JP6499212B2

JP6499212B2 - 成長促進のためのビフィドバクテリウム・ロンガムｃｂｔｂｇ７菌株及びこれを含む成長促進用機能性食品組成物

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Publication number: JP6499212B2
Application number: JP2016576074A
Authority: JP
Inventors: チュンチョン，ミョン
Original assignee: セルバイオテックカンパニーリミテッド
Priority date: 2015-05-21
Filing date: 2015-07-13
Publication date: 2019-04-10
Anticipated expiration: 2035-07-13
Also published as: EP3135754B1; EP3135754A1; SG11201608731XA; US20180179603A1; US20190256934A1; WO2016186245A1; EP3135754A4; US10597740B2; JP2017521071A; CN113367346A; KR101589466B1; CN106715680A

Description

本発明は、成長促進のためのビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７（ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｏｎｇｕｍＣＢＴＢＧ７）菌株及びこれを含む成長促進用機能性食品組成物に関するものであって、より詳しくは、母乳の消化を助けて、ビタミンを合成し、新生児、乳幼児、小児、及び成長期の子供の成長を促進することができるビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７菌株及びこれを含む成長促進用機能性食品組成物に関するものである。

人の成長は、殆ど成長板が開いている思春期までの時期に生じる。成長を医学的に定義すると、成熟に伴われる大きさの変化であるといえ、特に、小児の成長というのは、身長の増加だけでなく、身体の各器官の大きさと機能の増大を包括的に含む概念である。

一般に、人の成長は遺伝的影響が最も大きく影響を及ぼすと認識されているが、実際には遺伝的な影響は２３％程度に過ぎず、残りの７７％は、後天的な影響により決定される。最近、持続的な経済成長や食習慣の西欧化、栄養状態の改善等により、小児及び青少年の成長発育が大きく増加する傾向にある。また、外見や長身を好む社会的雰囲気が高まるにつれて、成長に対する関心が増大している。

これまで知られている成長を促進するための方法としては、成長ホルモン製剤の投与療法がある。しかし、成長ホルモンの使用時、費用負担が大きいだけでなく、注射部位の掻痒感、発作、脂肪萎縮や高血圧、耐糖能（ｇｌｕｃｏｓｅｉｎｔｏｌｅｒａｎｃｅ）、膵炎、全身アレルギー反応、成長ホルモン抗体の陽性、がん発生及び男性の女性化乳房等の症状のような副作用があり得る。従って、成長に根本的に役立つ安全で効果的な食品素材に対する開発が切実に必要なのが実情である。

韓国特許第０８８７３７７号（乳児及び青少年のための健康補助食品）、韓国特許第１０５３０２１１号（学習能力を向上させる健康機能食品組成物及びその製造方法）、韓国特許第０５６１２８６号（乾燥酵母、天然物抽出粉末及び栄養成分混合粉末を含有し、成長の発育に役立つ健康機能性組成物）等がこのような成長促進用食品を提案しているが、これらは成長促進の効果が期待に添えないという限界がある。

本発明者は、成長促進の効能に優れたプロバイオティクスを発掘するために鋭意研究した結果、ビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７（ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｏｎｇｕｍＣＢＴＢＧ７）菌株の成長促進製品としての適用可能性を実験的に確認し、本発明を完成した。本発明の目的は、新生児、乳幼児、小児及び成長期の子供の成長促進用に好適なビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７（ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｏｎｇｕｍＣＢＴＢＧ７）菌株を提供することである。

本発明の他の目的は、母乳オリゴ糖の消化を助けて、ビタミンの合成を促進し、有害細菌の増殖を抑制することによって、新生児、乳幼児、小児及び成長期の子供の成長を促進することができる機能性食品組成物を提供することである。

上述した目的を達成するための本発明の一つの様態は、成長促進のための韓国生命工学研究院遺伝子銀行（ＫｏｒｅａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｆｏｒＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ；ＫＣＴＣ）に受託番号ＫＣＴＣ１２２００ＢＰとして国際寄託されたビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７（ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｏｎｇｕｍＣＢＴＢＧ７）ビフィズス菌に関するものである。

本発明の他の様態は、本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７（ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｏｎｇｕｍＣＢＴＢＧ７）の菌株を含む乳幼児、小児及び成長期の子供の成長発育を促進することができる機能性食品組成物を提供することである。

本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７（ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｏｎｇｕｍＣＢＴＢＧ７）の菌株は、産業的規模で大量生産できず、人の酵素によって消化されない母乳オリゴ糖（ＨｕｍａｎＭｉｌｋＯｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を消化させて供給し、ビタミンの生合成を促進し、腸内の有害細菌の増殖を抑制し、有益菌の生長を促進し、免疫系を調節して、成長促進の効能に優れる。

