CN115919905A - 复合益生菌在制备用于预防和治疗自身免疫性肝炎中的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种复合益生菌在制备用于预防和治疗自身免疫性肝炎中的药物中的应用，所述复合益生菌包括嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌、两歧双歧杆菌、动物双歧杆菌、瑞士乳杆菌、长双歧杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊式乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜热链球菌、副干酪乳杆菌。本发明通过实验证明该复合益生菌能够调节肠道菌群，降低肠壁通透性，改善Treg/Th17平衡，通过TLR4/NF‑κB信号通路发挥抗炎抗凋亡作用，降低AIH小鼠肝脏的炎症反应，从而缓解自身免疫性肝炎，其效果优于目前的常规激素治疗。健康人群服用该复合益生菌制剂可以预防AIH发病，AIH患者服用可以缓解AIH症状甚至彻底恢复正常。

Description

复合益生菌在制备用于预防和治疗自身免疫性肝炎中的药物中的应用

技术领域

本发明属于医学技术领域，涉及一种复合益生菌的新应用，具体涉及一种复合益生菌在制备用于预防和治疗自身免疫性肝炎中的药物中的应用。

背景技术

自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis，AIH)是肝组织汇管区大量淋巴细胞浸润、肝细胞纤维化及碎屑样坏死的界面型肝炎，并伴有血清转氨酶升高。肝抗原和完全弗氏佐剂(S100/CFA)诱导小鼠AIH是一种典型的慢性炎症性肝炎模型。目前临床治疗以糖皮质激素及免疫抑制剂为主，这些药物虽可有效缓解患者病情，但用药仅限于AIH发病后，导致T细胞各亚群均降低及与之相应的广泛的免疫功能下降，并且停药后易复发并伴有较多副作用，整体治疗效果不佳。因此，一种可有效缓解AIH的即食型营养补充剂对AIH的预防及治疗具有重要价值。

AIH可被多因素诱发，准确发病机制尚无定论。肠道微生物抗原或其代谢产物通过门静脉进入肝组织诱发肝免疫损伤，以及机体免疫功能紊乱可能是AIH发病的主要因素。Wei等人研究表明，与SPF(specific pathogen free)小鼠相比，无菌小鼠对刀豆蛋白A诱导的急性AIH具有抗性；有研究证明AIH患者粪便中双歧杆菌、乳酸菌等益生菌丰度下降、肠道屏障被破坏及血清脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)水平升高，引起内毒素血症或全身低度炎症，进一步损害周围组织。此外，益生菌可以发酵肠道中纤维素产生短链脂肪酸(short-chain fatty acid,SCFAs)。SCFAs不仅可以上调紧密连接蛋白的表达以增强肠上皮屏障的完整性，还可以促进Treg细胞的体外分化。尽管AIH患者与正常人群肠菌存在差异，但至今并无研究证明益生菌调节肠道以缓解AIH。目前，复合益生菌制剂用于预防及治疗AIH未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对上述问题，提供一种复合益生菌在制备用于预防和治疗自身免疫性肝炎中的药物中的应用。

本发明为了实现其目的，采用的技术方案是：

一种复合益生菌在制备用于预防和治疗自身免疫性肝炎中的药物中的应用，所述复合益生菌包括嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌、两歧双歧杆菌、动物双歧杆菌、瑞士乳杆菌、长双歧杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊式乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜热链球菌、副干酪乳杆菌。

按重量份数计，所述复合益生菌包括嗜酸乳杆菌2-8份、乳双歧杆菌4-20份、两歧双歧杆菌2-10份、动物双歧杆菌4-16份、瑞士乳杆菌2-10份、长双歧杆菌2-8份、干酪乳杆菌、植物乳杆菌2-8份、罗伊式乳杆菌2-8份、鼠李糖乳杆菌4-16份、嗜热链球菌2-8份、副干酪乳杆菌；所述干酪乳杆菌和副干酪乳杆菌两者相加的重量份数和为4-20份，干酪乳杆菌和副干酪乳杆菌的重量比为5-0.2﹕1。

