KR20240010089A - 네오에피토프의 반복적 발견 및 이에 대한 적응성 면역치료 및 방법 - Google Patents

네오에피토프의 반복적 발견 및 이에 대한 적응성 면역치료 및 방법 Download PDF

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스티븐 찰스 벤츠
카이반 니아치
패트릭 순-시옹
앤드류 응유옌
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난토믹스, 엘엘씨
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Abstract

고려된 암 치료는 치료 후 또는 면욕 요법의 연속적인 회차 사이에 및/또는 추가의 면역요법을 알리기 위한 화학요법 후 환자의 다양한 생검 부위로부터의 환자-, 암- 및 위치- 특이적 네오에피토프의 재귀 분석을 포함한다. 재귀 분석은 다양한 네오에피토프 속성을 포함하여 치료 관련 네오에피토프를 동정하는 것이 바람직하다.

Description

네오에피토프의 반복적 발견 및 이에 대한 적응성 면역치료 및 방법{ITERATIVE DISCOVERY OF NEOEPITOPES AND ADAPTIVE IMMUNOTHERAPY AND METHODS THEREFOR}
본원은 본원에 참고로 인용된 2015년 10월 12일자로 출원된 미국 가출원 제62/240482호를 우선권으로 주장한다.
기술분야
본 발명의 분야는 종양성 질환(neoplastic diseases)의 면역학적 치료, 특히 전이성 암의 면역학적 치료이다.
배경 기술은 본 발명을 이해하는 데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 여기에 제공된 임의의 정보가 선행 기술이거나 본원에 청구된 발명과 관련이 있다거나 또는 구체적으로 또는 암시적으로 언급된 임의의 공보가 선행 기술임을 인정하는 것은 아니다.
본원에 인용된 모든 공보는 각각의 개별 공보 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 인용되도록 지시된 것과 동일한 정도로 본원에 참고로 인용된다. 인용된 참고문헌에서의 용어의 정의 또는 사용이 일관성이 없거나 본원에 제공된 해당 용어의 정의와 상반되는 경우에는 본원에 제공된 해당 용어의 정의가 적용되며 참고문헌에서의 해당 용어의 정의는 적용되지 않는다.
암 치료, 특히 개인화된 암 치료는 점차 많은 환자에게 실행가능한 옵션이 되었다. 그러나, 이러한 개선된 치료에도 불구하고, 재발은 여전히 성공적으로 관리되지 못하고 있으며 바람직한 결과보다 덜 나타날 수 있다. 다른 이유들 중에서도, 종양 이형성(예를 들어, WO 2015/164560 참조)은 치료 성공으로 이끄는 항원의 적절한 선택 기회를 상당히 감소시킨다. 더욱이, WO 2014/058987에 기술된 바와 같이, 많은 종양은 시간이 지남에 따라 클론적으로 상이한 전이를 발생시키므로 면역 치료에 의해 표적화되지 않을 수 있다. 또한, 다른 비-면역학적 약물 치료는 대부분의 경우 면역학적 약물 치료를 방해한다.
따라서, 면역요법에 대한 다양한 암 치료 옵션이 당업계에 공지되어 있지만, 암의 면역요법에서 치료 결과를 개선하는 것을 돕는 시스템 및 방법에 대한 필요성이 여전히 남아있다.
발명의 요약
본 발명자들은 다양한 부위, 바람직하게는 상이한 시점으로부터의 네오에피토프 분석에 의해 유도되는 암의 반복적 치료가 암의 재발을 억제하거나 심지어 제거할 가능성이 훨씬 더 높다는 것을 발견했다. 특히 바람직한 양태에서, 생검은 환자의 원발성 종양, 림프절 및 전이로부터 취해지며, 이들 샘플 각각은 오믹스(omics) 분석을 통해 면역학적 조성물(예를 들어 항체, 신바디(synbody), 변형된 NK 세포, T-세포, 재조합 바이러스 등)에 의한 치료에 적합한 네오에피토프의 환자-, 종양- 및 위치-특이적 정보를 얻는다. 그런 다음, 환자는 면역요법과 선택적으로 (저용량) 화학요법을 받게 되고, 이후에 동일한 및/또는 새로운 부위에서 추가 생검을 취하여 이러한 에피토프를 보유하거나 표시하는 암 세포의 존재 또는 증가 또는 감소를 모니터링할 뿐만 아니라 이들 부위에서의 새로운 네오에피토프를 동정한다. 그런 다음, 면역학적 및/또는 화학요법적 치료를 조정하여 환자를 추가로 치료한다.
발명 대상의 한 양태에서, 본 발명자들은 종양으로 진단된 환자를 위한 유도된 면역요법의 방법을 고찰한다. 특히 바람직한 방법에서, 오믹스 데이터는 환자의 제1 및 제2 위치에서 종양 세포에 대해 수집되고, 오믹스 데이터는 제1 및 제2 위치의 종양 세포에서의 네오에피토프를 각각 결정하는 데 사용된다. 또 다른 단계에서, 치료 관련 네오에피토프는 그룹 속성(attribute), 위치 속성, 기능 속성, 대사 속성 및/또는 경로 속성 중 적어도 하나(또는 적어도 2개 또는 3개 또는 적어도 4개)를 사용하여 제1 및 제2 위치의 종양 세포에서 동정된다. 면역 치료 조성물을 치료 관련 네오에피토프를 사용하여 생성한 다음, 면역 치료 조성물을 환자에게 투여한다.
특정 양태에서 환자는 순전한 치료일 수 있지만, 환자는 또한 생성된 면역 치료 조성물과 다를 수도 있고 그렇지 않을 수도 있는 초기 면역 치료 조성물에 의해 이전에 치료를 받았을 수도 있다. 가장 전형적으로, 제1 위치는 원발성 종양이고, 제2 위치는 국소 전이, 원거리 전이, 림프절 또는 순환계(예를 들어, 종양 세포가 순환형 종양 세포인 곳)일 수 있다.
일반적으로, 각각의 네오에피토프는 매칭된 정상 오믹스 데이터에 대한 필터링 및/또는 환자의 HLA-유형에 대한 필터링에 의해 결정되는 것이 더 바람직하다. 그룹 속성과 관련하여, 이러한 속성은 고유의 네오에피토프, 공유된 네오에피토프 및/또는 클론성 상태일 수 있으며, 위치 속성은 원발성 종양 위치, 전이 위치 및/또는 순환계일 수 있으며, 기능 속성은 운전자(driver) 돌연변이 또는 승객(passenger) 돌연변이일 수 있다. 대사 속성은 약물 내성 또는 증가된 해당작용일 수 있으며, 경로 속성은 성장 신호전달 경로의 돌연변이, 아폽토시스 신호전달 경로의 돌연변이, 호르몬 신호전달 경로의 돌연변이 및/또는 신호전달 경로 사용의 변화일 수 있다.
더욱이, 적절한 면역 치료 조성물은 치료 관련 네오에피토프를 코딩하는 재조합 바이러스성 발현 시스템, 치료 관련 네오에피토프를 발현하는 재조합 면역 수용성 세포, 치료 관련 네오에피토프를 위한 수용체를 발현하는 재조합 면역 수용성 세포, 치료 관련 네오에피토프를 결합시키기 위한 합성 항체, 및 치료 관련 네오에피토프와 생체외 활성화된 백혈구 세포를 포함하는 것이 고려된다. 새로운 네오에피토프를 계속해서 표적화하기 위해, (a) 제1 및 제2 위치에서 종양 세포에 대한 오믹스 데이터를 수집하는 단계; (b) 각각의 네오에피토프를 결정하기 위해 오믹스 데이터를 이용하는 단계; (c) 치료 관련 네오에피토프를 동정하는 단계; 및 (d) 치료 관련 네오에피토프를 사용하여 면역 치료 조성물을 제조하는 단계가 반복되어 업데이트된 면역 치료 조성물을 생성할 수 있음이 추가로 고찰된다.
따라서, 다른 관점에서 볼 때, 본 발명자들은 또한 암을 가진 환자에 대한 면역요법을 최적화하는 방법을 고찰하며, 이 방법은 제1 위치 및 제2 위치 중 적어도 하나에서 종양 세포에 대한 치료-전 네오에피토프 서열 정보를 수집하는 단계, 및 제1 및 제2 위치 중 적어도 하나에서 종양 세포에 대한 치료-후 네오에피토프 서열 정보를 수집하는 추가의 단계를 포함한다. 전술한 바와 같이, 각각의 치료-전 및 치료-후 네오에피토프 서열 정보는 바람직하게는 그룹 속성, 위치 속성, 기능 속성, 대사 속성 및/또는 경로 속성을 갖는다. 또 다른 단계에서, 업데이트된 치료 관련 네오에피토프는 치료-전 및 치료-후 네오에피토프 서열 정보의 그룹 속성, 위치 속성, 기능 속성, 대사 속성 및/또는 경로 속성에 기초하여 동정된다. 그런 다음, 업데이트된 면역 치료 조성물이 업데이트된 치료 관련 네오에피토프를 사용하여 생성된 다음, 업데이트된 면역 치료 조성물이 환자에게 투여된다.
가장 전형적으로, 제1 위치는 원발성 종양이고, 제2 위치는 국소 전이, 원거리 전이, 림프절 또는 순환계이다. 예를 들어, 치료-전 및 사후-네오에피토프 서열 정보는 제1 및 제2 위치의 종양 세포로부터의 것이며, 업데이트된 치료 관련 네오에피토프는 치료-전 및 치료-후 네오에피토프 서열 정보의 그룹 속성, 위치 속성 및 기능 속성 중 적어도 2개에 기초할 수 있다. 전술한 바와 같이, 일반적으로 그룹 속성은 고유한 네오에피토프, 공유된 네오에피토프 또는 클론성 상태일 수 있고, 위치 속성은 원발성 종양 위치, 전이 위치 또는 순환계일 수 있으며, 기능 속성은 운전자 돌연변이, 승객 돌연변이, 성장 신호전달 경로의 돌연변이, 아폽토시스 신호전달 경로의 돌연변이 또는 호르몬 신호전달 경로의 돌연변이일 수 있는 것이 바람직하다. 마찬가지로, 면역 치료 조성물은 치료 관련 네오에피토프를 코딩하는 재조합 바이러스성 발현 시스템, 치료 관련 네오에피토프를 발현하는 재조합 면역 수용성 세포, 치료 관련 네오에피토프를 위한 수용체를 발현하는 재조합 면역 수용성 세포, 치료 관련 네오에피토프를 결합시키기 위한 합성 항체, 또는 치료 관련 네오에피토프와 생체외 활성화된 백혈구 세포 집단일 수 있는 것이 일반적으로 바람직하다.
결과적으로, 본 발명자들은 또한 종양으로 진단된 환자에 대한 치료를 개선하는 방법을 고찰한다. 바람직한 방법은 환자의 종양 세포에 대한 복수의 제1 오믹스 데이터를 수집하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 제1 오믹스 데이터는 종양 세포의 적어도 2곳 이상의 상이한 위치로부터 얻어진다. 추가 단계에서, 환자-, 암- 및 위치-특이적 네오에피토프는 그룹 속성, 위치 속성, 기능 속성, 대사 속성 및/또는 경로 속성 중 적어도 하나를 각각 갖는 제1 오믹스 데이터로부터 결정되고, 이어서 상기 네오에피토프는 환자-특이적 면역 치료 조성물을 생성하는 데 사용된다. 또 다른 단계에서, 복수의 제2 오믹스 데이터가 환자의 종양 세포에 대해 수집되고, 여기서 제2 오믹스 데이터는 종양 세포의 적어도 2개의 상이한 위치로부터 얻어지며, 제2 오믹스 데이터는 환자-특이적 면역 치료 조성물에 의해 환자를 치료한 후에 얻어진다. 다시 한번, 업데이트된 환자-, 암- 및 위치-특이적 네오에피토프는 그룹 속성, 위치 속성, 기능 속성, 대사 속성 및/또는 경로 속성 중 적어도 하나를 각각 갖는 제2 오믹스 데이터로부터 결정되고, 이어서 상기 업데이트된 네오에피토프는 환자-특이적 면역 치료 조성물을 생성하는 데 사용된다.
제1 및 제2 위치, 상기 속성들 및 환자-특이적 면역 치료 조성물과 관련하여, 상기에서 제공된 것과 동일한 고려사항이 적용된다. 또한, 일반적으로 환자-특이적 면역 치료 조성물과 업데이트된 환자-특이적 면역 치료 조성물은 치료 관련 네오에피토프를 코딩하는 재조합 바이러스성 발현 시스템, 치료 관련 네오에피토프를 발현하는 재조합 면역 수용성 세포, 치료 관련 네오에피토프를 위한 수용체를 발현하는 재조합 면역 수용성 세포, 치료 관련 네오에피토프를 결합시키기 위한 합성 항체, 및 치료 관련 네오에피토프와 생체외 활성화된 백혈구 세포 집단으로 이루어진 군으로부터 선택되는 상이한 개체인 것이 고려된다.