本発明の成長促進用機能性食品組成物は、新生児、乳幼児、小児及び成長期の子供の体内代謝を均衡的に活性化させ、免疫系を調節し、成長発育に役立つだけでなく、頭脳発達も促進することができる。また、本発明の成長促進用機能性食品組成物は、成長不振、発育不振、体力低下、低体重を改善することができる。

本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７（ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｏｎｇｕｍＣＢＴＢＧ７）ＫＣＴＣ１２２００ＢＰ菌株の１６ＳｒＲＮＡ配列、本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７に関する種の１６ＳｒＲＮＡ配列の相同性及び系統発生的関係（ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）を比較図示したものである。本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７菌株のゲノムＤＮＡのＲＡＰＤ（ＲａｎｄｏｍＡｍｐｌｉｆｉｅｄＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ）の分析結果である。本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７（ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｏｎｇｕｍＣＢＴＢＧ７）ＫＣＴＣ１２２００ＢＰ菌株のゲノムＤＮＡのＰＦＧＥ（ＰｕｌｓｅｄＦｉｅｌｄＧｅｌＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）の分析結果である。本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７菌株及び関連のビフィドバクテリウムの菌株の系統発生のツリーを図示したものである。本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７菌株の母乳オリゴ糖の代謝に関する遺伝子の数を示した図面である。本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７菌株の二次代謝産物の生合成遺伝子の有無を示した図面である。本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７菌株のマウスの生長に及ぼす成長促進効果を示したグラフである。

以下で、本発明についてさらに詳しく説明する。

本発明の一つの様態は、成長促進の効能に優れた韓国生命工学研究院遺伝子銀行（ＫｏｒｅａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｆｏｒＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ；ＫＣＴＣ）に受託番号ＫＣＴＣ１２２００ＢＰとして国際寄託されたビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７（ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｏｎｇｕｍＣＢＴＢＧ７）のビフィズス菌である。

本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７菌株は、人の酵素によっては分解せず、構造が非常に多様で複雑であり、産業的に大量生産が難しい母乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を分解し、そのような菌株を服用する乳児や小児に供給し、また、ビタミンのような人体内で栄養素として機能できる代謝産物を生産し、新生児、乳児及び成長期の子供の成長発育を促進させることができる。

人の母乳は、有益な機能を有する２００種以上の多様なオリゴ糖を含むことが知られている。母乳オリゴ糖（ＨｕｍａｎＭｉｌｋＯｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）は、有益な腸内の微生物叢の増殖及び繁殖を促進し、有害細菌の増殖を阻害して、細胞反応の調節因子として機能し、免疫系を調節し、新生児及び乳児の頭脳成長発達の必須成分として頭脳活動のエネルギーを供給することによって、新生児及び乳児の頭脳発達に寄与することが知られている。

前記母乳オリゴ糖は、上部胃腸官及び小腸での酵素の消化に抵抗性があるため、結腸まで損傷することなく到達し、結腸で結腸発酵に対する基質として機能する。人の母乳は、病原性微生物の増殖を阻止する好ましい腸内細菌叢の増殖を促進するいくつかの因子を含むと考えられている。母乳オリゴ糖が有益菌の数を増加させ、潜在的に病原性である細菌の数を減少させることができる方法は、細胞表面の受容体に対する競争、必須栄養素に対する競争、抗菌剤の生成、及び排泄物のｐＨを下げて、潜在的に病原性である細菌を抑制することができる短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）のような抑制性化合物の生成を通じて起こる。母乳オリゴ糖は発酵し、酢酸、プロピオン酸、及び酪酸のような短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）を生成する。このようなＳＣＦＡは熱量に寄与し、腸上皮に対する主要エネルギー源として機能し、結腸内のナトリウム及び水の吸収を促進し、小腸の消化及び吸収を強化させるものと考えられる。また、ＳＣＦＡは、胃腸の発達及び免疫機能を調節することによって、全般的な胃腸健康に寄与する。

母乳オリゴ糖（ＨＭＯ）は多様な構造のオリゴ糖で構成されるが、主に５つの単糖類：Ｄ−グルコース（Ｇｌｃ）、Ｄ−ガラクトース（Ｇａｌ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｌ−フコース（Ｆｕｃ）とサリチル酸（Ｓｉａ；Ｎ−アセチルノイラミン酸[Ｎｅｕ５Ａｃ]）で構成されている。

本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７菌株のゲノムは、α型のマンノースを加水分解するα−マンノシダーゼ、β型のガラクトースを加水分解するβ−ガラクトシダーゼ、α−マンノシダーゼ及びムチン及びムチン型糖たんぱく質のセリン並びにトレオニン残基のガラクトシル−β−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトースアミンのα結合を加水分解するエンド−α−Ｎ−アセチルガラクトースアミニダーゼをコード化する遺伝子のような母乳オリゴ糖（ＨＭＯ）の消化酵素をコード化する多様な遺伝子を含む。

