CN109875989A

CN109875989A - 3-羟基丁酸及其衍生物在制备防治结肠炎、结肠癌的产品中的应用

Info

Publication number: CN109875989A
Application number: CN201910160165.8A
Authority: CN
Inventors: 陈国强; 张书杰; 李子华; 张雨点
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2019-03-04
Filing date: 2019-03-04
Publication date: 2019-06-14

Abstract

本发明公开了3‑羟基丁酸及其衍生物在制备防治结肠炎和结肠癌的产品中的应用。3‑羟基丁酸及其衍生物容易被人体吸收，安全剂量高，没有显著的毒副作用。3‑羟基丁酸可以有效抵抗肠道慢性的炎症，非常合适作为慢性炎症导致的癌症患者作为长期服用的辅助性药物。我们的实验结果也表明，口服给药100mg/kg/day的3‑羟基丁酸可以有效抵抗DSS诱导的小鼠肠炎的发生，以及显著减少结肠肿瘤的发生。

Description

3-羟基丁酸及其衍生物在制备防治结肠炎、结肠癌的产品中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及3-羟基丁酸及其衍生物在制备防治结肠炎、结肠癌的产品中的应用。

背景技术

结直肠癌是一种发病率较高的常见的恶性肿瘤，全球发病率位居第三位，死亡率位于第二位，我国的结肠癌死亡率也处于恶性肿瘤的第五位，严重危害着国民的身体健康。结肠癌的发生是一个缓慢的过程，通常从最开始的结肠息肉，在环境和基因的共同作用下进一步恶化，最终发展到恶性癌症，一般需要10-20年的时间。早期的结肠癌可以通过内窥镜检测发现，此时如果及时治疗，有较好的预后，然而一旦发展到中晚期，只能通过手术和化疗合用的治疗方式，患者切除直肠后生活质量低下，同时还得面临化疗药物的毒副作用，给患者造成巨大的心里压力。所以发展出副作用小的早期预防和治疗药物显得尤为重要。

慢性的炎症在结肠癌的发展中起到推波助澜的作用，如果能在此时进行治疗，可以有效阻断癌症的发展。近年来有关肠道菌群的研究表明，在结肠癌的发病过程中，肠道菌也参与其中，异常的肠道菌造成长期的慢性炎症，加速了癌症的转变，同时对于已经病变的组织，某些类群的肠道菌可以显著促进肿瘤的发展，另外也有文献表明，肠道益生菌(乳酸菌，双歧杆菌，嗜粘蛋白-艾克曼菌)的使用可以显著改善肠道微环境，起到抑制慢性炎症的发生的作用，可以有效降低肠道肿瘤的发生发展。

结肠癌的早期预防越来越受到关注，目前用于结肠癌预防的药物有阿司匹林，环氧合酶抑制剂，非甾体类抗炎药物，目的都是抑制慢性炎症，从而抑制肿瘤的发生。当然这些药物的长期使用存在着明显的不足之处，现有的抗炎药物一般都会造成胃肠运动减弱，消化道出血以及肝肾损伤，同时可能还会对心血管系统产生较大的威胁，因此探索新的无毒副作用的有效药物是结肠癌治疗的当务之急。

3-羟基丁酸是人体的代谢产物，是人体在饥饿和剧烈运动情况下肝脏利用脂肪酸产生的化合物，作为替代葡萄糖的能量来源。近年来随着3-羟基丁酸的研究的越来越深入，发现其不仅仅可以作为能量分子，还可以发挥重要的信号分子。3-羟基丁酸可以通过激活细胞膜表面的GPR109A受体发挥抗酒精性脂肪肝的作用(J Hepatol.2018 Sep；69(3):687-696.)，另外，3-羟基丁酸还可以有效改善高血压(Cell Rep.2018 Oct 16；25(3):677-689.)。此外，3-羟基丁酸也可以改善神经变性疾病、癫痫、糖尿病、心血管疾病等。

