CN115011518A - 一种具有缓解结肠炎相关结直肠癌作用的乳酸菌混合物及其应用 - Google Patents
一种具有缓解结肠炎相关结直肠癌作用的乳酸菌混合物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明开发一种具有缓解结肠炎相关结直肠癌作用的乳酸菌混合物及其应用。混合物包括两歧双歧杆菌H3‑R2和乳酸乳球菌KLDS4.0325(活菌数1:1)。评估了两菌及其混合物对结肠癌HT‑29细胞的影响，发现三者均可抑制HT‑29细胞增殖，上调Caspase‑3、Caspase‑9和Bax，下调Bcl‑2，促进HT‑29细胞凋亡。探究了两菌及其混合物对AOM/DSS诱导的结肠炎相关结直肠癌小鼠的影响。发现显著降低了结肠缩短、髓过氧化物酶(MPO)活性以及HIF‑1α水平；改善了CAC小鼠结肠组织学损伤，并表现出较低的白介素‑6(IL‑6)、白介素‑1β(IL‑1β)、白介素‑22(IL‑22)、白介素‑17(IL‑17)和肿瘤坏死因子‑α(TNF‑α)水平，同时上调了结肠和血清中抗炎细胞因子IL‑10的水平。此外，两菌联合使用能增加结肠紧密连接蛋白(ZO‑1、Claudin‑1和Occludin)的表达。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种具有缓解结肠炎相关结直肠癌作用的乳酸菌混合物及其应用。
背景技术
结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是全球最常见的癌症类型之一，其发病率仅次于乳腺癌和肺癌，同结直肠癌也是全球第二大癌症相关死亡原因。多数肠癌与炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)存在密切关系，IBD包括溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis，UC)和克罗恩病(crohn’s disease，CD)，UC主要表现为结肠和直肠黏膜发炎，而克罗恩病则会影响口腔至肛门的任何部位。长期的慢性炎症刺激，可能会导致组织的进一步增生，进而引发肿瘤。结肠炎相关结直肠癌(colitis-associated colorectal cancer，CAC)是其中比较典型的由炎症引发癌症的例子，已经有多项研究证实UC与CAC之间的关系。据报道，溃疡性结肠炎患者在发病30年后，其CRC发病率高达18％，远大于一般人群。目前，炎症与肿瘤的关系已成为深入了解肿瘤发生发展的研究热点。因此，控制疾病活动、维持长时间缓解、预防癌变的发生至关重要。
益生菌可通过一系列作用机制对结直肠癌起到预防作用，包括改变肠道微生物组成；通过促进癌细胞凋亡以及调节细胞分化抑制肿瘤生长，并通过抑制细胞增殖阻碍肿瘤发展；与腐败和致病微生物竞争，恢复受损的黏膜屏障功能；增强宿主免疫反应，抑制炎症反应等。由于菌株特性不同，不同益生菌菌株及组合对CAC表现出不同程度的缓解作用。研究发现双歧杆菌具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，动物实验表明，大鼠服用双歧杆菌后，结肠癌的癌前病变降低25～30％。嗜酸乳杆菌、两歧双歧杆菌和婴儿双歧杆菌的混合物可以调节结直肠癌大鼠微生物菌群组成，通过TLR2信号促进紧密连接蛋白ZO-1、Occludin的表达，增强肠黏膜上皮屏障完整性，从而减少肿瘤的发生。而关于乳酸乳球菌对CAC的影响研究较少。乳酸乳球菌广泛应用于乳制品发酵，本课题组前期从新疆传统乳制品中分离出一株乳酸乳球菌KLDS4.0325，含有KLDS4.0325的发酵乳具有调节小鼠肠道菌群的作用。我们之前的研究表明两歧双歧杆菌H3-R2具有恢复小鼠受伤肠粘膜，增加绒毛长度和隐窝深度的能力。因此基于现状，两歧双歧杆菌与乳酸乳球菌混合物用于CAC的缓解具有非常重要的现实意义及应用价值。
