CN110049760A - 用于治疗炎性疾病的组合物及其用途以及益生菌组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗对象的炎性疾病、病症或病况，尤其是消化道的炎性疾病、病症或病况如炎性肠病(IBD)和/或结肠直肠癌的方法中的组合物及其用途。本发明还涉及益生菌组合物和该组合物用于治疗胃肠病症的用途。

Description

用于治疗炎性疾病的组合物及其用途以及益生菌组合物
发明领域
本发明涉及3-羟基丁酸(3-HB)或其盐，其用于治疗对象的炎性疾病、病症或病况，特别是消化道的炎性疾病、病症或病况如炎症性肠病(IBD)和/或结肠直肠癌的方法。本发明还涉及包含本文所述组合物的益生菌组合物和该组合物用于治疗胃肠病症的用途。
发明背景
炎症是免疫系统的复杂反应，其涉及在感染、毒素暴露或细胞损伤部位的白细胞和血浆蛋白的积累和活化。虽然炎症在控制感染和促进组织修复中起到保护作用，但它也造成组织损伤和疾病。IBD，例如克罗恩病(Crohn's disease)和溃疡性结肠炎，伴有异常的肠炎性应答。不受控制的炎症也可以驱动肠中肿瘤发生，并且患有IBD的患者发生结肠直肠癌的风险增加。
有报道提出细胞因子和蛋白质的特定网络参与调节炎症，特别是粘膜组织如肠粘膜的炎症，其参与疾病例如IBD的发病机理。迄今为止包括氨基水杨酸盐和类固醇的药物疗法提供了症状的改善，但未能阻止潜在的炎性过程，并且也没有改变病程。
生物试剂例如抗体通过靶向炎性细胞因子或蛋白质为这些慢性疾病提供了替代治疗选项。
促炎细胞因子TNF-α是在炎症中，具体是在肠炎症中，起关键作用的细胞因子的实例(Neurath,M.F.(2014)Nature Reviews Immunology；14:329–342)。TNF-α活化成纤维细胞，刺激促炎细胞因子的产生和血管生成，诱导上皮细胞的死亡，介导T细胞抵抗细胞凋亡以及诱导恶病质。抗TNF-α试剂已经成为许多工作的焦点，临床上已经批准许多试剂用于治疗炎性疾病，如银屑病、克罗恩病和类风湿性关节炎(Neurath,M.F.(2014)Nature ReviewsImmunology；14:329–342)。实例包括单克隆抗体英夫利昔单抗(infliximab)阿达木单抗(adalimumab)培化舍珠单抗(certolizumabpegol)和戈利木单抗(golimumab)
IL-12和IL-23也在炎症中起作用，并且具体地与肠炎症相关(Teng,M.W.L.,etal.(2015)Nature Medicine；21:719–729)。在患有克罗恩病的患者的发炎粘膜中诱导IL-12和IL-23。IL-12诱导1型辅助T(TH1)细胞，并且发现克罗恩病与TH1应答相关。已经在克罗恩病和溃疡性结肠炎中鉴定出17型辅助T(TH17)细胞应答，并且IL-23作为TH17细胞的活化剂是熟知的。IL-12和IL-23共有一个亚基(p40)，市售药物乌司奴单抗(ustekinumab)靶向该亚基，并被批准用于克罗恩病。Risankizumab特异性针对IL-23独有的p19亚基，并且2期数据表明其对克罗恩病的疗效(Neurath,M.F.(2017)Nature Reviews Gastroenterology&Hepatology；14:269–278)。其它用于治疗炎性疾病，例如银屑病、银屑病关节炎、强直性脊柱炎和类风湿性关节炎的抗IL-23试剂正在临床开发中。
促炎细胞因子IL-6也在炎症中起作用，并且具体地与肠炎症相关(Neurath,M.F.(2014)Nature Reviews Immunology；14:329–342)。IL-6活化T细胞并防止细胞凋亡，诱导巨噬细胞活化，招募免疫细胞，活化急性期蛋白，诱导上皮细胞增殖以及促进肿瘤生长(Neurath,M.F.(2014)Nature Reviews Immunology；14:329–342)。正在研发的抗IL-6药物(例如托珠单抗(tocilizumab))已显示治疗克罗恩病的早期临床疗效。在IBD患者中，诱导IL-6和其激动性可溶性受体sIL-6R，并介导T细胞的活化及其对细胞凋亡的抗性。IL-6阻断在实验性结肠炎中是有效的(Neurath,M.F.(2017)Nature Reviews Gastroenterology&Hepatology；14:269–278)。用于治疗炎性疾病，例如类风湿性关节炎的抗IL-6试剂也在临床开发中，并且已被批准用于癌症疗法。
显示阻断IL-1β活性通过损害巨噬细胞依赖性IL-6的分泌从而减少小鼠的肿瘤发生。缺失IL-1β转化酶(ICE，也成为胱天蛋白酶(caspase)1)—一种将IL-1β和IL-18切割成活性细胞因子的酶—保护小鼠免受葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎，这表明阻断IL-1家族成员可能与治疗慢性肠炎症有关(Neurath,M.F.(2014)Nature Reviews Immunology；14:329–342)。
IL-10抑制抗原递呈细胞和T细胞产生促炎细胞因子，并在调节性T细胞中诱导STAT3信号通路。IL-10参与炎性疾病，特别是肠炎症如结肠炎。例如，IL-10的缺失与IBD相关(Neurath,M.F.(2014)Nature Reviews Immunology；14:329–342)。
TGF-β1由小鼠和人肠中的许多免疫和非免疫细胞产生，并且两种TGF-β1受体(I型和II型)几乎在所有肠细胞中表达。TGF-β1抑制效应T细胞和巨噬细胞的活化和功能，并有助于表达Foxp3的调节性T细胞(Fantini,M.C.,et al.(2004)J Immunol；172:5149-5153)和TH17细胞的外周分化。它还为参与炎性应答的白细胞和其他细胞提供趋化梯度，并且一旦它们被活化即抑制细胞。TGF-β1抑制基质细胞产生细胞外基质降解蛋白酶，同时刺激这些这些细胞产生胶原蛋白，并促进上皮细胞边集(margination)。TGF-β1是参与粘膜免疫球蛋白A(IgA)产生的主要细胞因子。与小鼠炎症模型产生的数据一致的是，在正常、肠粘膜细胞或外植体培养物中用中和抗体阻断内源性TGF-β1的活性，增强炎性分子的诱导，而用重组TGF-β1刺激正常肠免疫细胞，消除炎性信号。Mongersen是一种正在研发的用于治疗克罗恩病的药物。Mongersen通过敲低TGF-β1的抑制剂(Smad7)恢复TGF-β1的活性，从而导致小鼠中炎性通路的抑制和结肠炎的消除(Ardizzone,S.,et al.(2016)Ther AdvGastroenterol；9(4):527–532)。
细胞因子通过活化细胞内信号分子例如STAT3和NF-κB来活化肿瘤细胞增殖、扩增和存活(Neurath,M.F.(2014)Nature Reviews Immunology；14:329–342)。NF-κB是控制DNA转录、细胞因子产生和细胞存活的蛋白质复合物。IBD中的慢性粘膜炎症是由效应免疫细胞的过度活化引起的，其产生高水平的促炎细胞因子，如TNF-α、IL-6和干扰素γ，导致结肠组织损伤。在该免疫环境中，核转录因子NF-κB被鉴定为关键调节子之一。局部施用p65(NF-κB的亚基)反义寡核苷酸可以成功治疗三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的结肠炎，并且NF-κB途径在治疗性干预IBD中是一个有吸引力的靶点。对于参与IBD的所有细胞因子和蛋白质，NF-κB也参与正常细胞生理活动。阻断小鼠肝细胞中NF-κB的活化与肝细胞癌的自发发展相关，因此，将NF-κB的抑制作用局部限制于发炎的结肠粘膜内的免疫细胞中是期望的(Atreya,I.et al.(2008)Journal of Internal Medicine；263:591–596)。
基质金属蛋白酶(MMP)控制IBD中的组织重塑和破坏。在IBD中，特别是在溃疡性结肠炎患者中，发现MMP9的表达增加。体内动物研究表明MMP在损害上皮通透性和加重炎症中的重要作用(Neurath,M.F.(2017)Nature Reviews Gastroenterology&Hepatology；14:269–278)。
靶向细胞因子和蛋白质的生物试剂，例如单克隆抗体，由于其性质对其靶具有高度特异性。抗体疗法通常还与由于长期不耐受引起的继发性衰竭和戒断有关(Amiot,A.etal.(2015)Ther Adv Gastroenterol；8(2):66–82)。
Miyarisan Pharmaceutical Co Ltd(日本)生产了用于消化健康的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)(CBM588菌株)益生菌。该产品使用非工程化的梭菌属(Clostridium)菌株，其不会产生3-HB。丁酸梭菌(C.butyricum)存在于人类肠道微生物群中，并且作为人类和动物健康的益生菌有安全使用历史。
本领域仍然需要治疗炎性疾病、病症或病况，特别是肠道中的炎性疾病、病症或病况(包括结肠直肠癌)的新疗法。本领域仍然需要抑制疾病、病症或病况的潜在的炎性过程的疗法和/或能够改变疾病、病症或病况的过程的疗法。需要更有效、更小的副作用、口服可接受的、易于施用以及表现出对治疗方案提高的依从性、和/或靶向局部炎症部位以治疗疾病、病症或病况的新疗法。
发明内容
在第一方面，本发明提供了3-羟基丁酸(3-HB)或其盐，其用于治疗对象的炎性疾病、病症或病况的方法。
在第二方面，本发明提供了一种包含3-HB或其盐的药物组合物，其用于治疗对象的炎性疾病、病症或病况的方法。
在第三方面，本发明提供了一种药物组合物，其用于治疗对象的炎性疾病、病症或病况的方法，其中所述组合物包含3-HB递送工具，并且所述方法包含将3-HB递送工具递送至胃肠(GI)道的腔和/或粘膜表面。
在第四方面，本发明提供了一种治疗对象的炎性疾病、病症或病况的方法，包括向对象施用：a)3-羟基丁酸(3-HB)或其盐；b)包含3-HB或其盐的药物组合物；和或c)包含3-HB递送工具的药物组合物。
在第五方面，本发明提供了一种组合物，其包含或基本上由产生(R)-3-HB的遗传工程化厌氧细菌和可口服摄取载体组成。
在第六方面，本发明提供了一种治疗或预防胃肠疾病或病症的方法，包括施用产生(R)-3-羟基丁酸盐的遗传工程化厌氧细菌。
在第七方面，本发明提供了一种治疗或预防胃肠生态失调的方法，包括施用产生(R)-3羟基丁酸盐的遗传工程化厌氧细菌。
在第八方面，本发明提供了一种治疗或预防艰难梭菌(Clostridiumdifficile)感染的方法，包括施用产生(R)-3羟基丁酸盐的遗传工程化厌氧细菌。
在第九方面，本发明提供了一种调节对象肠道菌群的方法，包括施用产生(R)-3羟基丁酸盐的遗传工程化厌氧细菌。
附图说明
图1A显示梭菌属中天然酸产生的代谢途径。
图1B显示引入非天然(R)-3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶后，梭菌属中酸产生的代谢途径。
图2显示针对来自钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)的phaB基因的密码子优化的DNA序列。
图3详述在pMTl83251中pfdx_phaB的质粒图谱(丁酸梭菌)。
图4A显示由野生型丁酸梭菌(wt)产生的(R)-3-HB、丁酸盐和乙酸盐的产生。
图4B显示由遗传工程化丁酸梭菌(CHN1-phaB)产生的(R)-3-HB、丁酸盐和乙酸盐的产生。
图5显示随着时间以CFU/ml测量的由野生型丁酸梭菌(wt)和遗传工程化丁酸梭菌(CHN1-phaB)产生的总CFU(A)和孢子(耐热CFU)(B)。
图6显示野生型丁酸梭菌(wt)和遗传工程化丁酸梭菌(CHN1-phaB)随着时间产生的孢子与营养细胞的百分比。
图7显示在改良的BIM上CHN-1的总活菌计数，表示为菌落形成单位/mL。CFU/mL显示为三次独立实验的平均值，误差棒代表标准差。
图8显示在改良的BIM上耐热菌计数，表示为菌落形成单位/mL。CFU/mL显示为三次独立实验的平均值，误差棒代表标准差。
图9显示在不同时间点测量的结肠模拟中的pH。
图10显示在选定时间点时，结肠模拟中乙酸盐的存在(mM)。
图11显示在选定时间点时，结肠模拟中丁酸盐的存在(mM)。
图12显示对于组合的实验重复(A)和每个实验重复(B)，在24小时时，结肠模拟中(R)-3-HB的产生。
图13显示利用寡核苷酸ISR-F和ISR-R进行16s-23s基因间隔区-特异性PCR，以检测生物反应器中的CHN-1。
图14显示利用寡核苷酸phaB-F和phaB-R进行phaB特异性PCR，以检测生物反应器中的CHN-1。
图15显示来自肠类器官模型的数据。提供了当用TNFα、TNFα和丁酸盐和/或(R)-3-HB孵育类器官时，与未刺激的类器官相比，炎性因子NF-κB(A)和TNF-α(B)的相对表达(mRNA)水平。
图16显示来自肠类器官模型的数据。显示当单独用TNFα或TNFα与(R)-3-HB一起刺激类器官时，与未刺激的类器官相比，炎性标志物IL-10(A)、IL-23(B)、TNFα(C)、IL-1β(D)、TGF-β1(E)、IL-6(F)和NF-κB(G)的相对表达(mRNA)。
图17显示用60ng/mL的TNF-α和浓度增加的丁酸盐或(R)-3-HB处理的类器官中，IL-23的相对mRNA表达水平。
图18显示来自离体组织模型的数据。显示当单独用TNFα或TNFα与(R)-3-HB一起刺激离体结肠组织样品时，与未刺激的组织样品相比，炎性标志物IL-10(A)、IL-12(B)、IL-1β(C)和IL-6(D)的相对蛋白量(Luminex)。