所述复合益生菌还包括菊粉、低聚半乳糖、低聚果糖和甘油酯粉末。

可选地，所述复合益生菌还包括菊粉40-60份、低聚半乳糖5-15份、低聚果糖5-15份和甘油酯粉末0.5-3份，且菊粉和瑞士乳杆菌的重量比为20-10﹕1。

优选地，所述乳双歧杆菌是乳双歧杆菌HN019和乳双歧杆菌Bi07的混合物，且乳双歧杆菌HN019和乳双歧杆菌Bi07的质量比为5-0.2﹕1；所述干酪乳杆菌是干酪乳杆菌LC11，所述副干酪乳杆菌是副干酪乳杆菌Lpc37；所述鼠李糖乳杆菌是鼠李糖乳杆菌R11和鼠李糖乳杆菌GG的混合物，且鼠李糖乳杆菌R11和鼠李糖乳杆菌GG的重量比为4-0.25﹕1；所述动物双歧杆菌是动物双歧杆菌BB-12和动物双歧杆菌B94的混合物，且动物双歧杆菌BB-12和动物双歧杆菌B94的混合物的重量比为4-0.25﹕1；所述嗜酸乳杆菌具体为嗜酸乳杆菌NCFM，两歧双歧杆菌具体为两歧双歧杆菌Bb06，瑞士乳杆菌具体为瑞士乳杆菌R52，长双歧杆菌具体为长双歧杆菌R175，植物乳杆菌具体为植物乳杆菌R1012，罗伊式乳杆菌具体为罗伊式乳杆菌HA188,嗜热链球菌具体为嗜热链球菌St21。

优选地，所述复合益生菌中的益生菌是以菌粉形式添加，所述复合益生菌为冻干粉制剂。

优选地，所述复合益生菌中，每克复合益生菌含100亿CFU活菌。

本发明的有益效果是：该复合益生菌制剂是食品级固态饮料，安全、食用方便，未见毒副作用；与单株益生菌相比，复合益生菌制剂更能模拟肠道微生态的整体移植，效果更显著；复合益生菌制剂能够缓解AIH的肝病理损伤，修复肝功能，效果优于常规的糖皮质激素治疗。

通过实验证明此复合益生菌制剂能够明显降低血清转氨酶，改善肝组织病变，下调促炎细胞Th1,Th17和促炎因子IFN-γ,IL-17A，提高抑炎细胞Treg和抑炎因子TGF-β，增加结肠长度，降低肠壁通透性，增加肠道菌群丰度及短链脂肪酸含量。说明此复合益生菌能够调节肠道菌群，降低肠壁通透性，减少肠源性LPS移位至肝脏，改善Treg/Th17平衡，通过TLR4/NF-κB信号通路发挥抗炎抗凋亡作用，降低AIH小鼠肝脏的炎症反应，从而缓解自身免疫性肝炎，其效果优于目前的常规激素治疗。由此推测健康人群服用该复合益生菌制剂可以预防AIH发病，AIH患者服用可以缓解AIH症状甚至彻底恢复正常。

附图说明

图1是复合益生菌和激素对AIH小鼠的保护作用及对比图，图中*p<0.05；**p<0.01；****p<0.0001。

图2是复合益生菌和激素对AIH小鼠免疫功能的影响及对比图，图中*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001。

图3是复合益生菌对肝脏中IL-17A,TNF-α及TGF-β的影响结果图。

图4是复合益生菌对肝脏中TLR4/NF-κB信号通路及凋亡的影响结果图，图中*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001。

图5是复合益生菌对AIH小鼠肠壁通透性的影响结果图，图中*p<0.05。

图6是复合益生菌对AIH小鼠紧密连接蛋白的影响结果图，图中*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