본 발명의 대상의 다양한 목적, 특징, 양태 및 장점은 첨부된 도면과 함께 바람직한 구현예에 대한 하기 상세한 설명으로부터 명백해질 것이며, 도면에서 유사한 번호는 유사한 구성요소를 나타낸다.
도 1은 상이한 위치 및 시점에 걸친 종양 이형성의 예시적인 도면이다.
본 발명자들은 면역요법 및/또는 화학요법 후에 환자-, 종양- 및 위치- 특이적 네오에피토프의 재귀적 동정을 사용하여 다양한 암의 치료가 현저히 개선될 수 있고, 이러한 후속적 네오에피토프가 면역요법을 정제 또는 조정하기 위한 새로운 치료 표적으로 사용될 수 있음을 발견했다. 가장 주목할 만한 것은, 이러한 접근법은 또한 종래 치료법을 사용하여 치료할 수 없는 종양 및/또는 전이의 특정 하위-집단을 표적으로 할 수 있다는 것이다. 더욱이, 고찰된 시스템 및 방법은 종양이 높은 유전 변화 속도를 겪을지라도 치료 표적의 업데이트를 가능하게 할 것이다.
이러한 맥락에서, 바람직한 네오에피토프는 암(예를 들어 CEA)에 공통인 에피토프 또는 특정 유형의 암(예를 들어 PSA)에 특이적인 에피토프가 아니라 특정 종양에 대해 또는 심지어 종양 내의 위치에 독점적인 항원임을 이해해야 한다. 또한, 바람직한 네오에피토프는 하기에 보다 상세히 논의되는 바와 같이 특정 환자(따라서 SNP 및 다른 공지된 변이체를 제거한) 및 그 또는 그녀의 HLA-유형에 특이적이라는 것을 이해해야 한다. 마지막으로, 하기에 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 본원에서 사용하기에 적합한 네오에피토프는 이들의 해부학적 위치에 대해 특이적이다. 다른 관점에서 볼 때, 고찰되는 네오에피토프는 특정 환자 및 그/그녀의 HLA-유형, 종양 및 위치에 대해 진정한 것이다. 또한, 네오에피토프는 또한 특정 치료 단계(예를 들어, 치료 전, 제1 회 치료 후 등)에 특이적일 수 있다.
대조적으로, 네오에피토프가 표준 '건강한' 참조 서열을 사용하여 종양 샘플로부터 결정되는 경우, 다수의 이러한 네오에피토프가 체이적(idiosyncratic) SNP로 인해 위양성(false positive)일 가능성이 있다. 더욱이, 환자의 HLA 유형을 고려하지 않으면, 네오에피토프가 환자-특이적 네오에피토프인 경우에도 다수의 네오에피토프가 면역 시스템에 '가시적'이지 않을 것이다. 따라서, 현재 알려진 대부분의 네오에피토프 시스템 및 방법은 치료학적 효과를 초래하지 않을 수 있는 상당한 양의 위양성 결과를 제공할 것이다. 또한, 네오에피토프 분석이 단일 샘플만을 기초로 하는 경우, 해부학적 위치와 시간에 대한 종양의 유전적 이형성으로 인해 대부분의 면역 치료법이 효과가 없거나 효과가 떨어질 것이다. 도 1은 면역요법에 대한 과제의 예를 도시한다. 여기서, 삼중 네거티브 유방암 진단을 받은 환자는 지시된 바와 같은 상이한 시간과 위치에서 다중 생검을 받는다. 또한, 환자는 7일부터 시작하는 시스플라틴 및 125일부터 시작하는 벨리파리브(veliparib)로 치료를 받았다. 각각의 생검 및 시점에 대한 원형 플롯으로부터 알 수 있는 바와 같이, 종양 및 전이는 유전적으로 다양하고 동적이었다. 이러한 이형성을 고려하여, 다양한 위치와 시간에 걸쳐 다른 네오에피토프를 더 분석하지 않고 단일 네오에피토프를 사용하는 면역요법은 원하는 치료 결과를 얻지 못할 것이다. 이 과제를 극복하기 위해, 본 발명자들은 종양으로 진단된 환자에게 유도된 면역요법의 방법을 다음과 같은 단계를 포함하는 것으로 고려한다: (a) 환자의 제1 위치에서 종양 세포에 대한 오믹스 데이터를 수집하고 환자의 제2 위치에서 종양 세포에 대한 오믹스 데이터를 수집하는 단계; (b) 상기 오믹스 데이터를 사용하여 상기 제1 및 제2 위치의 종양 세포에서 각각의 네오에피토프를 결정하는 단계; (c) 그룹 속성, 위치 속성 및 기능 속성 중 적어도 하나를 사용하여 상기 제1 및 제2 위치의 종양 세포에서의 치료 관련 네오에피토프를 동정하는 단계; 및 (d) 상기 치료 관련 네오에피토프를 사용하여 면역 치료 조성물을 제조하고 상기 면역 치료 조성물을 환자에게 투여하는 단계.
따라서, 다른 관점에서 볼 때, 본 발명자들은 또한 암을 가진 환자에 대한 면역요법을 최적화하는 방법을 다음과 같은 단계를 포함하는 것으로 고려한다: (a) 제1 및 제2 위치 중 적어도 하나에서 종양 세포에 대한 치료-전 네오에피토프 서열 정보를 수집하는 단계; (b) 상기 제1 및 제2 위치 중 적어도 하나에서 종양 세포에 대한 치료-후 네오에피토프 서열 정보를 수집하는 단계; (c) 여기서 각각의 상기 치료-전 및 치료-후 네오에피토프 서열 정보는 그룹 속성, 위치 속성 및 기능 속성을 가지며; (d) 상기 치료-전 및 사루-치료 네오에피토프 서열 정보의 그룹 속성, 위치 속성 및 기능 속성 중 적어도 하나에 기초하여 업데이트된 치료 관련 네오에피토프를 동정하는 단계; 및 (e) 상기 업데이트된 치료 관련 네오에피토프를 사용하여 업데이트된 면역 치료 조성물을 생성하고, 상기 업데이트된 면역 치료 조성물을 환자에게 투여하는 단계.
따라서, 또 다른 관점에서 볼 때, 본 발명자들은 또한 종양으로 진단된 환자에 대한 치료를 개선하는 방법을 다음 단계를 포함하는 것으로 고려하며, 이는 (a) 환자의 종양 세포에 대한 복수의 제1 오믹스 데이터를 수집하는 단계로서, 여기서 상기 제1 오믹스 데이터는 상기 종양 세포의 2개 이상의 상이한 위치로부터 수득되는, 단계; (b) 그룹 속성, 위치 속성 및 기능 속성 중 적어도 하나를 각각 갖는 제1 오믹스 데이터로부터 환자-, 암- 및 위치-특이적 네오에피토프를 결정하는 단계; (c) 상기 네오에피토프를 사용하여 환자-특이적 면역 치료 조성물을 생성하는 단계; (d) 환자의 종양 세포에 대한 복수의 제2 오믹스 데이터를 수집하는 단계로서, 여기서 상기 제2 오믹스 데이터는 종양 세포의 2개 이상의 상이한 위치로부터 수득되고, 상기 제2 오믹스 데이터는 환자-특이적 면역 치료 조성물의 치료로부터 수득되는, 단계; (e) 그룹 속성, 위치 속성 및 기능 속성 중 적어도 하나를 각각 갖는 제2 오믹스 데이터로부터 업데이트된 환자-, 암- 및 위치-특이적 네오에피토프를 결정하는 단계; 및 (f) 상기 업데이트된 네오에피토프를 사용하여 업데이트된 환자-특이적 면역 치료 조성물을 생성하는 단계를 포함한다.
네오에피토프와 관련하여, 네오에피토프는 고유하고 종양 특이적 항원을 생성하는 종양 세포에서 무작위 돌연변이를 발현하는 것으로 볼 수 있다. 따라서, 다른 관점에서 볼 때, 네오에피토프는 침묵 및 다른 비-연관 돌연변이를 제거시키는 제1 내용 필터로서 작용할 수 있는 돌연변이의 유형(예컨대 결실, 삽입, 전환, 전이, 전좌) 및 영향(예컨대 넌센스(non-sense), 미스센스, 프레임 이동 등)을 고려하여 동정할 수 있다. 또한, 네오에피토프 서열은 비교적 짧은 길이(예컨대 7 내지 11mer)의 서열 신장으로 정의될 수 있으며, 여기서 이러한 신장은 아미노산 서열의 변화(들)를 포함할 것이라는 것을 이해해야 한다. 가장 전형적으로, 변화된 아미노산은 중앙 아미노산 위치 또는 그 근처에 있을 것이다. 예를 들어, 전형적인 네오에피토프는 A4-N-A4, 또는 A3-N-A5, 또는 A2-N-A7, 또는 A5-N-A3, 또는 A7-N-A2의 구조를 가질 수 있으며, 여기서 A는 단백질생성 아미노산이고 N은 변화된 아미노산(야생형 또는 매칭된 정상군에 대해)이다. 예를 들어, 본원에서 고려되는 네오에피토프 서열은 비교적 짧은 길이(예컨대 5 내지 30mer, 보다 전형적으로 7 내지 11mer 또는 12 내지 25mer)의 서열 신장을 포함하며, 여기서 이러한 신장은 아미노산 서열의 변화(들)를 포함한다.
따라서, 단일 아미노산 변화가, 변화된 아미노산의 위치에 따라, 변화된 아미노산을 포함하는 다수의 네오에피토프 서열에 제시될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 유리하게는, 이러한 서열 가변성은 네오에피토프의 다중 선택을 가능하게 하여 하나 이상의 바람직한 형질(예컨대 환자 HLA-유형에 대한 가장 높은 친화도, 가장 높은 구조적 안정성 등)을 기초로 선택될 수 있는 잠재적으로 유용한 표적의 수를 증가시킨다. 가장 전형적으로, 이러한 네오에피토프는 2 내지 50개의 아미노산, 보다 전형적으로는 5 내지 30개의 아미노산, 가장 전형적으로는 9 내지 15개의 아미노산의 길이를 갖도록 계산되며, 변화된 아미노산은 바람직하게는 중앙에 위치하거나 그렇지 않으면 MHC와의 결합을 향상시키는 방식으로 위치한다. 예를 들어, 에피토프가 MHC-I 복합체에 의해 제공되는 경우, 전형적인 네오에피토프 길이는 약 8 내지 11개의 아미노산이고, MHC-II 복합체를 통해 제시된 전형적인 네오에피토프 길이는 약 13 내지 17개의 아미노산을 가질 것이다. 쉽게 이해되는 바와 같이, 네오에피토프에서의 변화된 아미노산의 위치는 중심이 아니기 때문에, 실제 펩타이드 서열 및 네오에피토프의 실제 위상은 상당히 다를 수 있다.
물론, 네오에피토프의 동정 또는 발견은, 이하에서 더욱 상세히 논의되는 바와 같이, 새로운 생검, 동결 또는 그렇지 않으면 보존된 조직 또는 세포 샘플, 순환형 종양 세포, 엑소좀, 다양한 체액(특히 혈액) 등을 비롯한 다양한 생물학적 물질로 시작될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 적절한 오믹스 분석 방법은 핵산 시퀀싱, 특히 DNA 상에서 작동하는 NGS 방법(예를 들어, 일루미나 시퀀싱, 이온 토렌트 시퀀싱, 454 파이로시퀀싱, 나노기공 시퀀싱 등), RNA 시퀀싱(예를 들어, RNAseq, 역전사 기반 시퀀싱 등), 및 단백질 시퀀싱 또는 질량 분광학 기반 시퀀싱(예를 들어, SRM, MRM, CRM 등)을 포함한다.
이와 같이, 특히 핵산 기반 시퀀싱의 경우, 종양 조직의 높은 처리량의 게놈 시퀀싱이 특히 네오에피토프의 신속한 동정을 허용할 것이라는 점을 인식해야 한다. 그러나, 이렇게 획득된 서열 정보가 표준 참조와 비교되는 경우, 이종접합뿐만 아니라 정상적으로 발생하는 환자 간 변화(예를 들어, SNP, 짧은 삽입-결실(indel), 다른 반복 횟수 등에 기인함)가 비교적 많은 수의 잠재적인 위양성 네오에피토프를 초래한다. 특히, 환자의 종양 샘플이 동일한 환자의 매칭된 정상(즉, 비-종양) 샘플과 비교되는 경우, 이러한 부정확성은 제거될 수 있다.
