JP2701092B2 - 異なるdnaシーケンスを検出するためのプローブ方法と構成物 - Google Patents
異なるdnaシーケンスを検出するためのプローブ方法と構成物Info
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Description
ーケンスを検出するときに使用するためのプローブ構成
物と方法に関するものである。
1:1543−1546. アプライド バイオシステムズ、DNA Sequencer User
Bulletin.#11、Synthesis of Fluorescent Dye−Labe
led Oligonucleotides for Use as Primers in Fluores
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2). 3.発明の背景 種々のDNAハイブリッド形成技法は多数のシーケンス
領域を含む試料中の1個またはそれ以上の選択されたポ
リヌクレオチドシーケンスを検出するために利用でき
る。断片捕獲および標識化の簡単な方法では選択された
シーケンスを含む断片は固定化プローブにハイブリッド
形成することによって捕獲される。捕獲した断片は検出
できるレポーター標識を含む第2のプローブにハイブリ
ッド形成によって標識を付けることができる。
この方法では、試料中のDNA断片の混合物をゲル電気泳
動によって分別し、次にニトロセルロースフィルターに
固定する。フィルターを1個またはそれ以上の標識プロ
ーブとハイブリッド形成条件下に反応させて、プローブ
シーケンスを含むバンドの存在を同定することができ
る。この方法は特に、一定のプローブシーケンスを含む
制限酵素DNA消化物中の断片を同定するため、および制
限断片長多型(RFLPS)を分析するために有用である。
ーケンスの存在を検出するための別のアプローチは、ポ
リメラーゼ鎖反応(ムリス、サイキ)によるシーケンス
の選択的増幅を含む。この方法では、選択されたシーケ
ンスの向かい合った末端部分に相補的なプライマーを使
用して熱循環と共に、プライマー開始複製の次の繰り返
しを進める。増幅されたシーケンスは種々の技法によっ
て容易に同定できる。このアプローチは特にポリヌクレ
オチド含有試料中の低コピーシーケンスの存在を検出す
るため、例えば体液試料中の病原体シーケンスを検出す
るために有用である。
的シーケンスを同定する方法が報告された(ウ・ホワイ
トリイ、ランデグレン、ウィン−ディーン)。オリゴヌ
クレオチド連結反応アッセイ(OLA)として知られてい
る1つのアプローチでは、関係のある標的領域に広がる
2個のプローブまたはプローブエレメントが標的領域と
ハイブリッド形成される。プローブエレメントが、プロ
ーブエレメントの向かい合った端部にて隣接する標的塩
基と(塩基対を)マッチさせると、この2個のエレメン
トが連結反応によって、例えばリガーゼを用いて処理し
て結合することができる。連結したプローブエレメント
を次に分析して、標的シーケンスの存在を証明する。
トは1対の相補的プローブエレメントに対して鋳型とし
て働く。2対の相補的プローブエレメントの存在で変
性、再アニーリングおよび連結反応の連続したサイクル
を用いて、標的シーケンスを幾何学的に増幅し、極少量
の標的シーケンスを検出および/または増幅させる。こ
のアプローチはまたリガーゼ鎖反応(LCR)と呼ばれ
る。
々の存在または不在を検出する際に有用な方法に対し
て、例えば遺伝スクリーニングの分野において、成長す
る必要がある。例えば、150ほどの異なる突然変異体が
嚢胞性繊維症と関係していた。この病気に対する遺伝的
素因についてスクリーニングする際に、“嚢胞性繊維
症”の陽性の同定を行うために、関係するゲノムDNA中
の可能な異なる遺伝子シーケンスの突然変異の全部を試
験することが最適である。理想的には1回のアッセイで
可能な突然変異の部位の全部の存在または不在について
試験したい。
回のアッセイフォーマットで多数の選択されたシーケン
スを検出する際に使用するために容易に採用できない。
従って、ポリヌクレオチド試料中の多数の選択されたシ
ーケンスの存在または不在を検出するため迅速な1回の
アッセイフォーマットを提供することが望ましい。
レオチド中の複数の選択された標的シーケンスの存在ま
たは不在を検出する方法を含む。この方法を実施する際
に、複数の異なるシーケンスプローブ対を標的ポリヌク
レオチドに添加し、各プローブ対は、標的ポリヌクレオ
チド中の標的シーケンスの選択された1個の隣接部位に
シーケンスにおいて相補的である2個のポリヌクレオチ
ドプローブを含む。各プローブ対は、プローブエレメン
トの1個が、対におけるエレメントが連結するとき、篩
分けマトリックスにおいて特有な電気泳動の移動度を、
会合したプローブ対に伝達する非ポリヌクレオチドポリ
マー鎖を含む。対中の他のエレメントは検出できるレポ
ーターラベルを含む。
成させた後、ハイブリッド形成したポリヌクレオチド
は、末端サブユニットが隣接の標的塩基と塩基対になっ
ているとき、標的結合プローブエレメントの末端サブユ
ニットを連結するために有効な条件下に処理される。連
結したプローブ対は、次の標的ポリヌクレオチドから脱
離して、篩分けマトリックス中に電気泳動によって分離
される。
位は、連結した形で、実質的に同じ長さである。この具
体例では、連結したプローブ対の分離可能性は各プロー
ブに結合した非ポリヌクレオチドポリマーに主として依
存している。
と連結の繰り返しのサイクルによって増幅される。連結
したプローブは標的シーケンスに対して連結していない
プローブを繰り返して結合し連結することによって線状
に増幅される。あるいは、連結したプローブは、共に選
択された連結プローブに相補的であるシーケンスを作る
第1と第2のプローブオリゴヌクレオチドの第2の対の
存在で、プローブの結合と連結のサイクルを繰り返し
て、指数関数的に増幅することができる。
チドは、(i)会合した標的シーケンスの同じ部位にお
いて代替シーケンスに相補的であり、そして(ii)異な
る検出できるレポーターを用いて誘導される、2個の代
替シーケンスオリゴヌクレオチドを含む。この方法は標
的シーケンスの突然変異状態を、(a)そのプローブと
会合した標的シーケンスを同定する各プローブのサイン
電気泳動の移動度、および(b)その標的シーケンスの
突然変異状態を同定するサインレポーター標識に従って
決定することができる。
溶性鎖、例えば異なるシーケンス結合ポリマーに結合し
た鎖が異なる数のポリマー単位を有する、ポリエチレン
オキシド(PEO)単位から成る鎖またはポリペプチド鎖
であってもよい。また、荷電または非荷電の連結基によ
って連結した多数のサブユニットの単位からなるポリマ
ーも含まれる。