图7是复合益生菌对AIH回肠TLR4/NF-κB信号通路的影响结果图，图中*p<0.05；**p<0.01。

图8是复合益生菌对AIH小鼠肠菌组成的影响结果图。

图9是复合益生菌对AIH小鼠肠菌门水平上细菌丰度的影响结果图，图中*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

图10是复合益生菌对AIH小鼠肠菌属水平上细菌丰度的影响结果图，图中*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001。

图11是复合益生菌对AIH小鼠粪便中短链脂肪酸的影响结果图，图中*p<0.05。

图12是肠道微生物与肝肠损伤指标、免疫细胞比例及SCFAs的相关性分析图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

主要实验材料来源：

清洁级4-6周C57BL/6J雄性小鼠购自山西医科大学动物中心；RPMI-1640培养基购自美国Hyclone公司；弗氏完全佐剂(F5881-10X10ML)购自美国Sigma公司；BCA蛋白定量试剂盒(14C07A46)购自武汉博士德生物工程有限公司；蛋白转运抑制剂(Protein TransportInhibitor)(HY-16592)购自美国BD公司；佛波酯(PMA)(P1585)购自美国Sigma公司；离子霉素(lonomycin)(I139530)购自杭州阿拉丁公司；地塞米松注射液购自郑州峰卓药业；NC膜购自博士德生物；

CD4mAb(PE-Cy5标记)(8346562)、CD4mAb(APC标记)(B277606)、IL-17A mAb(PE标记)(5016509)、IFN-γmAb(FITC标记)(5119572)、CD25mAb(PE标记)(5352927)、CD127mAb(PE-Cy7标记)(4330426)以上荧光抗体、布雷非德菌素A(Brefeldin A)、CytoFix/CytoPerm buffer均购自美国BD公司(Becton,Dickinson and Company)；

IL-17A抗体(D163812)、IFN-γ抗体(D167849)、TGF-β抗体(D162976)均购自北京博奥森生物技术有限公司；

ZO-1抗体(GR3322351-1)，occludin抗体(GR3243495-10)，NF-κB抗体(GR3199609-9)，IκB抗体(GR275907-38)，P-IκB(GR97848-43)抗体均购自英国Abcam公司；

TLR4抗体(D220102-0025)品牌为BBI；

β-Actin抗体(AA0718B8088Z)、山羊抗兔IgG(D110058-0025)、ECL发光液(14C14B71)、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、DAB显色试剂盒、HE染色试剂盒、SABC免疫组化染色试剂购自武汉博士德生物工程有限公司；

Caspase-3抗体(9662S)、BAX抗体(14796S)购自美国CST公司(Cell SignalingTechnology,Inc)；

BCL-2抗体(I06031556)、Survivin抗体(G12293402)购自沈阳万类生物科技有限公司；

胎牛血清、PCR引物及内参引物购自上海生工生物公司；

ELISA试剂盒(AD202001)购自安迪华泰(中国)生物科技有限公司；

逆转录试剂盒(18Ja1804)、RT-PCR试剂盒(19Ja2511)、Trizol(MF034-05)购自北京聚合美生物科技有限公司。

本申请所有实施例中使用的复合益生菌为中科宜康(北京)生物科技有限公司的活性冻干粉产品，产品名称：与

(广谱型)，产品类型：其它固体饮料[活菌(未杀菌)型]。该产品中包含15株菌株：乳双歧杆菌HN019,两歧双歧杆菌Bb06,动物双歧杆菌BB-12,乳双歧杆菌Bi07,长双歧杆菌R175,动物双歧杆菌B94,鼠李糖乳杆菌GG,干酪乳杆菌LC11,瑞士乳杆菌R52,副干酪乳杆菌Lpc37,植物乳杆菌R1012,罗伊式乳杆菌HA188,鼠李糖乳杆菌R11,嗜酸乳杆菌NCFM,嗜热链球菌St21。该产品已经取得中国专利，专利号ZL201810723151.8。