发明内容
本发明提供了一种具有缓解结肠炎相关结直肠癌作用的乳酸菌混合物，通过体外试验及动物试验判断其初步预防及缓解CAC的效果。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：一种具有缓解结肠炎相关结直肠癌作用的乳酸菌混合物及其应用，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)菌株的培养：混合菌悬液是将H3-R2与KLDS 4.0325以活菌数1:1比例混合。(2)体外评估两菌及其混合物对结肠癌HT-29细胞的增殖抑制及促凋亡作用：通过CCK-8法检测菌株对HT-29细胞的增殖抑制作用；通过流式细胞仪检测细胞凋亡；通过RT-qPCR检测HT-29细胞凋亡相关mRNA表达；通过Western blot检测HT-29细胞凋亡相关蛋白表达。(3)利用AOM/DSS诱导的小鼠模型评估受试菌株对CAC的作用效果：使用雄性5周龄C57BL/6J小鼠，饲养温度23±2℃，湿度55±5％，12h交替光照。将60只小鼠试喂养1周后随机分为6组：正常组(NC)、模型组(MC)、阳性对照组(PC)、两歧双歧杆菌H3-R2组(BH)、乳酸乳球菌KLDS4.0325组(LK)以及H3-R2加KLDS4.0325混菌组(BL)。对不同组小鼠体重、脾脏指数、结肠组织状态、结肠组织髓过氧化物酶(MPO)活力、缺氧诱导因子(HIF-1α)、血清及结肠组织中的细胞因子、紧密连接蛋白、Ki67免疫组化以及NLRP3信号通路相关基因mRNA的表达水平进行测定，并对小鼠肠道菌群进行分析。
所述的两歧双歧杆菌H3-R2和乳酸乳球菌乳酸亚种KLDS4.0325由实验室自行分离，保藏于东北农业大学乳品科学教育部重点实验室。
所述的CCK-8法检测菌株对HT-29细胞的增殖抑制作用为：目的菌株与HT-29细胞共同孵育6h和12h后，目的菌株对HT-29细胞表现出不同程度的抑制作用，BL对HT-29增殖的抑制率显著高于单个菌株处理组。
所述的流式细胞仪检测HT-29细胞的凋亡情况。目的菌株单独或混合作用均可促进HT-29细胞凋亡，H3-R2与KLDS4.0325混菌作用效果优于单个菌株作用效果。
所述的RT-qPCR检测HT-29细胞凋亡相关mRNA表达结果为：HT-29细胞经药物5-FU处理后，Caspase-3、Caspase-9、Bax蛋白表达水平显著升高，而Bcl-2蛋白表达水平显著降低。与正常对照组(NC组)相比，BH组、LK组以及BL组的Caspase-3、Caspase-9和Bax mRNA相对表达量显著上调，Bal-2的表达量显著下调。
所述的Western blot检测HT-29细胞凋亡相关蛋白表达结果为：BH、LK以及BL处理的Caspase-3、Caspase-9和Bax蛋白水平显著高于正常对照组，Bcl-2蛋白水平显著低于正常对照组，其中BL组调节蛋白表达效果最显著。
所述的小鼠体重变化为：AOM/DSS处理使得小鼠体重下降，显著低于正常组。两歧双歧杆菌H3-R2与乳酸乳球菌KLDS4.0325的单独或联合干预能显著改善AOM/DSS小鼠体重减轻的状况。
所述的结肠长度及结肠组织状态为：两歧双歧杆菌H3-R2与乳酸乳球菌KLDS4.0325单独或联合使用可显著缓解AOM/DSS小鼠结肠缩短的情况。并显著改善AOM/DSS处理导致小鼠结肠上皮结构破坏，炎症细胞浸润，隐窝扭曲等症状。
所述的小鼠脾脏指数为：两歧双歧杆菌H3-R2联合乳酸乳球菌KLDS4.0325使用可显著缓解小鼠由于AOM/DSS刺激引起的小鼠脾脏肿大。
所述的结肠组织髓过氧化物酶(MPO)活力及缺氧诱导因子(HIF-1α)为：两歧双歧杆菌H3-R2单独作用或与乳酸乳球菌KLDS4.0325联合作用可显著降低CAC小鼠结肠的MPO活性。两菌单独或联合作用均能显著降低AOM/DSS小鼠结肠中HIF-1α水平。
