BR122021014039B1 - Método de identificação de neoantígenos específicos de tumor - Google Patents

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Catherine Wu
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Abstract

a presente invenção refere-se a peptídeos imunoterapêuticos e seu uso em imunoterapia, em particular a imunoterapia de câncer. especificamente, a invenção provê um processo de identificação de neoantígenos específicos de tumor que so-zinhos ou em combinação com outros peptídeos associados com tumor servem co-mo ingredientes farmacêuticos ativos de composições de vacina que estimulam respostas antitumor.

Description

[001]Dividido do BR 11 2012 029066 5, depositado em 16/05/2011.
Pedidos de Patente Relacionados
[002]Este pedido de patente reivindica os benefícios de pedido de patente provisório U.S. No. 61/334 866, depositado em 14 de maio de 2010, que é aqui incor-porado por referência em sua totalidade.
Campo da Invenção
[003]A presente invenção refere-se genericamente à identificação de neoan- tígenos específicos de tumor e os usos destes neoantígenos para produção de vacinas de câncer.
Antecedentes da Invenção
[004]Vacinas de tumor são tipicamente compostas por antígenos tumorais e moléculas imuno estimuladoras (por exemplo, citocinas ou ligantes TLR) que traba-lham juntos para indução de células T citotóxicas específicas de antígeno (CTLs) que reconhecem e lisam células tumorais. Atualmente, quase todas as vacinas contêm tanto antígenos tumorais compartilhados ou preparações de célula de tumor inteira (Gilboa, 1999). Os antígenos tumorais compartilhados são proteínas imunogênicas com expressão seletiva em tumores através de muitos indivíduos e são comumente liberados para pacientes como peptídeos sintéticos ou proteínas recombinantes (Boon et al., 2006). Em contraste, preparações de célula de tumor inteira são liberadas para pacientes como células irradiadas autólogas, lisados de células, fusões de células, preparações de proteína de choque térmico ou mRNA total (Parmiani et al., 2007). Uma vez que células tumorais inteiras são isoladas do paciente autólogo, as células expressam antígenos tumorais específicos de paciente assim como antígenos tumo- rais compartilhados. Finalmente, há uma terceira classe de antígenos tumorais que raramente tem sido usada em vacinas devido a dificuldades técnicas na identificação dos mesmos (Sensi et al., 2006). Esta classe consiste em proteínas com mutações específicas de tumor que resultam em sequências de aminoácidos alteradas. Tais proteínas mutantes têm o potencial de: (a) marcar de modo único um tumor (em rela-ção a células não-tumor) para reconhecimento e destruição pelo sistema imune (Len- nerz et al., 2005); (b) evitar tolerância de célula T central e algumas vezes periférica, e assim ser reconhecida através de receptores de célula T mais efetivos, de alta avidez (Gotter et al., 2004).
[005]Assim existe uma necessidade de um processo de identificação de neo- epítopos que sejam úteis como vacinas de tumores.
Resumo da Invenção
[006]A presente invenção refere-se em parte à verificação de um processo de identificação de peptídeos que são capazes de elicitar uma resposta de célula T es-pecífica de tumor.
[007]Em um aspecto a invenção provê processos de identificação de um ne- oantígeno através de identificação de uma mutação específica de tumor em um gene expresso de um indivíduo tendo câncer. Em alguns aspectos quando a mutação é uma mutação pontual o processo ainda compreende identificação de peptídeo mutante tendo a mutação. Preferivelmente o peptídeo mutante se liga a uma proteína HLA classe I com maior afinidade que um peptídeo tipo selvagem e tem uma IC50 de menos que 500 nm. Em outros aspectos quando a mutação é uma mutação sítio de splice, troca de fase de leitura, leitura através ou fusão de gene o processo ainda compreende identificação do polipeptídeo mutante codificado pela mutação. Preferivelmente, o polipeptídeo mutante se liga a uma proteína HLA classe I.
[008]Opcionalmente, o processo ainda inclui seleção de peptídeos ou polipep- tídeos que ativam células CD8 T antitumor.
[009]O peptídeo ou polipeptídeo mutante preferivelmente se liga a uma prote-ína HLA classe I com uma afinidade maior que um peptídeo tipo selvagem e tem uma IC50 de menos que 500 nM. Preferivelmente, o peptídeo ou polipeptídeo tem uma IC50 de menos que 250 nM. Mais preferivelmente, o peptídeo ou polipeptídeo tem uma IC50 de menos que 100 nM. Mais preferivelmente, o peptídeo ou polipeptídeo tem uma IC50 de menos que 50 nM.
[0010]O peptídeo mutante é de cerca de 8-10 aminoácidos de comprimento. Em um outro aspecto é de cerca de 8-50 aminoácidos de comprimento. Por exemplo, o peptídeo mutante é maior que 10 aminoácidos em comprimento, maior que 15 ami- noácidos em comprimento, maior que 20 aminoácidos em comprimento, maior que 30 aminoácidos em comprimento. Preferivelmente os peptídeos mutantes são de cerca de 24-40 aminoácidos em comprimento.
[0011]Ainda em um aspecto a invenção provê processos de indução de uma resposta imune específica de tumor em um indivíduo através de administração de um ou mais peptídeos ou polipeptídeos identificados de acordo com os processos da in-venção e um adjuvante. O adjuvante é, por exemplo, um adjuvante baseado em TLR ou um adjuvante baseado em óleo mineral. Em alguns aspectos o peptídeo ou poli- peptídeo e adjuvante baseado em TLR são emulsificados com um adjuvante baseado em óleo mineral. Opcionalmente, o processo ainda inclui administração de um agente anti-imuno supressivo tal como um anticorpo anti-CTLA-4, um anticorpo anti-PD1, um anticorpo anti-PD-L1, um anticorpo anti-CD25 ou um inibidor de IDO.
[0012]Ainda em um outro aspecto a invenção provê processos de indução de uma resposta imune específica de tumor em um indivíduo através de administração para o indivíduo de células dendríticas autólogas ou células apresentadoras de antí- geno que foram pulsadas com um ou mais dos peptídeos ou polipeptídeos identifica-dos de acordo com os processos das invenções. Opcionalmente, o processo ainda inclui administração de um adjuvante tal como, por exemplo, um adjuvante baseado em TLR ou um adjuvante baseado em óleo mineral. Em alguns aspectos o peptídeo ou polipeptídeo e adjuvante baseado em TLR são emulsificados com um adjuvante baseado em óleo mineral. Em algumas realizações o processo ainda inclui adminis-tração de um agente anti-imuno supressivo. Agentes anti-imuno supressivos incluem, por exemplo, um anticorpo anti-CTLA-4, um anticorpo anti-PD1, um anticorpo anti-PD- L1, um anticorpo anti-CD25 ou um inibidor de IDO.
[0013]Em um outro aspecto a invenção provê um processo de vacinação ou tratamento de um indivíduo para câncer através de identificação de uma pluralidade de mutações específicas de tumor em um gene expresso do sujeito, identificação de peptídeos ou polipeptídeos mutantes tendo as mutações específicas de tumor identi-ficadas,seleção de um ou mais dos peptídeos ou polipeptídeos identificados que se ligam a uma proteína HLA classe I preferivelmente com uma afinidade maior que um peptídeo tipo selvagem e são capazes de ativar células CD8 T antitumor, e adminis-tração ao indivíduo de um ou mais selecionados peptídeos, polipeptídeos ou células dendríticas autólogas ou células apresentadoras de antígeno pulsadas com o um ou mais peptídeos ou polipeptídeos identificados. O peptídeo mutante é de cerca de 810 aminoácidos em comprimento. Em um outro aspecto é cerca de 8-50 aminoácidos em comprimento. Por exemplo, peptídeo mutante é maior que 10 aminoácidos em comprimento, maior que 15 aminoácidos em comprimento, maior que 20 aminoácidos em comprimento, maior que 30 aminoácidos em comprimento. Preferivelmente, os peptídeos mutantes são de cerca de 24-40 aminoácidos em comprimento.
[0014]Opcionalmente, o processo ainda inclui administração de um adjuvante tal como, por exemplo, um adjuvante baseado em TLR ou um adjuvante baseado em óleo mineral. Em alguns aspectos o peptídeo ou polipeptídeo e adjuvante baseado em TLR são emulsificados com um adjuvante baseado em óleo mineral. Em algumas re-alizações o processo ainda inclui administração de um agente anti-imuno supressivo. Agentes anti-imuno supressivos incluem, por exemplo, um anticorpo anti-CTLA-4, um anticorpo anti-PD1, um anticorpo anti-PD-L1, um anticorpo anti-CD25 ou um inibidor de IDO.
[0015]O processo da reivindicação 22, onde o dito indivíduo recebeu um transplante de células troncos hematopoiéticas.
[0016]O indivíduo é um humano, cão, gato, ou cavalo. O câncer é câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão, câncer de rim, câncer gástrico, câncer de cólon, câncer de testículo, câncer de cabeça e pescoço, câncer pancreático, câncer do cérebro, linfoma melanoma, tal como linfoma de célula-B ou leucemia, tal como leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crônica, leucemia linfocítica crônica, ou leucemia linfocítica de célula T.
[0017]Também são incluídas na invenção composições farmacêuticas con-tendo o peptídeo ou polipeptídeo identificado de acordo com os processos da inven-ção e um carreador farmaceuticamente aceitável.
[0018]Por exemplo, a invenção provê uma composição contendo pelo menos dois peptídeos SF3B1 distintos onde cada peptídeo é igual a ou menos que 50 ami- noácidos em comprimento e contém:uma leucina na posição de aminoácido 625;um histidina na posição de aminoácido 626;um ácido glutâmico em posição de aminoácido 700;um ácido aspártico na posição de aminoácido 742; ouuma arginina na posição de aminoácido 903, quando numerado de acordo com SF3B1 tipo selvagem.
[0019]A invenção também provê uma composição contendo pelo menos dois peptídeos MYD88 distintos onde cada peptídeo é igual a ou menos que 50 aminoáci- dos em comprimento e contém uma treonina na posição de aminoácido 232; uma leucina na posição de aminoácido 258; ou uma prolina na posição de aminoácido 265, quando numerado de acordo com MYD88 tipo selvagem.
[0020]A invenção ainda provê composição contendo pelo menos dois peptí- deos distintos TP53 onde cada peptídeo é igual a, ou menos que 50 aminoácidos em comprimento e contém uma arginina na posição de aminoácido 111; uma arginina na posição de aminoácido 215; uma serina na posição de aminoácido 238, uma gluta- mina na posição de aminoácido 248; uma fenil alanina na posição de aminoácido 255; uma cisteína na posição de aminoácido 273 ou uma asparagina na posição de ami- noácido 281, quando numerado de acordo com TP53 tipo selvagem.
[0021]A invenção ainda provê composição contendo pelo menos dois peptí- deos ATM distintos onde cada peptídeo é igual a, ou menos que 50 aminoácidos em comprimento e contém uma fenil alanina na posição de aminoácido 1252; uma argi- nina na posição de aminoácido 2038; uma histidina na posição de aminoácido 2522; ou uma cisteína na posição de aminoácido 2954, quando numerados de acordo com ATM tipo selvagem.
[0022]Uma composição compreendendo pelo menos dois peptídeos Ab1 dis-tintos onde cada peptídeo é igual a ou menos que 50 aminoácidos em comprimento e contém uma valina na posição de aminoácido 244; uma valina na posição de amino- ácido 248; um ácido glutâmico na posição de aminoácido 250; uma alanina na posição de aminoácido 250; uma histidina na posição de aminoácido 252; uma arginina na posição de aminoácido 252; uma fenil alanina na posição de aminoácido 253; uma histidina na posição de aminoácido 253; uma lisina na posição de aminoácido 255; uma valina na posição de aminoácido 255; uma glicina na posição de aminoácido 276; uma isoleucina na posição de aminoácido 315; uma asparagina na posição de amino- ácido 315; uma leucina na posição de aminoácido 317; uma treonina na posição de aminoácido 343; uma treonina na posição de aminoácido 351; uma glicina na posição de aminoácido 355; uma valina na posição de aminoácido 359; uma alanina na posição de aminoácido 359; uma isoleucina na posição de aminoácido 379; uma leucina na posição de aminoácido 382; uma metionina na posição de aminoácido 387; uma prolina na posição de aminoácido 396; uma arginina na posição de aminoácido 396; uma tirosina na posição de aminoácido 417; ou uma serina na posição de aminoácido
[0023]Ainda incluída na invenção é uma composição contendo pelo menos dois peptídeos FBXW7 distintos onde cada peptídeo é igual a ou menos que 50 ami- noácidos em comprimento e contém uma leucina na posição de aminoácido 280; uma histidina na posição de aminoácido 465; uma cisteína na posição de aminoácido 505; ou um ácido glutâmico na posição de aminoácido 597, quando numerado de acordo com FBXW7 tipo selvagem.
[0024]Ainda em um aspecto a invenção provê uma composição contendo pelo menos dois peptídeos MAPK1 distintos onde cada peptídeo é igual a ou menos que 50 aminoácidos em comprimento e contém uma asparagina na posição de aminoácido 162; uma glicina na posição de aminoácido 291; ou uma fenil alanina na posição de aminoácido 316, quando numerado de acordo com MAPK1 tipo selvagem.
[0025]A invenção também provê uma composição contendo pelo menos dois peptídeos GNB1 distintos onde cada peptídeo é igual a ou menos que 50 aminoácidos em comprimento e contém uma treonina na posição de aminoácido 180, quando nu-merado de acordo com GNB1 tipo selvagem.
[0026]É também provido pela invenção um processo de tratamento de um in-divíduo com um tumor resistente a imatinibe para um indivíduo positivo HLA-A3 uma composição de peptídeo Bcr-ab1 igual a ou menos que 50 aminoácidos em comprimento que contém uma lisina na posição 255 quando numerado de acordo com bcr- ab1 tipo selvagem.
[0027]É ainda provido pela invenção um processo de tratamento de um indi-víduo com tumor resistente a imatinibe compreendendo administração ao indivíduo um ou mais peptídeos contendo uma mutação bcr-ab1 onde o peptídeo é igual a, ou menos que 50 aminoácidos e se liga a uma proteína HLA classe I com uma IC50 de menos que 500 nm.
[0028]A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado como comumente entendido por aqueles versados na técnica à qual esta invenção pertence. Embora processos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática da presente invenção, apropriados processos e materiais são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes, e outras referências aqui mencionadas são expressamente incorporadas por referência em suas totalidades. Em casos de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo definições, controlarão. Em adição, os materiais, processos, e exemplos aqui descritos são somente ilustrativos e não são pretendidos serem limitantes.
[0029]Outras características e vantagens da invenção serão aparentes de, e abrangidas pela seguinte descrição detalhada e reivindicações.
Breve Descrição dos Desenhos
[0030]A Figura 1 mostra o balanço de especificidade e toxidez autoimune usando 3 classes de antígenos para vacinas de tumor. Células tumorais inteiras podem ser a formulação de antígeno menos específica para vacinas de tumor uma vez que o inteiro conjunto de antígenos proteínas expressos em células tumorais inclui milhares de proteínas que também estão presentes em outras células do corpo. antí- genos tumorais super-expressos são levemente mais específicos porque eles foram selecionados para expressão muito maior e mais seletiva em tumores comparados a outras células no corpo. Não obstante, é impossível testar cada célula no corpo para expressão destes genes e existe um substancial risco de que outras células expressem os mesmos. Finalmente, proteínas mutantes geram neoepítopos que estão presentes somente em células tumorais e provêm o mais alto nível de especificidade.
[0031]A Figura 2 é um esquema para uma estratégia de vacinação de neoan- tígeno personalizada que pode ser aplicada ao tratamento de qualquer câncer. Nós também ressaltamos a possibilidade de aplicação desta estratégia em dois cenários únicos. No primeiro caso, um paciente é vacinado no período inicial seguindo transplante de célula tronco hematopoiética (HSCT) (por exemplo, como é feito em CLL, CML e outras leucemias). O período pós-HSCT inicial é um conjunto terapêutico único quando o sistema imune é competente devido a reconstituição com HSCT, assim superando defeitos imunes de hospedeiro induzidos por tratamento ou tumor. Além disso, a abundância de citocinas homeostáticas em um milieu de linfopenia, tal como conjunto pós-HSCT inicial, pode contribuir para rápida expansão de células T. No segundo caso, um paciente é vacinado inicialmente no curso de doença quando competência imune pode estar mais intacta nos estágios iniciais de doença, antes de prejuízo por exposição à quimioterapia (por exemplo, para tumores sólidos ou hema- topoiéticos). Uma vez que o sistema imune é provável de ser mais ativo nestas duas situações específicas, nós sugerimos que estas são as situações ideais para aplicação de estratégias de vacinação de tumor.
[0032]A Figura 3 mostra uma estratégia para identificação de neoepítopos tu- morais descrita em 3 etapas: (1) usando tecnologias de sequenciamento, detectar mutações de gene que estão presentes em tumor mas não em DNA de linha germe de um paciente único; (2) usando algoritmos de predição, prever se peptídeos mutan- tes têm o potencial para ligação de alelo HLA pessoal; estes peptídeos previstos podem ser opcionalmente testados experimentalmente para ligação a apropriadas proteínas HLA. Em adição, estes genes também têm de ser expressos em células de tumor. (3) gerando células T ex vivo e testando se elas são capazes de reconhecer células expressando a proteína mutante; alternativamente, espectrometria de massa pode ser usada para detectar peptídeos eluídos de proteínas HLA de superfície de célula de tumor. Para leucemia linfocítica crônica, nossos estudos atuais demonstram que há uma média de 23 mutações de alteração de proteína por paciente, 46 peptí- deos mutantes de ligação previstos e 15-25 peptídeos mutantes de ligação validados. Destes, nós antecipamos que ~7-12 peptídeos são expressos e processados em células tumorais (embora isto possa diferir através de tumores e pacientes).
[0033]A Figura 4 mostra cinco classes de mutações geradas por potenciais neoepítopos tumorais. Novos epítopos específicos de tumor podem surgir como um resultado de mutações não-sinônimas, emenda de sítio, troca de fase de leitura ou de ponto de leitura através (asterisco vermelho), ou a partir de fusão de dois genes (ou dentro do mesmo gene). Em particular, mutações de emenda de sítio, troca de fase de leitura, leitura - através e fusões de genes podem cada uma gerar novos estirões de aminoácidos (em magenta) que normalmente não são traduzidos, mas agora são expressos e traduzidos como um resultado de mutação. Mutações não-sinônimas con-duzem a peptídeos com mudanças em um único aminoácido.
[0034]A Figura 5 mostra a frequência de mutações por classe em pacientes CLL. Nossos estudos aplicando um sequenciamento de geração seguinte a uma série de 7 tumores CLL revela que células CLL abrigam muitas mutações, que provêm uma rica fonte de possíveis peptídeos que sofreram mutação. Nós observamos que o nú-mero total de alterações de gene não-silenciosas em CLL variou de 17-155 por indiví-duo, a maioria das quais foram mutações pontuais somaticamente alteradas (não- sinônimas). Os tumores de 4 pacientes também abrigaram mutações de emenda de sítio; para 3 pacientes, novas fusões de gene foram identificadas através de sequen- ciamento de RNA.
[0035]A Figura 6 mostra dados de previsões automatizadas (Etapa 2A da es-tratégia na Figura 3) de ligação de peptídeo (para peptídeos que abrigam uma espe-cífica mutação não-sinônima) contra cada um dos 6 alelos HLA (MHC de classe I) de paciente. Magenta = ligantes fortes; verde = ligantes intermediários.
[0036]A Figura 7 mostra processos para confirmação de expressão de RNA de genes que sofreram mutação (Etapa 2B da estratégia na Figura 3). A. Para 7 pacientes CLL, nós verificamos que mais da metade do genes que sofreram mutação com peptídeos de ligação de HLA previstos foram expressos no nível de RNA. B. Nós tam-bém usamos piro-sequenciamento de RNA para detectar RNAs expressos abrigando específicas mutações encontradas em DNA. C. Nós podemos validar novas fusões de genes que foram vistas por sequenciamento de DNA usando clonagem PCR-TOPO da região de ponto de ruptura (é mostrada uma fusão descoberta para paciente 2).