また、本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７菌株のゲノムは、ビタミンＢ群中、Ｌ−アスパラギン酸塩からニコチン酸（Ｂ３）を合成することができる。

本発明の他の様態によると、本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７菌株は、プロバイオティクスビフィズス菌として用いられたリ、多様な乳製品及びその他発酵製品に用いられることもある。

本発明のまた別の様態は、本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７菌株を含む成長促進用機能性食品組成物に関するものである。母乳オリゴ糖（ＨＭＯ）は、現在としては大量生産や商業的利用ができず、殆どの調整乳または調整食には欠乏している。母乳オリゴ糖（ＨＭＯ）は乳幼児の必須栄養源であるが、人の酵素によっては消化されず、消化されない場合、糞便に排泄される。本発明の成長促進用機能性食品組成物は、母乳オリゴ糖を消化させて供給することによって、新生児及び乳幼児の頭脳発達及び成長発育を促進することができる。前記食品組成物は、食品、補充剤（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、生菌剤または共生剤（ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ）である。本明細書で「生菌剤」という用語は、好適な量で供給される場合、宿主生物の健康に有益な生きている微生物を意味する。本明細書で、「共生剤」という用語は、プレバイオティク（ｐｒｅｂｉｏｔｉｃ）及び生菌剤の混合物を含有する食品を意味する。

本発明の組成物は、実施例によってビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７菌株以外にラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・ヘルヴェティクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・デルブリッキー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｊｏｈｏｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバチルス・ケフィア（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｅｆｉｒ）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・プソイドロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・テルモフィルム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｈｅｍｏｐｈｉｌｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）で構成される群から選択される１種以上のプロバイオティク乳酸菌またはビフィズス菌をさらに含み得る。

本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７菌株は、ビフィズス菌の培養に通常用いられる培地を使用し、通常用いられる条件下で培養することによって、増殖して回収できる。培養後に得られる培養物をそのまま用いてもよく、さらに、必要に応じて遠心分離等による粗精製及び／またはろ過等による固液分離や滅菌操作を行ってもよい。好ましくは、遠心分離を行い、ビフィズス菌の菌体のみを回収する。また、本発明で使用するビフィズス菌は、湿潤菌体であってもよく、または乾燥菌体であってもよい。例えば、凍結乾燥により生菌剤の形で製造して用いられ得る。

本発明の組成物は、ビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７菌株以外に通常の担体または賦形剤をさらに含み得、これ以外にもバインダー、分解剤、コーティング剤、潤滑剤等のような通常用いられる多様な添加剤と剤形化して調製されることができる。

本発明の組成物は、前記ビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７菌株と適切な担体、賦形剤、補助有効成分等との混合によって粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセルまたは液状の形で剤形化され得る。また、本発明の菌株は、公知の方法を使用し、胃腸を通過した後、大腸に到達し、活性成分であるビフィズス菌が迅速に腸内に放出されるように腸溶被覆され製品化されることができる。

本発明で使用可能な賦形剤は、スクロース、ラクトース、マンニトール、グルコース等のような砂糖及びコンスターチ、バレイショデンプン、米デンプン、部分的にプレゼラチン化したデンプン等の澱粉を含む。バインダーは、デキストリン、アルギン酸ナトリウム、カラギーナン、グアーガム、アカシア、アガー等の多糖類、トラガカント、ゼラチン、グルテン等の天然−発生の巨大分子物質、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルエチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース誘導体及びポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセテート、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びビニルアセテート樹脂等の高分子を含む。

分解剤としては、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、低置換ヒドロキシプロピルセルロース等のセルロース誘導体及びカルボキシメチルナトリウムデンプン、ヒドロキシプロピルデンプン、コンスターチ、バレイショデンプン、米デンプン及び部分的にプレゼラチン化したデンプン等の澱粉を使用し得る。

本発明で使用可能な潤滑剤の例は、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、コロイドシリカ、ヒドロシリコンジオキシド、多様な種類のワックス及びヒドロゲネイティッドオイル等を含む。

コーティング剤としては、ジメチルアミノエチルメタクリレート−メタクリル酸共重合体、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、エチルアクリレート−メタクリル酸共重合体、エチルアクリレート−メチルメタクリレート−クロロトリメチルアンモニウムエチルメタクリレート共重合体、エチルセルロース等の水不溶性重合体、メタクリル酸−エチルアクリレート共重合体、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートコハク酸塩等の張性重合体及びメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール等の水溶性重合体を含むが、必ずこれらに制限されるわけではない。

本発明の成長促進用組成物で、有効成分である前記ビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７菌株の含量は、体重、年齢や性別等を考慮して適切に決定されることができる。一例として、本発明の組成物は、組成物の総重量に対して、有効成分としてビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７菌株を栄養的に有効な濃度で含むが、好ましくは１０^８乃至１０^１２ｃｆｕ／ｇの含量で含むか、同等の数の生菌を有する培養物を含む。一般に、成人の場合、１×１０^６以上の生菌、好ましくは１×１０^８乃至１×１０^１２の生菌を必要に応じて一回または数回にわたって分けて服用することができる。

