lectura con una secuencia marcadora que permite, por ejemplo, la purificación del polipéptido codificado, que a continuación puede incorporarse en la vacuna neoplásica personalizada o composición inmunogénica. Por ejemplo, la secuencia marcadora puede ser una etiqueta de hexahistidina suministrada por un vector pQE-9 para permitir la purificación del polipéptido maduro fusionado con el marcador en el caso de un huésped bacteriano, o la secuencia marcadora puede ser una hemaglutinina (HA) etiqueta derivada de la proteína hemaglutinina de influenza cuando se utiliza un huésped mamífero (por ejemplo, células COS-7). Las etiquetas adicionales incluyen, entre otras, etiquetas Calmodulin, etiquetas FLAG, etiquetas Myc, etiquetas S, etiquetas SBP, Softag 1, Softag 3, etiqueta V5, etiqueta Xpress, Isopeptag, SpyTag,
[0117] En realizaciones, los polinucleótidos pueden comprender la secuencia codificante para uno o más de los péptidos neoantigénicos específicos de tumor fusionados en el mismo marco de lectura para crear una única construcción de péptido neoantigénico concatemerizado capaz de producir múltiples péptidos neoantigénicos.
[0118] En ciertos casos, moléculas de ácido nucleico aisladas que tienen una secuencia de nucleótidos al menos 60 % idéntica, al menos 65 % idéntica, al menos 70 % idéntica, al menos 75 % idéntica, al menos 80 % idéntica, al menos 85 % idéntica , al menos 90% idéntico, al menos 95% idéntico, o al menos 96%, 97%, 98% o 99% idéntico a un polinucleótido que codifica un péptido neoantigénico específico de tumor de la presente invención.
[0119] Por un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos, por ejemplo, 95 % "idéntica" a una secuencia de nucleótidos de referencia se entiende que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia de polinucleótidos puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos idéntica en al menos un 95 % a una secuencia de nucleótidos de referencia, se puede eliminar o sustituir hasta el 5 % de los nucleótidos de la secuencia de referencia con otro nucleótido, o un número de nucleótidos de hasta El 5% del total de nucleótidos en la secuencia de referencia se puede insertar en la secuencia de referencia.
[0120] En la práctica, si una molécula de ácido nucleico en particular es al menos 80 % idéntica, al menos 85 % idéntica, al menos 90 % idéntica y, en algunos casos, al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o El 99% de identidad con una secuencia de referencia se puede determinar convencionalmente utilizando programas informáticos conocidos como el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). Bestfit usa el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981), para encontrar el mejor segmento de homología entre dos secuencias. Al usar Bestfit o cualquier otro programa de alineación de secuencias para determinar si una secuencia en particular es, por ejemplo, 95 % idéntica a una secuencia de referencia según la presente descripción, los parámetros se fijan de manera que el porcentaje de identidad se calcula sobre la longitud completa de la secuencia de nucleótidos de referencia y se permiten espacios en la homología de hasta el 5 % del número total de nucleótidos en la secuencia de referencia.
[0121] Los péptidos neoantigénicos específicos de tumores aislados descritos en el presente documento se pueden producir in vitro (por ejemplo, en el laboratorio) mediante cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica. Dichos procedimientos van desde procedimientos de síntesis directa de proteínas hasta la construcción de una secuencia de ADN que codifica secuencias polipeptídicas aisladas y expresa esas secuencias en un huésped transformado adecuado. En algunas realizaciones, se construye una secuencia de ADN usando tecnología recombinante aislando o sintetizando una secuencia de ADN que codifica una proteína de interés de tipo salvaje. Opcionalmente, la secuencia se puede mutagenizar mediante mutagénesis específica de sitio para proporcionar análogos funcionales de la misma. Véase, por ejemplo, Zoeller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5662-5066 (1984) y la Patente de EE.UU. N° 4.588.585.
[0122] En realizaciones, una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de interés se construiría mediante síntesis química utilizando un sintetizador de oligonucleótidos. Dichos oligonucleótidos pueden diseñarse basándose en la secuencia de aminoácidos del polipéptido deseado y seleccionando aquellos codones que son favorecidos en la célula huésped en la que se produce el polipéptido recombinante de interés. Se pueden aplicar procedimientos estándar para sintetizar una secuencia polinucleotídica aislada que codifica un polipéptido aislado de interés. Por ejemplo, se puede usar una secuencia de aminoácidos completa para construir un gen retrotraducido. Además, se puede sintetizar un oligómero de ADN que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido aislado particular. Por ejemplo, se pueden sintetizar y a continuación ligar varios oligonucleótidos pequeños que codifican porciones del polipéptido deseado.
[0123] Una vez ensambladas (por ejemplo, por síntesis, mutagénesis dirigida al sitio u otro procedimiento), las secuencias de polinucleótidos que codifican un polipéptido aislado particular de interés se insertan en un vector de expresión y, opcionalmente, se unen operativamente a una secuencia de control de expresión apropiada para la expresión de la proteína en un huésped deseado. El ensamblaje adecuado se puede confirmar mediante la secuenciación de nucleótidos, el mapeo de restricción y la expresión de un polipéptido biológicamente activo en un huésped adecuado. Como es bien sabido en la técnica, para obtener altos niveles de expresión de un gen transfectado en un huésped, el gen puede unirse operativamente a secuencias de control de la expresión transcripcional y traduccional que son funcionales en el huésped de expresión elegido.
[0124] Pueden usarse vectores de expresión recombinantes para amplificar y expresar ADN que codifica los péptidos neoantigénicos específicos de tumores. Los vectores de expresión recombinantes son construcciones de ADN replicables que tienen fragmentos de ADN sintéticos o derivados de ADNc que codifican un péptido neoantigénico específico de tumor o un análogo bioequivalente unido operativamente a elementos reguladores transcripcionales o traduccionales adecuados derivados de genes de mamíferos, microbianos, virales o de insectos. Una unidad transcripcional generalmente comprende un ensamblaje de (1) un elemento genético o elementos que tienen un papel regulador en la expresión génica, por ejemplo, promotores o potenciadores transcripcionales, (2) una secuencia estructural o codificante que se transcribe en ARNm y se traduce en proteína, y (3) secuencias apropiadas de iniciación y terminación de la transcripción y traducción, como se describe en detalle en el presente documento. Dichos elementos reguladores pueden incluir una secuencia operadora para controlar la transcripción. Puede incorporarse adicionalmente la capacidad de replicarse en un huésped, normalmente conferida por un origen de replicación, y un gen de selección para facilitar el reconocimiento de transformantes. Las regiones de ADN están unidas operativamente cuando están funcionalmente relacionadas entre sí. Por ejemplo, el ADN de un péptido señal (líder secretor) se une operativamente al ADN de un polipéptido si se expresa como un precursor que participa en la secreción del polipéptido; un promotor está unido operativamente a una secuencia codificante si controla la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosomas se une operativamente a una secuencia de codificación si se coloca para permitir la traducción. En general, ligado operativamente significa contiguo, y en el caso de líderes secretores, significa contiguo y en marco de lectura. Los elementos estructurales previstos para su uso en sistemas de expresión de levadura incluyen una secuencia líder que permite la secreción extracelular de la proteína traducida por una célula huésped. Alternativamente, cuando la proteína recombinante se expresa sin una secuencia líder o de transporte, puede incluir un residuo de metionina N-terminal. Este residuo se puede escindir opcionalmente posteriormente de la proteína recombinante expresada para proporcionar un producto final.
[0125] Los vectores de expresión útiles para huéspedes eucarióticos, especialmente mamíferos o humanos incluyen, por ejemplo, vectores que comprenden secuencias de control de expresión de SV40, virus del papiloma bovino, adenovirus y citomegalovirus. Los vectores de expresión útiles para huéspedes bacterianos incluyen plásmidos bacterianos conocidos, como plásmidos de Escherichia coli, incluidos pCR 1, pBR322, pMB9 y sus derivados, plásmidos de intervalo de huéspedes más amplios, como M13 y fagos de ADN filamentoso monocatenario.
[0126] Las células huésped adecuadas para la expresión de un polipéptido incluyen células procariotas, levaduras, insectos o eucariotas superiores bajo el control de promotores apropiados. Los procariotas incluyen organismos gram negativos o gram positivos, por ejemplo, E. coli o bacilos. Las células eucariotas superiores incluyen líneas celulares establecidas de origen mamífero. También podrían emplearse sistemas de traducción sin células. Los vectores de clonación y expresión apropiados para usar con huéspedes celulares bacterianos, fúngicos, de levadura y de mamífero son bien conocidos en la técnica (véase Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, NY, 1985).
[0127] También se emplean ventajosamente varios sistemas de cultivo de células de insectos o mamíferos para expresar la proteína recombinante. La expresión de proteínas recombinantes en células de mamíferos se puede realizar porque tales proteínas generalmente se pliegan correctamente, se modifican apropiadamente y son completamente funcionales. Los ejemplos de líneas de células huésped de mamífero adecuadas incluyen las líneas COS-7 de células de riñón de mono, descritas por Gluzman (Cell 23:175, 1981), y otras líneas celulares capaces de expresar un vector apropiado que incluye, por ejemplo, células L, C127, 3T3, ovario de hámster chino (CHO), 293, líneas celulares HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamíferos pueden comprender elementos no transcritos, como un origen de replicación, un promotor y un potenciador adecuados unidos al gen que se va a expresar, y otras secuencias no transcritas flanqueantes en 5' o 3', y secuencias 5' o 3' secuencias no traducidas, como los sitios de unión a ribosomas necesarios, un sitio de poliadenilación, sitios donantes y aceptores de corte y empalme, y secuencias de terminación de la transcripción. Los sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insectos están revisados por Luckow y Summers, Bio/Technology 6:47 (1988).
[0128] Las proteínas producidas por un huésped transformado pueden purificarse según cualquier procedimiento adecuado. Dichos procedimientos estándar incluyen cromatografía (por ejemplo, cromatografía en columna de intercambio iónico, afinidad y tamaño, y similares), centrifugación, solubilidad diferencial o cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. Las etiquetas de afinidad tales como hexahistidina, dominio de unión a maltosa, secuencia de cubierta de influenza, glutatión-S-transferasa y similares pueden unirse a la proteína para permitir una fácil purificación pasándola por una columna de afinidad apropiada. Las proteínas aisladas también se pueden caracterizar físicamente utilizando técnicas como la proteólisis, la resonancia magnética nuclear y la cristalografía de rayos X.
[0129] Por ejemplo, los sobrenadantes de sistemas que secretan proteína recombinante en medios de cultivo pueden concentrarse primero usando un filtro de concentración de proteína disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Después del paso de concentración, el concentrado se puede aplicar a una matriz de purificación adecuada. Alternativamente, se puede emplear una resina de intercambio aniónico, por ejemplo, una matriz o sustrato que tenga grupos colgantes de dietilaminoetilo (DEAE). Las matrices pueden ser de acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos comúnmente empleados en la purificación de proteínas. Alternativamente, se puede emplear un paso de intercambio de cationes. Los intercambiadores de cationes adecuados incluyen varias matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Por fin, Se pueden emplear uno o más pasos de cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa (RP-HPLC) que emplean medios de RP-HPLC hidrófobos, por ejemplo, gel de sílice que tiene metilo colgante u otros grupos alifáticos, para purificar más una composición de proteína Fc de células madre cancerosas. Algunos o todos los pasos de purificación anteriores, en varias combinaciones, también se pueden emplear para proporcionar una proteína recombinante homogénea.
[0130] La proteína recombinante producida en cultivo bacteriano puede aislarse, por ejemplo, mediante extracción inicial de sedimentos celulares, seguida de una o más etapas de cromatografía de concentración, salificación, intercambio iónico acuoso o exclusión por tamaño. La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) se puede emplear para los pasos finales de purificación. Las células microbianas empleadas en la expresión de una proteína recombinante pueden romperse mediante cualquier procedimiento conveniente, incluidos ciclos de congelación y descongelación, sonicación, ruptura mecánica o uso de agentes de lisis celular.
Síntesis de péptidos/polipéptidos in vivo
[0131] La presente descripción también contempla el uso de moléculas de ácido nucleico como vehículos para administrar péptidos/polipéptidos neoantigénicos al sujeto que los necesita, in vivo, en forma de, por ejemplo, vacunas de ADN/ARN (véase, por ejemplo, WO2012/ 159643 y WO2012/159754).
[0132] En un caso, se pueden administrar neoantígenos a un paciente que los necesite mediante el uso de un plásmido. Estos son plásmidos que generalmente consisten en un fuerte promotor viral para impulsar la transcripción y traducción in vivo del gen (o ADN complementario) de interés (Mor, et al., (1995). The Journal of Immunology 155 (4): 2039 -2046). A veces se puede incluir el intrón A para mejorar la estabilidad del ARNm y, por lo tanto, aumentar la expresión de la proteína (Leitner et al. (1997). The Journal of Immunology 159 (12): 6112-6119). Los plásmidos también incluyen una fuerte señal de poliadenilación/terminación de la transcripción, como la hormona de crecimiento bovina o secuencias de poliadenilación de beta-globulina de conejo (Alarcon et al., (1999). Adv. Parasitol. Advances in Parasitology 42: 343-410; Robinson et al. , (2000), Adv. Virus Res. Advances in Virus Research 55: 1-74, Bohmet al., (1996). Revista de procedimientos inmunológicos 193 (1): 29-40.). Los vectores multicistrónicos a veces se construyen para expresar más de un inmunógeno, o para expresar un inmunógeno y una proteína inmunoestimuladora (Lewis et al., (1999). Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88).
[0133] Debido a que el plásmido es el "vehículo" a partir del cual se expresa el inmunógeno, es esencial optimizar el diseño del vector para la máxima expresión de proteínas (Lewis et al., (1999). Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88). Una forma de mejorar la expresión de proteínas es optimizar el uso de codones de mRNA patogénicos para células eucariotas. Otra consideración es la elección del promotor. Dichos promotores pueden ser el promotor SV40 o el virus del sarcoma de Rous (RSV).
[0134] Los plásmidos pueden introducirse en tejidos animales mediante varios procedimientos diferentes. Los dos enfoques más populares son la inyección de ADN en solución salina, utilizando una aguja hipodérmica estándar y la administración de pistolas de genes. En Scientific American (Weiner et al., (1999) Scientific American 281 (1): 34-41) se ilustra un esquema de la construcción de un plásmido de vacuna de ADN y su subsiguiente administración mediante estos dos procedimientos en un huésped. La inyección de solución salina normalmente se realiza por vía intramuscular (IM) en el músculo esquelético, o por vía intradérmica (ID), y el ADN se administra a los espacios extracelulares. Esto puede ser asistido por electroporación al dañar temporalmente las fibras musculares con miotoxinas como la bupivacaína; o mediante el uso de soluciones hipertónicas de solución salina o sacarosa (Alarcon et al., (1999). Adv. Parasitol. Advances in Parasitology 42: 343-410).
[0135] El suministro de pistola de genes, el otro procedimiento de suministro comúnmente utilizado, acelera balísticamente el ADN plasmídico (pDNA) que ha sido adsorbido en micropartículas de oro o tungsteno en las células diana, utilizando helio comprimido como acelerante (Alarcon et al., (1999) (Adv. Parasitol. Advances in Parasitology 42: 343-410; Lewis et al., (1999). Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88).
[0136] Los procedimientos de administración alternativos pueden incluir la instilación en aerosol de ADN desnudo en superficies mucosas, como la mucosa nasal y pulmonar (Lewis et al., (1999). Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88) y administración tópica de pDNA en el ojo y la mucosa vaginal (Lewis et al., (1999) Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88). La entrega en la superficie de la mucosa también se ha logrado usando preparaciones catiónicas de liposomas-ADN, microesferas biodegradables, vectores atenuados de Shigella o Listeria para la administración oral a la mucosa intestinal y vectores de adenovirus recombinantes.
[0137] El procedimiento de administración determina la dosis de ADN necesaria para generar una respuesta inmunitaria eficaz. Las inyecciones de solución salina requieren cantidades variables de ADN, de 10 |jg a 1 mg, mientras que las entregas con armas de genes requieren de 100 a 1000 veces menos ADN que la inyección de solución salina intramuscular para generar una respuesta inmunitaria eficaz. En general, se requieren de 0,2 |jg a 20 |jg, aunque se han informado cantidades tan bajas como 16 ng. Estas cantidades varían de una especie a otra; los ratones, por ejemplo, requieren aproximadamente 10 veces menos ADN que los primates. Las inyecciones de solución salina requieren más a Dn porque el ADN se envía a los espacios extracelulares del tejido objetivo (normalmente músculo), donde tiene que superar barreras físicas (como la lámina basal y grandes cantidades de tejido conectivo, por mencionar algunas) antes de es absorbido por las células, 299-302; Fynan et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (24): 11478-82). 299-302; Fynan et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (24): 11478-82).
[0138] En un caso, una vacuna o una composición inmunogénica contra la neoplasia puede incluir plásmidos de ADN separados que codifican, por ejemplo, uno o más péptidos/polipéptidos neoantigénicos según se identifican según la presente invención. Como se discute en el presente documento, la elección exacta de los vectores de expresión puede depender del péptido/polipéptido que se va a expresar, y está bien dentro de la experiencia del experto en la materia. Se espera que la persistencia esperada de las construcciones de ADN (por ejemplo, en una forma episomal, no replicante, no integrada en las células musculares) proporcione una mayor duración de la protección.
[0139] Uno o más péptidos neoantigénicos de la divulgación pueden codificarse y expresarse in vivo utilizando un sistema basado en virus (por ejemplo, un sistema de adenovirus, un vector de virus adenoasociado (AAV), un poxvirus o un lentivirus). En un caso, la vacuna contra la neoplasia o la composición inmunogénica puede incluir un vector basado en virus para usar en un paciente humano que lo necesite, como, por ejemplo, un adenovirus (ver, por ejemplo, Baden et al. Primera evaluación en humanos de la seguridad e inmunogenicidad de una vacuna recombinante de adenovirus serotipo 26 HIV-1 Env (IPCAVD 001).J Infect Dis. 2013 Jan 15;207(2):240-7). Los plásmidos que se pueden usar para la administración de virus, adenovirus y lentivirus adenoasociados se han descrito anteriormente (véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. Nos 6.955.808 y 6.943.019 y la solicitud de patente de EE. UU.
[0140] Entre los vectores que pueden usarse en la práctica de la descripción, la integración en el genoma huésped de una célula es posible con procedimientos de transferencia de genes de retrovirus, lo que a menudo da como resultado una expresión a largo plazo del transgén insertado. En un caso preferido, el retrovirus es un lentivirus. Además, se han observado altas eficiencias de transducción en muchos tipos de células y tejidos diana diferentes. El tropismo de un retrovirus se puede alterar mediante la incorporación de proteínas de envoltura extrañas, lo que amplía la población diana potencial de células diana. También se puede diseñar un retrovirus para permitir la expresión condicional del transgén insertado, de modo que el lentivirus infecte solo ciertos tipos de células. Los promotores específicos del tipo de célula se pueden usar para dirigir la expresión en tipos de células específicos. Los vectores lentivirales son vectores retrovirales (y, por lo tanto, pueden usarse vectores lentivirales y retrovirales en la práctica de la divulgación). Además, se prefieren los vectores lentivirales ya que son capaces de transducir o infectar células que no se dividen y normalmente producen títulos virales elevados. Por lo tanto, la selección de un sistema de transferencia de genes retrovirales puede depender del tejido diana. Los vectores retrovirales se componen de repeticiones terminales largas que actúan en cis con capacidad de empaquetamiento de hasta 6-10 kb de secuencia extraña. Los LTR mínimos que actúan en cis son suficientes para la replicación y el empaquetamiento de los vectores, que a continuación se utilizan para integrar el ácido nucleico deseado en la célula diana para proporcionar una expresión permanente. Los vectores retrovirales ampliamente usados que pueden usarse en la práctica de la divulgación incluyen aquellos basados en el virus de la leucemia murina (MuLV), virus de la leucemia del simio gibón (GaLV), virus de la inmunodeficiencia de los simios (SIV), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y combinaciones de los mismos (ver, por ejemplo, Buchscher et al., (1992) J. Virol. 66:2731-2739; Johann et al., (1992) J. Virol. 66:1635-1640; Sommnerfelt et al., (1990) Virol.
176:58-59; Wilson et al., (1998) J. Virol. 63:2374- 2378; Miller et al., (1991) J. Virol. 65:2220-2224; PCT/US94/05700). Zou et al. administrado alrededor de 10 j l de un lentivirus recombinante con un título de 1 * 10 PCT/US94/05700). Zou et al. administrado alrededor de 10 j l de un lentivirus recombinante con un título de 1 * 10 PCT/US94/05700). Zou et al. administrado alrededor de 10 j l de un lentivirus recombinante con un título de 1 * 109 unidades transductoras (UT)/ml por catéter intratecal. Este tipo de dosificación puede adaptarse o extrapolarse al uso de un vector retroviral o lentiviral en la presente descripción.
[0141] También es útil en la práctica de la divulgación un vector lentiviral mínimo no primate, tal como un vector lentiviral basado en el virus de la anemia infecciosa equina (EIAV) (ver, por ejemplo, Balagaan, (2006) J Gene Med; 8 : 275 - 285, Publicado en línea el 21 de noviembre de 2005 en Wiley InterScience (www.interscience.wiley.com).DOI: 10.1002/jgm.845). Los vectores pueden tener un promotor de citomegalovirus (CMV) que dirige la expresión del gen diana. En consecuencia, la divulgación contempla entre vectores útiles en la práctica de la divulgación: vectores virales, incluidos vectores retrovirales y vectores lentivirales.
[0142] También es útil en la práctica de la descripción un vector de adenovirus. Una ventaja es la capacidad de los adenovirus recombinantes para transferir y expresar eficientemente genes recombinantes en una variedad de células y tejidos de mamíferos in vitro e in vivo, lo que da como resultado una alta expresión de los ácidos nucleicos transferidos. Además, la capacidad de infectar productivamente células quiescentes amplía la utilidad de los vectores adenovirales recombinantes. Además, los altos niveles de expresión aseguran que los productos de los ácidos nucleicos se expresarán a niveles suficientes para generar una respuesta inmunitaria (ver, por ejemplo, la Patente de EE.UU. No. 7.029.848).
[0143] En un caso en el presente documento, la administración es a través de un adenovirus, que puede ser una dosis de refuerzo única que contiene al menos 1 * 105 partículas (también denominadas unidades de partículas, pu) de vector adenoviral. En una realización del presente documento, la dosis es preferiblemente al menos aproximadamente 1 * 106 partículas (por ejemplo, aproximadamente 1 * 106 -1 * 1012 partículas), más preferiblemente al menos aproximadamente 1 * 107 partículas, más preferiblemente al menos aproximadamente 1 * 108 partículas (por ejemplo, alrededor de 1 * 108-1 * 1011 partículas o alrededor de 1 * 108 -1 * 1012 partículas), y lo más preferiblemente al menos alrededor de 1 * 109partículas (por ejemplo, aproximadamente 1 * 109 -1 * 1010 partículas 0 aproximadamente 1 * 109-1 * 1012 partículas), o incluso al menos aproximadamente 1 * 1010 partículas (por ejemplo, aproximadamente 1 * 1010 -1 * 1012 partículas) del vector adenoviral. Alternativamente, la dosis comprende no más de aproximadamente 1 * 1014 partículas, preferiblemente no más de aproximadamente 1 * 1013 partículas, aún más preferiblemente no más de aproximadamente 1 * 1012 partículas, incluso más preferiblemente no más de aproximadamente 1 * 1011 partículas, y lo más preferiblemente no más de aproximadamente 1 * 1010 partículas (por ejemplo, no más de aproximadamente 1 * 109 artículos). Por lo tanto, la dosis puede contener una sola dosis de vector adenoviral con, por ejemplo, aproximadamente 1 * 106 unidades de partículas (pu), aproximadamente 2 * 106 pu, aproximadamente 4 * 106 pu, aproximadamente 1 * 107 pu, aproximadamente 2 * 107 pu, aproximadamente 4 * 10 7 pu, aproximadamente 1 * 108 pu, aproximadamente 2 * 108 pu, aproximadamente 4 * 108 pu, aproximadamente 1 * 109 pu, aproximadamente 2 * 109 pu, aproximadamente 4 * 109 pu, aproximadamente 1 * 1010pu, aproximadamente 2 * 1010 pu, aproximadamente 4 * 1010 pu, aproximadamente 1 * 1011 pu, aproximadamente 2 * 1011 pu, aproximadamente 4 * 1011 pu, aproximadamente 1 * 1012pu, aproximadamente 2 * 1012pu, o aproximadamente 4 * 1012 pu de vector adenoviral. Véanse, por ejemplo, los vectores adenovirales en la Patente de EE.UU. N° 8.454.972 B2 de Nabel, et. al., otorgado el 4 de junio de 2013; y las dosificaciones en la columna 29, líneas 36-58 del mismo. En un ejemplo de este documento, el adenovirus se administra a través de múltiples dosis.
[0144] En términos de administración in vivo, AAV es ventajoso sobre otros vectores virales debido a la baja toxicidad y la baja probabilidad de causar mutagénesis por inserción porque no se integra en el genoma del huésped. AAV tiene un límite de empaquetado de 4,5 o 4,75 Kb. Las construcciones mayores de 4,5 o 4,75 Kb dan como resultado una producción de virus significativamente reducida. Hay muchos promotores que se pueden usar para impulsar la expresión de moléculas de ácido nucleico. AAV ITR puede servir como promotor y es ventajoso para eliminar la necesidad de un elemento promotor adicional. Para la expresión ubicua se pueden utilizar los siguientes promotores: CMV, CAG, CBh, PGK, SV40, cadenas pesadas o ligeras de ferritina, etc. Para la expresión cerebral se pueden utilizar los siguientes promotores: SynapsinI para todas las neuronas, CaMKIIalpha para las neuronas excitatorias, GAD67 o GAD65 o VGAT para neuronas GABAérgicas, etc. Los promotores utilizados para impulsar la síntesis de ARN pueden incluir: Promotores Pol III como U6 o HI. El uso de un promotor Pol II y casetes intrónicos se puede utilizar para expresar el ARN guía (ARNg).
[0145] En cuanto a AAV, el AAV puede ser AAV1, AAV2, AAV5 o cualquier combinación de los mismos. Uno puede seleccionar el AAV con respecto a las células a las que se dirige; por ejemplo, se pueden seleccionar los serotipos 1, 2, 5 de AAV o una cápside híbrida AAV1, AAV2, AAV5 o cualquier combinación de los mismos para dirigirse a células cerebrales o neuronales; y uno puede seleccionar AAV4 para dirigirse al tejido cardíaco. AAV8 es útil para la entrega al hígado. Los promotores y vectores anteriores se prefieren individualmente.
[0146] En un ejemplo del presente documento, la entrega es a través de un AAV. Se cree que una dosificación terapéuticamente eficaz para la administración in vivo del AAV a un ser humano está en el intervalo de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 ml de solución salina que contiene aproximadamente 1 * 1010 a aproximadamente 1 * 1050 AAV funcional/ml de solución. . La dosis puede ajustarse para equilibrar el beneficio terapéutico frente a cualquier efecto secundario. En un caso aquí, la dosis de AAV está generalmente en el intervalo de concentraciones de aproximadamente 1 * 105 a 1 * 1050 genomas AAV, de aproximadamente 1 * 108 a 1 * 10 20 genomas AAV, de aproximadamente 1 * 1010 a alrededor de 1 * 1016genomas, o alrededor de 1 * 1011 a aproximadamente 1 * 1016genomas AAV. Una dosis humana puede ser de aproximadamente 1 * 1013genomas AAV. Dichas concentraciones pueden administrarse desde alrededor de 0,001 ml hasta alrededor de 100 ml, desde alrededor de 0,05 hasta alrededor de 50 ml, o desde alrededor de 10 hasta alrededor de 25 ml de una solución portadora. En un caso preferido, se usa AAV con un título de aproximadamente 2 x 1013 genomas virales/mililitro, y cada uno de los hemisferios estriatales de un ratón recibe una inyección de 500 nanolitros. Un experto en la materia puede establecer fácilmente otras dosificaciones eficaces mediante ensayos de rutina que establezcan curvas de respuesta a la dosis. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense N° 8.404.658 B2 de Hajjar, et al., concedida el 26 de marzo de 2013, en la col. 27, líneas 45-60.
[0147] En otro caso, se puede lograr la activación eficaz de una respuesta inmunitaria celular para una vacuna o una composición inmunogénica contra la neoplasia expresando los neoantígenos relevantes en una vacuna o composición inmunogénica en un microorganismo no patógeno. Ejemplos bien conocidos de tales microorganismos son Mycobacterium bovis BCG, Salmonella y Pseudomona (véase la patente de EE.UU. n° 6.991.797).
[0148] En otro caso, se usa un Poxvirus en la vacuna contra la neoplasia o en la composición inmunogénica. Estos incluyen orthopoxvirus, avipox, vaccinia, MVA, NYVAC, canarypox, ALVAC, fowlpox, TROVAC, etc. 2013; 31(39): 4220-4222). Los vectores de expresión de poxvirus se describieron en 1982 y rápidamente se utilizaron ampliamente para el desarrollo de vacunas, así como para la investigación en numerosos campos. Las ventajas de los vectores incluyen una construcción simple, la capacidad de acomodar grandes cantidades de ADN extraño y altos niveles de expresión.
[0149] En otro caso, el virus vaccinia se usa en la vacuna contra la neoplasia o en la composición inmunogénica para expresar un neoantígeno. (Rolph et al., Virus recombinantes como vacunas y herramientas inmunológicas. Curr Opin Immunol 9:517-524, 1997). El virus vaccinia recombinante es capaz de replicarse dentro del citoplasma de la célula huésped infectada y, por lo tanto, el polipéptido de interés puede inducir una respuesta inmunitaria. Además, los poxvirus se han utilizado ampliamente como vacunas o vectores de composiciones inmunogénicas debido a su capacidad para dirigirse a antígenos codificados para su procesamiento mediante la vía del complejo principal de histocompatibilidad de clase I al infectar directamente las células inmunitarias, en particular las células presentadoras de antígenos, pero también debido a su capacidad al autoadyuvante.