[0037]A Figura 8 mostra um processo e dados para validação experimental de ligação de peptídeo - HLA (Etapa 2C da estratégia na Figura 3). A. Esquema para validação experimental de ligação de peptídeo a específicos alelos HLA. B. Resumo de peptídeos que sofreram mutação candidatos identificados em pacientes 1 e 2. Cé-lulas sombreadas indicam que a análise está em progresso. C. Dados para afinidade de ligação prevista vs. verificada experimentalmente de peptídeos gerados a partir de alterações genéticas (mutação não-sinônima ou fusão de gene) para paciente2. Um corte de previsão de IC50 < 120 nM (linha vertical sólida na esquerda) resulta em todos os peptídeos mostrando ligação experimental para HLA classe I.
[0038]A Figura 9 mostra ligação diferencial prevista de peptídeos de mutação vs. linha germe (isto é, também chamada parente, tipo selvagem ou normal) para ale- los HLA. 12 de 25 peptídeos que sofreram mutação ligantes de HLA previstos de Pt2 têm > 2 vezes maior ligação (corte = linha pontilhada vermelha) do que peptídeos parentes. Isto ainda aumenta a especificidade de peptídeos que sofreram mutação. Peptídeos que sofreram mutação são específicos por duas razões: primeiro, muitas dos receptores de célula T que reconhecem um peptídeo que sofreu mutação não são prováveis de detectar o peptídeo parente tipo selvagem; segundo, alguns dos peptí- deos que sofreram mutação podem ser ligar a HLA com maior afinidade que o peptí- deo parente. Uma vez que a primeira propriedade não pode ser computacionalmente prevista, nós focalizaremos na previsão da segunda propriedade e seleção para inclu-são em vacinas somente aqueles peptídeos que mostram maior ligação para HLA para peptídeos que sofreram mutação em relação a tipos selvagens.
[0039]A Figura 10 mostra reatividade de célula T contra um neoepítopo CLL pessoal candidato (Etapa 3 da estratégia na Figura 3). Nós observamos que células T isoladas de paciente 1 após terapia detectam um peptídeo TLK2 que sofreu mutação específico (peptídeo #7) (usando o ensaio Elispot).
[0040]A Figura 11 mostra que mutações BCR-ABL geram muitos peptídeos previstos para ligação de alelos HLA-A e HLA-B. Através de aplicação de algoritmo de previsão NetMHC (Nielsen et al. PLoS One. 2007, 2(8):e796), nós previmos peptí- deos gerados a partir de mutações BCR-ABL com potencial para ligação a 8 alelos HLA-A e -B comuns. As mutações BCR-ABL mais comuns são ordenadas em fre-quência decrescente (a partir da esquerda para direita), e IC50 prevista de vários pep- tídeos de ligação MHC de classe I são mostradas. No total, foram previstos 84 peptí- deos para ligação com boa afinidade, definidos como uma IC50 de menos que 1000, através de uma ampla faixa de alelos HLA. De todos os peptídeos previstos, 24 de 84 (29%) foram previstos serem ligantes fortes com uma IC50 < 50. 42 peptídeos (50%) foram ligantes intermediários, definidos como IC50 entre 50 e 500. 18 peptídeos (21%) foram ligantes fracos definidos como IC50 entre 500 e 1000.
[0041]A Figura 12 mostra peptídeo BCR-ABL abrigando a mutação E255K liga proteínas HLA e é associado com células T polifuncionais, específicas presentes em pacientes CML. A. Pontuação de ligação derivados experimentalmente de E255K-B (e peptídeo parente) para HLA A3 e membros tipo super. B. Em células T CD8+ ex-pandidas a partir de um paciente HLAA3+ E255K+ seguindo HSCT, nós detectamos secreção de IFNgama contra o peptídeo E255K-B (MUT) e APCs expressando A3+ expressando o minigene E255K (MG). Esta resposta foi anulada na presença do an-ticorpo de bloqueio classe I (w6/32). Células secretando IFNgama também foram te- trâmero+ para o peptídeo que sofreu mutação e foram (D) polifuncionais, secretando IP10, TNFalfa e GM-CSF (baseado no ensaio Luminex).
[0042]A Figura 13 mostra que clones de células T derivados de paciente po-dem reconhecer epítopos específicos de tumor e células assassinas apresentando estes epítopos. A. Reatividade para o epítopo de célula T CD8+ de CML66 (peptídeo 66-72C) é restrita por HLA B-4403. B. mRNA CML66 pode ser eficientemente núcleo- fectado em células B expandidas - CD40L. C. Células T CD8+ específicas-CML66 são citotóxicas para células B CD40L expressando CML66 através de núcleofecção ou através de pulso de peptídeo, mas não alvos controles.
[0043]A Figura 14 mostra genes significantemente mutantes em CLL. A. Os 9 genes mais significantemente mutantes entre 64 amostras CLL. N - território coberto total em pares de bases através de 64 amostras sequenciadas. Valores p- e q- foram calculados através de comparação de probabilidade de visão de constelação obser-vada de mutações para as taxas de mutação de fundo calculadas através de conjunto de dados. Barras vermelhas - genes previamente não conhecidos serem mutantes em CLL; barras cinzas - genes nos quais mutação em CLL foi previamente reportada. B. Tipo (não-sinônima, emenda de sítio, não-sentido) e localização de mutações em ATM, SF3B1, TP53, MYD88, FBXW7, DDX3X, MAPK1, e GNB1 descobertas entre as 64 CLLs (posição e mutação em amostras CLL mostradas acima de gene)comparadas a mutações previamente reportadas na literatura ou na base de dados COSMIC (linhas mostram posição de mutações abaixo de gene).
[0044]A Figura 15 mostra que SF3B1 é expressa em amostras CLL (7a coluna no gráfico) e tem expressão maior que muitas células controles, incluindo: PBMC, M: monócito, CC: linhagem de células cancerosas (inclui K562, Jurkat, IM9, MCF-7, Hela, Ovcar, RPMI, OTM, MCF-CAR, KM12BM e MM1S).
[0045]A Figura 16 mostra que mutações SF3B1 geram peptídeos que são pre-vistos serem ligados a alelos HLA específicos de paciente. Por exemplo, um peptídeo que inclui a mutação SF3B1 K700E comum é previsto ligar fortemente HLA.
Descrição Detalhada da Invenção
[0046]Uma das barreiras críticas para o desenvolvimento de imunoterapia cu-rativa e específica de tumor é a identificação e seleção de antígenos tumorais alta-mente restritos para evitar autoimunidade. Neoantígenos tumorais, que surgem como um resultado de mudança genética dentro de células malignas, representam a classe mais específica de tumor de antígenos. Neoantígenos têm sido raramente usados em vacinas devido a dificuldades técnicas na identificação dos mesmos. Nossa aborda-gem para identificar neoepítopos específicos de tumor envolve três etapas. (1) Identi-ficação de mutações de DNA usando genoma completo ou exoma completo (isto é, somente exons capturados) ou sequenciamento de RNA de tumor versus amostras de linha germe emparelhadas de cada paciente; (2) aplicação de algoritmos de previsão de ligação de MHC - peptídeo validados para geração de um conjunto de epítopos de célula T candidatos que podem ser ligados a alelos HLA de paciente e são baseados em mutações não-silenciosas presentes em tumores; e (3) opcional demonstração de células T específicas de antígeno contra peptídeos que sofreram mutação ou demonstração de que um peptídeo candidato está ligado a proteínas HLA sobre a superfície de tumor.
[0047]Da mesma maneira, a presente invenção refere-se a processos para identificação e/ou detecção de epítopos de célula T de um antígeno. Especificamente, a invenção provê processo de identificação e/ou detecção neoantígenos específicos de tumor que são úteis na indução de uma resposta imune específica de tumor em um indivíduo.
[0048]Em particular, a invenção provê um processo de vacinação ou trata-mento de um indivíduo através de identificação de uma pluralidade de mutações es-pecíficas de tumor no genoma de um sujeito. Peptídeos e polipeptídeos mutantes tendo as mutações identificadas e que ligam a uma proteína HLA classe I são seleci-onados. Opcionalmente, estes peptídeos e polipeptídeos se ligam a proteínas HLA classe I com uma afinidade maior que o peptídeo tipo selvagem e/ou são capazes de ativar células T CD8+ anti-tumor. Estes peptídeos são administrados ao sujeito. Alter-nativamente, células apresentadoras de antígeno autólogo que foram pulsadas com os peptídeos são administradas.
[0049]A importância de antígenos que sofreram mutação, ou neoepítopos, no controle imune de tumores tem sido apreciada em estudos seminais mostrando que: (a) camundongos e humanos frequentemente montam respostas de célula T para an- tígenos que sofreram mutação (Parmiani et al., 2007; Sensi and Anichini, 2006); (b) camundongos podem ser protegidos de um tumor através de imunização com um único peptídeo que sofreu mutação que está presente no tumor (Mandelboim et al., 1995); (c) sobreviventes de melanoma de longo mediado por vacina ou espontâneo montam forte memória de respostas de célula T citotóxica (CTL) para antígenos que sofreram mutação (Huang et al., 2004; Lennerz et al., 2005; Zhou et al., 2005a); (d) finalmente, pacientes de linfoma folicular mostram remissão molecular quando imunizados com proteínas imunoglobulinas que sofreram mutação específica de paciente que estão presentes em células tumorais autólogas (Baskar et al., 2004). Além disso, as respostas CTL nestes pacientes são direcionadas no sentido de regiões que sofreram mutação antes que compartilhadas da proteína imunoglobu- lina. Adicionalmente, tais peptídeos que sofreram mutação têm o potencial para: (a) marcar de modo único um tumor para reconhecimento e destruição pelo sistema imune, assim reduzindo o risco para autoimunidade; e (b) evitar tolerância de célula T central e periférica, permitindo o antígeno ser reconhecido por receptores de células T mais efetivos, de alta avidez. (Figura 1).
[0050]Mutações idênticas em qualquer gene particular são raramente en-contradasatravés de tumores (e estão mesmo em baixa frequência para mutações condutoras mais comuns). Assim, os processos da presente invenção compreen-sivamenteidentificarão mutações de tumor específicas de paciente. Usando tecnologias de sequenciamento altamente paralelo, ferramentas de previsão de ligação de peptídeo - HLA e ensaios bioquímicos, os processos da invenção permitirão: (1) compreensiva identificação de peptídeos que sofreram mutação que são expressos e se ligam a proteínas HLA presentes em um tumor de paciente; (2) monitoração da resposta imune natural de pacientes de câncer para estes neoepí- topos identificados; (3) determinação de se células T citotóxicas que reconhecem estes peptídeos no contexto de proteínas HLA de paciente podem lisar seletivamentecélulas tumorais autólogas ex vivo. Esta estratégia endereça-se a várias questões fundamentais relacionadas à como o sistema imune de pacientes de câncer interage com neoepítopos tumorais . Estas incluem: qual e que fração de neo- epítopos tumorais são detectadas por células T, quantos precursores de células T são capazes de responder a neoepítopos, quão frequente são células T efetoras e de memória específica de neoepítopo em circulação e no tumor, quanta avidez as células T têm para estes epítopos, células T específicas - neoepítopo são funcionais ? As respostas para estas questões provêm ambas, a justificativa e estratégia para uso de neoepítopos tumorais em vacinas humanas.
[0051]O sistema imune de um humano pode ser classificado em dois subsis-temas funcionais, isto é, o sistema imune inato e o adquirido. O sistema imune inato é a primeira linha de defesa contra infecções, e maior parte de potenciais patógenos são rapidamente neutralizados antes de poderem causar, por exemplo, uma infecção notável. O sistema imune adquirido reage a estruturas moleculares, referidas como antígenos, do organismo intruso. Existem dois tipos de reações imunes adquiridas, isto é, a reação imune humoral e a reação imune mediada por célula. Na reação imune humoral, os anticorpos secretados por células B em fluidos corpóreos se ligam a an- tígenos derivados de patógenos, conduzindo à eliminação do patógeno através de uma variedade de mecanismos, por exemplo, lise mediada por complemento. Na reação imune mediada por célula, células T capazes de destruir outras células são ativadas. Se, por exemplo, proteínas associadas com uma doença estão presentes em uma célula, elas são, dentro da célula, proteoliticamente fragmentadas a peptídeos. Proteínas específicas de célula então ligam elas próprias ao antígeno ou peptídeo formado desta maneira e transportam o mesmo para a superfície da célula, onde eles são apresentados aos mecanismos de defesa molecular, em particular células T, do corpo. Células T citotóxicas reconhecem estes antígenos e matam as células que abrigam os antígenos.
[0052]As moléculas que transportam e apresentam peptídeos sobre a superfície de célula são referidas como proteínas do complexo de histocompatibilidade principal (MHC). As proteínas MHC são classificadas em proteínas MHC de classe I e de classe II. As estruturas das proteínas das duas classes MHC são muito similares; entretanto, elas diferem bem consideravelmente em sua função. Proteínas de classe I MHC estão presentes sobre a superfície de quase todas as células do corpo, incluindo maioria de células de tumor. As proteínas MHC de classe I são carregadas com antí- genos que usualmente originam de proteínas endógenas ou de patógenos presentes dentro de células, e são então apresentadas para linfócitos T citotóxicos (CTLs). As proteínas MHC de classe II estão somente presentes sobre células dendríticas, linfó- citos B, macrófagos e outras células apresentadoras de antígeno. Elas apresentam principalmente peptídeos, que são processados a partir de fontes externas de antíge- nos, isto é, fora das células, para células auxiliares-T (Th). Maioria dos peptídeos ligados pelas proteínas MHC de classe I origina-se de proteínas citoplásmicas produzidas no próprio organismo hospedeiro saudável e normalmente não estimulam uma reação imune. Da mesma maneira, linfócitos T citotóxicos que reconhecem tais moléculas MHC apresentando auto-peptídeo de classe I são suprimidos no timo ou, após sua liberação a partir do timo, são suprimidas ou inativadas, isto é, tornadas toleradas. Moléculas MHC somente são capazes de estimular uma reação imune quando elas apresentam peptídeos para linfócitos -T citotóxicos não-tornados tolerados. Linfócitos T citotóxicos têm, sobre sua superfície, ambos, receptores de célula-T (TCR) e moléculas CD8. Receptores de célula-T são capazes de reconhecer e ligar peptídeos com- plexados com as moléculas de MHC de classe I. Cada linfócito-T citotóxico expressa um único receptor de célula-T que é capaz de ligação de específicos complexos de peptídeo / MHC.
[0053]Os peptídeos ligam eles próprios às moléculas de MHC classe I através de ligação de afinidade competitiva dentro de retículo endoplásmico, antes delas serem apresentadas sobre a superfície de célula. Aqui, a afinidade de um peptídeo individual é diretamente ligada à sua sequência de aminoácidos e a presença de específicos motivos de ligação em definidas posições dentro de sequência de aminoácido. Se a sequência de um tal peptídeo é conhecida, é possível, por exemplo, manipular o sistema imune contra células adoentadas usando, por exemplo, vacinas de peptídeos.
[0054]Usando algoritmos de computador, é possível prever potenciais epíto- pos de célula-T, isto é, sequências de peptídeos, que são ligadas pelas moléculas MHC de classe I ou classe II na forma de um complexo apresentando - peptídeo e então, nesta forma, reconhecido pelos receptores de célula-T de linfócitos-T. Atualmente,é feito uso, em particular, de dois programas, SYFPEITHI (Rammensee et al., Immunogenetics, 50 (1999), 213-219) e HLA_BIND (Parker et al., J. Immunol., 152 (1994), 163-175). As sequências de peptídeos determinadas desta maneira, que potencialmente podem se ligar a moléculas MHC de classe I, então têm de ser examinadas in vitro para sua real capacidade de ligação.
[0055]O objeto técnico da presente invenção é prover um processo aperfeiçoado para identificação e separação de potenciais epítopos de célula-T presentes em células de tumor, cujo processo permite exame simultâneo e rápido de um grande número de sequências de peptídeos, para sua capacidade de ligação a específicas moléculas MHC.
[0056]Na presente invenção, o objeto técnico sobre o qual ela está baseada é obtido através de provimento de um processo para identificação e/ou detecção de antígenos que sofreram mutação que estão presentes em tumores mas não em tecido normal. O processo usa massivamente sequenciamento genômico paralelo da inteira porção codificante de um genoma de paciente de câncer para identificar os específicos genes que sofreram mutação em um tumor. De modo a estreitar os peptí- deos mutantes para aqueles com potencial para ligar mais fortemente a HLA que os peptídeos tipo selvagem e assim conferir especificidade de tumor, algoritmos bem es-tabelecidosserão usados para prever peptídeos que ligam qualquer um dos 6 alelos HLA classe I únicos de cada paciente e uma IC50 prevista para todos os peptídeos de 9- ou 10-mer com resíduos mutantes específicos de tumor vs. aqueles com resíduo de linha germe será calculada. Tipicamente, peptídeos com IC50<50 nM prevista, são genericamente considerados peptídeos de afinidade de ligação média a alta e serão selecionados para teste de sua afinidade usando empiricamente ensaios bioquímicos de ligação-HLA. Finalmente, será determinado se o sistema imune humano pode montar respostas imunes efetivas contra estes antígenos tumorais que sofreram mutação e assim matar efetivamente o tumor mas não células normais.
Definições
[0057]Um “epítopo de célula-T” é para ser entendido como significando uma sequência de peptídeo que pode ser ligada pelas moléculas MHC de classe I ou II na forma de uma molécula MHC apresentando peptídeo ou complexo MHC e então, nesta forma ser reconhecida e ligada por linfócitos-T citotóxicos ou células auxiliares- T, respectivamente.
[0058]Um “receptor” é para ser entendido como significando uma molécula biológica ou um agrupamento de moléculas capaz de ligação de um ligante. Um receptor pode servir, para transmitir informação em uma célula, uma formação de célula ou um organismo. O receptor compreende pelo menos uma unidade receptora e preferivelmente duas unidades receptoras, onde cada unidade receptora pode consistir em uma molécula de proteína, em particular uma molécula de glicoproteína. O receptor tem uma estrutura que complementa aquela de um ligante e pode complexar o ligante como um parceiro de ligação. A informação é transmitida em particular através de mudanças de conformação do receptor seguindo complexação do ligante sobre a superfície de uma célula. De acordo com a invenção, um receptor é para ser entendido como significando em particular proteínas de MHC de classes I e II capazes de formar um complexo de ligante / receptor com um ligante, em particular um peptídeo ou fragmento de peptídeo de apropriado comprimento. Um “ligante” é para ser entendido como significando uma molécula que tem uma estrutura complementar àquela de um receptor e é capaz de formar um complexo com este receptor. De acordo com a invenção, um ligante é para ser entendido como significando em particular um peptídeo ou fragmento de peptídeo que tem um apropriado comprimento e apropriados motivos de ligação em sua sequência de aminoácidos, de modo que o peptídeo ou fragmento de peptídeo seja capaz de formar um complexo com proteínas de MHC de classe I ou de MHC de classe II.
[0059]Um “complexo de ligante / receptor” é também entendido como signifi-cando um “complexo de peptídeo / receptor” ou “complexo de fragmento de peptídeo / receptor”, em particular uma molécula MHC de classe I ou de classe II apresentando um peptídeo ou fragmento de peptídeo.