また別の様態で、本発明の成長促進用機能性食品組成物は、ビフィドバクテリウム・ロンガムインファンティスＣＢＴＢＴ１(Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｏｎｇｕｍｂｖ. ｉｎｆａｎｔｉｓＣＢＴＢＴ１)（ＫＣＴＣ１１８５９ＢＰ）、ビフィドバクテリウム・ブレーベＣＢＴＢＲ３（ＫＣＴＣ１２２０１ＢＰ）、及びビフィドバクテリウム・ビフィドゥムＣＢＴＢＦ３（ＫＣＴＣ１２１９９ＢＰ）で構成される群から選択される一つ以上の他のプレバイオティク（ｐｒｅｂｉｏｔｉｃ）をさらに含み得る。このような組成物は、各々のビフィズス菌を同一の割合で含み得る。

以下で、本発明を実施例によって詳しく説明する。但し、下記実施例は、本発明を例示するものであるだけで、本発明の内容が下記実施例によって限定されるわけではない。

＜実施例１＞ビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７（ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｏｎｇｕｍＣＢＴＢＧ７）菌株の分離及び同定
１−１．新規な菌株の選抜
ヒトの糞便１ｇを滅菌嫌気水に連続希釈した後、各希釈液１ｍｌをＧｌｕｃｏｓｅＢｌｏｏｄＬｉｖｅｒ（ＢＬＢＤ、ＵＳＡ）固体培地に注ぎ、嫌気条件で３日間培養した。生成されたコロニーを再度ＢＬにＢＣＰ（Ｂｒｏｍｏｃｒｅｓｏｌｐｕｒｐｌｅ、０．１７ｇ/Ｌ）を添加したビフィズス菌選択培地に選び出した後、同じ条件で再度３日間培養した。コロニーの周辺の色が黄色に変化したビフィズス菌のコロニーを選択した後、生化学的、分子生物学的同定を行い、その後、菌株の物理的特性に最も優れる菌株１種を最終選抜した。

１−２．選抜された菌株の同定
１）糖利用性の分析
ヒトの糞便から分離した菌株に対して、ＡＰＩＣＨＬ５０キットを用いて糖利用性を確認した。糖利用性確認の結果は、ＡＰＩウェブ（ｈｔｔｐｓ：//ａｐｉｗｅｂ.ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ.ｃｏｍ）に入力して確認し、その結果を表１に示した。

２）１６ｓｒＲＮＡの同定
選抜された菌株を分子生物学的方法を用いて同定するために、１６ｓｒＲＮＡ塩基配列を分析した。糞便から分離した菌株の純粋培養液１ｍｌでＡｃｃｕｐｒｅｐゲノム抽出キット（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｋｏｒｅａ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡを鋳型として１６ｓｒＲＮＡ領域をプライマーＦ（５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’）とプライマーＲ（５’−ＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＧＣＣ−３’）を用いてＰＣＲ（ＭｙＣｙｃｌｅｒ、ＢＩＯ−ＲＡＤ、ＵＳＡ）を行った。ＰＣＲ産物は、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）に連結し、Ｅ.ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５αに形質転換させた後、ＬＢ／ｘ−ｇａｌ／ａｍｐｐｌａｔｅに塗抹し、３７℃で一晩培養した。スクリーニングを通じて形質転換体から挿入体を含む組み換えプラスミドを分離した後、ＤＮＡ塩基配列の分析を行った。ＤＮＡ塩基配列の分析は、ＤＮＡｓｔａｒｐｒｏｇｒａｍのＣｌｕｓｔｅｒＶｍｅｔｈｏｄを用いてＢ．ｌｏｎｇｕｍ^T （ＡＴＣＣ１５７０７）をはじめとしたビフィドバクテリウム属の様々な菌株との相同性を比較した。分離菌株の16ｓｒＲＮＡ塩基配列は、図１に図示されたように、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ^T （ＡＴＣＣ１５７０７）と９９．１％の相同性を示した。

３）ＲＡＰＤ（ＲａｎｄｏｍＡｍｐｌｉｆｉｅｄＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ）の分析
ＲＡＰＤ分析は、糞便から分離したビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７からゲノムＤＮＡを抽出し、分離したＤＮＡを鋳型として（ＧＴＧ）_５（５’−ＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧ −３’）プライマーを用いて、ＰＣＲ−ＲＡＰＤ（ＭｙＣｙｃｌｅｒ、ＢＩＯ−ＲＡＤ、ＵＳＡ）を行った。最終の産物であるＰＣＲ産物は、ＥｔＢｒに染色した後、Ｇ：ＢＯＸ（ＳＹＮＧＥＮＥ、ＵＫ）で観察した。また、ＰＦＧＥ分析は、純粋培養したビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７を最終のＯＤをＯＤ_６００＝４としてプラグを作製した後、様々な酵素を用いてゲノムＤＮＡを切って電気泳動を行った後、対照群であるＢ．ｌｏｎｇｕｍ^T （ＡＴＣＣ１５７０７）と比較分析した。