[0150] En otro caso, ALVAC se usa como vector en una vacuna contra la neoplasia o en una composición inmunogénica. ALVAC es un virus de la viruela del canario que puede modificarse para expresar transgenes extraños y se ha utilizado como procedimiento de vacunación contra antígenos tanto procarióticos como eucarióticos (Horig H, Lee DS, Conkright W, et al. Phase I Clinical Trial of a recombinant canarypoxvirus (ALVAC) que expresa el antígeno carcinoembrionario humano y la molécula coestimuladora B7.1 Cancer Immunol Immunother 2000;49:504-14; von Mehren M, Arlen P, Tsang KY, et al. Pilot study of a dual gene recombinant avipox vacuna que contienen antígeno carcinoembrionario (CEA) y transgenes B7.1 en pacientes con adenocarcinomas recurrentes que expresan CEA Clin Cancer Res 2000;6:2219-28, Musey L, Ding Y, Elizaga M, et al. La vacunación contra el VIH-1 administrada por vía intramuscular puede inducir inmunidad de células T tanto sistémica como mucosal en individuos no infectados por el VIH-1. J Immunol 2003; 171: 1094-101; Paoletti E. Aplicaciones de los vectores del virus de la viruela a la vacunación: una actualización. Proc Natl Acad Sci USA 1996;93:11349-53; Patente de EE.UU. No. 7,255,862). En un ensayo clínico de fase I, un virus ALVAC que expresa el antígeno tumoral CEA mostró un excelente perfil de seguridad y resultó en un aumento de las respuestas de células T específicas de CEA en pacientes seleccionados; sin embargo, no se observaron respuestas clínicas objetivas (Marshall JL, Hawkins MJ, Tsang KY, et al. Estudio de fase I en pacientes con cáncer de una vacuna recombinante avipox defectuosa en la replicación que expresa antígeno carcinoembrionario humano. J Clin Oncol 1999;17:332-7).
[0151] En otro caso, puede usarse un virus Vaccinia Ankara Modificado (MVA) como vector viral para una vacuna de neoantígeno o composición inmunogénica. MVA es un miembro de la familia Orthopoxvirus y ha sido generado por alrededor de 570 pases en serie en fibroblastos de embrión de pollo de la cepa Ankara del virus Vaccinia (CVA) (para una revisión ver Mayr, A., et al., Infection 3, 6-14 , 1975). Como consecuencia de estos pases, el virus MVA resultante contiene 31 kilobases menos de información genómica en comparación con CVA, y está altamente restringido a la célula huésped (Meyer, H. et al., J. Gen. Virol. 72, 1031-1038, 1991). ). MVA se caracteriza por su extrema atenuación, es decir, por una virulencia o capacidad infecciosa disminuida, pero aún conserva una excelente inmunogenicidad. Cuando se probó en una variedad de modelos animales, se demostró que MVA no es virulento, incluso en personas inmunodeprimidas.®-HER2 es una inmunoterapia candidata diseñada para el tratamiento del cáncer de mama HER-2 positivo y actualmente se encuentra en ensayos clínicos. (Mandl et al., Cancer Immunol Immunother. enero de 2012; 61(1): 19-29). Se han descrito procedimientos para producir y usar MVA recombinante (por ejemplo, véanse las Patentes de EE.Uu . Nos. 8.309.098 y 5.185.146).
[0152] En otro caso, la cepa Copenhagen modificada del virus vaccinia, NYVAC y variaciones de NYVAC se usan como vector (véanse las patentes de EE. UU. n.° 7.255.862; PCT WO 95/30018; patentes de EE. UU. Nos. 5.364.773 y 5.494.807).
[0153] En un caso, las partículas virales recombinantes de la vacuna o la composición inmunogénica se administran a pacientes que las necesitan. Las dosis de neoantígeno expresado pueden oscilar entre unos pocos y unos pocos cientos de microgramos, por ejemplo, de 5 a 500 |jg. La vacuna o composición inmunogénica se puede administrar en cualquier cantidad adecuada para lograr la expresión a estos niveles de dosificación. Las partículas virales pueden administrarse a un paciente que lo necesite o transfectarse en células en una cantidad de aproximadamente al menos 10 35 pfu; por lo tanto, las partículas virales se administran preferiblemente a un paciente que las necesita o se infectan o transfectan en células en al menos alrededor de 104 ufp a alrededor de 106 ufp; sin embargo, a un paciente que lo necesite se le puede administrar al menos alrededor de 108 ufp de manera que una cantidad más preferida para la administración puede ser al menos de 107 ufp a 109 ufp. Las dosis de NYVAC son aplicables a ALVAC, MVA, MVA-BN y viruela aviar, como la viruela del canario y la viruela aviar.
Adyuvante de vacuna o composición inmunogénica
[0154] Las composiciones vacunales o inmunogénicas efectivas incluyen ventajosamente un adyuvante fuerte para iniciar una respuesta inmune. Como se describe en este documento, poli-ICLC, un agonista de TLR3 y los dominios de ARN helicasa de MDA5 y RIG3, ha mostrado varias propiedades deseables para una vacuna o adyuvante de composición inmunogénica. Estas propiedades incluyen la inducción de la activación local y sistémica de las células inmunitarias in vivo, la producción de quimiocinas y citocinas estimulantes y la estimulación de la presentación de antígenos por parte de las DC. Además, poli-ICLC puede inducir respuestas duraderas de CD4+ y CD8+ en humanos. Es importante destacar que se observaron sorprendentes similitudes en la regulación positiva de las vías transcripcionales y de transducción de señales en sujetos vacunados con poli-ICLC y en voluntarios que habían recibido la vacuna contra la fiebre amarilla altamente eficaz y con capacidad de replicación. Además, > El 90 % de las pacientes con carcinoma de ovario inmunizadas con poli-ICLC en combinación con una vacuna de péptido NY-ESO-1 (además de Montanide) mostraron inducción de células T CD4+ y CD8+, así como respuestas de anticuerpos al péptido en una fase 1 reciente estudio. Al mismo tiempo, el poli-ICLC se ha probado exhaustivamente en más de 25 ensayos clínicos hasta la fecha y mostró un perfil de toxicidad relativamente benigno. Además de un inmunógeno potente y específico, los péptidos de neoantígeno pueden combinarse con un adyuvante (por ejemplo, poli-ICLC) u otro agente antineoplásico. Sin estar ligado a la teoría, se espera que estos neoantígenos pasen por alto la tolerancia tímica central (permitiendo así una respuesta de células T antitumorales más fuerte), mientras reducen el potencial de autoinmunidad (por ejemplo, al evitar la selección de autoantígenos normales). Una respuesta inmunitaria eficaz incluye ventajosamente un adyuvante fuerte para activar el sistema inmunitario (Speiser y Romero, Vacunas definidas molecularmente para inmunoterapia contra el cáncer y Seminarios de inmunidad de células T protectoras en Immunol 22:144 (2010)). Por ejemplo, los receptores tipo Toll (TLR) han surgido como poderosos sensores de "señales de peligro" de patógenos microbianos y virales, que inducen de manera efectiva al sistema inmunitario innato y, a su vez, al sistema inmunitario adaptativo (Bhardwaj y Gnjatic, TLR AGONISTS: Are They ¿Buenos adyuvantes?, Cancer J.
16:382-391 (2010)). Entre los agonistas de TLR, el poli-ICLC (un imitador sintético de ARN de doble cadena) es uno de los activadores más potentes de las células dendríticas derivadas de mieloides. En un estudio de voluntarios humanos, Se ha demostrado que poli-ICLC es seguro e induce un perfil de expresión génica en células de sangre periférica comparable al inducido por una de las vacunas virales atenuadas vivas más potentes, la vacuna contra la fiebre amarilla YF-17D (Caskey et al, Synthetic double- el ARN de cadena induce respuestas inmunitarias innatas similares a una vacuna viral viva en humanos J Exp Med 208:2357 (2011)). En una realización preferida Hiltonol® , se utiliza como adyuvante una preparación GMP de poli-ICLC preparada por Oncovir, Inc. En otras realizaciones, se prevén otros adyuvantes descritos en el presente documento. Por ejemplo, aceite en agua, agua en aceite o W/O/W multifásica; véase, por ejemplo, US 7.608.279 y Aucouturier et al, Vaccine 19 (2001), 2666-2672, y documentos citados allí.
Indicaciones
[0155] Los ejemplos de cánceres y afecciones cancerosas que pueden tratarse con la composición inmunogénica o la vacuna de este documento incluyen, pero no se limitan a, un paciente que lo necesite y que haya sido diagnosticado con cáncer o con riesgo de desarrollar cáncer. El sujeto puede tener un tumor sólido como el de mama, ovario, próstata, pulmón, riñón, gástrico, colon, testicular, cabeza y cuello, páncreas, cerebro, melanoma y otros tumores de órganos tisulares y tumores hematológicos, como linfomas y leucemias. , incluida la leucemia mielógena aguda, la leucemia mielógena crónica, la leucemia linfocítica crónica, la leucemia linfocítica de células T y los linfomas de células B, tumores del cerebro y del sistema nervioso central (por ejemplo, tumores de las meninges, el cerebro, la médula espinal, los nervios craneales y otras partes del SNC, como glioblastomas o blastomas del bulbo raquídeo); cáncer de cabeza y/o cuello, tumores de mama, tumores del sistema circulatorio (por ejemplo, corazón, mediastino y pleura y otros órganos intratorácicos, tumores vasculares y tejido vascular asociado a tumores); tumores de la sangre y del sistema linfático (por ejemplo, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma de Burkitt, linfomas relacionados con el SIDA, enfermedades inmunoproliferativas malignas, mieloma múltiple y neoplasias malignas de células plasmáticas, leucemia linfoide, leucemia mieloide, leucemia linfocítica aguda o crónica) leucemia, leucemia monocítica, otras leucemias de tipo celular específico, leucemia de tipo celular no especificado, neoplasias malignas no especificadas de tejidos linfoides, hematopoyéticos y relacionados, como linfoma difuso de células grandes, linfoma de células T o linfoma cutáneo de células T); tumores del sistema excretor (por ejemplo, riñón, pelvis renal, uréter, vejiga, y otros órganos urinarios); tumores del tracto gastrointestinal (por ejemplo, esófago, estómago, intestino delgado, colon, colorrectal, unión rectosigmoidea, recto, ano y canal anal); tumores que afectan el hígado y los conductos biliares intrahepáticos, la vesícula biliar y otras partes del tracto biliar, el páncreas y otros órganos digestivos; tumores de la cavidad oral (por ejemplo, labio, lengua, encía, piso de la boca, paladar, glándula parótida, glándulas salivales, amígdala, orofaringe, nasofaringe, seno puriforme, hipofaringe y otros sitios de la cavidad oral); tumores del sistema reproductivo (por ejemplo, vulva, vagina, cuello uterino, útero, ovario y otros sitios asociados con los órganos genitales femeninos, placenta, pene, próstata, testículos y otros sitios asociados con los órganos genitales masculinos); Tumores de las vías respiratorias (por ejemplo, cavidad nasal, oído medio, senos accesorios, laringe, tráquea, bronquios y pulmón, como el cáncer de pulmón de células pequeñas y el cáncer de pulmón de células no pequeñas); tumores del sistema esquelético (por ejemplo, hueso y cartílago articular de las extremidades, cartílago óseo articular y otros sitios); tumores de la piel (por ejemplo, melanoma maligno de la piel, cáncer de piel no melanoma, carcinoma de células basales de la piel, carcinoma de células escamosas de la piel, mesotelioma, sarcoma de Kaposi); y tumores que afectan a otros tejidos, incluidos los nervios periféricos y el sistema nervioso autónomo, tejido conjuntivo y blando, retroperitoneo y peritoneo, ojo, tiroides, glándula suprarrenal y otras glándulas endocrinas y estructuras relacionadas, neoplasias malignas secundarias y no especificadas de ganglios linfáticos, neoplasias malignas secundarias de sistemas respiratorio y digestivo y neoplasia maligna secundaria de otros sitios.
[0156] De especial interés es el tratamiento del linfoma no Hodgkin (NHL), el carcinoma de células renales de células claras (ccRCC), el melanoma metastásico, el sarcoma, la leucemia o un cáncer de vejiga, colon, cerebro, mama, cabeza y cuello, endometrio, pulmón, ovario, páncreas o próstata. En ciertas realizaciones, el melanoma es un melanoma de alto riesgo.
[0157] Los cánceres que pueden tratarse usando esta composición inmunogénica o vacuna pueden incluir, pero no se limitan a, casos que son refractarios al tratamiento con otros quimioterapéuticos. El término "refractario", como se usa en el presente documento, se refiere a un cáncer (y/o metástasis del mismo), que muestra una respuesta antiproliferativa nula o solo débil (por ejemplo, ninguna o solo una débil inhibición del crecimiento tumoral) después del tratamiento con otro agente quimioterapéutico. Estos son cánceres que no pueden tratarse satisfactoriamente con otros quimioterapéuticos. Los cánceres refractarios abarcan no solo (i) cánceres en los que uno o más quimioterapéuticos ya han fallado durante el tratamiento de un paciente, sino también (ii) cánceres que pueden demostrar que son refractarios por otros medios, por ejemplo, biopsia y cultivo en presencia de quimioterápicos.
[0158] La composición inmunogénica o vacuna descrita en el presente documento también es aplicable al tratamiento de pacientes que lo necesitan y que no han sido tratados previamente.
[0159] La composición inmunogénica o vacuna descrita en el presente documento también es aplicable cuando el sujeto no tiene una neoplasia detectable pero tiene un alto riesgo de recurrencia de la enfermedad.
[0160] También es de especial interés el tratamiento de pacientes que lo necesitan que se han sometido a un trasplante autólogo de células madre hematopoyéticas (AHSCT), y en particular pacientes que muestran enfermedad residual después de someterse a AHSCT. El entorno posterior al AHSCT se caracteriza por un bajo volumen de enfermedad residual, la infusión de células inmunes a una situación de expansión homeostática y la ausencia de cualquier terapia estándar para retrasar la recaída. Estas características proporcionan una oportunidad única para usar la vacuna neoplásica o la composición inmunogénica descrita para retrasar la recaída de la enfermedad.
Composiciones Farmacéuticas/Procedimientos de suministro
[0161] La presente divulgación también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad eficaz de uno o más compuestos según la presente divulgación (incluyendo una de sus sales farmacéuticamente aceptable), opcionalmente en combinación con un vehículo, excipiente o aditivo farmacéuticamente aceptable.
[0162] Aunque los péptidos neoantigénicos específicos de tumores se pueden administrar como el único agente farmacéutico activo, también se pueden usar en combinación con uno o más agentes y/o adyuvantes. Cuando se administran como una combinación, los agentes terapéuticos se pueden formular como composiciones separadas que se administran al mismo tiempo o en momentos diferentes, o los agentes terapéuticos se pueden administrar como una sola composición.
[0163] Las composiciones se pueden administrar una vez al día, dos veces al día, una vez cada dos días, una vez cada tres días, una vez cada cuatro días, una vez cada cinco días, una vez cada seis días, una vez cada siete días, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez cada dos meses, una vez cada seis meses o una vez al año. El intervalo de dosificación se puede ajustar según las necesidades de cada paciente. Para intervalos de administración más prolongados, se pueden usar formulaciones de liberación prolongada o depósito.
[0164] Las composiciones de la presente invención se pueden usar para tratar enfermedades y estados patológicos que son agudos y también se pueden usar para el tratamiento de estados crónicos. En particular, las composiciones de la presente invención se usan en procedimientos para tratar o prevenir una neoplasia. En ciertos casos, los compuestos de la divulgación se administran durante períodos de tiempo que superan las dos semanas, tres semanas, un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses, un año, dos años, tres años, cuatro años. , o cinco años, diez años o quince años; o por ejemplo, cualquier intervalo de período de tiempo en días, meses o años en el que el extremo inferior del intervalo es cualquier período de tiempo entre 14 días y 15 años y el extremo superior del intervalo es entre 15 días y 20 años (por ejemplo, 4 semanas y 15 años, 6 meses y 20 años). En algunos casos, puede ser ventajoso que los compuestos de la descripción se administren durante el resto de la vida del paciente. En realizaciones preferidas, se monitoriza al paciente para controlar la progresión de la enfermedad o trastorno, y la dosis se ajusta en consecuencia. En realizaciones preferidas, el tratamiento según la presente invención es efectivo durante al menos dos semanas, tres semanas, un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses, un año, dos años, tres años, cuatro años, o cinco años, diez años, quince años, veinte años, o por el resto de la vida del sujeto.
[0165] Los péptidos neoantigénicos específicos de tumores pueden administrarse por inyección, por vía oral, parenteral, por pulverización de inhalación, por vía rectal, vaginal o tópica en formulaciones de unidades de dosificación que contienen portadores, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables convencionales. El término parenteral como se usa aquí incluye, en un ganglio o ganglios linfáticos, subcutáneo, intravenoso, intramuscular, intrastemal, técnicas de infusión, intraperitonealmente, ojo u ocular, intravítreo, intrabucal, transdérmico, intranasal, en el cerebro, incluyendo intracraneal e intradural, en las articulaciones, incluyendo tobillos, rodillas, caderas, hombros, codos, muñecas, directamente en tumores y similares, y en forma de supositorio.
[0166] La resección quirúrgica usa cirugía para extirpar tejido anormal en cáncer, tal como tumores mediastínicos, neurogénicos o de células germinales, o timoma. En ciertas realizaciones, la administración de la vacuna o la composición inmunogénica contra la neoplasia se inicia 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más semanas después de la resección del tumor. Preferiblemente, la administración de la vacuna o la composición inmunogénica contra la neoplasia se inicia 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12 semanas después de la resección del tumor.
[0167] Los regímenes de sensibilización/refuerzo se refieren a las administraciones sucesivas de una vacuna o composiciones inmunogénicas o inmunológicas. En determinadas realizaciones, la administración de la vacuna o la composición inmunogénica contra la neoplasia se realiza en un régimen de dosificación de sensibilización/refuerzo, por ejemplo, la administración de la vacuna o la composición inmunogénica contra la neoplasia en las semanas 1, 2, 3 o 4 como dosis inicial y la administración de la vacuna o la composición inmunogénica contra la neoplasia es a los 2, 3 o 4 meses como refuerzo. En otra realización, se usan estrategias heterólogas de sensibilización y refuerzo para provocar una mayor respuesta de células T citotóxicas (véase Schneider et al., Induction of CD8+ T cells using heterologous prime-boost immunization Strategies, Immunological Reviews Volumen 170, Issue 1, páginas 29- 38, agosto de 1999). En otro caso, se utilizan neoantígenos que codifican ADN para sensibilizar, seguido de un refuerzo de proteína. En otro caso, se usa proteína para sensibilizar, seguido de un refuerzo con un virus que codifica el neoantígeno. En otro caso, se usa un virus que codifica el neoantígeno para sensibilizar y otro virus se usa para reforzar. En otro caso, la proteína se usa para sensibilizar y el ADN se usa para reforzar. En un caso preferido, se usa una vacuna de ADN o una composición inmunogénica para sensibilizar una respuesta de células T y se usa una vacuna viral recombinante o una composición inmunogénica para reforzar la respuesta. En otro caso preferido, una vacuna viral o composición inmunogénica se coadministra con una vacuna o composición inmunogénica de proteína o ADN para actuar como adyuvante para la vacuna o composición inmunogénica de proteína o ADN. A continuación, el paciente puede ser reforzado con la vacuna o la composición inmunogénica viral, proteína, o vacuna o la composición inmunogénica de ADN (véase Hutchings et al. Combination of protein and viral vaccines induces potent celular and humoral immune responses and enhanced protection from murine malaria challenge. Infect Immun. 2007. Dec; 75 (122): 5819-26. Epub 2007 (Oct. 1)
[0168] Las composiciones farmacéuticas se pueden procesar según procedimientos convencionales de farmacia para producir agentes medicinales para la administración a pacientes que las necesiten, incluidos humanos y otros mamíferos.
[0169] Las modificaciones de los péptidos neoantigénicos pueden afectar a la solubilidad, biodisponibilidad y velocidad de metabolismo de los péptidos, proporcionando así control sobre la administración de las especies activas. La solubilidad se puede evaluar preparando el péptido neoantigénico y ensayándolo según procedimientos conocidos bien dentro de la experiencia del médico de rutina en la técnica.
[0170] Se ha descubierto inesperadamente que una composición farmacéutica que comprende ácido succínico o una de sus sales farmacéuticamente aceptables (succinato) puede proporcionar una solubilidad mejorada para los péptidos neoantigénicos. De este modo, en un caso, la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende: al menos un péptido neoantigénico o una de sus sales farmacéuticamente aceptables; un modificador de pH (tal como una base, tal como una sal de dicarboxilato o tricarboxilato, por ejemplo, una sal farmacéuticamente aceptable de ácido succínico o ácido cítrico); y un portador farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones farmacéuticas se pueden preparar combinando una solución que comprende al menos un péptido neoantigénico con una base, tal como una sal de dicarboxilato o tricarboxilato, tal como una sal farmacéuticamente aceptable de ácido succínico o ácido cítrico (tal como succinato de sodio), o combinando una solución que comprende al menos un péptido neoantigénico con una solución que comprende una base, tal como una sal de dicarboxilato o tricarboxilato, tal como una sal farmacéuticamente aceptable sal de ácido succínico o ácido cítrico (incluyendo, por ejemplo, una solución tampón de succinato). En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica comprende succinato de sodio. En ciertos casos, el modificador de pH (tal como citrato o succinato) está presente en la composición a una concentración de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 10 mM y, en ciertos casos, a una concentración de aproximadamente 1,5 mM a aproximadamente 7,5 mM, o de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 6,0 mM, o de aproximadamente 3,75 a aproximadamente 5,0 mM. Según la presente invención, el modificador de pH es succinato o citrato a una concentración de 1 mM a 10 mM.
[0171] Según la presente invención, el portador farmacéuticamente aceptable comprende agua. En determinadas realizaciones, el portador farmacéuticamente aceptable comprende además dextrosa. Según la presente invención, el portador farmacéuticamente aceptable comprende además del 1 al 4% de dimetilsulfóxido. En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica comprende además un inmunomodulador o adyuvante. En ciertas realizaciones, el inmunomodulador o adyuvante se selecciona del grupo que consiste en poli-ICLC, 1018 ISS, sales de aluminio, Amplivax, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, Imiquimod , ImuFact IMP321, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, JuvImmune, LipoVac, MF59, monofosforil lípido A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197- MP-EC, ONTAK, PEPTEL, sistema vectorial, micropartículas PLGA, resiquimod, SRL172, virosomas y otras partículas similares a virus, YF-17D, VEGF trap, R848, beta-glucano, Pam3Cys y estímulo QS21 de Aquila. En ciertas realizaciones, el inmunomodulador o adyuvante comprende poli-ICLC.
[0172] Los derivados de xantenona, tales como, por ejemplo, Vadimezan o AsA404 (también conocido como ácido 5,6-dimetilaxantenona-4-acético (DMXAA)), también se pueden usar como adyuvantes según realizaciones de la presente invención. Alternativamente, dichos derivados también pueden administrarse en paralelo a la vacuna o composición inmunogénica de la presente invención, por ejemplo mediante administración sistémica o intratumoral, para estimular la inmunidad en el sitio del tumor. Sin estar ligado a la teoría, se cree que dichos derivados de xantenona actúan estimulando la producción de interferón (IFN) a través del receptor estimulador del gen IFN ISTING) (ver, por ejemplo, Conlon et al. (2013) Mouse, but not Human STING, Binds and Signals in Response to the Vascular Disrupting Agent 5,6-Dimethylxanthenone-4-Acetic Acid, Journal of Immunology, 190:5216-25 y Kim et al. (2013) Anticancer Flavonoids are Mouse-Selective STING Agonists, 8: 1396-1401).
[0173] La vacuna o composición inmunológica también puede incluir un compuesto adyuvante elegido entre los polímeros acrílicos o metacrílicos y los copolímeros de anhídrido maleico y un derivado de alquenilo. Es en particular un polímero de ácido acrílico o metacrílico reticulado con un polialquenil éter de un azúcar o polialcohol (carbómero), en particular reticulado con una alil sacarosa o con alilpentaeritritol. También puede ser un copolímero de anhídrido maleico y etileno reticulado, por ejemplo, con éter divinílico (véase la Patente de EE. UU. No. 6,713,068).
[0174] En ciertas realizaciones, el modificador de pH puede estabilizar el adyuvante o inmunomodulador, tal como se describe en este documento.
[0175] En ciertos casos, una composición farmacéutica comprende: de uno a cinco péptidos, dimetilsulfóxido (DMSO), dextrosa (o trehalosa o sacarosa), agua, succinato, poli I:poli C, poli-L-lisina, carboximetilcelulosa y cloruro. En ciertas realizaciones, cada uno de los cinco péptidos está presente en una concentración de 300 pg/ml. En ciertos casos, la composición farmacéutica comprende < 3% de DMSO en volumen. En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica comprende 3,6 -3,7 % de dextrosa en agua. En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica comprende 3,6 - 3,7 mM de succinato (por ejemplo, como succinato disódico) o una de sus sales. En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica comprende 0,5 mg/ml de poli I:poli C. En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica comprende 0,375 mg/ml de poli-L-lisina. En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica comprende 1,25 mg/ml de carboximetilcelulosa sódica. En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica comprende cloruro de sodio al 0,225 %.
[0176] Las composiciones farmacéuticas comprenden los péptidos neoantigénicos específicos de tumores descritos en el presente documento en una cantidad terapéuticamente eficaz para tratar enfermedades y afecciones (por ejemplo, una neoplasia/tumor), que se han descrito en el presente documento, opcionalmente en combinación con un aditivo, un portador y /o excipiente farmacéuticamente aceptable. Un experto en la técnica a partir de esta divulgación y el conocimiento en la técnica reconocerá que una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más compuestos según la presente invención puede variar con la afección a tratar, su gravedad, el régimen de tratamiento a ser empleado, la farmacocinética del agente utilizado, así como el paciente (animal o humano) tratado.
[0177] Para preparar las composiciones farmacéuticas según la presente invención, preferiblemente se mezcla íntimamente una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más de los compuestos según la presente divulgación con un portador farmacéuticamente aceptable según las técnicas convencionales de preparación de compuestos farmacéuticos para producir una dosis. Un portador puede tomar una amplia variedad de formas dependiendo de la forma de preparación deseada para la administración, por ejemplo, ocular, oral, tópica o parenteral, incluyendo geles, cremas, ungüentos, lociones y preparaciones implantables de liberación prolongada, entre muchas otras. En la preparación de composiciones farmacéuticas en forma de dosificación oral, se puede utilizar cualquiera de los medios farmacéuticos habituales. Por lo tanto, para preparaciones orales líquidas, tales como suspensiones, elixires y soluciones, se pueden utilizar portadores y aditivos adecuados que incluyen agua, glicoles, aceites, alcoholes, agentes aromatizantes, conservantes, agentes colorantes y similares. Para preparaciones orales sólidas, tales como polvos, comprimidos, cápsulas y para preparaciones sólidas, tales como supositorios, se pueden usar portadores y aditivos adecuados, incluidos almidones, portadores de azúcares, tales como dextrosa, manitol, lactosa y portadores relacionados, diluyentes, agentes de granulación, lubricantes, aglutinantes, agentes disgregantes y similares. Si se desea, los comprimidos o cápsulas pueden tener un recubrimiento entérico o una liberación sostenida mediante técnicas estándar.
[0178] El compuesto activo se incluye en el portador o diluyente farmacéuticamente aceptable en una cantidad suficiente para administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz para la indicación deseada, sin causar efectos tóxicos graves en el paciente tratado.
[0179] Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un portador comestible. Pueden estar encerrados en cápsulas de gelatina o comprimirse en comprimidos. Para fines de administración terapéutica oral, el compuesto activo o su derivado profármaco se puede incorporar con excipientes y usarse en forma de comprimidos, trociscos o cápsulas. Los agentes aglutinantes farmacéuticamente compatibles y/o los materiales adyuvantes pueden incluirse como parte de la composición.
[0180] Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante, tal como celulosa microcristalina, goma tragacanto o gelatina; un excipiente, tal como almidón o lactosa, un agente dispersante, tal como ácido algínico o almidón de maíz; un lubricante, tal como estearato de magnesio; un deslizante, tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante, tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante, tal como menta, salicilato de metilo o aroma de naranja. Cuando la forma de unidad de dosificación es una cápsula, puede contener, además del material descrito en el presente documento, un portador líquido, tal como un aceite graso. Además, las formas de las unidades de dosificación pueden contener varios otros materiales que modifican la forma física de la unidad de dosificación, por ejemplo, recubrimientos de azúcar, goma laca o agentes entéricos.
[0181] Las formulaciones de la presente invención adecuadas para la administración oral se pueden presentar como unidades discretas, tales como cápsulas, “cachets” o comprimidos, conteniendo cada una una cantidad predeterminada del ingrediente activo; como polvo o gránulos; como solución o suspensión en un líquido acuoso o líquido no acuoso; o como una emulsión líquida de aceite en agua o una emulsión de agua en aceite y como un bolo, etc.
[0182] Una comprimido se puede fabricar por compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes auiliares. Las comprimidos se pueden preparar comprimiendo en una máquina adecuada el ingrediente activo en una forma de flujo libre, tal como un polvo o gránulos, opcionalmente mezclado con un aglutinante, lubricante, diluyente inerte, conservante, tensioactivo o agente dispersante. Los comprimidos moldeados pueden fabricarse moldeando en una máquina adecuada una mezcla del compuesto en polvo humedecido con un diluyente líquido inerte. Los comprimidos opcionalmente se pueden recubrir o ranurar y se pueden formular para proporcionar una liberación lenta o controlada del ingrediente activo en los mismos.
[0183] Los procedimientos para formular tales composiciones de liberación lenta o controlada de ingredientes farmacéuticamente activos son conocidos en la técnica y se describen en varias patentes de Estados Unidos concedidas, algunas de las cuales incluyen, pero no se limitan a, las patentes de Estados Unidos números 3.870.790; 4.226.859; 4.369.172; 4.842.866 y 5.705.190. Los recubrimientos se pueden usar para la administración de compuestos al intestino (véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos números 6.638.534, 5.541.171, 5.217.720 y 6.569.457 y las referencias citadas en ellas).
[0184] El compuesto activo o su sal farmacéuticamente aceptable también se puede administrar como un componente de un elixir, suspensión, jarabe, oblea, goma de mascar o similar. Un jarabe puede contener, además de los compuestos activos, sacarosa o fructosa como agente edulcorante y ciertos conservantes, tintes y colorantes y sabores.
[0185] Las soluciones o suspensiones utilizadas para aplicación ocular, parenteral, intradérmica, subcutánea o tópica pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril, tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos, tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes, tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes, tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones, tales como acetatos, citratos o fosfatos; y agentes para el ajuste de la tonicidad, tales como cloruro de sodio o dextrosa.
[0186] En determinados casos, el portador farmacéuticamente aceptable es un disolvente acuoso, es decir, un disolvente que comprende agua, opcionalmente con codisolventes adicionales. Ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables incluyen agua, soluciones tampón en agua (tal como solución salina tamponada con fosfato (PBS) y dextrosa al 5 % en agua (D5W) o trehalosa al 10 % o sacarosa al 10 %. En ciertos casos, el disolvente acuoso comprende además sulfóxido de dimetilo ( DMSO), por ejemplo, en una cantidad de aproximadamente 1-4 % o 1-3 % En ciertas realizaciones, el portador farmacéuticamente aceptable es isotónico (es decir, tiene sustancialmente la misma presión osmótica que un fluido corporal, tal como el plasma).
[0187] En una realización, los compuestos activos se preparan con portadores que protegen el compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden utilizar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, ácido poliláctico y ácido poliláctico-coglicólico (PLGA). Los procedimientos para la preparación de tales formulaciones están dentro del ámbito del experto en la materia en vista de esta divulgación y el conocimiento en la técnica.