[0060]“Proteínas ou moléculas do complexo de histocompatibilidade principal (MHC)”, “moléculas MHC”, “proteínas MHC” ou “proteínas HLA” são para serem en-tendidos como significando, em particular, proteínas capazes de ligação de peptídeos resultantes da clivagem proteolítica de antígenos proteínas e representando poten-ciaisepítopos de célula-T, transportando os mesmos para a superfície de célula e apresentando os mesmos para específicas células, em particular células auxiliares-T ou linfócitos-T citotóxicos. O complexo de histocompatibilidade principal no genoma compreende a região genética cujos produtos genes expressos sobre a superfície de célula são importantes para ligação e apresentação de antígenos endógenos e/ou es-tranhos e assim para regulação de processos imunológicos. O complexo de histocom- patibilidade principal é classificado em dois grupos de genes codificando para diferen-tesproteínas, por exemplo, moléculas de MHC de classe I e moléculas de MHC de classe II. As moléculas das duas classes MHC são especializadas para diferentes fontes de antígenos. As moléculas de MHC de classe I apresentam antígenos sintetizados endogenamente, por exemplo, proteínas virais e antígenos tumorais . As moléculas de MHC de classe II apresentam antígenos proteínas originando de fontes exógenas, por exemplo, produtos bacterianos. A biologia celular e os padrões de expressão das duas classes MHC são adaptados para estes diferentes papéis.
[0061]Moléculas MHC de classe I consistem em uma cadeia pesada e uma cadeia leve e são capazes de ligação de um peptídeo de cerca de 8 a 11 aminoácidos, mas usualmente 9 ou 10 aminoácidos, se este peptídeo tem apropriados motivos de ligação, e apresenta o mesmo para linfócitos T citotóxicos. O peptídeo ligado pelas moléculas MHC de classe I origina-se de um antígeno de proteína endógena. A cadeia pesada das moléculas MHC de classe I é preferivelmente um monômero HLA-A, HLA- B ou HLA-C, e a cadeia leve é beta-2-microglobulina.
[0062]Moléculas MHC de classe II consistem em uma cadeia alfa e uma cadeia beta e são capazes de ligar um peptídeo de cerca de 15 a 24 aminoácidos se este peptídeo tem apropriados motivos de ligação, e apresentar o mesmo para células T auxiliares. O peptídeo ligado pelas moléculas MHC de classe II usualmente origina- se de um antígeno proteína exógeno extracelular. A cadeia alfa e a cadeia beta são em particular monômeros HLA-DR, HLA-DQ e HLA-DP.
[0063]Uma “vacina” é para ser entendida como significando uma composição para geração de imunidade para a profilaxia e/ou tratamento de doenças. Da mesma maneira, vacinas são medicamentos que compreendem antígenos e são pretendidos para serem usados em humanos ou animais para geração de específica defesa e substância protetora através de vacinação.
[0064]“Isolado” significa que o polinucleotídeo ou polipeptídeo ou seu frag-mento, variante, ou derivado foi essencialmente removido de outros materiais biológicos com os quais ele está naturalmente associado, ou essencialmente livre de outros materiais biológicos derivados de, por exemplo, de uma célula hospedeira recombi- nante que foi modificada geneticamente para expressar o polipeptídeo da invenção.
[0065]“Neoantígeno” significa uma classe de antígenos tumorais que surge de mutações específicas de tumor em proteína expressa.
[0066]“Purificado” significa que o polinucleotídeo ou polipeptídeo ou seu frag-mento, variante, ou derivado é substancialmente livre de outro material biológico com o qual ele está naturalmente associado, ou livre de outros materiais biológicos derivados, por exemplo, de uma célula hospedeira recombinante que foi geneticamente modificada para expressar o polipeptídeo da invenção. Ou seja, por exemplo, um poli- peptídeo purificado da presente invenção é um polipeptídeo que é pelo menos cerca de 70-100% puro, isto é, o polipeptídeo está presente em uma composição onde o polipeptídeo constitui cerca de 70-100% em peso da composição total. Em algumas realizações, o polipeptídeo purificado da presente invenção é cerca de 75%-99% em peso puro, cerca de 80%-99% em peso puro, cerca de 90-99% em peso puro, ou cerca de 95% a 99% em peso puro.
Identificação de Mutações Específicas de Tumor
[0067]A presente invenção é baseada, na identificação de certas mutações (por exemplo, as variantes ou alelos que estão presentes em células de câncer). Em particular, estas mutações estão presentes no genoma de células cancerosas de um indivíduo tendo câncer mas não em tecido normal do sujeito.
[0068]Mutações genéticas em tumores podem ser consideradas úteis para o direcionamento imunológico de tumores se elas podem conduzir a mudanças na se-quência de aminoácidos de uma proteína exclusivamente no tumor. Mutações úteis incluem: (1) mutações não-sinônimas conduzindo a diferentes aminoácidos na proteína; (2) mutações de leitura através nas quais um códon de interrupção é modificado ou suprimido, conduzindo a tradução de uma proteína mais longa com uma nova sequência específica de tumor no terminus-C; (3) mutações de emenda de sítio que conduzem à inclusão de um íntron no mRNA maduro e assim uma sequência de proteína específica de tumor única; (4) rearranjos cromossomais que originam uma proteína quimérica com sequências específicas de tumor na junção de 2 proteínas (isto é, fusão de gene); (5) mutações de troca de fase de leitura ou supressões que conduzem a um novo quadro de leitura aberto com uma nova sequência de proteína específica de tumor.
[0069]Peptídeos com mutações ou polipeptídeos que sofreram mutação surgindo de, por exemplo, mutações de emenda de sítio, troca de fase de leitura, leitura através, fusão de gene em células tumorais podem ser identificados através de se- quenciamento de DNA, RNA ou proteína em células normais versus tumor.
[0070]Também dentro do escopo da invenção estão peptídeos incluindo pré-viasmutações específicas de tumor identificadas. Mutação de tumor conhecida pode ser encontrada em http://www.sanger.ac.uk/cosmic.
[0071]Uma variedade de processos são disponíveis para detecção de presença de uma particular mutação ou alelo em um DNA ou RNA de indivíduo. Avanços neste campo proveram genotipificação SNP em larga escala acurada, fácil, e barata. Mais recentemente, por exemplo, várias novas técnicas foram descritas incluindo hi- bridização específica de alelo dinâmica (DASH), eletroforese de gel em diagonal de arranjo de microplaca (MADGE), piro-sequenciamento, ligação específica de oligonu- cleotídeo, o sistema TaqMan assim como várias tecnologias de “chip” de DNA tais como os chips Affymetrix SNP. Estes processos requerem amplificação da região genética alvo, tipicamente através de PCR. Ainda outros processos recentemente desenvolvidos, baseados na geração de pequenas moléculas sinais através de clivagem invasiva seguida por espectrometria de massa ou sondas cadeado imobilizadas e amplificação de círculo - rolante, podem eventualmente eliminar a necessidade de PCR. Vários dos processos conhecidos na técnica para detecção de específicos polimorfismos de nucleotídeo simples são resumidos abaixo. O processo da presente invenção
[0072]PCR baseada em meios de detecção pode incluir amplificação multiplex de uma pluralidade de marcadores simultaneamente. Por exemplo, é bem conhecido na técnica selecionar iniciadores de PCR para geração de produtos de PCR que não se sobrepõem em tamanho e podem ser analisados simultaneamente. Alternativamente,é possível amplificar diferentes marcadores com iniciadores que são rotulados diferencialmente e assim podem ser, cada um, diferencialmente detectados. É claro, detecção baseada em hibridização significa permitir a detecção diferencial de múltiplos produtos de PCR em uma amostra. Outras técnicas são conhecidas para permitirem as análises multiplex de uma pluralidade de marcadores.
[0073]Vários processos foram desenvolvidos para facilitar a análise de poli-morfismos de nucleotídeo simples em DNA genômico ou RNA celular. Em uma reali-zação, o polimorfismo de base simples pode ser detectado através de uso de um nu- cleotídeo resistente a exonuclease especializado, como mostrado, por exemplo, em Mundy, C.R>. (patente U.S. 4 656 127). De acordo com o processo, um iniciador com-plementar para a sequência alélica imediatamente 3’ para o sítio polimórfico é permitido hibridizar para uma molécula alvo obtida de um particular humano ou animal. Se o sítio polimórfico sobre a molécula alvo contém um nucleotídeo que é complementar para o particular derivado de nucleotídeo resistente a exonuclease presente, então ste derivado será incorporado sobre a extremidade do iniciador hibridizado. Tal incorporação torna o iniciador resistente a exonuclease, e pelo que permite sua detecção. Uma vez que a identidade do derivado resistente a exonuclease da amostra é conhecida, uma verificação de que o iniciador tornou-se resistente a exonuclease revela que o nucleotídeo presente no sítio polimórfico da molécula alvo foi complementar àquele do derivado nucleotídeo usado na reação. Este processo tem a vantagem de que ele não requer a determinação de grandes quantidades de dados de sequência estranha.
[0074]Em uma outra realização da invenção, um processo baseado em solução é usado para determinação de identidade do nucleotídeo de um sítio polimór- fico. Cohen, D. et al. (patente FR 2 650 840; pedido PCT No. WO91/02087). Como no processo Mundy de patente U.S. 4 656 127, um iniciador é empregado que é comple-mentar para sequências alélicas imediatamente 3’ para um sítio polimórfico. O processo determina a identidade do nucleotídeo daquele sítio usando derivados dideoxi- nucleotídeo marcados, que, se complementares para o nucleotídeo do sítio polimór- fico tornar-se-ão incorporados sobre o terminus do iniciador.
[0075]Um processo alternativo, conhecido como Genetic Bit Analysis ou GBA é descrito por Goelet, P. et al. (PCT Appln. No. 92/15712). O processo de Goelet, P. et al. usa misturas de terminadores marcados e um iniciador que é complementar para a sequência 3’ para um sítio polimórfico. O terminador marcado que é incorporado é assim determinado através de, e complementar a, o nucleotídeo presente no sítio po- limórfico da molécula alvo sendo avaliada. Em contraste ao processo de Cohen et al. (patente FR 2 650 840; PCT Appln. No. WO91/02087) o processo de Goelet, P. et al. é preferivelmente um ensaio de fase heterogênea, no qual o iniciador ou a molécula alvo é imobilizada em uma fase sólida.
[0076]Recentemente, vários procedimentos de incorporação de nucleotídeo guiada por iniciador para ensaio de sítios polimórficos em DNA foram descritos (Komher, J. S. et al., Nucl. Acids. Res. 17:7779-7784 (1989); Sokolov, B. P., Nucl. Acids Res. 18:3671 (1990); Syvanen, A.-C., et al., Genomics 8:684-692 (1990); Ku- ppuswamy, M. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:1143- 1147 (1991); Prezant, T. R. et al., Hum. Mutat. 1:159-164 (1992); Ugozzoli, L. et al., GATA 9:107-112 (1992); Nyren, P. et al., Anal. Biochem. 208:171-175 (1993)). Estes processos diferem de GBA em que todos eles baseiam-se na incorporação de desoxinucleotídeos marcados para discriminação entre bases em um sítio polimórfico. Em um tal formato, uma vez que o sinal é proporcional ao número de desoxinucleotídeos incorporados, polimorfismos que ocorrem em corridas do mesmo nucleotídeo podem resultar em sinais que são proporcionais ao comprimento da corrida (Syvanen, A.-C., et al., Amer. J. Hum. Genet. 52:46-59 (1993)).
[0077]Um número de iniciativas está atualmente sendo realizado para obter informação de sequência diretamente de milhões de moléculas individuais de DNA ou RNA em paralelo. Tecnologias de sequenciamento-através de-síntese de molécula simples em tempo real baseiam-se na detecção de nucleotídeos fluorescentes quando eles são incorporados em uma fita nascente de DNA que é complementar para o molde sendo sequenciado. Em um processo, oligonucleotídeos de 30-50 bases em comprimento são covalentemente ancorados na extremidade 5’ para lâminas de cobertura de vidro. Estas fitas ancoradas desempenham duas funções. Primeiro, elas atuam como sítios de captura para as fitas moldes alvos se os moldes são configurados com caudas de captura complementares para os oligonucleotídeos ligados na superfície. Elas também atuam como iniciadores para a extensão de iniciador direcionada por molde que forma as bases da leitura de sequência. Os iniciadores de captura funcionam como um sítio de posição fixa para determinação de sequência usando múltiplos sítios de síntese, detecção, e clivagem química do ligador - corante para remover o corante. Cada ciclo consiste em adição de mistura de nucleotídeo marcado / polimerase, rinsagem, formação de imagem e clivagem de corante. Em um processo alternativo, polimerase é modificada com uma molécula doadora fluorescente e imobilizada sobre uma lâmina de vidro, enquanto cada nucleotídeo é codificado - cor com uma metade fluorescente receptora ligada a um fosfato gama. O sistema detecta a interação entre uma polimerase direcionada fluorescentemente e um nucleotídeo modificado fluorescentemente quando o nucleotídeo torna-se incorporado na cadeia de novo. Também existem outras tecnologias de sequenciamento-através de-síntese.
[0078]Preferivelmente, qualquer plataforma de sequenciamento-através de- síntese apropriada pode ser usada para identificar mutações. Como descrito acima, quatro principais plataformas de sequenciamento-através de-síntese são atualmente disponíveis: o Genome Sequencers de Roche/454 Life sciences, o 1G Analyzer de Illumina/Solexa, o SOLiD system de Applied BioSystems, e o Heliscope sytem de Helicos Biosciences. Plataformas de sequenciamento-através de-síntese também foram descritas por Pacific BioSciences e VisiGen Biotechnologies. Cada uma destas plataformas pode ser usada nos processos da invenção. Em algumas realizações, uma pluralidade de moléculas de ácido nucléico sendo sequenciadas é ligada a um suporte (por exemplo, suporte sólido). Para imobilizar o ácido nucléico sobre um suporte, um sítio de priming universal/sequência de captura pode ser adicionado na extremidade 3’ e/ou extremidade 5’ do molde. Os ácidos nucléicos podem ser ligados ao suporte através de hibridização de sequência de captura para uma sequência complementar ligada covalentemente ao suporte. A sequência de captura (também referida como uma sequência de captura universal) é uma sequência de ácidos nucléicos complementar a uma sequência ligada a um suporte que pode servir duplamente como um iniciador universal.
[0079]Como uma alternativa para uma sequência de captura, um membro de um par de acoplamento (tal como, por exemplo, anticorpo / antígeno, receptor / ligante, ou o par avidina - biotina como descrito em, por exemplo, pedido de patente U.S. No- 2006/0252077)pode ser ligado a cada fragmento a ser capturado sobre uma superfície revestida com um respectivo segundo membro daquele par de acoplamento.
[0080]Subsequente à captura, a sequência pode ser analisada, por exemplo, através de detecção / sequenciamento de molécula simples, por exemplo, como descrito nos Exemplos e na patente U.S. No. 7 283 337, incluindo sequenciamento-através de-síntese dependente de molde. Em sequenciamento-através de-síntese, a molécula de ligação de superfície é exposta a uma pluralidade de nucleotídeos trifosfatos marcados na presença de polimerase. A sequência do molde é determinada pela orem de nucleotídeos marcados incorporados na extremidade 3’ da cadeia crescendo. Isto pode ser feito em tempo real ou pode ser feito em um modo de etapa-e-repetição. Para análise em tempo - real, diferentes rótulos óticos para cada nucleotídeos podem ser incorporados e múltiplos lasers podem ser utilizados para estimulação de nucleo- tídeos incorporados.
[0081]Qualquer tipo de célula ou tecido pode ser utilizado para obter amostras de ácido nucléico para uso nos diagnósticos aqui descritos. Em uma realização preferida, a amostra de DNA ou RNA é obtida de um tumor ou um fluido corpóreo, por exemplo, sangue, obtido através de técnicas conhecidas (por exemplo, perfuração de veia) ou saliva. Alternativamente, testes de ácido nucléico podem ser realizados sobre amostras secas (por exemplo, cabelo ou pele).
[0082]Alternativamente, espectrometria de massa de proteína pode ser usada para identificar ou validar a presença de peptídeos que sofreram mutação ligados a proteínas MHC sobre células de tumor. Peptídeos podem ser eluidos com ácido a partir de células tumorais ou de moléculas HLA que são imuno precipitadas a partir de tumor, e então identificados usando espectrometria de massa.
Peptídeos Neoantigênicos
[0083]A invenção ainda inclui peptídeos isolados que compreendem as muta-ções específicas de tumor identificadas pelos processos da invenção, peptídeos que compreendem mutações específicas de tumor conhecidas, e polipeptídeos mutantes ou seus fragmentos identificados pelo processo da invenção. Estes peptídeos e poli- peptídeos são aqui referidos como “peptídeos neoantigênicos” ou “polipeptídeos neo- antigênicos”. O termo “peptídeo” é usado intercambiavelmente com “peptídeo mutante” e “peptídeo neoantigênico” no presente relatório descritivo para designar uma série de resíduos, tipicamente L-aminoácidos, conectados uns aos outros, tipicamente através de ligações peptídicas entre os grupos alfa-amino e carboxila de aminoácidos adjacentes. Similarmente, o termo “polipeptídeo” é usado intercambiavelmente com “po- lipeptídeo mutante” e “polipeptídeo neoantigênico” no presente relatório descritivo para designar uma série de resíduos, tipicamente L-aminoácidos, conectados uns aos outros, tipicamente por ligações peptídicas entre os grupos alfa amino e carboxila de aminoácidos adjacentes. Os polipeptídeos ou peptídeos podem ser de uma variedade de comprimentos, tanto em suas formas neutras (não-carregadas) ou em formas que são sais, e livres de modificações tais como glicosilação, oxidação de cadeia lateral, ou fosforilação ou contendo estas modificações, indivíduo à condição de que a modificação não destrói a atividade biológica dos polipeptídeos como aqui descritos.
[0084]Em certas realizações o tamanho da pelo menos uma molécula de pep- tídeo neoantigênico pode compreender, mas não é limitado a, cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 11, cerca de 12, cerca de 13, cerca de 14, cerca de 15, cerca de 16, cerca de 17, cerca de 18, cerca de 18, cerca de 19, cerca de 20, cerca de 21, cerca de 22, cerca de 23, cerca de 24, cerca de 25, cerca de 26, cerca de 27, cerca de 28, cerca de 29, cerca de 30, cerca de 31, cerca de 32, cerca de 33, cerca de 34, cerca de 35, cerca de 36, cerca de 37, cerca de 38m cerca de 39, cerca de 40, cerca de 41, cerca de 42, cerca de 43, cerca de 44, cerca de 45, cerca de 46, cerca de 47, cerca de 48, cerca de 49, cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 90, cerca de 100, cerca de 110, cerca de 120 ou maior resíduos de molécula amino, e qualquer faixa dali derivável. Em específicasrealizações as moléculas neoantigênicas são iguais a ou menos que 50 amino- ácidos.
[0085]Em algumas realizações os particulares peptídeos e polipeptídeos ne- oantigênicos da invenção são: para MHC de classe I 13 resíduos ou menos em com-primento e usualmente consistem entre cerca de 8 e cerca de 11 resíduos, particular-mente 9 ou 10 resíduos; para MHC de Classe II, 15-24 resíduos.
[0086]Um peptídeo mais longo pode ser projetado em várias maneiras. Em um caso, quando peptídeos de ligação de HLA são previstos ou conhecidos, um pep- tídeo mais longo pode consistir em: (1) peptídeos ligantes individuais com extensões de 2-5 aminoácidos na direção de terminus N- e C- de cada correspondente produto gene; (2) uma concatenação de alguns ou todos os peptídeos ligantes com sequências estendidas para cada. Em um outro caso, quando sequenciamento revela uma longa (> 10 resíduos) sequência de neoepítopo presente no tumor (por exemplo, devido a um troca de fase de leitura, leitura através ou inclusão de íntron que conduz a uma nova sequência de peptídeo), um peptídeo mais longo pode consistir em: (3) o inteiro estirão de novos aminoácidos específicos de tumor - assim desviando a necessidade de previsão computacional ou testes in vitro de ligação de peptídeo a proteínas HLA. Em ambos os casos, uso de um peptídeo mais longo permite processamento endógeno através de células de paciente e pode conduzir a mais efetiva apresentação de antígeno e indução de respostas de células T.