본 발명의 대상 중 하나의 특히 바람직한 양태에서, DNA 분석은 종양 및 매칭된 정상 샘플 둘 다의 전체 게놈 시퀀싱 및/또는 엑손 시퀀싱(전형적으로 적어도 10x, 보다 전형적으로는 적어도 20x의 커버리지(coverage) 깊이에서)에 의해 수행된다. 대안적으로, DNA 데이터는 또한 이전의 서열 결정으로부터 이미 확립된 서열 기록(예를 들어, SAM, BAM, FASTA, FASTQ 또는 VCF 파일)으로부터 제공될 수도 있다. 따라서, 데이터 세트는 처리되지 않거나 처리된 데이터 세트를 포함할 수 있고, 예시적인 데이터 세트는 BAMBAM 포맷, SAMBAM 포맷, FASTQ 포맷 또는 FASTA 포맷을 갖는 것들을 포함할 수 있다. 그러나, 데이터 세트가 BAMBAM 포맷 또는 BAMBAM 디프(diff) 대상물로 제공되는 것이 특히 바람직하다(예를 들어, US2012/0059670A1 및 US2012/0066001A1 참조). 또한, 데이터 세트는 동일한 환자의 종양 및 매칭된 정상 샘플을 반영하여 환자 및 종양 특이적 정보를 얻는다는 점에 유의해야 한다. 따라서, 종양을 유발하지 않는 유전적 배선 변이(예를 들어, 침묵 돌연변이, SNP 등)가 배제될 수 있다. 물론, 이하에서 더욱 상세히 다루어지는 바와 같이, 종양 샘플은 초기 종양, 치료 시작시 종양, 재발성 종양 또는 전이 부위 등으로부터 유래될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 대부분의 경우, 환자의 매칭된 정상 샘플은 종양과 동일한 조직 유형의 혈액 또는 비-질환 조직일 수 있다.
물론, 서열 데이터의 컴퓨터 분석은 다양한 방식으로 수행될 수 있음에 주목해야 한다. 그러나, 가장 바람직한 방법에서, BAM 파일 및 BAM 서버를 사용하여 예를 들어 US 2012/0059670A1 및 US 2012/0066001A1에 개시된 바와 같이 종양 및 정상 샘플의 위치-유도 동시 정렬에 의해 인-실리코(in-silico) 분석된다. 이러한 분석은 위양성 네오에피토프를 유리하게 감소시키고 메모리 및 계산 자원에 대한 요구를 상당히 감소시킨다.
또한, 상기 분석은 매칭된 정상 서열 데이터가 다른 시점 및/또는 상이한 위치로부터의 종양 서열 데이터로 대체되는 방식으로 수행될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 종양의 분석은 매칭된 정상 서열 정보와 종양 서열 정보를 비교하는 방식으로 수행될 뿐만 아니라 시간 경과에 따른 하나의 위치의 종양(예를 들어 제1 회 치료 전후의 원발성 종양) 또는 원발성 종양 대 다른 위치의 종양(예를 들어 원발성 종양 대 원거리 전이)에서 차등 돌연변이의 검출을 허용하는 방식으로 수행될 수 있다. 따라서, 유전적 부동(drift) 및 네오에피토프 부동이 동정될 수 있고 치료가 쉽게 적응될 수 있다. 더욱이, 이전의 치료 효과는 치료 유효성을 위한 분자 프록시 마커로서 사용될 수 있는 네오에피토프의 존재 또는 부재와 상관 관계가 있을 수 있다. 예를 들어, 제1 네오에피토프를 이용한 면역요법은 종양 세포 집단 또는 네오에피토프를 발현하는 클론의 박멸을 초래하는 한편 새로운 네오에피토프에 의한 치료 내성이 쉽게 확인되고 뒤따를 수 있다. 다른 관점에서 볼 때, 동일한 환자의 생검 데이터로부터의 상이한 네오에피토프 분석은 새로운 면역요법의 생성뿐만 아니라 이전 치료의 추적 및 평가에 유용할 수 있다.
컴퓨터에 지시된 임의의 언어는 서버, 인터페이스, 시스템, 데이터베이스, 에이전트, 피어(peer), 엔진, 컨트롤러, 또는 개별적으로 또는 집합적으로 작동하는 기타 유형의 컴퓨팅 장치를 포함하는 컴퓨팅 장치들의 임의의 적절한 조합을 포함하도록 판독되어야 한다는 점에 유의해야 한다. 컴퓨팅 장치는 유형의(tangible) 비-일시적인 컴퓨터 판독가능한 저장 매체(예를 들어, 하드 드라이브, 솔리드 스테이트 드라이브, RAM, 플래시, ROM 등) 상에 저장된 소프트웨어 명령을 실행하도록 구성된 프로세서를 포함하는 것으로 이해해야 한다. 소프트웨어 명령은 바람직하게는 개시된 장치와 관련하여 후술되는 바와 같은 역할, 책임 또는 다른 기능을 제공하도록 컴퓨팅 장치를 구성한다. 또한, 개시된 기술은 프로세서로 하여금 컴퓨터-기반 알고리즘, 프로세스, 방법 또는 다른 명령들의 구현과 관련된 개시된 단계들을 실행하게 하는 소프트웨어 명령들을 저장하는 비-일시적인 컴퓨터 판독가능한 매체를 포함하는 컴퓨터 프로그램 제품으로서 구현될 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, 다양한 서버, 시스템, 데이터베이스, 또는 인터페이스는 아마도 HTTP, HTTPS, AES, 공개-개인 키 교환, 웹 서비스 API, 공지의 금융 거래 프로토콜 또는 다른 전자 정보 교환 방법 기반의 표준화된 프로토콜 또는 알고리즘을 사용하여 데이터를 교환한다. 장치간 데이터 교환은 패킷-교환 네트워크, 인터넷, LAN, WAN, VPN, 또는 다른 유형의 패킷 교환 네트워크; 회선 교환 네트워크; 셀 교환 네트워크; 또는 다른 유형의 네트워크를 통해 수행될 수 있다.
다른 관점에서 볼 때, 5 내지 25개 아미노산의 소정의 길이를 가지며 적어도 하나의 변화된 아미노산을 포함하는 서열의 환자-, 암- 및 위치-특이적인 인-실리코 수집을 확립할 수 있다. 이러한 수집은 전형적으로 각각의 변화된 아미노산에 대해, 변화된 아미노산의 위치가 동일하지 않은 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 6개 이상의 구성원을 포함할 것이다. 그런 다음, 이러한 수집은 하기에 보다 상세히 설명되는 바와 같이 (예를 들어, 하위-세포 위치, 전사 및/또는 발현 수준, MHC-1 및/또는 II 친화도 등에 의해) 추가 필터링을 위해 사용될 수 있다.
암의 유형과 단계에 따라, 일부 네오에피토프 분획만이 면역 반응을 일으키는 것으로 관찰되었다. 치료학적으로 효과적인 반응의 가능성을 높이기 위해, 네오에피토프는 추가로 필터링될 수 있다. 물론, 다운스트림 분석은 본원에서 제시된 방법의 목적을 위한 침묵 돌연변이를 고려할 필요가 없다는 것을 이해해야 한다. 그러나, 바람직한 돌연변이 분석은 돌연변이 유형(예를 들어 결손, 삽입, 전환, 전이, 전좌)뿐만 아니라 돌연변이 영향(예를 들어 넌센스, 미스센스 등)에 대한 정보를 제공하며, 침묵 돌연변이를 제거시키는 제1 내용 필터로서 작용할 수 있다. 예를 들어, 네오에피토프는 돌연변이가 프레임-이동, 넌센스 및/또는 미스센스 돌연변이인 추가 고려를 위해 선택될 수 있다. 이러한 필터링은 시퀀싱 데이터 또는 인-실리코 번역된 서열을 사용하여 수행될 수 있다.
추가적인 필터링 접근법에서, 네오에피토프는 또한 하위-세포 위치 파라미터에 대한 상세한 분석 대상이 될 수 있다. 예를 들어, 네오에피토프 서열은 네오에피토프가 막 관련 위치를 갖는 것으로 동정된 경우(예를 들어, 세포의 세포막 외부에 위치하는 경우) 및/또는 인-실리코 구조 계산에 의해 네오에피토프가 용매에 노출되거나 구조적으로 안정한 에피토프(예컨대 문헌[J Exp Med 2014])를 나타낼 수 있는 경우에 추가적인 고찰을 위해 선택될 수 있다.
네오에피토프를 필터링하는 것과 관련하여, 네오에피토프는 네오에피토프가 실제로 발현되는 것으로 밝혀진 오믹스(또는 다른) 분석에 사용하기에 특히 적합한 것으로 고려된다. 네오에피토프의 발현 및 발현 수준의 동정은 당업계에 공지된 모든 방식으로 수행될 수 있으며, 바람직한 방법은 정량적 RNA(hnRNA 또는 mRNA) 분석 및/또는 정량적 프로테오믹스 분석을 포함한다. 가장 일반적으로, 네오에피토프를 포함하는 것에 대한 임계치 수준은 상응하는 매칭된 정상 서열의 발현 수준의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50%의 발현 수준이 될 것이므로, (네오)에피토프가 면역 시스템에 잠재적으로 "가시적"인 것으로 보장한다. 따라서, 오믹스 분석은 또한 유전자 발현 분석(전사체 분석(transcriptomic analysis))을 포함하여 돌연변이가 있는 유전자 발현 수준을 동정하는 것이 일반적으로 바람직하다.
당해 분야에 공지된 전사체 분석의 수많은 방법이 존재하며, 공지된 모든 방법이 본원에서의 사용에 적합한 것으로 간주된다. 예를 들어, 바람직한 물질은 mRNA 및 1차 전사체(hnRNA)를 포함하고, RNA 서열 정보는 동일한 환자의 종양 샘플 및 매칭된 정상(건강한) 샘플로부터 차례로 얻어지는 역전사된 폴리 A+-RNA로부터 얻을 수 있다. 마찬가지로, 폴리 A+-RNA는 전형적으로 전사체의 표현으로서 바람직하지만, 다른 형태의 RNA(hn-RNA, 비-폴리아데닐화된 RNA, siRNA, miRNA 등)도 본원에서의 사용에 적합하다고 간주됨을 유의해야 한다. 바람직한 방법은 정량적 RNA(hnRNA 또는 mRNA) 분석 및/또는 정량적 프로테오믹스 분석, 특히 예를 들어 RNAseq 등을 포함한다. 다른 양태에서, 다양한 대안적인 방법(예를 들어, 고상 하이브리드화-기반 방법)이 또한 적합하다고 여겨지지만, RNA 정량화 및 시퀀싱은 RNA-seq, qPCR 및/또는 rtPCR 기반 방법을 사용하여 수행된다. 또 다른 관점에서 볼 때, 전사체 분석은 암- 및 환자-특이적 돌연변이를 갖는 유전자를 동정하고 정량화하기 위해 (단독으로 또는 게놈 분석과 함께) 적합할 수 있다.
유사하게, 프로테오믹스 분석은 네오에피토프의 RNA의 실제적인 번역을 확인하기 위해 다양한 방식으로 수행될 수 있으며, 프로테오믹스 분석의 모든 공지된 방식이 본원에서 고려된다. 그러나, 특히 바람직한 프로테오믹스 방법은 항체-기반 방법 및 질량 분광분석 방법을 포함한다. 또한, 프로테오믹스 분석은 단백질 그 자체에 관한 정성적 또는 정량적 정보를 제공할 뿐만 아니라, 단백질이 촉매 작용 또는 다른 기능적 활성을 갖는 단백질 활성 데이터를 또한 포함할 수 있음을 주목해야 한다. 프로테오믹스 분석을 수행하기 위한 하나의 예시적인 기술은 본원에 참고로 인용된 US 7473532에 기재되어 있다. 단백질 발현의 더 적절한 동정 및 심지어 정량화의 또 하나의 적합한 방법은 다양한 질량분광 분석(예를 들어, 선택적 반응 모니터링(SRM), 다중 반응 모니터링(MRM) 및 연속 반응 모니터링(CRM))을 포함한다.
필터링의 또 다른 양태에서, 네오에피토프는 인간-동일 서열의 사용을 피하기 위해 (예를 들어, 환자 또는 환자 집단의) 공지된 인간 서열을 함유하는 데이터베이스와 비교될 수 있다. 또한, 필터링은 SNP가 종양 및 매칭된 정상 서열 둘 다에 존재하는 환자의 SNP로 인한 네오에피토프 서열의 제거를 포함할 수도 있다. 예를 들어, dbSNP(단일 뉴클레오티드 다형성 데이터베이스(Single Nucleotide Polymorphism Database))는 국립 인간 게놈 연구소(NHGRI)와 공동으로 국립 생물공학 정보 센터(NCBI)가 개발하고 호스팅한 여러 종에 걸친 유전적 변이에 대한 무료 공개 아카이브이다. 데이터베이스의 명칭이 한 종류의 다형성(단일 뉴클레오티드 다형성(SNP))의 집합만을 의미하지만, 실제로는 (1) SNP, (2) 짧은 결실 및 삽입 다형성(인델/DIP), (3) 마이크로위성(microsatellite) 마커 또는 짧은 탠덤 반복(STR), (4) 다중 뉴클레오티드 다형성(MNP), (5) 이종접합 서열, 및 (6) 명명된 변이체와 같은 비교적 광범위한 분자적 변이를 포함한다. dbSNP는 명백하게도 중성 다형성, 공지된 표현형에 상응하는 다형성, 및 불변 영역을 수용한다.