ーブのハイブリッド形成は固体支持体に固定化した標的
ポリヌクレオチドを用いて行われる。固定化した標的ポ
リヌクレオチドに対するプローブのハイブリッド形成に
続いて、標的ポリヌクレオチドを洗浄してシーケンスの
特殊な方法で標的ポリヌクレオチドに結合していないプ
ローブ対を除去する。次に標的ポリヌクレオチドを変性
してシーケンスの特殊な方法で結合したプローブを脱離
する。
ィ法を用いる標的ポリヌクレオチド中の複数の選択され
た標的シーケンスの存在または不在を検出する方法を含
む。この方法では、複数の異なるシーケンスプローブ対
を標的ポリヌクレオチドに添加し、各プローブ対は標的
ポリヌクレオチド中の標的シーケンスの選択されたもの
に隣接する部位に対してシーケンスにおいて相補的であ
る2個のポリヌクレオチドプローブを含む。各プローブ
対において、プローブエレメントの1個は、対中のエレ
メントが連結するとき、会合したプローブ対に対してク
ロマトグラフィ分離手段において特有の溶出特性を与え
る非ポリヌクレオチドポリマー鎖を含む。対中の他のエ
レメントは検出できるレポーター標識を含む。
ッド形成させた後、ハイブリッド形成したポリヌクレオ
チドを、末端サブユニットが隣接の標的塩基と塩基対に
なるとき標的結合したプローブエレメントの末端サブユ
ニットを連結するために有効な条件下に処理する。次に
連結したプローブ対を標的ポリヌクレオチドから脱離し
てクロマトグラフィによって分離する。
の一般的な具体例について上述したものに似た具体例を
含む。
を、添付する図面と関連して読むとき一層完全に明らか
になるだろう。
用される3つの一般的なタイプのプローブおよびプロー
ブエレメントを示す; 図2は選択された数のヘクサポリエチレンオキシド
(HEO)ユニットを有するポリエチレンオキシドポリマ
ー鎖の合成方法を示す; 図3はHEOユニットがビスウレタントリル連鎖によっ
て連結されているポリエチレングリコールポリマー鎖の
合成方法を示す; 図4Aおよび4Bは図2および3のポリマー鎖をポリヌク
レオチドの5′末端に、それぞれ結合するためのカップ
リング反応を示す; 図5は、ホスホジエステル連鎖によって、続いて蛍光
標識を付けて、HEOユニットを連続してオリゴヌクレオ
チドに付加するための反応行程を示す; 図6はヘプタエチレンオキシドユニットがアミド連鎖
によって連結されているポリエチレンオキシドポリマー
鎖を付加するための反応工程を示す; 図7は図6の式24(n=1−4)によって示される選
択された誘導化ポリヌクレオチド種のHPLCによる分離を
示す; 図8A−8Dは標的シーケンスが塩基適合プローブエレメ
ントの連結(OLA)によって検出される本発明の具体例
を示す; 図9は図8の方法でみられる理想化された電気泳動パ
ターンを示し、標的ポリヌクレオチドは2個の異なる標
的領域に突然変異体を含む; 図10A−10Cは本発明の具体例を示し、突然変異体は本
発明によるリガーゼ鎖反応(LCR)により塩基適合プロ
ーブの連結反応によって検出される; 図11A−11Bは本発明の具体例における工程を示し、二
重鎖標識プローブを生成するためプライマー開始増幅を
用いる; 図12Aおよび12Bは図12の方法において形成された増幅
標的シーケンスに標識を付けるための代替方法を示す; 図13Aおよび13Bは本発明の具体例の工程を示し、標的
結合プローブにレポーター標識ヌクレオチド付加を用い
て標識プローブ種を形成する; 図14Aおよび14Bは本発明の方法により、既知のシーケ
ンスポリヌクレオチド断片を変更する他の方法を示す; 図15A−15Cは本発明の方法により、修飾された標識プ
ローブを形成するための方法を示す; 図16Aおよび16Bは、本発明の他の具体例により、修飾
された標識プローブを形成するための代替方法を示す; 図17A−17Bは、本発明によるプローブ連結方法の具体
例を示す; 図18Aおよび18Bは、本発明による修飾された標識プロ
ーブを形成するための他の方法を示す; 図19A−19Cは、本発明の他の具体例を示し、プローブ
は固体支持体に固定化された標的ポリヌクレオチドに対
してハイブリッド形成される。
または二本鎖RNAまたはDNA分子を含む、1個またはそれ
以上の核酸分子を含むことができる。
のヌクレオチドの隣接するシーケンスを意味する。この
ようなシーケンスの“複数”は1またはそれ以上のヌク
レオチド部位につき塩基シーケンスが異なる2またはそ
れ以上の核酸シーケンスを含む。
たは塩基シーケンス特異性をもつシーケンスサブセット
に結合するために有効なポリマーを意味し、選択された
ハイブリッド形成条件下に、試験試料中の所定の複数の
シーケンスにおける任意の他の標的シーケンスまたはシ
ーケンスサブセットに対して、実質的に一層低い結合親
和性を有する。
溶出するために用いられる溶媒相を意味する。
件下に分析物を結合(すなわち吸着)するために有効な
静止または粒子相を意味する。
たはキャピラリィプレートにおける電気泳動を意味し、
分離カラムの直径または分離プレートの厚さは約25−50
0μmであり、分離媒体を通して有効な熱放散と共に結
果的に媒体内の熱対流を下げることができる。
リックスを通して充填された物質の電気泳動の移動を遅
くするために有効な架橋または非架橋ポリマーを含む電
気泳動媒体を意味する。
(i)選択されたイソクラテックまたは浅いグラジエン
ト移動相条件下にクロマトグラフィ分離媒体における特
有の、すなわちユニークな移動度;(ii)限度を超える
とき、分離媒体から分析物を溶出できる移動相グラジエ
ントにおけるユニークな濃度限界;または(iii)選択
された移動相グラジエントプロトコルにおけるユニーク
な溶出時間によって証明される。
度”は篩分けマトリックス中の分析物の特有の、すなわ
ちユニークな電気泳動の移動度によって証明される。
上に定義したように“クロマトグラフィ分離媒体におい
て特徴のある特有の溶出”および/または“特有の電気
泳動の移動度”を意味する。
にシーケンス特定方法で結合するために有効な結合ポリ
マー、(ii)クロマトグラフィまたは電気泳動分離にお
いて特有な移動を、結合ポリマーに与えるポリマー鎖、
および(iii)検出できるレポーターまたはタグから成
るプローブを指す。
たは“タグ”は、レポーター標識抗体またはアビジンの
ような、検出できる抗リガンドに特異的に高い親和力で
結合できる、抗原またはビオチンのような、適当な検出
器、またはリガンドによって標識プローブを直接検出で
きる、蛍光団、発光団、ラジオアイソトープ、またはス
ピン標識を指す。
して“スペクトルにより分解できる”の語は、染料の蛍
光放出バンドが充分にはっきりしている、すなわち充分
にオーバーラップしていないことを意味し、各染料が結
合している標的物質、例えばポリヌクレオチドが、標準
光検出装置により各染料によって生じた蛍光信号を基礎