[0087]Os peptídeos e polipeptídeos neoantigênicos ligam uma proteína HLA. Em alguns aspectos os peptídeos e polipeptídeos neoantigênicos ligam uma proteína HLA com afinidade maior que um peptídeo tipo selvagem. O peptídeo ou polipeptídeo neoantigênico tem uma IC50 de pelo menos menor que 5000 nM, pelo menos menor que 500 nM, pelo menos menor que 250 nM, pelo menos menor que 200 nM, pelo menos menor que 150 nM, pelo menos menor que 100 nM, pelo menos menor que 50 nM ou menos.
[0088]Os peptídeos e polipeptídeos neoangiogênicos não induzem uma resposta autoimune e/ou invocam tolerância imunológica quando administrados a um indivíduo.
[0089]A invenção também provê composições compreendendo pelo menos dois ou mais peptídeos neoantigênicos. Em algumas realizações a composição contêm pelo menos dois peptídeos distintos. Preferivelmente, os pelo menos dois peptí- deos distintos são derivados do mesmo polipeptídeo. Por polipeptídeos distintos é pretendido que o peptídeo varia através de comprimento, sequência de aminoácidos ou ambos. Os peptídeos são derivados de qualquer polipeptídeo conhecido ou verificado através dos processos da invenção conter uma mutação específica de tumor. Apropriados polipeptídeos dos quais os peptídeos neoantigênicos podem ser derivados podem ser encontrados, por exemplo, na base de dados COSMIC (http://www.sanger.ac.uk/cosmic) COSMIC adjunta informação compreensiva sobre mutações somáticas em câncer humano. O peptídeo contém a mutação específica de tumor. Em alguns aspectos a mutação específica de tumor é uma mutação condutora para um particular tipo de câncer. Em alguns aspectos, os peptídeos são derivados de um polipeptídeo SF3B1, um polipeptídeo MYD88, um polipeptídeo TP53, um poli- peptídeo ATM, um polipeptídeo Abl, um polipeptídeo FBXW7, um polipeptídeo DDX3X, um polipeptídeo MAPK1 de um polipeptídeo GNB1.
[0090]Por um peptídeo SF3B1 é pretendido que o peptídeo contém uma porção de um polipeptídeo SF3B1. Preferivelmente, um peptídeo SF3B1 inclui uma leu- cina na posição de aminoácido 625; uma histidina na posição de aminoácido 626; um ácido glutâmico na posição de aminoácido 700; um ácido aspártico na posição de aminoácido 742; ou uma arginina na posição de aminoácido 903, quando numerado de acordo com SF3B1 tipo selvagem. Um SF3B1 tipo selvagem é mostrado na Tabela A (SEQ ID NO: 1). Tabela A: SF3B1 Tipo Selvagem (SEQ ID NO: 1) makiakthedieaqireiqgkkaaldeaqgvgldstgyydqeiyggsdsr fagyvtsiaateledddddyssstsllgqkkpgyhapvallndipqsteq ydpfaehrppkiadredeykkhrrtmiisperldpfadggktpdpkmnar tymdvmreqhltkeereirqqlaekakagelkvvngaaasqppskrkrrw dqtadqtpgatpkklsswdqaetpghtpslrwdetpgrakgsetpgatpg skiwdptpshtpagaatpgrgdtpghatpghggatssarknrwdetpkte rdtpghgsgwaetprtdrggdsigetptpgaskrksrwdetpasqmggst pvltpgktpigtpamnmatptpghimsmtpeqlqawrwereidernrpls deeldamfpegykvlpppagyvpirtparkltatptplggmtgfhmqted rtmksvndqpsgnlpflkpddiqyfdkllvdvdestlspeeqkerkimkl llkikngtppmrkaalrqitdkarefgagplfnqilpllmsptledqerh llvkvidrilyklddlvrpyvhkilvviepllidedyyarvegreiisnl akaaglatmistmrpdidnmdeyvrnttarafavvasalgipsllpflka vckskkswqarhtgikivqqiailmgcailphlrslveiiehglvdeqqk vrtisalaiaalaeaatpygiesfdsvlkplwkgirqhrgkglaaflkai gyliplmdaeyanyytrevmlilirefqspdeemkkivlkvvkqccgtdg veanyikteilppffkhfwqhrmaldrrnyrqlvdttvelankvgaaeii srivddlkdeaeqyrkmvmetiekimgnlgaadidhkleeqlidgilyaf qeqttedsvmlngfgtvvnalgkrvkpylpqicgtvlwrlnnksakvrqq aadlisrtavvmktcqeeklmghlgvvlyeylgeeypevlgsilgalkai vnvigmhkmtppikdllprltpilknrhekvqencidlvgriadrgaeyv sarewmricfellellkahkkairratvntfgyiakaigphdvlatllnn Ikvqerqnrvcttvaiaivaetcspftvlpalmneyrvpelnvqngvlks Isflfeyigemgkdyiyavtplledalmdrdlvhrqtasavvqhmslgvy gfgcedslnhllnyvwpnvfetsphviqavmgaleglrvaigpcrmlqyc Iqglfhparkvrdvywkiynsiyigsqdaliahypriynddkntyiryel dyil
[0091]Por um peptídeo MYD88 é pretendido que o peptídeo contém uma porção de um polipeptídeo MYD88. Preferivelmente, um peptídeo MYD88 inclui uma tre- onina em posição de aminoácido 232; uma leucina em posição de aminoácido 258; ou uma prolina em posição de aminoácido 265, quando numerado de acordo com MYD88 tipo selvagem. Um MYD88 tipo selvagem é mostrado na Tabela B (SEQ ID NO: 2). Tabela B: MYD88 Tipo Selvagem (SEQ ID NO: 2) mrpdraeapgppamaaggpgagsaapvsstsslplaalnmrvrrrlslfl nvrtqvaadwtalaeemdfeyleirqletqadptgrlldawqgrpgasvg rllelltklgrddvllelgpsieedcqkyilkqqqeeaekplqvaavdss vprtaelagittlddplghmperfdaficycpsdiqfvqemirqleqtny rlklcvsdrdvlpgtcvwsiaseliekrcrrmvvvvsddylqskecdfqt kfalslspgahqkrlipikykamkkefpsilrfitvcdytnpctkswfwt rlakalslp
[0092]Por um peptídeo TP53 é pretendido que o peptídeo contenha uma porção de um polipeptídeo TP53. Preferivelmente, o peptídeo TP53 inclui tanto uma ar- ginina em posição de aminoácido 111; uma arginina em posição de aminoácido 215; uma serina em posição de aminoácido 238; uma glutamina em posição de aminoácido 248; uma fenil alanina em posição de aminoácido 255; uma cisteína em posição de aminoácido 273 ou uma asparagina em posição de aminoácido 281, quando numerado de acordo com TP53 tipo selvagem. Um TP53 tipo selvagem é mostrado na Tabela C (SEQ ID NO: 3).Tabela C: TP53 Tipo Selvagem (SEQ ID NO: 3) meepqsdpsvepplsqetfsdlwkllpennvlsplpsqamddlmlspddi eqwftedpgpdeaprmpeaappvapapaaptpaapapapswplsssvpsq ktyqgsygfrlgflhsgtaksvtctyspalnkmfcqlaktcpvqlwvdst pppgtrvramaiykqsqhmtevvrrcphhercsdsdglappqhlirvegn lrveylddrntfrhsvvvpyeppevgsdcttihynymcnsscmggmnrrp iltiitledssgnllgrnsfevrvcacpgrdrrteeenlrkkgephhelp pgstkralpnntssspqpkkkpldgeyftlqirgrerfemfrelnealel
[0093]Por um peptídeo ATM é pretendido que o peptídeo contenha uma porção de um polipeptídeo SF3B1. Preferivelmente, um peptídeo ATM inclui uma fenil alanina na posição de aminoácido 1252; uma arginina na posição de aminoácido 2038; uma histidina na posição de aminoácido 2522; ou uma cisteína na posição de amino- ácido 2954, quando numerado de acordo com ATM tipo selvagem.Um ATM tipo selvagem é mostrado na Tabela D (SEQ ID NO: 4).Tabela D: ATM Tipo Selvagem (SEQ ID NO: 4) mslvlndlliccrqlehdraterkkevekfkrlirdpetikhldrhsdsk qgkylnwdavfrflqkyiqketeclriakpnvsastqasrqkkmqeissl vkyfikcanrraprlkcqellnyimdtvkdssngaiygadcsnillkdil svrkywceisqqqwlelfsvyfrlylkpsqdvhrvlvariihavtkgccs qtdglnskfldffskaiqcarqeksssglnhilaaltiflktlavnfrir vcelgdeilptllyiwtqhrlndslkeviielfqlqiyihhpkgaktqek gayestkwrsilynlydllvneishigsrgkyssgfrniavkenlielma dichqvfnedtrsleisqsytttqressdysvpckrkkielgwevikdhl qksqndfdlvpwlqiatqliskypaslpncelspllmilsqllpqqrhge rtpyvlrcltevalcqdkrsnlessqksdllklwnkiwcitfrgisseqi qaenfgllgaiiqgslvevdrefwklftgsacrpscpavccltlalttsi vpgtvkmgieqnmcevnrsfslkesimkwllfyqlegdlenstevppilh snfphlvlekilvsltmknckaamnffqsvpecehhqkdkeelsfsevee lflqttfdkmdfltivrecgiekhqssigfsvhqnlkesldrcllglseq llnnysseitnsetlvrcsrllvgvlgcycymgviaeeeaykselfqkak slmqcagesitlfknktneefrigslrnmmqlctrclsnctkkspnkias gfflrlltsklmndiadickslasfikkpfdrgevesmeddtngnlmeve dqssmnlfndypdssvsdanepgesqstigainplaeeylskqdllfldm lkflclcvttaqtntvsfraadirrkllmlidsstleptkslhlhmylml lkelpgeeyplpmedvlellkplsnvcslyrrdqdvcktilnhvlhvvkn lgqsnmdsentrdaqgqfltvigafwhltkerkyifsvrmalvnclktll eadpyskwailnvmgkdfpvnevftqfladnhhqvrmlaaesinrlfqdt kgdssrllkalplklqqtafenaylkaqegmremshsaenpetldeiynr ksvlltliavvlscspicekqalfalcksvkenglephlvkkvlekvset fgyrrledfmashldylvlewlnlqdteynlssfpfillnytniedfyrs cykvliphlvirshfdevksianqiqedwkslltdcfpkilvnilpyfay egtrdsgmaqqretatkvydmlksenllgkqidhlfisnlpeivvellmt lhepanssasqstdlcdfsgdldpapnpphfpshvikatfayisnchktk lksileilskspdsyqkillaiceqaaetnnvykkhrilkiyhlfvslll kdiksglggawafvlrdviytlihyinqrpscimdvslrsfslccdllsq vcqtavtyckdalenhlhvivgtliplvyeqvevqkqvldllkylvidnk dnenlyitiklldpfpdhvvfkdlritqqkikysrgpfslleeinhflsv svydalpltrleglkdlrrqlelhkdqmvdimrasqdnpqdgimvklvvn llqlskmainhtgekevleavgsclgevgpidfstiaiqhskdasytkal klfedkelqwtfimltylnntlvedcvkvrsaavtclknilatktghsfw eiykmttdpmlaylqpfrtsrkkflevprfdkenpfeglddinlwiplse nhdiwiktltcafldsggtkceilqllkpmcevktdfcqtvlpylihdil Iqdtneswrnllsthvqgfftsclrhfsqtsrsttpanldsesehffrcc Idkksqrtmlavvdymrrqkrpssgtifndafwldlnylevakvaqscaa hftallyaeiyadkksmddqekrslafeegsqsttisslsekskeetgis Iqdllleiyrsigepdslygcgggkmlqpitrlrtyeheamwgkalvtyd letaipsstrqagiiqalqnlglchilsvylkgldyenkdwcpeleelhy qaawrnmqwdhctsvskevegtsyheslynalqslrdrefstfyeslkya rvkeveemckrslesvyslyptlsrlqaigelesigelfsrsvthrqlse vyikwqkhsqllkdsdfsfqepimalrtvileilmekemdnsqrecikdi Itkhlvelsilartfkntqlperaifqikqynsvscgvsewqleeaqvfw akkeqslalsilkqmikkldascaannpslkltyteclrvcgnwlaetcl enpavimqtylekavevagnydgessdelrngkmkaflslarfsdtqyqr ienymkssefenkqallkrakeevgllrehkiqtnrytvkvqreleldel alralkedrkrflckavenyincllsgeehdmwvfrlcslwlensgvsev ngmmkrdgmkiptykflplmyqlaarmgtkmmgglgfhevlnnlisrism dhphhtlfiilalananrdefltkpevarrsritknvpkqssqldedrte aanriictirsrrpqmvrsvealcdayiilanldatqwktqrkginipad qpitklknledvvvptmeikvdhtgeygnlvtiqsfkaefrlaggvnlpk iidcvgsdgkerrqlvkgrddlrqdavmqqvfqmcntllqrntetrkrkl tictykvvplsqrsgvlewctgtvpigeflvnnedgahkryrpndfsafq cq kkm m evq kksfeekyevfm dvcqnfq pvfryfcmekfldpa iwfe krl aytrsvatssivgyilglgdrhvqnilineqsaelvhidlgvafeqgkil ptpetvpfrltrdivdgmgitgvegvfrrccektmevmrnsqetlltive vllydplfdwtmnplkalylqqrpedetelhptlnaddqeckrnlsdidq sfnkvaervlmrlqeklkgveegtvlsvggqvnlliqqaidpknlsrlfp gwkawv
[0094]Por um peptídeo Ab1 é pretendido que o peptídeo contém uma porção de um polipeptídeo Ab1. Preferivelmente, um peptídeo Bcr-ab1 inclui uma valina em posição de aminoácido 244; uma valina em posição de aminoácido 248; um ácido glutâmico em posição de aminoácido 250; uma alanina em posição de aminoácido 250; uma histidina em posição de aminoácido 252; uma arginina em posição de ami- noácido 252; uma fenil alanina em posição de aminoácido 253; uma histidina em posição de aminoácido 253; uma lisina em posição de aminoácido 255; uma valina em posição de aminoácido 255; uma glicina em posição de aminoácido 276; uma isoleu- cina em posição de aminoácido 315; uma asparagina em posição de aminoácido 315; uma leucina em posição de amino ácido 317; uma treonina em posição de amino ácido 343; uma treonina em posição de amino ácido 351; uma glicina na posição de amino ácido 355; uma valina na posição de amino ácido 359; uma alanina na posição de amino ácido 359; uma isoleucina na posição de amino ácido 379; uma leucina na posição de amino ácido 382; uma metionina na posição de aminoácido 387; uma prolina na posição de aminoácido 396; uma arginina na posição de aminoácido 396; uma tirosina na posição de aminoácido 417; ou uma serina na posição de aminoácido 486, quando numerado de acordo com Ab1 tipo selvagem. Um Ab1 tipo selvagem é mostrado na Tabela E (SEQ ID NO: 5). Tabela E: Ab1 Tipo Selvagem (SEQ ID NO: 5) MLEICLKLVGCKSKKGLSSSSSCYLEEALQRPVASDFEPQGLSEAARWNSKENLLA GPSENDPNLFVALYDFVASGDNTLSITKGEKLRVLGYNHNGEWCEAQTKNGQGWVPSNYITPVNSLEKH SWYHGPVSRNAAEYLLSSGINGSFLVRESESSPGQRSISLRYEGRVYHYRINTASDGKLYVSSESRFNTLAEL VHHHSTVADGLITTLHYPAPKRNKPTVYGVSPNYDKWEMERTDITMKHKLGGGQYGEVYEGVWKK YSLTVAVKTLKEDTMEVEEFLKEAAVMKEIKHPNLVQLLGVCTREPPFYIITEFMTYGNLLDYLRECNRQEVN AVVLLYMATQISSAMEYLEKKNFIHRDLAARNCLVGENHLVKVADFGLSRLMTGDTYTAHAGAKFPIK WTAPESLAYNKFSIKSDVWAFGVLLWEIATYGMSPYPGIDLSQVYELLEKDYRMERPEGCPEKVYELMRA CWQWNPSDRPSFAEIHQAFETMFQESSISDEVEKELGKQGVRGAVSTLLQAPELPTKTRTSRRAAEHRDTTD VPEMPHSKGQGESD PLDHEPAVSPLLPRKERGPPEGGLNEDERLLPKDKKTNLFSALIKKKKKTAPTPPKR SSSFREMDGQPER RGAGEEEGRDISNGALAFTPLDTADPAKSPKPSNGAGVPNGALRESGGSGFRSPHL WKKSSTLTSSRLATGEEEGGGS S SKRFLRSCSASCVPHGAKDTEWRSVTLPRDLQSTGRQFDSSTFGGHK SEKPALPRKRAGENRSDQVTRGTVTPPPRLVKKNEEAADEVFKDIMESSPGSSPPNLTPKPLRRQVTVAPA SGLPHKEEAGKGS ALGTPAAAEPVTPTSKAGSGAPGGTSKGPAEESRVRRHKHSSESPGRDKGKLSRLK PAPPPPPAASAGKAGGKPSQSPSQEAAGEAVLGAKTKATSLVDAVNSDAAKPSQPGEGLKKPVLPATPK PQSAKPSGTPISPAPVPSTLPSASSALAGDQPSSTAFIPLISTRVSLRKTRQPPERIASGAITKGVVLDSTEAL CLAISRNSEQMASHSAVLEAGKNLYTFCVSYVDSIQQMRNKFAFREAINKLENNLRELQICPATAGS GPAATQDFSKLLSSVKEISDIVQR
[0095]Por um peptídeo FBXW7 é pretendido que o peptídeo contém uma porção de um polipeptídeo FBXW7. Preferivelmente, um peptídeo FBXW7 inclui uma leu- cina em posição de aminoácido 280; uma histidina em posição de amino ácido465; uma cisteína em posição de amino ácido 505; ou um ácido glutâmico em posição de amino ácido 597, quando numerado de acordo com FBXW7 tipo selvagem. Um FBXW7 tipo selvagem é mostrado na Tabela F (SEQ ID NO: 6). Tabela F: FBXW7 Tipo Selvagem (SEQ ID NO: 6) mnqellsvgskrrrtggslrgnpsssqvdeeqmnrvveeeqqqqlrqqee ehtarngevvgveprpggqndsqqgqleennnrfisvdedssgnqeeqee deehageqdeedeeeeemdqesddfdqsddssredehthtnsvtnsssiv dlpvhqlsspfytkttkmkrkldhgsevrsfslgkkpckvseytsttglv pcsatpttfgdlraangqgqqrrritsvqpptglqewlkmfqswsgpekl laldelidsceptqvkhmmqviepqfqrdfisllpkelalyvlsflepkd llqaaqtcrywrilaednllwrekckeegideplhikrrkvikpgfihsp wksayirqhridtnwrrgelkspkvlkghddhvitclqfcgnrivsgsdd ntlkvwsavtgkclrtlvghtggvwssqmrdniiisgstdrtlkvwnaet gecihtlyghtstvrcmhlhekrvvsgsrdatlrvwdietgqclhvlmgh vaavrcvqydgrrvvsgaydfmvkvwdpetetclhtlqghtnrvyslqfd gihvvsgsldtsirvwdvetgncihtltghqsltsgmelkdnilvsgnad stvkiwdiktgqclqtlqgpnkhqsavtclqfnknfvitssddgtvklwd lktgefirnlvtlesggsggvvwrirasntklvcavgsrngteetkllvl dfdvdmk
[0096]Por um peptídeo DDX3X é pretendido que o peptídeo contenha uma porção de um polipeptídeo DDX3X. Um peptídeo DDX3X é um peptídeo que é o re-sultado de uma mutação não-sinônima em posição de aminoácido 24; um sitio de emenda em posição de aminoácido 342 ou um troca de fase de leitura em posição de aminoácido 410 quando numerado de acordo com DDX3X tipo selvagem. Um DD3X tipo selvagem é mostrado na Tabela G (SEQ ID NO: 7). Tabela F: DDX3XTipo Selvagem (SEQ ID NO: 7) mshvavenalgldqqfagldlnssdnqsggstaskgryipphlrnreatk gfydkdssgwssskdkdayssfgsrsdsrgkssffsdrgsgsrgrfddrg rsdydgigsrgdrsgfgkferggnsrwcdksdeddwskplppserleqel fsggntginfekyddipveatgnncpphiesfsdvemgeiimgnieltry trptpvqkhaipiikekrdlmacaqtgsgktaafllpilsqiysdgpgea lramkengrygrrkqypislvlaptrelavqiyeearkfsyrsrvrpcvv yggadigqqirdlergchllvatpgrlvdmmergkigldfckylvldead rmldmgfepqirriveqdtmppkgvrhtmmfsatfpkeiqmlardfldey iflavgrvgstsenitqkvvwveesdkrsflldllnatgkdsltlvfvet kkgadsledflyhegyactsihgdrsqrdreealhqfrsgkspilvatav aargldisnvkhvinfdlpsdieeyvhrigrtgrvgnlglatsffnerni nitkdlldllveakqevpswlenmayehhykgssrgrskssrfsggfgar dyrqssgassssfsssrasssrsgggghgssrgfggggyggfynsdgygg nynsqgvdwwgn
[0097]Por um peptídeo MAPK1 é pretendido que o peptídeo contenha uma porção de um polipeptídeo MAPK1. Preferivelmente, um peptídeo MAPK1 inclui uma asparagina em posição de aminoácido 162; uma glicina em posição de aminoácido 291; ou uma fenil alanina em posição de aminoácido316, quando numerado de acordo com MAPK1 tipo selvagem. Um MAPK1 tipo selvagem é mostrado em Tabela H (SEQ ID NO: 8). Tabela F: MAPK1 Tipo Selvagem (SEQ ID NO: 8) maaaaaagagpemvrgqvfdvgprytnlsyigegaygmvcsaydnvnkvr vaikkispfehqtycqrtlreikillrfrheniigindiiraptieqmkd vyivqdlmetdlykllktqhlsndhicyflyqilrglkyihsanvlhrdl kpsnlllnttcdlkicdfglarvadpdhdhtgflteyvatrwyrapeiml nskgytksidiwsvgcilaemlsnrpifpgkhyldqlnhilgilgspsqe dlnciinlkarnyllslphknkvpwnrlfpnadskaldlldkmltfnphk rieveqalahpyleqyydpsdepiaeapfkfdmelddlpkeklkelifee tarfqpgyrs
[0098]Por um peptídeo GNB1 é pretendido que o peptídeo contenha uma porção de um polipeptídeo GNB1. Preferivelmente, um peptídeo GNB1 inclui uma treo- nina em posição de aminoácido 180, quando numerado de acordo com GNB1 tipo selvagem. Um GNB1 tipo selvagem é mostrado na Tabela I (SEQ ID NO: 9).Tabela 1: GNB1 Tipo Selvagem (SEQ ID NO: 9) mseldqlrqeaeqlknqirdarkacadatlsqitnnidpvgriqmrtrrt lrghlakiyamhwgtdsrllvsasqdgkliiwdsyttnkvhaiplrsswv mtcayapsgnyvacggldnicsiynlktregnvrvsrelaghtgylsccr flddnqivtssgdttcalwdietgqqtttftghtgdvmslslapdtrlfv sgacdasaklwdvregmcrqtftghesdinaicffpngnafatgsddatc rlfdlradqelmtyshdniicgitsvsfsksgrlllagyddfncnvwdal kadragvlaghdnrvsclgvtddgmavatgswdsflkiwn
[0099]Peptídeos e polipeptídeos neoantígênicos tendo a desejada atividade podem ser modificados quando necessário para provimento de certos atributos dese-jados, por exemplo, aperfeiçoadas características farmacológicas, enquanto aumentando ou pelo menos retendo substancialmente toda a atividade biológica do peptídeo não-modificado para ligar a desejada molécula MHC e ativar a apropriada célula T. Por exemplo, o peptídeo e polipeptídeos neoantigênicos podem ser submetidos a várias mudanças, tais como substituições, tanto conservativas como não-conservativas, onde tais mudanças podem prover certas vantagens em seu uso, tal como aperfeiçoada ligação de MHC. Por substituição conservativa é pretendido substituição de um resíduo de aminoácido com um outro que é biologicamente e/ou quimicamente similar, por exemplo, um resíduo hidrofóbico por outro, ou um resíduo polar por outro. As substituições incluem combinações tais como Gly, Ala; Val, Ile, Leu, Met; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; e Phe, Tyr. O efeito de substituições de aminoácidos simples também pode ser sondado usando D-aminoácidos. Tais modificações podem ser feitas usando-se procedimentos de síntese de peptídeo bem conhecidos, como descritos em, por exemplo, Merrifield, Science 232:341-347 (1986), Barany & Merrifield, The Peptides, Gross & Meienhofer, eds. (N.Y., Academic Press), pp. 1-284 (1979); e Stewart & Young, Solid Phase Peptide Synthesis, (Rockford, III., Pierce), 2d Ed. (1984).
