CN101575586A - 一种支气管败血波氏杆菌基因缺失疫苗及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物基因工程疫苗制备技术领域。具体涉及一种支气管败血波氏杆菌aroA(5－烯醇丙酮酰莽草酸－3－磷酸合成酶)基因缺失菌株的构建，基因缺失疫苗的制备与应用。所述支气管败血波氏杆菌支气管败血波氏杆基因缺失菌株(Bordetella bronchiseptica)QH0814ΔaroA，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCCNO：M208018，该菌株的缺失了5－烯醇丙酮酰莽草酸－3－磷酸合成酶(aroA)基因全长1340bp，导致该菌株对芳香族氨基酸的代谢出现障碍。本发明利用该基因缺失菌株制备了支气管败血波氏杆菌基因缺失疫苗。本发明还公开了所述基因缺失菌株在制备支气管败血波氏杆菌基因缺失疫苗(弱毒活疫苗)的应用。

Description

一种支气管败血波氏杆菌基因缺失疫苗及应用

技术领域

本发明属于动物细菌基因工程技术领域，具体涉及一种支气管败血波氏杆菌5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶基因(aroA)缺失菌株、基因缺失疫苗及应用。

背景技术

猪萎缩性鼻炎(Atroptic Rhinitis，AR)是由支气管败血波氏杆菌(Bordetella Bronchiseptica，Bb)和产毒素多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，Pm)共同作用引起的一种猪呼吸道传染性疾病，该病给世界养猪业造成了严重的经济损失，世界动物卫生组织OIE]和我国将其列为B类或乙类动物疫病。猪萎缩性鼻炎在临床上以出现鼻炎、鼻甲骨萎缩和生长性能下降为特征。研究表明，支气管败血波氏杆菌是引起猪萎缩性鼻炎的原发性病原菌，单独的Bb常常造成隐性感染，发病猪生长缓慢，育肥延迟，极大地降低了生产效率。更为严重的是，Bb感染猪后，可入侵并滞留在肺泡巨嗜细胞内并对巨嗜细胞产生细胞毒性作用，在感染后7小时内就可使其活性丧失90％以上，这样就为其他病原菌入侵提供了条件，导致更为严重的进行性萎缩性鼻炎或者复杂的呼吸道感染。

支气管败血波氏杆菌除了导致猪萎缩性鼻炎外，该菌还能广泛地感染多种哺乳动物，如兔，狗和灵长类动物，具有一定的公共卫生意义。虽然在多数情况下Bb的感染仅限于上呼吸道，而且处于隐形感染状态，故Bb的感染常常被忽视。但是Bb能够抑制呼吸道的局部免疫，并造成呼吸道屏障功能的破坏，为其他病原的入侵提供了机会。近年的流行病学调查发现Bb能够感染某些特定人群，如老人，免疫缺陷者，产生类似于百日咳杆菌(该菌也属于波氏杆菌属)引起的百日咳症状。所以人们对Bb的预防控制日益重视。

预防Bb感染最有效的方法是免疫接种。支气管败血波氏杆菌全细胞灭活疫苗获准在各国应用已有30多年了，通过免疫母猪经初乳提供的保护显然已降低了这一细菌对养殖生产的经济影响。然而，现有的灭活疫苗不足以抵御Bb在呼吸道，尤其是上呼吸道的定殖。因为通过肌肉免疫的灭活疫苗虽然能够激起很好的体液免疫，产生高滴度的抗体，但是IgG类型的抗体不能到达肺泡表面和上呼吸道，导致定殖在呼吸道的波氏杆菌不能有效的被清除。而Bb在鼻腔和呼吸道的长期定殖将导致萎缩性鼻炎和慢性肺炎等疾病，并增加其他疾病继发感染的风险。正是由于现有的猪萎缩性鼻炎疫苗的这种缺陷，世界各国学者都致力于猪萎缩性鼻炎基因工程疫苗的研究，力求获得一种更安全、高效的新型疫苗。