其余试剂如未表明，均为本领域常规试剂，可商购获得。

实施例1

一、小鼠分组

将C57BL/6J雄性小鼠随机分为4组，分别为正常组、AIH+生理盐水对照组、AIH+益生菌组、AIH+激素对照组。

二、小鼠饲养环境：室温22±2℃，湿度55％，12小时昼夜交替，给予足够的水与饲料。

三、小鼠AIH模型建立

使用质量百分比为10％的水合氯醛麻醉C57BL/6J雄性小鼠，麻醉后用预冷的无菌PBS缓冲液灌肝直至肝脏被漂白，同时查看其它器官有无病变。将同种系小鼠肝组织剪碎并与等体积无菌冷PBS缓冲液混合，冰水浴中超声粉碎制备肝匀浆。20,000g，4℃，离心1h获取上清即为肝组织S100抗原。采用BCA法定量并调整S100抗原浓度为0.5-2mg/mL。再次滤过除菌并与弗氏完全佐剂(CFA)1:1混合，漩涡混合器上充分混匀直到液滴入水不散开。

AIH+生理盐水对照组、AIH+益生菌组、AIH+激素对照组小鼠在第7天和第14天分别腹腔注射乳化S100/CFA 1ml建立小鼠模型，正常组不予任何处理。

AIH+生理盐水对照组连续42天每天灌饲同体积无菌生理盐水；AIH+益生菌组小鼠灌饲复合益生菌(0.75g活菌/只/天，0.75g含75亿菌落形成单位)，连续灌胃42天，，AIH+激素对照组在二次造模每5天腹腔注射0.1mg/kg地塞米松()连续42天，正常组不予任何处理。

小鼠干预至实验结束(总程序第42天)，采集血液、肝脏，脾脏组织进行相应检测。

四、小鼠肝功能检测

将小鼠全血室温静置1小时后，4℃，3000rpm离心10min，取血清。血清由太原市中医医院检验科检测，采用全自动生化分析仪检测小鼠血清中的丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)；

五、小鼠组织病理学检测HE染色

将剪切的肝脏及回肠组织放于10％的中性福尔马林溶液中固定24h；通过浸入不同浓度梯度的乙醇溶液中进行组织脱水；对肝脏及回肠组织进行石蜡包埋及切片；使用苏木素伊红(HE)对肝脏及回肠组织切片染色。光学显微镜下观察小鼠肝脏及回肠组织病例形态结构的变化并对肝脏病例损伤程度，根据Ishak评分系统，对门静脉和肝小叶内炎症、变性和坏死程度进行评分，病例程度从0分(无病例损伤)到3分(严重病例损伤)。

六、流式检测脾淋巴细胞中Th1、Th17和Treg的相对百分数

首先制备脾淋巴细胞悬液，小鼠麻醉后在无菌环境中取脾，将脾脏在200目滤网上轻柔研磨并加无菌PBS缓冲液，收集该悬液后，裂解红细胞后即为脾脏淋巴细胞。脾淋巴细胞浓度为5×106/ml，取1ml加入6孔板中，加RPMI1640细胞培养液至总体积为4ml，加体积百分比为1％的青霉素和链霉素混合液0.04ml、佛波酯(PMA，终浓度为50ng/ml)、离子霉素(lonomycin，终浓度为1μg/ml)、蛋白转运抑制剂(Protein Transport Inhibitor,终浓度2μl/3ml)，置于37℃5％的CO2培养箱中培养，5h后收集细胞，PBS洗涤细胞。①检测Th1,Th17细胞：加入CD4mAb(PE-Cy5标记)，4℃避光孵育30min,加入2ml PBS洗涤。加入150μl固定穿孔液，室温避光15min,加入2ml PBS洗涤；沉淀细胞中加入IL-17A mAb(PE标记)或IFN-γmAb(FITC标记)混匀，4℃避光孵育30min,加入2ml PBS洗涤，加RPMI 1640细胞培养液200μl，重悬，上机检测。②检测Treg细胞：加入CD4mAb(APC标记)、CD25mAb(PE标记)和CD127mAb(PE-Cy7标记)4℃避光孵育30min,加入2ml PBS洗涤，加RPMI 1640细胞培养液200μl，重悬，上机检测。