所述的血清及结肠组织细胞因子含量为：两歧双歧杆菌H3-R2与乳酸乳球菌KLDS4.0325单独或联合使用均可不同程度增加IL-10浓度，降低IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-17和IL-22的浓度。
所述的紧密连接蛋白及Ki67免疫组化结果：两歧双歧杆菌H3-R2联合乳酸乳球菌KLDS4.0325使用可增加结肠紧密连接蛋白表达(ZO-1，Occludin和Claudin-1)，改善肠道屏障功能。并可显著减少AOM/DSS小鼠结肠中的Ki67的表达。
所述的NLRP3信号通路mRNA表达为：两歧双歧杆菌H3-R2与乳酸乳球菌KLDS4.0325单独或联合均可不同程度降低AOM/DSS小鼠结肠中NLRP3、Caspase-1和IL-1β的转录水平。
所述的肠道菌群组成分析结果为：两歧双歧杆菌H3-R2联合乳酸乳球菌KLDS4.0325的干预可降低AOM/DSS诱导的疣微菌门丰度增加，增加放线菌门相对丰度；在属水平上，两菌联合使用可显著降低Prevotellaceae、Oscillibacter和Akkermansia的相对丰度，增加Lactobacillus的相对丰度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图；
图1为不同受试物与HT-29细胞共孵育6h(A)和12h(B)时对HT-29细胞增殖的抑制作用；
图2为各处理组HT-29细胞的凋亡情况；
图3为HT-29细胞凋亡相关蛋白Caspase-3(A)Caspase-9(B)Bax(C)Bcl-2(D)mRNA的表达；
图4为HT-29细胞凋亡相关蛋白的表达；
图5为实验过程中小鼠体重的变化；
图6为小鼠的结肠；
图7为小鼠的脾脏指数；
图8为小鼠结肠组织HE染色切片(H&E染色，放大倍数×200)；
图9为小鼠结肠组织中MPO活性；
图10为小鼠结肠组织中HIF-1α的含量；
图11为小鼠结肠中细胞因子的浓度；
图12为小鼠血清中细胞因子的浓度；
图13为紧密连接蛋白表达；
图14为Ki67表达；
图15为小鼠结肠组织中NLRP3(A)、Caspase-1(B)、IL-1β(C)的mRNA相对表达量；
图16为小鼠肠道菌群在门水平上的结构组成；
图17为小鼠肠道菌群在属水平上的结构组成。
具体实施方式
下面结合附图对本发明具体实施例进行详细描述。
一种具有缓解结肠炎相关结直肠癌作用的乳酸菌混合物及其应用，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)菌株的培养：混合菌悬液是将H3-R2与KLDS 4.0325以活菌数1:1比例混合。(2)体外评估两菌及其混合物对结肠癌HT-29细胞的增殖抑制及促凋亡作用：通过CCK-8法检测菌株对HT-29细胞的增殖抑制作用；通过流式细胞仪检测细胞凋亡；通过RT-qPCR检测HT-29细胞凋亡相关mRNA表达；通过Western blot检测HT-29细胞凋亡相关蛋白表达。(3)利用癌症小鼠模型评估受试菌株对CAC的作用效果：使用雄性5周龄C57BL/6J小鼠，饲养温度23±2℃，湿度55±5％，12h交替光照。动物模型建立方法为：腹腔注射AOM(10mg/kg)后，7天之后使用含有2.5％(m/v)DSS饮水代替正常饮水，持续饲养5d；恢复正常饮水10d；再次将正常饮用水换为有2.5％(m/v)DSS饮水，持续饲养5d；恢复正常饮水饲养14d。第41天处死小鼠。将60只小鼠试喂养1周后随机分为6组：正常组(NC)、模型组(MC)、阳性对照组(PC)、两歧双歧杆菌H3-R2组(BH)、乳酸乳球菌KLDS4.0325组(LK)以及H3-R2加KLDS4.0325混菌组(BL)。从注射AOM开始，NC组与MC组每天灌胃200μL生理盐水，BH组、LK组以及BL组每天灌胃200μL1×109CFU/mL的H3-R2、KLDS4.0325和H3-R2与KLDS4.0325混菌，PC组每天灌胃美沙拉嗪200μL(75mg/kg/d)。对不同组小鼠健康指数、结肠组织状态、结肠组织髓过氧化物酶(MPO)活力、血清及结肠组织细胞因子、紧密连接蛋白、Ki67表达以及NLRP3信号通路相关基因mRNA的表达水平进行测定，并对小鼠肠道菌群进行分析。