ＲＡＰＤの結果では、分離した菌株は、図２に図示されたように、ビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７がＢ．ｌｏｎｇｕｍ^T （ＡＴＣＣ１５７０７）と相違したバンドパターンを示した。図２におけるレーン１は、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ^T （ＡＴＣＣ１５７０７）の結果であり、レーン２は、ビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７の結果である。上記の結果に基づき、糞便から分離した微生物であるビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７は、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ^T （ＡＴＣＣ１５７０７）と異なる新規な菌株であることを確認した。

４）ＰＦＧＥ（ＰｕｌｓｅＦｉｅｌｄＧｅｌＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）の分析
ＢＬｂｒｏｔｈで純粋培養したビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７のＯ．Ｄ．を測定した後、２％ｏｗＭｅｌｔｉｎｇＡｇａｒｏｓｅを用いて、最終にＯＤ_６００＝４に合わせてプラグ（ｐｌｕｇ）を作製した後、様々な酵素を用いてゲノムＤＮＡを切った後に電気泳動を行い、対照群であるＢ．ｌｏｎｇｕｍ^T （ＡＴＣＣ１５７０７）と比較分析した。

作製されたプラグを１ｍｌリゾチーム緩衝液（２ｍｇ／ｍｌＬｙｓｏｚｙｍｅ（Ｓｉｇｍａ）、０．０５％Ｎ−ｌａｕｏｒｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ））に入れて、４ｍｇ／ｍｌＬｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ（ｓｉｇｍａ）１０ μlを加えた後、３７℃で一晩反応させた。プラグを慎重に取り外してＮＤＳ緩衝液（1ｍｌ１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）、１０ｍｌ１００％ＳＤＳ、８９ｍｌ０．５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ＝８．５）４ｍｌに入れて、５０℃で一晩反応させた。以降、軽く振とうしながら、５０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．５）１０ｍｌでプラグを６回洗浄した後、処理しようとする酵素緩衝液４００μlにプラグを慎重に移し、常温で３０分放置する。プラグを新たな酵素緩衝液４００μlに移した後、制限酵素（２０Ｕ）を入れて、３７℃で一晩反応させた。このとき、制限酵素はＸｂａＩとＡｐａＩを使用した。電気泳動はＣＨＥＦシステム（ＢＩＯ−ＲＡＤ、ＵＳＡ）を用いて、０．５ＸＴＢＥで５．３ｃｍ／Ｖ、１ｓ〜１５ｓパルスタイム、１８時間実施した。

電気泳動が完了した後、ＥｔＢｒ溶液で染色した後、Ｇ：ＢＯＸ（ＳＹＮＧＥＮＥ、ＵＫ）でバンドパターンを観察した。ＸｂａIとＡｐａIを用いたＰＦＧＥの結果、糞便から分離したビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７は、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ^T （ＡＴＣＣ１５７０７）と相違したバンドパターンを示す新たな菌株であることを確認した。図３におけるレーン１は、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ^T （ＡＴＣＣ１５７０７）の結果であり、レーン２は、ビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７の結果である。

５）酵素活性試験
ビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍＣＢＴＢＧ７）の酵素活性を測定するためにＡＰＩＺＹＭキットを用いて生成酵素の差を確認した。ビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７とＢ．ｌｏｎｇｕｍ^T （ＡＴＣＣ１５７０７）の酵素活性可否を比較したとき、ビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７はＢ．ｌｏｎｇｕｍ^T （ＡＴＣＣ１５７０７）とほぼ類似する酵素活性を示した。特に、ビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７は、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ^T （ＡＴＣＣ１５７０７）で酵素活性を示さないβ−グルコシダーゼ活性を示し、このような酵素はグラム陰性病原体の菌株細胞壁のペプチドグリカンに含まれているグルコースを分解し、病原性菌株の成長を阻害させる役割を果たす。また、発がん性酵素であるβ−Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅの活性を示さなかった。

６）その他菌学的特性
本発明によるビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７の特性は次の通りである。

以上の結果に基づき、前記菌株を“ビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７（ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｏｎｇｕｍＣＢＴＢＧ７）”菌株と名付けて、２０１２年５月７日付で韓国の特許菌株寄託機関である微生物資源センター（ＫＣＴＣ）に寄託し、受託番号ＫＣＴＣ１２２００ＢＰの付与を受けた。