[0188] Un experto en la técnica a partir de esta divulgación y el conocimiento en la técnica reconoce que, además de los comprimidos, se pueden formular otras formas de dosificación para proporcionar una liberación lenta o controlada del ingrediente activo. Dichas formas de dosificación incluyen, pero no se limitan a, cápsulas, granulados y cápsulas de gel.
[0189] Las suspensiones liposomales también pueden ser portadores farmacéuticamente aceptables. Estos pueden prepararse según procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, las formulaciones liposomales se pueden preparar disolviendouno o más lípidos apropiados en un disolvente inorgánico que, a continuación, se evapora, dejando una película delgada de lípido seco en la superficie del recipiente. A continuación, se introduce en el recipiente una solución acuosa del compuesto activo. A continuación, el recipiente se agita a mano para liberar el material lipídico de los lados del recipiente y dispersar los agregados de lípidos, formando así la suspensión liposomal. En este aspecto de la presente invención también se pueden usar otros procedimientos de preparación bien conocidos por los expertos en la materia.
[0190] Las formulaciones se pueden presentar convenientemente en forma de dosificación unitaria y se pueden preparar mediante técnicas farmacéuticas convencionales. Dichas técnicas incluyen la etapa de asociar el ingrediente activo y el prtador o portadores o excipiente o excipientes farmacéuticos. En general, las formulaciones se preparan asociando uniforme e íntimamente el ingrediente activo con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos, y a continuación, si es necesario, dando forma al producto.
[0191] Las formulaciones y composiciones adecuadas para la administración tópica en la boca incluyen pastillas que comprenden los ingredientes en una base aromatizada, normalmente sacarosa y acacia o tragacanto; pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia; y enjuagues bucales que comprenden el ingrediente a administrar en un portador líquido adecuado.
[0192] Las formulaciones adecuadas para la administración tópica a la piel se pueden presentar como ungüentos, cremas, geles y pastas que comprenden el ingrediente que se va a administrar en un portador farmacéuticamente aceptable. Un sistema de administración tópica preferido es un parche transdérmico que contiene el ingrediente a administrar.
[0193] Las formulaciones para administración rectal se pueden presentar como un supositorio con una base adecuada que comprende, por ejemplo, manteca de cacao o un salicilato.
[0194] Las formulaciones adecuadas para la administración nasal, en las que el portador es un sólido, incluyen un polvo grueso que tiene un tamaño de partícula, por ejemplo, en el intervalo de 20 a 500 micras que se administra de la manera en que se administra el rapé, es decir, por inhalación rápida a través de las fosas nasales desde un recipiente del polvo mantenido cerca de la nariz. Las formulaciones adecuadas, en las que el portador es un líquido, para la administración, como por ejemplo, un aerosol nasal o gotas nasales, incluyen soluciones acuosas u oleosas del ingrediente activo.
[0195] Las formulaciones adecuadas para la administración vaginal pueden presentarse como pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones en aerosol que contienen, además del ingrediente activo, los vehículos que se sabe que son apropiados en la técnica.
[0196] La preparación parenteral se puede encerrar en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiples fabricados de vidrio o plástico. Si se administra por vía intravenosa, los portadores preferidos incluyen, por ejemplo, solución salina fisiológica o solución salina tamponada con fosfato (PBS).
[0197] Para formulaciones parenterales, el portador generalmente comprende agua estéril o solución acuosa de cloruro de sodio, aunque se pueden incluir otros ingredientes que incluyen aquellos que ayudan a la dispersión. Por supuesto, cuando se va a usar y mantener agua estéril, las composiciones y los portadores también se esterilizan. También se pueden preparar suspensiones inyectables, en cuyo caso se pueden emplear portadores líquidos apropiados, agentes de suspensión y similares.
[0198] Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones de inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las formulaciones se pueden presentar en envases de dosis unitaria o multidosis, por ejemplo, ampollas y viales sellados, y se pueden almacenar en condiciones de secado por congelación (liofilizado) que solo requieren la adición del portador líquido estéril, por ejemplo, agua para inyecciones, inmediatamente antes de su uso. Las soluciones y suspensiones para inyección extemporánea pueden prepararse a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles del tipo descrito anteriormente.
[0199] La administración del compuesto activo puede variar desde administración continua (goteo intravenoso) hasta varias administraciones orales por día (por ejemplo, Q.I.D.) y puede incluir administración oral, tópica, oftálmica, parenteral, intramuscular, intravenosa, subcutánea, transdérmica (que puede incluir un agente potenciador de la penetración), bucal y en supositorios, entre otras vías de administración, incluida a través del ojo o la vía ocular.
[0200] La vacuna o la composición inmunogénica contra la neoplasia se puede administrar por inyección, por vía oral, por vía parenteral, por pulverización de inhalación, por vía rectal, vaginal o tópica en formulaciones de unidades de dosificación que contienen portadores, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables convencionales. El término parenteral, tal como se usa en el presente documento, incluye, en un ganglio o ganglios linfáticos, subcutáneo, intravenoso, intramuscular, intraesternal, técnicas de infusión, intraperitoneal, ocular u ocular, intravítreo, intrabucal, transdérmico, intranasal, en el cerebro, incluyendo intracraneal e intradural, en las articulaciones, incluyendo tobillos, rodillas, caderas, hombros, codos, muñecas, directamente en tumores y similares, y en forma de supositorio.
[0201] Se pueden usar diversas técnicas para proporcionar las composiciones objeto en el sitio de interés, tales como inyección, uso de catéteres, trocares, proyectiles, gel plurónico, stents, polímeros de liberación sostenida de fármacos u otro dispositivo que proporcione acceso interno. Cuando un órgano o tejido es accesible debido a la extracción del paciente, dicho órgano o tejido puede bañarse en un medio que contiene las composiciones objeto, las composiciones objeto pueden pintarse sobre el órgano o pueden aplicarse de cualquier manera conveniente.
[0202] Los péptidos neoantigénicos específicos de tumores pueden administrarse a través de un dispositivo adecuado para la liberación controlada y sostenida de una composición eficaz para obtener un efecto fisiológico o farmacológico local o sistémico deseado. El procedimiento incluye colocar el sistema de administración de fármacos de liberación sostenida en un área en la que se desea la liberación del agente y se permite que el agente pase a través del dispositivo al área de tratamiento deseada.
[0203] Los péptidos neoantigénicos específicos de tumores se pueden utilizar en combinación con al menos otro agente terapéutico conocido, o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho agente. Los ejemplos de agentes terapéuticos conocidos que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, corticosteroides (por ejemplo, cortisona, prednisona, dexametasona), fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) (por ejemplo, ibuprofeno, celecoxib, aspirina, indometicina, naproxeno), agentes alquilantes, tales como busulfán, cisplatino, mitomicina C y carboplatino; agentes antimitóticos, tales como colchicina, vinblastina, paclitaxel y docetaxel; inhibidores de topo I, tales como camptotecina y topotecán; inhibidores de topo II, tales como doxorrubicina y etopósido; y/o antimetabolitos de ARN/ADN, tales como 5-azacitidina, 5-fluorouracilo y metotrexato; antimetabolitos de ADN, tales como 5-fluoro-2'-desoxi-uridina, ara-C, hidroxiurea y tioguanina; anticuerpos, tales como HERCEPTIN y RITUXAN.
[0204] Debe entenderse que además de los ingredientes particularmente mencionados en el presente documento, las formulaciones de la presente invención pueden incluir otros agentes convencionales en la técnica teniendo en cuenta el tipo de formulación en cuestión, por ejemplo, los adecuados para administración oral pueden incluir agentes aromatizantes.
[0205] Las formas de sal farmacéuticamente aceptables pueden ser la forma química preferida de los compuestos según la presente invención para su inclusión en las composiciones farmacéuticas según la presente invención.
[0206] Los presentes compuestos o sus derivados, incluidas las formas de profármacos de estos agentes, se pueden proporcionar en forma de sales farmacéuticamente aceptables. Tal como se usa en el presente documento, el término sales o complejos farmacéuticamente aceptables se refiere a sales o complejos apropiados de los compuestos activos según la presente divulgación que retienen la actividad biológica deseada del compuesto original y exhiben efectos toxicológicos limitados para las células normales. Ejemplos no limitantes de tales sales son (a) sales de adición de ácido formadas con ácidos inorgánicos (por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico y similares), y sales formadas con ácidos orgánicos, tales como ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido málico, ácido ascórbico, ácido benzoico, ácido tánico, ácido pamoico, ácido algínico y ácido poliglutámico, entre otros; (b) sales de adición de base formadas con cationes metálicos, tales como zinc, calcio, sodio, potasio y similares, entre muchos otros.
[0207] Los compuestos de este documento están disponibles comercialmente o se pueden sintetizar. Como puede entender un experto en la materia, los procedimientos adicionales para sintetizar los compuestos de las fórmulas de este documento son evidentes para los expertos en la materia. Además, los diversos pasos sintéticos se pueden realizar en una secuencia u orden alternativo para dar los compuestos deseados. Las transformaciones químicas sintéticas y las metodologías de grupos protectores (protección y desprotección) útiles para sintetizar los compuestos descritos en el presente documento se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, las descritas en R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, 2nd. Ed., Wiley-VCH Publishers (1999); TW Greene y PGM Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3er. Ed., John Wiley and Sons (1999); L. Fieser y M. Fieser, Fieser y Fieser' s Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1999); y L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995), y ediciones posteriores de las mismas.
[0208] Los agentes adicionales que pueden incluirse con los péptidos neoantigénicos específicos de tumores de esta divulgación pueden contener uno o más centros asimétricos y, por lo tanto, se presentan como racematos y mezclas racémicas, enantiómeros individuales, diastereómeros individuales y mezclas de diastereoisómeros. Todas estas formas isoméricas de estos compuestos se incluyen expresamente en la presente divulgación. Los compuestos de esta divulgación también se pueden representar en múltiples formas tautoméricas, en tales casos, la divulgación incluye expresamente todas las formas tautoméricas de los compuestos descritos en este documento (por ejemplo, la alquilación de un sistema de anillo puede dar como resultado la alquilación en múltiples sitios, la presente invención incluye expresamente todos estos productos de reacción). Todas las formas isoméricas de dichos compuestos se incluyen expresamente en la presente divulgación. Todas las formas cristalinas de los compuestos descritos en este documento se incluyen expresamente en la presente divulgación.
Dosis
[0209] Cuando los agentes descritos en el presente documento se administran como productos farmacéuticos a seres humanos o animales, pueden administrarse per se o como una composición farmacéutica que contiene un ingrediente activo en combinación con un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.
[0210] Los niveles de dosificación reales y el curso temporal de la administración de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden variar para obtener una cantidad del ingrediente activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente en particular, la composición, y modo de administración, sin ser tóxico para el paciente. Generalmente, los agentes o las composiciones farmacéuticas de la divulgación 1 se administran en una cantidad suficiente para reducir o eliminar los síntomas asociados con la infección viral y/o la enfermedad autoinmune.
[0211] Una dosis preferida de un agente es la máxima que un paciente puede tolerar y no desarrollar efectos secundarios graves o inaceptables. Los intervalos de dosis de ejemplo incluyen de 0,01 mg a 250 mg por día, de 0,01 mg a 100 mg por día, de 1 mg a 100 mg por día, de 10 mg a 100 mg por día, de 1 mg a 10 mg por día y de 0,01 mg a 10 mg por día. Una dosis preferida de un agente es la máxima que un paciente puede tolerar y no desarrollar efectos secundarios graves o inaceptables. En realizaciones, el agente se administra a una concentración de aproximadamente 10 microgramos a aproximadamente 100 mg por kilogramo de peso corporal por día, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg/kg por día, o de aproximadamente 1,0 mg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal por día.
[0212] En realizaciones, la composición farmacéutica comprende un agente en una cantidad que oscila entre 1 y 10 mg, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 mg.
[0213] En realizaciones, la dosificación terapéuticamente eficaz produce una concentración sérica de un agente de aproximadamente 0,1 ng/ml a aproximadamente 50-100 mg/ml. Las composiciones farmacéuticas 5 normalmente deberían proporcionar una dosificación de aproximadamente 0,001 mg a aproximadamente 2000 mg de compuesto por kilogramo de peso corporal por día. Por ejemplo, las dosis para la administración sistémica a un paciente humano pueden variar de 1 a 10 mg/kg, de 20 a 80 mg/kg, de 5 a 50 mg/kg, de 75 a 150 mg/kg, de 100 a 500 mg/kg, de 250 a 750 mg/kg, de 500 a 1000 mg/kg, 1-10 mg/kg, 5-50 mg/kg, 25-75 mg/kg, 50-100 mg/kg, 100-250 mg/kg, 50-100 mg/kg, 250-500 mg/ kg, 500-750 mg/kg, 750-1000 mg/kg, 1000-1500 mg/kg, 10 1500-2000 mg/kg, 5 mg/kg, 20 mg/kg, 50 mg/kg, 100 mg/kg , 500 mg/kg, 1000 mg/kg, 1500 mg/kg o 2000 mg/kg. Las formas unitarias de dosificación farmacéutica se preparan para proporcionar de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 5000 mg, por ejemplo de aproximadamente 100 a aproximadamente 2500 mg del compuesto o una combinación de ingredientes esenciales por forma de dosificación unitaria.
[0214] En las realizaciones, se administra a un sujeto de aproximadamente 50 nM a aproximadamente 1 pM de un agente. En realizaciones relacionadas, se administra aproximadamente 50-100 nM, 50-250 nM, 100-500 nM, 250-500 nM, 250-750 nM, 500-750 nM, 500 nM a 1 pM o 750 nM a 1 pM de un agente a un sujeto.
[0215] La determinación de una cantidad efectiva está dentro de la capacidad de los expertos en la técnica, especialmente a la luz de la divulgación detallada proporcionada en este documento. En general, una cantidad eficaz o efectiva de un agente se determina administrando primero una dosis baja del agente o agentes y, a continuación, aumentando progresivamente la dosis o las dosis administradas hasta observar el efecto deseado (por ejemplo, reducir o eliminar los síntomas asociados con la infección viral o la enfermedad) en el sujeto tratado, con efectos secundarios tóxicos mínimos o aceptables. Los procedimientos aplicables para determinar una dosis y un programa de dosificación apropiados para la administración de una composición farmacéutica de la presente invención se describen, por ejemplo, en The Pharmacological Basis of Therapeutics de Goodman y Gilman, Goodman et al., eds., 11a edición, McGraw-Hill. 2005, y Remingotn: The Science and Practice of Pharmacy, 20a y 2 1 a edición, Gennaro y University of the Sciences in Philapdelphia, Eds., Lippencott Williams & Williams (2003 y 2005).
[0216] Las formulaciones de dosificación unitaria preferidas son aquellas que contienen una dosis o unidad diaria, subdosis diaria, tal como se describe en el presente documento, o una fracción apropiada de la misma, del ingrediente administrado.
[0217] El régimen de dosificación para tratar un trastorno o una enfermedad con los péptidos neoantigénicos específicos de tumores de esta divulgación y/o composiciones de esta invención se basa en una variedad de factores, que incluyen el tipo de enfermedad, la edad, el peso, el sexo, el estado médico del paciente, la gravedad de la afección, la vía de administración y el compuesto particular empleado. Por lo tanto, el régimen de dosificación puede variar ampliamente, pero se puede determinar de manera rutinaria usando procedimientos estándar.
[0218] Las cantidades y los regímenes de dosificación administrados a un sujeto pueden depender de varios factores, tales como el modo de administración, la naturaleza de la afección que se trata, el peso corporal del sujeto que se trata y el criterio del médico que prescribe; estando todos estos factores dentro del ámbito del experto en la materia de esta divulgación y el conocimiento en la técnica.
[0219] La cantidad de compuesto incluida en las formulaciones terapéuticamente activas según la presente invención es una cantidad eficaz para tratar la enfermedad o afección. En general, una cantidad terapéuticamente eficaz del presente compuesto preferido en forma de dosificación normalmente oscila entre algo menos de aproimadamente 0,025 mg/kg/día y aproximadamente 2,5 g/kg/día, preferiblemente de aproximadamente 0,1 mg/kg/día a aproximadamente 100 mg/kg/día del paciente o considerablemente más, dependiendo del compuesto utilizado, la afección o infección tratada y la vía de administración, aunque la presente invención puede contemplar excepciones a este intervalo de dosificación. En su forma más preferida, los compuestos según la presente descripción se administran en cantidades que oscilan entre aproximadamente 1 mg/kg/día y aproximadamente 100 mg/kg/día. La dosificación del compuesto puede depender de la afección que se esté tratando, el compuesto particular y otros factores clínicos, tales como el peso y el estado del paciente y la vía de administración del compuesto. Debe entenderse que la presente invención tiene aplicación tanto para uso humano como veterinario.
[0220] Para la administración oral a seres humanos, generalmente es suficiente una dosificación de entre aproximadamente 0,1 y 100 mg/kg/día, preferiblemente entre aproximadamente 1 y 100 mg/kg/día.
[0221] Cuando la administración del fármaco es sistémica en lugar de tópica, este intervalo de dosificación generalmente produce concentraciones efectivas en sangre del compuesto activo que oscilan entre menos de aproximadamente 0,04 y aproximadamente 400 microgramos/cc o más de sangre en el paciente. El compuesto se administra convenientemente en cualquier forma de dosificación unitaria adecuada, que incluye, pero no se limita a, una que contiene de 0,001 a 3000 mg, preferiblemente de 0,05 a 500 mg de ingrediente activo por forma de dosificación unitaria. Suele ser conveniente una dosis oral de 10 a 250 mg.
[0222] Según ciertas realizaciones de ejemplo, la vacuna o composición inmunogénica se administra a una dosis de aproximadamente 10 |jg-1 mg por péptido neoantigénico. Según ciertas realizaciones de ejemplo, la vacuna o composición inmunogénica se administra a un nivel de dosis semanal promedio de aproximadamente 10 jg-2000 jg por péptido neoantigénico.
[0223] La concentración de compuesto activo en la composición del fármaco dependerá de las velocidades de absorción, distribución, inactivación y excreción del fármaco, así como de otros factores conocidos por los expertos en la técnica. Cabe indicar que los valores de dosificación también variarán con la gravedad de la afección a aliviar. Debe entenderse además que para cualquier sujeto en particular, los regímenes de dosificación específicos deben ajustarse con el tiempo según la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los intervalos de concentración establecidos en este documento son solo a modo de ejemplo y no pretenden limitar el alcance o la práctica de la composición reivindicada. El principio activo puede administrarse de una sola vez, o se puede dividir en una serie de dosis más pequeñas para administrar en intervalos de tiempo variables.
[0224] La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que contienen al menos un neoantígeno específico de tumor descrito en este documento. En realizaciones, las composiciones farmacéuticas contienen un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable, que incluye cualquier agente farmacéutico que no induce por sí mismo la producción de una respuesta inmunitaria dañina para un sujeto que recibe la composición, y que puede administrarse sin toxicidad indebida. Tal como se usa en el presente documento, el término "farmacéuticamente aceptable" significa estar aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o estar incluido en la Farmacopea de EE. UU., la Farmacopea europea u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en mamíferos, y más particularmente en humanos. Estas composiciones pueden ser útiles para tratar y/o prevenir infecciones virales y/o enfermedades autoinmunes.
[0225] En Remington's Pharmaceutical Sciences (17a ed., Mack Publishing Company) y Remington: The Science and Practice of Pharmacy (21a ed., Lippincott Williams & Wilkins) se presenta un análisis exhaustivo de portadores, diluyentes y otros excipientes farmacéuticamente aceptables. La formulación de la composición farmacéutica debe adaptarse al modo de administración. En realizaciones, la composición farmacéutica es adecuada para la administración a seres humanos y puede ser estéril, sin partículas y/o no pirógena.
[0226] Los portadores, excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol, tampón acuoso isotónico estéril y combinaciones de los mismos.
[0227] Agentes humectantes, emulsionantes y lubricantes, tales como laurilsulfato de sodio y estearato de magnesio, así como agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de recubrimiento, agentes edulcorantes, aromatizantes y perfumantes, conservantes y antioxidantes también pueden estar presentes en las composiciones.
[0228] Los ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y similares; y (3) agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares.
[0229] En realizaciones , la composición farmacéutica se proporciona en forma sólida, tal como un polvo liofilizado adecuado para la reconstitución, una solución líquida, suspensión, emulsión, comprimido, píldora, cápsula, formulación de liberación sostenida o polvo.
[0230] En realizaciones, la composición farmacéutica se suministra en forma líquida, por ejemplo, en un recipiente sellado que indica la cantidad y concentración del ingrediente activo en la composición farmacéutica. En realizaciones relacionadas, la forma líquida de la composición farmacéutica se suministra en un recipiente sellado herméticamente.
[0231] Los procedimientos para formular las composiciones farmacéuticas de la presente invención son convencionales y bien conocidos en la técnica (ver Remington y Remington's). Un experto en la técnica puede formular fácilmente una composición farmacéutica que tenga las características deseadas (por ejemplo, vía de administración, bioseguridad y perfil de liberación).
[0232] Los procedimientos para preparar las composiciones farmacéuticas incluyen la etapa de asociar el ingrediente activo con un portador farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, uno o más ingredientes auxiliares. Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar asociando uniforme e íntimamente el ingrediente activo con portadores líquidos, o portadores sólidos finamente divididos, o ambos, y, a continuación, si es necesario, dar forma al producto. Se describe una metodología adicional para preparar las composiciones farmacéuticas, incluida la preparación de formas de dosificación multicapa, en Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems de Ansel (9a ed., Lippincott Williams & Wilkins).
[0233] Las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración oral pueden estar en forma de cápsulas, “cachets”, píldoras, comprimidos, pastillas (utilizando una base aromatizada, generalmente sacarosa y acacia o tragacanto), polvos, gránulos o como una solución o suspensión en un líquido acuoso o no acuoso, o como una emulsión líquida de aceite en agua o agua en aceite, o como un elixir o jarabe, o como pastillas (utilizando una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia) y/o enjuagues bucales y similares, conteniendo cada uno de los cuales una cantidad predeterminada de uno o más compuestos descritos en el presente documento, un derivado del mismo o una sal o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo como ingrediente o ingredientes activos. El ingrediente activo también se puede administrar como bolo, electuario o pasta.
[0234] En formas farmacéuticas sólidas para administración oral (por ejemplo, cápsulas, comprimidos, píldoras, grageas, polvos, gránulos y similares), el ingrediente activo se mezcla con uno o más portadores, excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables, tales como citrato de sodio o fosfato dicálcico y/o cualquiera de los siguientes: (1) cargas o extensores, tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y/o ácido silícico; (2) aglutinantes, tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y/o goma arábiga; (3) humectantes, tales como glicerol; (4) agentes disgregantes, tales como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos y carbonato de sodio; (5) agentes retardantes de la solución, tales como parafina; (6) aceleradores de absorción, tales como compuestos de amonio cuaternario; (7) agentes humectantes, tales como, por ejemplo, alcohol acetílico y monoestearato de glicerol; (8) absorbentes, tales como caolín y arcilla de bentonita; (9) lubricantes, tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, laurilsulfato de sodio y mezclas de los mismos; y (10) agentes colorantes. En el caso de cápsulas, comprimidos y píldoras, las composiciones farmacéuticas también pueden comprender agentes tamponantes. También se pueden preparar composiciones sólidas de un tipo similar usando cargas en cápsulas de gelatina rellenas blandas y duras, y excipientes, tales como lactosa o azúcares de leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.
[0235] Un comprimido se puede preparar por compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes auiliares. Las comprimidos se pueden preparar utilizando aglutinantes (por ejemplo, gelatina o hidroxipropilmetilcelulosa), lubricantes, diluyentes inertes, conservantes, disgregantes (por ejemplo, glicolato de almidón sódico o carboximetilcelulosa sódica reticulada), tensoactivos y/o agentes dispersantes. Los comprimidos moldeados pueden fabricarse mediante moldeo en una máquina adecuada de una mezcla del ingrediente activo en polvo humedecido con un diluyente líquido inerte.
[0236] Los comprimidos y otras formas de dosificación sólidas, tales como grageas, cápsulas, píldoras y gránulos, opcionalmente se pueden ranurar o preparar con recubrimientos y cubiertas, tales como recubrimientos entéricos y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica.
[0237] En algunas realizaciones, para prolongar el efecto de un ingrediente activo, es deseable ralentizar la absorción del compuesto de la inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede lograr mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo que tiene poca solubilidad en agua. La velocidad de absorción del ingrediente activo depende entonces de su velocidad de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y la forma cristalina. Alternativamente, la absorción retardada de un ingrediente activo administrado por vía parenteral se logra disolviendo o suspendiendo el compuesto en un vehículo oleoso. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede lograrse mediante la inclusión de agentes que retrasen la absorción, tales como el monoestearato de aluminio y la gelatina.
[0238] Las composiciones parenterales de liberación controlada pueden estar en forma de suspensiones acuosas, microesferas, microcápsulas, microesferas magnéticas, soluciones oleosas, suspensiones oleosas, emulsiones, o el ingrediente activo puede incorporarse en un portador o portadoores biocompatibles, liposomas, nanopartículas, implantes o dispositivos de infusión.
[0239] Los materiales para usar en la preparación de microesferas y/o microcápsulas incluyen polímeros biodegradables/bioerosionables, tales como poliglactina, poli-(isobutilcianoacrilato), poli(2-hidroxietil-L-glutamina) y poli(ácido láctico).
[0240] Los potadores biocompatibles que pueden usarse cuando se formula una formulación parenteral de liberación controlada incluyen carbohidratos, tales como dextranos, proteínas, tales como albúmina, lipoproteínas o anticuerpos.
[0241] Los materiales para uso en implantes pueden ser no biodegradables, por ejemplo, polidimetilsiloxano, o biodegradables, tales como, por ejemplo, poli(caprolactona), poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico) o poli(ortoésteres).
[0242] En realizaciones, el ingrediente o ingredientes activos se administran mediante aerosol. Esto se logra preparando un aerosol acuoso, una preparación liposomal o partículas sólidas que contienen el compuesto. Puede usarse una suspensión no acuosa (por ejemplo, propulsor de fluorocarbono). La composición farmacéutica también se puede administrar utilizando un nebulizador sónico, lo que minimizaría la exposición del agente a la cizalladura, lo que puede dar como resultado la degradación del compuesto.
[0243] Normalmente, un aerosol acuoso se prepara formulando una solución o suspensión acuosa del ingrediente o ingredientes activos junto con portadores y estabilizantes farmacéuticamente aceptables convencionales. Los portadores y estabilizadores varían según los requisitos del compuesto en particular, pero generalmente incluyen tensioactivos no iónicos (Tweens, Pluronics o polietilenglicol), proteínas inocuas como albúmina sérica, ésteres de sorbitán, ácido oleico, lecitina, aminoácidos, tales como glicina, tampones, sales, azúcares o alcoholes de azúcar. Los aerosoles generalmente se preparan a partir de soluciones isotónicas.
[0244] Las formas de dosificación para la administración tópica o transdérmica de uno o más ingredientes activos incluyen polvos, aerosoles, ungüentos, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhalantes. El ingrediente o ingredientes activos se pueden mezclar en condiciones estériles con un portador farmacéuticamente aceptable y con cualquier conservante, tampón o propelente, según corresponda.
[0245] Los parches transdérmicos adecuados para usar en la presente invención se describen en Transdermal Drug Delivery: Developmental Issues and Research Initiatives (Marcel Dekker Inc., 1989) y las patentes de EE.UU. números 4.743.249, 4.906.169, 5.198.223, 4.816.540, 5.422.119, 5.023.084. El parche transdérmico también puede ser cualquier parche transdérmico bien conocido en la técnica, incluidos los parches transescrotales. Las composiciones farmacéuticas en dichos parches transdérmicos pueden contener uno o más potenciadores de la absorción o potenciadores de la permeación de la piel bien conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Nos. 4.379.454 y 4.973.468, que se incorporan aquí como referencia). Los sistemas terapéuticos transdérmicos para uso en la presente invención pueden basarse en iontoforesis, difusión o una combinación de estos dos efectos.
[0246] Los parches transdérmicos tienen la ventaja añadida de proporcionar un suministro controlado de ingrediente o ingredientes activos al cuerpo. Dichas formas de dosificación se pueden preparar disolviendo o dispersando el ingrediente o ingredientes activos en un medio adecuado. También se pueden usar potenciadores de la absorción para aumentar el flujo del ingrediente activo a través de la piel. La velocidad de dicho flujo se puede controlar ya sea proporcionando una membrana de control de la velocidad o dispersando el ingrediente o ingredientes activos en una matriz polimérica o gel.
[0247] Tales composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de cremas, ungüentos, lociones, linimentos, geles, hidrogeles, soluciones, suspensiones, barras, aerosoles, pastas, emplastos y otros tipos de sistemas de administración transdérmica de fármacos. Las composiciones también pueden incluir portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como agentes emulsionantes, antioxidantes, agentes tamponadores, conservantes, humectantes, potenciadores de la penetración, agentes quelantes, agentes formadores de gel, bases para ungüentos, perfumes y agentes protectores de la piel.
[0248] Los ejemplos de agentes emulsionantes incluyen, pero no se limitan a, gomas de origen natural, por ejemplo, goma arábiga o goma de tragacanto, fosfátidos de origen natural, por ejemplo, lecitina de soja y derivados de monooleato de sorbitán.
[0249] Los ejemplos de antioxidantes incluyen, pero no se limitan a, hidroxianisol butilado (BHA), ácido ascórbico y derivados del mismo, tocoferol y derivados del mismo, y cisteína.
[0250] Los ejemplos de conservantes incluyen, pero no se limitan a, parabenos, tales como p-hidroxibenzoato de metilo o propilo y cloruro de benzalconio.
[0251] Los ejemplos de humectantes incluyen, pero no se limitan a, glicerina, propilenglicol, sorbitol y urea.
[0252] Los ejemplos de potenciadores de la penetración incluyen, pero no se limitan a, propilenglicol, DMSO, trietanolamina, N,N-dimetilacetamida, N,N-dimetilformamida, 2-pirrolidona y sus derivados, alcohol tetrahidrofurfurílico, propilenglicol, dietilenglicol monoetil o monometil éter con monolaurato de propilenglicol o laurato de metilo, eucaliptol, lecitina, TRANSCUTOL y AZONE.
[0253] Los ejemplos de agentes quelantes incluyen, pero no se limitan a, EDTA sódico, ácido cítrico y ácido fosfórico.
[0254] Los ejemplos de agentes formadores de gel incluyen, pero no se limitan a, Carbopol, derivados de celulosa, bentonita, alginatos, gelatina y polivinilpirrolidona.
[0255] Además del ingrediente o ingrediente activos, los ungüentos, pastas, cremas y geles de la presente divulgación pueden contener excipientes, tales como grasas animales y vegetales, aceites, ceras, parafinas, almidón, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicoles, siliconas, bentonitas, ácido silícico, talco y óxido de zinc, o mezclas de los mismos.