상기한 바와 같은 데이터베이스 및 다른 필터링 옵션을 사용하여, 환자 및 종양 특이적 네오에피토프를 필터링하여 이들 공지된 서열을 제거함으로써, 실질적으로 감소된 위양성을 갖는 다수의 네오에피토프 서열을 갖는 서열 세트를 산출할 수 있다.
필터링에도 불구하고, 네오에피토프가 환자의 MHC 복합체에 제시되어야 하므로 모든 네오에피토프가 면역 시스템에서 가시적일 수는 없음을 인식해야 한다. 실제로, 네오에피토프의 일부만이 표현에 충분한 친화도을 나타낼 것이며, MHC 복합체의 다양성으로 인해 모두는 아니더라도 대부분의 공통적인 네오에피토프의 사용은 배제될 것이다. 따라서, 면역요법의 맥락에서, 네오에피토프가 MHC 복합체에 결합되고 제시될 때 네오에피토프가 보다 효과적일 것이라는 것은 너무나도 분명하다. 다른 관점에서 볼 때, 효과적인 결합 및 제시는 환자의 네오에피토프 서열과 특정 HLA-유형의 조합된 기능이다. 가장 전형적으로, 적합한 HLA-유형 결정은 적어도 3개의 MHC-I 하위-유형(예컨대, HLA-A, HLA-B, HLA-C) 및 적어도 1개, 또는 2개, 또는 3개의 MHC-II 하위-유형(예컨대, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR)을 포함한다. 바람직하게는 각각의 하위-유형은 적어도 4-자리 깊이(4-digit-depth)로 결정될 것이다. 그러나, 더 큰 깊이(예를 들어, 6자리, 8자리)도 또한 본원에서 고려된다.
HLA 결정은 당해 분야에 잘 공지된 습식-화학에서의 다양한 방법을 사용하여 수행될 수 있고, 이들 방법 모두는 본원에서의 사용에 적합한 것으로 간주된다. (공지의 화학 또는 인-실리코 결정을 사용하여) 일단 환자의 HLA-유형이 확인되면, HLA-유형에 대한 구조 용액을 데이터베이스에서 계산하거나 얻은 다음, HLA 구조 용액에 대한 (전형적으로 필터링된) 네오에피토프의 결합 친화력을 결정하기 위해 인-실리코 도킹(docking) 모델에 사용한다. 하기에서 추가로 논의되는 바와 같이, 결합 친화력을 결정하기에 적합한 시스템은 NetMHC 플랫폼을 포함한다(예를 들어 문헌[Nucleic Acids Res. 2008 Jul 1; 36(Web Server issue): W509-W512.] 참조). 그런 다음, 환자의 MHC-I/II 하위-유형에 대한 지식과 함께, 사전 결정된 HLA-유형에 대해 높은 친화력(예를 들어, 100 nM 미만, 75 nM 미만, 50 nM 미만)을 갖는 네오에피토프가 요법 생성을 위해 선택된다.
특히 바람직한 방법에서, HLA-유형은 공지된 및/또는 공통 HLA-유형의 대부분 또는 전부를 함유하는 참조 서열을 사용하여 인-실리코 환자의 오믹스 데이터로부터 예측될 수 있다. 예를 들어, 하나의 예시적인 방법에서, 염색체 6p21.3(또는 HLA 대립형질이 발견되는 곳/근처에 있는 임의의 다른 위치)에 매핑되는 비교적 다수의 환자 서열 판독이 데이터베이스 또는 시퀀싱 기계에 의해 제공된다. 가장 전형적으로, 서열 판독은 약 100 내지 300개의 염기의 길이를 가지며 판독 품질, 정렬 정보, 배향, 위치 등을 포함한 메타데이터를 포함한다. 예를 들어 적절한 포맷에는 SAM, BAM, FASTA, GAR 등이 포함된다. 본 발명의 대상을 제한하는 것은 아니지만, 일반적으로 환자 서열 판독은 적어도 5x, 보다 전형적으로는 적어도 10x, 더욱 전형적으로는 적어도 20x, 가장 일반적으로는 적어도 30x의 커버리지의 깊이를 제공하는 것이 바람직하다.
환자 서열 판독에 추가하여, 고려된 방법은 공지된 별개의 HLA 대립형질의 다수의 서열을 포함하는 하나 이상의 참조 서열을 추가로 이용한다. 예를 들어, 전형적인 참조 서열은 상기 HLA-유형의 다중 HLA-대립형질을 갖는 적어도 하나의 HLA-유형의 서열 단편을 포함하는 합성(상응하는 인간 또는 다른 포유동물 대응물을 갖지 않음) 서열일 수 있다. 예를 들어, 적합한 참조 서열은 HLA-A의 적어도 50개의 상이한 대립형질에 대한 공지된 게놈 서열의 집합을 포함한다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 상기 참조 서열은 또한 HLA-A의 적어도 50개의 상이한 대립형질에 대한 공지된 RNA 서열의 집합을 포함할 수 있다. 물론, 참조 서열은 HLA-A의 50개의 대립형질에 한정되지 않고 HLA-유형 및 대립형질의 수/조성에 대한 대안적인 조성물을 가질 수 있다. 가장 전형적으로, 참조 서열은 컴퓨터 판독가능한 포맷으로 존재하고 데이터베이스 및 다른 데이터 저장 장치로부터 제공될 것이다. 예를 들어, 적합한 참조 서열 포맷은 FASTA, FASTQ, EMBL, GCG 또는 GenBank 포맷을 포함하고, 공용 데이터 저장소(예컨대 국제 면역유전학 정보 시스템(IMGT) 또는 대립형질 빈도 네트 데이터베이스(The Allele Frequency Net Database), EUROSTAM, URL: www.allelefrequencies.net)의 데이터로부터 직접 얻거나 구축할 수 있다. 대안적으로, 참조 서열은 또한 대립형질 빈도, 종족 대립형질 분포, 공통 또는 희귀 대립형질 유형 등과 같은 하나 이상의 사전 결정된 기준에 기초한 개별적인 공지의 HLA-대립형질로부터 구축될 수 있다.
참조 서열을 사용하여, 환자 서열 판독은 이제 드브루인(de Bruijn) 그래프를 통해 쓰레딩(threading)되어 가장 적합한 대립형질을 동정할 수 있다. 이러한 맥락에서, 각 개인은 각각의 HLA-유형에 대해 2개의 대립형질을 갖고 있으며 이러한 대립형질은 매우 유사하거나 어떤 경우에는 동일할 수도 있다는 점에 주목해야 한다. 이러한 고도의 유사성은 전통적인 정렬 방식에 상당한 문제를 제기한다. 본 발명자들은 이제 HLA 대립형질 및 심지어 매우 밀접하게 관련된 대립형질이 드브루인 그래프가 상대적으로 작은 k-mer(전형적으로 10 내지 20개의 염기 길이를 가짐)로 판독된 서열을 분해함으로써 그리고 대립형질의 서열과 매칭되는 서열 판독의 k-mer에 기초하여 각각의 환자 서열 판독이 각각의 대립형질에 대한 투표("정량적 판독 지원")를 제공하는 가중 투표 과정을 구현함으로써 구성되는 접근법을 사용하여 해결될 수 있음을 발견하였다. 그런 다음, 대립형질에 대해 누적적으로 가장 높은 투표가 가장 가능성이 높게 예측된 HLA 대립형질을 나타낸다. 또한, 일반적으로 대립형질에 매칭되는 각각의 단편을 사용하여 대립형질의 전체적인 커버리지와 커버리지의 깊이를 계산하는 것이 바람직하다.
특히 탑 히트(top hit) 중 많은 부분이 유사한 경우(예를 들어, 스코어의 상당 부분이 고도로 공유된 k-mer 세트의 경우) 스코어를 더 높이거나 세분화할 수 있다. 예를 들어, 스코어 정제는 현재의 탑 히트와 실질적으로 유사한(예를 들어, 99% 초과 또는 다른 소정의 값) 대립형질이 차후 고려사항으로부터 제거되는 가중치 방식을 포함할 수 있다. 현재의 탑 히트에 의해 사용되는 k-mer에 대한 카운트는 인자(예컨대, 0.5)에 의해 재-가중되고, 각 HLA 대립형질에 대한 스코어는 이들 가중된 카운트를 합산함으로써 재계산된다. 이러한 선택 과정은 새로운 탑 히트를 구하기 위해 반복된다. 이러한 방법의 정확성은 심지어 DNA에 존재하는 2개의 대립형질 중 때로는 단지 1개일 수 있는 종양에 의해 발현되는 대립형질을 동정할 수 있는 RNA 서열 데이터를 사용하여 더욱 개선될 수 있다. 고려된 시스템 및 방법의 또 다른 유리한 양태에서, DNA 또는 RNA, 또는 DNA와 RNA 둘 다의 조합을 처리하여 고도로 정확하고 종양 또는 혈액 DNA 또는 RNA로부터 유도될 수 있는 HLA 예측을 수행할 수 있다. 인-실리코 HLA 타이핑에서의 고정밀도에 대한 추가의 측면, 적합한 방법 및 고려사항은 본원에 참고로 인용된 국제 출원 제PCT/US16/48768호에 기재되어 있다.
일단 환자/종양 특이적 네오에피토프 및 HLA-유형이 동정되면, HLA에 네오에피토프를 도킹하고 예를 들어 NetMHC를 사용하여 최상의 결합제(예를 들어, 최저 KD, 예컨대 500 nM 미만, 또는 250 nM 미만, 또는 150 nM 미만, 또는 50 nM 미만)를 결정하여 컴퓨터 분석을 수행할 수 있다. 이러한 접근법은 환자 및 각 위치에 대한 종양에 대해 진정한 특정 네오에피토프를 동정할 뿐만 아니라 세포 상에 나타날 가능성이 가장 높고 치료 효과에 의해 면역 반응을 이끌어낼 가능성이 가장 높은 네오에피토프를 동정할 수 있음을 이해해야 한다. 물론, 이와 같이 동정된 HLA-매칭된 네오에피토프는 치료학적 조성물에 사용하기 전에 (예를 들어, MHC 복합체와 네오에피토프 및/또는 제시 사이의 고-친화도 결합을 확립하기 위해) 시험관내에서 생화학적으로 유효화될 수 있음을 이해해야 한다.
물론, 환자의 HLA-유형과 환자- 및 암-특이적 네오에피토프의 매칭은 NetMHC 이외의 시스템을 사용하여 수행될 수 있으며, 적합한 시스템에는 NetMHC II, NetMHCpan, IEDB 분석 자원(URL immuneepitope.org), RankPep, PREDEP, SVMHC, Epipredict, HLABinding 및 기타(예컨대, 문헌[J Immunol Methods 2011; 374: 1-4] 참조)가 포함된다. 가장 높은 친화력을 계산할 때, 변형된 아미노산의 위치가 이동된 네오에피토프 서열의 수집(상술됨)이 사용될 수 있다는 점에 주목해야 한다. 대안적으로 또는 부가적으로, 네오에피토프에 대한 변형은 N- 및/또는 C-말단 변형을 가함으로써 발현된 네오에피토프와 환자 HLA-유형의 결합을 더욱 증가시킴으로써 구현될 수 있다. 따라서, 네오에피토프는 특정 HLA-유형에 보다 잘 매칭되도록 동정되거나 추가로 변형된 상태의 원형일 수 있다. 또한, 필요한 경우, 상응하는 야생형 서열(즉, 아미노산 변화가 없는 네오에피토프 서열)의 결합을 계산하여 높은 차등 친화력을 보장할 수 있다. 예를 들어, 네오에피토프와 이의 상응하는 야생형 서열 간의 MHC 결합에서 특히 바람직한 높은 차등 친화력은 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 100배, 적어도 500배, 적어도 1000배 등이다.
종양 세포에서의 치료 관련 네오에피토프를 동정하기 위해, 본 발명의 대상의 특히 고려되는 양태에서, 암으로 진단된 환자에서 적어도 2개, 더욱 전형적으로는 적어도 3개 위치에서 다수의 생검이 수행된다. 가장 전형적으로, 이러한 생검은 전형적으로 비교적 좁은 시간 프레임(예를 들어, 같은 날) 내에서의 원발성 종양, 종양 근위 림프절, 하나 이상의 국소 전이 및 하나 이상의 원거리 전이로부터의 생검을 포함할 것이다. 물론, 생검의 모든 방식이 적절하다고 간주되고 신선한(액체 및 고체) 생검, 플래시-냉동 생검, FFPE 샘플 등이 포함됨을 이해해야 한다. 이러한 독립된 생검은 이어서 오믹스 분석을 거쳐 각 부위에 대한 각각의 오믹스 데이터를 얻은 다음, 치료 관련 네오에피토프를 사용하여 환자-, 질환- 및 위치-특이적 면역요법 또는 화학요법을 설계하는 데 사용된다.