１−３．機能性及び安定性
１）抗生剤の耐性実験
分離したビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７（ＫＣＴＣ１２２００ＢＰ）の安全性を検証するために、抗生剤の耐性を分析した。抗生剤の耐性実験は、ＥｕｒｏｐｅａｎＦｏｏｄＳａｆｅｔｙＡｕｔｈｏｒｉｔｙ（ＥＦＳＡ）で推薦するｍｉｃｒｏ−ｄｉｌｕｔｉｏｎ方法を用いて行い、実験に用いられた抗生剤は１０種であって、アンピシリン（ＡＭＰ）、バンコマイシン（ＶＡＮ）、ゲンタマイシン（ＧＥＮ）、カナマイシン（ＫＡＮ）、ストレプトマイシン（ＳＴＭ）、エリトロマイシン（ＥＲＭ）、シナシッド（Ｑ／Ｄ）、クリンダマイシン（ＣＬＭ）、テトラサイクリン（ＴＥＴ）及びクロラムフェニコール（ＣＰ）である。

クリンダマイシンを除いた抗生剤に対しては、ＩＳＯ−ｓｅｎｓｉｔｅｓｔｂｒｏｔｈ１０％とＭＲＳｂｒｏｔｈ９０％とを混合したｂｒｏｔｈに２５６、１２８、６４、３２、１６、８、４、２、１、０．５ μg／ｍｌの濃度で添加し、クリンダマイシンはラクトバチルスグループのＥＦＳＡブレークポイント値が０．２５μｇ／ｍｌ以下であるため、抗生剤の濃度は１６、８、４、２、１、０．５、０．２５、０．１２５、０．０６２５、０．０３１２５μg／ｍｌの濃度で添加して使用した。また、シナシッドはＢｉｏＭｅｒｉｕｘ社のＥ−テストストリップを用いて行った。

マイクロプレートを３７℃下の嫌気性条件下で４８時間インキュベーションし、続いてＭＩＣを可視的な成長が観察されない最低の抗生剤濃度で測定した。ＥＦＳＡブレークポイントに基づき、ビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７（ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｏｎｇｕｍＣＢＴＢＧ７)が各々の抗生剤に対して耐性があるか否かを確認するために、下記表４に示した。

分離したビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７は、実験に用いられた全ての抗生剤に対する耐性がＥＦＳＡ抗生剤の耐性基準よりも低く示されたため、ＥＦＳＡの抗生剤に対する安定性の基準に好適なものと確認された。ビフィドバクテリアは、シトクロム−媒介の薬物輸送システムの欠如でカナマイシンのようなアミニグリコシドに対して耐性があることが報告されているため、ＥＦＳＡはビフィドバクテリウムに対する薬剤のＭＩＣ値を要求しない。

２）腸定着性実験
ビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７の腸定着性の測定は、ビフィドバクテリウム・ロンガム^T （ＡＴＣＣ１５７０７）を対照群として人の大腸上皮細胞に由来するＨＴ−２９細胞株で実施した。ＨＴ−２９細胞株に各菌株を１時間処理した後、グラム染色と生菌の数を測定することによって、菌株の腸定着能を比較し、下記表５に示した。

腸定着性の測定結果、ビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７菌株は、ビフィドバクテリウム・ロンガム^T（ＡＴＣＣ１５７０７）菌株よりも優れた腸定着性を示す菌株であることを確認した。このような結果は、本発明の前記菌株が腸上皮細胞に付着し、腸内環境を改善することができるということを示す。

３）急性毒性実験
本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７菌株に対する安全性を検証するために、実験動物を対象に急性毒性実験を実施した。６週齢の雌雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）系マウスに本発明の凍結乾燥された菌株を１．０×１０^１１ｃｆｕ／ｋｇで経口投与した。対照群には０．８５％塩水を胃内に投与した。全ての実験動物に対する臨床症状は、試料投与の１日から剖検日まで１日１回ずつ１４日間観察した。観察結果は、下記表６に示した。

ビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７菌株を投与した後、全ての対照群及び投与群で死亡率を観察できず、また、特異的な臨床症状を示す個体を見つけることができなかった。さらに、投与後１４日間の餌と水の摂取量、及び体温を観察した結果、投与群と対照群との間に統計学的に有意的な差を見つけることができなかった。

