CN102302771A - 一种预防和治疗猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种预防和治疗猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗及其制备方法，所述多价灭活疫苗包含灭活的支气管败血波氏杆菌、多杀性巴氏杆菌A型和多杀性巴氏杆菌D型及PMT类毒素。本发明还提供了一种新的PMT培养和提取的方法，因此，本发明的猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗抗原保护全面，相对于传统的猪萎缩性鼻炎疫苗而言，可以更全面并且更加有效地治疗和预防猪萎缩性鼻炎。最后，本发明的多价疫苗中，各种抗原的配比合理的疫苗，可以解决各种抗原相互干扰的问题，进而提高免疫的效果。而且，发明人还提供了一种水型佐剂，可以解决传统的铝胶佐剂、弗氏佐剂、油包水型佐剂注射后吸收不完全，副反应大等缺点。

Description

一种预防和治疗猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗

技术领域

本发明涉及一种预防和治疗猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗，特别是指一种含多种抗原的猪萎缩性鼻炎的水性佐剂灭活疫苗。

背景技术

猪萎缩性鼻炎(atrophic rhinitis，AR)是猪群的一种重要的呼吸系统传染病，它会引起猪的慢性鼻炎、打喷嚏、流眼泪、颜部变性和鼻甲骨萎缩等症状，严重的还可以导致鼻吻变形并影响全身骨骼发育，从而导致猪生长迟缓，使猪容易感染继发性复合性肺炎，给养猪业造成巨大的损失。该病可感染任何年龄阶段的猪，其中4周龄以内的猪感染率最高，症状一般出现在8-12周龄。

猪萎缩性鼻炎可分为进行性猪萎缩性鼻炎(progressive atrophicrhinitis，PAR)和非进行性猪萎缩性鼻炎(nonprogressive atrophicrhinitis，NPAR)。进行性猪萎缩性鼻炎主要由产毒素多杀性巴氏杆菌(toxigenic Pasteurella multocida，Pm)引起，是猪萎缩性鼻炎的主要形式；非进行性猪萎缩性鼻炎，单纯由支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica，Bb)引起，由于其通常只引起轻微的鼻甲骨萎缩，往往观察不到鼻吻部的典型病变，而常常为人们所忽视。

产毒素多杀性巴氏杆菌(Pm)有荚膜D型和A型等。D型和A型Pm均可以分泌一种皮肤坏死毒素(Pasteurella multocida toxin，PMT)。由于D型Pm与A型Pm产生的PMT均相同，因此，现有的疫苗中常常仅含有D型Pm抗原，不含A型Pm。

PMT是约146KDa的类毒素(toxoid)，可直接引起猪鼻炎、鼻梁变形、鼻甲骨萎缩甚至消失，全身代谢障碍，生产性能下降，是猪萎缩性鼻炎最重要的致病因子。PMT在去离子水(DW)中，或在高于pH10或低于pH4的溶液中，都不稳定。因此，传统中用于预防猪萎缩性鼻炎的疫苗抗原是利用福尔马林(formaldehyde)灭活，以使PMT成为失去毒性但保有抗原性的类毒素(toxoid)。但是，生产PMT类毒素的步骤复杂，现有技术中是先于37℃下以血液培养基来培养多杀巴斯德氏菌产毒株Pm长达26小时，或是以脑心浸出物肉汤培养基(brain heart infusionbroth，BHI broth)培养72小时后，进行PMT的提取与浓缩，所收获的毒素于37℃下以1％福尔马林灭活4天后，才能得到低毒性但仍具抗原性的类毒素。因此，除了制备方式繁琐以外，将PMT灭活制备成疫苗中抗原成本很高，也限制了PMT在猪萎缩性鼻炎中的应用。

当前，我国所用的猪萎缩性鼻炎疫苗还主要是支气管败血波氏杆菌(Bb)灭活苗或支气管败血波氏杆菌(Bb)加有产毒素多杀性巴氏杆菌D型(Pm-D)的灭活苗，所使用的佐剂常常为铝胶佐剂、弗氏佐剂、油包水型佐剂，存在着保护性抗原成分少，不能提供完全的保护，注射后吸收不完全，副反应大等缺点。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种预防和治疗猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗，包含灭活的支气管败血波氏杆菌(Bb)，灭活的多杀性巴氏杆菌A型(Pm-A)，灭活的多杀性巴氏杆菌D型(Pm-D)和灭活的多杀性巴氏杆菌D型的类毒素(PMT)及兽药学上可接受的佐剂。