다수의 생검 및 관련된 다수의 네오에피토프는 암 조직의 모든 발생에 걸쳐 보다 대표적인 돌연변이 변화의 그림을 제공할 뿐만 아니라 치료 감시 및 시간에 따른 적응을 허용한다는 점에 주목해야 한다. 또한, 후술되는 속성의 특정 방식에 따라, 치료는 하나 이상의 특정 측면 또는 하위-클론에 대해 구성될 수 있다(예를 들어, 전이 세포만을 표적으로 하거나 화학요법 내성 세포만을 표적으로 하거나, 또는 선조(founder) 돌연변이를 표적으로 하는 것 등). 다수의 생검이 존재하고 치료에 대한 잠재적 표적 수가 증가함에 따라, 위에서 설명한 바와 같이 동정되는 네오에피토프는 특정 목적을 달성하기 위해 가능한 순열의 수를 임상적으로 관련된 네오에피토프 세트로 줄이기 위해 더 많은 기여를 한다.
가장 바람직하게는, 상기 속성은 그룹 속성, 위치 속성, 기능 속성, 대사 속성, 경로 속성 중 적어도 하나(또는 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 4개)를 포함할 것이다. 예를 들어, 상기 속성이 그룹 속성인 경우, 그룹 속성은 동일한 환자의 다른 네오에피토프에 관한 네오에피토프에 대한 정보를 제공할 것이다. 따라서, 적절한 그룹 속성은 고유한 네오에피토프로서 또는 공유된 네오에피토프(예를 들어 배수 림프절에서 원발성 종양과 종양 세포 간에 공유되거나 모든 생검에서의 모든 종양들 간에서 공유된)로서의 네오에피토프의 동정, 배수성 상태(예를 들어 이수성, 다배수성 등)의 동정, 클론성 상태(예를 들어 하위-클론의 그룹 내의 특정 하위-클론에 속한), 진단 테스트(예를 들어 최초 진단시 발생, 후발성 종양 또는 전이)에 의한 검출 시간 및/또는 네오에피토프가 발견되는 질환 조직의 유형(예를 들어 원발성 종양, 전이 등)으로서의 네오에피토프의 동정을 포함할 것이다. 클론성 분석과 관련하여, 이러한 분석은 기존의 오믹스 데이터에 기초하여 수행되는 것이 바람직하며, 특히 적절한 클론성 분석은 WO 2014/058987에 개시된 방법을 사용하여 수행된다. 물론, 각각의 특정 그룹 속성은 하나 초과의 기술자(descriptor)를 포함할 수 있음을 이해해야 한다.
적절한 위치 속성은 일반적으로 네오에피토프의 전체 및 미세 해부학적 위치에 대한 기술적 정보를 제공할 것이다. 예를 들어, 위치 속성에는 종양 위치(예를 들어 장기 및/또는 감염된 세포 구조), 전이 위치(예를 들어 림프절, 국소, 원거리) 및 네오에피토프가 순환계 또는 골수 내 세포(예를 들어 순환형 종양 세포)에서 발견되는지 여부에 대한 정보가 포함된다. 기능 속성과 관련하여, 기능 속성은 네오에피토프가 가지고 있거나 가지고 있다고 의심되는 기능적인 영향에 관한 정보를 제공할 것으로 생각된다. 예를 들어, 기능 속성에는 운전자 돌연변이 또는 승객 돌연변이와 관련된 (또는 이와 관련된) 네오에피토프의 동정이 포함된다. 기능 속성의 다른 예는 또한 네오에피토프를 코딩하는 핵산의 메틸화 상태 또는 스플라이스 변이체를 포함한다.
본 발명의 대상의 또 다른 고려되는 양태에서, 네오에피토프는 또한 네오에피토프가 결합된 세포에 대한 대사 정보를 제공하는 대사 속성을 가질 수 있다. 예를 들어, 네오에피토프는 특정 약물에 내성이거나 약물이나 치료 유형에 민감한 세포 집단에서 발견될 수 있다. 대사 정보에는 또한 세포의 호흡 상태(예를 들어 증가된 락트산 수준 또는 당분해 효소의 활성), 세포 표면에 영양 수송체의 존재 또는 부재(예를 들어 글루코스 수송체 GLUT1, 아미노산 수송체 이합체 파트너 4F2hc, 순수 아미노산 수송체 예컨대 EAT2, SNAT1/2 등)이 포함될 수 있다. 마찬가지로, 경로 속성의 성질도 상당히 변할 수 있으며, 일반적으로 네오에피토프가 관찰되는 세포의 경로 정보(예를 들어, 돌연변이의 기능적 영향 또는 경로 활성의 하나 이상의 결함 또는 변화에 관한)를 포함할 것이다. 예를 들어, 적합한 경로 속성은 성장 신호전달 경로의 돌연변이 또는 기능, 아폽토시스 신호전달 경로의 돌연변이 또는 기능, 호르몬 신호전달 경로의 돌연변이 또는 기능, 및/또는 신호전달 경로 사용의 변화에 관한 정보를 포함한다. 특히, 이러한 경로 정보는 동일한 오믹스 데이터로부터 얻어질 수 있으며, 경로 분석은 신호전달 단백질, 또는 구성적으로 활성인 수용체 단백질 또는 도메인의 활성 증가 또는 감소를 나타낼 수 있다. 당업계에 공지된 경로 분석의 다양한 방식이 있으며, 이들 모두는 본원에서 사용하기에 적절하다고 간주된다. 그러나, 특히 바람직한 양태에서, 경로 분석은 PARADIGM(예를 들어, WO 2011/139345 또는 WO 2013/062505에 기재된 바와 같이)을 사용하여 수행된다.
네오에피토프 및 관련 속성의 결정시, 이렇게 얻어진 정보는 면역 치료제의 생성에 유용할 수 있는 서열 수집뿐만 아니라 동정된 서열은 개선된 면역학적 치료 조성물에 적절한 표적 선택을 유도할 수 있는 유전적, 생리학적 및 일시적인 '메타데이터'를 제공하는 것으로 이해해야 한다. 예를 들어, 원발성 및 전이성 종양이 운전자 돌연변이와 관련된 동일한 네오에피토프를 갖는 경우, 네오에피토프는 모든 종양성 성장을 근절시키기 위한 면역요법을 사용하는 표적으로서 특히 적합할 수 있다. 한편, 원발성 종양의 두 전이가 공통의 네오에피토프를 공유하는 경우, 공통의 네오에피토프를 표적으로 하는 면역요법을 시행하면서 원발성 종양을 외과적으로 제거할 수 있다. 따라서, 다른 관점에서 볼 때, 특정 종양 클론, 특정 위치, 또는 모든 종양 성장을 표적으로 하는 하나 이상의, 또는 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 4개의 속성에 기초하여 네오에피토프 서열을 선택할 수 있다.
예를 들어, 그룹 속성은 환자의 암을 제거하기 위한 포괄적인 치료(예를 들어 그룹 속성이 공유된 네오에피토프인 경우) 또는 환자의 종양이 수술 불가능한 위치에 있거나 다르게는 빠른 제거가 필요한 고도의 표적 치료(예를 들어 그룹 속성이 고유한 네오에피토프인 경우)에 유용할 수 있는 개별 네오에피토프를 동정하는 데 사용될 수 있다. 한편, 그룹 속성이 배수성 상태를 동정하는 경우, 그룹 속성은 증폭된 (과활성) 신호전달 성분으로 세포를 우선적으로 표적화하는 데 사용될 수 있다. 한편, 그룹 속성이 클론성 상태인 경우, 그 속성을 사용하여 급성장 또는 고도로 전이된 하위-클론을 표적으로 할 수 있다. 그룹 속성이 진단 테스트 또는 질환 조직의 유형에 의한 검출 시간인 또 다른 예에서, 후발성 종양 또는 전이가 먼저 표적화되는 한편, 원발성 종양은 화학요법을 사용하여 치료될 수 있다.
위치 속성과 관련하여, 네오에피토프가 네오에피토프의 전체 또는 미세한 해부학적 위치에 특이적인 것으로 동정될 수 있음을 알아야 한다. 이와 같이, 종양 및/또는 전이를 선택적으로 치료하여 그러한 제거가 가능하지 않거나 너무 위험할 수 있는 (예를 들어 뇌 또는 간 전이) 외과적 제거를 피할 수 있다. 마찬가지로, 기능 속성은 네오에피토프가 운전자 돌연변이에 있거나 이와 관련된 경우 특히 유용할 수 있다. 이러한 경우, 종양 성장 및 진행은 이러한 네오에피토프가 면역요법에 의해 표적화되는 경우에 효과적으로 중단되거나 느려질 수 있다. 한편, 상기 속성이 종양 세포가 약물이나 다른 치료 방식에 민감하다는 것을 나타내는 대사 속성인 경우 면역요법보다는 약물 치료가 권고될 수 있다. 마찬가지로, 경로 속성이 구성적으로 활성인 수용체를 나타내는 경우, 그 신호전달 경로를 통한 신호 흐름을 정지시키거나 감소시키기 위해 약물 치료가 수행될 수 있다.
물론, 상이한 속성으로부터의 정보를 결합하여 치료 옵션과 표적을 더욱 명확하게 정의할 수 있음을 인식해야 한다. 예를 들어, 그룹 속성 및 위치 속성은 면역 치료제로 치료하기 위한 하나 이상의 공통 표적을 동정하는 데 사용될 수 있는 반면, 대사 속성은 비-면역 치료 약물에 민감할 수 있는 잔류 종양을 동정하는 데 사용될 수 있다. 다른 관점에서 볼 때, 집합 이론으로부터의 연산을 사용하는 다양한 수학적 연산이 다양한 속성에 이용되어 특정의 네오에피토프를 의도적인 방식으로 선택할 수 있음을 이해해야 한다. 예를 들어, 본원의 교시와 관련하여 사용하기 위한 고려된 조작은 결합, 교차, 멱 집합, 집합 차이, 대칭 차이, 및 데카르트 곱을 포함한다. 이러한 모든 조작은 하나 이상의 특정 치료 결과를 목표로 하는 하나 이상의 네오에피토프를 초래할 것이다.
따라서, 분석은 또한 면역요법 치료가 종양의 한 하위-세트에 적합할 수 있는 반면, 다른 종양은 방사선, 화학요법 및/또는 방사선 요법을 포함하여 보다 통상적인 방식으로 동일한 환자에게 치료될 수 있음을 나타낼 수 있다. 마찬가지로, 본원에 제시된 방법은 면역요법이 방사선, 화학요법 및/또는 방사선 요법을 포함하는 다른 치료 양상에 의해 보강될 수 있음을 나타낼 수 있다. 또한, 하나 이상의 속성이 비-면역요법 치료에 사용되어 치료 경과를 추적하거나 정량화할 수도 있음에 유의해야 한다. 예를 들어, 원발성 종양의 고유한 네오에피토프의 소실은 (예를 들어, 혈관신생 억제제를 사용하여) 원발성 종양을 표적으로 하는 약물 치료의 프록시 마커로서 사용될 수 있는 반면, 순환형 종양 세포들 사이에서 공유되는 네오에피토프의 소실은 면역 체크포인트 억제제의 치료 효과를 추적하거나 정량화하는 데 사용될 수 있다. 유사하게, 일련의 치료 후에 새로운 네오에피토프의 출현은 면역 치료제의 후속 설계에 사용될 수 있는 잔여 종양 세포의 유전적 부동을 동정하는 데 사용될 수 있다.
네오에피토프 속성의 특정 용도에 관계없이, 이렇게 동정되고 선택된 네오에피토프 또는 네오에피토프들은 특정 환자에 대한 면역 치료 조성물의 생성에 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 본원에 제시된 방법은 유리하게는 HLA 매칭된 환자-, 종양- 및 위치-특이적 면역 치료 조성물의 직접 또는 간접 생성을 허용할 것이라는 점에 유념해야 한다. 본원에 사용된 바와 같이, 면역 치료 조성물과 관련하여 "생성"이란 용어는 또한 면역 치료 조성물을 생성시키는 것을 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 면역 치료 조성물은, 직접적으로는 백신, 항체 또는 다른 네오에피토프-특이적 친화도 시약, 또는 네오에피토프-특이적 세포 기반 조성물을 생성함으로써 또는 간접적으로는 면역 치료 조성물을 생성하는 제조업자에게 선택된 네오에피토프에 대한 정보를 제공함으로써 제조될 수 있다.