[0256] Los polvos y aerosoles pueden contener excipientes, tales como lactosa, talco, ácido silícico, hidróxido de aluminio, silicatos de calcio y poliamida en polvo, o mezclas de estas sustancias. Los aerosoles pueden contener además propulsores habituales, tales como clorofluorohidrocarburos e hidrocarburos volátiles no sustituidos, tales como butano y propano.
[0257] Las formas de depósito inyectables se fabrican formando matrices de microcápsulas de compuesto o compuestos de la divulgación en polímeros biodegradables, tales como poliláctido-poliglicólido. Dependiendo de la proporción de compuesto a polímero y de la naturaleza del polímero particular empleado, se puede controlar la velocidad de liberación del compuesto. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Las formulaciones inyectables de depósito también se preparan atrapando el fármaco en liposomas o microemulsiones que son compatibles con el tejido corporal.
[0258] Los implantes subcutáneos son bien conocidos en la técnica y son adecuados para su uso en la presente invención. Los procedimientos de implantación subcutánea son preferiblemente no irritantes y mecánicamente elásticos. Los implantes pueden ser de tipo matriz, de tipo reservorio o híbridos de los mismos. En los dispositivos de tipo matriz, el material portador puede ser poroso o no poroso, sólido o semisólido y permeable o impermeable al compuesto o compuestos activos. El material del vehículo puede ser biodegradable o puede erosionarse lentamente después de la administración. En algunos casos, la matriz no es degradable sino que depende de la difusión del compuesto activo a través de la matriz para que el material portador se degrade. Los procedimientos alternativos de implante subcutáneo utilizan dispositivos de depósito en los que el compuesto o compuestos activos están rodeados por una membrana de control de la velocidad, por ejemplo, una membrana independiente de la concentración del componente (que posee una cinética de orden cero). Los dispositivos que consisten en una matriz rodeada por una membrana de control de velocidad también son adecuados para su uso.
[0259] Los dispositivos de tipo depósito y matriz pueden contener materiales, tales como polidimetilsiloxano, tal como SILASTIC u otros cauchos de silicona. Los materiales de la matriz pueden ser polipropileno insoluble, polietileno, cloruro de polivinilo, acetato de etilvinilo, poliestireno y polimetacrilato, así como del tipo ésteres de glicerol del palmitostearato de glicerol, estearato de glicerol y behenato de glicerol. Los materiales pueden ser polímeros hidrófobos o hidrófilos y, opcionalmente, contener agentes solubilizantes.
[0260] Los dispositivos de implante subcutáneo pueden ser cápsulas de liberación lenta fabricadas con cualquier polímero adecuado, por ejemplo, tal como se describe en la patente de EE.UU. Nos 5.035.891 y 4.210.644.
[0261] En general, son aplicables al menos cuatro enfoques diferentes para proporcionar un control de velocidad sobre la liberación y la permeación transdérmica de un compuesto de fármaco. Estos enfoques son: sistemas moderados por membrana, sistemas controlados por difusión adhesiva, sistemas de tipo dispersión de matriz y sistemas de microdepósito. Se entiende que se puede obtener una composición percutánea y/o tópica de liberación controlada usando una mezcla adecuada de estos enfoques.
[0262] En un sistema moderado por membrana, el ingrediente activo está presente en un depósito que está totalmente encapsulado en un compartimento poco profundo moldeado a partir de un laminado impermeable a los fármacos, tales como un laminado de plástico metálico, y una membrana polimérica de control de velocidad, tal como una membrana microporosa o una membrana polimérica no porosa, por ejemplo, copolímero de etileno-acetato de vinilo. El ingrediente activo se libera a través de la membrana polimérica de control de velocidad. En el depósito del fármaco, el ingrediente activo puede dispersarse en una matriz sólida de polímero o suspenderse en un medio líquido viscoso no lixiviable, tal como un fluido de silicona. Sobre la superficie externa de la membrana polimérica, se aplica una capa delgada de un polímero adhesivo para lograr un contacto íntimo del sistema transdérmico con la superficie de la piel. El polímero adhesivo es preferiblemente un polímero que es hipoalergénico y compatible con la sustancia farmacológica activa.
[0263] En un sistema controlado por difusión adhesiva, se forma un depósito del ingrediente activo dispersando directamente el ingrediente activo en un polímero adhesivo y a continuación, por ejemplo, colando con solvente, extendiendo el adhesivo que contiene el ingrediente activo sobre una lámina plana de soporte de plástico metálico sustancialmente impermeable a los fármacos para formar una fina capa de depósito del fármaco.
[0264] Un sistema de tipo dispersión de matriz se caracteriza porque se forma un depósito del ingrediente activo dispersando sustancialmente de manera homogénea el ingrediente activo en una matriz polimérica hidrófila o lipófila. A continuación, el polímero que contiene el fármaco se moldea a continuación en un disco con un área superficial sustancialmente bien definida y un grosor controlado. El polímero adhesivo se extiende a lo largo de la circunferencia para formar una tira de adhesivo alrededor del disco.
[0265] Un sistema de microdepósito se puede considerar como una combinación de los sistemas de tipo de dispersión de matriz y depósito. En este caso, el depósito de la sustancia activa se forma primero suspendiendo los sólidos del fármaco en una solución acuosa de polímero soluble en agua y, a continuación, dispersando la suspensión del fármaco en un polímero lipofílico para formar una multiplicidad de esferas microscópicas no lixiviables de depósitos de fármaco.
[0266] Cualquiera de las composiciones de liberación controlada, liberación prolongada y liberación sostenida descritas en el presente documento se puede formular para liberar el ingrediente activo en aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 1 semana, en aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 72 horas, en aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 24 horas, en aproimadamente 30 minutos a 12 horas, en aproimadamente 30 minutos a 6 horas, en aproimadamente 30 minutos a 4 horas, y en aproimadamente 3 horas a 10 horas. En realizaciones, se mantiene una concentración eficaz del ingrediente o ingredientes activos en un sujeto durante 4 horas, 6 horas, 8 horas, 10 horas, 12 horas, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas o más después de la administración de las composiciones farmacéuticas al sujeto.
Vacunas o composiciones inmunogénicas
[0267] La presente invención se refiere a una composición inmunogénica, por ejemplo, una vacuna o una composición inmunogénica contra la neoplasia capaz de generar una respuesta específica de células T. La vacuna contra la neoplasia o la composición inmunogénica comprende péptidos neoantigénicos y/o polipéptidos neoantigénicos correspondientes a neoantígenos específicos de tumores identificados mediante los procedimientos descritos en el presente documento.
[0268] Una vacuna o una composición inmunogénica contra la neoplasia adecuada puede contener preferiblemente una pluralidad de péptidos neoantigénicos específicos de tumores. En una realización, la vacuna o composición inmunogénica puede incluir entre 1 y 100 conjuntos de péptidos, más preferiblemente entre 1 y 50 de dichos péptidos, incluso más preferiblemente entre 10 y 30 conjuntos de péptidos, incluso más preferiblemente entre 15 y 25 péptidos. Según otra realización preferida, la vacuna o composición inmunogénica puede incluir al menos un péptido, más preferiblemente 2, 3, 4 o 5 péptidos. En ciertas realizaciones, la vacuna o composición inmunogénica puede comprender 5, 6, 7, 8, 9 , 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 péptidos diferentes.
[0269] La cantidad óptima de cada péptido a incluir en la vacuna o composición inmunogénica y el régimen de dosificación óptimo pueden ser determinados por un experto en la técnica sin experimentación indebida. Por ejemplo, el péptido o su variante se pueden preparar mediante inyección intravenosa (i.v.), inyección subcutánea (s.c.), inyección intradérmica (i.d.), inyección intraperitoneal (i.p.), inyección intramuscular (i.m.). Los procedimientos preferidos de inyección de péptidos incluyen s.c., i.d., i.p., i.m. e i.v. Los procedimientos preferidos de inyección de ADN incluyen i.d., i.m., s.c., i.p. e i.v.. Por ejemplo, dosis de entre 1 y 500 mg, 50 |jg y 1,5 mg, preferiblemente de 10 |jg hasta 500 jg de péptido o ADN se pueden administrar y pueden depender del péptido o ADN respectivo. Las dosis de este intervalo se utilizaron con éxito en ensayos anteriores (Brunsvig PF, et al., Cancer Immunol Immunother.
2006; 55(12): 1553-1564; M. Staehler, et al., reunión de ASCO 2007; Resumen n° 3017). Otros procedimientos de administración de la vacuna o composición inmunogénica son conocidos por los expertos en la técnica.
[0270] En un caso de la presente divulgación, los diferentes péptidos y/o polipéptidos neoantigénicos específicos de tumores se seleccionan para su uso en la vacuna o la composición inmunogénica contra la neoplasia para maximizar la probabilidad de generar un ataque inmunitario contra la neoplasia/tumor del paciente. Sin pretender imponer ninguna teoría, se cree que la inclusión de una diversidad de péptidos neoantigénicos específicos de tumores puede generar un ataque inmunitario a gran escala contra una neoplasia/tumor. En una realización, los péptidos/polipéptidos neoantigénicos específicos de tumor seleccionados están codificados por mutaciones con cambio de sentido. En una segunda realización, los péptidos/polipéptidos neoantigénicos específicos de tumor seleccionados están codificados por una combinación de mutaciones con cambio de sentido y mutaciones neoORF. En una tercera realización, los péptidos/polipéptidos neoantigénicos específicos de tumor seleccionados están codificados por mutaciones neoORF.
[0271] En una realización en la que los péptidos/polipéptidos neoantigénicos específicos de tumor seleccionados están codificados por mutaciones scon cambio de sentido, los péptidos y/o polipéptidos se eligen en función de su capacidad para asociarse con las moléculas MHC particulares del paciente. Los péptidos/polipéptidos derivados de mutaciones neoORF también se pueden seleccionar en base a su capacidad para asociarse con las moléculas MHC particulares del paciente, pero también se pueden seleccionar incluso si no se prevé que se asocien con las moléculas MHC particulares del paciente.
[0272] La vacuna o composición inmunogénica es capaz de generar una respuesta específica de células T citotóxicas y/o una respuesta específica de células T auiliares.
[0273] La vacuna o composición inmunogénica puede comprender además un adyuvante y/o un portador. En este documento se dan ejemplos de adyuvantes y portadores útiles. Los péptidos y/o polipéptidos en la composición se pueden asociar con un portador, tal como, por ejemplo, una proteína o una célula presentadora de antígeno, tal como, por ejemplo, una célula dendrítica (DC) capaz de presentar el péptido a una célula T.
[0274] Los adyuvantes son cualquier sustancia cuya mezcla en la vacuna o composición inmunogénica aumenta o, en cualquier caso, modifica la respuesta inmunitaria al péptido mutante. Los portadores son estructuras de andamiaje, por ejemplo, un polipéptido o un polisacárido, a las que pueden asociarse los péptidos neoantigénicos. Opcionalmente, los adyuvantes se conjugan de forma covalente o no covalente a los péptidos o polipéptidos de la divulgación.
[0275] La capacidad de un adyuvante para aumentar la respuesta inmunitaria a un antígeno se manifiesta típicamente mediante un aumento significativo en la reacción mediada por el sistema inmunitario o la reducción de los síntomas de la enfermedad. Por ejemplo, un aumento en la inmunidad humoral se manifiesta típicamente por un aumento significativo en el título de anticuerpos producidos contra el antígeno, y un aumento en la actividad de las células T se manifiesta típicamente en una mayor proliferación celular, citotoxicidad celular o secreción de citoquinas. Un adyuvante también puede alterar una respuesta inmunitaria, por ejemplo, cambiando una respuesta principalmente humoral o Th2 a una respuesta principalmente celular o Th1.
[0276] Los adyuvantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, 1018 ISS, sales de aluminio, Amplivax, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, Imiquimod, ImuFact IMP321, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, JuvImmune, LipoVac, MF59, monofosforil lípido A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, PEPTEL. sistema vectorial, micropartículas PLG, resiquimod, SRL172, virosomas y otras partículas similares a virus, YF-17D, VEGF trap, R848, beta-glucano, Pam3Cys, estímulo QS21 de Aquila (Aquila Biotech, Worcester, Mass., EE. UU.) que se deriva de saponina, extractos de micobacterias e imitadores sintéticos de la pared celular bacteriana, y otros adyuvantes patentados, tales como Detox de Ribi. Quil o Superfos. Varios adyuvantes inmunológicos (por ejemplo, MF59) específicos para células dendríticas y su preparación se han descrito previamente (Dupuis M, et al., Cell Immunol.
1998; 186(1): 18-27; Allison AC; Dev Biol Stand. 1998; 92:3-11). También pueden usarse citocinas. Varias citocinas se han relacionado directamente con la influencia de la migración de células dendríticas a los tejidos linfoides (por ejemplo, TNF-alfa), aceleración de la maduración de las células dendríticas en células presentadoras de antígeno eficientes para los linfocitos T (por ejemplo, GM-CSF, IL-1 e IL-4) (patente de EE. UU. n.° 5.849.589) y que actúan como inmunoadyuvantes (por ejemplo, IL-12) (Gabrilovich DI, et al., J Immunother Emphasis Tumor Immunol. 1996 (6): 414-418).
[0277] Los receptores tipo Toll (TLR) también se pueden usar como adyuvantes y son miembros importantes de la familia de receptores de reconocimiento de patrones (PRR) que reconocen motivos conservados compartidos por muchos microorganismos, denominados "patrones moleculares asociados a patógenos" (PAMPS). El reconocimiento de estas "señales de peligro" activa múltiples elementos del sistema inmunitario innato y adaptativo. Los TLR se expresan en células del sistema inmunitario innato y adaptativo, como las células dendríticas (DC), los macrófagos, las células T y B, los mastocitos y los granulocitos, y se localizan en diferentes compartimentos celulares, como la membrana plasmática, los lisosomas, los endosomas, y endolisosomas. Diferentes TLR reconocen distintos PAMPS. Por ejemplo, TLR4 es activado por LPS contenido en las paredes celulares bacterianas, TLR9 es activado por ADN CpG bacteriano o viral no metilado, y TLR3 es activado por ARN de doble cadena. La unión del ligando TLR conduce a la activación de una o más vías de señalización intracelular, lo que finalmente da como resultado la producción de muchas moléculas clave asociadas con la inflamación y la inmunidad (en particular, el factor de transcripción NF-kB y los interferones de tipo I). La activación de DC mediada por TLR conduce a una mayor activación de DC, fagocitosis, regulación positiva de marcadores de activación y coestimulación como CD80, CD83 y CD86, expresión de CCR7 que permite la migración de DC a los ganglios linfáticos de drenaje y facilita la presentación de antígenos a las células T, así como como aumento de la secreción de citocinas como interferones tipo I, IL-12 e IL-6. Todos estos eventos posteriores son críticos para la inducción de una respuesta inmune adaptativa.
[0278] Entre las vacunas contra el cáncer o los adyuvantes de composición inmunogénica más prometedores actualmente en desarrollo clínico se encuentran el agonista de TLR9 CpG y el poli-ICLC de ligando TLR3 de ARN bicatenario sintético (dsRNA). En estudios preclínicos, el poli-ICLC parece ser el adyuvante de TLR más potente en comparación con LPS y CpG debido a su inducción de citoquinas proinflamatorias y falta de estimulación de IL-10, así como al mantenimiento de niveles altos de moléculas coestimuladoras en DCs1. Además, recientemente se comparó directamente poli-ICLC con CpG en primates no humanos (macacos rhesus) como adyuvante para una vacuna proteica o una composición inmunogénica que consiste en capsómeros del virus del papiloma humano (VPH)16 (Stahl-Hennig C, Eisenblatter M, Jasny E, et al. Los ARN sintéticos de doble cadena son adyuvantes para la inducción de T helper 1 y respuestas inmunitarias humorales al virus del papiloma humano en macacos rhesus. PLoS pathogens. abril de 2009; 5(4)).
[0279] También se ha informado que los oligonucleótidos inmunoestimuladores de CpG mejoran los efectos de los adyuvantes en un entorno de vacuna o composición inmunogénica. Sin pretender imponer ninguna teoría, los oligonucleótidos CpG actúan activando el sistema inmunitario innato (no adaptativo) a través de los receptores tipo Toll (TLR), principalmente TLR9. La activación de TLR9 desencadenada por CpG mejora las respuestas humorales y celulares específicas de antígeno a una amplia variedad de antígenos, incluidos antígenos peptídicos o proteicos, virus vivos o muertos, vacunas de células dendríticas, vacunas celulares autólogas y conjugados de polisacáridos en vacunas profilácticas y terapéuticas. Más importante aún, mejora la maduración y diferenciación de las células dendríticas, lo que da como resultado una mayor activación de las células Th1 y una fuerte generación de linfocitos T citotóxicos (CTL), incluso en ausencia de la ayuda de las células T CD4. El sesgo Th1 inducido por la estimulación con TLR9 se mantiene incluso en presencia de adyuvantes de vacunas como el alumbre o el adyuvante incompleto de Freund (IFA) que normalmente promueven un sesgo Th2. Los oligonucleótidos CpG muestran una actividad adyuvante aún mayor cuando se formulan o coadministran con otros adyuvantes o en formulaciones como micropartículas, nanopartículas, emulsiones lipídicas o formulaciones similares, que son especialmente necesarias para inducir una respuesta fuerte cuando el antígeno es relativamente débil. También aceleran la respuesta inmunitaria y permitieron reducir las dosis de antígeno en aproximadamente dos órdenes de magnitud, con respuestas de anticuerpos comparables a la vacuna de dosis completa sin CpG en algunos experimentos (Arthur M. Krieg, Nature Reviews, Drug Discovery, 5, junio de 2006, 471-484). Patente de EE.UU. N° 6.406, 705 B1 describe el uso combinado de oligonucleótidos CpG, adyuvantes que no son ácidos nucleicos y un antígeno para inducir una respuesta inmunitaria específica de antígeno. Un antagonista de CpG TLR9 comercialmente disponible es dSLIM (inmunomodulador de bucle de doble tallo) de Mologen (Berlín, ALEMANIA), que es un componente preferido de la composición farmacéutica de la presente invención. También pueden usarse otras moléculas de unión a TLR tales como TLR 7, TLR 8 y/o TLR 9 de unión a ARN.
[0280] Otros ejemplos de adyuvantes útiles incluyen, pero no se limitan a, CpG modificados químicamente (por ejemplo, CpR, Idera), poli (I: C) (por ejemplo, polii: CI2U), ADN o ARN bacteriano no CpG, así como inmunoactivos moléculas pequeñas y anticuerpos como ciclofosfamida, sunitinib, bevacizumab, celebrex, NCX-4016, sildenafil, tadalafil, vardenafil, sorafinib, X l-999, CP-547632, pazopanib, ZD2171, AZD2171, ipilimumab, tremelimumab y SC58175, que pueden actuar terapéuticamente y/o como adyuvante. Las cantidades y concentraciones de adyuvantes y aditivos útiles en el contexto de la presente invención pueden ser determinadas fácilmente por el experto en la materia sin experimentación indebida. Los adyuvantes adicionales incluyen factores estimulantes de colonias, como el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF, sargramostim).
[0281] Poli-ICLC es un ARN bicatenario preparado sintéticamente que consta de cadenas polii y poliC de una longitud media de aproximadamente 5000 nucleótidos, que se ha estabilizado a desnaturalización térmica e hidrólisis mediante nucleasas séricas mediante la adición de polilisina y carboximetilcelulosa. El compuesto activa TLR3 y el dominio helicasa de ARN de MDA5, ambos miembros de la familia PAMP, lo que lleva a la activación de células d C y asesinas naturales (NK) y a la producción de una "mezcla natural" de interferones tipo I, citocinas y quimiocinas. Además, el poli-ICLC ejerce un efecto antiinfeccioso y posiblemente antitumoral más directo y amplio dirigido al huésped, mediado por los dos sistemas de enzimas nucleares inducibles por IFN, el 2'5'-OAS y la quinasa P1/eIF2a, también conocida como PKR (4-6), así como helicasa RIG-I y MDA5.
[0282] En roedores y primates no humanos, se demostró que poli- ICLC mejora las respuestas de células T a antígenos virales, cebado cruzado y la inducción de células T CD8+ específicas de tumor, virus y autoantígeno. En un estudio reciente en primates no humanos, se descubrió que el poli-ICLC es esencial para la generación de respuestas de anticuerpos y la inmunidad de las células T a la proteína Gag p24 del VIH dirigida o no dirigida a DC, lo que enfatiza su eficacia como adyuvante de vacunas.
[0283] En sujetos humanos, el análisis transcripcional de muestras de sangre completa en serie reveló perfiles de expresión génica similares entre los 8 voluntarios humanos sanos que recibieron una única administración sc de poli-ICLC y expresión diferencial de hasta 212 genes entre estos 8 sujetos frente a 4 sujetos que recibieron placebo. Sorprendentemente, la comparación de los datos de expresión del gen poli-ICLC con datos previos de voluntarios inmunizados con la vacuna altamente efectiva contra la fiebre amarilla YF17D mostró que una gran cantidad de vías canónicas transcripcionales y de transducción de señales, incluidas las del sistema inmunitario innato, estaban reguladas al alza de manera similar en puntos de tiempo pico.
[0284] Más recientemente, se informó un análisis inmunológico en pacientes con cáncer de ovario, de trompas de Falopio y peritoneal primario en segunda o tercera remisión clínica completa que fueron tratados en un estudio de fase 1 de vacunación subcutánea con péptidos largos superpuestos sintéticos (OLP) de el antígeno testicular de cáncer NY-ESO-1 solo o con Montanide-ISA-51, o con 1,4 mg de poli-ICLC y Montanide. La generación de células T CD4+ y CD8+ específicas de NY-ESO-1 y las respuestas de anticuerpos mejoraron notablemente con la adición de poli-ICLC y Montanide en comparación con OLP solo o OLP y Montanide.
[0285] Una vacuna o composición inmunogénica según la presente invención puede comprender más de un adyuvante diferente. Además, la presente invención abarca una composición terapéutica que comprende cualquier sustancia adyuvante que incluye cualquiera de las discutidas en este documento. También se contempla que el péptido o polipéptido y el adyuvante se puedan administrar por separado en cualquier secuencia apropiada.
[0286] Un vehículo puede estar presente independientemente de un adyuvante. El vehículo puede estar unido covalentemente al antígeno. También se puede añadir un vehículo al antígeno insertando ADN que codifica el vehículo en marco con ADN que codifica el antígeno. La función de un vehículo puede ser, por ejemplo, conferir estabilidad, aumentar la actividad biológica o aumentar la vida media en suero. La extensión de la vida media puede ayudar a reducir el número de aplicaciones ya dosis más bajas, por lo que son beneficiosas por razones terapéuticas pero también económicas. Además, un vehículo puede ayudar a presentar péptidos a las células T. El vehículo puede ser cualquier vehículo adecuado conocido por el experto en la materia, por ejemplo, una proteína o una célula presentadora de antígeno. Una proteína transportadora podría ser, pero no se limitan a, hemocianina de lapa californiana, proteínas séricas como la transferrina, albúmina sérica bovina, albúmina sérica humana, tiroglobulina u ovoalbúmina, inmunoglobulinas u hormonas, como insulina o ácido palmítico. Para la inmunización de seres humanos, el vehículo puede ser un vehículo fisiológicamente aceptable aceptable para los seres humanos y seguro. Sin embargo, el toxoide tetánico y/o el toxoide diftérico son vehículos adecuados en una realización de la presente invención. Alternativamente, el vehículo puede ser dextranos, por ejemplo, sefarosa.
[0287] Las células T citotóxicas (CTL) reconocen un antígeno en forma de un péptido unido a una molécula de MHC en lugar del propio antígeno extraño intacto. La propia molécula MHC se encuentra en la superficie celular de una célula presentadora de antígeno. Por lo tanto, una activación de CTL solo es posible si está presente un complejo trimérico de antígeno peptídico, molécula MHC y APC. En consecuencia, puede potenciar la respuesta inmunitaria si no solo se usa el péptido para la activación de los CTL, sino si además se añaden APC con la molécula MHC respectiva. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la vacuna o composición inmunogénica según la presente invención contiene adicionalmente al menos una célula presentadora de antígeno.
[0288] La célula presentadora de antígeno (o célula estimuladora) normalmente tiene una molécula de MHC de clase I o II en su superficie y, en una realización, es sustancialmente incapaz de cargar por sí misma la molécula de MHC de clase I o II con el antígeno seleccionado. Como se describe con más detalle en el presente documento, la molécula de MHC de clase I o II puede cargarse fácilmente con el antígeno seleccionado in vitro.
[0289] La actividad de las células CD8+ se puede aumentar mediante el uso de células CD4+. La identificación de epítopos de células T+ CD4 para antígenos tumorales ha suscitado interés porque muchas terapias inmunológicas contra el cáncer pueden ser más eficaces si se utilizan linfocitos T CD8+ y CD4+ para atacar el tumor de un paciente. Las células CD4+ son capaces de mejorar las respuestas de las células T CD8. Muchos estudios en modelos animales han demostrado claramente mejores resultados cuando las células T CD4+ y CD8+ participan en respuestas antitumorales (ver, por ejemplo, Nishimura et al. (1999) Distinct role of antigen-specific T helper type 1 (TH1) and Th2 cells en la erradicación de tumores in vivo J Ex Med 190:617-27). Se han identificado epítopos universales de células T CD4+ que son aplicables al desarrollo de terapias contra diferentes tipos de cáncer (ver, por ejemplo, Kobayashi et al. (2008) Current Opinion in Immunology 20: 221-27). Por ejemplo, un péptido auxiliar restringido por HLA-DR del toxoide tetánico se usó en vacunas contra el melanoma para activar las células T CD4+ de manera no específica (ver, por ejemplo, Slingluff et al. (2007) Immunologic and Clinical Outcomes of a Randomized Phase II Trial of Two Multipeptide Vaccines for Melanoma en el entorno adyuvante, Clinical Cancer Research 13(21):6386-95). Se contempla dentro del alcance de la presente invención que tales células CD4+ pueden ser aplicables en tres niveles que varían en su especificidad tumoral: 1) un nivel amplio en el que pueden usarse epítopos CD4+ universales (por ejemplo, toxoide tetánico) para aumentar las células CD8+; 2) un nivel intermedio en el que pueden usarse epítopos CD4+ nativos asociados a tumores para aumentar las células CD8+; y 3) un nivel específico del paciente en el que pueden usarse epítopos CD4+ de neoantígeno para aumentar las células CD8+ de una manera específica del paciente.
[0290] La inmunidad de células CD8+ también puede generarse con vacuna de células dendríticas (DC) cargada con neoantígeno. Las DC son potentes células presentadoras de antígenos que inician la inmunidad de las células T y se pueden usar como vacunas contra el cáncer cuando se cargan con uno o más péptidos de interés, por ejemplo, mediante inyección directa de péptidos. Por ejemplo, se demostró que los pacientes a los que se les acababa de diagnosticar melanoma metastásico estaban inmunizados contra 3 HLA-A 'Péptidos derivados del antígeno de melanoma gp100 restringido a 0201 con CD maduros activados con CD40L/IFN-g pulsados con péptido autólogo a través de una vacuna de DC del paciente que produce IL-12p70 (ver, por ejemplo, Carreno et al (2013) vacuna de DC del paciente que produce L-12p70 provoca inmunidad polarizada Tc1, Journal of Clinical Investigation, 123(8):3383-94 y Ali y otros (2009) La regulación in situ de los subconjuntos de DC y las células T median la regresión tumoral en ratones, Cancer Immunotherapy, 1(8): 1-10). Está contemplado dentro del alcance de la presente invención que las DC cargadas con neoantígeno pueden prepararse usando el agonista sintético de TLR 3 poliinosínico-ácido policitidílico-poli-L-lisina carboximetilcelulosa (Poly-ICLC) para estimular las DC. Poly-ICLC es un potente estímulo de maduración individual para las CD humanas según lo evaluado por una regulación positiva de CD83 y CD86, inducción de interleucina-12 (IL-12), factor de necrosis tumoral (TNF), proteína 10 inducida por interferón gamma (IP-10), interleucina 1 (IL-1) e interferones tipo I (IFN) y producción mínima de interleucina 10 (IL-10). Las DC se pueden diferenciar de las células mononucleares de sangre periférica congeladas (PBMC) obtenidas por leucoaféresis, mientras que las PBMC se pueden aislar mediante centrifugación en gradiente de Ficoll y congelar en alícuotas.
[0291] De manera ilustrativa, se puede usar el siguiente protocolo de activación de 7 días. Las PBMC del día 1 se descongelan y se colocan en placas en matraces de cultivo de tejidos para seleccionar los monocitos que se adhieren a la superficie de plástico después de 1-2 horas de incubación a 37 °C en la incubadora de cultivo de tejidos. Después de la incubación, los linfocitos se lavan y los monocitos adherentes se cultivan durante 5 días en presencia de interleucina-4 (IL-4) y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) para diferenciarlos en DC inmaduras. El día 6, las CD inmaduras se pulsan con la proteína hemocianina de lapa californiana (KLH) que sirve como control de la calidad de la vacuna y puede aumentar la inmunogenicidad de la vacuna. Las DC se estimulan para que maduren, se cargan con antígenos peptídicos y se incuban durante la noche. El día 7, las células se lavan, y se congelaron en alícuotas de 1 ml que contenían 4-20 x 10(6) células usando un congelador de velocidad controlada. Se pueden realizar pruebas de liberación de lotes para los lotes de DC para cumplir con las especificaciones mínimas antes de inyectar las DC a los pacientes (ver, por ejemplo, Sabado et al. (2013) Preparación de células dendríticas maduras cargadas de antígeno tumoral para inmunoterapia, J. Vis Exp. 1 de agosto;(78).doi: 10.3791/50085).
[0292] Se puede incorporar una vacuna DC en un sistema de armazón para facilitar la administración a un paciente. El tratamiento terapéutico de la neoplasia de un paciente con una vacuna de DC puede utilizar un sistema de biomaterial que libera factores que reclutan células dendríticas del huésped en el dispositivo, diferencia las DC inmaduras residentes mediante la presentación local de adyuvantes (por ejemplo, señales de peligro) mientras libera antígeno y promueve la liberación de DC cargadas de antígeno activadas a los ganglios linfáticos (o sitio de acción deseado) donde las DC pueden interactuar con las células T para generar una potente respuesta de linfocitos T citotóxicos a los neoantígenos del cáncer. Los biomateriales implantables pueden usarse para generar una potente respuesta de linfocitos T citotóxicos contra una neoplasia de una manera específica para el paciente. Las células dendríticas residentes en el biomaterial pueden entonces activarse exponiéndolas a señales de peligro que simulan una infección, junto con la liberación del antígeno del biomaterial. Las células dendríticas activadas a continuación migran desde los biomateriales a los ganglios linfáticos para inducir una respuesta efectora T citotóxica. Se ha demostrado previamente que este enfoque conduce a la regresión del melanoma establecido en estudios preclínicos utilizando un lisado preparado a partir de biopsias tumorales (ver, por ejemplo, Ali et al. (2209) In situ regulator of DC subsets and T cells medias tumor regression in mice, Cancer Immunotherapy 1(8):1-10; Ali et al. (2009) Infection-imimicing materials to program dendritic cells in situ. Nat Mater 8:151-8), y dicha vacuna se está probando actualmente en una fase clínica I. ensayo iniciado recientemente en el Dana-Farber Cancer Institute. También se ha demostrado que este enfoque conduce a la regresión del glioblastoma, así como a la inducción de una potente respuesta de memoria para prevenir la recaída, usando el modelo de glioma de rata C6.24 en la propuesta actual. La capacidad de dicho andamio implantable de administración de vacunas con biomatriz para amplificar y mantener la activación de células dendríticas específicas del tumor puede conducir a una inmunosensibilización antitumoral más sólida que la que se puede lograr mediante las administraciones tradicionales de vacunas subcutáneas o intraganglionares.