＜実施例２＞ビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７菌株の遺伝子分析
ビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７（ＫＣＴＣ１２２００ＢＰ）菌株のゲノムシーケンシングは、ＰａｃＢｉｏＲＳＩＩＳｙｓｔｅｍ（ＤＮＡＬｉｎｋ、ＲｅｐｕｂｌｉｃｏｆＫｏｒｅａ）を用いて行った。ゲノムに対して、１０ｋｂのライブラリーを作り、Ｃ２−Ｐ４ｃｈｅｍｉｓｔｒｙを有するＳＭＲＴｃｅｌｌのうち一つを用いて、ゲノムシーケンシングを実施した。ゲノムシーケンシングによって３３７，６５５，２８２ｂｐの長い配列が収得された。ＳＭＲＴｐｉｐｅＨＧＡＰによりＤｅｎｏｖｏ組立を実施し、ＳＭＲＴｐｉｐｅＡＨＡによってスキャフォールディングとギャップフィリングを行った。構造遺伝子の予測は、Ｇｌｉｍｍｅｒ３とし、遺伝子ａｎｎｏｔａｔｉｏｎはＰｆａｍ、Ｕｎｉｒｅｆ１００、ＫＥＧＧ、ＣＯＧ及びＧｅｎＢａｎｋＮＲデータベースに対してＢＬＡＳＴＰによって得た結果を用いて、ＡｕｔｏＦＡＣＴ（Ｋｏｓｋｉｅｔａｌ. ２００５）によって行った。ＴｒａｎｓｆｅｒＲＮＡ及びリボソームＲＮＡは、各々ｔＲＮＡｓｃａｎ−ＳＥ（ＬｏｗｅａｎｄＥｄｄｙ１９９７）及びＲＮＡｍｍｅｒ（Ｌａｇｅｓｅｎｅｔａｌ. ２００７）を用いて行った。ＣｌｕｓｔｅｒｓｏｆＯｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓＧｒｏｕｐｓ（ＣＯＧｓ）ｃａｔｅｇｏｒｙによる遺伝子の機能的分類は、ｅ−ｖａｌｕｅｃｕｔｏｆｆを１ｅ−２未満としてＲＰＳ−ＢＬＡＳＴを用いて行った（Ｍａｖｒｏｍａｔｉｓｅｔａｌ. ２００９）。

ゲノム上の特殊な遺伝子の存在は、収集されたデータセットに対して配列相同性≧５０％のパラメータでＢＬＡＳＴＰを用いて行った。ゲノムの代謝経路の分析は、ＫＥＧＧａｕｔｏｍａｔｉｃａｎｎｏｔａｔｉｏｎｓｅｒｖｅｒを用いて行った（Ｍｏｒｉｙａｅｔａｌ. ２００７）。二次代謝産物の生合成遺伝子の分析は、ａｎｔｉＳＭＡＳＨｖｅｒｓｉｏｎ３.０.０（Ｂｌｉｎｅｔａｌ. ２０１３；Ｂｌｉｎｅｔａｌ. ２０１４）（ｈｔｔｐ：//ａｎｔｉｓｍａｓｈ.ｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ.ｏｒｇ/）を用いて行った。

２−１．ＨＭＯ（ＨｕｍａｎＭｉｌｋＯｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）代謝関連の遺伝子
本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７菌株のゲノムの遺伝子コンテンツ分析の結果、母乳オリゴ糖代謝に関する遺伝子中、β−ガラクトシダーゼ、α−マンノシダーゼ及びエンド−α−Ｎ−アセチルガラクトースアミニダーゼをコード化する遺伝子を含むことが確認された。これによって、本発明の菌株が人の酵素によって消化されない母乳オリゴ糖を消化させて供給することができるということが分かる（図５参照）。

２−２．ビタミン生合成遺伝子
遺伝子分析の結果、本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７菌株は、ビタミンＢ群中、Ｌ−アスパラギン酸塩からニコチン酸（Ｂ３）を生合成する遺伝子を有することが確認された。

２−３．有害細菌の成長抑制
本発明の菌株の抗菌剤の生成によって有害菌の生長を抑制する効果を確認するために、ビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７菌株のゲノム上で二次代謝産物の生合成及び抗生剤の生産に関する遺伝子の存在可否を分析した。

図６を参照すると、二次代謝産物の生合成を調査した結果、本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７菌株は、バクテリオシンをコード化する遺伝子を含むことが確認された。このような結果を見るとき、本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７菌株は、バクテリオシンのような抗菌化合物の生産によって病原菌の増殖を抑制することができるということが分かる。

２−４．病原性遺伝子の不在
ＰＡＩｓ (Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙｉｓｌａｎｄｓ) 及びＲＥＩｓ（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｓｌａｎｄｓ）に対する分析は、ＰＡＩデータベース（Ｙｏｏｎｅｔａｌ. ２００７; Ｙｏｏｎｅｔａｌ. ２０１５）のＰＡＩｆｉｎｄｅｒを用いて行った。分析の結果、本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７菌株のゲノムには、ＰＡＩ (Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙｉｓｌａｎｄｓ) 及びＰＡＩ−類似領域は存在しないことが確認された。

実施例３．ビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７菌株の成長促進効果
以下の実施例で、本発明の菌株の特性と成長促進用効能を立証する。全ての実施例の実験結果は、平均（ｍｅａｎ）±標準偏差（ＳＤ）で表し、実験結果の統計処理は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ^ＴＭ６．０を用いて、実験群間の平均の差は、ｏｎｅ−ｗａｙＡＮＯＶＡで有意性を確認した後、Ｔｕｋｅｙ’ｓｍｕｌｔｉｐｌｅｒａｎｇｅｔｅｓｔを用いて事後検証した。.