所述的两歧双歧杆菌H3-R2和乳酸乳球菌乳酸亚种KLDS 4.0325由东北农业大学乳品科学教育部重点实验室工业微生物菌种保藏中心提供。
所述的HT-29细胞处理条件为：以未受处理的细胞作正常对照组(NC)，5-FU(15μg/mL)处理的细胞作为阳性对照组(PC)，BH组为两歧双歧杆菌H3-R2，LK组为乳酸乳球菌KLDS4.0325，BL组为H3-R2与KLDS4.0325以活菌数1:1混菌组，目的菌株与细胞感染比(MOI)为10:1。
实施1
以5-FU(15μg/mL)处理的细胞作为阳性对照组(PC)，以活菌体与细胞感染比(MOI)为10:1做目的菌株对结肠癌HT-29细胞增殖抑制实验。取对数生长期的HT-29细胞，消化后均匀吹散，以1×105个/孔的密度接种于96孔板，待细胞贴壁后，弃去培养液，用无菌PBS清洗细胞3次，每组4个复孔，向96孔板中加入100μL菌悬液，分别共培养6h和12h，然后去掉旧培养液，PBS清洗3次，每孔加110μL混合液(100μL无双抗DMEM培养液+10μL CCK-8)，在细胞培养箱中孵育1～2h，用酶标仪在450nm波长处测OD值。细胞增殖抑制率按下式计算：
目的菌株与HT-29细胞共同孵育6h和12h后，BL对HT-29增殖的抑制率分别为14.78％和36.42％，显著高于单个菌株处理组。结果见图1。
实施2
将目的菌株与HT-29细胞共培养12h后，把细胞培养液吸出至10mL离心管内，PBS洗涤细胞一次，用不含EDTA的胰酶将细胞消化2min，然后收集细胞于相应的离心管中，1000rpm/min离心5min，弃上清液收集细胞，根据Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书操作(上海碧云天科技有限公司)。加入195μL Annexin V-FITC结合液充分悬浮细胞，随后补加5μL的Annexin V-FITC并充分混匀，最后加入10μL的碘化丙啶染色液混合均匀，室温条件下避光反应20min，反应完成后立即上流式细胞仪检测。KLDS 4.0325和H3-R2单独与HT-29细胞共培养12h，凋亡率分别是10.1％和8.9％，而BL组HT-29细胞凋亡率为12.6％，显著高于BH组和LK组，但仍显著低于阳性对照组的43.1％。结果见图2。
实施3
按照天根试剂盒说明书提取细胞总RNA，并反转录得到cDNA，使用紫外分光光度计测定RNA浓度。实时荧光定量聚合酶链反应用于检测相关基因的表达。引物采用Primer 5.0软件设计，由吉林库美生物科技有限公司合成。以GAPDH为内参，Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2和Bax的相对表达量采用2-△△Ct法进行计算。与正常对照组(NC组)相比，BH、LK和BL组都能不同程度的上调Caspase-3、Caspase-9和Bax的mRNA表达量，下调Bal-2的mRNA表达量，其中BL组对Caspase-3、Caspase-9、Bax和Bal-2转录水平的调节效果最为显著。结果见图3。
实施4