として識別でき、例えば、米国特許4,230,558、4,811,2
18等、またはフィーレスら、pgs.21−76,in Flow Cytom
etry:Instrumentation and Data Analysis(Academic P
ress.New York.1985)に記載されている装置によって例
示されるようなバンドパスフィルターおよび光電子増倍
管の装置を用いる。
たプローブの幾つかの具体例を述べる。代表的な場合
は、プローブは、セクションIIIに記載した方法に従っ
て、複数の標的シーケンスの1またはそれ以上を検出す
るために使用される複数のプローブを含むプローブ構成
物の1部である。図1Bおよび1Cを参照して記載したプロ
ーブは本発明に従ってプローブ構成物を作成するプロー
ブまたはプローブエレメントを代表する。
プローブの1つであるプローブ20を示す。以下に示すよ
うに、プローブの20のようなプローブを含むプローブ構
成物は、図1Aの点線26によって示される標的ポリヌクレ
オチドの領域24のシーケンスのような、標的シーケンス
を同定する“プローブ伸長”方法で、または、このよう
な標的シーケンスを同定するための“プローブ捕獲”方
法で使用するために設計される。これらの方法は以下の
セクションIVで述べる。
くは少なくとも10−20塩基を含むオリゴヌクレオチド結
合ポリマー22を含み、一本鎖形態と同様に、標的ポリヌ
クレオチド26において領域24に相補的である塩基シーケ
ンスを有する。この構成物の他のプローブは標的ポリヌ
クレオチドにおいて既知のシーケンスの他の標的領域に
対してシーケンス特異性をもつ。好適例では、異なるシ
ーケンスプローブ全部の結合ポリマーは実質的に同じ長
さであり、実質的に同じハイブリッド形成反応の動態及
び熱力学(Tm)をもつ標的ポリヌクレオチドに異なるプ
ローブのハイブリッド形成を可能にする。
ドのようなポリヌクレオチドの類似体であり、そして一
本鎖または二本鎖標的ポリヌクレオチドに塩基特異的に
結合できる他の結合ポリマーもまた予想される。荷電し
ていないがデオキシリボヌクレオシドサブユニット間の
立体異性メチルホスホネート連鎖が報告された(ミラ
ー、1979、1980、1990、ムラカミ、ブレイク、1985a,19
85b)。また種々の類似の荷電していないホスホルアミ
デート結合オルゴヌクレオチド類似体も報告された(フ
レーラー)。また、アキラルな荷電していないインター
サブユニット連鎖(スタチャク)をもつデオキシリボヌ
クレオシド類似体およびアキラルなインターサブユニッ
ト連鎖をもつ荷電していないモルホリノに基づくポリマ
ーが報告された(米国特許第5,034,506号)。このよう
な結合ポリマーはワトソン−クリック型塩基対によって
一本鎖的分子にシーケンス特異的に結合するために、ま
たは二本鎖核酸の主要溝中のフーグスティーン型結合部
位によって二本鎖標的ポリヌクレオチドにシーケンス特
異的に結合するために設計することができる(コンバー
グ)。
その5′末端で、Nサブユニット28から成るポリマー27
で誘導化される。このユニットはポリマーのサブユニッ
トまたはサブユニット群であることができる。
ポリマー鎖を形成するエレメント)はそれが結合してい
る対応する結合ポリマーに、上のセクションIに示され
さらに以下に述べるようなクロマトグラフィまたは電気
泳動条件下に特有の移動度を与える。以下に述べるよう
に、特有の移動度はポリマー鎖中のユニット数の差異に
よって達成することができる。
ー、ランダムコポリマー、またはブロックコポリマーで
あることができ、そしてポリマーは好ましくは線状配置
内にある。代わりに、ポリマー鎖は櫛状、枝状、または
樹木状の配置であることができる。さらに、本発明はこ
こで単一点で会合した結合ポリマーに結合した単一ポリ
マー鎖に関して述べているが、本発明はまた、エレメン
トが集合的にポリマー鎖を形成する1個以上のポリマー
鎖エレメントによって誘導される結合ポリマーを期待す
る。
ことを保証するものである。ポリマーはまたハイブリッ
ド形成反応に影響してはならない。結合ポリマーはオリ
ゴヌクレオチドの場合のように高く荷電している場合、
ポリマー鎖は好ましくは荷電していないか、または若干
の荷電を含む。
によって長さを変えることができるモノマー(例えば、
ポリエチレンオキシドユニットまたは線状炭化水素ユニ
ット)を用いて形成することができる。このようなモノ
マーは直接、あるいは、荷電しているか荷電していない
結合基を介して、互いに結合できる。
例えばポリアミドアミン分枝ポリマーを含むポリマーで
あることができる(Polysciences,Inc.,Warrinkgton,P
A)。
してまたは単一プローブ固相合成法の一部として、以下
に記載する。
ユニットから形成され、HEOユニットは末端と末端を接
合し、図2に示されるような、エチレンオキシドサブユ
ニットのこわれない鎖を形成するか、または、以下に述
べるように、荷電していない(図3)または荷電した
(図5)連鎖によって結合する。アミド連結基によるヘ
プタエチレンオキシドユニットの連鎖は図6に示し、短
いアミノ酸ペプチドから成るポリマー鎖は実施例7に記
載する。
であり、それら自身、単一のプローブまたはプローブセ
ットとして、本発明による構成物を形成する3個の追加
のプローブまたはプローブエレメント対を記載する。
ンス特異的に結合するために設計されたポリマー21を結
合するシーケンス特異的オリゴヌクレオチドを有するプ
ローブ25を示す。これによって結合ポリマーは、一定の
ハイブリッド形成条件下に、それぞれ選ばれた一本鎖ま
たは二本鎖標的シーケンスと安定な二重または三重ハイ
ブリッドを形成するために有効なサブユニットのシーケ
ンスを含むことを意味する。以下の図18を参照して示さ
れるように、結合ポリマーはDNAとRNA断片の両方を含
む。Nユニット33から成るポリマー鎖31はその5′末端
で結合ポリマーに結合し、下記のように、特有の移動度
を結合ポリマーに与える。結合ポリマーの3′末端はレ
ポーターまたはタグ39を用いて誘導される。ある面で
は、本発明は複数のこのようなプローブを有する構成物
を含み、各々は関係する異なる標的領域に対して標的と
なる異なるシーケンス結合ポリマーを有し、各々は会合
したポリマー鎖によって与えられる特有の移動度を有す
る。
から成るプローブ32を示し、特に点線40によって示した
標的ポリヌクレオチドの1またはそれ以上の各領域、例
えば領域38において選択シーケンスを検出するために設
計される。
えば点突然変異、または1または少数の塩基を含む追加
または削除型突然変異を含むことができる。代表的な例
では、突然変異の期待部位は既知のシーケンス標的領域
の中心点付近であり、その領域を2つの副領域に分け
る。例示すると、突然変異が点突然変異であり、突然変
異の期待される部位が2個の隣接塩基T−Gの1個にあ