优选地，本发明的灭活的多杀性巴氏杆菌D型的类毒素为使用甲醛灭活获得的类毒素。

优选地，本发明的支气管败血波氏杆菌HN8株保藏号为CCTCC NO：M2011223，多杀性巴氏杆菌A型HN5株保藏号为CCTCC NO：M2011222，多杀性巴氏杆菌D型HB4株保藏号为CCTCC NO：M2011221。

优选地，本发明的支气管败血波氏杆菌含量为1×10⁹～5×10⁹CFU/ml。

优选地，本发明的多杀性巴氏杆菌A型含量为1×10⁹～5×10⁹CFU/ml。

优选地，本发明的多杀性巴氏杆菌D型含量为1×10⁹～5×10⁹CFU/ml。

优选地，本发明的多杀性巴氏杆菌D型的类毒素含量为1～5μg/ml。

优选地，本发明的兽药学上可接受的佐剂为水佐剂。

优选地，本发明的兽药学上可接受的佐剂为gel佐剂。

本发明的另一目的在于提供一种猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)将保存的支气管败血波氏杆菌HN8株菌种于固体平面活化，挑取单克隆于适宜培养基培养16-24h，之后于适宜培养基扩大培养16-24h，收获菌液，灭活；

(2)将保存的多杀性巴氏杆菌A型HN5株，多杀性巴氏杆菌D型菌HB4株种于固体平面活化，挑取单克隆于适宜培养基培养16-24h，之后于适宜培养基扩大培养16-24h，收获菌液，灭活；

(3)多杀性巴氏杆菌D型菌HB4株种于固体平面活化，挑取单克隆于适宜培养基培养16-24h，之后于适宜培养基扩大培养16-24h，收获菌液，离心收集菌体，超声破碎，提取多杀性巴氏杆菌D型(PMT)毒素，甲醛灭活制成PMT类毒素；

(4)将已灭活的支气管败血波氏杆菌、多杀性巴氏杆菌A型、多杀性巴氏杆菌D型和PMT类毒素按比例混合，加入水佐剂，乳化制成多价灭活疫苗。

优选地，本发明的猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗的制备方法，已灭活的支气管败血波氏杆菌的含量为1×10⁹～5×10⁹CFU/ml、多杀性巴氏杆菌A型的含量为1×10⁹～5×10⁹CFU/ml、多杀性巴氏杆菌D型的含量为1×10⁹～5×10⁹CFU/ml和PMT类毒素的含量为1～5μg/ml。

技术效果

由上可知，本发明的猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗有如下优点：

首先，本发明的猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗的抗原保护全面，相对于传统的猪萎缩性鼻炎疫苗而言，不仅有常见的灭活的多杀性巴氏杆菌D型(Pm-D)抗原和灭活的支气管败血波氏杆菌(Bb)抗原，还含有灭活的多杀性巴氏杆菌A型(Pm-A)抗原和PMT类毒素，因此本发明的猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗可以更全面并且更加有效地治疗和预防猪萎缩性鼻炎，特别是针对由多杀性巴氏杆菌A型或PMT直接引起的猪萎缩性鼻炎提供更加有效的疫苗，而在以往对猪萎缩性鼻炎中的防治中常常被人们所忽视。

其次，本发明提供了一种新的PMT培养和提取的方法，克服了以往灭活PMT类毒素需要使用福尔马林，而可能使该毒素的抗原性产生一些无法预估的化学结构性变化，进而影响到疫苗的效力的缺点。并且，本发明的培养PMT的工艺简便，具有生产时间短、效率高、生产成本低廉、无毒性、高安全性及高免疫保护效力特点，因此，本发明的猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗可以含有传统疫苗中没有的灭活的PMT类毒素的抗原。

最后，本发明的猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗经过发明人反复试验获得了一种各种抗原的配比合理的疫苗，可以解决各种抗原相互干扰的问题，进而提高免疫的效果。而且，发明人还提供了一种水型佐剂，可以解决传统的铝胶佐剂、弗氏佐剂、油包水型佐剂注射后吸收不完全，副反应大等缺点。