[00100]O peptídeo e polipeptídeos neoantigênicos também podem ser modi-ficadosatravés de extensão ou diminuição de sequência de aminoácidos de composto, por exemplo, através de adição ou supressão de aminoácidos. Os peptídeos, polipep- tídeos ou análogos também podem ser modificados através de alteração de ordem ou composição de certos resíduos, sendo facilmente apreciado que certos resíduos de aminoácidos essenciais para atividade biológica, por exemplo, aqueles em sítios de contato críticos ou resíduos conservados, genericamente não podem ser alterados sem um efeito adverso sobre atividade biológica. Os aminoácidos não-críticos não precisam ser limitados àqueles ocorrendo naturalmente em proteínas, tais como L- alfa-aminoácidos, ou seus D-isômeros, mas também podem incluir aminoácidos não— naturais, tais como β, Y, δ-aminoácidos, assim como muitos derivados de L-alfa-ami- noácidos.
[00101]Tipicamente, uma série de peptídeos com substituições de aminoáci- dos simples são empregados para determinar o efeito de carga eletrostática, hidrofo- bicidade, etc., sobre ligação. Por exemplo, uma série de substituições de aminoácidos carregados positivamente (por exemplo, Lys ou Arg) ou carregados negativamente (por exemplo, Glu) são feitas ao longo do comprimento do peptídeo revelando diferentes padrões de sensitividade na direção de várias moléculas MHC e receptores de célula T. Em adição, múltiplas substituições usando metades relativamente neutras, pequenas, tais como Ala, Gly, Pro, ou resíduos similares podem ser empregadas. As substituições podem ser homo - oligômeros ou hetero - oligômeros. O número e tipos de resíduos que são substituídos ou adicionados dependem do espaçamento necessário entre pontos de contato essenciais e certos atributos funcionais que são procurados (por exemplo, hidrofobicidade versus hidrofilicidade). Aumentada afinidade de ligação para uma molécula MHC ou receptor de célula T também pode ser obtida através de tais substituições, comparada à afinidade do peptídeo parente. Em qualquer caso, tais substituições devem empregar resíduos de aminoácidos ou outros fragmentos moleculares escolhidos para evitar, por exemplo, interferência estérea e de carga que podem interromper a ligação.
[00102]Substituições de aminoácidos são tipicamente de resíduos simples. Substituições, supressões, inserções ou qualquer combinação das mesmas podem ser combinadas para chegar-se a um peptídeo final. Variantes de substituição são aquelas onde pelo menos um resíduo de um peptídeo foi removido e um resíduo diferente inserido em seu lugar. Tais substituições genericamente são feitas de acordo com a seguinte Tabela quando é desejado modular finamente as características do peptídeo.Resíduo Original Substituição Exemplar Ala Ser Arg Lys, His Asn Gln Asp Glu Cys Ser Gln Asn Glu Asp Gly Pro His Lys; Arg Ile Leu; Val Leu Ile; Val Lys Arg; His Met Leu; Ile Phe Tyr; Trp Ser Thr Thr Ser Trp Tyr; Phe Tyr Trp; Phe Val Ile; Leu Pro Gly
[00103]Substanciais mudanças em função (por exemplo, afinidade para mo-léculas MHC ou receptores de células T) são feitas através de seleção de substituições que são menos conservativas que aquelas na Tabela acima, isto é, seleção de resíduos que diferem mais significantemente em seu efeito sobre manutenção de (a) a estrutura da cadeia principal de peptídeo na área da substituição, por exemplo, como uma conformação de folha ou helicoidal, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo ou (c) o volume da cadeia lateral. As substituições que em geral são esperadas produzirem as maiores mudanças em propriedades de peptídeo serão aquelas nas quais (a) resíduo hidrofílico, por exemplo, serila, é substituto para (ou por) um resíduo hidrofóbico, por exemplo, leucila, isoleucila, fenil alanila, valila ou alanila; (b) um resíduo tendo uma cadeia lateral eletropositiva, por exemplo, lisila, arginila, ou histidila, é substituto para (ou por) um resíduo eletronegativo, por exemplo, glutamila ou aspartila; ou (c) um resíduo tendo uma cadeia lateral volumosa, por exemplo, fenil alanina, é substituto para (ou por) um não tendo uma cadeia lateral, por exemplo gli- cina.
[00104]Os peptídeos e polipeptídeos também podem compreender isosteres de dois ou mais resíduos nos peptídeos ou polipeptídeos neoantigênicos. Um isostere como aqui definido é uma sequência de dois ou mais resíduos que podem ser substituídos por uma segunda sequência devido a conformação estérea da primeira sequência adaptar-se a um sítio de ligação específico para a segunda sequência. O termo inclui especificamente modificações de cadeia principal de peptídeo bem conhecidas por aqueles versados na técnica. Tais modificações incluem modificações do nitrogênio amida, o carbono alfa, carbonila amida, completa substituição da ligação amida, extensões, supressões ou reticulações de cadeia principal. Ver, genericamente, Spa- tola, Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. VII (Weinstein ed., 1983).
[00105]Modificações de peptídeos e polipeptídeos com vários miméticos de aminoácidos ou aminoácidos não-naturais são particularmente úteis no aumento de estabilidade do peptídeo e polipeptídeo in vivo. Estabilidade pode ser ensaiada em um número de maneiras. Por exemplo, peptidases e vários meios biológicos, tais como plasma e soro humano, têm sido usados para testar estabilidade. Ver, por exemplo, Verhoef et al., Eur. J. Drug Metab Pharmacokin. 11:291-302 (1986). Meia vida dos peptídeos da presente invenção é convenientemente determinada usando um ensaio de soro humano 25% (v/v). O protocolo é genericamente como se segue. Soro humano reunido (Tipo AB, não-termicamente inativado) é deslipidado por centrifugação antes de uso. O soro é então diluído para 25% com meio de cultura de tecido RPMI e usado para testar estabilidade de peptídeo. Em intervalos de tempo predeterminados uma pequena quantidade de solução de reação é removida e adicionada a ácido tri- cloro acético aquoso6%ou etanol. A amostra de reação turva é resfriada (4oC) por 15 minutos e então girada para pelotizar as proteínas de soro precipitadas. A presença dos peptídeos é então determinada por HPLC de fase reversa usando condições de cromatografia específicas - estabilidade.
[00106]Os peptídeos e polipeptídeos podem ser modificados para provimento de outros desejados atributos que não meia vida em soro aperfeiçoada. Por exemplo, a habilidade dos peptídeos para induzir atividade CTL pode ser aperfeiçoada através de ligação a uma sequência que contém pelo menos um epítopo que é capaz de induzir uma resposta de célula auxiliar T. Conjugados auxiliar T / peptídeos imunogêni- cos particularmente preferidos são ligados por uma molécula espaçadora. O espaçador é tipicamente compreendido por moléculas neutras, relativamente pequenas, tais como aminoácidos ou miméticos de aminoácidos, que são substancialmente não-carregados sob condições fisiológicas. Os espaçadores são tipicamente selecionados de, por exemplo, Ala, Gly, ou outros espaçadores neutros de aminoácidos não- polares ou aminoácidos polares neutros. Será entendido que o espaçador opcionalmente presente não precisa ser compreendido pelos mesmos resíduos e assim pode ser um hetero- ou homo-oligômero. Quando presente, o espaçador usualmente será pelo menos um ou dois resíduos, mais usualmente três a seis resíduos. Alternativamente, o peptídeo pode ser ligado ao peptídeo auxiliar T sem um espaçador.
[00107]O peptídeo neoantigênico pode ser ligado ao peptídeo auxiliar T tanto diretamente como via um espaçador no terminus amino ou carboxi do peptídeo. O terminus amino do peptídeo neoantigênico ou o peptídeo auxiliar T pode ser acilado. Peptídeos auxiliares T exemplares incluem toxóide de tétano 830-843, influenza 307319, circunsporozóide de malária 382-398 e 378-389.
[00108]Proteínas ou peptídeos podem ser fabricados através de qualquer técnica conhecida por aqueles versados, incluindo a expressão de proteínas, polipeptí- deos ou peptídeos através de técnicas padrões de biologia molecular, o isolamento de proteínas ou peptídeos a partir de fontes naturais, ou a síntese química de proteínas ou peptídeos. As sequências de nucleotídeo e proteína, polipeptídeo e peptídeo correspondendo a vários genes foram previamente mostradas, e podem ser encontradas em bases de dados computadorizados conhecidas por aqueles versados na técnica. Uma tal base de dados é o National Center for Biotechnology Information’s Genbank and GenPept databases localizados no site de web de National Institutes of Health. As regiões codificantes para genes conhecidos podem ser amplificadas e/ou expressas usando as técnicas aqui mostradas ou como podem ser conhecidas por aqueles versados na técnica. Alternativamente, várias preparações comerciais de proteínas, polipeptídeos e peptídeos são conhecidas por aqueles versados na técnica.
[00109]Ainda em um aspecto a invenção provê um ácido nucléico (por exem-plo,polinucleotídeo) codificando um peptídeo neoantigênico da invenção. O polinucle- otídeo pode ser, por exemplo, DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA, tanto de fita dupla como simples, ou formas nativas ou estabilizadas de polinucleotídeos, tais como, por exem-plo,polinucleotídeos com uma cadeia principal fósforotioato, ou suas combinações e ele pode ou não conter introns tanto quanto ele codifique o peptídeo. É claro, somente peptídeos que contêm resíduos de aminoácidos ocorrendo naturalmente ligados por ligações peptídicas ocorrendo naturalmente são codificáveis por um polinucleotídeo. Ainda um aspecto da invenção provê um vetor de expressão capaz de expressar um polipeptídeo de acordo com a invenção. Vetores de expressão para diferentes tipos de células são bem conhecidos na técnica e podem ser selecionados sem indevida experimentação. Genericamente, o DNA é inserido em um vetor de expressão, tal como um plasmídeo, em própria orientação e correto quadro de leitura para expressão. Se necessário, o DNA pode ser ligado às apropriadas sequências de nucleotídeos de controle regulador traducional e transcricional reconhecidas pelo desejado hospedeiro, embora tais controles sejam genericamente disponíveis no vetor de expressão. O vetoré então introduzido no hospedeiro através de técnicas padrões. Orientação pode ser encontrada, por exemplo, em Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratoy, Cold Spring Harbor, N.Y.
Composições de Vacina
[00110]A presente invenção é direcionada a uma composição imunogênica, por exemplo, uma composição de vacina capaz de elevar uma específica resposta de célula T. A composição de vacina compreende peptídeos mutantes e polipeptídeos mutantes correspondendo a neoantígenos específicos de tumor identificados através dos processos aqui descritos.
[00111]Aqueles versados na técnica serão capazes de selecionar preferidos peptídeos, polipeptídeos ou combinação dos mesmos através de testes, por exemplo, a geração de células T in vitro assim como sua eficiência e presença total, a proliferação, afinidade e expansão de certas células T para certos peptídeos, e a funcionalidade das células T, por exemplo, através de análise de produção de IFN-Y ou morte de tumor por células T. Usualmente, os peptídeos mais eficientes são então combinados como uma vacina.
[00112]Uma vacina apropriada preferivelmente conterá entre 1 e 20 peptídeos, mais preferivelmente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 diferentes peptídeos, ainda preferido 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, ou 14 diferentes peptí- deos, e mais preferivelmente 12, 13 ou 14 diferentes peptídeos.
[00113]Em uma realização da presente invenção os diferentes peptídeos e/ou polipeptídeos são selecionados de modo que uma composição de vacina compreende peptídeos e/ou polipeptídeos capazes de associação com diferentes moléculas MHC, tais como diferentes moléculas MHC de classe I. Preferivelmente, uma composição de vacina compreende peptídeos e/ou polipeptídeos capazes de associação com moléculas MHC de classe I ocorrendo mais frequentemente. Portanto composições de vacina de acordo com a invenção compreendem diferentes fragmentos capazes de associação com pelo menos 2 preferidas, mais preferivelmente pelo menos 3 preferidas, mesmo mais preferivelmente pelo menos 4 preferidas moléculas MHC de classe I.
[00114]A composição de vacina é capaz de elevar uma específica resposta de células T citotóxicas e/ou específica resposta de células T auxiliares.
[00115]A composição de vacina ainda pode compreender um adjuvante e/ou um carreador. Exemplos de adjuvantes e carreadores úteis são dados aqui abaixo. Os peptídeos e/ou polipeptídeos na composição podem ser associados com um car- reador tal como, por exemplo, uma proteína ou uma célula apresentadora de antígeno (APC) tal como, por exemplo, uma célula dendrítica (DC) capaz de apresentar o pep- tídeo para uma célula T. Adjuvantes são quaisquer substâncias cuja mistura na composição de vacina aumenta ou de outro modo modifica a resposta imune para o peptídeo mutante. Carreadores são estruturas tablados, por exemplo, um polipeptídeo ou um polissacarídeo, ao qual o peptídeo neoantigênico, é capaz de ser associado. Opcionalmente, adjuvantes são conjugados covalentemente ou não-covalentemente aos peptídeos ou polipeptídeos da invenção.
[00116]A habilidade de um adjuvante para aumentar a resposta imune para um antígeno é tipicamente manifestada por um significante aumento em reação mediada - imune, ou redução em sintomas de doença. Por exemplo, um aumento em imunidade humoral é tipicamente manifestado por um significante aumento no título de anticorpos elevados para o antígeno, e um aumento em atividade de célula T é tipicamente manifestado em aumentada proliferação de células, ou citotoxidez celular, ou secreção de citocina. Um adjuvante também pode alterar uma resposta imune, por exemplo, através de mudança de uma resposta Th ou primariamente humoral em uma resposta Th, ou primariamente celular.
[00117]Adjuvantes apropriados incluem, mas não são limitados a 1018 ISS, sais de alumínio, Amplivax, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, GM- CSF, IC30, IC31, Imiquimod, ImuFact IMP321, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, Ju- vImmune, LipoVac, MF59, monofosforil lipídeo A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, PepTel.RTM. sistema vetor, micropartículas PLG, resiquimod, SRL172, Vi- rossomas e outras partículas semelhantes a vírus, YF-17D, VEGF trap, R848, beta- glicano, Pam3Cys, Aquila's QS21 stimulon (Aquila Biotech, Worcester, Mass., USA) que é derivado de saponina, extratos micobacterianos e mímicos de parede de célula bacteriana sintéticos, e outros adjuvantes proprietários tais como Ribi’s Detox. Quil ou Superfos. Adjuvantes como Freund’s incompleto ou GM-CSF são preferidos. Vários adjuvantes imunológicos (por exemplo, MF59) específicos para células dendríticas e sua preparação foram previamente descritos (Dupuis M, et al., Cell Immunol. 1998; 186(1):18-27; Allison A C; Dev Biol Stand. 1998; 92:3-11). Citocinas também podem ser usadas. Várias citocinas foram diretamente ligadas para influenciar migração de células dendríticas para tecidos linfóides (por exemplo, TNF-alfa), acelerando a maturação de células dendríticas em eficientes células apresentadoras de antígeno para linfócitos T (por exemplo, GM-CSF, IL-1 e IL-4) (patente U.S. No. 5 849 589, especificamente aqui incorporada por referência em sua totalidade) e atuando como imuno adjuvantes (por exemplo, IL-12) (Gabrilovich D I, et al., J Immunother Emphasis Tumor Immunol. 1996 (6):414-418).