细菌弱毒疫苗是现代疫苗的发展方向之一。使用安全性高、致弱的活细菌作为疫苗有很多优点：首先它能直接进入猪的呼吸系统，激发机体产生有效的黏膜免疫、体液免疫和细胞免疫；二是它可以通过滴鼻或鼻腔喷雾等方式接种，操作简便易行；三是免疫原性好，一次免疫就能产生很好保护水平；四是该弱毒菌株能够对异源的支气管败血波氏杆菌产生保护；五是生产方便，快速，经济，适合大面积推广；F.它可以携带较大的基因片断，易于构建多价基因工程疫苗，达到一种疫苗预防两种或者多种疾病的目的。目前国内外使用的使细菌致弱的方法主要有：缺失细菌的主要毒力基因，或者缺失细菌与营养代谢有关的基因。相对于通过缺失毒力基因至弱的方法，缺失营养代谢基因有以下几个好处：i)缺失了营养代谢基因的弱毒菌株在动物体内只能有限繁殖，水平传播能力极度下降，这样确保了弱毒疫苗的安全性；ii)缺失毒力基因会导致免疫原性下降，而缺失营养基因往往不影响毒力基因的表达。

目前国外已有学者开始对支气管败血波氏杆菌作为弱毒活疫苗进行研究，但迄今为止还没有一个较为成熟的产品问世。本发明考虑到芳香族生物合成途径是革兰氏阴性菌和阳性菌共有的途径，aroA编码5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶，该酶催化芳香族氨基酸的合成，而哺乳动物不具备该合成途径，故细菌从宿主体内获得这些化合物的可能性极小，使得aroA缺失株的体外培养存在营养缺陷，在宿主体内只能有限繁殖，从而使毒力减弱，但其仍保留良好的免疫保护性。因此，我们首先克隆aroA及其上、下游基因，构建重组自杀性质粒，利用氯霉素抗性和PCR进行aroA基因缺失株的筛选，并对其遗传稳定性、毒力、对猪的致病性和免疫原性进行研究。该疫苗菌株不携带任何外源基因、抗生素抗性基因或者基因转移原件，所以菌株对动物、环境和人均是安全的，且具有很好的免疫效果。以自行构建的基因工程菌株研制具有我国知识产权的基因工程弱毒疫苗并应用于生产，将是我国应对当今农业所面临的挑战，提高竞争力的措施之一。

发明内容

本发明的目的在于获得一株支气管败血波氏杆菌基因缺失菌株；

本发明的第二个目的是利用该支气管败血波氏杆菌基因缺失菌株制备猪支气管败血波氏杆菌基因缺失疫苗；

本发明的第三个目的是支气管败血波氏杆菌基因缺失菌株在制备支气管败血波氏杆菌基因缺失疫苗中的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

利用基因工程技术先将支气管败血波氏杆菌野生菌株HH0809(该菌株是猪源支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica)HH0809，于2007年9月18日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：M207148；参见申请人在前的发明专利申请“一种表达猪源支气管败血波氏杆菌fhaB和prn基因片段的重组猪霍乱沙门氏菌株、疫苗及应用”，专利申请号号200710053386.2，公开号：CN101157907)的一个主要芳香烃氨基酸代谢基因aroA完全缺失后，使整个芳香基团的生化代谢途径被阻断。将aroA基因的上游和下游各800bp的序列通过分子克隆技术克隆至克隆载体上，通过酶切位点拼接在一起，构成重组所必需的上下游同源臂。将连接在一起的上下游同源臂片段转移至自杀性载体pRE112，(徐引弟，郭爱珍，陈焕春.猪霍乱沙门氏菌C500株crp-/gfp+缺失株的构建及鉴定，农业生物技术学报，2008，16(2)：196-201)上。然后将重组有上下游同源臂自杀性载体通过结合转移至支气管败血波氏杆菌野生菌株HH0809中，通过自杀性载体pRE112上的氯霉素抗性基因和针对aroA基因的PCR方法来筛选同源臂和同源基因的第一次同源重组(单交换)。筛选所得单交换克隆通过对氯霉素抗性的消除和PCR验证来筛选aroA缺失的双交换菌株(QH0814ΔaroA)。申请人将筛选所得aroA基因缺失菌株命名为支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica)QH0814ΔaroA。该基因缺失菌株于2008年1月24日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：M208018。本发明制备的一种支气管败血波氏杆菌基因缺失株氨基酸代谢基因aroA被缺失，导致其毒力大大降低，并且在环境中只能有限存在，因而具有很高的安全性。而且由于营养基因缺失菌株仍然能表达所有的毒力基因，因此具有很好的免疫原性。