但是3-羟基丁酸防治结肠炎、结肠癌的应用未见报道。

发明内容

本发明目的之一是提供3-羟基丁酸及其衍生物的新的药物用途。

本发明所提供的3-羟基丁酸及其衍生物的药物新用途为3-羟基丁酸及其衍生物在制备下述产品中的应用：

1)预防和/或治疗结肠炎、肠炎的产品；

2)预防和/或治疗下消化道肿瘤的产品；

3)调整肠道菌群结构的产品。

所述产品具体可为药物或保健品。

所述下消化道肿瘤可为结肠肿瘤、回肠肿瘤、直肠肿瘤；具体可为结肠肿瘤。

所述调整肠道菌群结构的产品为能够稳定肠道有益菌的产品。

所述3-羟基丁酸及其衍生物，其结构式如下述式I或式II所示：

式I和式II中的R₁均为H、不同链长的直链或支链烷基(如C₁-C₂₀、C₁-C₁₀、C₁-C₆或C₁-C₃的直链或支链烷基)、不同链长的直链或支链烷氧基(如C₁-C₂₀、C₁-C₁₀、C₁-C₆或C₁-C₃的直链或支链烷氧基)、环烷基(如C₃-C₆的环烷基)或芳基；

式I中的R₂为H、不同链长的直链或支链的烷基(如C₁-C₂₀、C₁-C₁₀、C₁-C₆或C₁-C₃的直链或支链烷基)、环烷基(如C₃-C₆的环烷基)或芳基；

式II中的R₂为无毒金属离子(如钠、钾或钙等)，式II中n值根据金属离子的价态确定。

所述3-羟基丁酸及其衍生物可以是D型或L型的，也可以是D型和L型的混合物。

具体可为：3-羟基丁酸(3-hydroxybutyric acid或3-HB)甲酯、3-羟基丁酸(3-HB)乙酯、3-羟基丁酸(3-HB)(包括其钠盐、钾盐、钙盐等)、3-羟基己酸 (3-hydroxyhexanoicacid或3-HHx)甲酯、3-羟基己酸(3-HHx)乙酯、3-羟基己酸 (3-HHx)(包括其钠盐、钾盐、钙盐等)。

本发明中所述3-羟基丁酸及其衍生物可通过各类聚羟基脂肪酸PHA的水解和醇解等多种方法得到，经过蒸馏纯化，通过GC分析确认纯度极高，没有双键等危害细胞生长的副产物(Chen GQ，Wu Q.Microbial Production and Applications of ChiralHydroxyalkanoates.Appl Microbiol Biotechnol，67(2005)592-599)。

本发明的另一个目的是提供一种预防和/或治疗结肠炎、肠炎，预防和/或治疗下消化道肿瘤的产品。

所述产品具体可为药物或保健品。

本发明所提供的预防和/或治疗结肠炎、肠炎，预防和/或治疗下消化道肿瘤的产品，其活性成分为本发明中所述的3-羟基丁酸及其衍生物，所述产品可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

需要的时候，在上述产品中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。

以3-羟基丁酸及其衍生物为活性成分制备的预防和/或治疗结肠炎、肠炎以及预防和/或治疗下消化道肿瘤的产品可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

本发明公开了3-羟基丁酸及其衍生物在制备防治结肠炎、肠炎以及防治下消化道肿瘤的药物或保健品中的应用。3-羟基丁酸及其衍生物容易被人体吸收，安全剂量高，没有显著的毒副作用。慢性的炎症是诱导肿瘤发生的元凶，3-羟基丁酸可以有效抵抗肠道慢性的炎症，非常合适作为慢性炎症导致的癌症患者作为长期服用的辅助性药物。我们的实验结果也表明，口服给药100mg/kg/day的3-羟基丁酸可以有效抵抗DSS诱导的小鼠肠炎的发生，以及显著减少结肠肿瘤的发生。