[00118]Oligonucleotídeos imuno estimuladores CpG também foram reporta-dosaperfeiçoarem os efeitos de adjuvantes em um conjunto vacina. Sem ser preso por teoria, oligonucleotídeos CpG atuam através de ativação de sistema imune inato (não-adaptativo) via receptores semelhantes-Toll (TLR), principalmente TLR9. Ativação de TLR9 disparada por CpG aperfeiçoa respostas celular e humoral específicas de antígeno para uma ampla variedade de antígenos, incluindo antígenos peptídeo ou proteína, vírus vivos ou mortos, vacinas de células dendríticas, vacinas celulares au- tólogas e conjugados de polissacarídeos em ambas as vacinas, profiláticas e terapêuticas. Mais importantemente, aperfeiçoa maturação e diferenciação de célula dendrí- tica, resultando em aperfeiçoada ativação de células TH1 e forte geração de linfócito T citotóxico (CTL), mesmo na ausência de auxílio de célula-T CD4. A tendência TH1 induzida por estimulação de TLR9 é mantida mesmo na presença de adjuvantes de vacina tal como alúmen ou adjuvante de Freund incompleto (IFA) que normalmente promove uma tendência TH2. Oligonucleotídeos CpG mostram mesmo maior atividade adjuvante quando formulados ou co-administrados com outros adjuvantes ou em formulações tais como micropartículas, nanopartículas, emulsões de lipídeos ou formulações similares, que são especialmente necessárias para indução de uma resposta forte quando o antígeno é relativamente fraco. Eles também aceleram a resposta imune e permitiram as doses de antígeno serem reduzidas por aproximadamente duas ordens de magnitude, com comparáveis respostas de anticorpo para a vacina de dose inteira sem CpG em alguns experimentos (Arthur M. Krieg, Nature Reviews, Drug Discovery, 5, Jun. 2006, 471-484). A patente U.S. No. 6,406,705 B1 descreve o uso combinado de oligonucleotídeos CpG, adjuvantes ácido não-nucléico e um antígeno para induzir uma resposta imune específica de antígeno. Um antagonista de TLR9 CpG comercialmente disponível é dSLIM (imuno modulador de laço de tronco duplo) por Mologen (Berlim, Alemanha), que é um componente preferido da composição farmacêutica da presente invenção. Outras moléculas de ligação de TLR tal como RNA ligando TLR 7, TLR 8 e/ou TLR 9 também podem ser usadas.
[00119]Outros exemplos de adjuvantes úteis incluem, mas não são limitados a, CpGs quimicamente modificados (por exemplo, CpR, Idera), poly(I:C) (por exemplo, polii:CI2U), DNA ou RNA bacteriano não-CpG assim como moléculas pequenas imuno reativas e anticorpos como ciclo fosfamida, sunitinibe, bevacizumabe, celebrex, NCX- 4016, sildenafil, tadalafil, vardenafil, sorafinibe, XL-999, CP-547632, pazopanibe, ZD2171, AZD2171, ipilimumabe, tremelimumabe, e SC58175, que podem atuar tera- peuticamente e/ou como um adjuvante. As quantidades e concentrações de adjuvantes e aditivos úteis no contexto da presente invenção podem ser facilmente determinadas por aqueles versados na técnica sem indevida experimentação. Adicionais adjuvantes incluem fatores de estimulação de colônia, tais como fator de estimulação de colônia de macrófago granulócito (GM-CSF, sargramostim).
[00120]Uma composição de vacina de acordo com a presente invenção pode compreender mais de um adjuvante diferente. Além disso, a invenção abrange uma composição terapêutica compreendendo qualquer substância adjuvante incluindo qualquer uma de acima ou suas combinações. Também é contemplado que o peptí- deo ou polipeptídeo, e o adjuvante podem ser administrados separadamente em qual-quersequência apropriada.
[00121]Um carreador pode estar presente independentemente de um adjuvante. A função de um carreador pode, por exemplo, ser para aumentar o peso molecular deum particular mutante de modo a aumentar sua atividade ou imunogenicidade, para conferir estabilidade, para aumentar a atividade biológica, ou para aumentar meia-vida em soro. Além disso, um carreador pode auxiliar na apresentação de pep- tídeos para células-T. O carreador pode ser qualquer carreador apropriado conhecido por aqueles versados na técnica, por exemplo, uma célula apresentando proteína ou um antígeno. Uma proteína carreadora pode ser, mas não é limitada a, hemocianina de limpeta fechadura, proteínas de soro como transferrina, albumina de soro bovino, albumina de soro humano, tiroglobulina ou ovalbumina, imunoglobulinas, ou hormônios, como insulina ou ácido palmítico. Para imunização de humanos, o carreador tem de ser um carreador fisiologicamente aceitável para humanos e seguro. Entretanto, toxóide de tétano e/ou toxóide de difteria são carreadores apropriados em uma realização da invenção. Alternativamente, o carreador pode ser dextranos, por exemplo, sefarose.
[00122]Células-T citotóxicas (CTLs) reconhecem um antígeno na forma de uma ligação peptídica para uma molécula MHC antes que o próprio antígeno estranho intacto. A própria molécula de MHC está localizada na superfície de célula de uma célula apresentadora de antígeno. Assim, uma ativação de CTLs é somente possível se um complexo trimérico de antígeno peptídeo, molécula MHC, e APC está presente. Correspondentemente, pode aperfeiçoar a resposta imune se não somente o peptídeo é usado para ativação de CTLs, mas se adicionalmente APCs com a respectiva molécula MHC são adicionadas. Por isso, em algumas realizações a composição de vacina de acordo com a presente invenção adicionalmente contém pelo menos uma célula apresentadora de antígeno. A célula apresentadora de antígeno (ou célula estimuladora) tipicamente tem uma molécula de MHC de Classe I ou II sobre sua superfície, e em uma realização é substancialmente incapaz dela própria carregar a molécula MHC de classe I ou II com o selecionado antígeno. Como é descrito em mais detalhes abaixo, a molécula MHC de classe I ou II pode ser facilmente carregada com o antígeno selecionado in vitro.
[00123]Preferivelmente, as células apresentadoras de antígeno são células dendríticas. Apropriadamente, as células dendríticas são células dendríticas autólo- gas que são pulsadas com o peptídeo neoantigênico. O peptídeo pode ser qualquer peptídeo apropriado que origine uma apropriada resposta de células-T. Terapia de célula-T usando células dendríticas autólogas pulsadas com peptídeos de um antí- geno associado a tumor é mostrada em Murphy et al. (1996) The Prostate 29, 371380 e Tjua et al. (1997) The Prostate 32, 272-278.
[00124]Assim, em uma realização da presente invenção a composição de vacina contendo pelo menos uma célula apresentadora de antígeno é pulsada ou carregada com um ou mais peptídeos da presente invenção. Alternativamente, células mo- nonucleares de sangue periférico (PBMCs) isoladas de um paciente podem ser carregadas com peptídeos ex vivo e injetadas de volta no paciente.
[00125]Como uma alternativa a célula apresentadora de antígeno compreende uma construção de expressão codificando um peptídeo da presente invenção. O polinucleotídeo pode ser qualquer polinucleotídeo apropriado e é preferido que ele seja capaz de transdução de célula dendrítica, assim resultando na apresentação de um peptídeo e indução de imunidade.
Processos Terapêuticos
[00126]A invenção ainda provê um processo de indução de uma resposta imune específica para tumor em um sujeito, vacinação contra um tumor, tratamento e/ou alívio de um sintoma de câncer em um indivíduo através de administração para o indivíduo de um peptídeo neoantigênico ou composição de vacina da invenção.
[00127]O indivíduo foi diagnosticado com câncer ou está em risco de desen-volver câncer. O indivíduo tem um tumor resistente a imatinibe. O indivíduo é um humano, cão, gato, cavalo ou qualquer animal no qual uma resposta imune específica para tumor é desejada. O tumor é qualquer tumor sólido tal como tumor de mama, ovário, próstata, pulmão, rim, gástrico, cólon, testicular, cabeça e pescoço, pâncreas, cérebro, melanoma, e outros tumores de tecido de órgãos e tumores hematológicos, tais como linfomas e leucemias, incluindo leucemia mielógena aguda, leucemia mie- lógena crônica, leucemia linfocítica crônica, leucemia linfocítica de células T, e linfo- mas de célula B. O peptídeo ou composição da invenção é administrado em uma quantidade suficiente para induzir uma resposta CTL.
[00128]Em realizações específicas, a invenção provê processos de tratamento de um tumor resistente a imatinibe através de administração para um indivíduo de um ou mais peptídeos neoantigênicos que contêm uma mutação bcr-abl. Em algumasrealizações o indivíduo é HLA-A3. Mutações Bcr-abl incluem, por exemplo, T315I, E255K, M351T, Y253H, Q252H, F317L, F359V, G250E, Y253F, E355G, E255V, M244V, L248V, G250A, Q252R, D276G,T315N, M343T, F359A, V379I, F382L, L387M, H396P, H396R, S417Y, F486S.
[00129]O peptídeo, polipeptídeo neoantigênico ou composição de vacina da invenção pode ser administrado sozinho ou em combinação com outros agentes tera-pêuticos. O agente terapêutico é, por exemplo, um agente quimioterapêutico, radiação, ou imunoterapia. Qualquer apropriado tratamento terapêutico para um particular câncer pode ser administrado. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem, mas não são limitados a, aldesleucina, altretamina, amifostina, asparaginase, bleomicina, capecitabina, carboplatina, carmustina, cladribina, cisaprida, cisplatina, ciclo fosfa- mida, citarabina, dacarbazina (DTIC), dactinomicina, docetaxel, doxorubicina, drona-binol, epoetina alfa, etoposide, filgrastim, fludarabina, flúor uracila, gemcitabina, gra- nisetron, hidroxi uréia, idarubicina, ifosfamida, interferon alfa, irinotecano, lansoprazol, levamisol, leucovorina, megestrol, mesna, metotrexato, metoclopramida, mitomicina, mitotane, mitoxantrona, omeprazol, ondansetrom, paclitaxel (Taxol®), pilocarpina, procloroperazina, rituximabe, tamoxifeno, taxol, cloridrato de topotecano, trastuzu- mabe, vinblastina, vincristina e tartarato de vinorelbina. Para tratamento de câncer de próstata, um agente quimioterapêutico preferido com o qual anti-CTLA-4 pode ser combinado é paclitaxel (Taxol).
[00130]Em adição, o indivíduo ainda pode ser administrado com um agente imuno estimulador / anti-imuno supressor. Por exemplo, o indivíduo é ainda adminis-trado com um anticorpo anti-CTLA ou anti-PD-1 ou anti-PD-L1. Bloqueio de CTLA-4 ou PD-L1 por anticorpos pode aperfeiçoar a resposta imune para células cancerosas no paciente. Em particular, bloqueio de CTLA-4 foi mostrado efetivo quando seguindo um protocolo de vacinação.
[00131]A quantidade ótima de cada peptídeo a ser incluído na composição de vacina e o regime de dosagem ótimo podem ser determinados por aqueles versados na técnica sem indevida experimentação. Por exemplo, o peptídeo ou sua variante pode ser preparado para injeção intravenosa (i.v.), injeção subcutânea (s.c.), injeção intradérmica (i.d.), injeção intraperitoneal (i.p.), injeção intramuscular (i.m.). Processos preferidos de injeção de peptídeo incluem s.c., i.d., i.p., i.m., e i.v. Processos preferidos de injeção de DNA incluem i.d., i.m., s.c., i.p., e i.v. Por exemplo, doses entre 1 e 500 mg, 50 microgramas e 1,5 mg, preferivelmente 125 microgramas a 500 microgra- mas, de peptídeo ou DNA podem ser dadas e dependerão do respectivo peptídeo ou DNA. Doses nesta faixa foram usadas com sucesso em prévios experimentos (Bruns- vig PF, et al., Cancer Immunol Immunother. 2006; 55(12):1553-1564; M. Staehler, et al., ASCO meeting 2007; Abstract No 3017). Outros processos de administração da composição de vacina são conhecidos por aqueles versados na técnica.
[00132]A composição farmacêutica inventiva pode ser compilada de modo que a seleção, número e/ou quantidade de peptídeos presentes na composição é/são específica de tecido, câncer, e/ou paciente. Por exemplo, a exata seleção de peptí- deos pode ser guiada por padrões de expressão das proteínas parentes em um dado tecido para evitar efeitos colaterais. A seleção pode ser dependente do específico tipo de câncer, o status da doença, regimes de tratamento anteriores, o status imune do paciente, e, é claro, o haplotipo - HLA do paciente. Além disso, a vacina de acordo com a invenção pode conter componentes individualizados, de acordo com necessidades pessoais do particular paciente. Exemplos incluem variação de quantidades de peptídeos de acordo com a expressão do neoantígeno relacionado no particular paciente, indesejados efeitos colaterais devido a alergias pessoais ou outros tratamentos, e ajustes para tratamentos secundários seguindo um primeiro round ou esquema de tratamento.
[00133]Para uma composição a ser usada como uma vacina para câncer, peptídeos cujas proteínas parentes endógenas são expressas em altas quantidades em tecidos normais serão evitados ou estarão presentes em baixas quantidades na composição da invenção. Por outro lado, se é conhecido que o tumor de um paciente expressa altas quantidades de uma certa proteína a respectiva composição farmacêutica para tratamento deste câncer pode estar presente em altas quantidades e/ou mais de um peptídeo específico para esta particular proteína ou caminho desta proteína pode ser incluído.
[00134]Composições farmacêuticas compreendendo o peptídeo da invenção podem ser administradas a um indivíduo já sofrendo de câncer. Em aplicações tera-pêuticas, composições são administradas a um paciente em uma quantidade suficiente para elicitar uma efetiva resposta CTL para o antígeno de tumor e para curar ou pelo menos impedir parcialmente sintomas e/ou complicações. Uma quantidade adequada pra realizar isto é definida como “dose terapeuticamente efetiva”. Quantidades efetivas para este uso dependerão, por exemplo, de composição de peptídeo, a maneira de administração, o estágio e severidade da doença sendo tratada, o peso e estado geral de saúde do paciente, e o julgamento do médico atendente, mas genericamente varia para a imunização inicial (ou seja, para administração terapêutica ou profilática) de cerca de 1,0 micrograma a cerca de 50 000 microgramas de peptídeo para um paciente de 70 kg, seguido por dosagens de reforço ou de cerca de 1,0 mi- crograma a cerca de 10 000 microgramas de peptídeo de acordo com um regime de reforço sobre semanas a meses dependendo da resposta e condição do paciente através de medição de específica atividade CTL no sangue de paciente. Deve ser mantido em mente que o peptídeo e composições da presente invenção podem ser genericamente empregados em estados de doença sérios, ou seja, situações de ameaça de vida ou potencialmente ameaçadoras de vida, especialmente quando o câncer sofreu metástase. Em tais casos, em vista da minimização de substâncias estranhas e a relativa natureza não-tóxica do peptídeo, é possível e pode ser sentido desejável pelo médico tratando administrar substanciais excessos destas composições de pep- tídeos.
[00135]Para uso terapêutico, administração deve começar na detecção ou re-moção cirúrgica de tumores. Isto é seguido por doses de reforço até pelo menos sintomas serem substancialmente diminuídos e por um período a seguir.
[00136]As composições farmacêuticas (por exemplo, composições de vacina) para tratamento terapêutico são pretendidas para administração parenteral, tópica, nasal, oral ou local. Preferivelmente, as composições farmacêuticas são administradas parenteralmente, por exemplo, intravenosamente, subcutaneamente, intradermi- camente, ou intramuscularmente. As composições podem ser administradas no sítio de excisão cirúrgica para induzir uma resposta imune local para o tumor. A invenção provê composições para administração parenteral que compreendem uma solução dos peptídeos e composições de vacina são dissolvidas ou suspensas em um carre- ador aceitável, preferivelmente um carreador aquoso. Uma variedade de carreadores aquosos podem ser usados, por exemplo, água, água tamponada, solução salina 0,9%, glicina 0,3%, ácido hialurônico e semelhantes. Estas composições podem ser esterilizadas através de técnicas de esterilização bem conhecidas, convencionais, ou podem ser esterilizadas na filtração. As resultantes soluções aquosas podem ser em-baladas para uso como são, ou liofilizadas, a preparação liofilizada sendo combinada com uma solução estéril antes de administração. As composições podem conter subs-tâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis como requerido para aproximar con-dições fisiológicas, tais como agentes tampões e de ajuste de pH, agentes de ajuste de tonicidade, agentes umectantes e semelhantes, por exemplo, acetato de sódio, lactato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, mono laurato de sorbitano, oleato de trietanolamina, etc.
[00137]A concentração de peptídeos da invenção nas formulações farmacêuticas pode variar amplamente, isto é, de menos que cerca de 0,1%, usualmente em ou pelo menos cerca de 2% a tanto quanto 20% a 50% ou mais em peso, e será selecionada primariamente por volumes de fluidos, viscosidades, etc., de acordo com o particular modo de administração selecionado.
[00138]O peptídeo da invenção também pode ser administrado via lipossomas, que direcionam os peptídeos para um particular tecido de células, tal como tecido linfóide. Lipossomas também são úteis no aumento de meia-vida dos peptídeos. Li- possomas incluem emulsões, espumas, micelas, monocamadas insolúveis, cristais líquidos, dispersões de fosfolipídeos, camadas lamelares e semelhantes. Nestas pre-parações o peptídeo a ser liberado é incorporado como parte de uma lipossoma, sozinho ou em conjunção com uma molécula que se liga a, por exemplo, um receptor predominante entre células linfóides, tais como anticorpos monoclonais que se ligam ao antígeno CD45, ou com outras composições terapêuticas ou imunogênicas. Assim, lipossomas enchidas com um desejado peptídeo da invenção podem ser direcionadas para o sítio de células linfóides, onde as lipossomas então liberam as selecionadas composições de peptídeos terapêuticas / imunogênicas. Lipossomas para uso na in-venção são formadas de lipídeos de formação de vesícula padrões, que genericamente incluem fosfolipídeos carregados negativamente e neutros e um esterol, tal como colesterol. A seleção de lipídeos é genericamente guiada através de consideração de, por exemplo, tamanho de lipossoma, instabilidade ácida e estabilidade das lipossomas na corrente sanguínea. Uma variedade processos são disponíveis para preparação de lipossomas, como descrito em, por exemplo, Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9;467 (1980), USAU.S. Patent Nos. 4,235,871,4501728USA 4,501,728, 4,837,028, e 5,019,369 .
[00139]Para direcionar para as células imunes, um ligante a ser incorporado na lipossoma pode incluir, por exemplo, anticorpos ou seus fragmentos específicos para determinantes de superfície de célula das desejadas células de sistema imune. Uma suspensão de lipossomas contendo um peptídeo pode ser administrada intrave-nosamente, localmente, topicamente, etc., em uma dose que varia de acordo com, inter alia, a maneira de administração, o peptídeo sendo liberado, e o estágio da doença sendo tratada.
[00140]Para composições sólidas, carreadores sólidos não-tóxicos em nano- partícula ou convencionais podem ser usados os quais incluem, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, talco, celulose, glicose, sucrose, carbonato de magnésio, e semelhantes. Para administração oral, uma composição não-tóxica farmaceuticamente aceitável é formada por incorporação de qualquer um dos excipientes normalmente empregados, tais como aqueles carreadores previamente listados, e genericamente 10-95% de ingrediente ativo, ou seja, um ou mais peptídeos da invenção, e mais preferivelmente em uma concentração de 25%-75%.