本发明的主要优点是：

1、本发明所用的材料为支气管败血波氏杆菌野生致病菌株HH0809，具有全部的毒力因子和其他免疫原性良好的抗原。因此，用该致病菌株进一步构建的aroA基因缺失菌株QH0814ΔaroA研制成的弱毒疫苗对猪免疫具有很强的针对性，有广阔的市场应用前景。

2、本发明支气管败血波氏杆菌因缺失菌株不含抗性标记的疫苗菌株，完全符合在我们国家疫苗生物安全性要求。

3、支气管败血波氏杆菌芳香烃氨基酸代谢途径中的重要基因aroA完全缺失后，获得的aroA缺失株毒力大大降低而其免疫原性未发生改变，可以保护多种异源野毒菌株攻击。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明构建支气管败血波氏杆菌aroA缺失株所用的下游同源臂的序列

序列表SEQ ID NO：2是本发明的来源菌株支气管败血波氏杆菌野生菌HH0809中缺失的aroA基因序列。

序列表SEQ ID NO：3是本发明构建aroA缺失株所用的上游同源臂的序列。

图1：是本发明中用于构建支气管败血波氏杆菌aroA基因缺失株的转移质粒pREΔaroA的物理图谱。

图2：是本发明中转移质粒的鉴定：其中

图2A：是转移质粒pREΔaroA的酶切鉴定结果，图中M(left)：DNA Marker(DL15000)M(right)：DNA Ladder(DL2000)1-3：pREΔaroA/KpnI+SacI。

图2B：是转移质粒的PCR鉴定，M：DNA Ladder(DL2000)1：ddH2O control 2-4：PCR product ofpREΔaroA。

图3：是本发明制备的pREΔaroA转移质粒构建的流程图。

图4：本发明所使用的基因同源重组原理示意图

图5：是本发明中的转移质粒整合至基因组的PCR鉴定；图中M：DNA Ladder(DL 2,000)；1：ddH₂Ocontrol.2：parent strain HH08093：ΔaroA mutant conjugants 4：plasmid pREΔaroA。

图6：是本发明中的支气管败血波氏杆菌aroA基因缺失株的PCR筛选，图中M：DNALadder(DL 15000)；

1：ddH₂O control；

2：parent strain HH08093、4：ΔaroA mutants

图7：是本发明中的支气管败血波氏杆菌aroA基因缺失株QH0814ΔaroA的遗传稳定鉴定；图中M(left)：DNA Ladder(DL 15000)；M(right)：DNA Ladder(DL 2000)；1：ddH₂O control；2：parent strainHH0809；3：ΔaroA mutant conjugants；4-8：five generations ofΔaroA mutant

图8：本发明构建的支气管败血波氏杆菌基因缺失株QH0814ΔaroA的生长曲线

具体实施方式

以下结合说明书附图和实施例对本发明作进一步的说明，但不是限制本发明。

实施例1

1、aroA引物设计和PCR扩增

根据已报道的支气管败血波氏杆菌RB50株全基因组序列(参照GenBank登录号为AF315119的基因序列)设计两对引物(所有引物由上海生工生物工程技术有限公司合成)分别扩aroA基因的上游同源臂(SEQNO.3)和下游同源臂(SEQ NO.1)，扩增片段大小分别为863bp和900bp，上游臂两端分别设计KpnI和BamHI酶切位点，下游臂两端分别设计BamHI和SacI酶切位点。所述引物序列如下：