附图说明

图1为PCR鉴定结果图。

菌株保藏信息

本发明菌株为支气管败血波氏杆菌HN8株(Bordetellabronchiseptica HN8)保藏号为CCTCC NO：M2011223，多杀性巴氏杆菌A型HN5株(Pasteurella multocida A Type HN5)保藏号为CCTCC NO：M2011222、多杀性巴氏杆菌D型HB4株(Pasteurellamultocida D Type HB4)保藏号为CCTCC NO：M2011221。以上三个菌株于2011年6月28日在武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行了保藏。

具体实施方式

下面以具体实施例对本发明进行说明：

实施例1猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗的制备

1.本发明实施例的菌种的来源及鉴定

1.1菌种的来源

支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica，Bb)HN8株保藏号为CCTCC NO：M2011223，多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)A型HN5株保藏号为CCTCC NO：M2011222、多杀性巴氏杆菌D型HB4株保藏号为CCTCC NO：M2011221。以上三个菌株的菌株由普莱柯生物工程股份有限公司分离鉴定，上述菌株制备的疫苗免疫性好，特异性强，具有其他菌株不可替代的作用。

1.2菌种的鉴定

1.2.1生化鉴定

支气管败血波氏杆菌HN8株有溶血现象；过氧化氢酶、氧化酶、尿素酶、柠檬酸酶、氯化钠(6％、7.5％、9％)试验和石蕊牛乳试验均为阳性；阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、木糖试验和亚硝酸钾试验均为阴性。多杀性巴氏杆菌A型HN5株和多杀性巴氏杆菌D型HB4株氧化氢酶、氧化酶、尿素酶、吲垛、硫化氢试验和硝酸盐还原试验阳性，葡萄糖、半乳糖、蔗糖、山梨醇试验阳性；麦康凯培养基生长性、运动性、溶血性为阴性；MR、VP反应，明胶液化试验，乳糖、棉籽糖试验为阴性。

1.2.2PCR鉴定

将保存支气管败血波氏杆菌HN8株、多杀性巴氏杆菌A型HN5株、多杀性巴氏杆菌D型HB4株菌种划线于BHIAgar平板复苏，挑单菌落摇制菌液进行PCR鉴定，PCR引物共4对，为Bb，Pm，Pm-A，Pm-D，T⁺Pm，分别检测支气管败血波氏杆菌，多杀性巴氏杆菌，多杀性巴氏杆菌A型，多杀性巴氏杆菌D型，产毒素多杀性巴氏杆菌，Bb引物扩增基因为支气管败血波氏杆菌的flaA基因，PCR扩增片段为237bp。Pm引物扩增基因为多杀性巴氏杆菌的KMT1基因，PCR扩增片段为457bp。Pm-A引物扩增基因为多杀性巴氏杆菌A型的hyaD-hyaC基因，PCR扩增片段为1044bp。Pm-D引物扩增基因为多杀性巴氏杆菌D型的dcbF基因，PCR扩增片段为657bp。T⁺Pm引物扩增基因为toxA基因，PCR扩增片段为864bp。PCR鉴定结果见附图1，其中，

泳道1为Mark。

泳道2和3为支气管败血波氏杆菌HN8株，目的条带(237bp)为支气管败血波氏杆菌鉴定基因fla。

泳道4为ddH₂O。

泳道5为多杀性巴氏杆菌A型HN5株，泳道6为多杀性巴氏杆菌D型HB4株，目的条带(457bp)为多杀性巴氏杆菌种特异性基因KMT。

泳道7为ddH₂O。

泳道8和9为多杀性巴氏杆菌A型HN5株，目的条带(1044bp)为多杀性巴氏杆菌A型鉴定基因hyaD-hyaC。

泳道10为ddH₂O。

泳道11和12为多杀性巴氏杆菌D型HB4株，目的条带(657bp)为多杀性巴氏杆菌D型鉴定基因dcbF。

泳道13为ddH₂O。

泳道14和15为多杀性巴氏杆菌D型HB4株，目的条带(864bp)为产毒素多杀性巴氏杆菌鉴定基因ToxA。

2.猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗的配制

2.1菌毒液的制备

2.1.1支气管败血波氏杆菌菌液的制备

将支气管败血波氏杆菌HN8株划线于改良鲍姜氏血平板，与37℃培养48h，挑取溶血环明显的单克隆于含5ml BHI的试管中，于150-220rpm，37℃振荡培养16-24h，之后将菌液以1％的接种量于37℃扩大培养12-16h，转速150-220rpm。取样作系列十倍稀释，涂平板计数。