附图说明

图1表示实施例1中对照组、DSS模型组、DSS+3-羟基丁酸高剂量组、DSS+3-羟基丁酸低剂量组的小鼠体重的变化。

图2表示实施例1中对照组、DSS模型组、DSS+3-羟基丁酸高剂量组、DSS+3-羟基小鼠结肠长度的变化。

图3表示对照组、DSS模型组、DSS+3-羟基丁酸高剂量组、DSS+3-羟基丁酸低剂量组的小鼠结肠病理切片。

图4表示实施例2中3-羟基丁酸对LPS刺激小鼠腹膜巨噬细胞分泌炎性因子的影响作用。

图5表示实施例1中小鼠肠道菌群的构成。

图6表示实施例1中小鼠肠道菌丰度。

图7表示实施例1中3-羟基丁酸减少结肠肿瘤的发生。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、3-羟基丁酸抑制结肠炎的发生

取40只C57雌性小鼠，随机分成4组：给水对照组，DSS模型组，DSS+3-羟基丁酸高剂量组，DSS+3-羟基丁酸低剂量组。模型组小鼠给予2％的DSS进行造模，连续8天。此期间每天进行一次的3-羟基丁酸灌胃，低剂量组为100mg/kg，高剂量组为200mg/kg。之后取血并处死小鼠，评价肠炎发生水平。

统计与数据分析：数值采用mean±SD。统计比较采用Student's t-test，P值小于0.05为显著差异。

图1表示对照组、DSS模型组、DSS+3-羟基丁酸高剂量组，DSS+3-羟基丁酸低剂量组的小鼠体重的变化。

由图1可知，小鼠在给予DSS之后，出现了体重下降，而不同剂量的药物处理，均可以有效抑制体重下降，给药后小鼠状态良好，更接近正常鼠。

实验结果表明：药物显著改善DSS造成的小鼠体重下降。

图2表示对照组、DSS模型组、DSS+3-羟基丁酸高剂量组，DSS+3-羟基丁酸低剂量组的小鼠结肠长度的变化。

由图2可知，给药DSS的造模组，结肠长度相较于正常鼠长度变短，同时模型组肠道颜色较深，是由于大量的出血造成，而给药药物处理后，长度变长，同时也未见明显出血，可见该药物可以有效保护肠道健康状况。

实验结果表明：3-羟基丁酸能抑制DSS造成的肠道长度降低，同时改善肠道出血。

由图3可知，肠道的病理切片表明，正常的小鼠有大量的肠道褶皱，充斥着整个肠道，而DSS模型组肠道褶皱萎缩，同时可见红色的血细胞，不同剂量给药组出现了显著的改善，几乎回复的正常小鼠水平。

实验结果：改善肠道病理状态。

结论：3-羟基丁酸可以有效改善DSS诱导的小鼠结肠炎，主要是通过保护肠道粘膜组织，抑制肠道出血，降低肠道炎症水平，从而起到抑制肠道炎症发生的作用。

实施例2、3-羟基丁酸对LPS刺激小鼠腹膜巨噬细胞分泌炎性因子的影响作用

(1)实验材料

实验细胞株：腹膜巨噬细胞

实验试剂：3-羟基丁酸(纯度大于99％，sigma)，配成1mol/L的母液，再以 DMEM/1640培养基稀释成相应浓度；脂多糖(Escherichia coli，0111:B4，LPS)购自 sigma公司。

实验材料：mIL-6，mMCP-1的引物定于；Genstar，PrimeScriptTM RT reagent Kitwith gDNA Eraser(Perfect Real Time)，Code No.RR047A；Genstar,Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)，