３−１．本発明の菌株の培養物及びそれを含む組成物の製造
ビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７菌株（ＫＣＴＣ１２２００ＢＰ）をＢＬブロス（ＢＤＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ）で２４時間３７℃で培養し、リン酸塩バッファー溶液（ＰＢＳ、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１３０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）に１０^１１ＣＦＵ／ｍｌで希釈して超音波処理した後、上澄み液を遠心分離し、０．４５μｍポアサイズのフィルタでろ過し、凍結乾燥した後、−２０℃に生体内実験前まで保管した。

３−２．肥満動物のモデル及びサンプリング
動物実験は、ＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）のＡｎｉｍａｌｕｓｅａｎｄＣａｒｅＰｒｏｔｏｃｏｌを遵守して行った。実験動物は、ＳａｅｒｏｎｂｉｏＩｎｃ．（Ｕｉｗａｎｇ、Ｋｏｒｅａ）で雄のＳＤ実験用マウス６週齢を（グループ当たり１０匹、雌５匹、雄５匹）購入し、２４時間の適応期間を有した後、１７日間の飼育が行われ、飼育環境は２４±２℃、湿度５５±１５％でｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅが１２時間維持された。基礎食餌のために１７日間麦成分の飼料（ｂａｒｌｅｙｆｅｅｄ、Ａ０４、ＵＡＲ、Ｖｉｌｅｍｏｉｓｓｏｎ−ｓｕｒ−Ｏｒｇｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を摂取するようにし、飲用水は自由に摂取したり、ビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７（１０^７ＣＦＵ/ｈｅａｄ/ｄａｙ）を飲用水に混ぜて摂取するようにした。

３−３．本発明の菌株の成長発育促進の効果
本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７菌株の成長促進の効能を観察するために、麦成分の飼料を１７日間食べさせて基礎食餌を誘導し、実験を始めた後１７日まで毎日体重と摂取した飲用水及び飼料の量を測定した。体重の増加は、実験日の体重から実験開始日の体重を引いて計算した。飲用水と飼料は、ケージ別に測定した後、匹当たり計算して１７日までの総量を計算した。体重増加の効率は、総摂取した飼料の量から増加した体重を割って計算した。

図７を参照すると、ビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７を飲用水に混ぜて食べさせたグループ（ＣＢＴＢＧ７）の場合、一般の飲用水を正常的に食べさせたグループ（ＮＣ）に比べ、９日から有意性のあるように体重が増加することを観察した（１２ｄａｙ; ｐ＜０．０５、１３ｔｏ１７ｄａｙｓ; ｐ＜０．０１）（図７（Ａ））。しかし、１７日間摂取した総飼料の摂取量（ＦＩ）と飲用水の量（ＷＩ）は、二つのグループ間で特別な差を示さなかった（図７（Ｂ））。本発明の菌株の投与が飼料摂取に影響を与えず、体重（ＷＧ）の増加が飼料摂取量（ＦＩ）の差に起因していないことが確認できる。このように摂取した飼料の量に対する体重増加の効率（ＦＩ／ＷＧ）は、正常グループに対してビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７を摂取したグループで有意味な結果が示され、本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＣＢＴＢＧ７菌株の投与により成長が促進されることが確認された。

以上で、本発明についてその好ましい実施例を中心に見た。本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者は、本発明が本発明の本質的な特性から外れない範囲内で多様に変形または変更された形で具現できるということを理解できるであろう。従って、本発明の真の保護範囲は、前述の実施例ではなく、以下の特許請求範囲及びそれと均等な範囲に解釈されなければならない。

Claims

受託番号ＫＣＴＣ１２２００ＢＰとして国際寄託されたビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｏｎｇｕｍ）ＣＢＴＢＧ７株ビフィズス菌を有効成分として含有する成長促進用食品組成物。
前記ビフィズス菌は、β−ガラクトシダーゼ、α−マンノシダーゼ及びエンド−α−Ｎ−アセチルガラクトースアミニダーゼをコードする遺伝子を有することを特徴とする請求項１に記載の成長促進用食品組成物。
前記ビフィズス菌は、Ｌ−アスパラギン酸塩からニコチン酸（Ｂ３）を合成する遺伝子を有することを特徴とする請求項１に記載の成長促進用食品組成物。
前記ビフィズス菌の生菌または乾燥菌を１０ ⁸ 乃至１０ ¹²ｃｆｕ／ｍｌ含むことを特徴とする、請求項１に記載の成長促進用食品組成物。
請求項１から４のいずれか１項に記載の食品組成物を含有する、食品。
請求項１から４のいずれか１項に記載の食品組成物を含有する、機能性食品。