り、T塩基は副領域38aの5′末端を画定し、隣接G塩
基は隣接副領域38bの3′末端を画定する。以下に示す
ように、プローブエレメントはまた種々の他のタイプの
標的シーケンス、例えば病原体に関連したシーケンスま
たは特定のゲノム遺伝子シーケンスを検出するために有
用である。
代表であるプローブエレメント32は、必須の塩基対特異
性のため、好ましくは少なくとも10−20塩基を含むポリ
マーエレメント42を結合するオリゴヌクレオチドから成
り、標的ポリヌクレオチド中の副領域38aに相補的であ
る塩基シーケンスを有する。特に、3′末端ヌクレオチ
ド塩基は対応する副領域、例えば図に示したA:Tマッチ
ングの5′末端ヌクレオチド塩基に対になっている塩基
に対して選択される。第1のプローブエレメントのオリ
ゴヌクレオチドは、その5′末端にて、ユニット28から
形成された鎖27に関して実質的に述べたように、好まし
くはユニット45を繰り返すNから成るポリマー鎖44と共
に、誘導される。プローブ20に関して述べたように、第
1のプローブエレメントのポリマー鎖は、電気泳動また
はクロマトグラフィの条件下に、移動性を与え、これは
構成物中の各シーケンス特異的プローブエレメントに対
して特有である。
代表でもある第2のプローブエレメント36は、必須の塩
基対特異性のため、好ましくは少なくとも10−20塩基を
含むオリゴヌクレオチドポリマー結合エレメント46から
成り、標的ポリヌクレオチド中の副領域38bに相補的で
ある塩基シーケンスを有する。特に、5′末端ヌクレオ
チド塩基は対応する副領域、例えば図に示したC:Gマッ
チングの3′末端ヌクレオチド塩基に対になっている塩
基に対して選択される。
らの会合標的領域に対し共にハイブリッド形成すると
き、2個のプローブにおける対面する末端サブユニッ
ト、この実施例では対面するAおよびCの塩基は、隣接
する塩基、例えば標的ポリヌクレオチドにおける隣接す
るTおよびG塩基とマッチする。この状態では、2個の
プローブエレメントはそれらの対面する末端で連結する
ことができ、以下に述べる本発明の1具体例に従って、
両方のオリゴヌクレオチドエレメントを含む連結プロー
ブを形成し、シーケンス特異的ポリマー鎖および結合オ
リゴヌクレオチドの反対側末端に結合したレポーターを
有する。この2個のプローブにおける隣接塩基の状態
が、標的領域に対しプローブをハイブリッド形成した
後、エスソヌクレアーゼ処理によってオーバーラップす
るデオキシリボヌクレオチドを除去することにより、生
成されることもできることが認められるだろう。
の3′末端にて、図1Bにおいて、48にて示されるレポー
ターFのような検出できるレポーターを用いて標識を付
ける。好ましくは、このレポーターは、光学レポータ
ー、例えば光学検出装置によって容易に検出できる蛍光
分子である。異なる励起波長で検出できる多くの標準蛍
光標識、例えばFAM、JOE、TAMRA、およびROX、およびオ
リゴヌクレオチドにレポーターを取り付ける方法が報告
されている(Applied Biosystems,Connell)。
ブエレメントを含み、1個のエレメントは標的シーケン
スにおいてワイルドタイプの塩基と塩基対になることが
できる末端サブユニット塩基シーケンスを有し、第2の
エレメントはシーケンス中の予想される突然変異と塩基
対となる末端サブユニット塩基を有する。この2個の代
替エレメントは識別できるレポーターを用いて標識を付
け、以下のセクションIIIに記載するように、各標的領
域中の野生型または突然変異シーケンスの明確な同定を
可能にする。あるいは2個の第2のプローブエレメント
(例えばオリゴヌクレオチド)は同じレポーターを有
し、その第1のプローブエレメントは2個の第2のプロ
ーブエレメントに対し特有の移動性を与えるポリマー鎖
をもつ。
された構成物中のプローブを代表するプローブ50を示
す。プローブは、第1と第2のプライマーエレメント5
2、54から成り、プライマーエレメントシーケンスによ
って結合される二本鎖標的ポリヌクレオチドにおける領
域の存在または不在を検出するために特に設計されてい
る。図1Dに示す例において、プライマーシーケンスによ
って結合した領域は56で示され、二本鎖標的ポリヌクレ
オチドの二本の鎖は点線58、60で示される。
を代表するプライマーエレメント52は、必須の塩基対特
異性に対し、少なくとも7−15塩基を好ましくは含むオ
リゴヌクレオチドプライマーエレメント62から成り、そ
して2個の標的鎖の1個、この場合は、鎖58における領
域56の3′末端部位に相補的である塩基シーケンスをも
つ。
ユニット28から形成される鎖27に関して実質的に記載し
たように、好ましくはユニット66を繰り返すNから成る
ポリマー鎖64を用いて誘導される。プローブ20に関して
述べたように、第1のプローブエレメントのポリマー鎖
は構成物中の各シーケンスに特異的なプライマーエレメ
ントに特有な移動を与える。
成物中の第2のプローブエレメントを代表し、必須の塩
基対特異性に対し、やはり少なくとも7−15塩基対を好
ましくは含むオリゴヌクレオチドプライマーエレメント
68から成り、そして反対側の鎖−−この場合には、領域
56を形成する二重のDNAの鎖60の5′末端部位に相補的
である塩基シーケンスをもつ。第2のプライマーエレメ
ントは、上述のように、検出できるレポーターを用いて
標識を付ける。あるいは、標識付けは、以下に述べるよ
うに、増幅した標的シーケンスを形成した後に行うこと
ができる。
既知のポリマーサブユニット合成方法に従う。選択され
た長さのポリエチレンオキシド含有鎖の形成方法は以下
に示され、そして実施例1−5において詳述する。これ
らの方法は、一定の大きさのマルチサブユニットポリマ
ーユニットを直接または結合基を介して、互いにカップ
リングすることを含み、広範囲のポリマー、例えばポリ
エチレンオキシド、ペプチド、ポリグリコール酸、ポリ
乳酸、ポリウレタンポリマー、オリゴ糖および疎水性炭
化水素鎖に応用できる。
リマー鎖は選択された長さのコポリマー、例えばポリプ
ロピレンユニットと交替するポリエチレンオキシドユニ
ットを含む。他の例として、選択された長さのポリペプ
チドとアミノ酸構成物(即ち、天然または人工的アミノ
酸残基)は、ホモポリマーまたは混合ポリマーとして、
実施例5および7に記載したように、調製することがで
きる。
製するための1方法を示す。図に示すように、HEOはジ
メトキシトリチル(DMT)で一端が保護され、その他端
でメタンスルホネートで活性化する。活性化したHEOは
次にDMT−保護HEOダイマーを形成するため、第2のDMT
保護HEO基と反応することができる。このユニット付加
は連続して所望のPEO鎖長になる迄行われる。この方法
の詳細は実施例1に与えられる。
ってHEOユニットを連続してカップリングすることを記