C1：5`-TGCGGTACCTAGGTTGGAATCCATTTGGC-3`(Kpn I)

C2：5`-TAAGGATCCCCATGGCTATTTCCGCATCC-3`(BamH I)

引物C1和C2扩增上游同源臂863bp

T1：5`-TGTGGATCCTGGAATCCTTGCGCCAATTG-3`(BamH I)

T2：5`-TAAGAGCTCTCCGGCGCTGCCATATTGTT-3`(Sac I)

引物T1和T2下游同源臂900bp

2.支气管败血波氏杆菌aroA基因上游同源臂和下游同源臂的克隆

将改良的TSA(即胰蛋白大豆琼脂培养基，购自美国BD公司，以该培养基为基本成分，添加体积为10％的小牛血清)融化，冷却至50℃，倒于培养皿中，待冷却凝固后，置37℃温箱内培养2-3h至水汽烘干。将冻干的HH0809(参见本说明书前面的《发明内容》部分所述的菌株来源的描述)接至烘干培养皿中过夜培养。第二天挑取单菌落接种于改良TSB(即胰蛋白大豆培养基，购自美国BD公司，以该培养基为基本成分，添加体积为10％的小牛血清)培养基中，37℃200r/min培养7-10h提取细菌的基因组。

取1mL支气管败血波氏杆菌菌液离心，用200μL灭菌水重悬，加入200μL 2×Kawasaki Buffer(10mLBuffer中包含400μL 1MTris-HCl(pH8.3)，15μL 2M MgCl₂，125μL 4M KCl，100μL Tween-20)和1μL浓度为20mg/mL的蛋白酶K，56℃水浴过夜(超过8h)，次日95℃水浴15min以灭活蛋白酶K，冰上冷却10min，12000rpm离心10min，上清是支气管败血波氏杆菌基因组DNA，即为PCR模板。短期保存置于4℃，长期保存分装放于-20℃。

扩增反应在50μL的体系中进行，反应体系如下：模板DNA 5μL，10×PCR缓冲液(该缓冲液购自武汉晶美生物工程有限公司)5μL，25mmol/LMgCl₂ 2.5μL，10μmol/L P1 1μL，10μmol/LP2 1μL，2mmol/LdNTPs2μL，TaqE 1μL，ddH₂O 32.4μL。

扩增条件为：95℃变性5min后进入循环，循环参数为94℃1min，57℃1min，72℃，1min。35个循环后，72℃延伸10min。扩增的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳分析，扩增2个片段大小分别为863bp和900bp，与预期大小相当。将得到的目的基因克隆到pMD-18T载体(购自宝生物工程(大连)有限公司)，将重组质粒送宝生物工程(大连)有限公司进行外源基因序列的测定。