[00141]Para administração de aerossol, os peptídeos imunogênicos são pre-ferivelmente supridos em forma finamente dividida junto com um tensoativo e prope- lente. Típicas porcentagens de peptídeos são 0,01-20% em peso, preferivelmente 1%- 10%. O tensoativo tem, é claro, de ser não-tóxico, e preferivelmente solúvel no prope- lente. Representativos de tais agentes são os ésteres ou ésteres parciais de ácidos graxos contendo de 6 a 22 átomos de carbono, tais como ácidos capróico, octanóico, láurico, palmítico, esteárico, linoléico, linolênico, olestérico, e oléico com um álcool poliídrico alifático ou seu anidrido cíclico. Ésteres mistos, tais como glicerídeos mistos ou naturais podem ser empregados. O tensoativo pode constituir 0,1%-20% em peso da composição, preferivelmente 0,25-5%. O balanço da composição é comumente propelente. Um carreador também pode ser incluído quando desejado, como com, por exemplo, lecitina para liberação intranasal.
[00142]Para propósitos terapêuticos ou de imunização, ácidos nucléicos co-dificando o peptídeo da invenção e opcionalmente um ou mais dos peptídeos aqui descritos também podem ser administrados para o paciente. Um número de processossão convenientemente usados para liberar os ácidos nucléicos para o paciente. Por exemplo, o ácido nucléico pode ser liberado diretamente, como “DNA nu”. Esta abordagem é descrita, po0r exemplo, em Wolff et al., Science 247:1465-1468 (1990) assim como patentes U.S. 5 580 859 e 5 589 466. Os ácidos nucléicos também podem ser administrados usando liberação balística como descrita, por exemplo, na patente US 5 204 253. Partículas compreendidas unicamente por DNA podem ser administradas. Alternativamente, DNA pode ser aderido a partículas, tais como partículas de ouro.
[00143]Os ácidos nucléicos também podem ser liberados complexados a compostos catiônicos, tais como lipídeos catiônicos. Processos de liberação de gene mediados por lipídeo são descritos, por exemplo, em 9618372WOAWO 96/18372; 9324640WOAWO 93/24640; Mannino & Gould-Fogerite , BioTechniques 6(7): 682691 (1988); 5279833USARose U.S. Pat No. 5,279,833; 9106309WOAWO 91/06309; e Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7414 (1987).
[00144]Os peptídeos e polipeptídeos da invenção também podem ser expressos através de hospedeiros virais atenuados, tais como vaccinia ou epitelioma contagioso. Esta abordagem envolve o uso de vírus vaccinia como um vetor para expressar sequências de nucleotídeos que codificam o peptídeo da invenção. Com introdução em um hospedeiro aguda ou cronicamente infectado ou em um hospedeiro não-infectado, o vírus vaccinia recombinante expressa o peptídeo imunogênico, e pelo que elícita uma resposta CTL de hospedeiro. Vetores vaccinia e processos úteis em protocolos de imunização são descritos em, por exemplo, patente U.S. 4 722 848. Um outro vetor é BCG (Bacilo Calmette Guerin). Vetores BCG são descritos em Stover et al. (Nature 351:456-460 (1991)). Uma ampla variedade de outros vetores úteis para administração terapêutica ou imunização dos peptídeos da invenção, por exemplo, vetores Salmonella typhi e semelhantes, será visível para aqueles versados na técnica a partir da presente descrição.
[00145]Um meio preferido de administração de ácidos nucléicos codificando o peptídeo da invenção usa construções minigene codificando múltiplos epítopos. Para criar uma sequência de DNA codificando os epítopos CTL (minigene) selecionados para expressão em células humanas, as sequências de aminoácidos dos epítopos são traduzidas reversas. Uma tabela de utilização de códon humano é usada para guiar a escolha de códon para cada aminoácido. Estas sequências de DNA codificando epítopo são diretamente contíguas, criando uma sequência de polipeptídeos contínua. Para otimizar expressão e/ou imunogenicidade, elementos adicionais podem ser incorporados no projeto de minigene. Exemplos de sequência de aminoácidos que pode ser traduzida reversa e incluída na sequência de minigene incluem: linfócito T auxiliar, epítopos, uma sequência líder (sinal), e um sinal de retenção em retículo endoplásmico. Em adição, apresentação MHC de epítopos CTL pode ser aperfeiçoada através de inclusão de sequências flanqueadoras ocorrendo naturalmente ou sintéticas (por exemplo, polialanina) adjacentes aos epítopos CTL. A sequência de minigene é convertida a DNA através de montagem de oligonucleotídeos que codificam as fitas plus e minus do minigene. Oligonucleotídeos de sobreposição (30-100 bases de comprimento) são sintetizados, fosforilados, purificados e anelados sob condições apropriadas usando técnicas bem conhecidas. As extremidades dos oligonucleotídeos são unidas usando T4 DNA ligase. Este minigene sintético, codificando o polipeptídeo epítopo CTL, então pode ser clonado em um desejado vetor de expressão.
[00146]Sequências reguladoras padrões bem conhecidas por aqueles versados na técnica são incluídas no vetor para assegurar expressão nas células alvos. Vários elementos vetores são requeridos: um promotor com um sítio de clonagem à jusante para inserção de minigene; um sinal de poliadenilação para eficiente terminação de transcrição; uma origem E. coli de replicação; e um marcador selecionável E. coli (por exemplo, resistência a ampicilina ou canamicina). Numerosos promotores podem ser usados para este propósito, por exemplo, o promotor citomegalovírus humano (hCMV). Ver, patentes U.S. Nos. 5 580 859 e 5 589 466 para outras sequências promotoras apropriadas. Adicionais modificações de vetores põem ser desejadas para otimizar expressão de minigene e imunogenicidade. Em alguns casos, introns são requeridos para eficiente expressão de gene, e um ou mais introns ocorrendo naturalmente ou sintéticos podem ser incorporados na região de transcrição do minigene. A inclusão de sequências de estabilização de mRNA também pode ser considerada para aumento de expressão de minigene. Recentemente foi proposto que sequências imunoestimuladoras (ISSs ou CpGs) desempenham um papel na imunogenicidade de vacinas de DNA. Estas sequências podem ser incluídas no vetor, fora de sequência codificando minigene, se verificado aperfeiçoar imunogenicidade.
[00147]Em algumas realizações, um vetor de expressão bicistrônico, para permitir produção do epítopo codificado-minigene e uma segunda proteína incluída para aperfeiçoar ou diminuir imunogenicidade podem ser usados. Exemplos de proteínas ou polipeptídeos que podem aperfeiçoar beneficamente a resposta imune se co-expressas incluem citocinas (por exemplo, IL2, IL12, GM-CSF), moléculas de indução de citocinas (por exemplo, LeIF) ou moléculas co-estimuladoras. Epítopos auxiliares (HTL) podem ser ligados a sinais que têm alvo intracelular e expressos separadamente a partir de epítopos CTL.Isto pode permitir direcionamento dos epítopos HTL para um compartimento de célula diferente dos epítopos CTL. Se requerido, isto pode facilitar entrada mais eficiente de epítopos HTL no caminho de MHC de classe II, pelo que aperfeiçoando indução de CTL. Em contraste a indução de CTL, diminuição específica de resposta imune através de co-expressão de moléculas imuno supressivas (por exemplo, TGF-beta) pode ser benéfico em certas doenças.
[00148]Uma vez um vetor de expressão seja selecionado, o minigene é clonado na região de poli ligador à jusante do promotor. Este plasmídeo é transformado em uma apropriada linhagem de E. coli, e DNA é preparado usando técnicas padrões. A orientação e sequência de DNA do minigene, assim como todos os outros elementos no vetor são confirmados usando mapeamento de restrição e análise de sequência de DNA. Células bacterianas abrigando o plasmídeo correto podem ser estocadas como um banco de célula mestre e um banco de célula de trabalho.
[00149]DNA plasmídeo purificado pode ser preparado para injeção usando uma variedade de formulações. A mais simples destas é reconstituição de DNA liofilizado em solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS). Uma variedade de processos foram descritos, e novas técnicas podem tornar-se disponíveis. Como notado acima, ácidos nucléicos são convenientemente formulados com lipídeos catiônicos. Em adição, glicolipídeos, lipossomas fusogênicas, peptídeos e compostos referidos coletivamente como protetores, interativos, não-condensates (PINC) também podem ser complexados a DNA plasmídeo purificado para influências variáveis tais como estabilidade, dispersão intramuscular, ou tráfego para específicos órgãos ou tipos de células.
[00150]Sensibilização de célula alvo pode ser usada como um ensaio funcional para expressão e apresentação de MHC de classe I de epítopos CTL codificados por minigene. O DNA plasmídeo é introduzido em uma linha de célula mamífera que é apropriada como alvo para ensaios padrões de liberação de cromo CTL. O processo de transfecção usado dependerá da formulação final. Eletroporação pode ser usada para DNA “nu”, enquanto lipídeos catiônicos permitem direta transfecção in vitro. Um plasmídeo expressando proteína fluorescente verde (GFP) pode ser co-transfectado para permitir enriquecimento de células transfectadas usando classificação de célula ativada por fluorescência (FACS). Estas células são então marcadas com cromo-51 e usadas como células alvos para linhas CTL específicas de epítopo. Citólise, detectada por liberação de cromo 51, indica produção de apresentação de MHC de epítopos CTL codificados por minigene.
[00151]Imunogenicidade in vivo é uma segunda abordagem para testes funcionais de formulações de DNA de minigene. Camundongos transgênicos expressando apropriadas moléculas MHC humanas são imunizados com o produto DNA. A dose e rota de administração são dependentes de formulação (por exemplo, IM para DNA em PBS, IP para DNA complexado com lipídeo). Vinte e um dias após imunização, esplenócitos são colhidos e reestimulados por 1 semana na presença de peptídeos codificando cada epítopo sendo testado. Estas células efetoras (CTLs) são ensaiadas para citólise de células alvos marcadas com cromo-51, carregadas com peptídeo usando técnicas padrões. Lise de células alvos sensibilizadas por carga MHC de peptídeos correspondendo a epítopos codificados por minigene demonstra função de vacina DNA para indução in vivo de CTLs.
[00152]Peptídeos também podem ser usados para elicitar CTL ex vivo. O resultante CTL, pode ser usado para tratamento de tumores crônicos em pacientes que não respondem a outras formas convencionais de terapia, ou não responderá a uma abordagem de terapia de vacina de peptídeo. Respostas CTL ex vivo para um particular antígeno de tumor são induzidas através de incubação em cultura de tecido das células precursoras de CTL do paciente (CTLp) junto com uma fonte de células apresentadoras de antígeno (APC) e o apropriado peptídeo. Após um apropriado tempo de incubação (tipicamente 1-4 semanas), no qual as CTLp são ativadas e maduras e expandem em CTL efetora, as células são infundidas de volta no paciente, onde elas destruirão sua específica célula alvo (isto é, uma célula de tumor). De modo a otimizar as condições in vitro para a geração de específicas células T citotóxicas, a cultura de células estimuladoras é mantida em um apropriado meio livre de soro.
[00153]Antes de incubação das células estimuladoras com as células a serem ativadas , por exemplo, células CD8+ precursoras, uma quantidade de peptídeo antigênico é adicionada à cultura de células estimuladoras, de quantidade suficiente para tornar-se carregado sobre as moléculas Classe I humanas para serem expressas sobre a superfície das células estimuladoras. Na presente invenção, uma quantidade suficiente de peptídeo é uma quantidade que permitirá que cerca de 200, e preferivelmente 200 ou mais, moléculas MHC de Classe I humanas carregadas com peptídeo sejam expressas sobre a superfície de cada célula estimuladora. Preferivelmente, as células estimuladoras são incubadas com > 2 μg/mL de peptídeo. Por exemplo, as células estimuladoras são incubadas com > 3, 4, 5, 10, 15, ou mais μg/mL peptídeo.
[00154]Células CD8+ precursoras ou restantes são então incubadas em cultura com as apropriadas células estimuladoras por um período de tempo suficiente para ativar as células CD8+. Preferivelmente, as células CD8+ são ativadas em uma maneira específica de antígeno. A razão de células (efetoras) CD8+ precursoras ou restantes para células estimuladoras pode variar de indivíduo para indivíduo e assim pode depender de variáveis tais como a receptividade de linfócitos do indivíduo para condições de cultura e a natureza e severidade da condição de doença ou outra condição para a qual a modalidade de tratamento descrita é usada. Preferivelmente, entretanto, a razão de linfócito : célula estimuladora está na faixa de cerca de 30:1 a 300:1. A cultura de efetora / estimuladora pode ser mantida por um tempo tão longo quanto seja necessário para estimular um número de células CD8+ terapeuticamente utilizável ou efetivo.
[00155]A indução de CTL in vitro requer o específico reconhecimento de peptídeos que são ligados a moléculas de MHC de classe I específicas de alelo sobre APC. O número de complexos peptídeo / MHC específica por APC é crucial para a estimulação de CTL, particularmente em respostas imunes primárias. Embora pequenas quantidades de complexos de peptídeo / MHC por célula sejam suficientes para render uma célula suscetível a lise por CTL, ou para estimular uma resposta CTL secundária, a ativação bem sucedida de um precursor CTL (pCTL) durante resposta primária requer um número significantemente maior de complexos MHC / peptídeo. Carga de peptídeo de moléculas de complexo de histocompatibilidade principal vazio sobre células permite a indução de respostas de linfócito T citotóxico primárias.
[00156]Uma vez que linhas de células mutantes não existem para todo alelo MHC humano, é vantajoso usar uma técnica para remover peptídeos associados com MHC endógenos a partir da superfície de APC, seguido por carga de resultantes moléculas MHC vazias com os peptídeos imunogênicos de interesse. O uso de células não-infectadas, não-transformadas (não-tumorigênicas), e preferivelmente, células autólogas de pacientes como APC é desejável para o projeto de protocolos de indução de CTL direcionados para desenvolvimento de terapias CTL ex vivo. Este pedido de patente mostra processos para separação de peptídeos associados - MHC endógeno a partir da superfície de APC seguido por carga dos desejados peptídeos. Uma molécula MHC de classe I estável é um complexo trimérico formado dos seguintes elementos: 1) um peptídeo de usualmente 8 - 10 resíduos, 2) uma cadeia de proteína polimórfica pesada de trans-membrana que transporta o sítio de ligação de peptídeo em seus domínio α1 e α2, e 3) uma cadeia leve não-polimórfica associada não- covalentemente, β-2-microglobulina. Remoção de peptídeos ligados e/ou dissociação de β-2-microglobulina a partir do complexo torna as moléculas MHC de classe I não- funcionais e instáveis, resultando em rápida degradação. Todas as moléculas MHC de classe I isoladas de PBMCs têm peptídeos endógenos ligados às mesmas. Por isso, a primeira etapa é remoção de todos os peptídeos endógenos ligados a moléculas MHC de classe I sobre a APC sem causar sua degradação antes que peptídeos exógenos possam ser adicionados às mesmas.
[00157]Duas maneiras possíveis de libertar moléculas MHC de classe I de peptídeos ligados incluem diminuição de temperatura de cultura de 37oC para 26oC por toda noite para desestabilizar β-2-microglobulina e separar os peptídeos endógenos da célula usando um tratamento ácido suave. Os processos liberam peptídeos previamente ligados no ambiente extracelular permitindo que novos peptídeos exógenos se liguem às moléculas classe I vazias. O processo de incubação de temperatura fria permite que peptídeos exógenos se liguem eficientemente ao complexo MHC, mas requer uma incubação por toda noite a 26oC o que pode diminuir a taxa metabólica da célula. Também é provável que células não sintetizando ativamente moléculas MHC (por exemplo, PBMC repouso) não possam produzir altas quantidades de moléculas MHC de superfície vazias através do procedimento de temperatura fria.
[00158]Separação ácida severa envolve extração dos peptídeos com ácido triflúor acético, pH 2, ou desnaturação ácida dos complexos de peptídeo - classe I purificados por imuno afinidade. Estes processos não são exequíveis para indução de CTL, uma vez que é importante remover peptídeos endógenos enquanto preservando viabilidade de APC e um ótimo estado metabólico que é crítico para apresentação de antígeno. Soluções ácidas suaves de pH 3 tais como tampões de glicina ou citrato - fosfato têm sido usadas para identificar peptídeos endógenos e para identificar epítopos de célula T associados com tumor. O tratamento é especialmente efetivo, em que somente as moléculas MHC de classe I são desestabilizadas (e peptídeos associados liberados), enquanto outros antígenos de superfície permanecem intactos, incluindo moléculas MHC de classe II. Mais importantemente, tratamento de células com as soluções ácidas suaves não afeta a viabilidade de célula ou estado metabólico. O tratamento ácido suave é rápido uma vez que a separação dos peptídeos endógenos ocorre em dois minutos a 4oC e a APC está pronta para desempenhar sua função após os apropriados peptídeos serem carregados. A técnica é aqui utilizada para obter APCs específicas - peptídeo para a geração de CTL específica - antígeno primária. As resultantes APCs são eficientes na indução de CTL CD8+ específica - peptídeo.
[00159]Células CD8+ ativadas podem ser efetivamente separadas das células estimuladoras usando um de uma variedade de processos conhecidos. Por exemplo, anticorpos monoclonais específicos para as células estimuladoras, para os peptídeos carregados sobre as células estimuladoras, ou para as células CD8+ (ou um seu segmento) podem ser utilizados para ligação de seu apropriado ligante complementar. Moléculas etiquetadas com anticorpo então podem ser extraídas a partir da mistura de célula efetora - estimuladora via meios apropriados, por exemplo, via processos bem conhecidos de imuno precipitação ou ensaio imuno.
[00160]Quantidades citotóxicas, efetivas das células CD8+ ativadas podem variar entre usos in vitro e in vivo, assim como com a quantidade e tipo de células que são o alvo final destas células assassinas. A quantidade também variará dependendo da condição do paciente e deve ser determinada via consideração de todos os fatores apropriados pelo profissional. Preferivelmente, entretanto, cerca de 1x106 a cerca de 1x1012, mais preferivelmente cerca de 1x108 a cerca de 1x1011, e mesmo mais preferivelmente, cerca de 1x109 a cerca de 1x1010 células CD8+ ativadas são utilizadas para adultos humanos, comparadas a cerca de 5x106 - 5x107 células usadas em camundongos.
[00161]Preferivelmente, como discutido acima, as células CD8+ ativadas são colhidas da cultura de células antes de administração das células CD8+ para o indivíduo sendo tratado. É importante notar, entretanto, que diferente de outras modalidades de tratamento propostas e presentes, o presente processo usa um sistema de cultura de células que não é tumorigênico. Por isso, se completa separação de células estimuladoras e células CD8+ ativadas não é obtida, não há perigo inerente conhecido estar associado com a administração de um pequeno número de células estimuladoras, enquanto administração de células de promoção de tumor mamíferas pode ser extremamente perigosa.
[00162]Processos de reintrodução de componentes celulares são conhecidos na técnica e incluem procedimentos tais como aqueles exemplificados na patente U.S. 4 844 893 para Honsik, et al. e U.S. 4 690 915 para Rosenberg. Por exemplo, administração de células CD8+ ativadas via infusão intravenosa é apropriada.
[00163]A invenção será ainda descrita nos exemplos que se seguem, os quais não limitam o escopo da invenção descrito nas reivindicações.