实验结果如下：

由肝脏外观(见图1A)可以看出，复合益生菌及激素干预均能缓解AIH小鼠的脾增大；复合益生菌能使肝脏外观正常、肝小叶清晰；而激素干预效果较差，肝脏表面肿胀有颗粒感、肝组织粘连严重、肝小叶分叶不清，更接近生理盐水组。由经HE染色的组织病理形态结构(见图1B)以及肝脏病理损伤程度(见图1D)可以看出,复合益生菌及激素干预均能促进AIH小鼠肝小叶结构恢复，肝索排列整齐，炎症细胞浸润减少，复合益生菌干预效果好于激素，肝组织淋巴细胞浸润更少、炎症更轻，病理评分更低(P<0.05)；复合益生菌及激素干预均使ALT和AST明显降低，两种干预之间无统计差异(图1C)；复合益生菌干预能明显提升Treg比例(见图2)，而激素干预生理盐水对照组情况类似，均不能提高Treg比例与。

上述实验结果表明复合益生菌具有明显预防AIH发生及缓解AIH的作用。复合益生菌治疗效果在维持肝脏器官正常形态及免疫调节方面显著好于地塞米松。

实施例2

在实施例1的结果基础之上，进一步进行复合益生菌缓解AIH的机制探索研究，设置正常小鼠，AIH+益生菌组，AIH+生理盐水对照组。

一、建立C57BL/6J小鼠AIH模型

模型建立与实施例1中相同，见实施例1。

设置正常小鼠，AIH+益生菌组，AIH+生理盐水对照组。正常组不处理，益生菌组小鼠灌饲复合益生菌(0.75g活菌/只/天，0.75g含75亿菌落形成单位)，连续灌胃42天，AIH+生理盐水对照组灌饲同体积无菌生理盐水，小鼠干预至实验结束(总程序第42天)，采集血液、肝脏、脾脏、回肠组织及粪便进行相应检测。

二、益生菌通过抑制toll样受体4(Toll like receptor,TLR4)依赖的核因子(Nuclear factor kappaB,NF-κB)信号通路调节免疫降低肝脏炎症损伤

肝脏织免疫组织化学染色检测白介素-17A(Interleukin-17A,IL-17A),干扰素(IFN-γ),转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)：二甲苯处理组织切片去蜡两次，5-10min/次；无水乙醇、95％乙醇、80％乙醇、70％乙醇各放1-2min，蒸馏水清洗3min；抗原微波修复，去除过氧化物酶，5％胎牛血清封闭，IL-17A抗体，IFN-γ，TGF-β抗体过夜孵育，室温加二抗，DAB显色。蛋白质印迹法(Western Blot)检测肝脏组织中TLR4,NF-κB p65,IκB,P-IκB,半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3),Bax,Survivin及Bcl-2蛋白的表达量。

实验结果如下：

(1)肝脏免疫组织化学证明，复合益生菌可以降低肝脏中IL-17A，IFN-γ的分泌，P<0.0001，增加TGF-β的产生，P<0.01(见图3)。

(2)复合益生菌干预后肝组织TLR4，NF-κB，P-IκB的蛋白表达量均下降，IκB表达升高，P<0.05(见图4A)。

(3)复合益生菌干预后肝组织凋亡蛋白Caspase-3、Bax表达下降，Bcl-2、Survivin表达升高，P<0.05(见图4B)。

上述实验结果表明复合益生菌能抑制肝组织TLR4依赖的NF-κB信号通路，减少肝组织内促炎因子的表达，促进抑炎细胞因子的表达，抑制肝炎症反应并减少肝细胞凋亡，从而降低AIH小鼠肝损伤。