載する。簡単に述べると、図3に関して、HEOは穏和な
条件でトリレン−2,4−ジイソシアネートの2ユニット
と反応し、活性化したHEOは次にHEOと両端でカップリン
グしてHEOのビスウレタントリル結合トリマーを形成す
る。
来のホスホルアミダイトオリゴヌクレオチド合成方法の
拡充によって、または他の標準カップリング方法によっ
て行うことができる。図4Aは、ホスホルアミダイトカッ
プリングによって、固体支持体上に形成されたオリゴヌ
クレオチドの5′末端にPEOポリマー鎖をカップリング
するための方法を示す。図4Bは、やはりホスホルアミダ
イトカップリングによって、上記ビスウレタントリル結
合ポリマー鎖を固体支持体上でオリゴヌクレオチドにカ
ップリングすることを示す。2つのカップリング方法の
詳細は、それぞれ、実施例3Bおよび3Cに示される。
リマー鎖ユニットをオリゴヌクレオチドに段階的に付加
することによって、オリゴヌクレオチド(または他のシ
ーケンス特異的結合ポリマー)に作り上げることができ
る。
リゴヌクレオチドにHEOユニットを段階的に付加するこ
とを示す。この方法は一般に、段階的にヌクレオチド付
加を行う際に使用される同じホスホルアミダイト活性化
および脱保護工程に従う。詳細は実施例4に示される。
ヘプタエチレンオキシドユニットを段階的に付加するこ
とは図6に示される。この化学は規則正しいペプチド合
成に使用されるものと似ている。
に結合しているホスホルアミデート結合基によって結合
したポリエチレンオキシドユニットを含むポリマー鎖も
有用である(アグラワル、1990)。
シーケンスプローブに特有な電気泳動またはクロマトグ
ラフィによる移動度を与える。ポリマー鎖が誘導結合ポ
リマーの移動を行う寄与は一般にポリマー鎖のサブユニ
ット長に依存する。しかし、荷電基をポリマー鎖、例え
ばPEO鎖中の荷電した結合基、またはポリペプチド鎖中
の荷電したアミノ酸に付加することも使用され、プロー
ブに対して選択された移動度を達成することができる。
ラフィ方法または電気泳動方法によって分離することが
難しい異なるシーケンスのポリヌクレオチドは、結合す
るポリマーに取り付けたポリマー鎖によってきれいに分
離することができる。この方法は特にポリヌクレオチド
部位が実質的に同じ長さのポリヌクレオチド含有プロー
ブを分離するのに有用である。この特色の一つの利点は
本方法に使用されるプローブ対は実質的に同じハイブリ
ッド形成速度論をもつように設計できることである。
ンスプローブは液体クロマトグラフィによって分離され
る。本方法に使用するための例示的固相媒体は逆相媒体
(例えば、C−18またはC−8固相)、イオン交換媒体
(特にアニオン交換媒体)、および疎水性の相互作用媒
体を含む。
典型的に、線状、曲線状または段階的溶媒グラジエント
を用いて行われ、水性溶媒中のアセトニトリルまたはイ
ソプロパノールのような非極性溶媒の水準は、クロマト
グラフィ走行中に増加し、固相に対する各分析物の親和
性に従って連続して溶出物を溶出させる。ポリヌクレオ
チドを分離するため、イオン対をつくる薬剤(例えばテ
トラアルキルアンモニウム種)は典型的に溶媒に含まれ
ホスフェートオキシアニオンの電荷をマスクする。
変えるポリマー鎖の付加によって変えることができる。
従って、逆相クロマトグラフィを用いて、固相に対する
プローブの親和性を、適度に疎水性のポリマー(例えば
PEO含有ポリマー、短いポリペプチド、等)をプローブ
に付加して増加させることができる。一層長い結合ポリ
マーは固相に対して一層大きい親和性を与え、従って溶
出されるプローブに対して一層大きい非極性溶媒濃度
(および一層長い溶出時間)を必要とする。
与えるため付着ポリマーを使用することは実施例6およ
び7に示される。実施例6に記載したように、図6の式
24によって示される25量体のオリゴヌクレオチド誘導体
は、0ないし4ポリマーユニットをもつポリマー鎖を含
み、C−18カラムで逆相HPLC(高速液体クロマトグラフ
ィ)にかけた。オリゴヌクレオチド誘導体は0.1Mのトリ
エチルアンモニウムアセテート中でアセトニトリルの直
線勾配を用いて溶出した(30分以上、10−25%アセトニ
トリル)。
ロのHAAユニット(HAA=−NH(CH2CH2O)7CH2CO−)を
含むアセチル化25量体は最初、11.46分の溶出時間で溶
出した。1、2、3および4のHAAユニットを含む25量
体の誘導体は、それぞれ、13.78、16.27、19.41、およ
び22.62分の溶出時間で後に溶出した(クロマトグラフ
ィの他のピークはクロマトグラフィ前に除去しなかった
不純物に相当する)。
を用いる正に荷電した固相から溶出され、分析物は各分
析物の負電荷の数と分布に従って溶出する。ポリアニオ
ンとして、ポリヌクレオチドはポリヌクレオチドの長さ
に従って溶出し、最小のポリヌクレオチドが最初に溶出
し、塩の濃度が時間と共に増加するので一層長いポリヌ
クレオチドが溶出する。従って、アニオン交換クロマト
グラフィは本発明方法において使用される場合、プロー
ブに付着したポリマー鎖は好ましくは荷電しており;正
に荷電したポリマー鎖を使用して固相に対するプローブ
の親和力を減らし、負に荷電したプローブを使用して固
相に対する親和力を増すことができる。
する。
分離 本発明の他の面によれば、本発明の標識を付けた異な
るシーケンスプローブは篩分けマトリックスにおいて電
気泳動によって分離することができる。好ましくは、電
気泳動分離はキャピラリィチューブで行われる。使用で
きる篩分けマトリックスは電子対を共有して架橋したマ
トリックス、例えばビスアクリルアミドと電子対を共有
して架橋したアクリルアミド(コーエンら、1990);線
状ポリマーを用いて形成したゲルマトリックス(マチエ
スら、1992);ゲルを含まない篩分け媒体(ヅら、199
2);およびミセル含有媒体(例えば、テラベ、1985)
のようなマトリックスを含む。ポリアクリルアミド含有
マトリックス中のアクリルアミドの割合は、100−1000
塩基の範囲でフラグメントを分離するため約3.5%か
ら、10−100塩基の範囲で分離を行うため約20%までの
範囲であることができる。電気泳動媒体は変性剤、例え
ば、7Mのホルムアミドを、一本鎖形態にポリヌクレオチ
ドを維持するために含むことができる。
ドの移動度は正味の電荷および大きさに依存し、一層小
さいポリヌクレオチドは一層大きいポリヌクレオチドよ
りも迅速に移動する。従って、任意のポリマー鎖(例え
ば、図3)を使用して、ポリマー鎖を付着するプローブ
の全体の大きさを増加させて、一層低いプローブの移動
度を与えることができる。好ましくは、鎖はその正味の
電荷において中性または正である。正に荷電したポリマ
ー鎖(例えばアグラワルらによって記載された、1990)
は特に、ポリマー鎖における正の電荷がプローブの正味