[0293] Preferiblemente, las células presentadoras de antígenos son células dendríticas. Convenientemente, las células dendríticas son células dendríticas autólogas que se pulsan con el péptido neoantigénico. El péptido puede ser cualquier péptido adecuado que dé lugar a una respuesta de células T apropiada. La terapia de células T usando células dendríticas autólogas pulsadas con péptidos de un antígeno asociado a un tumor se describe en Murphy et al. (1996) The Prostate 29, 371-380 y Tjua et al. (1997) La Próstata 32, 272-278.
[0294] Por lo tanto, en una realización de la presente invención, la vacuna o composición inmunogénica que contiene al menos una célula presentadora de antígeno se pulsa o se carga con uno o más péptidos de la presente descripción. Como alternativa, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) aisladas de un paciente pueden cargarse con péptidos ex vivo e inyectarse de nuevo en el paciente. Como alternativa, la célula presentadora de antígeno comprende una construcción de expresión que codifica un péptido de la presente divulgación. El polinucleótido puede ser cualquier polinucleótido adecuado y se prefiere que sea capaz de transducir la célula dendrítica, dando así como resultado la presentación de un péptido y la inducción de inmunidad.
[0295] La composición farmacéutica de la presente invención se puede compilar de modo que la selección, el número y/o la cantidad de péptidos presentes en la composición sean específicos del tejido, el cáncer y/o el paciente. Por ejemplo, la selección exacta de péptidos puede guiarse por los patrones de expresión de las proteínas originales en un tejido determinado para evitar efectos secundarios. La selección puede depender del tipo específico de cáncer, el estado de la enfermedad, los regímenes de tratamiento anteriores, el estado inmunitario del paciente y, por supuesto, el haplotipo HLA del paciente. Además, la vacuna o composición inmunogénica según la presente invención puede contener componentes individualizados, según las necesidades personales del paciente particular. Los ejemplos incluyen variar las cantidades de péptidos según la expresión del neoantígeno relacionado en el paciente en particular,
[0296] Las composiciones farmacéuticas que comprenden el péptido de la divulgación se pueden administrar a un individuo que ya padece cáncer. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones se administran a un paciente en una cantidad suficiente para provocar una respuesta c Tl eficaz al antígeno tumoral y para curar o al menos detener parcialmente los síntomas y/o complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como "dosis terapéuticamente eficaz". Las cantidades eficaces para este uso pueden depender, por ejemplo, de la composición peptídica, la forma de administración, el estadio y la gravedad de la enfermedad que se está tratando, el peso y el estado general de salud del paciente y el criterio del médico que prescribe, pero generalmente varían para la inmunización inicial (es decir, para la administración terapéutica o profiláctica) de alrededor de 1,0 |jg a alrededor de 50, 000 jg de péptido para un paciente de 70 kg, seguido de dosis de refuerzo o de aproximadamente 1,0 jg a aproximadamente 10000 jg de péptido conforme a un régimen de refuerzo durante semanas o meses dependiendo de la respuesta y condición del paciente y posiblemente midiendo la actividad específica de CTL en el sangre del paciente. Debe tenerse en cuenta que el péptido y las composiciones de la presente descripción pueden emplearse generalmente en estados de enfermedad graves, es decir, situaciones potencialmente mortales o potencialmente mortales, especialmente cuando el cáncer ha hecho metástasis. Para uso terapéutico, la administración debe comenzar tan pronto como sea posible después de la detección o extirpación quirúrgica de los tumores. A esto le siguen dosis de refuerzo hasta que al menos los síntomas se reduzcan sustancialmente y durante un período posterior.
[0297] Las composiciones farmacéuticas (por ejemplo, composiciones de vacunas) para tratamiento terapéutico están destinadas a la administración parenteral, tópica, nasal, oral o local. Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas se administran por vía parenteral, por ejemplo, por vía intravenosa, subcutánea, intradérmica o intramuscular. Las composiciones pueden administrarse en el sitio de la escisión quirúrgica para inducir una respuesta inmunitaria local al tumor. La presente invención proporciona composiciones para administración parenteral que comprenden una solución de los péptidos y la vacuna o las composiciones inmunogénicas se disuelven o suspenden en un vehículo aceptable, preferiblemente un vehículo acuoso. Se puede utilizar una variedad de vehículos acuosos, por ejemplo, agua, agua tamponada, solución salina al 0,9 %, glicina al 0,3 %, ácido hialurónico y similares. Estas composiciones se pueden esterilizar por procedimientos convencionales, técnicas de esterilización bien conocidas, o puede filtrarse estérilmente. Las soluciones acuosas resultantes pueden envasarse para su uso tal cual, o liofilizarse, combinándose la preparación liofilizada con una solución estéril antes de la administración. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes tamponadores y de ajuste del pH, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humectantes y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio. , monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina, etc.
[0298] Una suspensión de liposomas que contiene un péptido se puede administrar por vía intravenosa, local, tópica, etc. en una dosis que varía según, entre otras cosas, la forma de administración, el péptido que se administra y la etapa de la enfermedad que se trata. Para dirigirse a las células inmunitarias, puede incorporarse en el liposoma un ligando, tal como, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos para los determinantes de la superficie celular de las células del sistema inmunitario deseadas.
[0299] Para composiciones sólidas, se pueden usar vehículos sólidos no tóxicos convencionales o de nanopartículas que incluyen, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio y el me gusta. Para la administración oral, se forma una composición no tóxica farmacéuticamente aceptable mediante la incorporación de cualquiera de los excipientes normalmente empleados, como los vehículos enumerados anteriormente, y generalmente 10-95 % del ingrediente activo, es decir, uno o más péptidos de la divulgación, y más preferiblemente a una concentración de 25%-75%.
[0300] Para la administración en aerosol, los péptidos inmunogénicos se suministran preferentemente en forma finamente dividida junto con un tensioactivo y un propulsor. Los porcentajes típicos de péptidos son 0,01 %-20 % en peso, preferiblemente 1 %-10 %. El tensioactivo puede, por supuesto, ser no tóxico y preferiblemente soluble en el propulsor. Representativos de tales agentes son los ésteres o ésteres parciales de ácidos grasos que contienen de 6 a 22 átomos de carbono, tales como los ácidos caproico, octanoico, láurico, palmítico, esteárico, linoleico, linolénico, olesterico y oleico con un alcohol polihídrico alifático o su anhídrido cíclico. . Pueden emplearse ésteres mixtos, tales como glicéridos mixtos o naturales. El tensioactivo puede constituir del 0,1% al 20% en peso de la composición, preferentemente del 0,25 al 5%. El resto de la composición es normalmente propulsor. También se puede incluir un portador como se desee, como con, por ejemplo,
[0301] Los péptidos y polipéptidos de la divulgación se pueden sintetizar fácilmente químicamente utilizando reactivos que están libres de sustancias bacterianas o animales contaminantes (Merrifield RB: síntesis de péptidos en fase sólida. I. La síntesis de un tetrapéptido. J. Am. Chem. Soc. 85:2149-54, 1963).
[0302] Los péptidos y polipéptidos de la divulgación] también se pueden expresar mediante un vector, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico como se describe en el presente documento, por ejemplo, ARN o un plásmido de ADN, un vector viral como un poxvirus, por ejemplo, un virus ortopox. , virus de la viruela aviar o adenovirus, AAV o lentivirus. Este enfoque implica el uso de un vector para expresar secuencias de nucleótidos que codifican el péptido de la divulgación. Tras la introducción en un huésped infectado de forma aguda o crónica o en un huésped no infectado, el vector expresa el péptido inmunogénico y, por lo tanto, provoca una respuesta CTL del huésped.
[0303] Para fines terapéuticos o de inmunización, los ácidos nucleicos que codifican el péptido de la descripción y, opcionalmente, uno o más de los péptidos descritos en el presente documento también se pueden administrar al paciente. Se utilizan convenientemente varios procedimientos para administrar los ácidos nucleicos al paciente. Por ejemplo, el ácido nucleico puede administrarse directamente, como "ADN desnudo". Este enfoque se describe, por ejemplo, en Wolff et al., Science 247: 1465-1468 (1990), así como en las patentes de Estados Unidos números 5.580.859 y 5.589.466. Los ácidos nucleicos también se pueden administrar utilizando el suministro balístico como se describe, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. N° 5.204.253. Pueden administrarse partículas compuestas únicamente por ADN. Alternativamente, el ADN se puede adherir a partículas, como partículas de oro. Generalmente, un plásmido para una vacuna o composición inmunológica puede comprender ADN que codifica un antígeno (por ejemplo, uno o más neoantígenos) unido operativamente a secuencias reguladoras que controlan la expresión o expresión y secreción del antígeno de una célula huésped, por ejemplo, una célula de mamífero; por ejemplo, de arriba a abajo, ADN para un promotor, como un promotor de virus de mamíferos (por ejemplo, un promotor de CMV como un hCMV o mCMV, por ejemplo, un promotor intermedio temprano o un promotor de SV40; consulte los documentos citados aquí para promotores útiles), ADN para un péptido líder eucariótico para secreción (por ejemplo, activador tisular del plasminógeno), ADN para el(los) neoantígeno(s) y ADN que codifica un terminador (por ejemplo, el terminador transcripcional 3'UTR del gen que codifica el crecimiento bovino Hormona o bGH poliA). Una composición puede contener más de un plásmido o vector, por lo que cada vector contiene y expresa un neoantígeno diferente. También se hace mención de patente de Estados Unidos de Wasmoen N° 5.849.303, y la Patente de EE.UU de Dale N° 5.811.104, cuyo texto puede ser de utilidad. Las formulaciones de ADN o plásmido de ADN se pueden formular con o dentro de lípidos catiónicos; y, en cuanto a lípidos catiónicos, así como adyuvantes, también se hace mención a la Solicitud de Patente de EE.UU. 2003/0104008 de Loosmore. Además, las enseñanzas en Audonnet US Pat. Nos. 6.228.846 y 6.159.477 se puede confiar en las enseñanzas de plásmidos de ADN que se pueden emplear en la construcción y uso de plásmidos de ADN que contienen y se expresan in vivo.
[0304] Los ácidos nucleicos también pueden administrarse complejados con compuestos catiónicos, como lípidos catiónicos. Los procedimientos de suministro de genes mediados por lípidos se describen, por ejemplo, en WO1996/18372; documento WO 1993/24640; Mannino & Gould-Fogerite, BioTechniques 6(7): 682-691 (1988); Patente de los Estados Unidos N° 5.279.833; documento WO 1991/06309; y Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7414 (1987).
[0305] El ARN que codifica el péptido de interés (por ejemplo, ARNm) también se puede usar para la administración (ver, por ejemplo, Kiken et al, 2011; Su et al, 2011; ver también US 8278036; Halabi et al. J Clin Oncol (2003) 21:1232-1237, Petsch et al, Nature Biotechnology 2012 Dec 7;30(12):1210-6).
[0306] Información sobre poxvirus que pueden usarse en la práctica de la presente invención, tales como poxvirus de la subfamilia Chordopoxvirinae (poxvirus de vertebrados), por ejemplo, ortopoxvirus y avipoxvirus, por ejemplo, virus vaccinia (por ejemplo, cepa Wyeth, cepa WR (por ejemplo, ATc C ® VR-1354), cepa Copenhagen, NYVa C, NYVAC.1, NYVAC.2, Mv A, MVA-b N), virus de la viruela del canario (por ejemplo, cepa Wheatley C93, ALVAC), virus de la viruela aviar (por ejemplo, cepa FP9, cepa Webster, TROVAC), la viruela del palomar, la viruela de la codorniz y la viruela del mapache, pero no se limitan a, sus recombinantes sintéticos o no naturales, sus usos y procedimientos para fabricar y usar dichos recombinantes se pueden encontrar en la literatura científica y de patentes, como:
^ Patentes de Estados Unidos Nos. 4.603.112, 4.769.330, 5.110.587, 5.174.993, 5.364.773, 5.762.938, 5.494.807, 5.766.597, 7.767.449, 6.780.407, 6.537.594, 6.265.189, 6.214.353, 6.130.066, 6.004.777, 5.990.091, 5.942.235, 5.833.975, 5.766.597, 5.756.101, 7.045.313, 6.780.417, 8.470.598 , 8.372.622, 8.268.329, 8.268.325, 8.236.560, 8.163.293, 7.964.398, 7.964.396, 7.964.395, 7.939.086, 7.923.017, 7.897.156, 7.892.533, 7.628.980, 7.459.270, 7.445.924, 7.384.644, 7.335.364, 7.189.536, 7.097.842, 6.913.752, 6.761.893, 6.682.743, 5.770.212, 5.766.882, y 5.989.562, y
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cada uno de los cuales se incorpora aquí por referencia.
[0307] En cuanto a los vectores de adenovirus útiles en la práctica de la presente invención, se hace mención a la Patente de EE.UU. N° 6.955.808. El vector de adenovirus utilizado se puede seleccionar del grupo que consiste en los vectores Ad5, Ad35, Ad11, C6 y C7. Se ha publicado la secuencia del genoma del Adenovirus 5 ("Ad5"). (Chroboczek, J., Bieber, F. y Jacrot, B. (1992) La secuencia del genoma del adenovirus tipo 5 y su comparación con el genoma del adenovirus tipo 2, Virology 186, 280-285). Los vectores Ad35 se describen en las patentes de EE.UU. números 6.974.695, 6.913.922 y 6.869.794. Los vectores Ad11 se describen en las patentes de EE.UU. N° 6.913.922. Los vectores de adenovirus C6 se describen en las patentes de EE.UU. Nos. 6.780.407; 6.537.594; 6.309.647; 6.265.189; 6.156.567; 6.090.393; 5.942.235 y 5.833.975. Los vectores C7 se describen en las patentes de EE.UU. N° 6.277.558. También se pueden usar vectores de adenovirus que son defectuosos o eliminados en E1, defectuosos o eliminados en E3 y/o defectuosos o eliminados en E4. Ciertos adenovirus que tienen mutaciones en la región E1 tienen un margen de seguridad mejorado porque los mutantes de adenovirus defectuosos en E1 son defectuosos en la replicación en células no permisivas o, como mínimo, están muy atenuados. Los adenovirus que tienen mutaciones en la región E3 pueden haber mejorado la inmunogenicidad al interrumpir el mecanismo por el cual el adenovirus regula a la baja las moléculas del MHC de clase I. Los adenovirus que tienen mutaciones E4 pueden tener una inmunogenicidad reducida del vector de adenovirus debido a la supresión de la expresión génica tardía. Dichos vectores pueden ser particularmente útiles cuando se desea una revacunación repetida utilizando el mismo vector. Vectores de adenovirus que están delecionados o mutados en E1, E3, E4, E1 y E3, y E1 y E4 pueden usarse según la presente invención. Además, los vectores de adenovirus "gutless", en los que se eliminan todos los genes virales, también se pueden usar según la presente invención. Dichos vectores requieren un virus auxiliar para su replicación y requieren una línea celular 293 humana especial que exprese tanto E1a como Cre, una condición que no existe en el entorno natural. Dichos vectores "gutless" no son inmunogénicos y, por lo tanto, los vectores se pueden inocular varias veces para la revacunación. Los vectores de adenovirus "gutless" pueden usarse para la inserción de insertos/genes heterólogos tales como los transgenes de la presente divulgación, e incluso pueden usarse para la administración conjunta de un gran número de insertos/genes heterólogos.
[0308] En cuanto a los sistemas de vectores de lentivirus útiles en la práctica de la presente invención, se hace mención de las patentes de Estados Unidos números 6428953, 6165782, 6013516, 5994136, 6312682 y 7.198.784, y los documentos citados en las mismas.
[0309] Con respecto a los vectores AAV útiles en la práctica de la presente invención, se hace mención de las Patentes de EE.UU. Nos. 5658785, 7115391, 7172893, 6953690, 6936466, 6924128, 6893865, 6793926, 6537540, 6475769 y 6258595 y los documentos allí citados. .
[0310] Otro vector es BCG (Bacille Calmette Guerin). Los vectores BCG se describen en Stover et al. (Nature 351:456-460 (1991)). Una amplia variedad de otros vectores útiles para la administración terapéutica o la inmunización de los péptidos de la divulgación, por ejemplo, vectores de Salmonella typhi y similares, es evidente para los expertos en la técnica a partir de la descripción del presente documento.
[0311] Los vectores se pueden administrar para tener una expresión y respuesta in vivo similar a las dosis y/o respuestas provocadas por la administración de antígenos.
[0312] Un medio preferido para administrar ácidos nucleicos que codifican el péptido de la divulgación utiliza construcciones de minigenes que codifican múltiples epítopos. Para crear una secuencia de ADN que codifique los epítopos de CTL seleccionados (minigen) para la expresión en células humanas, las secuencias de aminoácidos de los epítopos se traducen inversamente. Se utiliza una tabla de uso de codones humanos para guiar la elección de codones para cada aminoácido. Estas secuencias de ADN que codifican epítopos están unidas directamente, creando una secuencia polipeptídica continua. Para optimizar la expresión y/o la inmunogenicidad, se pueden incorporar elementos adicionales en el diseño del minigen. Ejemplos de secuencias de aminoácidos que podrían traducirse inversamente e incluirse en la secuencia del minigen incluyen: linfocitos T auxiliares, epítopos, una secuencia líder (señal) y una señal de retención del retículo endoplásmico. Además, la presentación de MHC de epítopos CTL se puede mejorar mediante la inclusión de secuencias flanqueantes sintéticas (por ejemplo, polialanina) o naturales adyacentes a los epítopos CTL.
[0313] La secuencia del minigen se convierte en ADN ensamblando oligonucleótidos que codifican las cadenas positiva y negativa del minigen. Los oligonucleótidos superpuestos (de 30 a 100 bases de longitud) se sintetizan, fosforilan, purifican e hibridan en condiciones apropiadas utilizando técnicas bien conocidas. Los extremos de los oligonucleótidos se unen utilizando ADN ligasa T4. Este minigen sintético, que codifica el polipéptido del epítopo CTL, puede clonarse a continuación en un vector de expresión deseado.
[0314] Las secuencias reguladoras estándar bien conocidas por los expertos en la técnica se incluyen en el vector para asegurar la expresión en las células diana. Se requieren varios elementos del vector: un promotor con un sitio de clonación corriente abajo para la inserción del minigen; una señal de poliadenilación para una terminación eficaz de la transcripción; un origen de replicación de E. coli; y un marcador seleccionable de E. coli (por ejemplo, resistencia a ampicilina o kanamicina). Se pueden usar numerosos promotores para este propósito, por ejemplo, el promotor del citomegalovirus humano (hCMV). Véanse las patentes de Estados Unidos números 5.580.859 y 5.589.466 para otras secuencias promotoras adecuadas.
[0315] Se pueden desear modificaciones adicionales del vector para optimizar la inmunogenicidad y la expresión del minigen. En algunos casos, se requieren intrones para una expresión génica eficiente, y se podrían incorporar uno o más intrones sintéticos o naturales en la región transcrita del minigen. También se puede considerar la inclusión de secuencias de estabilización de ARNm para aumentar la expresión de minigenes. Recientemente se ha propuesto que las secuencias inmunoestimuladoras (ISS o CpG) desempeñan un papel en la inmunogenicidad de las vacunas de ADN. Estas secuencias podrían incluirse en el vector, fuera de la secuencia codificante del minigen, si se encuentra que mejoran la inmunogenicidad.
[0316] En algunas realizaciones, se puede usar un vector de expresión bicistrónico para permitir la producción de los epítopos codificados por el minigen y una segunda proteína incluida para potenciar o disminuir la inmunogenicidad. Los ejemplos de proteínas o polipéptidos que podrían potenciar beneficiosamente la respuesta inmunitaria si se expresan conjuntamente incluyen citoquinas (por ejemplo, IL2, IL12, GM-CSF), moléculas inductoras de citoquinas (por ejemplo, LeIF) o moléculas coestimuladoras. Los epítopos auxiliares (HTL) podrían unirse a señales de direccionamiento intracelular y expresarse por separado de los epítopos CTL. Esto permitiría la dirección de los epítopos HTL a un compartimento celular diferente al de los epítopos CTL. Si es necesario, esto podría facilitar una entrada más eficaz de los epítopos HTL en la ruta del MHC de clase II, mejorando así la inducción de CTL. A diferencia de la inducción de CTL,
[0317] Una vez que se selecciona un vector de expresión, el minigen se clona en la región del polienlazador cadena abajo del promotor. Este plásmido se transforma en una cepa de E. coli apropiada y el ADN se prepara usando técnicas estándar. La orientación y la secuencia de ADN del minigen, así como todos los demás elementos incluidos en el vector, se confirman mediante mapeo de restricción y análisis de secuencia de ADN. Las células bacterianas que albergan el plásmido correcto se pueden almacenar como un banco de células maestro y un banco de células de trabajo.
[0318] El ADN de plásmido purificado se puede preparar para inyección usando una variedad de formulaciones. La más sencilla de ellas es la reconstitución del ADN liofilizado en solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril. Se han descrito una variedad de procedimientos y es posible que se disponga de nuevas técnicas. Como se indica aquí, los ácidos nucleicos se formulan convenientemente con lípidos catiónicos. Además, los glicolípidos, los liposomas fusogénicos, los péptidos y los compuestos denominados colectivamente como protectores, interactivos, sin condensación (PINC) también podrían formar complejos con ADN plasmídico purificado para influir en variables como la estabilidad, la dispersión intramuscular o el tráfico a órganos o tipos de células específicos.
[0319] La sensibilización de células diana se puede utilizar como un ensayo funcional para la expresión y presentación de MHC de clase I de epítopos de CTL codificados por minigenes. El ADN del plásmido se introduce en una línea celular de mamífero que es adecuada como diana para los ensayos estándar de liberación de cromo de CTL. El procedimiento de transfección utilizado depende de la formulación final. La electroporación se puede utilizar para el ADN "desnudo", mientras que los lípidos catiónicos permiten la transfección directa in vitro. Un plásmido que expresa la proteína verde fluorescente (GFP) se puede cotransfectar para permitir el enriquecimiento de las células transfectadas mediante la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). A continuación, estas células se marcan con cromo-51 y se utilizan como células diana para líneas CTL específicas de epítopo. La citólisis, detectada por la liberación de 51Cr, indica la producción de presentación MHC de epítopos CTL codificados por mini genes.
[0320] La inmunogenicidad in vivo es un segundo enfoque para el ensayo funcional de formulaciones de ADN de minigenes. Se inmunizan ratones transgénicos que expresan moléculas MHC humanas apropiadas con el producto de ADN. La dosis y la vía de administración dependen de la formulación (por ejemplo, IM para ADN en PBS, IP para ADN complejado con lípidos). Veintiún días después de la inmunización, se recolectan los esplenocitos y se reestimulan durante 1 semana en presencia de péptidos que codifican cada epítopo que se prueba. Estas células efectoras (CTL) se analizan para la citólisis de células diana marcadas con cromo-51 cargadas con péptido utilizando técnicas estándar. La lisis de células diana sensibilizadas por carga de MHC de péptidos correspondientes a epítopos codificados por minigene demuestra la función de vacuna de ADN para la inducción in vivo de CTL.
[0321] También se pueden usar péptidos para obtener CTL ex vivo. El CTL resultante puede usarse para tratar tumores crónicos en pacientes que lo necesiten y que no respondan a otras formas convencionales de terapia, o que no respondan a un enfoque de terapia con vacuna peptídica. Las respuestas de CTL ex vivo a un antígeno tumoral particular se inducen incubando en cultivo tisular las células precursoras de CTL del paciente (CTLp) junto con una fuente de células presentadoras de antígeno (APC) y el péptido apropiado. Después de un tiempo de incubación adecuado (normalmente de 1 a 4 semanas), en el que los CTLp se activan y maduran y se expanden en CTL efectores, las células se vuelven a infundir en el paciente, donde destruyen su célula diana específica (es decir, una célula tumoral) . Para optimizar las condiciones in vitro para la generación de células T citotóxicas específicas, se mantiene el cultivo de células estimuladoras en un medio libre de suero apropiado.
[0322] Antes de la incubación de las células estimuladoras con las células que se van a activar, por ejemplo, células CD8+ precursoras, se añade una cantidad de péptido antigénico al cultivo de células estimuladoras, en cantidad suficiente para cargarse en las moléculas de Clase I humanas que se van a expresar en la superficie de las células estimuladoras. En la presente invención, una cantidad suficiente de péptido es una cantidad que permite que aproximadamente 200, y preferiblemente 200 o más, moléculas MHC de Clase I humanas cargadas con péptido se expresen en la superficie de cada célula estimuladora. Preferiblemente, las células estimuladoras se incuban con >2 |jg/ml de péptido. Por ejemplo, las células estimuladoras se incuban con > 3, 4, 5, 10, 15 o más jg/m l de péptido.
[0323] A continuación, las células CD8+ en reposo o precursoras se incuban en cultivo con las células estimuladoras adecuadas durante un período de tiempo suficiente para activar las células CD8+. Preferiblemente, las células CD8+ se activan de manera específica para el antígeno. La proporción de células CD8+ precursoras o en reposo (efectoras) a células estimuladoras puede variar de un individuo a otro y puede depender además de variables tales como la susceptibilidad de los linfocitos de un individuo a las condiciones de cultivo y la naturaleza y gravedad de la enfermedad u otra condición para que se utiliza la modalidad de tratamiento descrita. Preferiblemente, sin embargo, la proporción de linfocitos:células estimuladoras está en el intervalo de aproximadamente 30: 1 a 300: 1. El cultivo efector/estimulador puede mantenerse durante el tiempo que sea necesario para estimular un número terapéuticamente utilizable o efectivo de células CD8+.
[0324] La inducción de CTL in vitro requiere el reconocimiento específico de péptidos que se unen a moléculas MHC de clase I específicas de alelo en APC. El número de complejos MHC/péptido específicos por APC es crucial para la estimulación de CTL, particularmente en las respuestas inmunitarias primarias. Mientras que pequeñas cantidades de complejos de péptido/MHC por célula son suficientes para hacer que una célula sea susceptible a la lisis por CTL, o para estimular una respuesta secundaria de CTL, la activación exitosa de un precursor de CTL (pCTL) durante la respuesta primaria requiere una cantidad significativamente mayor de MHC. /complejos peptídicos. La carga de péptidos de moléculas vacías del complejo principal de histocompatibilidad en las células permite la inducción de respuestas primarias de linfocitos T citotóxicos.
[0325] Dado que no existen líneas celulares mutantes para cada alelo del MHC humano, es ventajoso usar una técnica para eliminar los péptidos endógenos asociados al m Hc de la superficie de APC, seguido de cargar las moléculas de MHC vacías resultantes con los péptidos inmunogénicos de interés. . El uso de células no transformadas (no tumorigénicas), no infectadas y, preferiblemente, células autólogas de pacientes como APC es deseable para el diseño de protocolos de inducción de CTL dirigidos al desarrollo de terapias de CTL ex vivo. Esta solicitud describe procedimientos para separar los péptidos endógenos asociados al MHC de la superficie de APC seguido de la carga de los péptidos deseados.
[0326] Una molécula de MHC de clase I estable es un complejo trimérico formado por los siguientes elementos: 1) un péptido generalmente de 8 a 10 residuos, 2) una cadena de proteína polimórfica pesada transmembrana que lleva el sitio de unión del péptido en su al y a2 dominios, y 3) una cadena ligera no polimórfica asociada de forma no covalente, microglobuina p2. La eliminación de los péptidos unidos y/o la disociación de la microglobulina p2 del complejo hace que las moléculas del MHC de clase I no funcionen y sean inestables, lo que da como resultado una degradación rápida. Todas las moléculas de MHC de clase I aisladas de PBMC tienen péptidos endógenos unidos a ellas. Por lo tanto, el primer paso es eliminar todos los péptidos endógenos unidos a las moléculas MHC de clase I en el APC sin causar su degradación antes de que se les puedan agregar péptidos exógenos.
[0327] Dos formas posibles de liberar moléculas MHC de clase I de péptidos unidos incluyen bajar la temperatura de cultivo de 37 °C a 26 °C durante la noche para desestabilizar p2microglobulina y extraer los péptidos endógenos de la célula usando un tratamiento ácido suave. Los procedimientos liberan péptidos previamente unidos en el entorno extracelular, lo que permite que nuevos péptidos exógenos se unan a las moléculas de clase I vacías. El procedimiento de incubación a temperatura fría permite que los péptidos exógenos se unan de manera eficiente al complejo MHC, pero requiere una incubación durante la noche a 26 °C, lo que puede ralentizar la tasa metabólica de la célula. También es probable que las células que no sintetizan activamente moléculas de MHC (por ejemplo, PBMC en reposo) no produzcan grandes cantidades de moléculas de MHC de superficie vacía mediante el procedimiento de temperatura fría.
[0328] La extracción con ácido fuerte implica la extracción de los péptidos con ácido trifluoroacético, pH 2, o la desnaturalización con ácido de los complejos de péptido de clase I purificados por inmunoafinidad. Estos procedimientos no son viables para la inducción de CTL, ya que es importante eliminar los péptidos endógenos mientras se preserva la viabilidad de APC y un estado metabólico óptimo que es fundamental para la presentación de antígenos. Se han usado soluciones ácidas suaves de pH 3 tales como glicina o tampones de citrato - fosfato para identificar péptidos endógenos y para identificar epítopos de células T asociados a tumores. El tratamiento es especialmente eficaz, ya que solo se desestabilizan las moléculas del MHC de clase I (y se liberan los péptidos asociados), mientras que otros antígenos de superficie permanecen intactos, incluidas las moléculas del MHC de clase II. Lo que es más importante, el tratamiento de las células con soluciones ácidas suaves no afecta a viabilidad o estado metabólico de las células. El tratamiento con ácido suave es rápido ya que la eliminación de los péptidos endógenos se produce en dos minutos a 4 °C y el APC está listo para realizar su función después de cargar los péptidos apropiados. La técnica se utiliza aquí para hacer APC específicas de péptido para la generación de CTL específicos de antígeno primario. Las APC resultantes son eficaces para inducir CTL CD8+ específicos de péptido.