3.pREΔaroA转移质粒的构建

用KpnI和BamHI(购自宝生物工程(大连)有限公司)酶切大小为863bp的aroA上游同源臂PCR扩增产物，同时用相同的限制性内切酶酶切质粒pBluscriptSK(购自宝生物工程(大连)有限公司)。将酶切的aroA上游同源臂和质粒片段用T4DNA ligase(购自宝生物工程(大连)有限公司)连接(重组质粒命名为pSKaroA1)，16℃水浴过夜，转化DH5α感受态细菌，37℃培养，挑菌，然后将转化子转接扩大培养，将培养获得菌液用于小量制备质粒。用BamHI和SacI酶切大小为900bp的aroA下游同源臂PCR扩增产物，同时用相同的限制性内切酶酶切质粒pSKaroA1。将酶切的下游同源臂和质粒片段用T4 DNA ligase连接(重组质粒命名为pSKΔaroA)，16℃水浴过夜，转化DH5α感受态细菌，37℃培养，挑菌，然后将转化子转接扩大培养，将培养获得菌液用于小量制备质粒。同时分别用KpnI和SacI酶切载体pRE112和重组质粒pSKΔaroA。回收酶切过的上下游同源臂基因和载体pRE112(参见：徐引弟，郭爱珍，陈焕春.猪霍乱沙门氏菌C500株crp-/gfp+缺失株的构建及鉴定，农业生物技术学报，2008，16(2)：196-201)，然后用T4DNA ligase连接，16℃水浴过夜，转化DH5α感受态细菌，37℃培养，挑菌，然后将转化子转接扩大培养，将培养获得菌液用于小量制备质粒和KpnI和SacI双酶切鉴定。重组转移质粒pREΔaroA的物理图谱见图1。鉴定结果证实构建的转移质粒pREΔaroA是正确的(见图2)，转移质粒pREΔaroA构建流程如图3所示。

4.本发明的支气管败血波氏杆菌aroA基因缺失菌株的构建与鉴定

将本发明构建的重组质粒pREΔaroA转化至供体菌大肠杆菌X7213(该大肠杆菌菌株购自宝生物工程(大连)有限公司)以转化了重组质粒pREΔaroA的大肠杆菌X7213为供体，支气管败血波氏杆菌HH0809为受体进行接合转移。供体菌和受体菌分别在适合的琼脂平皿上培养过夜，然后用TSB洗两遍，调整菌浓度至OD600为0.8。各取100μL菌悬液混合，将无菌硝酸纤维滤膜贴于含2’6-二氨基庚二酸(DAP，购自Sigma公司)的TSA培养基上，并于37℃预温，然后将混合菌液滴于滤膜上，使之慢慢吸收。37℃接合4小时，同时做供体和受体对照。然后用TSB洗下滤膜上的支气管败血波氏杆菌，重悬后再用TSB洗两遍，涂布在含氯霉素(Cm，购自Sigma公司)的TSA培养机上，37℃培养过夜24小时。Cm抗性菌落进一步用PCR鉴定。PCR反应1(用引物C1/T2扩增)用来确定发生了第一次交换，PCR反应2(用引物Cm1/Cm2扩增)来确定pRE112中的Cm表达盒的存在，从而说明转移质粒已经整合到支气管败血波氏杆菌的染色体上了。将有正确PCR扩增条带的接合子接种于无NaCl的aromix改良LB固体培养基(为LB为基本培养基，附加二羟基苯甲酸(DHB)、对氨基苯甲酸(PABA)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)，使终浓度均为40μg/mL)培养基中37℃震荡培养过夜后，摇浑的菌液再取5μL在无NaCl的aromix改良LB固体培养基培养基中传代，这样进行20次，每代稀释适当的倍数涂布aromix改良LB固体培养基。40h培养后，挑取单菌落影印到Cm抗性aromix改良LB固体培养基上。筛选出Cm敏感(Cm sensitive，Cms)的克隆，然后用反应1和反应2进行PCR鉴定，以确定发生了第二次交换(见图4)。

PCR鉴定单交换：质粒整合到染色体上后，aroA的前后臂将有两个拷贝，一个是缺失型，一个是野生型，因此用上臂上游引物C1和下臂下游引物T2可以扩增出两个片段，野生型是3092bp，缺失型是1763bp(如图5)。

PCR鉴定双交换：阳性接合子在无抗性无NaCl的aromix改良LB固体培养基中培养过夜并传代，筛选Cms菌落，用引物C1与T2进行PCR扩增鉴定。发生第二次同源重组，可以产生两种结果，一种是得到aroA缺失株，一种是回复野生型。正确的aroA缺失株用C1与T2只能扩增出1763bp的片段(代表缺失型)(如图6)，并用Cm1和Cm2无法扩增出Cm基因盒。将C1和T2扩增得到的片段送上海生工测序，测序证明缺失菌株缺失了目的片段---aroA全基因。