三、复合益生菌通过抑制TLR4依赖的NF-κB信号通路恢复肠道屏障功能

使用Western Blot方法检测回肠组织中TLR4,NF-κB p65,IκB,P-IκB,肠上皮细胞紧密连接蛋白(zonula occludens-1,ZO-1),闭合蛋白(occludin)的表达量；回肠组织切片HE染色；回肠组织化学染色检测ZO-1,occludin蛋白的表达；ELISA检测肝匀浆及血清中脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)浓度。

提取肠组织中总RNA，检测回肠中IL-1β,IL-6,TNF-α,ZO-1,occludin基因表达量。称取100mg回肠组织加1mL Trizol，冰浴5min，高通量快速研磨仪破碎组织后，加入200μL氯仿混匀，4℃，12000rpm，离心15min。吸取上清，加入等体积的异丙醇混匀，4℃，12000rpm,离心10min。弃上清，留下的白色沉淀。向沉淀中加入DEPC水配制的75％的乙醇(DEPC水：无水乙醇＝1:3)1mL，4℃，12000rpm离心10min，吸去上清，干燥开盖，用微量核酸检测仪测总RNA浓度。利用聚合酶逆转录试剂盒将总RNA转录为cDNA。利用IL-1β、IL-6、occludin、ZO-1、TNF-α基因及β-actin(内参)引物(见表1)，按照聚合酶Realtime PCR Super mix试剂盒说明书进行PCR扩增，PCR扩增条件如下：

95℃，60sec；

40次循环：95℃，15sec；62℃,15sec；72℃,45sec。

表1 RT-PCR引物

检测结果如下：

(1)复合益生菌干预的小鼠血清中LPS下降但不显著，肝匀浆中LPS水平则明显下降(见图5A)，此结果进一步表明，AIH组小鼠肠漏严重，而复合益生菌干预的小鼠由于增加了肠道屏障的致密性，从而减少肠源性LPS移位至肝脏，避免肝脏炎症加剧；

(2)回肠病理表现复合益生菌组明显优于AIH组(见图5B)，经复合益生菌治疗后，回肠绒毛结构恢复，甚至相较正常小鼠，其肠绒毛密度和长度均有所增加，反映出小鼠具有较佳的消化和吸收功能；

(3)回肠免疫组织化学证明复合益生菌干预后ZO-1，occludin基因及蛋白表达量升高(见图6A,6B)，ZO-1，occludin作为肠屏障结构的重要蛋白，其含量升高体现出肠壁致密性较好；

(4)复合益生菌干预后回肠组织TLR4，NF-κB，及P-IκB/IκB的蛋白表达量均下降，IκB，ZO-1，occludin表达升高，P<0.05(见图7A)；

(5)复合益生菌干预后，回肠组织中IL-1β、IL-6、TNF-α炎症因子的相对表达量下降(见图7B)；

综上，复合益生菌能抑制回肠TLR4依赖的NF-κB信号通路，减少肠上皮细胞炎性细胞因子的产生，从而降低肠道炎症反应，在AIH小鼠肝损伤中发挥缓解作用。

四、复合益生菌恢复肠菌组成及代谢物

通过小鼠粪便16S rRNA基因高通量测序和短链脂肪酸(short-chain fattyacids，SCFAs)的检测分析肠道菌群分布及SCFAs。结果如下：

(1)偏最小二乘判别分析(Partial least squares discrimination anaylsis,PLS-DA)发现，复合益生菌干预后的菌群聚集明显与AIH+生理盐水对照组不同(见图8)。