图19显示来自离体组织模型的数据。利用比较蛋白质组点印记阵列(comparativeProteome Dot Blot Array)实验，比较单独用TNFα或TNFα与(R)-3-HB一起刺激的离体结肠组织样品中蛋白表达水平。显示了炎性标志物TNF-α(A)、IL-23(B)和MMP9(C)的数据。
图20显示通过单独或共培养中的丁酸梭菌和艰难梭菌的孢子的萌发和生长而获得的CFU/mL。
图21显示RCM琼脂平板上的CHN-1孢子在胃和小肠条件中孵育后的每毫升菌落形成单位。数据点代表三次独立实验的平均值，误差棒显示标准差。
具体实施方式
本文所述的发明基于本发明人的惊人发现，即3-HB，特别是(R)-异构体(R)-3羟基丁酸盐((R)-3-HB)，是有效的抗炎剂，其作用于许多由肠细胞产生的不同的炎性细胞因子和信号分子。具体来说，发明人已经表明在发炎的肠组织中，3-HB下调某些促炎细胞因子和蛋白质(例如TNF-α、IL-23、IL-6、IL-1β、IL-12和MMP9)，以及上调某些抗炎细胞因子(例如IL-10、TGF-β1)。所涉及的细胞因子和蛋白质参与了许多炎性疾病、病症或病况，特别是胃肠道炎症，包括IBD(例如克罗恩病、溃疡性结肠炎和结肠直肠癌)。
本发明解决了本领域的上述需求。具体来说，本发明提供了对许多不同炎性细胞因子和蛋白质具有广泛作用的治疗炎性疾病、病症或病况的改进疗法。
本发明人已经表明，当局部递送至发炎组织，特别是肠组织时，3-HB表现出抗炎作用。因此，本发明提供了可局部递送至炎症部位的治疗炎性疾病、病症或病况的改进疗法。
本发明提供了抑制潜在的炎性过程和/或改变病程的治疗炎性疾病、病症或病况的改进疗法。
在一些情况中，本发明提供针对结肠直肠癌的预防性治疗或疗法。
具体来说，与靶向各个细胞因子的生物试剂例如抗体相比，本发明提供了用于炎性疾病、病症或病况的改进疗法。具体来说，与这些生物试剂相比，3-HB对发炎组织的许多不同的炎性细胞因子和蛋白质具有更广泛作用。
在某些方面，本发明涉及将3-HB递送至胃肠道的药物组合物。
肠道微生物群参与促进结肠健康。认为实现这一目的的机制之一是通过膳食纤维的发酵产生短链脂肪酸(SCFA)乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐。丁酸盐因其对结肠健康的影响而受到最多关注，特别是作为抗炎和抗肿瘤发生的关键介质。肠道微生物组分析显示溃疡性结肠炎和结肠癌患者的结肠中，产丁酸盐细菌的数量显著减少(Frank,D.N.,et al.(2007)Proc Natl Acad Sci；104(34):13780–13785；Wang,T.,et al.(2012)The ISME Journal；6:320–329)。研究表明，用丁酸盐对结肠灌洗可以抑制溃疡性结肠炎期间的炎症(Hamer,H.M.,et al.(2008)Aliment Pharmacol Ther；27:104–119)。
本发明人还表明，相比于发炎组织，特别是肠组织中的丁酸盐，3-HB更大程度地降低了几种促炎细胞因子和蛋白质的相对表达水平，并且增加了抗炎细胞因子的相对表达水平。具体地，已经显示(R)-3HB在低浓度下(10-100μM)，相比于丁酸盐，对减少IL-23表达的作用更大。
(R)-3HB，也称为D-β-羟基丁酸盐(β-OHB)，是一种在肝脏中天然产生的酮体，并通过血流循环至肝外组织，在碳水化合物限制期，它可以充当代谢底物。(R)-3-HB还会在各种信号转导途径中发挥作用，但在成人的肠道腔中通常没有发现。以解离的(酸)形式摄入3-HB是不切实际的。为了摄取，酸可以配制成盐或酯类产品，但在这些情况下，3-HB会在小肠中快速吸收，并进入血流中，在血流中其被稀释并分布于全身。由于这些制剂中潜在的危险的高盐浓度(例如钠盐)，口服施用3-HB的盐也是不期望的。
本发明提供了可以肠内施用，优选口服施用的药物组合物。因此，本发明提供了一种口服可接受的且良好耐受的药物组合物用于递送3-HB。例如，与坚持生酮饮食相比，该药物组合物展示患者依从性的提高。
可以将3-HB递送至肠，优选递送至肠的厌氧部分，优选大肠并优选结肠。可以递送3-HB，使其不被小肠吸收。优选地，3-HB不被递送至食道、胃或小肠。本发明也提供了可以肠内施用，优选直肠施用的药物组合物。
因此，可以将3-HB递送至炎症部位，特别是胃肠道的腔，其在局部表现出效果。因此，最小化或避免了不良的副作用。具体来说，最小化或避免了与治疗有效量的酮体的递送和全身摄取相关的不良的副作用(例如盐过量)。
3-HB是具有两种异构体(R)-3-HB和(S)-3-HB的手性化合物。根据本发明的3-HB可以是单独的异构体、异构体的外消旋混合物或异构体的非外消旋混合物。(R)-3-HB和(S)-3-HB的外消旋混合物可以具有约50％/wt的(R)-3-HB和约50％/wt的(S)-3-HB。或者，至少约50、60、70、80或90％/wt的3-HB可以是(R)-3-HB，其余为(S)-3-HB。优选地，基本上全部或100％/wt的3-HB可以是(R)-3-HB。
(R)-3-HB和(S)-3-HB的摩尔比可以大于5：1，大于10：1，大于50：1，或者大于100：1。在一个实施方案中，(R)-3-HB和(S)-3-HB的比率在约100-5：1、100-50：1、100-20：1、50-5：1、20-5：1、15-5:1或约15-10：1的范围内。
3-HB以(R)或(S)-形式的纯对映体，或以(R)-3-HB和(S)-3-HB的外消旋混合物商业可得。3-HB也可以通过本领域已知的方法产生。优选地，可以通过发酵遗传工程化产生3-HB的厌氧细菌来产生3-HB。可以通过本领域已知的方法分离3-HB。优选地，可以通过发酵本文所述的产生手性化合物的新型梭菌属菌株产生3-HB。例如，可以是100％/wt(R)-3-HB的3-HB可以通过发酵包含能够表达(R)-3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶的异源基因的梭菌属(Clostridium)物种，优选丁酸梭菌(Clostridium butyricum)来产生。通过同时引入能够表达丁酸激酶和丁酰磷酸转移酶(phosphotransbutyrylase)的异源基因，可以实现滴度的增加。引入能够表达(R)-3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶的异源基因导致产生(R)形式的3-羟基丁酰基-CoA。然后，天然还原酶将(R)-3-羟基丁酰基-CoA转化为(R)-3-HB。或者，可以是至少约90％/wt(R)-3-HB，其余为(S)-3-HB的3-HB可以通过发酵包含能够表达(R)-羟基丁酰基-CoA脱氢酶的异源基因的梭菌属物种，优选丁酸梭菌来产生。通过引入能够表达丙酰基-CoA转移酶(PCT)的异源基因，可以实现3-HB滴度的增加。引入异源(R)-3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶和丙酰基-CoA转移酶基因导致(R)-3-HB和(S)-3-HB以约10：1的比率产生。
3-HB可以是药学上可接受的盐或溶剂化物的形式。如本文所用的“3-HB”是指3-HB或其盐。本文提及的“药学上可接受的盐”是适用于药学应用的任何盐制剂。药学上可接受的盐包括胺盐，例如N,N’-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、氨、二乙醇胺和其他羟烷基胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺、普鲁卡因、N-苄基苯乙胺、1-对氯苄基-2-吡咯烷-1’-基甲基苯并咪唑、二乙胺和其他烷基胺、哌嗪、三(羟甲基)氨基甲烷等；碱金属盐，如锂、钾、钠等；碱土金属盐，如钡、钙、镁等；过渡金属盐，如锌、铝等；其他金属盐，如盐酸氢钠、磷酸二钠等；无机酸，如盐酸盐、硫酸盐等；有机酸盐，如乙酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、丁酸盐、戊酸盐、富马酸盐等。
尽管3-HB可以单独施用，但优选3-HB存在于药物组合物中。因此，本发明提供了包含3-HB或其盐的药物组合物，其用于治疗对象的炎性疾病、病症或病况的方法。优选地，配制药物组合物以通过在胃肠道的腔或粘膜表面释放3-HB而将3-HB递送至胃肠道。
或者，药物组合物可通过其他方式将3-HB递送至胃肠道的腔或粘膜表面。因此，本发明提供了药物组合物，其用于治疗对象的炎性疾病、病症或病况的方法，其中所述组合物包含3-HB递送工具，并且所述方法包括将3-HB递送工具递送至胃肠道的腔或粘膜表面。
“3-HB递送工具”可以指将3-HB或其盐递送至胃肠道的腔的任何化学或生物学工具。合适的实例包括3-HB的前药或将3-HB递送至胃肠道的腔的生物递送系统。这种递送工具将在下面进一步讨论。
本发明包括药物组合物，其包含至少一种药学上可接受的载体，和任选的其他治疗和/或预防成分。
施用本发明的药物组合物，使得治疗有效量的3-HB被递送，并且通过任何可接受的提供相似效用的试剂的施用模式递送。
药物组合物包括适合口服或直肠施用的那些。优选地，使用方便的每日剂量方案口服施用，所述方案可以根据痛苦程度进行调整。
本发明的药物组合物可以与一种或多种常规佐剂、载体或稀释剂制备，并置于剂型例如单位剂量中。药物组合物和剂型可以包含常规比例的常规成分，并且剂型可以含有与预期的待采用的每日剂量范围相当的任何合适有效量的活性剂(如本文所述的3-HB)。
药物组合物可以采用多种不同形式中的任何形式，尤其取决于其使用方式。因此，例如，试剂或组合物的形式可以是粉末、片剂、胶囊、液体、乳膏、凝胶、水凝胶、泡沫、胶束溶液、脂质体悬浮液或可以施用于需要治疗的人或动物的任何其他合适的形式。应当理解的是，根据本发明的药物组合物的载体应该是被它所给予的对象良好耐受的载体。
本文提及的“药学上可接受的载体”是本领域技术人员已知的任何已知化合物或已知化合物的组合，其可用于配制药物组合物。
活性剂可以用于治疗对象的炎性疾病、病症或病况的单一疗法(即单独使用活性剂)。或者，活性剂可以用作包括以下的一种或多种其他活性剂的辅助剂或与包括以下的一种或多种其他活性剂组合：5-氨基水杨酸盐类(5-ASAs)，例如5-ASA、美沙拉嗪、柳氮磺吡啶、奥沙拉嗪和巴柳氮，特别是Asacol 和类固醇，特别是皮质类固醇，如氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松、泼尼松龙和布地奈德；免疫调节剂包括免疫抑制药物，如硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、环孢素-A和他克莫司；生物试剂包括抗TNF试剂如英夫利昔单抗、阿达木单抗、戈利木单抗和培化舍珠单抗，T细胞运输剂如整合素阻断剂那他珠单抗和维多珠单抗，抗生素和益生菌包括非致病性微生物如共生大肠杆菌(Escherichia coli)、乳杆菌(Lactobacillus)物种、酵母属(Saccharomyces)或寄生虫猪鞭虫(Trichuris suis)；结肠直肠癌的化疗剂，如卡培他滨氟尿嘧啶(5-FU,)、伊立替康奥沙利铂和曲氟尿苷/tipiracil(TAS-102,)；直肠癌的靶向疗法，包括抗血管生成疗法，如贝伐单抗瑞戈非尼阿帕西普(ziv-aflibercept)和雷莫芦单抗以及表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂如西妥昔单抗和帕木单抗短链脂肪酸如丁酸盐，例如丁酸。3-HB可以与上述任何一种或多种组合使用，例如与硫唑嘌呤和英夫利昔单抗组合使用。优选地，3-HB可以与丁酸盐组合使用。
在一个优选的实施方案中，药学上可接受的载体可以是固体，并且组合物的形式可以是粉末或片剂。固体药学上可接受的载体可以包括一种或多种物质，其也可用作调味剂、缓冲剂、润滑剂、稳定剂、增溶剂、悬浮剂、润湿剂、乳化剂、染料、填充剂、助流剂、压缩助剂、惰性粘合剂、甜味剂、防腐剂、染料、包衣或片剂-崩解剂。该载体也可以是包封材料。在粉末中，该载体是细微的固体，其与细微的根据本发明的活性剂混合。在片剂中，活性剂可以与具有必要压缩性能的载体以适当比例混合，并压制成所需的形状和大小。粉末和片剂优选含有高达99％的活性剂。合适的固体载体包括，例如，磷酸钙、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、糊精、淀粉、明胶、纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、低熔点蜡和离子交换树脂。在另一个实施方案中，药学上可接受的载体可以是凝胶，并且组合物的形式可以是乳膏等。
载体可以包括一种或多种赋形剂或稀释剂。这些赋形剂的实例是明胶、阿拉伯胶、乳糖、微晶纤维素、淀粉、淀粉羟乙酸钠(sodium starch glycolate)、磷酸氢钙、硬脂酸镁、滑石、胶体二氧化硅等。
然而，在另一优选实施方案中，药学上可接受的载体可以是液体，并且药物组合物的形式是溶液。液体载体用于用于制备溶液、悬浮液、乳液、糖浆、酏剂和加压组合物。根据本发明的活性剂可以被溶解或悬浮于药学可接受的液体载体中，例如水、有机溶剂、两者的混合物或药学上可以接受的油或脂肪。液体载体可含有其它合适的药物添加剂，例如增溶剂、乳化剂、缓冲剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、悬浮剂、增稠剂、着色剂、粘度调节剂、稳定剂或渗透调节剂。用于口服施用的液体载体的合适实例，包括水(部分含有如上所述的添加剂，例如纤维素衍生物、优选羧甲基纤维素钠溶液)、醇(包括一元醇和多元醇，例如二醇)及其衍生物，和油(例如分馏的椰子油和花生油)。