采用Western blot法检测胞内Caspase-3、Caspase-9、Bax和Bcl-2凋亡相关蛋白的表达量，并运用Image J软件对蛋白免疫印迹结果的灰度进行分析。以GAPDH作为参照，分析目的蛋白表达水平。收集细胞于离心管中，向细胞沉淀中加入一定量的细胞裂解液，于冰上裂解30min。根据BCA试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司)说明书提取蛋白并测定蛋白浓度。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，电泳结束后，进行转膜。用5％脱脂奶粉室温封闭1小时或4℃过夜。室温孵育一抗(Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2)。孵育一抗的膜用TBST洗涤3次，每次5min。随后根据用量，按照1:1000稀释HRP标记的二抗，与膜37℃孵育2h。加入ECL化学发光液显色。最后使用Gel-Pro Analyzer 4软件对结果进行灰度分析。与RT-qRCR检测结果一致，BH、LK以及BL处理的Caspase-3、Caspase-9和Bax蛋白水平显著高于正常对照组，Bcl-2蛋白水平显著低于正常对照组，其中BL组调节蛋白表达效果最显著。结果见图4。
实施5
从小鼠饲养开始至灌胃结束，每天观察小鼠的精神状态、粪便形态。每5天同一时间记录小鼠体重。MC组小鼠体重显著低于NC组。H3-R2与KLDS4.0325的干预能显著改善AOM/DSS小鼠体重状况，并且与PC组无显著性差异。结果见图5。
实施6
实验结束后，禁食12h，各组小鼠麻醉后眼球取血，之后将小鼠采用颈椎脱臼法处死。取出的全血静置一段时间后，离心(3000g，20min)收集血清，保存于-80℃冰箱用于后续实验。将小鼠腹部用酒精消毒并打开腹腔，取出结肠，仔细收集结肠内容物，然后测量完整结肠长度并拍照。在由炎症向癌症的发展过程中，结肠受损糜烂水肿，肠壁变薄，结肠长度缩短，实验结束时，解剖各组小鼠，小心取出结肠组织，发现MC组小鼠结肠有较大的肿瘤结节，说明AOM和DSS处理成功诱导小鼠形成肿瘤。测量从盲肠至近肛门处的长度，NC组平均结肠长度为7.9±0.29cm，MC组平均结肠长度为5.83±0.28cm，显著低于正常组(P<0.05)。BH、LK和BL组小鼠结肠长度分别为6.65±0.24cm、6.85±0.21cm、6.93±0.26cm，三个处理组小鼠结肠长度显著高于MC组。结果见图6。
实施6
小鼠处死以后，解剖收集小鼠脾脏，用滤纸吸干残血后称重(mg)，分别除以小鼠体重(g)，计算脾脏指数。结果发现两歧双歧杆菌H3-R2与乳酸乳球菌KLDS4.0325联合使用能够显著改善小鼠由于AOM/DSS刺激引起的小鼠脾脏肿大。结果见图7。
实施7
新鲜结肠组织用4％多聚甲醛固定24h以上，将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋，用石蜡切片机切成4μm薄片，之后利用苏木素和伊红染色，最后进行脱水。每张玻片滴加中性树胶50μL，进行封片，排掉气泡，显微镜观察。正常组(Z组)结肠黏膜完整，可见正常的上皮细胞、大量的杯状细胞和完整的固有层腺体结构，隐窝形状规则。AOM/DSS处理导致小鼠结肠上皮结构破坏，炎症细胞大量浸润，杯状细胞大量减少，隐窝结构发生扭曲，隐窝形状不规则甚至消失，提示小鼠结肠存在炎症并且肠上皮高度发育不良。与模型组相比，目的菌株处理组小鼠的组织学损伤有所改善，具体表现为：炎症细胞浸润水平较低，黏膜结构良好，隐窝形状相对比较规则。提示两歧双歧杆菌H3-R2和乳酸乳球菌KLDS4.0325可在一定程度上抑制炎症细胞的浸润和肿瘤的发生，维持肠上皮结构。结果见图8。
实施7
采用MPO生化试剂盒测定结肠组织中MPO的活力。准确称取结肠组织，以试剂二溶液为匀浆介质，按重量体积比为1:19加匀浆介质，制备5％组织匀浆，按照南京建成MPO(比色法)试剂盒说明书操作。试验结束后取出溶液立即在460nm处测定吸光度值。NC组小鼠结肠组织中的MPO活性为(0.045±0.01)U/g，用AOM/DSS处理小鼠后，MPO活性显著增加至(0.095±0.01)U/g。BH和BL干预均能显著降低CAC小鼠结肠的MPO活性。结果见图9。