(2)通过分类分析，发现在门水平上(见图9)，所有样本的肠道菌群以厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为主。与正常小鼠相比，AIH+生理盐水对照组小鼠的Firmicutes显著升高，而添加复合益生菌的小鼠的Firmicutes明显降低；添加复合益生菌的小鼠的Bacteroidetes含量显著高于AIH+生理盐水对照组；复合益生菌组与AIH+生理盐水对照组相比，Firmicutes/Bacteroidetes比值显著降低，复合益生菌组疣微菌门(Verrucomicrobia)和放线菌门(Actinobacteria)的相对丰度升高，而糖杆菌门(Saccharibacteria),脱铁杆菌门(Deferribacteres)和变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度降低。

(3)在属水平上(见图10)，乳杆菌属(Lactobacillus),双歧杆菌属(Bifidobacterium)和拟杆菌属(Bacteroidetes)是所有样品的主要肠道微生物群。在添加复合益生菌组的小鼠中，双歧杆菌属(Bifidobacterium)和拟杆菌属(Bacteroidetes),梭菌属(Clostridium)丰度显著增高；粪杆菌属(Faecalibacterium)、幽门螺杆菌属(Helicobacter)、以及葡萄球菌属(Staphylococcus)丰度显著下降；复合益生菌可增加AIH小鼠肠道瘤胃球菌属(Ruminococcus)、厌氧棒杆菌属(Anaerostipes)和同型产乙酸菌属(Blautia)的丰度，进一步促进肠道SCFAs含量。

(4)在添加复合益生菌组的小鼠的粪便中，乙酸、丙酸、丁酸浓度增加，其中，乙酸增加最为明显(P＜0.05)，从而使得复合益生菌组SCFAs含量明显高于AIH+生理盐水对照组(见图11)。

五、肠道微生物与肝肠损伤指标、免疫细胞比例及SCFAs的相关性分析

(1)在门水平上，有7个门与肝肠损伤指标、免疫细胞比例及SCFAs浓度具有相关性(见图12A)。其中，厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)的丰度与Treg、Th1比例呈显著正相关，与ZO-1和occludin的mRNA相对表达量显著负相关；变形菌门(Proteobacteria)的丰度与回肠IL-1β、IL-6、TNF-α炎症因子的mRNA相对表达量，肝匀浆中LPS的浓度呈正相关；变形菌门(Proteobacteria)的丰度与乙酸、丙酸浓度呈负相关；同时，放线菌门(Actinobacteria)的丰度与丙酸浓度呈负相关。

(2)在属水平上，有10个属与肝肠损伤指标、免疫细胞比例及SCFAs浓度具有相关性(见图12B)。其中，拟杆菌属(Bacteroidetes)及梭菌属(Clostridium)丰度与Treg细胞比例、SCFAs呈负相关，与紧密连接蛋白ZO-1和occludin的mRNA相对表达量、乙酸浓度呈正相关；双歧杆菌属(Bifidobacterium)和瘤胃球菌属(Ruminococcus)丰度与丙酸浓度呈正相关；同型产乙酸菌(Blautia)丰度与抗凋亡蛋白Bcl-2、Survivin、紧密连接蛋白ZO-1和occludi的mRNA相对表达量显著正相关；葡萄球菌属(Staphylococcus)丰度与回肠TNF-α炎症因子的mRNA相对表达量显著正相关，与乙酸浓度呈显著负相关；幽门螺旋杆菌属(Helicobacter)丰度与SCFAs呈显著正相关。

由上述实验结果可以看出，门和属中的差异菌可能在AIH的发生与发展中起重要作用，例如，变形菌门的增加可能参与了AIH的发生发展，拟杆菌属(Bacteroidetes)、梭菌属(Clostridium)、同型产乙酸菌(Blautia)的丰度增加，则有助于缓解AIH症状。而复合益生菌可明显改变AIH小鼠菌群组成，增加有益菌的丰度从而抑制有害菌的形成。在门的水平上，拟杆菌门(Bacteroidetes)参与肠道碳水化合物发酵增加肠菌代谢，复合益生菌干预后小鼠肠道优势菌由厚壁菌门(Firmicutes)变为拟杆菌门(Bacteroidetes)。在属水平上，拟杆菌属(Bacteroidetes)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、梭菌属(Clostridium)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、丁酸弧菌属(Anaerostipes)及同型产乙酸菌属(Blautia)均可通过增强肠道屏障功能抑制细菌移位，还可促进短链脂肪酸的生成，复合益生菌干预后这些有益菌的丰度显著升高，而有害菌属如粪杆菌属(Faecalibacterium)、幽门螺杆菌属(Helicobacter)、以及葡萄球菌属(Staphylococcus)的丰度下降。