2.1.2巴氏杆菌A型，巴氏杆菌D型菌液的制备

将巴氏杆菌A型HN5株，巴氏杆菌D型HB4株的菌种划线于TSA平板，与37℃培养16-20h，挑取单克隆于含5mlBHI的试管中，于150-220rpm，37℃振荡培养16-24h，之后将菌液以1％的接种量于37℃扩大培养12-16h，转速150-220rpm。取样作系列十倍稀释，涂平板计数。

2.1.4菌液的灭活

取支气管败血波氏杆菌HN8株、巴氏杆菌A型HN5株和巴氏杆菌D型HB4株菌液，加入甲醛，使甲醛的最终浓度为0.2％-0.4％体积，37℃灭活24-48h，其间不断摇动。灭活后取样涂布于BHI平板，37℃培养16-24h，无菌落生长。

2.1.5菌液的浓缩

将灭活后的菌液离心浓缩，弃上清，用PBS悬浮稀释菌体，使细菌含量相当于灭活前活菌数为1×10¹¹CFU/mL。

2.2多杀性巴氏杆菌D型(PMT)类毒素的提取于灭活

2.2.1将离心收集的巴氏杆菌D型HB4株菌体用灭菌双蒸水重悬，使细菌浓度达到10¹²CFU/mL。将重悬菌液置冰浴中经超声波破碎后，10000r/min离心30min，上清用0.22pm滤膜过滤，滤液为粗制PMT类毒素。用TE(10mmol/L Tris-HCl pH 7.4，1mmol/LEDTA)平衡DEAE-52柱，以含0～0.5mol/L NaCI的TE线性梯度洗脱，流速30mL/h。收集各峰，取50μL进行SDS-PAGE分析。将DEAE-52分离到的样品用蔗糖浓缩后上Sephadex G-200柱，用TE以6mL/h流速洗脱，分段收集各峰，进行SDS-PAGE分析。收集的PMT蛋白用超滤管浓缩，并用考马斯亮蓝法测定PMT蛋白浓度。将浓缩的蛋白加入甲醛，使甲醛的最终浓度为0.2％-0.4％体积，37℃灭活24-48h，其间不断摇动。PMT类毒素灭活后取0.1ml于豚鼠背部皮肤注射，无皮肤坏死。

(3)疫苗配制

取灭活后的支气管败血波氏杆菌HN8株、巴氏杆菌A型HN5株、巴氏杆菌D型HB4株菌液和PMT类毒素缓缓加入到一定量的Gel佐剂(法国赛比克公司)中，加的过程中不断用玻璃棒搅拌，最后加入柳硫汞钠，使最终浓度为0.01％体积，混匀、检验、分装，即为猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗，其中疫苗中菌体含灭活前支气管败血波氏杆菌HN8株、巴氏杆菌A型HN5株和巴氏杆菌D型HB4株含量为1×10⁹CFU/mL-5×10⁹CFU/mL，PMT类毒素含量为1-5μg/ml。

实施例2猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗的制备2

菌种及菌种的灭活，PMT类毒素的提取和灭活同实施例1。

实施例2的各个抗原的比例参见下表1。

实施例3猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗的制备3

菌种及菌种的灭活，PMT类毒素的提取和灭活同实施例1。

实施例3的各个抗原的比例参见下表1。

实施例1-3的疫苗的具体配比如表1：

表1猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗的成分配比

实施例4猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗的检验

根据实施例1的方法配制三批疫苗，批号分别为1104、1105和1106。

1.疫苗的检验

1.1无菌检验按“兽用生物制品规程”(2000版)附录50页的方法对三批疫苗进行无菌检验。

1.2安全试验

1.2.1小白鼠安全试验

选取3周龄BALB/c小鼠10只，分成两组，每组5只，一组各皮下注射本灭活苗0.5ml，另一组则于大腿肌肉注射0.1ml，观察10日，无任何反应，无死亡。

1.2.2豚鼠安全试验

选取体重为350g左右的豚鼠2只，各于背部皮内注射0.1ml，观察10日，无任何反应，无死亡。

1.2.3猪安全试验

选取30日龄以内的无支气管败血波氏杆菌及多杀性巴氏杆菌抗体的仔猪3头，随机取两只按免疫剂量(2ml)的双倍剂量(即每头4ml)颈部肌肉注射，其余一头为对照，观察三周，无任何反应，无死亡。