쉽게 이해되는 바와 같이, 적절한 면역 치료 조성물은 치료 관련 네오에피토프를 코딩하는 재조합(예를 들어 누드 DNA, RNA, 바이러스성, 세균성) 발현 시스템, 치료 관련 네오에피토프를 발현하는 재조합 면역 수용성 세포(예를 들어, NK 세포, T 세포, 수지상 세포), 치료 관련 네오에피토프를 위한 (키메라) 수용체를 발현하는 재조합 면역 수용성 세포(예를 들어 CAR 발현 T 세포), 치료 관련 네오에피토프를 결합시키기 위한 합성 항체, 및 치료 관련 네오에피토프와 생체외 활성화된 백혈구 세포 집단을 포함한다.
예를 들어, 치료 관련 네오에피토프의 선택시, 재조합 핵산은 세포내 발현 및 이후 세포 상에 네오에피토프의 제공을 위해 구성될 수 있다. 재조합 핵산은 네오에피토프가 MHC-I 및/또는 MHC-II 제공 경로로 유도되고 네오에피토프가 높은 친화도을 갖는 것으로 알려진 MHC 하위-유형으로 유도되도록 한 배열에서 하나 이상의 환자- 및 암-특이적 네오에피토프를 암호화하는 서열 부분을 포함한다. 이러한 표적화되고 이성적인 표현은 피하 전달에 의해 또는 보다 전형적으로는 하나 이상의 보조-자극 분자 및/또는 체크포인트 억제제의 발현에 의해 추가로 보강될 수 있는 보다 강력한 면역 반응을 생성하는 것으로 생각된다. 물론, 이러한 재조합 핵산 전달의 모든 방식이 적합하고 재조합 핵산이 DNA 백신, 재조합 바이러스 게놈 또는 형질전환 조성물에서 전달가능한 DNA 또는 RNA로서 제형화될 수 있는 것을 이해해야 한다. 따라서, 당업계에 공지된 모든 발현 시스템(예를 들어, 세균 발현 시스템, 효모 발현 시스템, '누드(naked)' DNA 및 RNA 발현 시스템)은 본원에서의 사용에 적합한 것으로 간주된다는 점에 유념해야 한다.
그러나, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 알파바이러스, 헤르페스 바이러스, 렌티바이러스 등을 포함하여 유전자 치료에서 이미 확립된 바이러스를 사용하는 것이 특히 바람직하다. 그러나, 다른 적절한 선택 중에서도, 아데노바이러스가 특히 바람직하다. 또한, 일반적으로, 바이러스는, 선택된 바이러스 단백질(예를 들어, E1, E3 단백질)의 표적화된 결실에 의해 전형적으로 달성되는 복제 결핍 및 비-면역원성 바이러스인 것이 더욱 바람직하다. 이러한 바람직한 특성은 E2b 유전자 기능을 결실시킴으로써 더욱 강화될 수 있으며, 최근에 보고된 바와 같이 유전자 변형된 인간 293 세포를 사용하여 높은 역가의 재조합 바이러스를 달성할 수 있다(예를 들어 문헌[J Virol 1998 Feb; 72(2): 926-933]). 가장 전형적으로, (바이러스 감염된 세포로부터의 발현을 위한) 원하는 핵산 서열은 당업계에 널리 공지된 적절한 조절 요소의 제어하에 있다.
네오에피토프를 코딩하는 서열 부분의 통합과 관련하여, 다양한 네오에피토프가 다양한 방식으로 배열될 수 있고, 전사 또는 번역 단위가 전형적으로 프로테아제 절단 부위를 추가로 포함할 수 있는 짧은 링커(예를 들어, 4 내지 20개의 아미노산을 갖는 가요성 링커)에 의해 분리된 다중 에피토프의 연쇄체성(concatemeric) 배열을 가질 수 있다. 이러한 연쇄체에는 (전형적으로 바이러스를 통해 전달될 수 있는 재조합 핵산의 크기에 의해 제한되는) 1 내지 20개의 네오에피토프가 포함될 수 있으며, 연쇄체는 MHC-I 및 MHC-II 복합체에 전달하기 위해 동일하거나 상이할 수 있음에 유념해야 한다. 따라서, 그리고 후술되는 바와 같이, MHC-I 및/또는 MHC-II를 통한 우선적 또는 심지어 특이적 발현을 달성하기 위해 다양한 펩타이드가 특정 세포 구획으로 전달될 수 있음을 이해해야 한다. 또 다른 관점에서 볼 때, 종양 관련 항원 및 네오에피토프는 발현 경로 모두를 통해 또는 선택적으로 동시에 또는 이후의 치료 회차에서 하나 또는 다른 경로로 제공될 수 있음을 인식해야 한다.
유전적으로 변형된 바이러스의 '페이로드(payload)'와 관련하여, 하나 초과 예를 들어 2, 3, 4, 5개 및 그 이상의 치료 관련 네오에피토프의 발현이 바람직하며, 이는 다수의 별개의 변형된 바이러스, 또는 하나 초과의 네오에피토프 서열(예를 들어, 연쇄체 또는 키메라 서열로서)을 갖는 바이러스를 사용하여 달성될 수 있다. 본 발명의 대상을 한정하는 것은 아니지만, 일반적으로 네오에피토프 서열은 탠덤 미니유전자(minigene)(예를 들어 aa12-네오에피토프 12-aa12) 또는 키메라 단백질로 번역되거나 번역되지 않을 수 있는 단일 전사 단위로 구성되는 것이 바람직하다. 따라서, 에피토프는 모노머, 멀티머, 개별적으로 또는 연쇄체성으로, 또는 N- 및/또는 C-말단 펩타이드와의 하이브리드 서열로 존재할 수 있음을 이해해야 한다. 가장 전형적으로, 핵산 서열은 바이러스 및/또는 숙주 코돈 선호도를 수용하기 위해 적절한 코돈 사용법을 사용하여 역-번역되는 것이 바람직하다. 그러나, 대체 코돈 사용 또는 비-매칭된 코돈 사용도 적절한 것으로 간주된다. 추가의 적합한 구성 및 발현 카세트에 관해, 본원에 참고로 인용된 2016년 3월 2일자로 출원된 공-계류중인 미국 가출원 제62/302168호 및 2016년 3월 28일자로 출원된 미국 가출원 제62/314366호를 참조한다.
또한, 네오에피토프 서열(예를 들어, 단일 네오에피토프 또는 폴리토프로서 발현된)은 적합한 서열 요소를 사용하여 하나 또는 둘 모두의 MHC 발현 경로로 구성되고 유도될 수 있음을 이해해야 한다. 이와 같이 발현된 네오에피토프를 원하는 MHC 시스템으로 전달하는 것과 관련하여, MHC-1 발현된 펩타이드는 전형적으로 프로테아좀 처리 및 소포체를 통한 전달을 통해 세포질로부터 발생할 것이라는 점에 주목해야 한다. 따라서, MHC-I 제시를 위해 의도된 에피토프의 발현은 일반적으로 하기에 더 상세히 논의되는 바와 같이 세포질로 유도될 것이다. 한편, MHC-II 제시된 펩타이드는 전형적으로 세포막에 전달되기 전에 산성 프로테아제(예를 들어, 레그마인, 카텝신 L 및 카텝신 S)에 의한 분해 및 가공을 통해 엔도좀성 및 리소좀성 구획으로부터 발생할 것이다. 따라서, MHC-II 제시를 위해 의도된 에피토프의 발현은 일반적으로 하기에 보다 상세히 논의되는 바와 같이 엔도좀성 및 리소좀성 구획으로 유도될 것이다.
가장 바람직한 양태에서, 신호 펩타이드는 네오에피토프를 엔도좀성 및 리소좀성 구획으로 (MHC-II에 대한 네오에피토프 제시를 유도하면서) 트래피킹(trafficking)하거나 세포질 공간에 (MHC-I에 대한 네오에피토프 제시를 유도하면서) 머무르도록 하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 펩타이드가 엔도좀성 및 리소좀성 구획을 표적으로 하는 예비-서열(presequences)을 표출하는 경우, 내부 표적화 펩타이드가 사용될 수 있다. 표적 펩타이드의 예비-서열은 바람직하게는 N-말단에 부가되고 6 내지 136개의 염기성 및 소수성 아미노산을 포함한다. 퍼옥시좀 표적화의 경우, 표적화 서열은 C-말단에 있을 수 있다. 다른 신호(예를 들어, 신호 패치)가 사용될 수 있으며, 펩타이드 서열에서 분리되고 적절한 펩타이드 접힘시 기능성이 되는 서열 요소를 포함할 수 있다. 또한, 글리코실화와 같은 단백질 변형은 표적화를 유도할 수 있다. 다른 적합한 표적화 신호 중에서도, 본 발명자들은 N-말단 근처에 위치하는 노나펩타이드인 퍼옥시좀 표적화 신호 1(PTS1), C-말단 트리펩타이드 및 퍼옥시좀 표적화 신호 2(PTS2)를 고려한다. 또한, 엔도좀 및 리소좀에 대한 단백질의 분류는, 전형적으로 짧은 선형 서열을 포함하는, 단백질의 세포질 도메인 내의 신호에 의해 매개될 수 있다. 일부 신호는 티로신-계 분류 신호라고 하며 NPXY 또는 YXXØ공통 모티프에 순응한다. 다이류신-계 신호로 알려진 다른 신호는 [DE]XXXL[LI] 또는 DXXLL 공통 모티프에 적합하다. 이러한 모든 신호는 막의 세포질 표면과 관련된 주변의 단백질 코팅 성분으로 인식된다. YXXØ및 [DE]XXXL[LI] 신호는 어댑터 단백질(AP) 복합체 AP-1, AP-2, AP-3 및 AP-4에 의해 특징적인 미세 특이성으로 인식되지만, DXXLL 신호는 어댑터는 GGA로 알려진 어댑터의 또 다른 계통으로 인식된다. 또한, 액포 단백질 분류 및 엔도좀 기능과 관련되어 있는 FYVE 도메인을 추가할 수 있다. 또 다른 양태에서, 인간 CD1 꼬리 서열을 사용하여 엔도좀 구획을 표적화할 수도 있다(예를 들어, 문헌[Immunology, 122, 522-531] 참조).
세포질 구획 내 트래피킹 또는 보유는 반드시 하나 이상의 특정 서열 요소를 필요로 하지 않을 수 있다. 그러나, 적어도 일부 양태에서, 막-고정 단백질 또는 막-고정 단백질의 막 앵커 도메인을 포함하는 N- 또는 C-말단 세포질 보유 신호가 추가될 수 있다. 예를 들어, 막-고정 단백질은 SNAP-25, 신택신(syntaxin), 시냅토프레빈(synaptrevin), 시냅토택민(synaptotagmin), 소포 관련 막 단백질(VAMP), 시냅스 소포 당단백질(SV2), 고친화도 콜린 수송체, 뉴렉신(Neurexin), 전압-관문 칼슘 채널, 아세틸콜린에스터라제 및 NOTCH를 포함한다.
또한, 바이러스 전달 비히클은 또한 감염된 수지상 세포와 T-세포 사이의 상호작용을 향상시키기 위해 적어도 하나, 보다 전형적으로 적어도 2개, 보다 더 전형적으로 적어도 3개, 가장 전형적으로 적어도 4개의 공동-자극(co-stimulatory) 분자를 코딩하는 것으로 고려된다. 예를 들어, 적절한 공동-자극 분자는 특히 B7.1(CD80) 및/또는 B7.2(CD86)와 조합된 ICAM-1(CD54), ICOS-L 및 LFA-3(CD58)을 포함한다. 추가 고려되는 공동-자극 분자는 4-1BBL, CD30L, CD40, CD40L, CD48, CD70, CD112, CD155, GITRL, OX40L 및 TL1A를 포함한다. 또한, 공동-자극 분자의 발현은 바람직하게는 항원 및/또는 네오에피토프가 하나 이상의 공동-자극 분자와 함께 제시되도록 조정된다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 전형적으로, 공동-자극 분자는 예를 들어 내부 리보좀 진입 부위 또는 2A 서열을 사용하여 단일 전사체로부터, 또는 다중 전사체로부터 생성되는 것으로 간주된다.
마찬가지로, 바이러스 벡터는 체크포인트 수용체에 결합하는 하나 이상의 펩타이드 리간드를 코딩하는 서열 부분을 추가로 포함할 것으로 예상된다. 가장 전형적으로, 결합은 수용체를 통한 신호전달을 억제하거나 적어도 감소시킬 것이며, 특히 고려되는 수용체는 CTLA-4(특히 CD8+ 세포의 경우) 및 PD-1(특히 CD4+ 세포의 경우)을 포함한다. 예를 들어, 펩타이드 결합제는 항체 단편 및 특히 scFv뿐만 아니라 수용체에 특이적으로 결합하는 소분자 펩타이드 리간드를 포함할 수 있다. 다시 한번, 펩타이드 분자의 발현은 바람직하게는 항원 및/또는 네오에피토프가 하나 이상의 펩타이드 분자와 함께 제시되도록 배위될 것임을 이해해야 한다. 따라서, 전형적으로, 펩타이드 분자는 예를 들어 내부 리보좀 진입 부위 또는 2A 서열을 사용하여 단일 전사체로부터, 또는 다중 전사체로부터 생성되는 것으로 간주된다.