(2)实验方法

提前4天腹腔注射4％巯乙基淀粉肉汤2ml/只小鼠，引颈处死小鼠后，腹腔注入5mlPBS，轻柔小鼠腹部，用注射器吸出腹腔液体，收集细胞，将细胞接种于六孔培养板，每孔10⁶个细胞，用DMEM+10％FBS培养基，在37℃、CO₂培养箱中培养过夜细胞完全贴壁后，细胞分为对照组，LPS刺激组，LPS+3-羟基丁酸500μmol/L、1mmol/L、 2mmol/L三个浓度组。首先，在LPS+3-羟基丁酸三个浓度组中分别加入不同浓度的3- 羟基丁酸预孵育3h，然后与LPS组同时加入LPS(终浓度为100ng/L)溶液，37℃、5％ CO₂饱和湿度条件下刺激腹膜巨噬细胞细胞3h，之后用Trizol提取总RNA。分别加入1ml Trizol，室温静置5min，7500rpm×10min 4℃离心，小心吸取上清，加入200μL氯仿，剧烈振荡15s，静置5min，12000rpm×10min 4℃离心，吸取上次水相400μL 至另一个无RNA酶的离心管中，同时加入等体积的异丙醇，室温放置10min，12000rpm ×10min 4℃离心10min，弃掉上清，加入75％乙醇1mL，12000rpm×10min4℃离心5min，并且重复一次，弃掉上清，快速晾干，50μL无RNA酶水将沉淀溶解，取2μL 样品溶于48μL RNase-Free H₂O中，测定RNA浓度。

反转录

1×反应体系如下：

反应条件为37℃5min

合成第一链cDNA

Realtime PCR，1×反应体系如下：

图4表示3-羟基丁酸对LPS刺激小鼠腹膜巨噬细胞分泌炎性因子的影响作用。

实验结果表明：3-羟基丁酸可以有效抑制LPS诱导的IL-6和MCP-1的升高，说明3-羟基丁酸可以抑制炎症反应。这也从细胞层面解释了3-羟基丁酸抗肠炎的机理，肠道炎症发生时伴随着大量的肠道巨噬细胞的浸润，如果可以抑制巨噬细胞的炎性反应，就可以保护肠道炎症的发生。

实验结论：3-羟基丁酸可以有效抑制巨噬细胞的炎症反应。

实施例3、3-羟基丁酸可以有效稳定小鼠肠道有益菌群，降低肠道炎症

对实施例1中的小鼠进行粪便取样，粪便样本进行16S rDNA高通量二代测序分析。

3-羟基丁酸对小鼠肠道菌群的影响分析流程：基因组DNA质检→引物设计并合成→PCR扩增和产物纯化→PCR产物定量和均一化→Illumina高通量测序分析。

(1)基因组DNA抽提和质检：利用Thermo NanoDrop 2000紫外微量分光光度计和1％琼脂糖凝胶电泳进行总DNA质检。

(2)引物设计并合成

16S rDNA扩增选择区域为V3-V4区，使用的通用引物为F341和R806。在通用引物的5’端加上适合HiSeq2500PE250测序的。index序列和接头序列，完成特异性引物的设计。

forward primer(5'-3')：ACTCCTACGGGRSGCAGCAG(F341)

reverse primer(5'-3')：GGACTACVVGGGTATCTAATC(R806)

(3)PCR扩增和产物纯化

以稀释后的基因组DNA为模板，使用KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR kit高保真酶进行PCR，确保扩增的准确性和高效性。用2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物。回收后，利用ThermoNanoDrop 2000紫外微量分光光度计和2％琼脂糖凝胶电泳进行文库质检。

(4)PCR产物定量和均一化

文库质检合格后，使用Qubit进行文库定量，并根据每个样品的数据量要求，进行相应比例的混合。

(5)Illumina测序使用Illumina HiSeq PE250进行上机测序。

(6)生物信息分析流程

对原始数据进行QC之后，用Usearch软件对数据进行去嵌合体和聚类的操作，Usearch聚类时，先将Reads按照丰度从大到小排序，通过97％相似度的标准聚类，得到 OTU(Operational Taxonomic Units)，每个OTU被认为可代表一个物种。接下来对每个样品的Reads进行随机抽平处理，并提取对应的OTU序列。然后使用Qiime软件，做Alpha 多样性指数的稀释曲线，根据稀释曲线，选择合理的抽平参数，利用Qiime软件对得到的抽平后的OTU进行分析，首先从OTU中分别提取一条Read作为代表序列，使用RDP方法，将该代表序列与16S数据库比对，从而对每个OTU进行物种分类。归类后，根据每个OTU 中序列的条数，从而得到OTU丰度表，最后根据该OTU丰度表进行后续分析，结果如图5 和图6。