の電荷を、そして従って電気泳動媒体によってプローブ
を引張るために有効な正味の電気的力を減らすので、プ
ローブの移動度を減らすために有効である。
ョンIに示したように、適当な検出器によって標識プロ
ーブまたはリガントを直接検出できるレポーター標識を
含む、または含むように改善することができる。
に好ましくはセクションIに定義されたようにスペクト
ルで分解できる。例えば、レポーター標識は、当該分野
で知られている方法によって、プローブのポリヌクレオ
チド部分の5′または3′−末端塩基に取り付けること
ができる(フングら、米国特許4,855,225;プロバーら、
Science 238、4767−4771(1987);スミスら、Nucleic
Acids Res,13,2399−2412(1985)等参照)。
フルオレセイン、5−および6−カルボキシ−4,7−ジ
クロロフルオレセイン、2′,7′−ジメトキシ−5−お
よび6−カルボキシ−4,7−ジクロロフルオレセイン、
2′,7′−ジメトキシ−4′,5′−ジクロロ−5−およ
び6−カルボキシフルオレセイン、 2′,7′−ジメトキシ−4′,5′−ジクロロ−5−およ
び6−カルボキシ−4,7−ジクロロフルオレセイン、 1′,2′,7′,8′−ジベンゾ−5−および6−カルボキ
シ−4,7−ジクロロフルオレセイン、 1′,2′,7′,8′−ジベンゾ−4′,5′−ジクロロ−5
−および6−カルボキシ−4,7−ジクロロフルオレセイ
ン、 2′,7′−ジクロロ−5−および6−カルボキシ−4,7
−ジクロロフルオレセイン、および2′,4′,5′,7′−
テトラクロロ−5−および6−カルボキシ−4,7−ジク
ロロフルオレセインを含む。
されている:ホブ.ジュニア、米国特許4,997,928;フン
グら、米国特許4,855,225;およびメンチェンら、PCT出
願US90/06608。あるいは、本発明のプローブはベルゴト
らによって教示されるスペクトルで分解できるローダミ
ン染料を用いて標識をつけることができる(PCT出願US9
0/05565)。
において1またはそれ以上の異なるシーケンス領域を検
出するために設計される。本方法では、上記タイプの複
数のシーケンス特異的プローブを標的シーケンス添加す
る。このプローブは、標的ポリヌクレオチドにおいて対
応するシーケンスにプローブのシーケンス特異的結合に
有利である条件下に標的ポリヌクレオチドを用いて反応
させる。上述のように、この結合は代表的にはワトソン
−クリック型塩基対による標的とプローブにおける相補
的塩基シーケンスのハイブリッド形成を含む。
スとの間の塩基特異的水素結合対は、フーグスティーン
型塩基対を介して、代表的には重複分子の主な慣例にお
いて(コーンバーグ)また予期される。
ローブを処理してシーケンス特異的方法において標的シ
ーケンスに結合したプローブに選択的に標識を付け、修
飾された標識プローブを生成し、各々は選択されたクロ
マトグラフィまたは電気泳動条件で明確な移動度をも
つ。修飾工程は、期待される突然変異位置の全域で、酵
素連結反応のような連結反応、選択された標識シーケン
スのプライマー開始増幅、標識を付けたヌクレオチドト
リホスフェート分子の存在でのプローブ伸長、または以
下のサブセクションA−Eに記載されるように、標的領
域に結合したプローブの酵素分解によって、プローブエ
レメントを結合することを含むことができる。
識プローブは、上記セクションIIIに述べたように、電
気泳動方法またはクロマトグラフィ方法によって分別さ
れる。この修飾された標識プローブの移動速度を使用し
て標識プローブと会合した特定のシーケンスを同定し、
標的ポリヌクレオチドにおける特定のシーケンスの存在
を同定することができる。
き、各プローブ対は選択された標的シーケンスの隣接部
分に対してシーケンスにおいて相補的である2個のポリ
ヌクレオチドプローブエレメントをもつ。電気泳動また
はクロマトグラフィの移動度を修飾するためのポリマー
鎖はプローブエレメントの1つに取り付けられ、検出で
きるレポーター標識は値のプローブエレメントに取り付
けられる。プローブは標的ポリヌクレオチドに対してハ
イブリッド形成され、次に標的結合プローブエレメント
の末端サブユニットが隣接の標的塩基と塩基対となると
きそれらの末端サブユニットを連結するために有効な条
件下に処理される。連結したプローブ対は次にポリヌク
レオチドから脱離して、上記のように、クロマトグラフ
ィまたは電気泳動により分離される。この方法は、対応
する連結したプローブ対を形成しないとき試料中に標的
シーケンスが存在することは報告されていないように設
計される。連結できないプローブ対は(i)レポーター
標識を含まないプローブエレメントは検出できず、(i
i)ポリマー標識を含むプローブエレメントは連結した
プローブ対の移動度とは実質的に異なる移動度をもつの
で、連結した対から区別することができる。さらに、ス
ペクトルで分解できるレポーター標識の使用は、選択さ
れた分離媒体において同じ移動度をもつ連結したプロー
ブを、異なるスペクトルの特徴を基礎として(異なる発
光波長をもつ蛍光標識を用いて)区別することを可能に
する。
レオチドにおいて特定のシーケンスを特に検出するため
に設計される。標的ポリヌクレオチドは、二本鎖または
一本鎖のポリヌクレオチドの単一分子、例えばゲノムDN
A、cDNAまたはRNAを含むウィルスゲノム、またはポリヌ
クレオチドフラグメント、例えばゲノムDNAフラグメン
トまたは感染試料からのウィルスおよび体細胞のポリヌ
クレオチドフラグメントの混合物であってもよい。代表
的には、本具体例において、標的ポリヌクレオチドは例
えば熱により変性してプローブ結合ポリマーとハイブリ
ッド形成できる一本鎖標的分子を形成する二本鎖DNAで
ある。
ば、図示した3′ないし5′配向をもつ二本鎖標的の
“+”鎖を示す。ポリヌクレオチドは、それぞれ72、7
4、76、および78に示される複数の領域R1、R2、R3ない
しRnを含み、それぞれは異なる塩基シーケンスを含む。
各領域は、好ましくは約20−80の塩基対の間で、好まし
くはほぼ同じ長さ、すなわち、塩基対の数をもつ。本方
法はまた僅かな異なるシーケンス領域が検出される場所
にも応用できるが、本方法でアッセイされるべき領域Rn
の全数は100までまたはそれ以上であってもよい。
ようにして小さい突然変異の発生の他の型、例えば1ま
たはそれ以上の塩基の除去または付加が本方法によって
検出できるかが正しく認識されるだろう。さらに一般的
に、本方法を使用して、同時に、標的シーケンス、例え
ば病原体標本の混合物と会合したシーケンス、またはゲ
ノムDNA断片混合物中の遺伝子シーケンスをアッセイす
ることができる。
クレオチド70の拡大部分を示す。領域74は、隣接する塩
基TおよびCを含み、これら2つの塩基で終わる2つの