5.支气管败血波氏杆菌aroA基因缺失菌株QH0814ΔaroA生物学特性及鉴定

(1)支气管败血波氏杆菌aroA基因缺失菌株的遗传稳定性分析，将得到的基因缺失株QH0814ΔaroA在aromix改良LB固体培养基的平皿上传10代，每代都用C1与T2鉴定遗传稳定性。结果显示连续传10代，都只能扩增出缺失型的1763bp的片段(如图7所示)，说明本发明制备的支气管败血波氏杆菌基因缺失株QH0814ΔaroA中的aroA的缺失是很稳定的。PCR操作的具体步骤是：提取aroA基因缺失株QH0814ΔaroA基因组DNA(方法如前述)，以其为模板进行PCR扩增。扩增反应在50μL的体系中进行，反应体系如下：模板基因组DNA 5μL，10×PCR缓冲液5μL，10μmol/L P1 2μL，10μmol/L P2 2μL，2mmol/LdNTPs 8μL，TaqE 0.5μL，ddH2O 22.5μL。扩增条件为：95℃变性5min后进入循环，循环参数为94℃1min，59℃1min，72℃4min 30sec。30个循环后，72℃延伸10min。结果如图7所示：本发明制备的支气管败血波氏杆菌aroA基因缺失菌株QH0814ΔaroA能够稳定遗传。

(2)支气管败血波氏杆菌aroA基因缺失菌株QH0814ΔaroA生长特性分析

Aromix改良LB固体培养基37℃培养36h，本发明制备的支气管败血波氏杆菌aroA缺失株菌落比亲本菌HH0809明显小，其直径约为1mm，较亲本株(2mm)小1倍。亲本株(野生菌株)HH0809与本发明的支气管败血波氏杆菌aroA缺失株从10⁷CFU/mL开始，在aromix改良TSB(添加体积为10％的小牛血清)液体培养基中培养，每2h取样，平板法计数并测OD600nm值，绘制生长曲线。结果显示，aroA缺失株生长速度明显慢于亲本株菌株(见图8)，亲本株6～22h左右左右进入对数生长期，本发明的支气管败血波氏杆菌aroA缺失株则需8～24h进入对数生长期。

经以上实验证实，本发明的支气管败血波氏杆菌aroA缺失菌株QH0814ΔaroA构建是成功的，于2007年1月19日送交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为：CCTCC NO：M208018。

6、支气管败血波氏杆菌aroA基因缺失疫苗的制备

将本发明的支气管败血波氏杆菌aroA基因缺失菌株(实验编号：野生菌株为HH0809，本发明的aroA基因缺失菌株为QH0814ΔaroA)进行鉴定，共进行20代鉴定，每代接种于aromix改良的LB培养基上，利用支气管败血波氏杆菌aroA基因及其上下游同源臂进行PCR检测鉴定重组细菌的遗传稳定性，经20次传代后发现仍然只能扩增出大小为1700bp左右的片段，表明申请人构建的支气管败血波氏杆菌aroA基因缺失菌株具有遗传稳定性。将该支气管败血波氏杆菌aroA基因缺失菌株先在aromix改良的LB固体培养基上培养，然后挑取单菌落于aromix改良的LB液体培养基上培养，直到活细菌浓度达到2×10¹⁰CFU/mL，将所述的支气管败血波氏杆菌aroA基因缺失菌株的菌液与明胶保护剂按体积比为7∶1(该明胶保护剂的配制方法是：每100mL去离子水中加蔗糖40g，明胶8g，充分融化后，置121℃下灭菌30min后保存备用)，于灭菌冻干瓶中按2.0mL/瓶分装，置-50℃冷冻干燥机中冻干，冻干36-40h后压盖，复苏后确定没有杂菌污染，置-20℃保存备用，即为本发明的支气管败血波氏杆菌aroA基因缺失疫苗。