이어서, 바이러스는 전형적으로 투여 단위당 104 내지 1011 바이러스 입자의 바이러스 역가를 갖는 멸균 주사용 조성물로서 제형화된 약학적 조성물에서 치료 백신으로서 개별적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 대안적으로, 바이러스는 환자(또는 다른 HLA 매칭된) 세포를 생체외에서 감염시키기 위해 사용될 수 있고 이렇게 감염된 세포는 환자에게 수혈된다. 추가의 예에서, 바이러스에 의한 환자의 치료는 베어(bare) 형태의 동종이식 또는 자가 자연 살해 세포 또는 T 세포에 의하거나 또는 네오에피토프, 네오에피토프들, 종양 관련 항원 또는 바이러스와 동일한 페이로드를 표적으로 하는 항체를 발현하는 키메라성 항원 수용체에 의해 달성될 수 있다. 환자-유래 NK-92 세포주를 포함하는 자연 살해 세포는 또한 CD16을 발현할 수 있으며 항체와 결합할 수 있다. 본원에 사용된 약학 조성물 또는 면역 치료 조성물을 "투여하는"이란 용어는 조성물의 직접 및 간접 투여 둘 다를 의미하고, 여기서 조성물의 직접 투여는 전형적으로 건강 관리 전문가(예를 들어, 의사, 간호사 등)에 의해 수행되며, 간접 투여는 (예를 들어, 주사, 주입, 경구 전달, 국소 전달 등을 통한) 직접 투여를 위해 건강 관리 전문가에게 약학 조성물 또는 약물을 제공하거나 이용가능하게 하는 단계를 포함한다.
추가로 고려되는 양태에서, 면역 치료 조성물은 또한, 전형적으로 합성 펩타이드로서 제조된 하나 이상의 치료 관련 네오에피토프를 포함할 수 있다. 당업계에는 합성 펩타이드를 제조하는 다수의 방법이 있으며, 모든 공지된 방법이 본원에서의 사용에 적합한 것으로 여겨진다. 예를 들어, 암 네오에피토프 서열을 갖는 펩타이드는 고체 상(예를 들어, 메리필드(Merrifield) 합성을 사용하여), 액상 합성을 통해, 또는 보다 작은 펩타이드 단편으로부터 제조될 수 있다. 덜 바람직한 양태에서, (특히 다중 치료 관련 네오에피토프가, 임의적으로 네오에피토프들 또는 절단 부위들 사이에 스페이서가 있는 단일 펩타이드 사슬상에 존재하는 경우) 적합한 숙주에서 재조합 핵산을 발현시킴으로써 펩타이드를 생성시킬 수도 있다.
따라서, 치료 관련 네오에피토프 서열에 상응하거나 이를 포함하는 합성 펩타이드의 구조는 X-L1-(An-L2)m-Q일 수 있으며, 여기서 X는 합성 펩타이드를 고체상에 공유 결합 또는 비공유 결합시키는 데 적합한 임의적인 커플링 기 또는 잔기이고, L1은 합성 펩타이드를 고체상 또는 커플링 기에 공유 결합시키는 임의적인 링커이다. An은 네오에피토프 서열을 갖는 합성 펩타이드이고, 여기서 A는 자연 (단백질생성) 아미노산이고 n은 7 내지 30의 정수이고, 가장 전형적으로는 7 내지 11 또는 15 내지 25의 정수이다. L2는 특히 다수의 합성 펩타이드 서열(동일하거나 상이한)이 구조 내에 존재하는 경우에 존재할 수 있는 임의적인 링커이고, m은 정수, 전형적으로 1 내지 30, 가장 전형적으로 2 내지 15의 정수이다. 마지막으로, Q는 합성 펩타이드의 말단을 고체상(예를 들어, 펩타이드를 입체적으로 구속하기 위해) 또는 리포터 기(예를 들어, 형광 마커) 또는 다른 기능성 잔기(예를 들어 친화도 마커)에 커플링하는 데 사용될 수 있는 말단 기이다. 결과적으로, 합성 펩타이드가 직접적인 MHC-1 결합에 사용되는 경우, 전체 길이는 8 내지 10개의 아미노산이 됨에 주목해야 한다. 유사하게, 합성 펩타이드가 직접적인 MHC-II 결합에 사용되는 경우, 전체 길이는 14 내지 20개의 아미노산일 것이다. 한편, 합성 펩타이드가 MHC 제시 전에 세포에서 (전형적으로 프로테아좀 처리를 통해) 처리되는 경우, 전체 길이는 전형적으로 10 내지 40개의 아미노산일 것이며, 합성 펩타이드의 중심 위치 또는 그 근처에서 변화된 아미노를 갖는다.
예를 들어, X는 고체 상에 상응하는 결합제(예를 들어 아비딘)를 결합시키는 비공유 친화도 잔기(예를 들어 비오틴), 또는 펩타이드의 N- 또는 C-말단 아미노 또는 카복실 기와 반응하는 화학 기(스페이서를 갖거나 갖지 않음), 또는 펩타이드 또는 링커 L1에서 설프하이드릴 기와 반응하는 선택적 반응성 기(예를 들어 아이오도아세틸 또는 말레이미드 기)일 수 있다. L1은 합성 펩타이드의 고체상으로부터의 거리를 증가시키는 데 사용될 수 있고, 따라서 전형적으로 약 2 내지 20개의 탄소-탄소 결합과 등가의 길이(예를 들어, 0.3 nm 내지 3 nm)를 갖는 (예를 들어, 글리콜 기, 알콕시 기, 글리신 등을 포함하는) 가요성 선형 잔기를 포함할 것이다. 물론, 합성 펩타이드는 펩타이드가 생성된 고체상을 사용할 수 있으며 별도의 커플링 기 또는 링커가 필요하지 않음을 이해해야 한다.
특정 합성 펩타이드 및 커플링 방법에 따라, 고체상의 성질은 상당히 변할 수 있고, 펩타이드의 부착을 위한 모든 공지된 고체상이 본원에서의 사용에 적합한 것으로 간주해야 함을 이해해야 한다. 예를 들어, 적합한 고체상은 아가로스 비드, 폴리머 비드(착색되거나 그렇지 않으면 개별적으로 어드레싱가능한), 마이크로타이터 플레이트 내의 웰의 벽 표면, 종이, 니트로셀룰로오스, 유리 등을 포함한다. 당업자는 고체상 및 부착 화학물질의 적합한 선택을 용이하게 평가할 수 있을 것이다. 추가의 바람직한 양태에서, 고체상은 일반적으로 파지(phage)(또는 다른 스캐폴드 캐리어) 상에 제공된 펩타이드가 합성 펩타이드를 통해 고체상에 가역적으로 결합하도록 허용하는 것과 같은 파지 디스플레이 방법과 관련된 프로토콜에 적합하다는 점에 주목한다. 여전히 추가로 고려된 용도에서, 고체상은 또한 특히 합성 단백질이 포유동물에서 백신으로서 또는 항체 생산을 위한 비-인간 포유동물에서 면역원성 화합물로서 사용되는 경우에 백신 접종에 사용되는 캐리어 단백질(예를 들어, 알부민, KLH, 파상풍 톡소이드, 디프테리아 독소 등)일 수 있음을 인식해야 한다. 마찬가지로, 합성 단백질은 또한 임의의 캐리어 없이 백신 또는 면역원성 화합물로서 사용될 수도 있다.
동정된 치료 관련 네오에피토프(들)에 대한 합성 항체를 수득하기 위해, 인-실리코 동정된 물질이 합성 펩타이드를 생산하도록 시험관내에서 제조되는 것으로 고려된다. 또 다른 바람직한 방법에서, 합성 펩타이드(암 네오에피토프를 포함하거나 이에 상응하는 것)가 고체상에 고정되는 경우, 네오에피토프에 대한 친화제, 특히 항체가 분리 및/또는 정제될 수 있음을 인식해야 한다. 가장 바람직하게는, 이러한 단리는 예비-제작된 고-다양성 라이브러리의 항체를 포함할 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 문맥상 달리 지시되지 않는 한, 용어 "항체"는 항체(예를 들어, IgG, IgM, IgE 등)의 모든 동형(isotype) 및 하위-유형뿐만 아니라 1가 IgG, F(ab')2, Fab', Fab, scFv, scFv-Fc, VhH 등을 포함하는 이의 모든 단편을 포함한다. 또한, 고려되는 항체는 인간 또는 비인간(예를 들어, 설치류) 기원으로 인간화되거나 키메라일 수 있다. 전형적인 방법에서, 고-다양성 라이브러리는 전형적으로 M13 파지 및 pIII, pVIII, pVI 또는 plX를 통한 디스플레이, 또는 T7 파지 및 유전자 10 캡시드 단백질을 기준으로 적어도 109개의 다양한 구성원, 또는 적어도 1010개의 다양한 구성원, 또는 그 이상의 다양성을 갖는 파지 디스플레이 라이브러리일 수 있다. 쉽게 이해할 수 있는 바와 같이, 큰 다양성 라이브러리의 사용은 비교적 짧은 시간 내에 최상의 결합제에 대해 추가로 선택될 수 있는 몇 가지 결합 후보 항체를 제공할 것이다. 실제로, 고정화된 합성 펩타이드에 대한 결합 친화력이 원하는 것보다 적은 경우, 친화력은 당업계에 공지된 프로토콜을 사용하여 친화도 성숙을 통해 개선될 수 있음을 인식해야 한다. 예를 들어, 낮은 친화도(KD>10-7M) 결합제 또는 보다 작은 라이브러리의 구성원은 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 결합 친화도 및/또는 동역학을 개선시키기 위해 친화도 성숙을 수행할 수 있다(예를 들어 문헌[Briefings In Functional Genomics and Proteomics. Vol 1. No 2. 189-203. July 2002] 참조). 또한, 항체 라이브러리가 일반적으로 바람직한 반면에, 다른 스캐폴드가 또한 적절하다고 여겨지며 베타 배럴, 리보좀 디스플레이, 세포 표면 디스플레이 등이 포함되는 점에 주목한다(예를 들어 문헌[Protein Sci. 2006 Jan; 15(1): 14-27] 참조). 따라서, 바람직한 양태에서, 합성 펩타이드는 항체 라이브러리에서 미끼로 사용되어 고-친화도 결합(KD<10-7M, 보다 전형적으로 KD<10-8M) 항체를 동정한다는 것을 알아야 한다.
항체가 이들 항체를 코딩하는 핵산을 운반하는 세포에 직접 결합되기 때문에, 이러한 핵산을 분석하여 경쇄 및 중쇄에 대한 초가변 루프, CDR1, CDR2 및 CDR3, 및/또는 SDR(특이성 결정 잔기)을 코딩하는 서열 요소를 동정할 수 있음을 이해해야 한다. 가장 전형적으로, 결정은 표준 시퀀싱 방법을 사용하여 수행된다. 일단 결정되면, 초가변 루프, 또는 CDR1-H, CDR2-H 및/또는 CDR3-H 및/또는 CDR1-L, CDR2-L 및/또는 CDR3-L, 및/또는 SDR은 인간 또는 인간화된 항체 스캐폴드 또는 항체에 그래프팅되는 것으로 여겨진다. 쉽게 이해되는 바와 같이, 그래프팅은 인간 또는 인간화된 항체 스캐폴드 또는 항체를 코딩하는 핵산의 유전 공학에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 각 CDR 내에서, 항원과의 상호작용에 직접적으로 관여하는 보다 가변적인 위치, 즉 특이성-결정 잔기(SDR)가 존재하지만, CDR 루프의 형태를 유지하는 보다 보존된 잔기가 존재한다. SDR은 항원-항체 복합체의 3D 구조 및/또는 CDR의 돌연변이 분석으로부터 동정될 수 있다. SDR-그래프팅된 인간화된 항체는 CDR의 구조를 유지하는 SDR 및 잔기를 인간 주형에 그래프팅함으로써 구성된다. 결과적으로, 이전에 항원과 접촉하지 않은 세포에서 항체가 발현되는 완전히 합성된 방식으로 암 네오에피토프에 특이성을 갖는 인간 또는 인간화된 항체를 제조할 수 있음을 인식해야 한다. 또한, 고려되는 방법은 치료 관련 네오에피토프에 대한 항체를 생산하거나 효과적으로 사용하지 못한 환자의 치료를 위한 환자 및 암 특이적 항체의 생산을 허용한다.
본 발명의 대상을 제한하는 것은 아니지만, 이렇게 제조된 합성 항체는 직접적으로 IgG(또는 다른 동형), 단편(예를 들어, 이중 특이적 Fab 또는 다른 이중 특이적 단편) 및/또는 키메라 단백질(예를 들어, 키메라 T 세포 수용체에서의 외부 도메인으로서의 scFv)로서 단독으로 또는 치료제 또는 진단 약제와 함께, 및/또는 횡단막 도메인과의 하이브리드 단백질로서 사용되어 세포에 대한 항체의 막 고정을 보장할 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 이렇게 동정된 합성 항체가 치료제 또는 진단 약제(세포성 또는 비세포성 성분을 가질 수 있음)에 커플링되어 면역 치료 조성물을 수득하는 암 면역 치료를 위한 면역 치료 조성물을 생성하는 방법을 고찰한다.