本发明的药物组合物可以以无菌溶液或悬浮液的形式口服施用，所述溶液或悬浮液含有其他溶质或悬浮剂(例如，足够的盐或葡萄糖以使溶液等渗)、胆盐、阿拉伯胶、明胶、脱水山梨糖醇单油酸酯(sorbitan monoleate)、聚山梨醇酯80(山梨糖醇的油酸酯和其与环氧乙烷共聚的酸酐)等。根据本发明的试剂也可以以液体或固体组合物形式口服施用。适用于口服施用的组合物包括固体形式，例如丸、胶囊、颗粒、片剂和粉末，以及液体形式，例如溶液、糖浆、酏剂和悬浮液，包括含有液体形式的胶囊，所有这些都是本领域技术人员已知的。
还可以配制本发明的药物组合物用于直肠施用，包括栓剂和灌肠制剂。在栓剂的情况下，首先融化低熔点蜡，例如脂肪酸甘油酯或可可脂的混合物，并且例如通过搅拌均匀分散活性组分。然后将融化的均匀混合物倒入便携大小的模具中，使其冷却并固化。灌肠制剂可以是半固体，包括凝胶或软膏，或者是液体形式，包括悬浮液、水溶液或泡沫，这些都是本领域技术人员已知的。
在Remington:The Science and Practice of Pharmacy 22nd Edition,Thepharmaceutical Press,London,Philadephia,2013中描述了其它合适的药学载体及其制剂。
本发明的药物组合物可以配制成缓释剂形。“缓释(modified release)”是指剂型是(一种或多种)活性剂的释放速率和/或部位不同于通过相同途径施用的迅速释放的剂型的制剂。通过特殊制剂设计和/或制备方法实现这种修饰。缓释剂型包括口服施用的缓释剂型。延长释放(或长期释放)剂型是在延长的时间段内显示持续释放的缓释剂型。在延迟释放剂型中，在施用或应用剂量后，活性物质的释放被延迟一段时间(延迟也称为滞后时间)。随后的释放可以类似于迅速释放剂型的释放。多阶段(multiphasic)释放剂型包括两阶段释放和脉冲释放。在两阶段释放剂型中，药物释放的第一阶段由在施用后不久提供治疗药物水平的快速释放剂量部分决定；第二长期释放阶段提供维持长时间有效治疗水平所需的剂量部分。脉冲药物释放旨在特定时间间隔时递送大量药物释放。多单位：多单位剂型含有多个单位，例如丸或珠，各自含有释放控制赋形剂，例如，在明胶胶囊中或压缩在片剂中。单一单位：单一单位剂型仅由一个单位组成，例如渗透片。
用于缓释的赋形剂和制剂是本领域已知的，并且具体技术可商购获得。
合适地，配制本发明的药物组合物以将3-HB递送至胃肠道，优选通过口服施用。人胃肠道由从口腔延伸到肛门的消化结构组成，包括食道、胃和肠。胃肠道不包括附属腺体器官，例如肝脏、胆道或胰腺。肠包括小肠和大肠。小肠包括十二指肠、空肠和回肠。大肠包括盲肠、结肠、直肠和肝门。上胃肠道包括口腔、咽、食道、胃和十二指肠。下胃肠道包括十二指肠下方的小肠和大肠。优选地，本发明的药物组合物将3-HB递送至胃肠道的腔或粘膜表面，更有选大肠的腔或粘膜表面，更优选结肠的腔或粘膜表面。优选地，本发明的药物组合物将3-HB递送至胃肠道的厌氧部分，优选结肠和/或末端小肠(回肠)。
已经提出了各种策略用于将口服施用的药物靶向结肠，包括：将药物和载体共价连接，所述载体包括增强稳定性和增加亲水性的那些；用pH敏感型聚合物包衣；制剂的定时释放系统；开发被结肠细菌特异性降解的载体；生物粘附系统；和控制渗透的药物递送系统。已经开发了的各种前药，其旨在递送5-氨基水杨酸(5-ASA)用于IBD的局部治疗。已经研究的可微生物降解的聚合物，尤其是偶氮交联的聚合物，用作靶向结肠药物的包衣。某些植物多糖，如直链淀粉、菊粉、果胶和瓜尔胶，在胃肠酶存在的情况下仍保持不受影响，并且已经被开发为用于结肠-靶向药物递送系统制剂的药物的包衣。另外，植物多糖和甲壳类动物提取物(包括壳聚糖或其衍生物)的组合，提供了开发结肠递送系统的兴趣。
用于缓释制剂的赋形剂的实例，包括能够在水中快速膨胀并在其膨胀结构中保留大量水的水凝胶。不同的水凝胶可以提供不同的药物释放模式，并且已经研究了利用水凝胶促进结肠递送。例如，使用高粘度丙烯酸树脂凝胶、Eudispert hv制备水凝胶和干凝胶，其在长期情况下，在直肠的下部具有优异的保持性能。聚合物(EvonikIndustries)提供不同形式的包衣，包括胃抗性、pH控制药物释放、结肠递送、保护活性物质和来自活性物质的保护。
药物组合物可根据本领域已知的任何技术制备，例如通过将3-HB、一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂和一种或多种缓释赋形剂混合。药物组合物可以通过如下制备：使用本领域技术，用缓释层或包衣将包含3-HB的核和一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂，以及任选一种或多种缓释赋形剂一起包被。例如，可以使用任何已知的压力包衣机，通过压缩形成包衣。或者，药物组合物可通过造粒和团聚技术制备，或使用喷雾干燥技术制备，然后干燥。
通过采用任何上述技术可以精确地控制包衣厚度。技术人员可以选择包衣厚度作为获得理想滞后时间和/或在滞后时间后以所需速率释放药物物质的工具。
pH依赖型系统利用普遍可接受的观点，即人类胃肠道的pH值从胃(其pH可以在约1和2之间，在消化期间pH增加至4)到消化部位小肠(其pH可以在约6和7之间)逐渐增加，在末端回肠增加。用pH敏感型聚合物包衣的片剂、胶囊或丸剂，提供延迟释放并保护活性药物免受胃液的影响。
可配制本发明的药物组合物在特定pH情况下将3-HB递送至胃肠道。可商购的赋形剂包括聚合物，其可以用于将3-HB递送至胃肠道中的特定位置。例如，在十二指肠中的pH可以为约5.5以上。可以使用 L 100-55(粉末)， L 30D-55(水分散体)和/或(粉末)，例如基于 L 100-55作为即用型肠溶包衣。空肠中的pH可以为约6至约7，可以使用 L 100(粉末)和/或 L 12,5(有机溶液)。在pH为约7.0以上的情况下可实现递送至结肠，可以使用 S 100(粉末)、 S 12,5(有机溶液)，和/或 FS 30D(水分散体)。可以使用PlasACRYLTM T20助流剂和塑化剂预混合物，特别是为FS 30D制剂而设计的预混合物。
在pH约5.5或更高，例如约5.6、5.7、5.8或5.9或更高，优选6或更高，例如约6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8或6.9或更高，优选7或更高，例如约7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8的情况下，可配制药物组合物以递送3-HB。优选地，在pH位于约5.5和7之间，约6和7.5之间，或7或8之间的情况下，可配制药物组合物以递送3-HB。在一个实施方案中，在适当的pH情况下，药物组合物释放3-HB或3-HB递送工具，从而将3-HB递送至胃肠道的腔中，优选递送至末端回肠和/或结肠。
空胃服用的药物组合物可能在给药后约5小时到达升结肠，实际到达的时间主要取决于胃排空速率。结肠内的药物递送受到通过该区域推进率的极大影响。在健康男性中，胶囊和片剂平均在20-30小时内通过结肠。溶液和颗粒通常在近端结肠内广泛扩散，并且通常分散在整个大肠中。
可以配制本发明的药物组合物用于时间控制的递送，即在施用后一定时间后(滞后时间)将3-HB递送至胃肠道。
用于时间控制的递送的市售赋形剂包括 RL PO(粉末)、RL 100(颗粒)、 RL 30D(水分散体)和 RL 12,5(有机溶液)。这些赋形剂是不可溶性、高渗透性、pH-非依赖性膨胀赋形剂，其可以通过与 RS以不同比率混合以提供定制的释放谱。 RS PO(粉末)、 RS 100(颗粒)、 RS 30D(水分散体)和 RS 12,5(有机溶液)是不可溶性、低渗透性、pH-非依赖性膨胀赋形剂，其可以通过与 RS以不同比率混合以提供定制的释放谱。 NE 30D(水分散体)、 NE 40D(水分散体)和NM 30D(水分散体)是不可溶性、低渗透性、pH-非依赖性膨胀赋形剂，其可以是基质形成剂。
优选地，可以配制药物组合物在施用后约4小时将3-HB递送至胃肠道。优选地，可以配制药物组合物在施用后约4至48小时将3-HB递送至胃肠道，优选在施用后约5至24小时，例如在施用后约5、10、15、20或24小时；优选在施用后约5至10小时之间、5至15小时之间、5至20小时之间或约10至24小时之间。优选地，药物组合物在进餐之间或与食物一起施用，优选与食物一起施用。在一个实施方案中，药物组合物在滞后时间后释放3-HB。或者，药物组合物在滞后时间后释放3-HB递送工具。
在适当的pH或在滞后时间后，从药物组合物中释放3-HB或3-HB递送工具，可以是迅速释放或是缓释。迅速释放和缓释制剂是本领域技术人员已知的。
可以通过制药工业中已知的方法测量从药物组合物释放3-HB或3-HB递送工具。药物溶出度测试常规用于提供针对质量控制目的(评估固体口服剂型，如片剂，的批次间一致性)和药物开发(预测体内药物释放谱)的关键的体外药物释放信息。溶出度测试可在溶出装置中进行，包括USP溶出装置1-篮(37℃)；USP溶出装置2-浆(37℃)；USP溶出装置3-往复筒(37℃)；USP溶出装置4-流通池(37℃)。
优选地，基本上没有3-HB从药物组合物中释放，直到达到适当的pH和/或直到滞后时间结束。优选地，基本上没有3-HB递送工具从药物组合物中释放，直到达到适当的pH和/或直到滞后时间结束。优选不超过10％/wt的3-HB或3-HB递送工具从药物组合物中释放，优选不超过9、8、7、6、5、4、3、2、或1％/wt的3-HB或3-HB递送工具从药物组合物中释放，直至达到适当的pH和/或直至滞后时间结束。
在具体实施方案中，可以使用Multi Matrix 技术(CosmoPharmaceuticals Inc.)配制药物组合物，优选为片剂。根据技术制造的片剂用pH-抗性丙烯酸共聚物包被，该共聚物延迟释放直到片剂到达程序性溶出开始的指定肠位置，从而保护活性剂免受不利的pH条件和上胃肠道存在的酶的影响。在结肠长度上的缓释不仅简化了患者的施用，而且允许将活性药物成分局部施用于受炎症影响的表面。例如，药物组合物可以配制成Zacol (Cosmo Pharmaceuticals Inc.)片剂，可以包括3-HB钙、麦芽糖糊精、菊粉、山梨糖醇、羟丙甲纤维素、微晶纤维素、改性玉米淀粉、柠檬酸、胶体二氧化硅水合物、滑石、紫胶、硬脂酸镁、硬脂酸、卵磷脂、二氧化钛、羟丙基、柠檬酸三乙酯；香料：香兰素。
在另一个实施方案中，可以将药物组合物配制成胶囊，其含有用钙和镁缓冲的3-HB(3-羟基丁酸、氢氧化钙、氢氧化镁和中链甘油三酯)的，胶囊壳包含羟丙基甲基纤维素，并且包含抗结块剂二氧化硅和硬脂酸镁。胶囊长约2.3厘米。
为了美学目的(例如包括着色剂)、为了稳定目的(例如用防潮层包被)、为了掩盖味道目的、或为了保护3-HB、前药、递送工具和/或赋形剂免受侵蚀性介质影响的目的，药物组合物可以用药学上可接受的薄膜包衣完全包被(over-coated)。优选地，药物组合物可以用胃保护型或肠溶包衣完全包被，例如其代表为丙烯酸和/或A型和/或B型甲基丙烯酸共聚物的混合物(例如，Eudragit S100和/或Eudragit L100)。优选地，由丙烯酸和/或A型和/或B型甲基丙烯酸共聚物的混合物的比率范围为1：5至5：1。胃保护包衣也可任选地包含增塑剂、染料、至少一种水溶剂、至少一种有机溶剂或其混合物。
“前药“是指药物分子的衍生物，其需要在体内转化从而释放活性药物。结肠药物递送策略涉及使用前药，其能被仅在结肠中发现的酶代谢。
生物递送系统
在一个实施方案中，将3-HB递送至胃肠道的药物组合物含有能够产生3-HB的生物递送系统。
“生物递送系统”是指生物试剂，例如微生物试剂，优选可以口服施用并能够产生3-HB的细菌试剂。优选地，生物递送系统可以是能够产生3-HB的遗传工程化厌氧细菌。该细菌可以产生3-HB作为唯一的发酵产物或与短链脂肪酸(SCFA)例如乙酸盐和/或丁酸盐的组合。
本发明的组合物可包含产生3-HB的遗传工程化厌氧细菌和可口服摄入的载体。该组合物可以向对象递送3-HB。一旦口服摄入，细菌随后将在对象中生长，并产生和分泌3-HB至胃肠道的厌氧部分。当细菌经过肠道或当它附着在上皮/粘膜细胞壁内层(cell walllining)时，细菌可以分泌3-HB。
细菌可以是厌氧细菌。厌氧细菌是能够在氧气限制(缺氧)环境下或完全氧气耗尽(无氧)环境中存活的细菌。这些包括专性厌氧菌，这些细菌会由于氧气的存在而受到伤害，并且这些细菌只能在厌氧(没有氧气)环境中生长；耐氧细菌，可以在有氧环境(含氧)中存活，但不能用分子氧作为它们呼吸途径中的末端电子受体；和兼性厌氧菌，它们可以在有氧和厌氧环境中存活，并且取决于它们优选电子受体的可得性，可以用分子氧或其他分子作为呼吸途径中的末端电子受体。优选地，细菌是专性厌氧菌。
在一个实施方案中，细菌是梭菌纲(Clostridia)。引入能够表达(R)-3-HB脱氢酶((R)-3-HBD))的非天然基因导致梭菌纲菌株可以产生(R)-3-HB。工程化的梭菌纲产生(R)-3-羟基丁酰基-CoA。如果存在天然PTB和BUK酶，可以将(R)-3-羟基丁酰基-CoA转化为(R)-3-HB。(R)-3-HB被分泌至肠道中。
天然产生丁酸盐作为主要发酵产物的梭菌纲现在已经应用于产生(R)-3-HB代替丁酸盐或产生与丁酸盐的组合。梭菌纲也可以产生其他有用的发酵产物，例如乙酸盐、丙酸盐、维生素和细菌素。