7、支气管败血波氏杆菌aroA基因缺失株对小鼠的LD₅₀测定

将支气管败血波氏杆菌aroA基因缺失菌株QH0814ΔaroA与对照亲本株HH0809在aromix改良LB固体培养基中传代活化，挑取单菌落在aromix改良LB液体培养基中37℃培养16h，通过平板法计数。然后用5倍比稀释，每个稀释度腹腔注射(i.p)4只5周龄Balb/C雌鼠，每只500μL，观察14天，统计出90％以上死亡和10％以下死亡的剂量，分别作为正式试验的最高与最低剂量。将预试验得出的最高、最低剂量换算为常用对数，然后将最高、最低剂量的对数差，分为4个对数等距的剂量组，每组6只Balb/C小鼠，开始正式试验。每个稀释度腹腔注射6只5周龄Balb/C雌鼠，每只500μL观察14天，死亡小鼠肺脏无菌接种aromix改良LB固体培养基，用引物F1/F2和C1/T2扩增鉴定，统计出每组死亡情况。根据寇氏(Korbor)法计算LD50，计算的公式为：

logLD50＝Xm-d(∑P-0.5)

在上面的公式中：Xm为最大剂量对数，d为相邻剂量比值对数，p为各组的死亡率(死亡率以小数表示)，∑P为各组死亡率的组合。

将过夜培养的亲本菌株(HH0809)和本发明的支气管败血波氏杆菌aroA基因缺失菌株分别按体积比1∶1000比例接种到20mL改良TSB培养基，培养至OD600约0.8，连续2倍稀释，每个稀释度腹腔注射(i.p)8只Balb/c小鼠，每只200μL，连续观察5天，记录小鼠死亡情况。

结果见表1：从小鼠存活情况看，本发明的QH0814ΔaroA的毒力有所降低，表明本发明的aroA基因缺失菌株QH0814ΔaroA毒力明显降低。

表1本发明的aroA基因缺失疫苗菌株QH0814ΔaroA与亲本株毒力比较试验

8.支气管败血波氏杆菌aroA基因缺失疫苗免疫仔猪的保护性试验

1)猪的免疫程序：

选择猪支气管败血波氏杆菌抗原，抗体阴性的7日龄的哺乳仔猪14头，试验分4组，第1组为基因缺失疫苗组，编号1～5，第二组为支气管败血波氏杆菌灭活疫苗组，编号6～10，第三组为无菌磷酸盐缓冲液(PBS，各组分浓度：137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄，2mM KH₂PO₄ pH＝7.2)对照组，编号11～13，第5组为空白对照，编号14～15。

磷酸缓冲液PBS对照组每头猪滴鼻1mL PBS，本发明的支气管败血波氏杆菌aroA基因缺失疫苗免疫组通过滴鼻免弱毒疫苗1mL(活菌含量1.0×10⁹CFU)，灭活疫苗免疫组通过肌肉注射2mL灭活疫苗(灭活支气管败血波氏杆菌含量1.3×10⁹CFU)，免疫2次，间隔3周。在一免后3周和二免后3周各采血一次，用常规的ELISA方法检测针对支气管败血波氏杆菌全菌的抗体水平。

表4本发明的支气管败血波氏杆菌aroA基因缺失疫苗免疫仔猪试验动物分组设计

2)针对波氏全菌的ELISA抗体水平检测

分别在第一次3周和第二次免疫猪后2周前腔静脉采血，分离血清，采用间接ELISA检测针对支气管败血波氏杆菌全菌的抗体，结果见表4，PBS对照组小于1∶40，表现为阴性；aroA基因缺失疫苗免疫组免疫仔猪攻毒前针对支气管败血波氏杆菌抗体水平在1∶80-1∶160之间。