[0329] Las células CD8+ activadas pueden separarse eficazmente de las células estimuladoras usando uno de una variedad de procedimientos conocidos. Por ejemplo, pueden utilizarse anticuerpos monoclonales específicos para las células estimuladoras, para los péptidos cargados en las células estimuladoras o para las células CD8+ (o un segmento de las mismas) para unirse a su ligando complementario apropiado. A continuación, las moléculas marcadas con anticuerpos pueden extraerse de la mezcla de células estimuladoras-efectoras mediante medios apropiados, por ejemplo, mediante procedimientos de inmunoprecipitación o inmunoensayo bien conocidos.
[0330] Las cantidades citotóxicas efectivas de las células CD8+ activadas pueden variar entre los usos in vitro e in vivo, así como con la cantidad y el tipo de células que son el objetivo final de estas células asesinas. La cantidad también puede variar dependiendo de la condición del paciente y debe ser determinada considerando todos los factores apropiados por parte del médico. Preferiblemente, sin embargo, aproximadamente 1 X 106 a aproximadamente 1 X 1012, más preferiblemente aproximadamente 1 X 108 a aproximadamente 1 X 1011, e incluso más preferiblemente, aproximadamente 1 X 109 a aproximadamente 1 X 1010 células CD8+ activadas son utilizado para humanos adultos, en comparación con aproximadamente 5 X 106 - 5 X 107células utilizadas en ratones.
[0331] Preferiblemente, como se analiza en el presente documento, las células CD8+ activadas se recogen del cultivo celular antes de la administración de las células CD8+ al individuo que se está tratando. Sin embargo, es importante señalar que, a diferencia de otras modalidades de tratamiento presentes y propuestas, el presente procedimiento utiliza un sistema de cultivo celular que no es tumorigénico. Por lo tanto, si no se logra la separación completa de las células estimuladoras y las células CD8+ activadas, no se conoce ningún peligro inherente asociado con la administración de una pequeña cantidad de células estimuladoras, mientras que la administración de células promotoras de tumores de mamíferos puede ser extremadamente peligrosa.
[0332] Los procedimientos para reintroducir componentes celulares son conocidos en la técnica e incluyen procedimientos como los ejemplificados en la Patente de EE.UU. No. 4.844.893 de Honsik, et al. y la Patente de EE.UU. N° 4.690.915 de Rosenberg. Por ejemplo, es apropiada la administración de células CD8+ activadas mediante infusión intravenosa.
[0333] La práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que están dentro del alcance del experto en la materia. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía, tales como "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook, 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984); "Animal Cell Culture" (Freshney, 1987); "Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Wei, 1996); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller and Calos, 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis, 1994); "Current Protocols in Immunology" (Coligan, 1991). Estas técnicas son aplicables a la producción de los polinucleótidos y polipéptidos de la descripción y, como tales, pueden considerarse en la fabricación y práctica de la invención. Las técnicas particularmente útiles para realizaciones particulares se discuten en las siguientes secciones.
Procedimientos Terapéuticos
[0334] La presente descripción proporciona procedimientos para inducir una respuesta inmunitaria específica de neoplasia/tumor en un sujeto, vacunar contra una neoplasia/tumor, tratar y/o aliviar un síntoma de cáncer en un sujeto mediante la administración al sujeto de una vacuna contra la neoplasia o un péptido neoantigénico o composición de la divulgación.
[0335] Según la presente invención, la vacuna contra la neoplasia descrita en el presente documento o la composición inmunogénica se puede usar para un paciente al que se le ha diagnosticado cáncer o está en riesgo de desarrollar cáncer. En una realización, el paciente puede tener un tumor sólido como el de mama, ovario, próstata, pulmón, riñón, gástrico, colon, testículo, cabeza y cuello, páncreas, cerebro, melanoma y otros tumores de órganos tisulares y tumores hematológicos, tales como como linternas y leucemias, incluyendo leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, leucemia linfocítica crónica, leucemia linfocítica de células T y linternas de células B.
[0336] El péptido o la composición de la descripción se administran en una cantidad suficiente para inducir una respuesta de CTL.
[0337] Las composiciones y procedimientos descritos en el presente documento se pueden usar en pacientes que los necesiten con cualquier cáncer según el proceso de flujo general que se muestra en la FIG. 2. Los pacientes que lo necesiten pueden recibir una serie de vacunas de sensibilización con una mezcla de péptidos tumorales específicos personalizados. Además, durante un período de 4 semanas, el cebado puede ir seguido de dos refuerzos durante una fase de mantenimiento. Todas las vacunas se administran por vía subcutánea. La vacuna o composición inmunogénica se evalúa en cuanto a seguridad, tolerabilidad, respuesta inmunitaria y efecto clínico en pacientes y en cuanto a la viabilidad de producir vacuna o composición inmunogénica e iniciar con éxito la vacunación dentro de un marco de tiempo apropiado. La primera cohorte puede constar de 5 pacientes y, una vez demostrada adecuadamente la seguridad, se puede inscribir una cohorte adicional de 10 pacientes.
Kits de vacunas o compuestos inmunogénicos y coenvasado
[0338] En un caso, la divulgación proporciona kits que contienen uno cualquiera o más de los elementos discutidos aquí para permitir la administración de la vacuna o composición inmunogénica. Los elementos se pueden proporcionar individualmente o en combinaciones, y se pueden proporcionar en cualquier recipiente adecuado, como un vial, una botella o un tubo. En algunas realizaciones, el kit incluye instrucciones en uno o más idiomas, por ejemplo, en más de un idioma. En algunos casos, un kit comprende uno o más reactivos para usar en un proceso que utiliza uno o más de los elementos descritos en este documento. Los reactivos pueden proporcionarse en cualquier recipiente adecuado. Por ejemplo, un kit puede proporcionar uno o más amortiguadores de entrega o almacenamiento. Los reactivos pueden proporcionarse en una forma que sea utilizable en un proceso particular, o en una forma que requiera la adición de uno o más componentes antes de su uso (por ejemplo, en forma concentrada o liofilizada). Un tampón puede ser cualquier tampón, incluidos, pero no se limitan a, un tampón de carbonato de sodio, un tampón de bicarbonato de sodio, un tampón de borato, un tampón Tris, un tampón MOPS, un tampón HEPES y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el tampón es alcalino. En algunas realizaciones, el tampón tiene un pH de aproximadamente 7 a aproximadamente 10. En algunos casos, el kit comprende uno o más de los vectores, proteínas y/o uno o más de los polinucleótidos descritos en el presente documento. El kit puede ventajosamente permitir la provisión de todos los elementos de los sistemas de la divulgación. Los kits pueden incluir vectores y/o partículas y/o nanopartículas que contengan o codifiquen ARN para 1-50 o más mutaciones de neoantígeno para administrar a un animal, mamífero, primate, roedor, etc. ., incluyendo dicho kit instrucciones para administrar a dicha eucariota, así como instrucciones para usar con cualquiera de los procedimientos de la presente invención.
[0339] En un caso, el kit contiene al menos un vial con una vacuna o composición inmunogénica. En un caso, los kits pueden comprender componentes listos para usar que se mezclan y están listos para usar. La composición de vacuna o inmunogénica lista para usar puede comprender viales separados que contienen diferentes grupos de composiciones inmunogénicas. Las composiciones inmunogénicas pueden comprender un vial que contiene un vector viral o un plásmido de ADN y el otro vial puede comprender una proteína inmunogénica. En otro caso, un kit puede contener una composición inmunogénica o una vacuna en una forma lista para ser reconstituida. La composición inmunogénica o de vacuna puede secarse por congelación o liofilizarse. El kit puede comprender un vial separado con un tampón de reconstitución que se puede agregar a la composición liofilizada para que esté lista para administrar. El tampón puede comprender ventajosamente un adyuvante o una emulsión según la presente invención. En otra realización, el kit puede comprender viales individuales que contienen una dosis de composición inmunogénica. En otro aspecto, se incluyen múltiples viales para que un vial se administre según una línea de tiempo de tratamiento. En una realización adicional, los viales están etiquetados para su correcta administración a un paciente que lo necesite. El inmunógeno puede estar en forma liofilizada, en forma seca o en solución acuosa como se describe en este documento. El inmunógeno puede ser un virus vivo atenuado, una proteína o un ácido nucleico como se describe en el presente documento.
[0340] En otro caso, el kit puede comprender viales separados para una composición inmunogénica para usar en la preparación de una respuesta inmunológica y otra composición inmunogénica para usar como refuerzo. En un caso, la composición inmunogénica de cebado podría ser ADN o un vector viral y la composición inmunogénica de refuerzo podría ser una proteína. Cualquiera de las composiciones puede estar liofilizada o lista para administrar.
Ejemplos
Ejemplo 1
Protocolo de prueba de vacunas contra el cáncer
[0341] Las composiciones y procedimientos descritos en el presente documento pueden probarse en 15 pacientes con melanoma de alto riesgo (estadios IIIB, IIIC y IVM1a,b completamente resecados) según el proceso de flujo general que se muestra en la FIG. 2. Los pacientes pueden recibir una serie de vacunas de preparación con una mezcla de péptidos específicos de tumores personalizados y poli-ICLC durante un período de 4 semanas seguido de dos refuerzos durante una fase de mantenimiento. Todas las vacunas se administran por vía subcutánea. La vacuna o composición inmunogénica se evalúa en cuanto a seguridad, tolerabilidad, respuesta inmunitaria y efecto clínico en pacientes y en cuanto a la viabilidad de producir vacuna o composición inmunogénica e iniciar con éxito la vacunación dentro de un marco de tiempo apropiado. La primera cohorte puede constar de 5 pacientes y, una vez demostrada adecuadamente la seguridad, se puede inscribir una cohorte adicional de 10 pacientes. La sangre periférica se monitoriza extensamente para determinar las respuestas de células T específicas de péptido y se siguen los pacientes durante hasta 2 años para evaluar la recurrencia de la enfermedad.
[0342] Como se describe en este documento, existe una gran cantidad de evidencia tanto en animales como en humanos de que los epítopos mutados son eficaz para inducir una respuesta inmunitaria y que los casos de regresión tumoral espontánea o la supervivencia a largo plazo se correlacionan con respuestas de células T CD8+ a epítopos mutados (Buckwalter y Srivastava PK. "Son los antígenos, estúpido" y otros lecciones de más de una década de vacciterapia del cáncer humano. Seminars in immunology 20:296-300 (2008); Karanikas et al, Alta frecuencia de linfocitos T citolíticos dirigidos contra un antígeno mutado específico de tumor detectable con HLA tetrámeros en la sangre de un paciente con carcinoma de pulmón con larga supervivencia. Cáncer Res. 61:3718-3724 (2001); Lennerz et al, La respuesta de las células T autólogas a un melanoma humano está dominada por neoantígenos mutados. Proc Natl Acad Sci U S A.102:16013 (2005)) y que la "inmunoedición" se puede rastrear hasta alteraciones en la expresión de mutaciones dominantes antígenos en ratones y humanos (Matsushita et al, Cancer exome analysis reveals a T-cell-dependent mechanism of cancer immunoediting Nature). inmunoedición Nature 482:400 (2012); DuPage et al, Expression of tumor-specific antigens underlies cancer immunoediting Nature 482:405 (2012); y Sampson et al, Escape inmunológico después de una supervivencia libre de progresión prolongada con vacunación con péptido de la variante III del receptor del factor de crecimiento epidérmico en pacientes con glioblastoma recién diagnosticado J Clin oncol. 28:4722-4729 (2010)).
[0343] La secuenciación de próxima generación ahora puede revelar rápidamente la presencia de mutaciones discretas, como mutaciones de codificación en tumores individuales, más comúnmente cambios de un solo aminoácido (por ejemplo, mutaciones scon cambio de sentido) y, con menos frecuencia, nuevos tramos de aminoácidos generados por inserciones/eliminaciones/fusiones de genes para desplazamiento de marcos, mutaciones de lectura completa en codones de terminación y traducción de intrones empalmados incorrectamente (por ejemplo, neoORF). Los NeoORF son particularmente valiosos como inmunógenos porque la totalidad de su secuencia es completamente nueva para el sistema inmunitario y, por lo tanto, son análogas a un antígeno extraño viral o bacteriano. Por lo tanto, los neoORF: (1) son muy específicos del tumor (es decir, no hay expresión en ninguna célula normal); (2) puede eludir la tolerancia central, aumentando así la frecuencia de precursores de CTL específicos de neoantígeno. Por ejemplo, el poder de utilizar secuencias extrañas análogas en una vacuna terapéutica contra el cáncer se demostró recientemente con péptidos derivados del virus del papiloma humano (VPH). ~50% de los 19 pacientes con enfermedad preneoplásica inducida por virus que recibieron 3 - 4 vacunas de una mezcla de péptidos de VPH derivados de los oncogenes virales E6 y E7 mantuvieron una respuesta completa durante >24 meses (Kenter et al, Vaccination contra las oncoproteínas HpV-16 para la neoplasia intraepitelial vulvar NEJM 361:1838 (2009)).
[0344] La tecnología de secuenciación ha revelado que cada tumor contiene múltiples mutaciones específicas del paciente que alteran el contenido de codificación de proteínas de un gen. Tales mutaciones crean proteínas alteradas, que van desde cambios de un solo aminoácido (causados por mutaciones de sentido erróneo) hasta la adición de regiones largas de secuencias de aminoácidos novedosas debido a cambios de marco, lectura completa de codones de terminación o traducción de regiones de intrones (mutaciones de marco de lectura abierto novedosas; neoORF). Estas proteínas mutadas son objetivos valiosos para la respuesta inmunitaria del huésped al tumor ya que, a diferencia de las proteínas nativas, no están sujetas a los efectos de amortiguación inmunitaria de la autotolerancia. Por lo tanto, es más probable que las proteínas mutadas sean inmunogénicas y también más específicas para las células tumorales en comparación con las células normales del paciente.
[0345] Utilizando algoritmos mejorados recientemente para predecir qué mutaciones scon cambio de sentido crean péptidos de unión fuerte a las moléculas MHC afines del paciente, se identifica y prioriza un conjunto de péptidos representativos de los epítopos mutados óptimos (tanto neoORF como sin sentido) para cada paciente y hasta 20 o más péptidos son preparado para la inmunización (Zhang et al, Competencia de aprendizaje automático en inmunología - Predicción de péptidos de unión a HLA de clase I J Immunol Methods 374:1 (2011); Lundegaard et al Predicción de epítopos usando procedimientos basados en redes neuronales J Immunol Methods 374:26 (2011) )). Los péptidos de ~20-35 aminoácidos de longitud se sintetizan porque estos péptidos "largos" se someten a una internalización, procesamiento y presentación cruzada eficientes en células presentadoras de antígenos profesionales, como las células dendríticas, y se ha demostrado que inducen CTL en humanos (Melief y van der Burg, Immunotherapy of established (pre)malignant disease by synthetic long peptide vaccines Nature Rev Cancer 8:351 (2008)).
[0346] Además de un inmunógeno potente y específico, una respuesta inmunitaria eficaz incluye de forma ventajosa un adyuvante fuerte para activar el sistema inmunitario (Speiser y Romero, Molecularly defined vaccines for cáncer immunotherapy, and protector T cell immune Seminars in Immunol 22:144 (2010)). Por ejemplo, los receptores tipo Toll (TLR) han surgido como poderosos sensores de "señales de peligro" de patógenos microbianos y virales, que inducen de manera efectiva al sistema inmunitario innato y, a su vez, al sistema inmunitario adaptativo (Bhardwaj y Gnjatic, TLR AGONISTS: Are They Good Adjuvants?, Cancer J. 16:382-391 (2010)). Entre los agonistas de TLR, el poli-ICLC (un imitador sintético de ARN de doble cadena) es uno de los activadores más potentes de las células dendríticas derivadas de mieloides. En un estudio de voluntarios humanos, Se ha demostrado que poli-ICLC es seguro e induce un perfil de expresión génica en células de sangre periférica comparable al inducido por una de las vacunas virales atenuadas vivas más potentes, la vacuna contra la fiebre amarilla YF-17D (Caskey et al, Synthetic double- el ARN de cadena induce respuestas inmunitarias innatas similares a una vacuna viral viva en humanos J Exp Med 208:2357 (2011)). Hiltonol®, se utiliza como adyuvante una preparación GMP de poli-ICLC preparada por Oncovir, Inc.
Ejemplo 2
Población de pacientes diana
[0347] Los pacientes con melanoma en estadio IIIB, IIIC y IVM1a,b tienen un riesgo significativo de recurrencia de la enfermedad y muerte, incluso con resección quirúrgica completa de la enfermedad (Balch et al, versión final de 2009 AJCC Melanoma Staging and Classification J Clin Oncol 27:6199 - 6206 (2009)). Una terapia adyuvante sistémica disponible para esta población de pacientes es el interferón-a (IFNa), que brinda un beneficio medible pero marginal y está asociado con una toxicidad significativa, frecuentemente limitante de la dosis (Kirkwood et al, Interferon alfa-2b Adjuvant Therapy of High-Risk Resected Melanoma cutáneo: The Eastern Cooperative Oncology Group Trial EST 1684 J Clin Oncol 14:7-17 (1996), Kirkwood et al, High-and Low-dosis Interferon Alpha-2b in High-Risk Melanoma: First Analysis of Intergroup Trial E1690/ S9111/C9190 J Clin Oncol 18:2444 - 2458 (2000)). Estos pacientes no están inmunocomprometidos por una terapia anterior dirigida contra el cáncer o por un cáncer activo y, por lo tanto, representan una excelente población de pacientes en la que evaluar la seguridad y el impacto inmunológico de la vacuna. Por último, el estándar de atención actual para estos pacientes no exige ningún tratamiento después de la cirugía, lo que permite una ventana de 8 a 10 semanas para la preparación de la vacuna.
[0348] La población diana son pacientes con melanoma cutáneo con metástasis ganglionares (locales o distantes) o en tránsito clínicamente detectables, confirmadas histológicamente, que se han resecado completamente y están libres de enfermedad (la mayoría en etapa IIIB (debido a la necesidad de tener tejido tumoral para secuenciación y desarrollo de líneas celulares, se excluyen pacientes con tumor primario ulcerado pero ganglios linfáticos micrometastásicos (T1-4b, N1a o N2a), todos en estadio IIIC y estadio IVM1a, b). Estos pueden ser pacientes en el primer diagnóstico o en la recurrencia de la enfermedad después del diagnóstico previo de un melanoma en etapa anterior.
[0349] Recolección de tumor: los pacientes pueden someterse a una resección completa de su melanoma primario (si aún no se ha eliminado) y toda la enfermedad metastásica regional con la intención de liberarlos del melanoma. Después de recolectar el tumor adecuado para la evaluación patológica, el tejido tumoral restante se coloca en medios estériles en un recipiente estéril y se prepara para su desagregación. Se utilizan porciones del tejido tumoral para la secuenciación del transcriptoma y el exoma completo y la generación de líneas celulares, y cualquier tumor restante se congela.
[0350] Recolección de tejido normal: se toma una muestra de tejido normal (muestra de sangre o esputo) para la secuenciación del exoma completo.
[0351] Los pacientes con enfermedad metastásica locorregional clínicamente evidente o enfermedad metastásica ganglionar, cutánea o pulmonar distante totalmente resecable (pero ausencia de enfermedad metastásica visceral o distante no resecable) se identifican y se inscriben en el estudio. Es necesario ingresar a los pacientes antes de la cirugía para adquirir tejido tumoral fresco para el desarrollo de líneas celulares de melanoma (para generar células objetivo para ensayos de citotoxicidad in vitro como parte del plan de monitoreo inmunológico).
Ejemplo 3
Dosis y pauta
[0352] Para los pacientes que han cumplido todos los criterios de pretratamiento, la administración de la vacuna puede comenzar tan pronto como sea posible después de que haya llegado el fármaco del estudio y haya cumplido con las especificaciones entrantes. Para cada paciente, hay cuatro fármacos de estudio separados, cada uno de los cuales contiene 5 de 20 péptidos específicos del paciente. Las inmunizaciones generalmente pueden proceder según el programa que se muestra en la FIG. 3.
[0353] Los pacientes son tratados en una clínica ambulatoria. La inmunización en cada día de tratamiento puede consistir en cuatro inyecciones subcutáneas de 1 ml, cada una en una extremidad separada para apuntar a diferentes regiones del sistema linfático para reducir la competencia antigénica. Si el paciente se ha sometido a una disección completa de los ganglios linfáticos axilares o inguinales, las vacunas se administran en el diafragma derecho o izquierdo como alternativa. Cada inyección puede consistir en 1 de los 4 fármacos del estudio para ese paciente y el mismo fármaco del estudio se inyecta en la misma extremidad para cada ciclo. La composición de cada inyección de 1 ml es:
0,75 ml del fármaco del estudio que contiene 300 |jg de cada uno de los 5 péptidos específicos del paciente 0,25 ml (0,5 mg) de 2 mg/ml de poli-ICLC (Hiltonol ®)
[0354] Durante la fase de inducción/cebado, los pacientes son inmunizados los días 1, 4, 8, 15 y 22. En la fase de mantenimiento, los pacientes pueden recibir dosis de refuerzo en las semanas 12 y 24.
[0355] Las muestras de sangre se pueden obtener en múltiples puntos de tiempo: antes (línea de base; dos muestras en días diferentes); día 15 durante la vacunación de cebado; cuatro semanas después de la vacunación de inducción/cebado (semana 8); antes (semana 12) y después (semana 16) del primer refuerzo; Antes (semana 24) y después (semana 28) del segundo refuerzo, se recogen 50 - 150 ml de sangre para cada muestra (excepto la semana 16). El punto final inmunológico primario es en la semana 16 y, por lo tanto, los pacientes pueden someterse a leucaféresis (a menos que se indique lo contrario según la evaluación del médico y del paciente).
Ejemplo 4
Monitoreo inmunológico
[0356] La estrategia de inmunización es un enfoque de "primación-refuerzo", que implica una serie inicial de inmunizaciones poco espaciadas para inducir una respuesta inmunitaria seguida de un período de descanso para permitir que se establezcan las células T de memoria. A esto le sigue una inmunización de refuerzo, y se espera que la respuesta de células T 4 semanas después de este refuerzo genere la respuesta más fuerte y sea el criterio de valoración inmunológico primario. La respuesta inmunológica global se controla inicialmente utilizando células mononucleares de sangre periférica a partir de este momento en un ensayo ELISPOT ex vivo de 18 h, estimulando con un grupo de péptidos 15mer superpuestos (superposición de 11 aa) que comprende todos los epítopos inmunizantes. Las muestras previas a la vacunación se evalúan para establecer la respuesta inicial a este conjunto de péptidos. Como se garantiza, se evalúan muestras de PBMC adicionales para examinar la cinética de la respuesta inmunitaria a la mezcla de péptidos totales. Para los pacientes que demuestran respuestas significativamente por encima de la línea de base, el grupo de todos los 15 mers se desconvolucionan para determinar qué péptido(s) inmunizante(s) particular(es) eran inmunogénicos. Además, se realizan una serie de ensayos adicionales caso por caso para las muestras apropiadas:
- El grupo completo o subgrupos de 15 mer se utilizan como péptidos estimulantes para ensayos de tinción de citocinas intracelulares para identificar y cuantificar poblaciones de memoria central y memoria efectora, CD4+, CD8+ específicas de antígeno.
- De manera similar, estos grupos se utilizan para evaluar el patrón de citocinas secretadas por células para determinar el fenotipo TH1 frente a TH2
- La tinción de citoquinas extracelulares y la citometría de flujo de células no estimuladas se utilizan para cuantificar las células supresoras derivadas de mieloides y Treg (MDSC).
- Si se establece con éxito una línea celular de melanoma a partir de un paciente que responde y se puede identificar el epítopo activador, se realizan ensayos de citotoxicidad de células T utilizando el mutante y el péptido de tipo salvaje correspondiente.
- Las PBMC del criterio de valoración inmunológico primario se evalúan para la "propagación de epítopos" usando antígenos conocidos asociados a tumores de melanoma como estimulantes y usando varios epítopos mutados identificados adicionales que no se seleccionaron para estar entre los inmunógenos, como se muestra en la FIG. 4.
[0357] Se lleva a cabo inmunohistoquímica de la muestra de tumor para cuantificar las poblaciones infiltrantes de CD4+, CD8+, MDSC y Treg.
Ejemplo 5
Preparación de neoantígenos
[0358] Después de la resección quirúrgica del tumor, una parte del tejido tumoral y una muestra de sangre se transfieren inmediatamente a la instalación donde se le asigna un código de identificación único para un seguimiento posterior. El tejido tumoral se desagrega con colagenasa y se congelan porciones separadas para la extracción de ácido nucleico (ADN y ARN). La muestra de sangre se transfiere inmediatamente a una instalación para la extracción de ácido nucleico. El ADN y/o el ARN extraídos del tejido tumoral se utilizan para la secuenciación del exoma completo (por ejemplo, mediante el uso de la plataforma Illumina HiSeq) y para determinar la información de tipificación de HLA. Se contempla dentro del alcance de la presente invención que los péptidos neoantigénicos neoORF o sin sentido pueden identificarse directamente mediante técnicas basadas en proteínas (por ejemplo, espectrometría de masas).
[0359] Los análisis bioinformáticos se realizan como sigue. El análisis de secuencias de Exome y RNA - SEQ fast Q files aprovecha las canalizaciones bioinformáticas existentes que se han utilizado y validado ampliamente en proyectos a gran escala como el TCGA para muchas muestras de pacientes (por ejemplo, Chapman et al, 2011, Stransky et al, 2011, Berger et al., 2012). Hay dos categorías secuenciales de análisis: procesamiento de datos y análisis del genoma del cáncer.
[0360] Línea de procesamiento de datos: la plataforma de secuenciación desarrolló la tubería de procesamiento de datos de Picard (picard.sourceforge.net/). Los datos sin procesar extraídos de secuenciadores (por ejemplo, Illumina) para cada tumor y muestra normal se someten a los siguientes procesos utilizando varios módulos en la canalización de Picard:
(i) Conversión de datos: los datos sin procesar de Illumina se convierten al formato BAM estándar y se generan métricas de control de calidad básicas relacionadas con la distribución de bases que exceden diferentes umbrales de calidad.
(ii) Alineación: la herramienta de alineación de Burrows-Wheeler (BWA) se utiliza para alinear pares de lectura con el genoma humano (hg19).
(iii) Marcar duplicados: PCR y duplicados ópticos se identifican en función de las posiciones de mapeo de pares de lectura y se marcan en el archivo BAM final.
(iv) Realineación de Indel: se examinan las lecturas que se alinean con sitios polimórficos de inserción y eliminación conocidos en el genoma y se corrigen aquellos sitios donde la puntuación de probabilidad logarítmica (LOD) para la mejora tras la realineación es de al menos 0,4.
(v) Recalibración de la calidad: las puntuaciones de calidad base originales notificadas por la canalización de Illumina se recalibran en función del ciclo de lectura, el carril, el mosaico de la celda de flujo, la base en cuestión y la base anterior. La recalibración asume que todas las discrepancias en las posiciones que no son dbSNP se deben a errores que permiten recalibrar la probabilidad de error en cada categoría de interés como la fracción de discrepancias entre el número total de observaciones.
(vi) Control de calidad: el archivo BAM final se procesa para generar métricas de control de calidad exhaustivas, incluida la calidad de lectura por ciclo, la distribución de las puntuaciones de calidad, el resumen de la alineación y la distribución del tamaño del inserto. Los datos que fallan en el control de calidad se incluyen en la lista negra. (vii) Verificación de identidad: los datos de genotipo de muestra recogidos ortogonalmente en ~100 posiciones SNP conocidas se comparan con los datos de secuencia para confirmar la identidad de la muestra. Una puntuación LOD de > 10 se utiliza como umbral para la confirmación de la identidad. Los datos que fallan en el control de calidad de identidad se incluyen en la lista negra.
(viii) Agregación de datos: Todos los datos de la misma muestra se fusionan y se repite el paso de marcar duplicados. Se identifican nuevas regiones diana que contienen supuestas inserciones cortas y regiones de deleción y se realiza el paso de realineación indel en estos loci.
(ix) Realineación local alrededor de putativos indels en datos agregados: se identifican nuevas regiones de destino que contienen supuestas inserciones y eliminaciones cortas y se realiza un paso de realineación local en estos loci (por ejemplo, usando los módulos GATK RealignerTargetCreator e IndelRealigner) para garantizar la consistencia y corrección de llamadas indel.
(x) Control de calidad de los datos agregados: se vuelven a calcular las métricas de control de calidad, como el resumen de alineación y la distribución del tamaño del inserto. Además, se genera un conjunto de métricas que evalúan la tasa de daño oxidativo en los primeros pasos del proceso de construcción de bibliotecas causado por el corte acústico del ADN en presencia de contaminantes reactivos del proceso de extracción.
[0361] La salida de Picard es un archivo bam (Li et al, 2009) (ver, por ejemplo, http://samtools.sourceforge.net/SAM1.pdf) que almacena las secuencias base, las puntuaciones de calidad y los detalles de alineación para todas las lecturas para la muestra dada.
[0362] Líneas de detección de mutación del cáncer: el tumor y los archivos bam normales coincidentes de la canalización de Picard se analizan como se describe en el presente documento:
1. Control de calidad
(i) . El programa Capseg se aplica a muestras de tumores y exomas normales emparejados para obtener los perfiles de número de copias. La herramienta CopyNumberQC se puede usar para inspeccionar manualmente los perfiles generados y evaluar las mezclas de muestras tumorales/normales. Las muestras normales que tienen perfiles ruidosos, así como los casos en los que la muestra del tumor tiene una variación del número de copias más baja que la normal correspondiente, se marcan y rastrean a través de las canalizaciones de análisis y generación de datos para comprobar si hay confusiones.
(ii) . La pureza y la ploidía del tumor se estiman mediante la herramienta ABSOLUTE 15 en función de los perfiles de número de copias generados por Capseg. Perfiles muy ruidosos pueden resultar de la secuenciación de muestras altamente degradadas. En tales casos, no sería posible realizar estimaciones de la pureza y la ploidía del tumor y se marca la muestra correspondiente.
(iii) . ContEst (Cibulskis et al, 2011) se utiliza para determinar el nivel de contaminación cruzada en las muestras. Las muestras con más del 4% de contaminación se desechan.
2. Identificación de variaciones somáticas de un solo nucleótido (SSNV)
Las sustituciones de pares de bases somáticas se identifican analizando el tumor y los bams normales emparejados de un paciente utilizando un marco estadístico bayesiano llamado muTect (Cibulskis et al, 2013). En el paso de preprocesamiento, se filtran las lecturas con una preponderancia de bases de baja calidad o discrepancias con el genoma. Mutect a continuación calcula dos puntajes de probabilidades logarítmicas (LOD) que encapsulan la confianza en la presencia y ausencia de la variante en las muestras de tumor y normales, respectivamente. En la etapa de posprocesamiento, las mutaciones candidatas se filtran mediante seis filtros para tener en cuenta los artefactos de captura, secuenciación y alineación:
(i) Espacio proximal: elimina los falsos positivos que surgen debido a la presencia de indeles desalineados en las cercanías del evento. Se rechazan las muestras con > 3 lecturas con inserciones o deleciones en una ventana de 11 pb alrededor de la mutación candidata.