作为天然肠道微生物群的一部分的细菌是优选的，即这些细菌天然存在于肠道中。天然产生丁酸盐的细菌也是优选的。梭菌纲是包含在组合物中的一类优选细菌。梭菌纲可包括但不限于梭菌科(Clostridiaceae)、Christensenellaceae、真杆菌科(Eubacteriaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、瘤胃球菌科(Ruminococcacea)。优选地，存在的细菌来自梭菌纲的第I、IV和/或XIVa簇。优选地，该细菌是在下胃肠道中经常检测到的梭菌纲。例如，在下胃肠道中检测到的物种包括：来自梭菌属(Clostridium)(第1簇)的细菌，包括在组合物中的优选物种包括但不限于，丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)、C.arbusti、桔黄丁酸梭菌(C.aurantibutyricum)、拜氏梭菌(C.beijerincki)、噬细胞梭菌(C.cellulovorans)、解纤维素梭菌(C.cellulolyticum)、热解纤维梭菌(C.thermocellum)、热丁酸梭菌(C.thermobutyricum)、巴氏梭菌(C.pasteurianum)、科氏梭菌(C.kluyveri)、诺氏梭菌(C.novyi)、糖丁酸梭菌(C.saccharobutylicum)、热产琥珀酸梭菌(C.thermosuccinogenes)、热棕榈梭菌(C.thermopalmarium)、解糖梭菌(C.saccharolyticum)、C.saccharoperbutylacetonicum、酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)、假破伤风梭菌(C.tetanomorphum)、大梭菌(C.magnum)、扬氏梭菌(C.ljungdahlii)、C.autoethanogenum、丁酸梭菌(C.butyricum)、浅紫色梭菌(C.puniceum)、C.diolis、5同型丙酸梭菌(C.5homopropionicum)和/或玫瑰色梭菌(C.roseum)；
来自Christensenellaceae、真杆菌科(Eubacteriaceae)和毛螺菌科(Lachnospiraceae)属(第XIVa簇)的细菌，包括在组合物中的优选物种包括但不限于，Roseburia intestinalis、Roseburia bromii、直肠真杆菌(Eubacterium rectale)、霍氏真杆菌(Eubacterium hallii)、Anaerostipes spp.和/或丁酸弧菌属物种(Butyrivibriospp)和/或粪球菌属物种(Coprococcus spp)；和来自瘤胃菌科(Ruminococcacea)属(第IV簇)的细菌，包括在组合物中的优选物种包括但不限于Faecalibacterium prausnitzi。
优选地，组合物中的物种是丁酸梭菌(C.butyricum)。
优选地，梭菌纲是丁酸盐生产者。熟知的梭菌丁酸盐的生产者包括，Anaerostipesspp.、丁酸弧菌属物种(Butyrivibrio spp)、粪球菌属物种(Coprococcus spp.)、Roseburia spp、直肠真杆菌(Eubacterium rectale)和霍氏真杆菌(Eubacterium hallii)相关物种。
优选地，在组合物中的梭菌属物种能够形成孢子，优选丁酸梭菌(C.butyricum)。在优选地实施方案中，菌株是DSM10702和ATCC19398。
工程化的细菌可包含能够表达(R)-3-HBD的非天然基因。能够表达(R)-3-HBD(EC1.1.1.36)的基因，选自但不限于来自以下生物体的基因，包括：富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)、钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)、芽孢杆菌属物种(Bacillussp)、克雷伯氏菌属物种(Klebsellia sp)、假单胞菌属物种(Pseudomonas sp)，例如phbB和phaB。
合适的基因包括UniProt登录号P14697(PHBB_CUPNH)、P50203(PHAB_ACISR)、A0A060V147(A0A060V147_KLESP)、C1D6J5(C1D6J5_LARHH)、F8GXX8(F8GXX8_CUPNN)、F8GP10(F8GP10_CUPNN)、G0ETI7(G0ETI7_CUPNN)、A9LLG6(A9LLG6_9BACI)、A0A0E0VPS5(A0A0E0VPS5_STAA5)、D5DZ99(D5DZ99_BACMQ)、和V6A8L4(V6A8L4_PSEAI)。
在一个实施方案中，(R)-3-HBD基因是phaB。可以针对所使用的特定梭菌属物种，对phaB基因序列进行密码子优化。phaB序列可以包含如图2所示的序列(SEQ ID NO:1)。
编码非天然(R)-3-HBD的核酸可包含与图2的phaB序列(SEQ ID NO:1)具有至少为60％、70％、80％、90％或99％序列相同性的序列。
有许多方法可以确定两个序列之间的相同性。用于确定序列之间相同性的优选计算机程序包括但不限于BLAST(Atschul et al,Journal of Molecular Biology,215,403-410,1990)。优选地，使用计算机程序的默认参数。
在梭菌纲中，天然酶可以催化3-羟基丁酸盐还原酶反应。因此，在一个实施方案中，梭菌属物种包含编码能够将(R)-3-羟基丁酰基-CoA转化为(R)-3-HB的酶的基因。
天然酶，例如PTB和BUK，通过(R)-3-羟基丁酸盐-磷酸盐，将(R)-3-羟基丁酰基-CoA转化为(R)-3-HB。因此，遗传工程化细菌可具有编码PTB和BUK的天然基因和编码(R)-3-HBD的非天然基因。
梭菌属物种还可以包含其他非天然基因，例如编码PTB、BUK、PCT和/或BUT的那些基因。
梭菌属物种可包含一种或多种编码能够将(R)-3-羟基丁酰基-CoA转化为(R)-3-HB的还原性酶的非天然基因，例如ptb和buk。这些基因可以来自生物体，包括但不限于芽孢杆菌(Bacillus)物种、大肠杆菌(E.coli)、或来自其他梭菌纲物种。
此外，梭菌属物种可包含一种或多种天然或非天然编码产生SCFA的酶(例如PCT或BUT)的基因。例如，可以将来自丙酸梭菌(Clostridium propionicum)的PCT工程化到菌株中，以催化(R/S)-3-羟基丁酸盐-CoA和乙酸盐之间的CoA转移反应。
术语“非天然基因”是指不在其天然环境中的基因，并且包括来自一种微生物物种的基因，所述基因被引入同属的另一物种中。
非天然基因可以针对梭菌纲进行密码子优化和/或将非天然基因置于启动子的控制下，所述启动子在梭菌纲中实现基因的可控表达。可以通过用诱导型启动子和/或具有不同强度的启动子控制基因表达来优化酶的表达水平。在一个实施方案中，将非天然基因置于天然梭菌纲启动子的控制下，例如铁氧化还原蛋白或硫解酶启动子。其他合适的启动子是本领域技术人员已知的。
可通过本领域已知的产生重组微生物的标准质粒转化技术，即接合或电穿孔，将非天然基因引入梭菌属菌株中。仅举例来说，通过接合实现质粒转化。
可以使用本领域技术人员已知的基因整合技术将非天然基因(包括(R)-3-HBD)整合到梭菌纲的染色体中。
梭菌纲是具有发酵代谢的厌氧细菌，其天然地将碳水化合物转化为多种还原型发酵产物。该细菌具有独特的代谢途径和生物化学，以产生三碳或四碳(C3/C4)化学品。
遗传工程化梭菌属菌株的代谢途径详见图1B。遗传工程化梭菌物种携带异源(R)-3-HBD(图1B中的酶A)，其将乙酰乙酰基-CoA转化为(R)-3-羟基丁酰基-CoA。(R)-特异性3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶与天然HBD酶竞争底物(乙酰乙酰基-CoA)。天然的巴豆酸酶(Crt)酶对3-羟基丁酰基-CoA的(R)-型没有或仅具有低活性，使得(R)-3-羟基丁酰基-CoA通过天然酶(例如PTB和BUK或BUT)转化为(R)-3-HB。酶PTB和BUK对R型是特异性的，并且通过(R)-3-羟基丁酰基-磷酸盐将(R)-3-羟基丁酰基-CoA转化为(R)-3-HB。
使用的途径将取决于梭菌属物种。在一些物种中，通常是在包括梭菌属(包括丁酸梭菌)的梭菌科(Clostridiaceae)(第I簇)中发现的那些物种，最后一步需要两种酶PTB和BUK。在其他物种中，通常是在毛螺菌科(Lachnospiraceae)(第XIVa簇)和瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)家族(第IV簇)中发现的那些物种，最后一步需要一种酶BUT。一些梭菌纲携带两种系统的酶，允许它们将(R)-3羟基丁酰基-CoA转化为(R)-3-HB。
如果PTB、BUK和/或BUT不存在于天然益生菌菌株中，那么编码这些酶的异源基因可以在工程菌株中表达。
在遗传工程化厌氧细菌中产生(R)-3-HB的另一途径是通过引入另外的编码例如硫酯酶的非天然基因，即来自大肠杆菌(E.coli)的TesB。这些酶可以分别将(S)-和(R)-3-羟基丁酰基-CoA转化为(S)-和(R)-3-HB。
梭菌属益生菌可以通过在适合细菌生长的条件下进行的发酵来制备。发酵后，可以使用离心纯化细菌，并制备以保持活性。以活生物体提供组合物种中的细菌。该组合物可以包含细菌孢子和/或营养细胞。可以干燥细菌以保持细菌的活性。合适的干燥方法包括冷冻干燥、喷雾干燥、加热干燥及其组合。然后将获得的粉末与一种或多种如本文所述的药学上可接受的赋形剂混合。
如本文所述，孢子和/或营养细菌可以与通常用于口服施用的赋形剂和组分一起配制。具体来说，在制药和食品补充剂工业中常见的脂肪和/或含水组分、保湿剂、增稠剂、防腐剂、变形剂(texturing agent)、增味剂和/或包衣剂、抗氧化剂、防腐剂和/或染料。合适的药学上可接受的载体包括微晶纤维素、纤维二糖、甘露糖醇、葡萄糖、蔗糖、乳糖、聚乙烯吡咯烷酮、硅酸镁、硬脂酸镁和淀粉，或其组合。然后，如本文所述，细菌可以形成合适的可口服摄入形式。益生菌的合适的可口服摄入形式可以通过制药工业中熟知的方法进行制备。
在一个实施方案中，产生3-HB的厌氧细菌可以以很广的浓度范围存在于药物组合物中，条件是细菌以足以提供所需的治疗效果的量存在。优选地，细菌以相当于干燥组合物的1x105到1x1010菌落形成单位/g(CFU/g)之间的量存在于药物组合物中，更优选地，细菌以相当于干燥组合物的1x108到1x1010菌落形成单位/g(CFU/g)之间的量存在。当组合物为片剂形式时，细菌可以以每片2x105到6x107CFU的量存在，优选每片约3x105到5x107CFU。优选地，细菌在结肠中生长和代谢，并向肠道的腔递送约1μm到10mM的3-HB，优选在约100μm到5mM之间，优选约1mM。
“递送3-HB”是指3-HB在对象的特定部位可得，使得3-HB显示出对治疗炎性疾病、病症或病况的治疗效果。可以将3-HB递送至对象的特定炎症部位，使得3-HB可得以具有局部治疗效果。优选地，本发明的药物组合物将3-HB递送至炎性疾病、病症或病况的部位，并且具有局部治疗效果。例如，3-HB可以从直肠直接递送至炎症部位；3-HB可以从口服剂型(如本文所述的胶囊或片剂)释放；或3-HB可以从3-HB递送系统(如在炎症部位产生3-HB的前药或生物递送系统)中释放。
应该施用的3-HB的治疗有效量取决于所使用的3-HB(例如(R)-与(S)异构体的比率)、所治疗的对象、痛苦的严重程度和类型、以及施用的方式和途径。
考虑到递送的3-HB的量，治疗有效量可以从约0.1mg每千克(kg)体重到约500mg每千克(kg)体重，例如，约1mg到约250mg每千克体重，例如，约10mg到约180mg每千克体重，例如约20mg到约150mg每千克体重，例如约60mg到约125mg每千克体重。例如，治疗有效量可以从约10mg到约40g，例如从约80mg到约20g，例如从约100mg到约15g，例如从约1g到约12g，例如从约5g到约10g。
对于口服施用，治疗有效量可以从约10mg到约20g，例如从约50mg到约20g，例如从约100mg到约20g，例如从约100mg到约10g，例如从约500mg到约10g，例如从约500mg到约5g，例如从约500mg到约2g，例如从约1g到约15g，例如从约1g到约10g，例如从约1g到约8g，例如从约1g到约2g，例如从约1g到约4g，例如从约2g到约4g，例如从约2g到约6g，例如从约4g到约8g，例如从约4g到约6g，例如从约5g到约10g，例如从约6g到约10g，例如从约6g到约8g，例如从约8g到约12g，例如从约8g到约10g，例如从约10g到约14g，例如从约10g到约12g，例如从约10g到约20g。在优选的实施方案中，治疗有效量可以从约10mg到约50g，例如从约10mg到约30g，例如从约50mg到约30g，例如从约100mg到约30g，例如从约100mg到约15g，或例如从约500mg到15g。在另一个优选的实施方案中，治疗有效量可以从1g到50g，例如从5g到50g，例如从10g到40g，例如从1g到30g，例如从5g到30g，例如从3g到25g，例如从1g到20g，例如从5g到20g，例如从1g到10g，例如从20g到30g，例如从30g到40g，例如从5g到15g。
每剂的治疗有效量可以是几个单位剂量。单一固体单位剂量可含有，例如，从约50mg到约3g，例如从约100mg到约2g，例如从约250mg到约2g，例如从约500mg到约2g，例如从约250mg到约1g，例如从约500mg到约1g，例如100mg到500mg，例如100mg到1g，例如100mg到2g，例如250mg到2g，例如250mg到1g，例如500mg到2g，例如500mg到1g，例如1g到3g，例如1g到2g。可提及的具体单位剂量是约1.5g、1.6g、1.7g、1.8g、1.9g和2g，优选约1.8g；或约300mg。
以上讨论的剂量的量可以给与例如每天一次、两次、三次或四次或每周一次或两次；优选每天三次。例如，对于口服施用，每日总剂量可以给与从30mg到约120g，例如从约240mg到约60g，例如从约300mg到约45g，例如从约3g到约36g，或例如从约15g到约30g。在一个优选地实施方案中，口服施用的每日总剂量为，例如从约1g到约50g，例如从约1g到约30g，例如从约5g到约30g，例如从约5g到约25g，例如从约5g到约15g，优选从约5g到约10g。优选地，每天三次施用约1.8g。