如在以上结果中所确定的，本发明的复合益生菌，能够缓解AIH的肝病理损伤，修复肝功能，具有免疫调节作用。

应当理解的是，本文所述的示例性实施方式应仅在描述意义上考虑，而非用作限制目的。各实施方式中的特征或方面的描述通常应该被认为对于其他实施方式中的类似特征或方面而言也是可行的。

Claims (7)

1.一种复合益生菌在制备用于预防和治疗自身免疫性肝炎中的药物中的应用，其特征在于：所述复合益生菌包括嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌、两歧双歧杆菌、动物双歧杆菌、瑞士乳杆菌、长双歧杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊式乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜热链球菌、副干酪乳杆菌。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：按重量份数计，所述复合益生菌包括嗜酸乳杆菌2-8份、乳双歧杆菌4-20份、两歧双歧杆菌2-10份、动物双歧杆菌4-16份、瑞士乳杆菌2-10份、长双歧杆菌2-8份、干酪乳杆菌、植物乳杆菌2-8份、罗伊式乳杆菌2-8份、鼠李糖乳杆菌4-16份、嗜热链球菌2-8份、副干酪乳杆菌；所述干酪乳杆菌和副干酪乳杆菌两者相加的重量份数和为4-20份，干酪乳杆菌和副干酪乳杆菌的重量比为5-0.2﹕1。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述复合益生菌还包括菊粉、低聚半乳糖、低聚果糖和甘油酯粉末。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述复合益生菌还包括菊粉40-60份、低聚半乳糖5-15份、低聚果糖5-15份和甘油酯粉末0.5-3份，且菊粉和瑞士乳杆菌的重量比为20-10﹕1。

5.如权利要求1至4任一项所述的应用，其特征在于：所述乳双歧杆菌是乳双歧杆菌HN019和乳双歧杆菌Bi07的混合物，且乳双歧杆菌HN019和乳双歧杆菌Bi07的质量比为5-0.2﹕1；所述干酪乳杆菌是干酪乳杆菌LC11，所述副干酪乳杆菌是副干酪乳杆菌Lpc37；所述鼠李糖乳杆菌是鼠李糖乳杆菌R11和鼠李糖乳杆菌GG的混合物，且鼠李糖乳杆菌R11和鼠李糖乳杆菌GG的重量比为4-0.25﹕1；所述动物双歧杆菌是动物双歧杆菌BB-12和动物双歧杆菌B94的混合物，且动物双歧杆菌BB-12和动物双歧杆菌B94的混合物的重量比为4-0.25﹕1；所述嗜酸乳杆菌具体为嗜酸乳杆菌NCFM，两歧双歧杆菌具体为两歧双歧杆菌Bb06，瑞士乳杆菌具体为瑞士乳杆菌R52，长双歧杆菌具体为长双歧杆菌R175，植物乳杆菌具体为植物乳杆菌R1012，罗伊式乳杆菌具体为罗伊式乳杆菌HA188,嗜热链球菌具体为嗜热链球菌St21。

6.如权利要求1至5任一项所述的应用，其特征在于：所述复合益生菌中的益生菌是以菌粉形式添加，所述复合益生菌为冻干粉制剂。

7.如权利要求1至6任一项所述的应用，其特征在于：所述复合益生菌中，每克复合益生菌含100亿CFU活菌。

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