(ii) Mapeo deficiente: descarta los falsos positivos que surgen en virtud de la ubicación ambigua de las lecturas en el genoma. Rechaza candidatos si > 50% de lecturas en tumor y muestras normales tienen calidad de mapeo cero o si no hay lecturas que albergan el alelo mutante con calidad de mapeo > 20.
(iii) Sitios trialeleicos: descarta sitios que son heterocigotos en la normal ya que estos tienen una tendencia a generar muchos falsos positivos.
(iv) Sesgo de cadenas: elimina los falsos positivos causados por errores de secuenciación específicos del contexto donde una gran fracción de las lecturas que albergan la mutación tienen la misma orientación. Rechaza candidatos donde el LOD específico de la hebra es < 2 donde la sensibilidad para pasar ese umbral es > 90%.
(v) Posición agrupada: rechaza falsos positivos debido a errores de alineación caracterizados por el alelo alternativo que ocurre a una distancia fija desde el inicio o el final de la alineación de lectura. Se rechaza si la distancia mediana desde el inicio y el final de las lecturas es < 10, lo que implica que la mutación se encuentra al inicio o al final de la alineación, o si la desviación absoluta mediana de las distancias es < 3, lo que implica que las mutaciones están agrupadas. . (vi) Observado en el control: descarta falsos positivos en el tumor donde hay evidencia de ocurrencia del alelo alternativo en la muestra normal más allá de lo esperado por errores de secuenciación aleatoria. Rechaza si hay > 2 lecturas que contienen el alelo alternativo en la muestra normal o si están en > 3 % de las lecturas, y si la suma de sus puntajes de calidad es > 20.
Además de estos 6 filtros, los candidatos se comparan con un panel de muestras normales y aquellas que se encuentran presentes como variantes de la línea germinal en dos o más muestras normales son rechazadas. El conjunto final de mutaciones se puede anotar con la herramienta Oncotator en varios campos, incluidos los cambios en la región genómica, el codón, el ADNc y la proteína.
3. Identificación de pequeñas inserciones y deleciones somáticas
La salida de realineación local descrita en este documento (consulte "Realineación local en torno a indeles putativos en datos agregados", supra) se usa para predecir indeles somáticos y de línea germinal candidatos en función de la evaluación de lecturas que respaldan la variante exclusivamente en tumor o tanto en tumor y bams normales respectivamente. Se realiza un filtrado adicional basado en el número y la distribución de las discrepancias y las puntuaciones de calidad base (McKenna et al, 2010, DePristo et al, 2011). Todos los indels se inspeccionan manualmente con Integrated Genomics Viewer (Robinson et al, 2011) (www.broadinstitute.org/igv) para garantizar llamadas de alta fidelidad.
4. Detección de fusión de genes
El primer paso en el proceso de detección de la fusión de genes es la alineación de las lecturas de RNA-Seq del tumor con una biblioteca de secuencias de genes conocidas, seguida del mapeo de esta alineación con las coordenadas genómicas. El mapeo genómico ayuda a colapsar múltiples pares de lectura que se asignan a diferentes variantes de transcripción que comparten exones en ubicaciones genómicas comunes. Se consulta el archivo bam alineado con el ADN en busca de pares de lectura en los que los dos compañeros se asignan a dos regiones de codificación diferentes que están en cromosomas diferentes o separadas por al menos 1 MB si están en el mismo cromosoma. También se puede requerir que los extremos del par estén alineados en sus genes respectivos en la dirección consistente con la dirección codificación->codificación 5'->3' del transcrito de ARNm de fusión (putativo). Una lista de pares de genes donde hay al menos dos de estos 'quiméricos' los pares de lectura se enumeran como la lista de eventos putativos inicial sujeta a un mayor refinamiento. A continuación, todas las lecturas no alineadas se extraen del archivo bam original, con la restricción adicional de que sus compañeros se alinearon originalmente y se mapearon en uno de los genes en los pares de genes obtenidos como se describe en este documento. A continuación, se puede intentar alinear todas las lecturas originalmente no alineadas con la "referencia" personalizada construida de todas las posibles uniones exón-exón (longitud completa, límite a límite, en la codificación 5'-> 3' dirección) entre el descubierto pares de genes. Si una de esas lecturas originalmente no alineadas se asigna (únicamente) a una unión entre un exón del gen X y un exón del gen Y, y su pareja se asignó de hecho a uno de los genes X o Y, entonces dicha lectura se marca como " fusión", se lee. Los eventos de fusión de genes se llaman en los casos en los que hay al menos una lectura de fusión en la orientación relativa correcta con respecto a su pareja, sin un número excesivo de desajustes alrededor de la unión exón:exón y con una cobertura de al menos 10 pb en cualquiera de los genes. Las fusiones de genes entre genes altamente homólogos (por ejemplo, la familia HLA) probablemente sean falsas y se filtren.
5. Estimación de la clonalidad.
El análisis bioinformático se puede utilizar para estimar la clonalidad de las mutaciones. Por ejemplo, el algoritmo ABSOLUTE (Carter et al, 2012, Landau et al, 2013) se puede utilizar para estimar la pureza del tumor, la ploidía, el número absoluto de copias y la clonalidad de las mutaciones. Las distribuciones de densidad de probabilidad de las fracciones alélicas de cada mutación se generan seguidas de la conversión en fracciones de células cancerosas (CCF) de las mutaciones. Las mutaciones se clasifican como clonales o subclonales en función de si la probabilidad posterior de su CCF que excede 0,95 es mayor o menor que 0,5 respectivamente.
6. Cuantificación de la expresión
La zona TopHat (Langmead et al, 2009) se usa para alinear las lecturas de RNA-Seq para el tumor y emparejar bams normales con el genoma hg19. La calidad de los datos de RNA-Seq se evalúa mediante el paquete RNA-SeQC (DeLuca et al., 2012). La herramienta RSEM (Li et al., 2011) se puede utilizar entonces para estimar los niveles de expresión de genes e isotermas. Las lecturas generadas por kilobase por millón y las estimaciones de tau se utilizan para priorizar los neoantígenos identificados en cada paciente como se describe en otra parte.
7. Validación de mutaciones en RNA-Seq
8. Confirmación de las mutaciones somáticas identificadas mediante el análisis de los datos del exorna completo tal como se describe en este documento (incluidas las variaciones de un solo nucleótido, las inserciones y deleciones pequeñas y las fusiones de genes) se evalúa examinando el archivo BAM del tumor RNA-Seq correspondiente del paciente. Para cada locus variante, se realiza un cálculo de potencia basado en la distribución binomial beta para garantizar que haya al menos un 95 % de potencia para detectarlo en los datos de RNA-Seq. Una mutación identificada por captura se considera validada si hay al menos 2 lecturas que alberguen la mutación para sitios con potencia adecuada.
[0363] Selección de epítopos que contienen mutaciones específicas de tumores: todas las mutaciones con cambio de sentido y los neoORF se analizan para detectar la presencia de epítopos que contienen mutaciones utilizando el algoritmo basado en redes neuronales netMHC, proporcionado y mantenido por el Centro de Análisis de Secuencias Biológicas, Universidad Técnica de Dinamarca , Países Bajos. Esta familia de algoritmos se calificó como los mejores algoritmos de predicción de epítopos en base a una competición recientemente completada entre una serie de enfoques relacionados (ref). Los algoritmos se entrenaron utilizando un enfoque basado en redes neuronales artificiales en 69 alelos HLA A y B humanos diferentes que cubren el 99% de los alelos HLA-A y el 87% de los alelos HLA-B que se encuentran en la población caucásica, el principal grupo étnico en la población objetivo de pacientes en el área local. Se utiliza la versión más actualizada (v2.4).
[0364] La precisión de los algoritmos se evaluó realizando predicciones a partir de mutaciones encontradas en pacientes con CLL para los que se conocían los alotipos HLA. Los alotipos incluidos fueron A0101, A0201, A0310, A1101, A2402, A6801, B0702, B0801, B1501. Se realizaron predicciones para todos los péptidos de 9 unidades y 10 unidades que abarcan cada mutación utilizando netMHCpan a mediados de 2011. En base a estas predicciones, se sintetizaron setenta y cuatro (74) péptidos de 9 unidades y sesenta y tres (63) péptidos de 10 unidades, la mayoría con afinidades predichas por debajo de 500 nM, y se midió la afinidad de unión usando un ensayo de unión competitiva (Sette).
[0365] Las predicciones para estos péptidos se repitieron en marzo de 2013 usando cada una de las versiones más actualizadas de los servidores netMHC (netMHCpan, netMHC y netMHCcons). Estos tres algoritmos fueron los algoritmos mejor calificados entre un grupo de 20 utilizados en una competción en 2012 (Zhang et al). A continuación, se evaluaron las afinidades de unión observadas con respecto a cada una de las nuevas predicciones. Para cada conjunto de valores pronosticados y observados, se proporciona el % de predicciones correctas para cada intervalo, así como el número de muestras. La definición de cada intervalo es la siguiente:
0 -150: Predicho para tener una afinidad igual o inferior a 150 nM y medido para tener una afinidad igual o inferior a 150 nM.
0 -150*: Predicho para tener una afinidad igual o inferior a 150 nM y medido para tener una afinidad igual o inferior a 500 nM.
151 - 500 nM: Predicha para tener una afinidad superior a 150 nM pero igual o inferior a 500 nM y medido para tener una afinidad igual o inferior a 500 nM.
FN (> 500 nM): falsos negativos: Predicho para tener una afinidad superior a 500 nM, pero medido para tener una afinidad igual o inferior a 500 nM.
[0366] Para los péptidos de 9 unidades (Tabla 1), hubo poca diferencia entre los algoritmos, con el valor ligeramente más alto para el intervalo de 151-500 nM para netMHCcons que no se consideró significativo debido al bajo número de muestras.
Tabla 1
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[0367] Para los péptidos de 10 unidades (Tabla 2), nuevamente hubo poca diferencia entre los algoritmos, excepto que netMHC produjo significativamente más falsos positivos que netMHCpan o netMMHCcons. Sin embargo, la precisión de las predicciones de 10 unidades es ligeramente menor en los intervalos de 0 - 150 nM y 0 - 150 * nM y significativamente menor en el intervalo de 151-500 nM, en comparación con los de 9 unidades.
Tabla 2
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[0368] Para 10 unidades, solo se utilizan predicciones en el intervalo de 0 a 150 nM debido a la precisión inferior al 50 % para los aglutinantes en el intervalo de 151 a 500 nM.
[0369] El número de muestras para cualquier alelo HLA individual era demasiado pequeño para sacar conclusiones con respecto a la precisión del algoritmo de predicción para diferentes alelos. Los datos del subconjunto más grande disponible (0 -150 * nM; 9 unidades) se muestran en la Tabla 3 como ejemplo.
[0370] Solo se utilizan predicciones para los alelos HLA A y B ya que hay pocos datos disponibles sobre los que juzgar la precisión de las predicciones para los alelos HLA C (Zhang et al).
Tabla 3
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[0371] Se realizó una evaluación de la información de la secuencia del melanoma y las predicciones de unión de péptidos utilizando información de la base de datos TCGA. La información de 220 melanomas de diferentes pacientes reveló que, en promedio, había aproximadamente 450 cambios de sentido y 5 neoORF por paciente. Se seleccionaron 20 pacientes al azar y se calcularon las afinidades de unión predichas para todas las mutaciones de cambio de sentido y neoORF usando netMHC (Lundegaard et al Prediction of epitopes using neural network based methods J Immunol Methods 374:26 (2011)). Como los alotipos HLA eran desconocidos para estos pacientes, el número de péptidos de unión previstos por alotipo se ajustó en función de la frecuencia de ese alotipo (conjunto de datos del registro de médula ósea para la población dominante afectada esperada en el área geográfica [caucásico para melanoma]) para generar un número previsto de epítopos mutantes accionables por paciente. Para cada uno de estos epítopos mutantes (MUT), también se predijo la unión del epítopo nativo (NAT) correspondiente.
Utilizando la priorización descrita en este documento:
[0372]
- Se predijo que el 90% (18 de 20) de los pacientes tenían al menos 20 péptidos apropiados para la vacunación; - Para casi una cuarta parte de los pacientes, los péptidos neoORF podrían constituir la mitad de los 20 péptidos; - Para poco más de la mitad de los pacientes, solo se utilizarían los péptidos de las categorías 1 y 2;
- Para el 80% de los pacientes, solo se utilizarían los péptidos de las categorías 1, 2 y 3.
[0373] Por lo tanto, hay un número suficiente de mutaciones en el melanoma para esperar que una alta proporción de pacientes genere un número adecuado de péptidos inmunogénicos.
Ejemplo 6
Producción y formulación de péptidos
[0374] Los péptidos neoantigénicos GMP para la inmunización se preparan mediante síntesis química (Merrifield RB: Solid phase peptide synthesis. I. THe synthesis of tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85:2149-54, 1963) según las regulaciones de la FDA. Se han realizado tres proceso de desarrollo de 20 péptidos de ~20-30 unidades cada uno. Cada proceso se llevó a cabo en las mismas instalaciones y utilizó el mismo equipo que se usa para los ciclos de GMP, utilizando borradores de registros de lotes de GMP. Cada proceso produjo con éxito > 50 mg de cada péptido, que se probaron mediante todas las pruebas de liberación planificadas actualmente (por ejemplo, apariencia, identificación por MS, pureza por RP-HPLC, contenido por nitrógeno elemental y contenido de t Fa por RP-HPLC) y cumplieron la especificación objetivo cuando corresponda. Los productos también se produjeron dentro del plazo previsto para esta parte del proceso (aproximadamente 4 semanas). Los péptidos en volumen liofilizados se colocaron en un estudio de estabilidad a largo plazo y se evaluaron en varios puntos de tiempo hasta 12 meses.
[0375] El material de estos procesos se ha utilizado para probar el enfoque de disolución y mezcla planificado. Brevemente, cada péptido se disuelve a alta concentración (50 mg/ml) en DMSO al 100 % y se diluye hasta 2 mg/ml en un disolvente acuoso. Inicialmente, se anticipó que se usaría PBS como diluyente, sin embargo, la formación de sal en una pequeña cantidad de péptidos provocó una turbidez visible. Se demostró que D5W (5% de dextrosa en agua) es mucho más efectivo; 37 de 40 péptidos se diluyeron con éxito hasta una solución transparente. También es eficaz sacarosa al 10 % o trehalosa al 10 % en agua. La formulación que contiene 10 % de sacarosa o 10 % de trehalosa es liofilizable a diferencia de la formulación que contiene 5 % de dextrosa. Los únicos péptidos problemáticos son los péptidos muy hidrofóbicos.
[0376] La Tabla 4 muestra los resultados de las evaluaciones de solubilidad de 60 péptidos neoantígenos potenciales, ordenados en base a la fracción calculada de aminoácidos hidrofóbicos. Tal como se muestra, casi todos los péptidos con una fracción hidrófoba inferior a 0,4 son solubles en DMSO/D5W, pero varios péptidos con una fracción hidrófoba superior o igual a 0,4 no fueron solubles en DMSO/D5W (indicado por resaltado en rojo en la columna etiquetada como "Solubilidad en DMSO/D5W"). Varios de estos se pueden solubilizar mediante la adición de succinato (indicado mediante resaltado en verde en la columna "Solubilidad en DMSO/D5W/Succinato"). 3 de 4 de estos péptidos tenían fracciones hidrófobas entre 0,4 y 0,43. Cuatro péptidos se volvieron menos solubles tras la adición de succinato; 3 de 4 de estos péptidos tenían una fracción hidrófoba mayor o igual a 0,45.
Tabla 4
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[0377] Se evalúan las propiedades bioquímicas pronosticadas de los péptidos inmunizantes planificados y los planes de síntesis pueden modificarse en consecuencia (usando un péptido más corto, desplazando la región que se va a sintetizar en la dirección N- o C-terminal alrededor del epítopo predicho, o utilizando potencialmente un péptido alternativo) para limitar el número de péptidos con una fracción hidrofóbica alta.
[0378] Se sometieron diez péptidos separados en DMSO/D5W a dos ciclos de congelación/descongelación y mostraron una recuperación completa. Se disolvieron dos péptidos individuales en DMSO/D5W y se estabilizaron a dos temperaturas (-20°C y -80°C). Estos péptidos se evaluaron (RP-HPLC y pH e inspección visual) durante un máximo de 24 semanas. Ambos péptidos son estables hasta durante 24 semanas; el porcentaje de impurezas detectadas por el ensayo RP-HPLC no cambió significativamente para ninguno de los péptidos cuando se almacenaron a -20 °C o -80 °C. Cualquier pequeño cambio parece deberse a la variabilidad del ensayo, ya que no se observaron tendencias para evaluar.
[0379] Tal como se muestra en la FIG. 5, el diseño del proceso de forma de dosificación consiste en preparar 4 conjuntos de péptidos específicos del paciente que consisten 5 péptidos cada uno. Se ha preparado y calificado un ensayo de RP-HPLC para evaluar estas mezclas de péptidos. Este ensayo logra una buena resolución de múltiples péptidos dentro de una sola mezcla y también puede usarse para cuantificar péptidos individuales.
[0380] Se usa filtración por membrana (tamaño de poro de 0,2 pm) para reducir la carga biológica y realizar la esterilización final del filtro. Inicialmente se evaluaron cuatro tipos diferentes de filtros de tamaño apropiado y se seleccionó el filtro Pall, PES (# 4612). Hasta la fecha, se han preparado 4 mezclas diferentes de 5 péptidos diferentes cada una y se han filtrado individualmente de forma secuencial a través de dos filtros PES. La recuperación de cada péptido individual se evaluó utilizando el ensayo RP-HPLC. Para 18 de los 20 péptidos, la recuperación después de dos filtraciones fue >90%. Para dos péptidos altamente hidrófobos, la recuperación fue inferior al 60 % cuando se evaluaron a pequeña escala, pero se recuperaron casi por completo (87 y 97 %) a escala. Tal como se establece en este documento, se llevan a cabo enfoques para limitar la naturaleza hidrofóbica de las secuencias seleccionadas.
[0381] Se preparó un conjunto de péptidos (Grupo 4) que consistía en cinco péptidos mediante disolución en DMSO, dilución con D5W/succinato (5 mM) hasta 2 mg/ml y combinación hasta una concentración de péptido final de 400 pg por ml y una concentración final en DMSO del 4%. Después de la preparación, los péptidos se filtraron con un filtro Pall PES de 25 mm (Cat # 4612) y se dispensaron en viales Nunc Cryo (# 375418) en alícuotas de un ml. Las muestras se analizaron a tiempo cero y a las 2 y 4 semanas hasta la fecha. Se analizaron muestras adicionales a las 8 y 24 semanas. A -80 °C, no se observaron cambios significativos en los perfiles de HPLC ni en el perfil de impurezas del conjunto de péptidos 4 en el punto de tiempo de cuatro semanas. Hasta el punto de tiempo de 4 semanas, la observación visual y el pH del conjunto de péptidos no cambiaron.
Ejemplo 7
Síntesis de péptidos
[0382] Los péptidos GMP se sintetizan mediante química estándar de péptidos sintéticos en fase sólida (por ejemplo, utilizando sintetizadores de péptidos CS 536 XT) y se purifican mediante RP-HPLC. Cada péptido individual se analiza mediante una variedad de ensayos calificados para evaluar la apariencia (visual), la pureza (RP-HPLC), la identidad (por espectrometría de masas), la cantidad (nitrógeno elemental) y el contraión trifluoroacetato (RP-HPLC) y se libera.
[0383] Los péptidos de neoantígeno personalizados pueden estar compuestos por hasta 20 péptidos distintos únicos para cada paciente. Cada péptido puede ser un polímero lineal de ~20 — 30 L-aminoácidos unidos por enlaces peptídicos estándar. El extremo amino puede ser una amina primaria (NH2-) y el extremo carboxi es un grupo carbonilo (-COOH). Se utilizan los 20 aminoácidos estándar que se encuentran comúnmente en las células de los mamíferos (alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina). El peso molecular de cada péptido varía en función de su longitud y secuencia y se calcula para cada péptido.
[0384] Los aminoácidos protegidos con Fmoc (9-fluorenilmetoiloxicarbnil)-N-terminal se utilizan para todas las reacciones de síntesis. Las cadenas laterales de los aminoácidos están protegidas por los grupos 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonil (Pbf), trifenilmetilo (Trt), t-butiloxicarbonilo (Boc) o t-butil éter (tBu), según corresponda. Todos los aminoácidos voluminosos se disuelven en dimetilformamida (DMF). La condensación utiliza las siguientes dos combinaciones de catalizadores en reacciones separadas:
Diisopilcarbodiimida/1-hidroxibenzotriazol (DIC/HOBT)
Diisopropiletilamina/ hexafluorofosfato de 2-(1H-Benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (DIEA/HBTU)
[0385] Cada aminoácido se acopla dos veces para asegurar un alto nivel de incorporación. El primer acoplamiento utiliza DIC/HOBT durante 2 a 6 horas y el segundo acoplamiento utiliza DIEA/HBTU durante 1 a 2 horas. Cada uno de los dos acoplamientos se controla mediante absorbancia UV y la resina se lava extensamente con DMF entre ciclos de acoplamiento para mejorar la eficiencia. Después de dos ciclos de acoplamiento, la eficiencia de acoplamiento calculada debe ser al menos del 95 % para continuar con el siguiente ciclo. Se detiene la síntesis adicional de cualquier péptido que no alcance esa eficiencia de acoplamiento mínima.
[0386] Después de acoplar todos los aminoácidos, la resina se lava dos veces con DMF y, a continuación, tres veces con metanol. A continuación, la resina se seca brevemente al vacío mientras aún está en el recipiente de reacción y, a continuación, se transfiere a un nuevo recipiente tarado para el secado al vacío (más de 12 horas) hasta que fluya libremente. La masa de péptido crudo sintetizado se determina pesando el recipiente que contiene resina seca, restando la masa del recipiente tarado y ajustando la masa de resina. Los rendimientos en masa esperados oscilan entre el 60 % y el 90 %. Cualquier síntesis que no consiga producir al menos 200 mg de péptido crudo se termina. La resina seca se puede almacenar a 4°C durante hasta 28 días antes del inicio de la escisión.
[0387] La reacción de escisión se lleva a cabo en una habitación individual. Antes de la transferencia del conjunto de resinas secas específicas del paciente desde la sala de síntesis a la sala de escisión, la sala de escisión está totalmente cualificada por QA para la síntesis de un nuevo producto GMP. La calificación incluye la inspección de espacio libre de línea, la verificación de la limpieza de la zona GMP, la organización de todos los materiales y la cristalería requeridos, la verificación de la idoneidad y el etiquetado del equipo, y la verificación de que todo el personal requerido esté debidamente capacitado y calificado para realizar el trabajo y esté debidamente vestido y libre de aparentes enfermedades.
[0388] Las operaciones de preparación de la sala se inician con la verificación del equipo a utilizar (rotavaporador, bomba de vacío, balanza) y la inspección de la documentación que indique que el equipo ha sido debidamente limpiado y calibrado (si corresponde). El control de calidad (QA) emite una lista completa de todas las materias primas requeridas (TFA, triisopropilsilano (TIS) y 1,2-etanoditiol) y la fabricación identifica el número de lote que se utilizará, la fecha de reevaluación o caducidad y la cantidad de material dispensado para las reacciones de cada día.
[0389] La escisión de la cadena peptídica de la resina y la escisión de los grupos protectores de la cadena lateral se logran en condiciones ácidas (TFA al 95 %) en presencia de triisopropilsilano (TIS) al 2% y 1,2-etanoditiol al 1% como secuestrantes de radicales libres generados por ácido durante 3 a 4 horas a temperatura ambiente.
[0390] La resina se separa del péptido bruto libre mediante filtración. La solución final del péptido liberado y desprotegido se somete a precipitación con éter y el precipitado se liofiliza durante 12 horas. El rendimiento del péptido crudo liberado se determina pesando el polvo liofilizado y calculando la proporción de péptido crudo liberado/péptido unido a resina. Los rendimientos esperados de péptido crudo son de 200 mg a 1000 mg. Se termina cualquier reacción de escisión que no produzca al menos 200 mg de péptido crudo. A continuación, el péptido crudo se transfiere a la zona de purificación.
[0391] La purificación se lleva a cabo en una habitación individual. Antes de la transferencia del conjunto de péptidos crudos secos de la sala de separación a la sala de purificación, la sala de purificación está completamente calificada por Control de calidad para la síntesis de un nuevo producto GMP. La calificación incluye la inspección de espacio libre de línea, la verificación de la limpieza de la zona GMP, la organización de todos los materiales y la cristalería requeridos, la verificación de la idoneidad y el etiquetado del equipo, y la verificación de que todo el personal requerido esté debidamente capacitado y calificado para realizar el trabajo y esté debidamente vestido y libre de aparentes enfermedad.
[0392] Las operaciones de preparación de la sala se inician con la verificación del equipo que se utilizará (cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa preparativa [RP-HPLC], balanza, cromatografía líquida analítica/espectrómetro de masas (LC/MS), liofilizador, balanza) y inspección de la documentación que indique que el equipo se ha limpiado y calibrado correctamente (si corresponde). El control de calidad y fabricación emite una lista completa de todas las materias primas requeridas (ácido trifluoroacético [TFA], acetonitrilo [ACN], agua) que identifica el número de lote que se utilizará, la fecha de vencimiento o de reevaluación y la cantidad de material dispensado para las reacciones de cada día.
[0393] La purificación se inicia disolviendo no más de 200 mg del péptido liberado liofilizado en ACN. A continuación, la muestra se diluye aún más con agua al 5% -10% de ACN. Se añade TFA a una concentración final de 0,1%. Se empaqueta una columna C-18 RP-HPLC (10 cm x 250 cm) antes del inicio de cada conjunto de péptidos específicos del paciente. Las columnas se lavan exhaustivamente con acetonitrilo al 5 % que contiene TFA al 0,1 % antes de cargar el péptido del paciente. La cantidad máxima de péptido cargado en una sola columna es de 200 mg. Las columnas se controlan mediante observación UV a 220 nm. Después de la carga del péptido único, se permite que la muestra entre en la columna y la columna se lava con acetonitrilo al 5 %/TFA al 0,1 %. Se usa un gradiente del 10% al 50% de acetonitrilo con TFA al 0,1% para eluir el péptido. Las fracciones se recogen (50 ml cada una) comenzando en el punto en que la observación UV está en un 20 % por encima de la línea de base. Las fracciones continúan recogiéndose hasta que no se eluye más material absorbente de UV de la columna o hasta que se completa el gradiente. Normalmente, el pico de elución principal se separa en 4 a 8 fracciones.
[0394] Cada fracción individual se evalúa mediante LC/MS analítica. Las condiciones analíticas elegidas se basan en el porcentaje de acetonitrilo asociado con el producto eluido pico. Las fracciones con la masa esperada y una pureza superior o igual al 95 % se agrupan como producto peptídico. Por lo general, de 2 a 4 fracciones cumplen con este requisito de combinación. El péptido combinado se coloca en un frasco tarado para liofilizar y liofilizar durante 24 a 72 horas. La masa de péptido liofilizado se determina determinando la masa del frasco que contiene el péptido liofilizado y restando la masa del frasco tarado.
[0395] Las porciones del péptido liofilizado se transfieren al control de calidad para su análisis y disposición. El resto se almacena a -20°C antes de su posterior procesamiento.
[0396] Se desecha cualquier péptido para el que ninguna de las fracciones cumpla el requisito del 95 % de pureza. No puede producirse reprocesamiento de fracciones de RP-HPLC. Si se dispone de suficiente péptido liofilizado y escindido sin purificar, se puede purificar una segunda muestra del péptido en la columna, ajustando las condiciones del gradiente para mejorar la pureza del péptido eluido.
[0397] A continuación, la columna se puede limpiar de cualquier péptido restante lavando extensamente con 4 volúmenes de columna de ACN al 100 %/TFA al 0,1 % y a continuación volver a equilibrarse con ACN al 5 %/TFA al 0,1 % antes de cargar el siguiente péptido.
[0398] Los péptidos para un paciente individual se procesan secuencialmente en la misma columna. No se procesan más de 25 péptidos en una sola columna.
[0399] Las operaciones unitarias para la fabricación de sustancias farmacológicas constituyen así:
Síntesis:
Condensación, lavado y recondensación para cada aminoácido
Lavado de resina y secado al vacío
Transferencia a la zona de escisión
Escisión:
Escisión ácida de la resina
Separación del péptido liberado de la resina y precipitación del péptido
Transferencia a la zona de purificación
Purificación: Disolución en acetonitrilo y purificación por RP-HPLC
Liofilización de las fracciones máximas durante 24 a 72 horas
Extracción de alícuotas para pruebas de control de calidad y almacenamiento del producto liofilizado restante.
[0400] Los péptidos de neoantígeno personalizados se pueden suministrar como una caja que contiene viales Nunc Cryo de 2 ml con tapas codificadas por colores, conteniendo cada vial aproximadamente 1,5 ml de una solución congelada de DMSO/D5W que contiene hasta 5 péptidos a una concentración de 400 ug/ml. Puede haber de 10 a 15 viales para cada uno de los cuatro grupos de péptidos. Los viales deben almacenarse a -80 °C hasta su uso. Los estudios de estabilidad en curso respaldan la temperatura y el tiempo de almacenamiento.
[0401] Almacenamiento y estabilidad: Los péptidos de neoantígeno personalizados se almacenan congelados a -80°C. Los intermedios descongelados, filtrados de forma estéril, en proceso y la mezcla final de péptidos de neoantígeno personalizados y poli-ICLC pueden conservarse a temperatura ambiente, pero deben utilizarse en un plazo de 4 horas.
[0402] Compatibilidad: Los péptidos de neoantígeno personalizados se mezclan con 1/3 de volumen de poli-ICLC justo antes de su uso.
Ejemplo 8
Pruebas de formulación
[0403] Se observó turbidez o precipitación con ciertos péptidos en la solución de combinación de péptidos en algunas condiciones. Por lo tanto, se evaluó el efecto de los tampones débiles sobre la solubilidad y estabilidad del péptido.
[0404] Se encontró que la mezcla de poli-ICLC y el grupo de péptidos (en D5W con DMSO) a veces producía turbidez o precipitación, posiblemente debido al bajo pH de la solución de poli-ICLC, particularmente para péptidos hidrófobos. Para elevar el pH de la solución peptídica, se probaron los tampones y se evaluó el efecto sobre la solubilidad del péptido. Según las pruebas iniciales, se probaron los tampones de citrato y succinato.
[0405] Se encontró que se observó una solubilidad mejorada para 3 de 4 péptidos que tenían problemas de solubilidad en D5W solo. En base a esta observación inicial, se evaluaron 19 péptidos adicionales con citrato o succinato y 4 péptidos adicionales con succinato solo. Se encontró que las soluciones de 18 de los 19 péptidos probados eran claras cuando se usaba citrato de sodio (cuando se probó) o succinato de sodio como tampón (ninguno de los cuatro péptidos evaluados en succinato solo demostró turbidez).