实施8
采用ELISA试剂盒测定。准确吸取小鼠血清加于酶标板孔底部，之后按照ELISA试剂盒说明操作，测定HIF-1α、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17和IL-22的含量。准确称取结肠组织，按重量体积比为1:9加入生理盐水，制备10％组织匀浆，将组织匀浆在4℃条件下，以2500g离心20min，取出上清液按照北京诚林ELISA试剂盒说明操作。
炎症可以诱导HIF-1α的激活，AOM/DSS处理显著增加了小鼠结肠中HIF-1α水平。与MC组相比，BH组、LK组及BL组的HIF-1α含量显著降低，并且BL组与PC组之间无统计学差异。结果见图10。
小鼠血清中细胞因子浓度变化：MC组的抗炎因子IL-10浓度显著降低，IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-17和IL-22浓度显著升高。与MC组相比，三个处理组均可不同程度增加IL-10浓度，降低IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-17的浓度，其中BL组的IL-17含量与PC组无显著差异；BH、LK以及BL处理可显著降低IL-22浓度，但三组之间无统计学差异。结果见图11。
小鼠结肠中细胞因子浓度变化：AOM/DSS处理显著降低了小鼠结肠组织中抑炎细胞因子IL-10的含量，增加了促炎因子IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-17和IL-22的含量。与血清中细胞因子浓度变化类似，三个处理组均不同程度地降低了结肠中IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-17和IL-22的浓度，提高了IL-10浓度。与MC组相比，BL组能最大程度恢复小鼠结肠中IL-10含量。三个处理组均可显著降低由AOM/DSS引起的IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-17和IL-22浓度增加，其中BL组的TNF-α、IL-17和IL-22含量与PC组无显著差异。结果见图12。
实施9
结肠组织切片脱蜡复水，在1％BSA封闭溶液中孵育后，将切片依次与ZO-1、Occludin、Claudin-1和Ki67(Abcam)的一抗孵育，并将相应的二抗与切片37℃孵育1h。用DAB显色后，用2％PBST终止反应。最后，用苏木精染色脱水处理后，在显微镜下观察DAB染色的阳性区域。ZO-1、Occludin、Claudin-1以及Ki67的信号强度通过使用基于ImageJ软件的IHC图谱的IHC评分进行定量测量。
与NC组相比，MC组中紧密连接蛋白ZO-1，Occludin和Claudin-1的评分显著下降，BH、LK以及BL三个处理组均能在一定程度上增加紧密连接蛋白的表达。结果见图13。
与NC组小鼠相比，MC组小鼠结肠中Ki67阳性增殖细胞的数量显著增加。BL的干预显著减少了AOM/DSS小鼠结肠中的Ki67的表达。结果见图14。
实施10
取各组小鼠部分结肠，按照动物组织总RNA提取试剂盒提取结肠组织总RNA，引物采用Primer 5.0软件设计，由吉林库美生物科技有限公司合成。以GAPDH为内参，NLRP3、Caspase-1、和IL-1β的相对表达量采用2-△△Ct法进行计算。AOM/DSS处理显著激活了小鼠结肠内NLRP3、Caspase1和IL-1β的mRNA表达。与MC组相比，三个处理组均可不同程度降低NLRP3、Caspase-1和IL-1β的转录水平，三个处理组的Caspase-1的转录水平无显著差异，BL组的NLRP3和IL-1β的mRNA相对表达量与PC组无显著差异。结果见图15。
实施11