副領域74a、74bに領域を分けることを示している。Tお
よびCの塩基は野生型(突然変異していない)塩基であ
るが、これらの塩基のひとつ、例えばT塩基は、関係す
る既知の点突然変異部位に相当する。同様に、領域76
は、この領域をこれら2個の塩基で終わる2個の副領域
76a、76bに分ける隣接塩基GおよびGを含む。副領域76
aのG塩基は野生型T塩基から点突然変異を示し、隣接
するG塩基は突然変異していない。このアッセイ方法
は、このような点突然変異を含む領域74および/または
76のような標的の領域を同定するように設計される。
のプローブエレメント、例えば上記図1Bに関して記載さ
れたものから成る。この構成物を、変性した形で、標的
ポリヌクレオチドに添加し、その成分をアニーリングし
てプローブエレメントを、図1Bに示すように、相補的シ
ーケンス標的領域に対してハイブリッド形成する。
プローブエレメント80a、80bを含み、それらのシーケン
スはそれぞれ標的ポリヌクレオチドの領域74において対
応する副領域74a、74bに相補的である、すなわち、プロ
ーブエレメントシーケンスが標的のR2領域の“−”鎖の
それらに対応している。特に、プローブエレメントは、
エレメントが図に示すように領域74の相補的副領域にハ
イブリッド形成されるとき、標的領域において隣接する
塩基TおよびCとワトソン−クリック型塩基対を形成す
るために有効である末端サブユニットAおよびG塩基を
有する。
クレオチドの領域76でそれぞれ対応する副領域76a、76b
にシーケンスが相補的である一対のプローブエレメント
82a、82bを含む。この場合に、プローブエレメントは、
図に示すように、領域76の相補的副領域に対してエレメ
ントがハイブリッド形成されるとき、野生型標的領域に
おける隣接する塩基TおよびG塩基とワトソン−クリッ
ク型塩基対を形成するために有効である末端サブユニッ
トAおよびC塩基を有する。しかし、示した実施例で
は、TないしGの突然変異は会合した標的塩基にA末端
サブユニットのワトソン−クリック型塩基対を妨げる。
をアニーリングした後、反応混合物を連結試薬、好まし
くはリガーゼ酵素で処理して、対比する塩基が隣接する
標的塩基と塩基対となるプローブエレメントの対を連結
する。代表的な連結反応条件は実施例8に示される。連
結反応は末端サブユニットが標的塩基と塩基対となって
いるプローブエレメントに対して選択的である。従っ
て、図に示した例では(図8C)、プローブエレメント80
a、80bは連結しているが、プローブエレメント82a、82b
は連結していない。
ゴヌクレオチドを検出できるレポーターを有するオリゴ
ヌクレオチドに結合し、1端がプローブ特異的ポリマー
鎖を用いて、その他端で検出できる(蛍光)レポーター
を用いて、標識を付けたオリゴヌクレオチドから成る、
連結したプローブ84のような、標識を付けた連結プロー
ブを選択的に形成することは、高く評価できる。図8Dに
示されるように、標的プローブ複合体を変性すると、野
生型の標的シーケンスに対応する連結し標識を付けたプ
ローブ、およびプローブエレメント末端サブユニットに
てあるいはその近くで、点突然変異体に対応する連結し
ていないプローブエレメントとの混合物を脱離する。各
連結し標識を付けたプローブはポリマー鎖を有し、これ
はプローブに対して、上記のように、選択されたクロマ
トグラフィまたは電気泳動条件下に特有の移動度を与え
る。
つ(R3)は、相補的シーケンスプローブエレメントの連
結反応を妨げる突然変異体を含む。実施例として、全体
の標的ポリヌクレオチドは関心のある8個のシーケンス
領域を含み、その領域のR3とR7はプローブエレメント連
結反応を妨げるタイプの突然変異体を有し、他の6個の
領域は連結し標識を付けたプローブに導く野生型シーケ
ンスであると思われる。図9は連結反応アッセイ方法に
おいて期待される理想化したクロマトグラフィ(または
電気泳動)パターンを示す。図中のピーク1−8は、HE
Oユニットを連結した1、2、3、4、5、6、7およ
び8のような、段々長くなるポリマー鎖をもつ連結オリ
ゴヌクレオチドプローブの予期される溶出時間である。
観察された電気泳動パターンは、図に示されるように、
3と7のピーク位置でギャップを示し、3と7の標的位
置における突然変異体の証拠となる。全部の修飾されて
いないDNAは実質的にN=Oのピークと共に溶出するだ
ろう。
要ならば、繰り返されるプローブエレメントハイブリッ
ド形成と連結反応工程を用いて誘導されたプローブの増
幅によって高めることができる。簡単な追加の(線状)
増幅は標的として標的ポリヌクレオチドを用い、変性、
アニーリング、およびプローブエレメント連結反応を誘
導プローブが所望濃度に達するまで繰り返して達成する
ことができる。
って形成された連結プローブを、公表された方法(ウィ
ン−ディーン)に従って、また実施例9に述べたよう
に、リガーゼ鎖反応(LCR)によって増幅することがで
きる。図10A−10Cに示したこの方法では、図1Bに関して
述べたように2組のシーケンス特異的プローブが二本鎖
DNAの各標的領域に対して用いられ、この2本の鎖は図1
0Aでは170と172で示されている。174で示した1組のプ
ローブはプローブエレメント174a、174bを含み、これら
は、図に示したように、鎖170上の標的シーケンスの隣
接する次の領域にてシーケンス特異的結合するために設
計されており、そして176で示した第2の組のプローブ
はプローブエレメント176a、176bを含み、これらは、や
はり図に示したように、反対側の鎖172上の標的シーケ
ンスの隣接する次の領域でシーケンス特異的結合するた
めに設計されている。
の組32に類似して、プローブエレメント174aと176aはポ
リマー鎖を用いて誘導され、プローブエレメント174bと
176bは蛍光レポーターを用いて誘導される。2組のプロ
ーブを変性していない一本鎖標的シーケンスにハイブリ
ッド形成した後、各標的領域に結合したプローブエレメ
ントを連結し、反応生成物を変性して標的を付けたプロ
ーブ178、180を脱離する(図10B)。これらの標識を付
けたプローブは、図10Bに示すように、今は22個の標識
プローブを生成する連結反応を用いてプローブの組17
4、176を結合するため標的基体として供することができ
る。この工程を、N−2回繰り返して、図10Cに示すよ
うに、2N個の標識プローブ178、180を全部、理想的に生
成する。
体を検出することについて上述したが、この方法はま
た、例えば異なる病原体シーケンスの存在または不在に
関係がある多重標的シーケンス、または高等生物の異な
るゲノムシーケンスを検出するためにも応用できること
が理解される。
の方法では、各シーケンス特異的プローブ、例えばプロ
ーブ204は一対のプローブエレメント、例えばエレメン