Exemplos Exemplo 1:Uma estratégia para identificar neopeptídeos para vacinação
[00164]Nossa abordagem para identificar neoepítopos específicos de tumor envolve 3 etapas. (1) Identificação de mutações de DNA usando o sequenciamento de genoma completo ou exoma completo (isto é, somente exons capturados) de tumor versus amostras de linha germe emparelhadas de cada paciente. Nossos estudos preliminares demonstram que células CLL contêm muitas mudanças genéticas distintas que alteram sequência de aminoácidos e podem gerar potenciais novos epítopos de célula T. (2) Aplicação de algoritmos de previsão de ligação MHC - peptídeo altamente validados para geração de um conjunto de epítopos de célula T candidatos baseado em mutações não-silenciosas presentes em tumores. Nós confirmaremos expressão de genes que sofreram mutação como RNA em amostras CLL, e então confirmar as previsões de ligação de HLA - peptídeo usando uma abordagem experimental para quantificar ligação de peptídeos candidatos a alelos HLA. (3) Geração de células T específicas - antígeno contra peptídeos que sofreram mutação.Exemplo 2:Sequenciamento de genoma normal e tumor para a identificação de genes mutantes em tumores de pacientes com leucemia linfocítica crônica (Etapa 1)
[00165]Para detectar mutações específicas de tumor (que não estão presentes em tecidos normais), foram coletadas amostras de tumores e de tecidos normais de cada paciente. Para leucemias, tumores foram purificados usando isolamento de pérola magnética ou classificação de célula ativada por fluorescência usando anticorpos específicos para células de tumor, por exemplo, as células tumorais de pacientes com leucemia linfocítica crônica (CLL) expressam os marcadores de superfície CD5 e CD19. Fibroblastos de pele foram usados como um controle de tecido normal. DNA ou RNA para sequenciamento foi purificado a partir de células de tecido normal ou tumor. Para tumores de melanoma, ovariano e outros tumores sólidos (nos quais há contaminação com células não-tumor), DNA e RNA foram isolados de culturas de curto termo relativamente homogêneas de células tumorais ou de tumor capturado com laser. PBMCs foram usadas como as células controles normais. Para todas as amostras, PBMCs foram criopreservadas até necessárias para expansão de células T específicas - peptídeo mutantes. Finalmente, culturas de curto termo de células tumorais também foram criopreservadas para posterior uso como alvos de células T expandidas. DNA ou RNA genômico isolado foi testado para integridade e pureza de ácido nucléico antes de sequenciamento.
[00166]Para cada amostra de DNA, DNA genômico inteiro foi cisalhado e sequenciado, ou exons codificantes foram capturados por oligonucleotídeos complementares usando seleção híbrida e então sequenciados (Gnirke et al., Nat Biotechnol. 2009, 27(2):182-9). Bibliotecas de DNA e RNA foram geradas e sequenciadas usando instrumentos de sequenciamento de geração-seguinte Illumina.
[00167]Sequenciamento de 64 pacientes com leucemia linfocítica crônica (CLL) rendeu uma média de 23 mutações não-silenciosas que alteram sequências de aminoácidos de proteínas (Figura 3) no tumor em relação à sequência de DNA de linha germe. Estas mutações não-silenciosas caem em 5 classes distintas com o potencial de gerar neoepítopos: sentido errado, emenda de sítio, troca de fase de leitura (indel, inserções e supressões), leitura através e fusões de genes (Figura 4). As frequências destas mutações variam através de pacientes individuais (Figura 5). Todas estas mutações provêm potenciais neoepítopos para imunização, com mutações de troca de fase de leitura, leitura através e emenda de sítio (por exemplo, com introns retidos) gerando estiramentos mais longos de novos peptídeos, mutações sentido errado conduzindo a peptídeos curtos com mudanças de aminoácidos simples e finalmente, fusão de genes gerando peptídeos híbridos com novas sequências de junção.Exemplo 3:Identificação de peptídeos de ligação de HLA derivados de proteínas expressas abrigando mutações específicas de tumor (Etapa 2).
[00168]A questão seguinte é se genes que sofreram mutação podem gerar peptídeos que podem ser apresentados por proteínas HLA/MHC de paciente. Primeiro, vários algoritmos foram usados para prever 30 e 137 peptídeos de ligação de HLA com pontuações de IC50 < 500 nM a partir de 10 mutações sentido errado de Paciente 1, e de 53 indel 1 de sentido errado e 2 fusões de genes de Paciente 2. Um exemplo para uma mutação de sentido errado em um paciente com 6 alelos HLA específicos é mostrado com 2 peptídeos de ligação previstos de 54 combinações de peptídeo 9- meros e alelos HLA (Figura 6). Para confirmar que estes genes são expressos em tumores, nós medimos níveis de RNA para o genes que sofreram mutação (usando várias abordagens que dependem da classe de mutação, Figura 7), e verificamos que 98% de genes que sofreram mutação com peptídeos de ligação de HLA foram expressos.
[00169]A capacidade de ligação de HLA de todos os peptídeos previstos que passam validação de expressão de RNA são então experimentalmente validados através de realização de ensaios de ligação competitiva com peptídeos testes versus peptídeos de referência conhecido ligarem-se ao alelo HLA. (Sidney et al. Curr Protoc Immunol. 2001, Chapter 18: Unit 18.3) (Figura 8A). Do subconjunto que nós submetemos a confirmação experimental de ligação de HLA, 8 de 17 (47%) peptídeos previstos das mutações de sentido errado em Pt 1 foram confirmadas terem altas afinidades ligantes para alelos HLA (IC50 < 500) (Figura 8B). Para Pt 2, 25 de 49 peptídeos previstos foram experimentalmente confirmados como ligando HLA (Figura 8B). Estes resultados sugerem que todos os peptídeos com IC50 < 150 nM prevista mostram experimentalmente ligação de HLA, enquanto um corte de < 500 nM gera peptídeos ligantes verdadeiros 40-50% do tempo (Figura 8C). De nota, 12 dos 25 confirmaram peptídeos que sofreram mutação de Pt 2 têm > 2-vezes melhor afinidade de ligação que o peptídeo de linha germe (Figura 9). Embora tais peptídeos sejam preferíveis para incorporação em uma vacina de tumor para reduzir a chance de células T reagirem cruzado com o peptídeo de linha germe, peptídeos que não mostram ligação diferencial ainda podem prover respostas específicas de tumor devido a reconhecimento diferencial de peptídeo linha germe vs. mutante através de receptor de célula T.Exemplo 4:Respostas de células T CD8+ contra peptídeos que sofreram mutação identificados por sequenciamento de amostras de paciente CLL (Etapa 3)
[00170]Baseado nos peptídeos que sofreram mutação de ligação de HLA verificados experimentalmente ou previstos, nós agora podemos determinar se células T podem ser geradas para reconhecer estes peptídeos que sofreram mutação específicos de tumor. Nós assim sintetizamos peptídeos com pontuações ligantes de menos que 1000 nM que são derivados de genes com expressão validada em células de tumor. Para gerar células T de desejada especificidade, nós estimulamos células T dos paciente sequenciados com APCs autólogas pulsadas com peptídeo (tanto usando um peptídeo individual como uma reunião de peptídeos) (células dendríticas e células B autólogas expandidas-CD40L) em uma base semanal, na presença de IL- 2 e IL-7. Após 3-4 ciclos de estimulação, as células CD8+ expandidas foram testadas sobre ELISpot para evidência de reatividade contra o peptídeo, baseado em secreção de IFNgama. Dos 17 peptídeos candidatos de Paciente 1 (Figura 10), nós detectamos secreção de IFN gama em células T contra DCs autólogas pulsadas com um peptídeo que sofreu mutação a partir de gene TLK2.Exemplo 5:Gene BCR-ABL que sofreu mutação se liga a proteínas MHC/HLA de paciente e pode elicitar células T CD8+ específicas de peptídeo mutante
[00171]Nós realizamos um estudo mais completo de respostas de células T para peptídeos mutantes específicos de tumor em pacientes com um outro tipo de leucemia, leucemia mielóide crônica (CML). CML é definida pela expressão de uma translocação específica de tumor, o produto da fusão de gene BCR-ABL. Mutações em BCR-ABL se desenvolvem em pacientes CML que desenvolvem resistência a droga para terapia farmacológica de linha de frente com mesilato de imatinibe, que tem por alvo BCR-ABL. Potencialmente, estas mutações podem gerar neoepítopos que células T do hospedeiro, ou um doador normal enxertado, podem reconhecer quando ligadas a proteínas MHC; estas células T são prováveis de serem minimamente toleradas.
[00172]Nós consideramos as 20 mutações mais comuns que evoluem em pacientes com resistência a imatinibe, e previmos a ligação de peptídeos de 9- e 1- meros telhados ao redor de cada mutação. Usando os algoritmos de previsão NetMHC (Nielsen et al. PLoS One. 2007, 2(8):e796) ou IEDB (Vita R et al. Nucleic Acids Res. 2010, 38:D854-62), nós previmos ligação de 84 peptídeos a partir de 20 mutações comuns para um ou mais 8 alelos HLA comuns (IC50 < 1000), com muitos peptídeos derivados das três mutações mais comuns. 24 de 84 peptídeos foram previstos serem ligantes fortes (IC50 < 50) (Figura 14), 42 peptídeos ligantes intermediários (50 < IC50 < 500), e 18 peptídeos ligantes fracos (500 < IC50 < 1000).
[00173]Nós focalizamos nossa atenção em um peptídeo mutante gerado de mutação E255K (E255K-B255-263) (KVYEGVWKK) (SEQ ID NO: 10) que é previsto ligar com alta afinidade a HLA-A3. (IC50 = 33,1). Usando um ensaio de ligação de MHC competitivo (Figura 8A), nós confirmamos experimentalmente a alta afinidade de ligação de E255K-B para HLA-A3 (IC50 = 17 nM) com ~10 vezes ligação de HLA mais forte do peptídeo mutante comparado ao peptídeo parente (tipo selvagem) (Figura 15A). E255K-B também foi experimentalmente verificado ligar-se a outros membros da família super tipo A3 HLA-A* 1101 e HLA-A* 68. Nós a seguir geramos linhas de células T contra E255K-B a partir de um doador HLA-A3+ normal e 2 pacientes CML E255K+/HLA-A3 que cada demonstrou maior especificidade contra o peptídeo que sofreu mutação do que o parente (Figura 15 B, C). E255K-B parece ser processado endogenamente e apresentado uma vez que células T reativas para E255K-B também responderam para APCs HLA-A3+ transfectadas com um minigene abrangendo 227 pares de bases circundando a mutação E255K. Finalmente, reatividade de E255K em um paciente desenvolveu-se somente seguindo allo-HSCT curativa (Figura 15D). Estes estudos demonstram que alterações genéticas dirigidas por leucemia podem prover novos alvos antígenos específicos de tumor imunogênicos que são associados com resposta clínica in vivo. Nossa abordagem para identificação de epítopos de célula T imunogênicos de BCR-ABL que sofreu mutação assim ilustra uma efetiva estratégia para aplicação de ferramentas de bio-informática para descobrir epítopos de células T a partir de genes que sofreram mutação.Exemplo 6:Clones de células T de paciente que reconhecem epítopos de tumor podem matar seletivamente células apresentando epítopos que sofreram mutação.
[00174]Confirmação de especificidade de alvo de células T é melhor endereçada por caracterização de clones de células T individuais. Nós por isso tipicamente isolamos clones de células T específicos de peptídeo que sofreu mutação através de diluição limitante de linhas de células T reativas e então usando ensaios padrões de liberação de cromo para selecionar clones de células T que demonstram morte diferencial de APCs autólogas pulsadas com peptídeo linha germe vs. aquelas que sofreram mutação. Usando uma série de diluição padrão para cada peptídeo, nós medimos a concentração de peptídeo requerida para 50% de morte. Se a razão de peptídeos tipo selvagem para mutantes necessária para 50% de morte é maior que 10 vezes, nós concluímos que há reconhecimento diferencial destes peptídeos por células T, como visto anteriormente para antígenos tumorais que sofreram mutação. Nós realizamos este procedimento para um antígeno de tumor CML, CML66. Para determinar se células T específicas de peptídeo CML66 reconhecem epítopos processados e apresentados, células T reativas com peptídeo-CML66 foram incubadas com transduções de APCs autólogas para expressão de inteira proteína CML66. Nós expressamos CML66 através de núcleofecção de DNA plasmídeo, ou RNA transcrito in vitro (em DCs, células B expandidas-CD40L, ou células K562 com moléculas HLA modificadas). Como mostrado na Figura 12A, células T estimuladas específicas para HLA-B4403 ligaram epítopo peptídeo derivado-CML66 (peptídeo 6672C). Uma vez que proteína CML66 inteira foi eficientemente expressa quando células B expandidas -CD40L foram núcleofectadas com mRNA CML66 (Figura 12B), nós fomos capazes de usar estas células (ou células pulsadas com peptídeo) como alvos em um ensaio padrão de liberação de cromo e verificamos que as células T lisaram efetivamente estas células alvos (Figura 12C). Ensaios comparáveis, incluindo lise de células tumorais emparelhadas-paciente, estão sendo realizados para cada uma das linhas de células T específicas para peptídeo que sofreu mutação geradas a partir de cada paciente de câncer (por exemplo, usando as linhas de células T descritas em Exemplos 6 e 7).Exemplo 7:Propulsores de tumor que sofreram mutação como potenciais antígenos tumorais
[00175]De 1188 mutações não-silenciosas através de 64 pacientes, nós identificamos 8 mutações recorrentes, incluindo SF3B1 (16% de pacientes CLL), TP53 (12,5%), MYD88 (9%), ATM (9%), FBXW7 (6%), MAPK1 (5%), GNB1 (3%) e M6PR (3%) (Figura 11). Estas mutações (especialmente as mais frequentes: SF3B1, TP53, MYD88 e ATM) são previstas dirigirem mutações que são essenciais para desenvolvimento ou progressão de tumor. Estes genes condutores representam promissores antígenos específicos de tumor para inclusão em uma vacina.
[00176]SF3B1 é o gene que mais frequentemente sofre mutação em CLL, sofreu mutação em sítios conservados, é altamente expresso em pacientes CLL (Figura 12), e não foi previamente descrito. A mutação de SF3B1 mais comum foi K700E (40% de mutações de SF3B1); genotipificação de adicionais 89 pacientes de CLL independentes descobriu mais 6 tumores de pacientes abrigando esta mutação. Através de aplicação de algoritmos de ligação de HLA-peptídeo às mutações de SF3B1, nós previmos ligação dos peptídeos que sofreram mutação para o alelo HLA- A2 mais comum (Figura 13). Se um peptídeo que abriga a mutação mais comum em CLL (SF3B1 K700E) liga o alelo HLA classe I mais comum (HLA-A2), então este peptídeo é um excelente candidato para inclusão em uma vacina CLL para muitos pacientes CLL. Referências Albert, T. J., Molla, M. N., Muzny, D. M., Nazareth, L., Wheeler, D., Song, X., Richmond, T. A., Middle, C. M., Rodesch, M. J., Packard, C. J., et al. (2007). 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Claims (16)

1. Método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:(a) selecionar 13 a 20 epítopos de um indivíduo com câncer que estão previstos para formar um complexo com uma ou mais proteínas codificadas por um ou mais alelos HLA do indivíduo, em que selecionar compreende:(i) gerar ácidos nucleicos de células cancerosas a partir de uma primeira amostra biológica compreendendo células cancerosas obtidas a partir de um tumor sólido do indivíduo e gerar ácidos nucleicos de células não cancerosas a partir de uma segunda amostra biológica compreendendo células não cancerosas obtidas do mesmo indivíduo;(ii) sequenciar os ácidos nucleicos das células cancerosas por sequencia- mento do genoma completo ou sequenciamento do exoma completo, obtendo, assim, uma primeira pluralidade de sequências de ácidos nucleicos compreendendo sequências de ácidos nucleicos de células cancerosas; e sequenciar os ácidos nucleicos de células não cancerosas por sequenciamento de genoma completo ou sequenciamento de exoma completo, obtendo, assim, uma segunda pluralidade de sequências de ácidos nucleicos compreendendo sequências de ácidos nucleicos de células não cancerosas;(iii) identificar uma pluralidade de sequências de ácidos nucleicos específicas do câncer a partir da primeira pluralidade de sequências de ácidos nucleicos que são específicas para as células cancerosas e que não são idênticas às sequências de ácidos nucleicos da segunda pluralidade de sequências de ácido nucleico, em que a pluralidade identificada de sequências de ácidos nucleicos específicas de câncer codificam duas ou mais sequências peptídicas diferentes de duas ou mais proteínas diferentes que são expressas pelas células cancerosas e não expressas nas células nãocancerosas, em que cada uma das duas ou mais sequências peptídicas diferentes das duas ou mais proteínas diferentes compreendem uma mutação específica de câncer;(iv) prever ou medir quais epítopos das duas ou mais sequências peptídicas diferentes formam um complexo com uma ou mais proteínas codificadas por um ou mais alelos HLA do mesmo indivíduo por uma análise de ligação ao peptídeo HLA; e(v) selecionar 13 a 20 epítopos previstos ou medidos em (iv), em que pelo menos dois dos 13 a 20 epítopos selecionados se ligam a uma proteína codificada por um alelo HLA do mesmo indivíduo com uma IC50 prevista ou medida inferior a 150 nM; e(b) fabricar (i) uma pluralidade de sequências peptídicas compreendendo os 13 a 20 epítopos selecionados em (a)(v), em que cada uma das sequências peptídicas da pluralidade tem um comprimento de 15 a 30 aminoácidos, ou (ii) um ou mais poli- nucleotídeos que codificam a pluralidade de sequências peptídicas.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende ainda colocar em contato células T obtidas do indivíduo com células apresentadoras de antígeno (APCs) ex vivo, em que as APCs apresentam pelo menos dois dos 13 a 20 epítopos selecionados em (a)(v).
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos dois dos 13 a 20 epítopos selecionados em (a)(v) se ligam à proteína codificada por um alelo HLA do mesmo indivíduo com uma IC50 prevista ou medida menor que 100 nM.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína codificada por um alelo HLA do mesmo indivíduo é uma proteína codificada por um alelo HLA selecionado a partir do grupo que consiste em HLA-A01:01, HLA-A02:01, HLA-A03:01, HLA-A11:01, HLA-A24:02, HLA-A30:01, HLA-A31:01, HLA-A32:01, HLA-A33:01, HLA-A68:01, HLA-B07:02, HLA-B08:01, HLA-B15:01, HLA-B44:03, HLA-C07:01 e HLA-C07:02.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que as células não cancerosas da segunda amostra biológica compreendem fibroblastos de pele ou células mononucleares do sangue pe-riférico (PBMCs).
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a identificação compreende identificar duas ou mais proteínas diferentes que são expressas pelas células cancerosas medindo os níveis de RNA que codificam as duas ou mais proteínas diferentes nas células cancerosas.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que:(i) cada um dos epítopos previstos para formar um complexo com uma proteína codificada por um alelo HLA de classe I do mesmo indivíduo em (a)(iv) tem um comprimento de 8 a 12 aminoácidos; e(ii) cada um dos epítopos previstos para formar um complexo com uma proteína codificada por um alelo HLA de classe II do mesmo indivíduo em (a)(iv) tem um comprimento de 10 a 24 aminoácidos.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que (a)(i) compreende isolar o DNA ou RNA genô- mico das células cancerosas e das células não cancerosas.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos dois dos 13 a 20 epítopos selecionados em (a)(iv) se ligam a uma proteína codificada por um alelo HLA do mesmo indivíduo com uma afinidade prevista ou medida mais forte do que os epítopos do tipo selvagem correspondentes.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que: (i) um primeiro epítopo dos 13 a 20 epítopos selecionados em (a)(v) é previsto ou medido para se ligar a uma proteína codificada por um primeiro alelo HLA do mesmo indivíduo; e(ii) o primeiro ou um segundo epítopo dos 13 a 20 epítopos selecionados em (a)(v) é previsto ou medido para se ligar a uma proteína codificada por um segundo alelo HLA do mesmo indivíduo que é diferente do primeiro alelo HLA.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de que identificar uma pluralidade de sequências de ácidos nucleicos específicas de câncer compreende comparar a primeira pluralidade de sequências de ácidos nucleicos de células cancerosas de um indivíduo com a segunda pluralidade de sequências de ácidos nucleicos de células não cancerosas do mesmo indivíduo.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, CARACTERIZADO pelo fato de que prever em (a)(iv) compreende prever as afinidades de ligação dos epítopos à proteína codificada por um alelo HLA do mesmo indivíduo.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos dois epítopos dos 13 a 20 epítopos selecionados em (a)(v) compreendem uma mutação pontual e se ligam à proteína codificada por um alelo HLA do mesmo indivíduo com uma IC50 prevista ou medida menor que 150 nM.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que a análise de ligação ao peptídeo HLA compreende o uso de um programa implementado em um sistema de computador.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que o programa é um algoritmo de predição de ligação de MHC-peptídeo.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, CARACTERIZADO pelo fato de que (a)(v) compreende selecionar com base na análise de ligação peptídeo-HLA.
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