면역 치료 조성물의 특정 유형에 관계 없이, 치료 관련 네오에피토프의 결정은 첫 번째 및/또는 연속 치료 후(수술, 면역 치료, 방사선, 화학 치료 등을 포함할 수 있음) 반복적으로 수행될 수 있음을 인식해야 한다. 가장 전형적으로, 새롭게 동정된 치료 관련 네오에피토프에 대해 상기 얻어진 정보는 추가 면역 치료(예를 들어 재조합 아데노바이러스 또는 합성 항체, 가능하게는 변형된 NK 세포와 함께, 모두 임의적으로는 체크포인트 억제제와 함께)에 사용될 수 있다. 또한, 면역 치료가 사용되는 경우, 통상적인 화학요법 치료가 면역 기능을 지지 또는 유지하기 위해 비교적 저량 투여될 수 있음이 일반적으로 고려된다. 예를 들어 화학요법은 저용량 방식(예를 들어 0.1% 내지 1%, 또는 1% 내지 5%, 또는 5% 내지 10%, 또는 10% 내지 20%, 또는 그 이상이지만 50% 미만, 또는 60% 미만, 또는 75% 미만의 통상적인(처방 정보 참조) 투여량)을 사용하여 수행될 수 있다.
면역요법 및/또는 화학요법(또는 다른 치료적 중재)을 포함하는 치료 주기의 지속 기간은 전형적으로 암의 유형 및 단계, 약물의 유형 및/또는 환자의 건강에 달려 있으며, 약물의 다중 투여 횟수는 수 시간 내지 수일 또는 심지어 수주씩 분리되어야 할 필요가 있음을 이해해야 한다. 따라서, 치료 사이클은 전형적으로 적어도 1일, 보다 전형적으로는 적어도 1주, 더욱 전형적으로는 적어도 4주, 가장 전형적으로는 적어도 6주 지속될 것이다. 다른 관점에서 볼 때, 치료 사이클의 지속 기간은 1주 내지 1개월, 1개월 내지 3개월, 또는 6주 내지 6개월, 또는 심지어 더 길 수 있다(예를 들어 완화시까지 또는 다른 진단 종료점까지). 치료 사이클이 끝나면, 통상적인 평가(예를 들어 방사선 사진, 혈액학적 검사 또는 기타 검사를 사용하여)가 전형적으로 수행되며, 전형적으로 첫 번째 또는 이전 회차와 동일한 위치 중 적어도 일부를 포함하는 적어도 하나의 새로운 생검 세트가 보완될 것이다. 물론, 필요에 따라, 새로운 위치를 샘플링할 수도 있다. 치료가 효과적이었고 원발성 종양 및/또는 전이가 검출 불가능하거나 생검에 적합하지 않은 경우, 순환형 종양 세포(CTC) 또는 미세소포 또는 엑소좀을 단리하고 추가의 오믹스 정보를 분석하여 치료 진행 및/또는 효능을 평가할 수 있는 것으로 생각된다. 예를 들어, 치료는 전이 및 CTC를 정지시키는 데 효과적일 수 있으나, 원발성 종양의 성장은 효과적이지 않을 수 있거나; 또는 치료는 원발성 종양에는 효과적일 수 있지만 모든 또는 일부 전이에는 효과적이지 않을 수 있다. 평가 및/또는 오믹스 정보의 결과에 따라, 면역요법 또는 화학요법이 그에 따라 적응될 수 있다. 예를 들어, 이전의 에피토프가 존재하는 곳에서 새로운 세트의 네오에피토프가 표적화될 수 있다. 오믹스 데이터의 변화는 암 세포 집단의 진화적 이동을 나타낼 수 있으며, 특정 세포 또는 에피토프 집단으로의 이동은 특정 치료법의 적합성을 나타낼 수 있거나 다른 치료 옵션을 배제할 수 있다.
예를 들어, 면역요법 및/또는 화학 요법의 새로운 회차가 초기 또는 이전 회차와 유사한 방식으로 수행되고, 결정된 제1 및/또는 제2 (및/또는 후속) 세트의 치료 관련 에피토프에 의해 통보될 것이다. 따라서 치료의 두 번째 회차는 전형적으로 치료 관련 네오에피토프와 관련하여 처음과는 다르지만, (예를 들어 다른 아데노바이러스, 다른 세트의 항체 또는 신바디를 사용하거나 다른 NK 세포(예컨대 네오에피토프에 대한 항체를 보유한 NK-92 변형된 세포 등)을 사용하는) 치료 유형에 따라 다를 수도 있다. 따라서, 후속 회차의 생검 및 추가의 변형된 또는 다르게는 적응된 면역요법 또는 화학요법이 암 성장을 감소 또는 유지시키거나 종양을 완전히 제거하는 것을 도울 것으로 예상된다. 대안적으로 또는 부가적으로, 네오에피토프에 대한 항체는 (고 친화도 Fc-세포 수용체를 나타내도록 추가로 변형될 수 있는) NK 세포, 특히 NK-92 세포를 사용하여 표적 개체로서 사용될 수 있다. 본 발명의 대상의 추가로 고려되는 양태에서, 항체 단편 또는 항체는 또한 T-세포, 특히 NK-세포에 결합되어 네오에피토프를 나타내는 세포에 대한 면역 반응을 자극하고 유도할 수 있다. 결과적으로, 암 네오에피토프에 대한 효과적인 면역 반응이 환자 또는 다른 유기체에서 면역화를 필요로 하지 않는 과정을 사용하여 유도됨으로써, 반응 시간과 치료용 항체의 이용가능성을 극적으로 감소시킬 수 있음을 인식해야 한다.
본원의 설명 및 하기의 청구범위를 통해 사용된 단수 형태는 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 대상을 포함한다. 또한, 본원의 설명에서 사용된 "안(in)"의 의미는 문맥상 달리 명시되지 않는 한 "안(in)"및 "위(on)"를 포함한다. 문맥상 상반되지 않는 한, 본원에 명시된 모든 범위는 종점을 포함하는 것으로 해석되어야 하며 개방형 범위는 상업적으로 실용적인 값을 포함하도록 해석되어야 한다. 유사하게, 문맥상 상반되지 않는 한, 모든 값의 목록은 중간 값을 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 또한, 본원에 기술된 모든 방법은 본원에서 달리 지시되지 않는 한 또는 다르게는 문맥상 명백하게 상충되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다.
본원의 특정 구현예와 관련하여 제공되는 임의의 및 모든 실시예 또는 예시적인 용어(예를 들어, "~와 같은")의 사용은 단지 본 발명을 보다 잘 나타내도록 의도된 것이며, 달리 청구된 본 발명의 범주를 제한하지 않는다. 명세서에서 어떠한 용어도 본 발명의 실시에 필수적인 청구되지 않은 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 발명의 개념을 벗어나지 않고 이미 기술된 것들 이외의 많은 수정이 가능하다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 대상은 첨부된 청구범위의 범주를 제외하고는 제한되지 않는다. 또한, 명세서 및 청구범위 모두를 해석함에 있어서, 모든 용어는 문맥에 따라 가능한 가장 넓은 방식으로 해석되어야 한다. 특히, 용어 "포함하는"은 요소, 성분 또는 단계를 비-배타적인 방식으로 참조하여, 그 참조된 요소, 성분 또는 단계가 명시적으로 언급되지 않은 다른 요소, 성분 또는 단계들과 함께 존재하거나 이용되거나 조합될 수 있음을 나타내는 것으로 해석되어야 한다. 명세서가 A, B, C ... 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택된 것 중 적어도 하나를 가리키는 경우, 본문은 A와 N, 또는 B와 N 등이 아닌, 군으로부터 단지 하나의 요소만을 필요로 하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (13)

  1. 치료 관련 네오에피토프를 선별하는 방법으로서,
    상기 방법은,
    환자의 제1 위치에서 종양 세포에 대한 오믹스(omics) 데이터를 수집하고 환
    자의 제2 위치에서 종양 세포에 대한 오믹스 데이터를 수집하는 단계;
    상기 오믹스 데이터를 사용하여 상기 제1 및 제2 위치의 종양 세포에서 각각
    의 네오에피토프(neoepitope)를 결정하는 단계;
    각각 결정된 각각의 네오에피토프의 그룹 속성(attribute), 위치 속성, 기능
    속성, 대사 속성 및 경로 속성 중 적어도 하나를 결정하는 단계; 및
    각각 결정된 각각의 네오에피토프의 그룹 속성, 위치 속성, 기능 속성, 대사
    속성 및 경로 속성 중 적어도 하나를 사용하여 상기 제1 및 제2 위치의 종양 세포에서, 상기 결정된 각각의 네오에피토프 중으로부터 치료 관련 네오에피토프를 동정하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 환자는 종양으로 진단된 환자인, 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 제1 위치는 원발성 종양이며, 상기 제2 위치는 국소 전이, 원거리 전이, 림프절 및 순환계로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 각각의 네오에피토프는 상기 환자의 매칭된(matched) 정상적인 오믹스 데이터에 대해 필터링함으로써 결정되는, 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 각각의 네오에피토프는 상기 환자의 HLA-유형에 대해 추가 필터링함으로써 결정되는, 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 그룹 속성은 고유한 네오에피토프, 공유된 네오에피토프, 배수성(ploidy) 상태 및 클론성(clonality) 상태로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 위치 속성은 원발성 종양 위치, 전이 위치 및 순환계로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 기능 속성은 운전자(driver) 돌연변이, 승객(passenger) 돌연변이 및 메틸화 상태로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 대사 속성은 약물 내성 및 증가된 해당작용으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 경로 속성은 성장 신호전달 경로의 돌연변이, 아폽토시스(apoptosis) 신호전달 경로의 돌연변이, 호르몬 신호전달 경로의 돌연변이 및 신호전달 경로 사용의 변화로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  7. 치료 관련 네오에피토프를 선별하는 방법으로서,
    상기 방법은,
    제1 및 제2 위치 중 적어도 하나에서 종양 세포에 대한 치료-전 네오에피토 프 서열 정보를 수집하는 단계;
    상기 제1 및 제2 위치 중 적어도 하나에서 종양 세포에 대한 치료-후 네오에 피토프 서열 정보를 수집하는 단계로서,
    여기서 각각의 상기 치료-전 및 치료-후 네오에피토프 서열 정보가 그룹 속 성, 위치 속성, 기능 속성, 대사 속성 및 경로 속성 중 적어도 하나를 갖는, 단계; 및
    각각의 상기 치료-전 및 치료-후 네오에피토프 서열 정보의 그룹 속성, 위치 속성, 기능 속성, 대사 속성 및 경로 속성 중 적어도 하나에 기초하여 업데이트된 치료 관련 네오에피토프를 동정하는 단계를 포함하는, 치료 관련 네오에피토프의 선별 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 제1 위치는 원발성 종양이며, 상기 제2 위치는 국소 전이, 원거리 전이, 림프절 및 순환계로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  9. 청구항 7에 있어서, 상기 치료-전 네오에피토프 서열 정보는 상기 제1 및 제2 위치의 종양 세포로부터의 것이며, 상기 치료-후 네오에피토프 서열 정보는 상기 제1 및 제2 위치의 종양 세포로부터의 것인, 방법.
  10. 청구항 7에 있어서, 상기 업데이트된 치료 관련 네오에피토프를 동정하는 단계는, 상기 치료-전 및 치료-후 네오에피토프 서열 정보의 그룹 속성, 위치 속성, 기능 속성, 대사 속성 및 경로 속성 중 적어도 하나에 기초한 것인, 방법.
  11. 청구항 7에 있어서, 상기 그룹 속성은 고유한 네오에피토프, 공유된 네오에피토프, 배수성 상태 및 클론성 상태로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 위치 속성은 원발성 종양 위치, 전이 위치 및 순환계로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 기능 속성은 운전자 돌연변이, 승객 돌연변이 및 메틸화 상태로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 대사 속성은 약물 내성 및 증가된 해당작용으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 경로 속성은 성장 신호전달 경로의 돌연변이, 아폽토시스 신호전달 경로의 돌연변이, 호르몬 신호전달 경로의 돌연변이 및 신호전달 경로 사용의 변화로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  12. 청구항 7에 있어서, 상기 치료-전 및 치료-후 네오에피토프 서열 정보는 HLA-매칭된 환자- 및 종양-특이적 네오에피토프 서열 정보인, 방법.
  13. 청구항 7 내지 12 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 치료 관련 네오에피토프를 선별하는 방법은, 암을 가진 환자에서 업데이트된 치료 관련 네오에피토프를 선별하기 위한 것인, 방법.
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