使用QIAamp DNA试剂盒提取小鼠粪便中的总微生物DNA。利用0.8％琼脂糖凝胶电泳进行分子大小判断以及紫外分光光度计对DNA进行定量。选用长度约为250bp的细菌16SrDNA基因的高度可变的V3-V4区用来测序。扩增结果进行2％琼脂糖凝胶电泳，然后用Axygen凝胶回收试剂盒回收目的片段。利用Quant-iT PicoGreen dsDNA试剂盒对PCR产物在Microplate reader(BioTek，FLx800)上进行定量。利用Illumina Miseq高通量测序平台，利用TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit进行建库。原始数据使用使用软件FLASH(Fast Length Adjustment of Short reads，v1.2.11)进行序列拼接，利用软件USEARCH(v9.2.64)将拼接好的Tags聚类为OUT。通过与数据库进行比对，利用QIIME软件对OTU进行物种分类，以R(v3.2.3)画图，并在门水平上做物种柱状图以及在属水平进行物种heatmap聚类分析。
肠道微生物群在门水平上，正常组小鼠肠道菌群的优势门为：厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、脱硫杆菌门(Desulfobacterota)以及放线菌门(Actinobacteriota)。模型组经AOM/DSS处理显著增加了疣微菌门(Verrucomicrobiota)，降低了脱硫杆菌门和放线菌门与模型组相比，BH与BL干预可降低AOM/DSS诱导的疣微菌门丰度增加，并且BL组可恢复由于AOM/DSS处理导致的小鼠中放线菌门丰度的降低，与正常组无显著差异，结果见图16；在属水平上，与NC组相比，AOM/DSS处理组中的Prevotellaceae、Eubacterium、Oscillibacter以及Akkermansia相对丰度显著增加，Candidatus_Saccharimonas、Lactobacillus相对丰度显著减少。BH、LK和BL处理组均可显著降低AOM/DSS引起的Prevotellaceae的丰度升高。与MC组相比，三个处理组均可显著降低Oscillibacter的相对丰度，其中BH组的相对丰度与NC组无显著差异，另外BL组可显著降低Akkermansia的丰度，但其相对丰度仍显著高于正常组。五个处理组都可不同程度增加AOM/DSS小鼠体内的Lactobacillus，其中BL组的Lactobacillus丰度与PC组和NC组无显著差异。因此两歧双歧杆菌H3-R2联合乳酸乳球菌KLDS4.0325可在门水平和属水平上调节小鼠肠道菌群。结果见图17。
Claims (10)
1.一种具有缓解结肠炎相关结直肠癌作用的乳酸菌混合物及其应用，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)菌株的培养：混合菌悬液是将H3-R2与KLDS 4.0325以活菌数1:1比例混合。(2)体外评估两菌及其混合物对结肠癌HT-29细胞的增殖抑制及促凋亡作用：通过CCK-8法检测菌株对HT-29细胞的增殖抑制作用；通过流式细胞仪检测细胞凋亡；通过RT-qPCR检测HT-29细胞凋亡相关mRNA表达；通过Western blot检测HT-29细胞凋亡相关蛋白表达。(3)利用AOM/DSS诱导的小鼠模型评估受试菌株对CAC的作用效果：使用雄性5周龄C57BL/6J小鼠，饲养温度23±2℃，湿度55±5％，12h交替光照。将60只小鼠试喂养1周后随机分为6组：正常组(NC)、模型组(MC)、阳性对照组(PC)、两歧双歧杆菌H3-R2组(BH)、乳酸乳球菌KLDS4.0325组(LK)以及H3-R2加KLDS4.0325混菌组(BL)。对不同组小鼠体重、脾脏指数、结肠组织状态、结肠组织髓过氧化物酶(MPO)活力、缺氧诱导因子(HIF-1α)、血清及结肠组织中的细胞因子、紧密连接蛋白、Ki67免疫组化以及NLRP3信号通路相关基因mRNA的表达水平进行测定，并对小鼠肠道菌群进行分析。