剂量可以作为餐食或零食或液体的一部分施用，其中向对象提供干燥剂量以与餐食、零食或液体(例如水或果汁)混合或组合。
根据本发明，3-HB可以与一种或多种另外的治疗试剂组合施用。施用包括施用包含3-HB和一种或多种另外的治疗试剂的制剂，或基本上同时、顺序或分开施用3-HB和一种或多种另外的治疗试剂的单独制剂。在一个实施方案中，3-HB递送工具还将一种或多种另外的治疗试剂递送至胃肠道的腔中，优选地，其中所述另外的治疗试剂是丁酸盐。
本发明还包括治疗对象的炎性疾病、病症或病况的方法。
治疗方法包括向对象施用3-HB，其目的是改善疾病、病症或病况(即，减缓或阻止或减少疾病、病症或病况或至少其临床症状之一的发展)；缓解或改善至少一种生理参数，包括那些患者可能无法辨别的生理参数；调节疾病、病症或病况，在身体上(例如稳定可辨别症状)、生理上(例如稳定生理参数)或两者；或预防或延迟疾病或病症或其临床症状的发作或发展或进展。
如果对象从这种治疗中在生物学、医学或生活质量方面受益，那么对象需要治疗。治疗通常由医师执行，该医师将会施用治疗有效量的3-HB。适当地，对象是人类。
治疗有效量的3-HB是指对上述治疗有效的量，例如减缓、阻止、减少或预防疾病、病症或病况或其症状。通常地，有此需要的对象是表现出疾病、病症或病况症状的对象。或者，对象可能对疾病、病症或病况易感，或者已经被检测为疾病、病症或病况阳性但尚未表现出症状。
优选地，所施用的治疗有效量的3-HB在胃肠道(优选在结肠)腔中，提供的3-HB的浓度为约1μM和约10mM之间，优选地，约100μM和约5mM之间，优选约1mM。
炎性疾病、病症或病况的特征在于促炎细胞因子或蛋白质的升高，和/或抗炎细胞因子或蛋白质的水平不足；特别是参与炎性疾病、病症或病况的那些，特别是胃肠道中的炎性疾病、病症或病况，包括IBD，例如克罗恩病和溃疡性结肠炎，以及结肠直肠癌。优选地，炎性疾病、病症或病况的特征在于一种或多种，优选2、3、4、5、6或更多或全部的TNF-α、IL-23、IL-6、IL-1β、IL-12、MMP9和NF-κB水平升高；优选IL-23水平升高。优选地，炎性疾病、病症或病况的特征在于实现和保持适当的免疫应答的IL-10和/或TGF-β1的水平不足。优选地，炎性疾病、病症或病况的特征在于2、3、4、5、或更多或全部的TNF-α、IL-23、IL-6、IL-1β、IL-12、MMP9水平升高，以及实现和保持适当的免疫应答的IL-10和/或TGF-β1的水平不足；优选地，特征在于TNF-α、IL-23、IL-6、IL-1β、IL-12、MMP9水平升高，以及IL-10和/或TGF-β1的水平不足，任选地，进一步的特征在于NF-κB的水平升高。
炎性疾病、病症或病况的进一步特征在于IL-8、IL-18、IL-18结合蛋白、IL-16、胱天蛋白酶-1、IL-1α、IL-17A和RANTES(CCL5)、IL-22和IL-27的一种或多种的水平升高和/或水平不足。
炎性疾病、病症或病况可以是IBD，例如克罗恩病、溃疡性结肠炎、隐窝炎、胶原性结肠炎和淋巴细胞性结肠炎、结肠直肠癌、类风湿性关节炎、多发硬化症、银屑病、银屑病性关节炎、痛风、强直性脊柱炎或COPD。
优选地，炎性疾病、病症或病况是胃肠道的，优选大肠的，更优选结肠的炎性疾病、病症或病况。优选地，炎性疾病、病症或病况是IBD，优选克罗恩病或溃疡性结肠炎，或结肠直肠癌。
本发明还涉及包含生物递送系统的组合物，例如如本文所述的，能够产生(R)-3-HB的遗传工程化厌氧细菌，它们在胃肠疾病和病症的治疗中以及为了动物健康，用作益生菌。
细菌可以与常用赋形剂和组分一起配制，对于这种口服组合物，即具体来说是在制药和食品补充剂工业中常见的脂肪和/或含水组分、保湿剂、增稠剂、防腐剂、变形剂、增味剂和/或包衣剂、抗氧化剂、防腐剂和/或染料。合适的药学上可接受的载体包括微晶纤维素、甘露醇、葡萄糖、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉，或其组合。然后细菌可以形成合适的可口服摄取形式。益生菌的合适的可口服摄取形式可以利用制药工业中已知的方法制备。口服施用的组合物可以配制成的形式为，例如包衣片、凝胶胶囊、凝胶、乳液、片剂、胶囊、水凝胶、食物棒、紧密或散装粉末、液体悬浮液或溶液、糖果产品或食品载体。优选地，组合物是干燥形式。组合物的优选口服形式是固体形式，例如胶囊、片剂或粉末。
可以通过常规方法来配制组合物以产生口服制剂，特别是包衣片、凝胶胶囊、凝胶、乳液、片剂、胶囊、水凝胶和粉末。
可口服摄取载体的也可以是食品，例如饮料、酒水、食品补充剂或营养品。
产生(R)-3-HB的遗传工程化厌氧细菌也可以作为食品的一部分掺入，即在酸奶、牛奶或豆奶中，或作为食品补充剂。这些食品和食品补充剂可以利用食品和补充剂工业中已知的方法制备。
该组合物可以作为饲料添加剂掺入动物饲料产品中。
该组合物还可以用于预防或治疗生态失调。使用广谱抗生素会导致胃肠生态失调。该组合物可以用于治疗和预防施用抗生素引起的生态失调。
在生态失调期间，对象对机会性致病微生物，包括艰难梭菌(C.difficile.)易感。该组合物可用于治疗或预防细菌感染。在本发明的一个实施方案中，该组合物可用于治疗或预防艰难梭菌的感染。
包含产生(R)-3-HB的遗传工程化厌氧细菌的组合物也可用于调节对象的肠道菌群。将包含或基本上由产生(R)-3-HB的遗传工程化厌氧细菌组成的组合物施用于健康的对象，即用于非治疗用途。该组合物可以通过口服施用给对象。
遗传工程化细菌在肠道中定殖的生长和程度可以通过物种和菌株的选择和/或通过提供作为细菌生长依赖的特定食物的益生元(其在含有益生菌的相同剂量中或者作为单独的摄取组合物)而得到控制。
该组合物还可以进一步包含益生元，以增强所施用的益生菌的生长。益生元可与包含产生(R)-3-HB的遗传工程化厌氧细菌的组合物顺序、同时或分开施用。益生元和遗传工程化细菌可以一起配制进相同的组合物中，用于同时施用。或者，细菌和益生元可以分别配制用于同时或顺序施用。
益生元是促进肠益生菌生长的物质。它们是被细菌在肠道中发酵的食物物质。益生元的添加提供了可促进肠中益生菌菌株生长的培养基。可以使用一种或多种增强细菌生长的单糖、寡糖、多糖或其他益生元。
优选地，益生元可以选自以下：寡糖(任选地含有果糖、半乳糖、甘露糖)；膳食纤维，特别是可溶性纤维、大豆纤维；菊粉；或其组合。优选的益生元是果糖寡糖(FOS)、半乳糖寡糖(GOS)、异麦芽糖寡糖、木糖寡糖、大豆寡糖、糖基蔗糖(GS)、乳蔗糖(LS)、乳果糖(LA)、palatinose-寡糖(PAO)、麦芽糖寡糖、果胶、其水解产物或其组合。
从细菌分泌的(R)-3-HB可以在肠道的腔内和/或肠的粘膜层内发挥局部作用，例如通过充当微生物生长的增强剂和/或抑制剂来调节肠道菌群。
本文(包括任何所附权利要求、摘要和附图)所描述的所有特征和/或所公开的任何方法的所有步骤，可以以任何组合与上述方面组合，除了这些特征和/或步骤中的至少一些是相互排斥的组合。特别地，本文所述的任何活性剂和组合物均可用于所述的任何治疗方法中。任何和所有这样的组合都被明确地设想为形成本发明的一部分。
实施例
现在将参考以下实施例进一步详细解释本发明。
实施例1–在表达phaB的丁酸梭菌(C.butyricum)中产生(R)-3-HB
1)遗传合成
将钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)phaB基因针对梭菌纲进行密码子优化。图2展示了由Gene (Thermo Fisher Scientific)合成的一个密码子优化的序列的实例。
2)质粒组装
使用标准的克隆技术将phaB克隆到质粒pMTL83251上，使其在生孢梭菌(C.sporogenes)Pfdx启动子的控制下，得到质粒pMTL83251_pfdx_phaB(见图3)。
3)菌株发育
使用大肠杆菌(E.coli)CA434作为接合供体，将质粒pMTL83251_pfdx_phaB接合到丁酸梭菌(Clostridium butyricum)ATCC19398/DSM10702中。采用菌株特异的接合方案。简而言之，使用携带质粒pMTL83251_pfdx_phaB的大肠杆菌CA434和丁酸梭菌的过夜培养物分别接种至9ml LB和RC培养液中。生长培养物直至OD600达到0.5-0.7。离心沉淀1ml的E.coli培养物，将沉淀与200μl热激的(50℃10分钟)丁酸梭菌培养物混合。将细胞混合物点在非选择性的RCM平板上并孵育过夜。将孵育的培养物在500μl的新鲜RCM中重悬，然后铺板于含有20μg/ml红霉素的选择性培养基上。使用质粒特异性引物通过PCR确认获得的转化接合子中质粒的存在。
4)丁酸梭菌的发酵数据
生长方法
使用每1L含有：酵母提取物13g、蛋白胨10g、可溶性淀粉1g、氯化钠5g、乙酸钠3g、盐酸半胱氨酸0.5g、碳水化合物2％的RC培养液。液体培养物中加入10g/L碳酸钙用于调节pH。固体培养基含有15g/L的琼脂。
转化子在种子培养物(RC培养液)中37℃生长过夜。将含有2％葡萄糖的100ml RC培养液接种至起始OD为0.05-0.1。在必需的抗生素存在的情况下，菌种在37℃中厌氧生长。定期取样用于代谢分析。
分析和结果
使用3-HB测定试剂盒(Sigma Aldrich)对工程化丁酸梭菌(CHN-1)培养物的上清液中的(R)-3-HB和(S)-3-HB进行分析。表达phaB的菌株只产生(R)-3-HB。使用HPLC-RI对CHN-1和天然丁酸梭菌培养物的上清液中SCFA和(R)-3-HB的产生进行分析。如图4B所示，24小时生长后，丁酸梭菌(CHN-1)的phaB表达菌株产生约187g/L。如图4A所示，野生型丁酸梭菌菌株只产生了丁酸盐和乙酸盐。
实施例2–结肠递送制剂
Zacol 是一种基于技术并针对结肠的膳食补充剂(营养品)。它是基于将技术应用到丁酸钙盐和菊粉的组合的产品。是技术的营养品版本。片剂含有3-HB钙(0.307g)、麦芽糖糊精、菊粉(0.250g)、山梨糖醇、羟丙甲纤维素、微晶纤维素、改良玉米淀粉、柠檬酸、胶体二氧化硅水合物、滑石、紫胶、硬脂酸镁、硬脂酸、卵磷脂、二氧化钛、羟丙基、柠檬酸三乙酯；香料：香兰素。
BioCare形式。胶囊含有1815mg 3-HB、243mg氢氧化钙、123mg氢氧化镁、中链甘油三酯、胶囊壳(羟丙基甲基纤维素)、抗结块剂(二氧化硅和硬脂酸镁)。胶囊每天三次与食物一起服用，或者按专业指导服用。
实施例3–细菌递送
丁酸梭菌的孢子形成
使用与发酵相同的培养基和接种技术。在实验开始和之后的72个小时内定期取样以测定营养细胞和孢子的比率。为了对孢子进行计数，将样品在65℃加热处理30分钟以杀死任何营养细胞。同时，将用于计数总CFU计数(营养细胞+孢子)的样品置于工作台上以防止在培养基中进一步的生长。然后将加热处理的和非加热处理的样品进行连续稀释，将野生型在非选择性培养基上铺板成20μl的离散点，并将工程菌株在选择性培养基上铺板成20μl的离散点，重复三次。37℃厌氧过夜孵育后，测定CFU/ml。图5A-B显示了72小时内孢子的发育。图6显示了72小时内培养物中总CFU中孢子的百分比。
片剂制剂包括玉米淀粉、乳糖、水合硅酸镁、微晶纤维素、硬脂酸镁和蔗糖。
实施例4–在模拟的结肠环境中评估CHN-1
使用pH控制实验室规模的生物反应器生产工程化丁酸梭菌(CHN-1)的孢子。在接种到生物反应器前，在37℃的充满氮气和二氧化碳的厌氧工作站中操作菌株。
在Reinforced Clostridial琼脂(Sigma-Aldrich,UK)平板上从孢子原种(stock)生长CHN-1。使用单个菌落接种到改良的Reinforced Clostridial(RC)培养液(每升含：酵母13g，蛋白胨10g，淀粉1g，氯化钠5g，乙酸钠3g，盐酸半胱氨酸0.5g，碳酸钙10g，葡萄糖20g)，接下来在改良的RC培养液中连续稀释至100-10-8。8-12小时后，在新鲜的改良的RC培养液中从生长的培养物上的最高稀释(通常是10-6)制备1:10的稀释物到日培养物。日培养物通常在转移到血清瓶前生长1.5-2小时。用橡皮塞盖住血清瓶以维持厌氧环境。使用血清瓶中的细菌培养物以1:10稀释后接种到生物反应器中。生物反应器中含有的改良的RC根据需要使用3M无菌KOH将pH控制在6.5，以125rpm搅拌，并以6L/h的氮气充满。生物反应器始终保持在37℃。24小时后收获细胞群(cell mass)，在纯化前4℃保存。营养细胞通过65℃加热处理被破坏。纯化需要使用无菌去离子水重复洗涤的步骤，并以5000xg离心20分钟。使用改进的Neubauer计数室对孢子进行计数，并通过RC琼脂上的菌落形成单位评估活孢子的计数。
使用Molly等人(1993)Appl Microbiol Biotechnol所述的模拟近端大肠对CHN-1孢子在结肠环境中萌发和生长的能力进行评估。将还原糖预耗尽的基础结肠培养基(含有存在于结肠中的营养物(例如宿主或饮食衍生的聚糖如粘蛋白或淀粉))加入双夹套玻璃生物反应器中。将CHN-1孢子和/或粪便接种物添加到厌氧工作站中的生物反应器中。粪便接种物是通过将新鲜的粪便样品与预还原的磷酸盐缓冲液以1:5混合并通过500xg离心除去颗粒物，由单个健康供体的粪便供体材料来制备的。然后将该接种物以1:10的稀释加入生物反应器中。用橡胶塞密封生物反应器以维持厌氧环境。
该实验需要4种不同的条件并重复三次：i)用过滤灭菌的粪便悬浮液和CHN-1接种；ii)用过滤灭菌的粪便悬浮液、CHN-1和葡萄糖(1g/L)接种；iii)用粪便悬浮液和CHN-1接种；iv)用粪便悬浮液接种。将生物反应器保持在37℃并以90rpm持续搅拌。在接种后分别在t＝0、2、4、6、24、30和48小时取出样品用于分析。