1.3效力检验

选择波氏杆菌抗体、抗多杀性巴氏杆菌PMT毒素抗体阴性，PCR检测Bb，Pm阴性的3周龄断奶仔猪30头，分为两组，免疫组15头，对照15头。3周龄仔猪进行第一次免疫，间隔2周，在仔猪第5周龄进行加强免疫，间隔2周，在7周龄进行攻毒，免疫仔猪组和对照组各再分成三组，每组5头，分别采取Bb/Pm(Pm-A或Pm-D)联合攻毒或PMT攻毒法，攻毒后观察30～45天后，处理免疫猪和对照猪，观察仔猪鼻甲骨萎缩情况。免疫仔猪为5头免疫猪至少4头以上获得保护，对照仔猪为5头攻毒猪至少4头以上发病。发病标准为：发病猪出现精神不振、呆滞、食欲下降，感染后期出现鼻子搔痒、打喷嚏、眼部出现泪斑，攻毒后30-45天剖杀所有猪，观察鼻甲骨病变，可见鼻甲骨卷曲出现不同程度的萎缩。

2实验室检验结果

2.1无菌检验：按“兽用生物制品规程”(2000版)附录50页方法对3批疫苗进行无菌检验，结果均无菌生长，如表2。

表2疫苗的无菌检验结果

批次	T.G培养	G.A培养	G.P培养	判定
					1104	-	-	-	无菌生长
1105	-	-	-	无菌生长
					1106	-	-	-	无菌生长

2.2安全试验结果

2.2.1小白鼠安全试验

分别对3周龄BALB/c小鼠皮下注射本灭活苗0.5ml和大腿肌肉注射本灭活苗0.1ml，注射后观察10日，小鼠精神状态良好，无不良反应，无死亡情况。

2.2.2豚鼠安全试验

对350g左右的豚鼠于背部皮内注射本灭活苗0.1ml，注射后观察10日，未见有不良反应，豚鼠进食正常，神状态良好，无死亡情况。

2.2.3猪安全试验

对30日龄以内仔猪双倍剂量注射本灭活苗，注射后观察三周，未见有不良反应，仔猪吃喝正常，神状态良好，无死亡情况。三周后剖杀，所有脏器未见异常变化。

综合以上安全试验证明疫苗安全。

2.3效力检验结果

对3周龄仔猪进行第一次免疫，间隔2周，在仔猪第5周龄进行加强免疫，间隔2周，在7周龄进行攻毒，进行了Bb/Pm-A、Bb/Pm-D联合攻毒以及PMT毒素的攻毒，攻毒后观察30～45天后，处理免疫猪和对照猪，观察仔猪鼻甲骨萎缩情况。免疫效果见表3、表4和表5。

表3疫苗效力检验结果(Bb/Pm-A攻毒)

注：攻毒剂量：Bb：1×10¹¹CFU，Pm-A：1×10¹⁰CFU，攻毒方式：气管注射。攻毒菌株来源：发病猪场分离强毒株。

表4疫苗效力检验结果(Bb/Pm-D攻毒)

注：攻毒剂量：Bb：1×10¹¹CFU，Pm-D：1×10¹⁰CFU，攻毒方式：气管注射。攻毒菌株来源：发病猪场分离强毒株。

由表3、表4和表5数据结果可表明本发明疫苗能够对免疫仔猪提供强有力的保护，能够抵抗Bb、Pm-A和Pm-D强毒以及PMT的攻击。

3.猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗与其他组分疫苗对比试验

A疫苗：含有灭活的支气管败血波氏杆菌，抗原含量为灭活前活菌数为5×10⁹CFU/头份，佐剂为白油。

B疫苗：含有灭活的支气管败血波氏杆菌多和杀性巴氏杆菌D型，每头份(2ml)抗原含量为：含支气管败血波氏杆菌灭活前活菌数为5×10⁹CFU，含杀性巴氏杆菌D型灭活前活菌数为2×10⁹CFU，佐剂为氢氧化铝胶。