2.根据权利要求1所述的一种具有缓解结肠炎相关结直肠癌作用的乳酸菌混合物及其应用，其特征在于，所述的两歧双歧杆菌H3-R2和乳酸乳球菌乳酸亚种KLDS 4.0325由实验室自行分离，保藏于东北农业大学乳品科学教育部重点实验室。
3.根据权利要求1所述的一种具有缓解结肠炎相关结直肠癌作用的乳酸菌混合物及其应用，其特征在于，所述的Western blot检测HT-29细胞凋亡相关蛋白表达结果为：BH、LK以及BL处理的Caspase-3、Caspase-9和Bax蛋白水平显著高于正常对照组，Bcl-2蛋白水平显著低于正常对照组，其中BL组调节蛋白表达效果最显著。
4.根据权利要求1所述的一种具有缓解结肠炎相关结直肠癌作用的乳酸菌混合物及其应用，其特征在于，所述的结肠长度及结肠组织状态为：从盲肠至近肛门处的长度，NC组平均结肠长度为7.9±0.29cm，MC组平均结肠长度为5.83±0.28cm；与NC组和PC组相比，BH、LK以及BL组的小鼠结肠均有不同程度缩短，但仍显著高于模型组；AOM/DSS处理导致小鼠结肠上皮结构破坏，炎症细胞大量浸润，杯状细胞大量减少，隐窝结构发生扭曲，隐窝形状不规则甚至消失；PC组小鼠结肠保留了大量的杯状细胞，炎症细胞浸润不明显；与MC组相比，三个处理组小鼠的炎症细胞浸润水平较低，黏膜结构良好，隐窝形状相对比较规则。
5.根据权利要求1所述的一种具有缓解结肠炎相关结直肠癌作用的乳酸菌混合物及其应用，其特征在于，所述的小鼠脾脏指数为：两歧双歧杆菌H3-R2与乳酸乳球菌KLDS4.0325联合使用能够改善小鼠由于AOM/DSS刺激引起的小鼠脾脏肿大。
6.根据权利要求1-2所述的一种具有缓解结肠炎相关结直肠癌作用的乳酸菌混合物及其应用，其特征在于，所述的结肠组织髓过氧化物酶(MPO)活力为：NC组小鼠结肠组织中的MPO活性为(0.045±0.01)U/g，用AOM/DSS处理小鼠后，MPO活性显著增加至(0.095±0.01)U/g。BH与BL处理组均能显著降低CAC小鼠结肠的MPO活性，且与PC组的MPO活性无显著差异。
7.根据权利要求1所述的一种具有缓解结肠炎相关结直肠癌作用的乳酸菌混合物及其应用，其特征在于，所述的结肠组织缺氧诱导因子(HIF-1α)浓度为：AOM/DSS处理显著增加了小鼠结肠中HIF-1α水平。与MC组相比，BH组、LK组以及BL组的HIF-1α含量显著降低。
8.根据权利要求1所述的一种具有缓解结肠炎相关结直肠癌作用的乳酸菌混合物及其应用，其特征在于，所述的血清及结肠组织细胞因子含量为：两歧双歧杆菌H3-R2与乳酸乳球菌KLDS4.0325单独或联合使用均可不同程度增加IL-10浓度，降低IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-17和IL-22的浓度。
9.根据权利要求1所述的一种具有缓解结肠炎相关结直肠癌作用的乳酸菌混合物及其应用，其特征在于，所述的紧密连接蛋白及Ki67免疫组化结果：两歧双歧杆菌H3-R2联合乳酸乳球菌KLDS4.0325使用可增加结肠紧密连接蛋白表达(ZO-1，Occludin和Claudin-1)，改善肠道屏障功能。并可显著减少AOM/DSS小鼠结肠中的Ki67的表达。
10.根据权利要求1所述的一种具有缓解结肠炎相关结直肠癌作用的乳酸菌混合物及其应用，其特征在于，所述的NLRP3信号通路mRNA表达为：两歧双歧杆菌H3-R2与乳酸乳球菌KLDS4.0325单独或联合均可不同程度降低AOM/DSS小鼠结肠中NLRP3、Caspase-1和IL-1β的转录水平。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20220906 |