孢子的萌发，CHN-1的生长和代谢活性通过以下进行评估：1)选择性培养基上的菌落形成单位；2)pH的降低；3)SCFA的产生；4)(R)-3-HB的产生；5)使用两种特异性PCR方案进行CHN-1的检测，以检测丁酸梭菌16s-23s基因间隔区和检测phaB。
1)如Popoff(1984)J Clin Microbiol所述，使用浓度250μg/mL的D-环丝氨酸作为唯一的抗生素，在改良的丁酸梭菌(C.butyricum)分离培养基(BIM)上评估菌落形成单位。该培养基允许CHN-1的选择性计数，在没有补充该菌株的情况下在背景中没有观察到菌落(检测阈值200CFU/mL)。通过连续稀释样品并铺板到改良的BIM上来评估总的活菌计数(图7)。在厌氧条件中孵育过夜后，进行菌落形成单位计数。通过在65℃对样品进行巴氏杀菌30分钟，然后连续稀释并铺板到改良的BIM上来评估耐热菌株的计数(图8)。在厌氧条件下孵育过夜后，进行菌落形成单位计数。
如图7所示，在接种过滤灭菌的粪便悬浮液和CHN-1的反应器(含有或不含葡萄糖)中，总的活菌计数之间没有显著差异。在接种CHN-1和粪便悬浮液的生物反应器中，实验的前6小时总活菌计数稳定增加，表明CHN-1的萌发和生长。24小时后与接种粪便悬浮液的相比，接种过滤灭菌的粪便悬浮液的生物反应器中的CHN-1总活菌计数数量统计学显著性更高(p<0.05)，表明在这些生物反应器中粪便微生物群与CHN-1之间存在竞争。未接种CHN-1的生物反应器未检测到高于检测阈值的任何CFU。
如图8所示，接种过滤灭菌的粪便悬浮液和CHN-1的生物反应器(含有或不含葡萄糖)中，耐热菌的计数没有显著差异。在孵育4到24小时之间，所有生物反应器中的耐热菌计数都稳定下降，表明孢子的萌发和生长导致营养细胞生长。
2)使用Senseline F410pH计(ProSense，Oosterhout，NL)在t＝0、6、24和48小时测量结肠模拟内代谢活性引起的pH降低(图9)。
如图9所示，在实验开始时，四个实验装置的pH没有显著差异。在实验过程中的任何时间接种过滤灭菌的粪便接种物和CHN-1的生物反应器的pH也没有显著差异，接种粪便悬浮液和CHN-1的生物反应器的pH值也没有显著差异。然而，当从时间点6小时以后比较添加葡萄糖或者不添加葡萄糖的那些时，接种过滤灭菌的粪便悬浮液和CHN-1的生物反应器中pH存在统计学显著差异(p<0.02)。当在时间点6小时和24小时比较添加CHN-1和不添加CHN-1的那些时，接种粪便悬浮液的生物反应器之间的pH也存在统计学显著差异(分别为p＝0.003和0.0133)。这表明在用过滤灭菌的粪便悬浮液以及粪便悬浮液滴注前6小时内的情况下，CHN-1在各自的背景中具有代谢活性。
3)如De Weirdt等人(2010)FEMS Microbiol Ecol所述，通过气相色谱法测量SCFA乙酸盐(图10)和丁酸盐(图11)的产生。
如图10所示，从孵育6小时后直至实验结束，与仅接种粪便接种物的那些生物反应器相比，接种粪便接种物和CHN-1的生物反应器中的乙酸盐浓度统计学显著地增加(p<0.04)。从时间点24小时以后，与含有过滤灭菌的粪便悬浮液和CHN-1的那些生物反应器相比，含有粪便接种物和CHN-1的生物反应器中的乙酸盐量也显著更高(p<0.003)。
如图11所示，在整个实验中，与仅接种粪便悬浮液的那些生物反应器相比，接种粪便接种物和CHN-1的生物反应器中丁酸盐浓度统计学显著地增加(p＝0.0001)。含有CHN-1的生物反应器(有或没有粪便悬浮液)之间没有显著差异。在那些补充了葡萄糖作为丁酸盐产生前体的反应器中发现最大量的丁酸盐(p<0.04)。
4)在Dionex UltiMate 3000系统(Thermo Scientific，USA)(设定为35℃，运行时间为55分钟)上使用具有9μm粒度的300mm×7.8mm的Aminex HPX-87H柱(Biorad，USA)通过HPLC-RI测量结肠模拟中的(R)-3-HB的产生。使用5mM H2SO4作为流动相，流速为0.5mL/min。在分析之前，使用具有孔径0.22μm的常规纤维素的直径为13mm的KX注射器过滤器(KinesisLtd，UK)对培养物样品进行过滤灭菌。在将样品与作为内参的含有50mM戊酸酯的流动相以1:1混合之前，将已知量的(R)-3-HB掺入样品中。含有增加浓度的葡萄糖、(R)-3-HB、丁酸盐、乙酸盐和乳酸盐的校准标准品与掺入的样品同时运行。
如图12A所示，与不含葡萄糖的生物反应器相比，在接种过滤灭菌的粪便悬浮液、CHN-1和葡萄糖的生物反应器中产生显著更高量的(R)-3-HB。与仅接种粪便悬浮液的生物反应器相比，在接种CHN-1的任何生物反应器中存在显著更高量的(R)-3-HB(p<0.03)。这表明所有生物反应器中(R)-3-HB的产生依赖于CHN-1的存在。
图12B显示了对图12A的第三实验条件(接种粪便悬浮液和CHN-1)进行的三次重复实验中每一次测量的(R)-3-HB浓度。这三个值被组合并展示在图12A中。在进食条件下，所有三次重复中检测到的(R)--3-HB在人血清中发现的基线浓度(0-200μM)以上。一个生物反应器中显示了约1mM的水平。如实施例5和6所述，200μM-1mM(R)-3-HB的范围在两种基于人结肠组织体外模型中都可有效降低多种炎性蛋白质的表达并增加抗炎蛋白质的表达。
5)使用菌株特异性PCR进一步证实了生物反应器中CHN-1的存在。为此，使用两组不同的寡核苷酸(表1)。如Nakanishi等人(2005)Microbiol Immunol所述，一组扩增丁酸梭菌的16s-23s基因间隔区。第二组特异性扩增整合的phaB基因。
表1：寡聚核苷酸序列
使用苯酚-氯仿提取来提取基因组DNA，然后使用两组寡核苷酸进行PCR。
如图13所示，在样品1-9中证实了丁酸梭菌的存在，这与接种CHN-1孢子的生物反应器相对应。在仅接种了粪便悬浮液的反应器10-12中也证实了低水平的丁酸梭菌(低于总活菌计数和耐热菌计数的检测水平(图7和8))。
如图14所示，在样品1-9中证实了phaB的存在，这与接种CHN-1孢子的生物反应器相对应。在仅接种粪便悬浮液的生物反应器中未观察到扩增子，证实在这些生物反应器中不存在phaB。
总之，这些数据表明CHN-1孢子可以在模拟的结肠环境中萌发。这些孢子的萌发随后导致营养细胞生长，如代谢活性指标所示，此时SCFA浓度和pH下降。数据还显示CHN-1成功引入了新的代谢产物，即(R)-3-HB，这通常在结肠环境中不存在。
实施例5-使用原代人类肠类器官模拟炎症
为了测量(R)-3-HB对原代人类肠类器官炎症的影响，在实验前将一个67岁女性供体的健康大肠样品体外培养8周。使用的方法如同Hannan et al.,Stem CellReports.Vol.1,293–306October 15,2013。
1)为了诱导炎症，单独用TNFα(40ng/mL)或TNFα(40ng/mL)与丁酸盐(10μM)、与(R)-3-HB(10μM)、或与丁酸盐和(R)-3-HB进行组合处理类器官18小时。随后，裂解细胞并分离RNA用于cDNA的合成，并通过qPCR测量炎症因子NF-κB和TNFα的mRNA表达水平。
图15显示了原代人类肠类器官对用TNFα与丁酸盐、与(R)-3-HB、或与丁酸盐和(R)-3-HB的组合进行组合来孵育的应答而表达的炎性因子NF-κB(A)和TNFα(B)相对于设定为1的对照(未刺激的样品)而标准化的相对mRNA表达水平。用丁酸盐、(R)-3-HB、或丁酸盐与(R)-3-HB的组合处理后，炎症因子NF-κB和TNFα的mRNA表达降低。
2)为了诱导炎症，单独用TNFα(40ng/mL)处理或与(R)-3-HB(10μM的钠盐)组合处理类器官18小时。随后，裂解细胞并分离RNA用于cDNA的合成，并通过qPCR测量一组炎症因子的mRNA表达水平。
图16显示了原代人类肠类器官对单独用TNF-α或者用TNF-α与(R)-3-HB组合来孵育的应答而表达的炎性因子相对于标准化的对照(未刺激的样品设定为0)而标准化的相对mRNA表达水平。与单独用TNF-α处理相比，在(R)-3-HB存在下促炎细胞因子和蛋白质IL-23、TNF-α、IL-1β、IL-6和NF-κβ的mRNA表达降低。与单独用TNF-α处理相比，在(R)-3-HB存在下抗炎细胞因子TGF-β1和IL-10的mRNA表达增加。
丁酸盐和(R)-3-HB均作用于促炎细胞因子和蛋白质以及抗炎细胞因子和蛋白质。(R)-3-HB比丁酸盐对IBD的多种重要促炎调节子具有更强的降低作用，并且对肠炎症的主要保护调节子具有更强的诱导作用(数据未显示)。
3)测量了(R)-3-HB和相关的SCFA丁酸盐对炎症应答的影响，所述应答由原代人类肠类器官在与作为炎症刺激物的TNF-α共孵育的基础上产生。如Hannan等人(2013)StemCell Reports所述，在实验前将原代人类肠类器官培养8周。
为了诱导炎症，单独用60ng/mL TNF-α或用TNF-α与不同浓度的(R)-3-HB或丁酸钠盐组合处理类器官24小时。随后，裂解细胞并使用RNeasy mini试剂盒(Qiagen Ltd，Germany)分离RNA用来合成cDNA。使用SensiMix SYBR low-ROX试剂盒(Bioline，UK)通过qPCR测量IL-23的mRNA表达水平。
针对未处理的对照将值标准化，图中展示了单独用TNF-α(设定为0)处理的类器官和用TNF-α和丁酸盐或(R)-3-HB处理的类器官中测量的mRNA水平的差异。
图17显示用60ng/mL TNF-α和增加浓度的丁酸盐或(R)-3-HB处理的类器官中IL-23的相对mRNA表达水平。这些数据表明10-100μM浓度的(R)-3-HB可有效降低人肠道粘膜中IL-23的表达。IL-23是IBD中炎症的关键介质，并且是几种药学单克隆抗体药物的靶。如体外肠道模型所证明的，这个浓度范围的(R)-3-HB可以使用细菌递送在肠道的腔中实现(见图12)。在这些浓度下，(R)-3-HB对IL-23表达的降低作用大于丁酸盐。
实施例6-使用离体人类结肠组织模型模拟炎症
在收到患者签署的知情同意后，可以从肠组织的手术切除或活组织检查获得结肠直肠样本。
材料：样本收集罐，无菌手术刀，无菌镊子，培养皿，PBS，高葡萄糖Dulbecco'sMinimal Essential Medium(DMEM)，胎牛血清(FCS)，L-谷氨酰胺，抗生素，带盖96孔U型底无菌培养皿，多通道移液器。
结直肠外植体的制备。在切除组织后，将样品保存在含有DMEM的样品收集罐中以运输到实验室。将样本放入带有一些培养基的培养皿中。用无菌手术刀从切除的样本上剥去肌肉。将剩余的组织转移到新的带有培养基的培养皿中，并将组织切割成包含上皮和肌层粘膜的外植体(Berry N,Herrera C,Cranage M.Methods Mol.Biol.2011；665:133-60)。继续进行分析。
候选化合物的临床前评估。为了诱导炎症，将外植体与100μl炎症刺激物(TNF-α15μg/ml)一起在96孔U形底无菌平板中孵育。用100ml完全培养基(含有FCS、L-谷氨酰胺和抗生素的DMEM)孵育外植体1小时。为了评估感兴趣的化合物的活性，将100μl化合物(10mM)加入到外植体中。然后将组织外植体在37℃，含5％CO2的环境中培养24小时。阴性对照是不用刺激物或候选化合物培养的组织外植体(加入200μl完全培养基)。阳性对照是仅用炎性刺激物处理的外植体。培养后，从培养孔中取出组织外植体，离心平板并收获180μl培养物上清液。-80℃冷冻上清液和组织外植体。继续定量上清液和/或组织外植体中感兴趣的分析物。
使用Luminex方法测定培养物上清液中的蛋白质浓度：
Luminex方案：内部检测由St Mary’s Hospital,Paddington,London的DrCarolina Herrera进行。Luminex测定缓冲液：PBS、山羊血清、小鼠血清、Tween 20、Tris pH7-8。Luminex洗涤缓冲液：PBS、Tween-20。步骤：
准备测定板
1.用测定缓冲液预润湿测定板
准备标准品
1.按照稀释步骤1/3准备11个标准品
准备样品
1.按照每组的要求稀释样品
准备珠子
1.超声波和涡旋震荡珠子
2.用测定缓冲液稀释珠子
设置实验
1.从平板上移除测定缓冲液
2.分别将50μl标准品、空白和样品加入相应的孔中
3.每孔加入50μl珠子，混合
4.用铝箔盖上平板并在平板振荡器上摇动1小时30分钟
添加检测抗体混合物
1.在测定缓冲液中稀释的检测抗体混合物
2.用洗涤缓冲液洗涤板子3次
3.向每个孔中加入50μl检测抗体混合物
4.用铝箔覆盖并像之前一样摇动1小时
添加链霉亲和素-PE
1.在测定缓冲液中稀释链霉亲和素-PE
2.用洗涤缓冲液洗涤板子3次
3.向每个孔中加入50μl稀释的链霉亲和素-PE
4.盖上铝箔并摇动30分钟
5.洗涤3次，每孔加入100μl鞘液
6.通过luminex运行平板之前摇动，或者用铝箔包裹存放在冰箱中直到第二天。
图18显示离体结肠组织样品对用TNF-α单独孵育(60分钟)或者用TNF-α孵育(60分钟)后又暴露于(R)-3-HB(24小时)的应答而表达的炎性因子相对于标准化对照(未刺激的样品设定为0)而标准化的相对蛋白质水平。研究了3-羟基丁酸钠盐和纯酸的钠盐，浓度均为10mM。使用标准曲线测定相对蛋白质水平[ng/mL]。与单独用TNF-α处理相比，在(R)-3-HB存在下促炎细胞因子和蛋白质IL-12、IL-1β和IL-6的蛋白质浓度降低。与单独用TNF-α处理相比，在(R)-3-HB存在下抗炎细胞因子IL-10的蛋白质浓度增加。丁酸盐和(R)-3-HB均作用于促炎细胞因子和蛋白质以及抗炎细胞因子和蛋白质。(R)-3-HB比丁酸盐对IBD的多种重要促炎调节子具有更强的降低作用，并且对肠炎症的主要保护调节子也具有更强的诱导作用(数据未显示)。