[0406] Se encontró que las concentraciones de succinato de 2 mM a 5 mM eran eficaces. Se mejoró la recuperación de péptido para un péptido en tampón succinato, pero no en tampón citrato. Dependiendo del conjunto de péptidos y de la concentración de tampón de succinato utilizada, el pH de las soluciones de péptidos en D5W/succinato osciló entre aproximadamente 4,64 y aproximadamente 6,96.
[0407] Después de la evaluación de un total de 27 péptidos (incluido el grupo inicial difícil de solubilizar de 4 péptidos), se encontró que un péptido mostraba turbiedad de forma reproducible en todas las condiciones, y un péptido adicional mostraba una ligera turbidez, pero era completamente recuperable tras la filtración. Ambos de estos dos péptidos tenían alta hidrofobicidad.
[0408] En general, se encontró que los péptidos que son transparentes tras la dilución a 2 mg/ml en D5W con tampón de succinato retienen la claridad tras la mezcla con otros péptidos (esto es generalmente cierto para los péptidos en D5W solo).
[0409] En un procedimiento representativo, los péptidos se pesaron y se corrigieron para el % de contenido de péptido y a continuación se disolvieron en DMSO hasta una concentración de 50 mg/ml. A continuación, la solución de DMSO/péptido se diluyó con succinato de sodio 5 mM en D5W hasta una concentración de péptido de 2 mg/ml.
[0410] Se ensayaron condiciones adicionales de solubilidad del péptido. Los péptidos CS6709, CS6712, CS6720, CS6726 y CS6783 se pesaron en aproximadamente 10 mg cada uno. A continuación, los péptidos se disolvieron en aproximadamente 200 pl de DMSO de grado USP para obtener una concentración de 50 mg/ml para cada péptido. Los solicitantes observaron que el péptido CS6709 a 10,02 mg no se disolvía completamente en la cantidad de 200 pl de DMSO que se calculó para proporcionar 50 mg/ml. La muestra parecía estar turbia. Se agregaron incrementos adicionales de 50 pL de DMs O al Péptido CS6709 hasta 400 pL; para un total de 600 l de DMSO. CS6709 pasó a la solución (transparente) cuando la cantidad de DMSO alcanzó los 600 pL, la concentración fue de 16,67 mg/mL.
[0411] Para diluir los péptidos a 400 pg, se preparó una solución de PBS pH 7,4 sin potasio. Las 5 muestras de péptido DMSO (50 mg/mL) se colocaron en un solo vial para dilución a 400 pg/mL. Cada péptido de DMSO se añadió al vial a 40 pl, excepto CS6709, que tenía una concentración de 16,67 mg/ml. El volumen de CS6709 agregado al vial individual fue de 120 pl. Las muestras se diluyeron a 400 pg mediante la adición de 4,72 ml de PBS pH 7,4. Tras la adición de PBS pH 7,4, se observó que uno o más de los péptidos habían precipitado.
[0412] Para determinar cuál de los péptidos precipitó, los solicitantes siguieron la matriz de la Tabla 5 a continuación usando cantidades muy pequeñas (10-20 j L) de los péptidos disueltos en DMSO y agregando estos péptidos a los diversos líquidos.
T l : M riz il n i
Figure imgf000064_0001
[0413] Se encontró que CS6783 precipitaba cuando se añadía PBS pH 7,4 como diluyente a la mezcla peptídica. El D5W grado USP Inyectable es un diluyente sustituto del PBS pH 7.4.
[0414] Además, los solicitantes probaron una pequeña cantidad de cada péptido (< 1 mg) para ver si alguno de los 5 péptidos podía disolverse en D5W sin usar d Ms O. Los péptidos CS6709, c S6712, CS6720 y CS6726 podían disolverse directamente en D5W. CS6783 no se pudo disolver usando D5W.
Ejemplo 9
Formulación
[0415] Las formulaciones para cada paciente incluyen hasta 20 péptidos producidos individualmente como inmunógenos. Para la vacunación, se preparan cuatro grupos (hasta 5 péptidos cada uno) para inyección en sitios separados dirigidos a distintas partes del sistema linfático, tal como se describe en el presente documento. Los péptidos individuales se pesan, se disuelven en DMSO a alta concentración, se diluyen con dextrosa al 5% en agua (D5W) y succinato de sodio (4,8-5 mM) y se mezclan en cuatro grupos. Las mezclas individuales se filtran a través de un filtro de 0,2 jm para reducir la carga biológica, se dividen en alícuotas en viales y se congelan. Los viales congelados se almacenan congelados hasta su uso.
[0416] Tal como se describe en el presente documento, el conjunto de péptidos específicos del paciente que constituyen las sustancias farmacológicas se preparan, liofilizan, analizan y liberan individualmente, y se almacenan después de la fabricación. Para preparar estos péptidos para inyección, se identifican cuatro grupos compuestos por hasta 5 péptidos diferentes cada uno para combinarlos.
Ejemplo 10
Preparación de vacunas
[0417] Pesaje y disolución: En base al peso bruto y el contenido de péptidos, se pesan 15 mg (peso neto) o un poco más de cada péptido individual y se agrega DMSO al 100% de grado USP (2:250 j l) para lograr una concentración de péptido final de 50 mg/ml. Basado en estudios de desarrollo, >95% de los péptidos disueltos demuestran claridad en este punto.
[0418] Dilución y mezcla: se prepara y se filtra (0,2 J..tm) de D5W de grado USP que contiene succinato de sodio 5 mM (D5W/Succ) para usar como diluyente. Se diluyen 250 j l de cada péptido disuelto con D5W/Succ para reducir la concentración de péptido a 2 mg de péptido/ml y ajustar el pH a aproximadamente ~6,0. Cualquier péptido que no muestre una solución clara se reemplaza con otro péptido (o solución de D5W/succinato solo si no hay péptidos adicionales disponibles). A continuación, se combinan 5,5 ml de cada solución de péptido diluido en una combinación única que contiene 5 péptidos con cada péptido a una concentración de 400 jg de péptido/ml. A continuación, se realiza el primero de los dos pasos de filtración por membrana de 0,2 jm . Cada combinación se extrae en una jeringa Becton Dickson de 60 ml (o equivalente) equipada con una punta Leur Lock y una aguja roma de calibre 18. Se retira la aguja y se reemplaza con un filtro de membrana de 0,2 jm PALL PES (poliéter sulfona) de 25 mm (catálogo PALL HP1002). El contenido de la jeringa se transfiere a través del filtro a un tubo de polipropileno estéril de 50 ml (Falcon# 352070 o equivalente). Se extrae una alícuota de cada combinación para realizar la prueba y el resto se congela a -80°C. El resto de cada péptido diluido individual se almacena a -20 °C hasta que se completa todo el análisis.
[0419] Envío: Las combinaciones de péptidos congelados se envían usando contenedores de envío validados y aire durante la noche.
[0420] Filtración y Almacenamiento: Las combinaciones congeladas se descongelan y se transfieren a una cabina de bioseguridad. Se analiza una muestra de 2 ml de la cómbinación descongelada para determinar la esterilidad y la prueba de endotoxinas. La solución en volumen restante se procesa en un segundo de dos pasos de filtración por membrana de 0,2 |jm. El péptido combinado en volumen se extrae en una jeringa Becton Dickinson de 60 ml (o equivalente) equipada con una punta luer-lock y una aguja roma de calibre 18. Se retira la aguja y se reemplaza con un filtro de membrana de 0,2 jm PALL PES (poliéter sulfona) de 25 mm (catálogo PALL HP1002). El contenido de la jeringa se transfiere a través del filtro a un tubo de polipropileno estéril de 50 ml (Falcon# 352070 o equivalente). A continuación, se transfieren alícuotas de 1,5 ml de la solución peptídica de forma aséptica a quince viales Nunc Cryo estériles preetiquetados de 1,8 ml (N° de catálogo 375418). Los viales se tapan con una de las 4 tapas codificadas por colores. Se usa una tapa codificada por color diferente para cada una de las 4 combinaciones de péptidos para un solo paciente para ayudar en la identificación. Los viales se etiquetan con el nombre del paciente, número de registro clínico, número de estudio, identificador alfanumérico del producto/muestra original y el identificador alfanumérico único (AD). Todos los viales se congelan a -80 °C. Los viales congelados restantes se almacenan hasta que todas las pruebas de liberación hayan pasado los criterios de aceptación. No se programa la inmunización de los pacientes hasta que se completen todas las pruebas de liberación y el producto se envíe a la farmacia.
[0421] Alternativamente, en cada día de inmunización, un conjunto (cuatro) de viales que aún no han sido sometidos a filtración esterilizante dentro de una cabina de bioseguridad, tal como se describe en el presente documento, se descongelan y transfieren a una cabina de bioseguridad. El contenido de cada vial se extrae en jeringas separadas. Se une un filtro esterilizador de 0,2 jm y el contenido se transfiere a través del filtro a un vial estéril. El filtro se retira y se comprueba su integridad. A continuación, se extraen 0,75 ml de la mezcla peptídica utilizando una jeringa estéril y se mezclan mediante transferencia de jeringa a jeringa con 0,25 ml de poli-IcLc (Hiltonol®1.
[0422] Análisis: Se realizan tres pruebas (Apariencia, Identidad y Disolventes Residuales) como pruebas durante el proceso en una alícuota de los péptidos agrupados. La endotoxina se analiza en una alícuota del conjunto de péptidos descongelados antes de la filtración final. La esterilidad se analiza en las muestras combinadas de dos viales del producto final. Este enfoque se toma para asegurar que la información bioquímica clave (solubilidad del péptido, identidad de cada pico en cada combinación y niveles de cualquier solvente residual) esté disponible antes de realizar la filtración final. Una vez recibidos los conjuntos de péptidos a granel agrupados y filtrados, se realizan pruebas de endotoxinas y cultivos de microorganismos para evaluar la pureza microbiológica. Se requiere cumplir con la especificación de endotoxinas para el uso del producto. Cualquier resultado positivo en la prueba de cultivo microbiano se investiga para determinar el impacto en el uso del producto.
Ejemplo 11
Administración
[0423] Después de mezclar con los péptidos/polipéptidos neoantigénicos personalizados, la vacuna (por ejemplo, péptidos poli-ICLC) debe administrarse por vía subcutánea.
[0424] Preparación de agrupaciones de péptidos/polipéptidos neoantigénicos personalizados: los péptidos se mezclan en 4 agrupaciones de hasta 5 péptidos cada una. Los criterios de selección para cada combinación se basan en el alelo MHC particular al que se predice que se unirá el péptido.
[0425] Composición del grupo: La composición de los grupos se seleccionará en función del alelo HLA particular al que se predice que se unirá cada péptido. Las cuatro piscinas se inyectan en sitios anatómicos que drenan a cuencas de ganglios linfáticos separadas. Este enfoque se eligió para reducir potencialmente la competencia antigénica entre los péptidos que se unen al mismo alelo HLA tanto como sea posible e involucrar a un amplio subconjunto del sistema inmunitario del paciente en el desarrollo de una respuesta inmunitaria. Para cada paciente, se identifican los péptidos previstos para unirse a hasta cuatro alelos HLA A y B diferentes. Algunos péptidos derivados de neoORF no están asociados con ningún alelo HLA en particular. El enfoque para distribuir péptidos a diferentes conjuntos es distribuir cada conjunto de péptidos asociados con un alelo HLA particular en la mayor cantidad posible de los cuatro conjuntos. Es muy probable que haya situaciones en las que haya más de 4 péptidos predichos para un alelo dado, y en estos casos es necesario asignar más de un péptido asociado con un alelo particular al mismo grupo. Los péptidos neoORF que no están asociados con ningún alelo en particular se asignan aleatoriamente a las ranuras restantes. A continuación se muestra un ejemplo:
A1 HLAA0101 3 péptidos
A2 HLA A1101 5 péptidos
B1 HLA B0702 2 péptidos
B2 HLA B6801 7 péptidos
X NINGUNO (neoORF) 3 péptidos
Grupo# 1 2 3 4
B2 B2 B2 B2
B2 B2 B2 A2
A2 A2 A2 A2
A1 A1 A1 B1
A2 X X X
[0426] Los péptidos que se prevé que se unan al mismo alelo MHC se colocan en grupos separados siempre que sea posible. No se puede predecir que algunos de los péptidos neoORF se unan a ningún alelo del MHC del paciente. Sin embargo, estos péptidos todavía se utilizan, principalmente porque son completamente nuevos y, por lo tanto, no están sujetos a los efectos de amortiguación inmunitaria de la tolerancia central y, por lo tanto, tienen una alta probabilidad de ser inmunogénicos. Los péptidos NeoORF también tienen un potencial drásticamente reducido para la autoinmunidad ya que no hay una molécula equivalente en ninguna célula normal. Además, pueden surgir falsos negativos del algoritmo de predicción y es posible que el péptido contenga un epítopo HLA de clase II (los epítopos HLA de clase II no se predicen de manera confiable en base a los algoritmos actuales). Todos los péptidos no identificados con un alelo HLA particular se asignan aleatoriamente a los grupos individuales. Las cantidades de cada péptido se basan en una dosis final de 300 |jg de cada péptido por inyección.
[0427] Para cada paciente, el fabricante prepara cuatro grupos distintos (etiquetados como "A", "B", "C" y "D") de 5 péptidos sintéticos cada uno y se almacenan a -80 °C. El día de la inmunización, se prepara en la farmacia de investigación la vacuna completa que consiste en el(los) componente(s) peptídico(s) y poli-ICLC. Un vial de cada uno (A, B, C y D) se descongela a temperatura ambiente y se traslada a un gabinete de bioseguridad para los pasos restantes. Se extraen 0,75 ml de cada conjunto de péptidos del vial en jeringas separadas. Por separado, se retiran cuatro alícuotas de 0,25 ml (0,5 mg) de poli-ICLC en jeringas separadas. El contenido de cada jeringa que contiene el conjunto de péptidos se mezcla a continuación suavemente con una alícuota de 0,25 ml de poli-ICLC mediante transferencia de jeringa a jeringa. El ml entero de la mezcla se usa para inyección.
[0428] En cada día de inmunización, a los pacientes se les inyecta por vía subcutánea hasta cuatro conjuntos de péptidos de neoantígeno personalizados mezclados con poli-ICLC (Hiltonol®),
[0429] El volumen de inyección para cada mezcla de péptidos y Hiltonol®es de 1 ml.
[0430] Cada grupo de péptidos consta de hasta 5 péptidos, cada uno a una concentración de 400 jg/ml.
[0431] La composición del conjunto de péptidos es:
Hasta cinco péptidos cada uno a una concentración de 400 jg/ml.
DMSO al 4 %
Dextrosa al 4,8-5 % en agua
Succinato de sodio 5 mM
[0432] Hiltonol® consiste en:
2 mg/ml de poli I:poli C
1,5 mg/ml de poli-L-lisina
5 mg/ml de carboximetilcelulosa sódica
cloruro sódico al 0,9 %
[0433] Cada volumen de inyección de 1 ml consiste en 0,75 ml de uno de los cuatro conjuntos de péptidos mezclados con 0,25 ml de Hiltonol®. Después de la mezcla, la composición es:
Hasta cinco péptidos cada uno a una concentración de 300 jg/ml.
<3% DMSO
dextrosa al 3,6-3,7% en agua
3,6-3,7 mM de Succinato de sodio
0,5 mg/ml de poli I:poli C
0. 375 mg/ml de poli-L-lisina
1,25 mg/ml de carboximetilcelulosa sódica
cloruro de sodio al 0,225%
[0434] Inyecciones: en cada inmunización, cada uno de los 4 fármacos del estudio se inyecta subcutáneamente en una extremidad. Cada fármaco del estudio individual se administra en la misma extremidad en cada inmunización durante toda la duración del tratamiento (es decir, el fármaco del estudio A se inyectará en el brazo izquierdo los días 1, 4, 8, etc., el fármaco del estudio B se inyectará en el brazo derecho los días 1, 4, 8, etc.). Las ubicaciones anatómicas alternativas para los pacientes cuyo estado del eje posterior a una disección completa de los ganglios linfáticos axilares o inguinales son el diafragma izquierdo y derecho, respectivamente.
[0435] La vacuna se administra siguiendo un programa de sensibilización/refuerzo. Las dosis de sensibilización de la vacuna se administran los días 1, 4, 8, 15 y 22, tal como se muestra en este documento. En la fase de refuerzo, la vacuna se administra los días 85 (semana 13) y 169 (semana 25).
[0436] Se evalúa la toxicidad de todos los pacientes que reciben al menos una dosis de vacuna. Se evalúa la actividad inmunológica de los pacientes si han recibido todas las vacunas durante la fase de inducción y la primera vacunación (refuerzo) durante la fase de mantenimiento.
Ejemplo 12
Estabilidad a temperatura ambiente a corto plazo de la forma farmacéutica final
[0437] Estabilidad de los péptidos. Se preparó un conjunto de péptidos (Grupo 3) que consistía en los cinco péptidos que se muestran en la Tabla 6 a continuación mediante disolución en DMSO y dilución con D5W/succinato (2 mM) hasta 2 mg/ml y combinación hasta una concentración de péptido final de 400 |jg por ml y una concentración final de DMSO del 4%. Después de la preparación, los péptidos se filtraron con un filtro Pall PES de 25 mm (Cat# 4612) y se dispensaron en viales Nunc Cryo (# 375418) en alícuotas de un ml.
Tabla 6: Péptidos y secuencias del grupo 3
Figure imgf000067_0001
[0438] Se prepararon tres muestras mezclando 0,75 ml del grupo 3 con 0,25 ml de Hiltonol® como estaba previsto para la preparación de la forma de dosificación. A continuación, las muestras se dejaron a temperatura ambiente durante 0, 4 y 6 horas y se analizaron mediante RP-HPLC (Tabla 7). No se observaron cambios para 4 de los 5 péptidos. Se observó un ligero aumento en un segundo pico asociado con el péptido CS6919, aumentando del 14% al 17% y al 18% a las 4 y 6 horas, respectivamente. Como se señaló en un estudio de estabilidad a -20 °C, los péptidos CS6919 y CS6934 (ambos representados en el grupo 4) pueden formar un heterodímero (tal como se muestra por espectrometría de masas) que eluye en la posición de esta impureza. La recuperación de todos los péptidos fue superior al 90 %, lo que indica que no hubo degradación ni pérdida de ningún péptido en la forma de dosificación final después de 6 horas de incubación a temperatura ambiente.
Tabla 7 Estabilidad resumida del grupo 3 después de la mecla con Hiltonol® e incubación a temperatura ambiente
Figure imgf000068_0001
[0439] Estabilidad de poli-ICLC. En un segundo estudio, se utilizó otro grupo de péptidos (grupo 4), se mezcló con Hiltonol® (0,75 ml de grupo de péptidos 0,25 ml de Hiltonol®) y se almacenó a temperatura ambiente durante 6 horas. La mezcla de péptido Hiltonol ® incubada a temperatura ambiente y Hiltonol® solo (que se almacenó continuamente a 4°C), a continuación se diluyeron hasta 20 ug/ml de poli-ICLC y se ensayaron para la estimulación de TLR utilizando células dendríticas de ratón según los procedimientos publicados. Después de 24 horas de estimulación, se usó PCR cuantitativa para evaluar los niveles de inducción de una serie de marcadores inmunitarios clave, tal como se muestra en la figura 6. No hubo diferencia en la capacidad estimulante de poli-ICLC después de 6 horas a temperatura ambiente con conjuntos de péptidos en la formulación final, lo que indica que Hiltonol® no se vio afectado por ningún componente de la formulación (DMSO[4%], D5W, 5 mM de succinato, péptidos) y fue estable en la forma de dosificación final hasta 6 horas a temperatura ambiente.
Ejemplo 13
Liofilización de la Forma de Formulación Final
[0440] La formulación de péptidos es la siguiente: cada conjunto de péptidos consiste en hasta 5 péptidos, cada uno a una concentración de 400 pg/ml. La composición del conjunto de péptidos es:
Hasta cinco péptidos cada uno a una concentración de 400 pg/ml
DMSO al 4 - 8 %
Dextrosa al 4,6 - 4,8 % en agua
Succinato de sodio 5 mM
[0441] El agente de carga que se usa para la estabilización es Dextrosa en agua (D5W). La formulación final se basa en las propiedades térmicas de la matriz de formulación. Los datos de calorimetría de barrido diferencial modulada (MDSC) sugirieron la presencia de dos temperaturas de transición vitrea (Tg') a -24 °C y -56 °C, respectivamente, y una reacción exotérmica a -67 °C debido a la fusión de DMSO. Según la literatura, la transición vítrea de D5W es de -43 °C. Los datos de MDSC sugieren que la presencia de DMSO reduce aún más la temperatura de transición vítrea. Basándose en esta información, se comprobó la viabilidad de la liofilización de los péptidos utilizando dos agentes de carga adicionales, sacarosa y trehalosa. Las siguientes formulaciones se evaluaron con análisis MDSC (FIG. 7-9):
1. D5W al 5 % y DMSO al 0,8 %
2. Sacarosa al 10 % y DMSO al 0,8 %
3. Trehalosa al 10 % y DMSO al 0,8 %
[0442] Las formulaciones anteriores se liofilizaron usando un ciclo de liofilización conservador por congelación - 50 °C durante 3 horas, secado primario a -35 °C a 75 mtorr durante 30 horas y a -30 °C durante 30 horas (FIG. 10 y 11). La formulación que contenía D5W-DMSO colapsó por completo, aunque se observó una torta parcial para la formulación que contenía D5W solo. Los resultados de la liofilización sugieren que en presencia de DMSo al 0,8%, la formulación que contiene trehalosa o sacarosa es más compatible para la liofilización que la formulación que contiene dextrosa (Figura 12).
[0443] Las muestras (25 j l ) se analizaron mediante MDSC usando el siguiente programa. Los siguientes parámetros se utilizaron para monitorear los eventos térmicos:
1. Equilibrar a 20,00 °C
2. Isotérmico durante 5,00 min
3. Modular /-1,00 °C cada 60 segundos
4. Almacenamiento de datos: ON
5. Rampa de 1,00 °C/min hasta -70 °C
6. Equilibrar a -70 °C
7. Isotérmico durante 5,00 min
8. Rampa de 1,00 °C/min a 20,00 °C
9. Equilibrado a 20,00 °C
10. Almacenamiento de datos: OFF
11. Isotérmico durante 5 minutos
12. Fin del procedimiento
[0444] Liofilización. Se usó MDSC para determinar la temperatura de transición vítrea (Tg) que se usa para seleccionar la temperatura primaria de secado y congelación de los productos (Tabla 8 y FIG. 7-9). Los datos indican que la fusión de DMSO ocurre alrededor de -68°C en todas las formulaciones. Hubo dos transiciones vítreas para las 3 formulaciones. La formulación que contiene dextrosa, trehalosa o sacarosa tiene la transición vítrea de flujo de calor más baja de -59 °C, -42 °C y -50 °C, respectivamente, lo que sugiere que es difícil liofilizar la formulación que contiene D5W-DMSO sin colapsar/derretirse.
Tabla 8: Análisis MDSC de sacarosa al 10 % DMSO al 08 %
Figure imgf000069_0001
[0445] La liofilización se probó inicialmente con viales Nunc, y se encontró que la configuración de los viales Nunc no era adecuada para liofilizar la matriz de formulación. Se liofilizó un ml de una formulación de D5W al 5 % y DMSO al 0,8 % en cuatro viales Nunc estériles de 1,8 ml (Thermo Scientific) utilizando el ciclo de liofilización (congelación a -50 °C y mantenimiento durante 2 horas, secado primario a -15 °C durante 20 horas a 75 mtorr y 8 horas de secado secundario a 20°C con 75 mtorr de presión). Se observó que no había torta en los viales y se observaron DMSO y D5W líquido residual en forma de pequeñas gotas de líquido en el fondo de los viales Nunc.
[0446] Se eligió el vial de pedernal adecuado para la liofilización para determinar la viabilidad de la liofilización de la formulación principal. Se llenaron cinco viales que contenían 1,5 ml de cada formulación en viales de pedernal de 13 mm de 3 ml y se cerraron parcialmente con un tapón para liofilización de 13 mm y se mantuvieron en el estante medio de Lyostar II para la liofilización.
[0447] Es difícil liofilizar una formulación que tiene una transición vítrea por debajo de -50°C. En base a la temperatura de transición vítrea, se establecieron los siguientes parámetros de liofilización conservadora para la liofilización (Tabla 9). Los resultados obtenidos sobre el perfil de presión y los perfiles de temperatura se presentan en la FIG. 10 y 11 respectivamente. La presión de pirani alcanzó por debajo de la presión establecida en el estante durante el secado primario y secundario, lo que sugiere que no hay humedad en la cámara (FIG. 10) y que el ciclo de liofilización está completo.
Tabla 9: Parámetros de liofilización de la formulación de placebo de péptidos que contienen DMSO y trehalosa, sacarosa o D5W.
Figure imgf000070_0001
[0448] Aspecto físico de la torta. La formulación que contiene D5W y DMSO está completamente colapsada y fundida, mientras que la formulación que contiene Trehalosa-DMSO o Sacarosa-DMSO tiene una torta amorfa blanca con un ligero colapso (FIG. 12).

Claims (18)

REIVINDICACIONESI. Composición farmacéutica que comprende:(a) al menos un péptido neoantigénico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que al menos un péptido neoantigénico tiene una longitud que varía de 5 a 50 aminoácidos;(b) un modificador de pH que es una base, en la que el modificador de pH es succinato o citrato y en la que el modificador de pH está presente en la composición a una concentración de 1 mM a 10 mM; y(c) un portador farmacéuticamente aceptable que comprende
1. agua;
ii. dextrosa, sacarosa o trehalosa; y
iii. 1-4% de dimetilsulfóxido.
2. Composición farmacéutica, según la reivindicación 1, en la que la composición farmacéutica es una composición de vacuna.
3. Composición farmacéutica, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que la composición farmacéutica es para administración intravenosa o subcutánea.
4. Composición farmacéutica, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que la composición farmacéutica comprende al menos dos, tres, cuatro o cinco péptidos neoantigénicos.
5. Composición farmacéutica, según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que el al menos un péptido neoantigénico tiene una longitud que varía de 15 a 35 aminoácidos.
6. Composición farmacéutica, según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que el modificador de pH está presente en la composición a una concentración de 1,5 mM a 7,5 mM, de 2,0 a 6,0 mM o de 3,75 a 5,0 mM.
7. Composición farmacéutica, según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que el modificador de pH es succinato.
8. Composición farmacéutica, según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que el modificador de pH es succinato de sodio, preferiblemente succinato de disodio.
9. Composición farmacéutica, según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que el portador farmacéuticamente aceptable comprende dextrosa, preferiblemente en la que el portador farmacéuticamente aceptable comprende 5% de dextrosa.
10. Composición farmacéutica, según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que el portador farmacéuticamente aceptable comprende trehalosa, preferiblemente en la que el portador farmacéuticamente aceptable comprende 10% de trehalosa.
I I . Composición farmacéutica, según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que el portador farmacéuticamente aceptable comprende sacarosa, preferiblemente en la que el portador farmacéuticamente aceptable comprende 10% de sacarosa.
12. Composición farmacéutica, según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en la que la composición farmacéutica comprende entre 50/pg y 1,5 mg del al menos un péptido neoantigénico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
13. Composición farmacéutica, según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en la que la composición farmacéutica comprende además un inmunomodulador o adyuvante, preferiblemente en la que el inmunomodulador o adyuvante se selecciona del grupo que consiste en 1018 ISS, sales de aluminio, Amplivax, AS15, BCG , CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, Imiquimod, ImuFact IMP321, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, Juvlmmune, LipoVac, MF59, monofosforil lípido A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, PepTel®, sistema vectorial, micropartículas de PLGA, resiquimod, SRL172, virosomas y otras partículas similares a virus, YF-17D, VEGF trap, R848, beta-glucano, Pam3Cys y estímulo QS21 de Aquila.
14. Composición farmacéutica, según cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en la que la composición farmacéutica es liofilizable.
15. Procedimiento para preparar una solución de péptido neoantigénico para una vacuna contra la neoplasia, comprendiendo el procedimiento:
(a) preparar una solución que comprende al menos un péptido neoantigénico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que el al menos un péptido neoantigénico el péptido tiene una longitud que varía de 5 a 50 aminoácidos; y
(b) combinar la solución que comprende al menos un péptido neoantigénico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo con una solución que comprende una sal farmacéuticamente aceptable de ácido succínico o ácido cítrico, preparando así una solución peptídica para una vacuna contra la neoplasia,
en la que la sal farmacéuticamente aceptable de ácido succínico o ácido cítrico está presente en la solución peptídica a una concentración de 1 mM a 10 mM y en la que la solución peptídica comprende agua; dextrosa, sacarosa o trehalosa; y 1-4% de dimetilsulfóxido; y
preferiblemente
(i) en la que la solución que comprende al menos un péptido neoantigénico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo comprende al menos dos o al menos tres, o cuatro o cinco péptidos neoantigénicos;
(ii) en la que la solución peptídica para una vacuna contra la neoplasia comprende agua, dextrosa, succinato de 1 mM a 10 mM y 1-4% de dimetilsulfóxido; o
(iii) que comprende además, después de la etapa de combinación, filtrar la solución peptídica para una vacuna contra la neoplasia; y
preferiblemente, en la que la solución peptídica para una vacuna contra la neoplasia es liofilizable.
16. Procedimiento para preparar una vacuna contra la neoplasia, comprendiendo el procedimiento:
(a) preparar una solución de péptido neoantigénico, según el procedimiento de la reivindicación 15; y
(b) combinar la solución de péptido neoantigénico con una solución de un inmunomodulador o adyuvante, preparando así una vacuna contra la neoplasia,
preferiblemente en el que el inmunomodulador o adyuvante se selecciona del grupo que consiste en 1018 ISS, sales de aluminio, Amplivax, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, GM-c Sf , IC30, IC31, Imiquimod, ImuFact IMP321, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, Juvlmmune, LipoVac, MF59, monofosforil lípido A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MPEC, ONTAK, PepTel®, sistema vectorial, micropartículas de PLGA, resiquimod, SRL172, virosomas y otras partículas similares a virus, YF-17D, VEGF trap, R848, beta-glucano, Pam3Cys y estímulo QS21 de Aquila.
17. Composición farmacéutica, según cualquiera de las reivindicaciones 1-14 para usar en el tratamiento de una neoplasia, en la que dicho tratamiento comprende administrar la composición farmacéutica a un sujeto diagnosticado con una neoplasia, preferiblemente que comprende además administrar una segunda, tercera o cuarta composición farmacéutica, según cualquiera de las reivindicaciones 1-14, al sujeto.
18. Kit de vacunación o inmunización que comprende:
(a) una composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en la que la composición se envasa por separado y se liofiliza; y
(b) una solución para la reconstitución de la composición liofilizada, preferiblemente en la que la solución contiene un adyuvante.
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