3)免疫仔猪攻毒保护率试验

二免后2周以PBS对照组(11～13号)、灭火疫苗组(6～10号)、本发明的aroA基因缺失疫苗免疫组(1-5号)通过滴鼻攻毒，攻毒剂量2.0mL(总活菌含量6.0×10¹¹CFU)；攻毒菌株支气管败血波氏杆菌HH0809。攻毒后连续观察1周，观察临床症状并最后计算攻毒保护率情况。结果说明以aroA基因缺失疫苗免疫仔猪可以完全保护强毒支气管败血波氏杆菌攻击。优于传统的灭活疫苗。攻毒后保护率情况见表5。

表5本发明制备的支气管败血波氏杆菌aroA基因缺失缺失疫苗免疫仔猪后抗体水平和攻毒保护结果

a食欲情况(1周内)：0，吃食；1，食欲降低；2，有点厌食；3不吃食

b呼吸困难：0，正常；1，轻微；2，中等程度；3，严重

c嗜睡程度：0，正常；1，轻微；2，中等程度

序列表

<110>华中农业大学

<120>一种支气管败血波氏杆菌基因缺失疫苗及应用

<130>

<141>2009-05-26

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>926

<212>DNA

<213>支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica)

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<221>gene

<222>(1)..(926)

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<400>1

tccggcgctg ccatattgtt tttctgcagg tatgagcgcg aacaattcgg caaacgggca   60

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<210>2

<211>1340

<212>DNA

<213>支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica)

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<221>gene

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<400>2

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<210>3

<211>861

<212>DNA

<213>支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica)

<220>

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<222>(1)..(861)

<223>

<400>3

ccccatggct atttccgcat ccgccggcgc cgcgccggtc atcaccatcg acggccccac     60

ggcttccggc aagggcacca tcgcgcaccg ggtggccaag cagctgggct gggacgtgct    120

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caccgacgaa ccggcggtgg ccgccgtggc ccaggcgctg gacgtacggt tcgacgggcc    240

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ctacgcttcg cgcatcgccg cctacccggg cgttcgtcag gccttgctgg agcgccagcg    360

ggctttccgg cagccgccgg gcctggtcgc cgacggccgc gacatgggga cggtcgtgtt    420

tcctgatgcg tccctgaaaa tatttctggt ggccgatgtc gaggcgcgcg cgcaaagacg    480

ctgtaagcag ttgatcgaaa agggaatttc tgctaatcta gatgacctgc tacgcgatat    540

gcgtgaacgc gatgcgcgcg acacgcagcg tgcggtggca ccgcttgccc cggctgccga    600

tgcgcatgtg ctggattctt ccggcctgac catcgaacag accgtacagg ccgtgctgga    660

tttctggcgc gcctagccac ggcgcgtgtt gtttgggcag tacctcagta cctgtttgag    720

gccctgacgg ccaatctcca gcccccacgg gacaccccgc aagggccggc gaagccggca    780

ggttttacca ctccactgct gcgggcaatc cgttgcggtg tgttttgaac ggccaatccc    840

ggccaaatgg attccaacct a                                              861

Claims (4)

1、一种支气管败血波氏杆菌支气管败血波氏杆基因缺失菌株，其特征是该菌株是支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica)QH0814ΔaroA，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M208018，该菌株的缺失了5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(aroA)基因全长1340bp，导致该菌株对芳香族氨基酸的代谢出现障碍。

2、一种由权利要求1所述的保藏号为CCTCC NO：M208018的基因缺失株制备的基因缺失疫苗。

3、权利要求1所述的支气管败血波氏杆菌基因缺失菌株在制备支气管败血波氏杆菌基因缺失疫苗的应用。

4、权利要求3所述的应用，所述的支气管败血波氏杆菌基因缺失疫苗是支气管败血波氏杆菌基因缺失弱毒活疫苗。

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