C疫苗：抗原含量于本实施例1相同，佐剂为白油。

将A疫苗、B疫苗、C疫苗和本发明猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗(批号1104)分别对3周龄仔猪进行第一次免疫，间隔2周，在仔猪第5周龄进行加强免疫，间隔2周，免疫后观察仔猪的不良反应。在7周龄进行攻毒，采取Bb/Pm-A(Bb/Pm-D)联合攻毒的方法，攻毒后观察30～45天后，处理免疫猪和对照猪，解剖观察注射部位反应，仔猪鼻甲骨萎缩情况。免疫后仔猪不良反应见表6，免疫效果见表7和表8。

表6不同疫苗的免疫副反应

表6的对比结果可知本疫苗所用法国赛比克公司的Gel水佐剂，具有吸收好，不良副反应低等优点。

表7不同疫苗的免疫保护效果(Bb/Pm-A攻毒)

注：攻毒剂量：Bb：1×10¹¹CFU，Pm-A：1×10¹⁰CFU，攻毒方式：气管注射。攻毒菌株来源：发病猪场分离强毒株。

表8不同疫苗的免疫保护效果(Bb/Pm-D攻毒)

注：攻毒剂量：Bb：1×10¹¹CFU，Pm-D：1×10¹⁰CFU，攻毒方式：气管注射。攻毒菌株来源：发病猪场分离强毒株。

由表7和表8数据结果表明本发明的疫苗具有保护率高，能够抵抗支气管败血波氏杆菌、多杀性巴氏杆菌A型和多杀性巴氏杆菌D型的攻击。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种预防和治疗猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗，其特征在于，包含灭活的支气管败血波氏杆菌，灭活的多杀性巴氏杆菌A型，灭活的多杀性巴氏杆菌D型和灭活的多杀性巴氏杆菌D型的类毒素及兽药学上可接受的佐剂。

2.根据权利要求1所述的猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗，其特征在于，灭活的多杀性巴氏杆菌D型的类毒素为使用甲醛灭活获得的类毒素。

3.根据权利要求1所述的猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗，其特征在于，所述的支气管败血波氏杆菌HN8株的保藏号为CCTCCNO：M2011223，所述的多杀性巴氏杆菌A型HN5株的保藏号为CCTCC NO：M2011222，所述的多杀性巴氏杆菌D型HB4株保藏号为CCTCC NO：M2011221。

4.根据权利要求1所述的猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗，其特征在于，所述的支气管败血波氏杆菌含量为1×10⁹～5×10⁹CFU/ml。

5.根据权利要求1所述的猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗，其特征在于，所述的多杀性巴氏杆菌A型含量为1×10⁹～5×10⁹CFU/ml。

6.根据权利要求1所述的猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗，其特征在于，所述的多杀性巴氏杆菌D型含量为1×10⁹～5×10⁹CFU/ml。

7.根据权利要求1所述的猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗，其特征在于，所述的多杀性巴氏杆菌D型的类毒素含量为1～5μg/ml。

8.根据权利要求1所述的猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗，其特征在于，所述的兽药学上可接受的佐剂为水佐剂。

9.根据权利要求8所述的猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗，其特征在于，所述的兽药学上可接受的佐剂为gel佐剂。

10.一种猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将保存的支气管败血波氏杆菌HN8株菌种于固体平面活化，挑取单克隆于适宜培养基培养16-24h，之后于适宜培养基扩大培养16-24h，收获菌液，灭活；

(2)将保存的多杀性巴氏杆菌A型HN5株，多杀性巴氏杆菌D型HB4株菌种于固体平面活化，挑取单克隆于适宜培养基培养16-24h，之后于适宜培养基扩大培养16-24h，收获菌液，灭活；

(3)多杀性巴氏杆菌D型HB4株菌种于固体平面活化，挑取单克隆于适宜培养基培养16-24h，之后于适宜培养基扩大培养16-24h，收获菌液，离心收集菌体，超声破碎，提取多杀性巴氏杆菌D型(PMT)毒素，甲醛灭活制成PMT类毒素；

(4)将已灭活的支气管败血波氏杆菌、多杀性巴氏杆菌A型、多杀性巴氏杆菌D型和PMT类毒素按比例混合，加入水佐剂，乳化制成多价灭活疫苗。

11.根据权利要求10所述的猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，

所述已灭活的支气管败血波氏杆菌的含量为1×10⁹～5×10⁹CFU/ml、多杀性巴氏杆菌A型的含量为1×10⁹～5×10⁹CFU/ml、多杀性巴氏杆菌D型的含量为1×10⁹～5×10⁹CFU/ml和PMT类毒素的含量为1～5μg/ml。

Images