使用Proteome ProfilerTM Array测量参与免疫应答的更大蛋白质和细胞因子集合的相对丰度。实验条件和结肠组织样品的制备与上述相同。该实验使用Human XLCytokine Array Kit(www.rndsystems.com)，目录号为ARY022。细胞因子、趋化因子和生长因子是介导细胞与细胞通讯的胞外信号分子。这些分子从细胞中释放出来，在许多生物过程中起着关键作用，如细胞生长、分化、遗传表达、迁移、免疫和炎症。在大多数生物过程中，多种细胞因子在一个大的网络中起作用，其中一种细胞因子的作用受其他细胞因子的存在或不存在的调节。Human XL Cytokine Array Kit是一种快速、灵敏且经济的工具，可同时检测样品间的细胞因子差异。可以在不进行多种免疫测定的情况下测定102种人可溶性蛋白质的相对表达水平。
测定的原理
在硝酸纤维素膜上点上捕获和对照抗体，重复两次。将细胞培养物上清液、细胞裂解物、血清、血浆、人乳、尿液、唾液或组织裂解物稀释，并用Proteome Profiler Human XLCytokine Array孵育过夜。洗涤膜以移除未结合的物质，然后与生物素化的检测抗体混合物一起孵育。然后应用链霉亲和素-HRP和化学发光检测试剂，并在每个捕获点产生对应蛋白质结合的量的信号。
图19显示离体结肠组织样品对用TNF-α单独孵育(60分钟)或者用TNF-α孵育(60分钟)后又暴露于(R)-3-HB(24小时)的应答而表达的炎性因子相对于标准化对照(未刺激的样品设定为0)而标准化的相对蛋白质水平。研究了3-羟基丁酸的钠盐和纯酸的钠盐，浓度均为10mM。与单独用TNF-α处理相比，在(R)-3-HB存在下促炎细胞因子和蛋白质TNF-α、IL-23和MMP9的蛋白质浓度降低。
实施例7–萌发和生长竞争测定
通过在孵育5天后从丰富培养基平板收获孢子原种来获得艰难梭菌(C.difficile)和遗传工程化改造的丁酸梭菌(C.butyricum)的孢子。将样品在65℃加热处理30分钟以杀死任何残留的营养细胞。为了使孢子萌发，将50μL孢子培养物接种到10mL补充有0.1％牛磺胆酸钠(艰难梭菌萌发诱导剂)的丰富培养基中。艰难梭菌和丁酸梭菌的孢子分别进行三组单独培养和共培养实验。在37℃的厌氧条件孵育24小时后，从每个单独的实验中取出样品，连续稀释并在丰富培养基上铺板成20μL的离散点，重复三次。在厌氧条件下于37℃孵育过夜后，测定CFU/mL。
图20显示艰难梭菌和丁酸梭菌的孢子的单独培养和共培养时获得的CFU/mL。当艰难梭菌孢子与丁酸梭菌的孢子共培养萌发时，艰难梭菌的萌发和/或生长被完全抑制。
实施例8-评估胃和小肠条件下的存活率
用1mL PBS重悬CHN-1孢子，将其接种于9mL含有以下的胃模拟培养基(GSM)中(g/L)：阿拉伯半乳聚糖1、果胶2、木聚糖1、淀粉3、葡萄糖0.4、酵母提取物3、蛋白胨1、粘蛋白4、半胱氨酸0.5和胃蛋白酶1。在高压灭菌之前，使用1M HCl将培养基调节至pH 3。将GSM培养物在37℃，100rpm搅拌厌氧孵育2小时，然后加入5mL含有以下的预还原的胰胆汁(g/L)：胰酶3、脱水胆汁提取物8、碳酸氢钠10。培养物在37℃，50rpm搅拌厌氧孵育4小时。GSM没有被预先还原，而是在转移到柜子之前储存在37℃，以模拟胃中遇到的有氧条件，并通过随后的厌氧孵育减少通过胃肠道的氧气。在孵育t＝0、2、4和6小时时取样。将样品连续稀释并在RCM琼脂平板上用点样3个离散的20μL的点。将平板在37℃厌氧孵育过夜，然后进行菌落计数以评估在胃和小肠条件中孢子的活力。
图21显示CHN-1的孢子在胃酸条件下存活以及随后的活力。
序列表
<110> 链生物技术有限公司
<120> 用于治疗炎性疾病的组合物及其用途以及益生菌组合物
<130> CHBI-001/001WO 329719-2002
<150> GB1616058.2
<151> 2016-09-21
<150> GB1706751.3
<151> 2017-04-27
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 744
<212> DNA
<213> Cupriavidus necator
<400> 1
atgactcaaa gaatagctta tgtgactgga ggaatgggtg gaataggaac tgcaatatgc 60
caaaggttag ctaaagatgg atttagagta gttgctggat gtggtccaaa ctctccaaga 120
agagaaagat ggcttgaaca gcaaaaagct ttaggttttg actttgtagc aagtgaagga 180
aacgttgctg actgggattc aactaagaca gcttttgata aagttaaagc agaagttgga 240
gaggtagatg tattaataaa taatgctgga ataactagag acgttgtttt tagaaaaatg 300
acaagagcag actgggatgc agtaattgat actaatttaa ctagcttatt taatgtgact 360
aagcaagtaa tagacggtat ggctgataga ggatggggaa gaatagtaaa tatatcaagt 420
gtaaacggtc agaaaggtca atttggacag acaaattatt caacagcaaa agctggatta 480
catggtttta ctatggcatt agcacaggaa gttgcaacaa agggagttac tgttaatact 540
gtttctccag gatatattgc aacagatatg gttaaagcaa ttagacaaga cgttttagac 600
aaaattgtag gaacaatacc tgttaaaaga cttggagagc ctgaggagat tgcaagtatt 660
tgcgcttggc tttcatctga tgaaagtggt ttttctacag gtgcagattt tagtttaaat 720
ggtggtcttc acatgggtta gtaa 744
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer
<400> 2
cctcctttct atggagaaat ctagca 26
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer
<400> 3
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<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer
<400> 4
gtgtagtagc ctgtgaaata ag 22
<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer
<400> 5
gaggcacatt tattttagct agcttactaa cccatgtg 38

Claims (52)

1.3-羟基丁酸(3-HB)或其盐，其用于治疗对象的炎性疾病、病症或病况的方法。
2.如权利要求1所述的3-HB，其中至少约90％的3-HB是(R)-异构体((R)-3-HB)。
3.包含3-HB或其盐的药物组合物，其用于治疗对象的炎性疾病、病症或病况的方法。
4.如权利要求3所述的药物组合物，其中配制所述组合物用于将3-HB或其盐递送至胃肠道，优选递送至胃肠道的腔。
5.一种药物组合物，其用于治疗对象的炎性疾病、病症或病况的方法，其中所述组合物包含3-HB递送工具，并且所述方法包括将3-HB递送工具递送至胃肠道的腔。
6.如权利要求5所述的药物组合物，其中所述3-HB递送工具是将3-HB递送至胃肠道的腔的前药或生物递送系统。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其中所述生物递送系统由产生3-HB的厌氧细菌组成。
8.如权利要求7所述的药物组合物，其中所述厌氧细菌是遗传工程化的。
9.如权利要求8所述的药物组合物，其中所述厌氧细菌是产丁酸盐的细菌，其包含能够表达(R)-3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶的非天然基因。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其中所述厌氧细菌是孢子形成专性厌氧菌，优选丁酸梭菌(Clostridium butyricum)。
11.如权利要求3-10中任一项所述的药物组合物，其中至少约90％的3-HB是(R)-异构体((R)-HB)。
12.如权利要求3-11中任一项所述的药物组合物，其中配制所述药物组合物用于缓释。
13.如权利要求5-12中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物用于口服施用。
14.如权利要求13所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含包围核的缓释层或者包衣，所述核包含3-HB或其盐或递送工具。
15.如权利要求13或14所述的药物组合物，其中配制所述药物组合物以将3-HB或其盐或递送工具递送至pH约5.5至约7的胃肠道。
16.如权利要求13或14所述的药物组合物，其中配制所述药物组合物以在与食物一起口服施用后5至24小时将3-HB或其盐或递送工具递送至胃肠道。
17.如权利要求13-16中任一项所述的药物组合物，其中配制所述药物组合物以将3-HB或其盐或递送工具递送至大肠，优选递送至大肠的厌氧部分，优选递送至结肠和/或末端回肠。
18.如权利要求1或2所述的3-HB或如权利要求3-17中任一项所述的药物组合物，其中所述对象是人。
19.如权利要求1或2所述的3-HB或如权利要求3-18中任一项所述的药物组合物，其中所述炎性疾病、病症或病况是炎性肠病(IBD)，优选克罗恩病或溃疡性结肠炎；或结肠直肠癌。
20.一种治疗对象的炎性疾病、病症或病况的方法，包括向对象施用：
a)3-羟基丁酸(3-HB)或其盐；
b)包含3-HB或其盐的药物组合物；和/或
c)包含3-HB递送工具的药物组合物。
21.基本上如本文所述的3-羟基丁酸(3-HB)或药物组合物。
22.一种组合物，其包含产生(R)-3-羟基丁酸盐的遗传工程化厌氧细菌和可口服摄取载体。
23.如权利要求22所述的组合物，其中所述细菌包含能够表达(R)-3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶的非天然基因。
24.如权利要求22或23中任一项所述的组合物，其中所述细菌是梭菌纲细菌。
25.如权利要求22-24中任一项所述的组合物，其中所述细菌来自梭菌纲第I、IV和/或XIVa簇。
26.如权利要求22-25中任一项所述的组合物，其中所述细菌来自梭菌属(Clostridium)。
27.如权利要求22-26中任一项所述的组合物，其中所述细菌是丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)。
28.如权利要求22-27中任一项所述的组合物，其中所述细菌具有编码丁酰磷酸转移酶和/或丁酸激酶的天然基因。
29.如权利要求22-28中任一项所述的组合物，其中所述细菌产生(R)-3-羟基丁酸盐作为唯一的发酵产物。
30.如权利要求22-29中任一项所述的组合物，其中所述细菌产生与乙酸盐和/或丁酸盐组合的(R)-3-羟基丁酸盐作为发酵产物。
31.如权利要求22-30中任一项所述的组合物，其包含药学上可接受的载体以用作药物。
32.如权利要求22-31中任一项所述的组合物，其用于治疗或预防胃肠病症。
33.如权利要求32所述的组合物，其中所述胃肠病症是炎性肠病或结肠癌。
34.如权利要求33所述的组合物，其中所述炎性肠病选自肠易激综合征、克罗恩病、隐窝炎、憩室炎和溃疡性结肠炎。
35.如权利要求22-31中任一项所述的组合物，其用于治疗胃肠生态失调。
36.如权利要求22-31中任一项所述的组合物，其用于治疗或预防艰难梭菌(C.difficile)感染。
37.如权利要求22-31中任一项所述的组合物，其用于调节对象的肠道菌群。
38.如权利要求22-31中任一项所述的组合物，其用于动物饲料中。
39.如权利要求22-31中任一项所述的组合物，其为胶囊、片剂或粉末的形式。
40.如权利要求22-30中任一项所述的组合物，其用于食品中。
41.如权利要求40所述的组合物，其中所述食品是饮料、酒水、食品补充剂或营养品。
42.如权利要求22-41中任一项所述的组合物，其中所述梭菌属物种是孢子或营养细胞的形式。
43.如权利要求22-42中任一项所述的组合物，其中所述梭菌属物种可以以1×106至1×1010 CFU/g组合物的量存在。
44.一种治疗或预防胃肠疾病或病症的方法，包括施用产生(R)-3-羟基丁酸盐的遗传工程化厌氧细菌。
45.一种治疗或预防胃肠生态失调的方法，包括施用产生(R)-3-羟基丁酸盐的遗传工程化厌氧细菌。
46.一种治疗或预防艰难梭菌(Clostridium difficile)感染的方法，包括施用产生(R)-3-羟基丁酸盐的遗传工程化厌氧细菌。
47.一种调节对象肠道菌群的方法，包括施用产生(R)-3-羟基丁酸盐的遗传工程化厌氧细菌。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述方法包括给动物喂食包含所述细菌的饲料或饲料添加剂。
49.如权利要求42-48中任一项所述的方法，其中所述细菌是梭菌纲(Clostridia)。