图5表示表示小鼠肠道菌群的构成。

图6表示小鼠肠道菌丰度。

由结果可知，正常鼠经过单独的3-HB预处理后未见明显的菌群改变，当小鼠给予DSS处理后菌群发生异常，有益菌显著减少，有害菌群丰度上升(Escherichia coli) 而此时当3-羟基丁酸存在时，可以有效稳定益生菌(Lactobacillus)。

结论：3-羟基丁酸可以有效稳定正常小鼠的菌群稳态，从而通过稳定健康的肠道菌组成而起到降低肠炎的作用。

实施例4、3-羟基丁酸减少结肠炎相关结肠肿瘤的发生

(1)实验材料：实验材料同实施例1

实验试剂：3-羟基丁酸(sigma)，氧化偶氮甲烷(AOM)购自Sigma公司，葡聚糖硫酸钠(DSS)购自MP Biomedicals公司

实验动物：C57雌性小鼠，8周龄，体重18-20g，购自北京维通利华。

(2)实验方法：

结肠癌造模方法(即AOM/DSS给药方案)：腹腔注射AOM工作液(AOM用量为10mg/kg小鼠体重)，对照组腹腔注射等量生理盐水。AOM给药一周后，持续一周以饮水方式给予25mg/ml DSS溶液，每只鼠保证每天饮入5ml DSS溶液，DSS溶液给予结束后，连续正常饮水14天，给予DSS溶液和水的步骤为一个循环，连续进行三个循环。

取40只C57雌性小鼠，随机分为2组：AOM/DSS模型组(20只)，AOM/DSS+3- 羟基丁酸(100mg/kg)。

小鼠第8天开始实施AOM/DSS给药方案；AOM/DSS+3-羟基丁酸组：小鼠每天灌胃给予3-羟基丁酸溶液，第8天开始实施AOM/DSS给药方案；第70天处死小鼠，评价肿瘤的发展水平。实验结束取出小鼠的结肠，统计肿瘤个数。结果如图7所示。

图7为3-羟基丁酸减少结肠肿瘤的发生。

实验结论：3-羟基丁酸可以有效降低AOM/DSS诱导的肿瘤的发生，说明其可以作为一种肿瘤防治的潜在的安全无毒的药物。

Claims

1.3-羟基丁酸及其衍生物在制备如下产品中的应用：

1)预防和/或治疗结肠炎、肠炎的产品；

2)预防和/或治疗下消化道肿瘤的产品；

3)调整肠道菌群结构的产品。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述3-羟基丁酸及其衍生物，其结构式如式I或式II所示：

式I和式II中的R₁均为H、不同链长的直链或支链烷基、不同链长的直链或支链烷氧基、环烷基或芳基；

式I中的R₂为H、不同链长的直链或支链的烷基、环烷基或芳基；

式II中的R₂为无毒金属离子，式II中n值根据金属离子的价态确定。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述3-羟基丁酸及其衍生物为D型或L型，或D型和L型的混合物。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于：所述3-羟基丁酸及其衍生物为：3-羟基丁酸甲酯、3-羟基丁酸乙酯、3-羟基丁酸或其盐、3-羟基己酸甲酯、3-羟基己酸乙酯、3-羟基己酸或其盐。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述产品为药物或保健品；

所述下消化道肿瘤为结肠肿瘤、回肠肿瘤、直肠肿瘤；

6.一种预防和/或治疗结肠炎、肠炎的产品，其活性成分为3-羟基丁酸及其衍生物。

7.一种预防和/或治疗下消化道肿瘤的产品，其活性成分为3-羟基丁酸及其衍生物。

8.一种调整肠道菌群结构的产品，其活性成分为3-羟基丁酸及其衍生物。

9.根据权利要求6、7或8所述的产品，其特征在于：所述产品为药物或保健品。

10.根据权利要求6、7或8所述的产品，其特征在于：所述产品可制成多种剂型，包括注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液。