50.如权利要求42-49中任一项所述的方法，其中所述细菌包含能够表达(R)-3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶的非天然基因。
51.如权利要求42-50中任一项所述的方法，包括口服施用所述细菌。
52.如权利要求42至51中任一项所述的方法，还包括施用益生元。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022134306A1 (zh) * 2020-12-22 2022-06-30 中山大学附属第六医院 3-羟基丁酸或其衍生物或可产生该物质的细菌组合物在治疗放射性肠损伤上的应用
CN115835787A (zh) * 2020-06-19 2023-03-21 雀巢产品有限公司 用以改善胃肠屏障的包含3-羟基丁酸的营养组合物

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11241403B2 (en) 2016-03-11 2022-02-08 Axcess Global Sciences, Llc Beta-hydroxybutyrate mixed salt compositions and methods of use
US11103470B2 (en) 2017-11-22 2021-08-31 Axcess Global Sciences, Llc Non-racemic beta-hydroxybutyrate compounds and compositions enriched with the R-enantiomer and methods of use
US10245242B1 (en) * 2017-11-22 2019-04-02 Axcess Global Sciences, Llc Non-racemic beta-hydroxybutyrate compounds and compositions enriched with the R-enantiomer and methods of use
JP6804352B2 (ja) * 2017-03-22 2020-12-23 大阪瓦斯株式会社 コラゲナーゼｍｍｐ１及び３の産生抑制剤
US10925843B2 (en) 2018-04-18 2021-02-23 Axcess Global Sciences, Llc Compositions and methods for keto stacking with beta-hydroxybutyrate and acetoacetate
US11202769B2 (en) 2017-11-22 2021-12-21 Axcess Global Sciences, Llc Ketone body esters of s-beta-hydroxybutyrate and/or s-1,3-butanediol for modifying metabolic function
US11944598B2 (en) 2017-12-19 2024-04-02 Axcess Global Sciences, Llc Compositions containing s-beta-hydroxybutyrate or non-racemic mixtures enriched with the s-enatiomer
GB2572185A (en) * 2018-03-21 2019-09-25 Chain Biotechnology Ltd Pharmaceutical compositions
WO2019200103A1 (en) * 2018-04-13 2019-10-17 White Dog Labs, Inc. A feed ingredient comprising clostridium tyrobutyricum
US11806324B2 (en) 2018-04-18 2023-11-07 Axcess Global Sciences, Llc Beta-hydroxybutyric acid compositions and methods for oral delivery of ketone bodies
US11419836B2 (en) 2019-02-13 2022-08-23 Axcess Global Sciences, Llc Racemic and near racemic beta-hydroxybutyrate mixed salt-acid compositions
CN109875989A (zh) * 2019-03-04 2019-06-14 清华大学 3-羟基丁酸及其衍生物在制备防治结肠炎、结肠癌的产品中的应用
US11141442B2 (en) 2019-06-06 2021-10-12 Compound Solutions, Inc. Tributyrin compositions and methods therefor
US11950616B2 (en) 2019-06-21 2024-04-09 Axcess Global Sciences, Llc Non-vasoconstricting energy-promoting compositions containing ketone bodies
WO2021243380A1 (en) * 2020-05-29 2021-12-02 Figene, Llc Augmentation of fibroblast cell therapy efficacy by microbiome manipulation
KR102368481B1 (ko) * 2020-09-10 2022-02-28 주식회사 피드업 식물성 오일 및 대두박의 발효물을 포함하는 사료 조성물 및 이의 제조방법
WO2022080250A1 (ja) * 2020-10-13 2022-04-21 拓己 佐藤 プロピオン酸遊離剤、酢酸遊離剤、成長促進剤及び整腸剤
GB202019767D0 (en) 2020-12-15 2021-01-27 Chain Biotechnology Ltd Compostitions and methods
GB202209115D0 (en) 2022-06-21 2022-08-10 Chain Biotechnology Ltd Compositions and methods
US11969430B1 (en) 2023-03-10 2024-04-30 Axcess Global Sciences, Llc Compositions containing paraxanthine and beta-hydroxybutyrate or precursor for increasing neurological and physiological performance

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030203459A1 (en) * 2002-01-04 2003-10-30 Guoqiang Chen Method for the production of D-(-)-3-hydroxybutyric acid by recombinant esherichia coli
EP1661574A1 (en) * 2003-09-01 2006-05-31 Earthus, Inc. Beta-hydroxy short to medium chain fatty acid polymer
WO2008144423A2 (en) * 2007-05-15 2008-11-27 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Compositions comprising a gpr109 ligand for treating disorders of the digestive tract and/or cancer
US20100094789A1 (en) * 2007-04-18 2010-04-15 Alenia Aeronautica S.P.A. Method and a system for estimating the impact area of a military load launched from an aircraft
CN102559550A (zh) * 2011-12-30 2012-07-11 山东宝来利来生物工程股份有限公司 一株具有治疗腹泻作用的丁酸梭菌及其作为丁酸钠替代品的应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2733202A1 (de) * 1976-08-04 1978-02-09 Agroferm Ag Verfahren zur herstellung der d(-)-3-hydroxybuttersaeure
US6323237B1 (en) * 1997-03-17 2001-11-27 Btg International Limited Therapeutic compositions
US20090247589A1 (en) * 2006-09-14 2009-10-01 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Monocarboxylates for modifying macrophage function
CN106038532B (zh) 2008-01-04 2019-05-14 牛津大学科技创新有限公司 用作降低血脂药剂的酮体和酮体酯
GB0903016D0 (en) * 2009-02-23 2009-04-08 Univ Gent Method for alleviating intestinal problems and novel bacterial strains therefor
GB201603915D0 (en) * 2016-03-07 2016-04-20 Chain Biotechnology Ltd Method and microbes for the production of chiral compounds
US11173138B2 (en) * 2016-04-19 2021-11-16 Keto Patent Group, Inc. Administration of butyrate, beta-hydroxybutyrate, and related compounds in humans

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030203459A1 (en) * 2002-01-04 2003-10-30 Guoqiang Chen Method for the production of D-(-)-3-hydroxybutyric acid by recombinant esherichia coli
EP1661574A1 (en) * 2003-09-01 2006-05-31 Earthus, Inc. Beta-hydroxy short to medium chain fatty acid polymer
US20100094789A1 (en) * 2007-04-18 2010-04-15 Alenia Aeronautica S.P.A. Method and a system for estimating the impact area of a military load launched from an aircraft
WO2008144423A2 (en) * 2007-05-15 2008-11-27 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Compositions comprising a gpr109 ligand for treating disorders of the digestive tract and/or cancer
CN102559550A (zh) * 2011-12-30 2012-07-11 山东宝来利来生物工程股份有限公司 一株具有治疗腹泻作用的丁酸梭菌及其作为丁酸钠替代品的应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TINA HOLSCHER等: "Production of the Chiral Compound (R)-3-Hydroxybutyrate by a Genetically Engineered Methylotrophic Bacterium", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115835787A (zh) * 2020-06-19 2023-03-21 雀巢产品有限公司 用以改善胃肠屏障的包含3-羟基丁酸的营养组合物
WO2022134306A1 (zh) * 2020-12-22 2022-06-30 中山大学附属第六医院 3-羟基丁酸或其衍生物或可产生该物质的细菌组合物在治疗放射性肠损伤上的应用

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JP2019533010A (ja) 2019-11-14
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