ト206、208を含み、これらは例えば標的ポリヌクレオチ
ド212のシーケンス210のような選択されたシーケンスの
隣接する位置に結合するために設計される。プローブ20
6は結合ポリマー214、プローブエレメントに特有の移動
性を与えるポリマー鎖216、およびポリマー鎖または結
合ポリマーに取り付けられるレポーター218を含む。第
2のプローブエレメントは、図8A−8Dについて上述した
ように、2個のエレメントを会合した標的シーケンスに
ハイブリッド形成させるとき、プローブエレメント206
と連結できるオリゴヌクレオチドである。
ブリッド形成し、連結し、そして脱離され、修飾した
(連結した)標識プローブ220を生成する。連結プロー
ブ220の移動性は取り付けたポリマー鎖によってプロー
ブ混合物中の他の結合したプローブの移動性に関して特
有である。次に修飾プローブは、上述したように、クロ
マトグラフィまたは電気泳動によって分別し、関心のあ
る異なる標的シーケンスと会合したプローブを同定す
る。
ローブを修飾するための関連した方法を示す。この方法
を使用して、フラグメントT1ないしTn、例えばそれぞれ
150および152で示した二本鎖フラグメントT1およびT3と
会合した1個またはそれ以上のシーケンスS1ないしSnの
存在を検出する。このフラグメントはこの方法では、関
心のある各標的シーケンスに対して、1対のプローブエ
レメント、例えば図1Bに記載したプローブエレメントの
一般的な構造をもつプローブエレメント152、154を含む
プローブ構成物を用いてハイブリッド形成によって修飾
される。即ち、エレメント152はフラグメントT1の1の
領域に塩基特異的に結合するために設計されたオリゴヌ
クレオチド156、および選択された長さのポリマー鎖157
を含み、エレメント154はフラグメントの第2の領域に
塩基特異的に結合するために設計されたレポーター標識
オリゴヌクレオチド158である。図15Aおよび15Bに示さ
れるように、標的シーケンスT1、T2、およびT3に対する
プローブはポリマー鎖(それぞれi,j、およびk)を含
み、これらはポリマー鎖が取り付けられている結合ポリ
マーに対して特有の電気泳動度を与える。
択された長さのポリマー鎖をもつ1のプローブと第2の
レポーター標識プローブを用いてハイブリッド形成した
フラグメント、例えばフラグメント160を形成するプロ
ーブ構成物中のプローブエレメントを用いて、ハイブリ
ッド形成によって修飾される。標的フラグメントはこの
方法では、2個のプローブエレメントを結合するプロー
ブ連結作用に役立つと考えられる。フラグメントそれ自
体は、結合したプローブエレメントの電気泳動の移動度
をはっきりとは変化させないので、電気泳動によって分
別するとき、この方法は1個のプローブエレメントのポ
リマー鎖によって与えられる特有の電気泳動の移動度に
従って標的シーケンスフラグメントを同定することがで
きる。図15Cでは、混合物中のフラグメントT1およびT3
に相当する2個のピークが電気泳動図において観察され
る。フラグメントT2(図15Cの点線)に相当するピーク
の不在は、T2が試料中に存在しないことを示している。
ローブは二本鎖標的ポリヌクレオチドの1またはそれ以
上の領域のプライマー開始増幅のために設計される。増
幅した標的領域の少なくとも1本の鎖は各増幅フラグメ
ントに特有の移動性を与えるポリマー鎖を有する。この
増幅した領域は増幅中または増幅後にレポーター標識を
付けることができる。
ための少なくとも1個の、そして代表的には複数の領
域、例えば領域96を有する通常は2本鎖の標的ポリヌク
レオチド94の2本の分離鎖90、92を示す。標的は、図1C
について上述したプローブ50において、各プローブがプ
ライマーエレメント52、54のような1対のプライマーエ
レメントから成るプローブ構成物と反応させる。図11A
はプライマーエレメント100、102から成るプローブ98を
示す。プライマーエレメント100は、一本の鎖の領域96
の3′末端にハイブリッド形成のために設計されたオリ
ゴヌクレオチドプライマー104から成り、その5′−末
端で、上記プライマーエレメント52に似ている選択され
た長さのポリマー鎖106を有する。エレメント102は反対
側の鎖領域96の5′末端にハイブリッド形成するために
設計されたオリゴヌクレオチドプライマーであり、その
5′末端で蛍光レポーターを有する。
は、図11Aに示したように、反対側の標的ポリマーヌク
レオチド鎖の相補的領域に対してプローブ構成物中のプ
ライマーエレメントを容易にアニーリングするハイブリ
ッド形成条件下に標的ポリヌクレオチドと反応する。こ
の反応混合物を次に数回、そして代表的には約20−40
回、よく知られたポリメラーゼ鎖反応(PCR)方法(ム
リス、サイキ)に従って、プライマー伸長、変性、プラ
イマー/標的シーケンスアニーリングによって熱循環さ
せる。プローブプライマー100、102によって生じる1個
の増幅領域は図11Bにおいて100で示される。
つにレポーター標識を付けると、領域103のような二本
鎖増幅領域は1本の鎖上にあるポリマー鎖および他の鎖
上のレポーターを有する標識プローブを形成する。ある
いは、増幅したシーケンスに臭化エチジウムのような挿
入または架橋染料を添加して二本鎖形態で標識を付けて
もよい。異なるシーケンスの増幅プローブは、二本鎖種
の異なる移動性に基づいて、上述のようにクロマトグラ
フィまたは電気泳動によって二本鎖形態で分別すること
ができる。
されたシーケンスの存在に対してアッセイする際に有用
である。1例として、標的ポリヌクレオチドは多数の可
能な連結した遺伝子シーケンスをもつゲノムDNAであっ
てもよい。構成物中のプローブは関心のある連結シーケ
ンスのPCR増幅において有効なプライマー対である。シ
ーケンス増幅後に関心のあるシーケンスの存在または不
在を、電気泳動またはクロマトグラフィによる操作の間
に標識プローブの位置または溶出時間から決定すること
ができる。
例えば縮重シーケンスが関心のある遺伝子シーケンスに
対して相補的であることをアッセイすることを望むこと
ができる。この応用では、プローブ構成物を使用して特
定のシーケンスを増幅する。各プライマーシーケンスは
特有のポリマー鎖をもつので、シーケンス末端領域に相
補的であるプライマーシーケンスは標識プローブの移動
性から決定することができる。上記の他の応用に加え
て、本方法は分別したプローブ混合物中に既知の大きさ
のポリマー鎖を用いて誘導された一連のオリゴヌクレオ
チド、およびテストプローブ上に有する標識を付けた異
なるレポーター基を含ませることを必要とし、クロマト
グラフィまたは電気泳動による分離に対して移動基準を
与える。
鎖形態におけるように、レポーター標識プローブを用い
て、増幅シーケンスに対してハイブリッド形成すること
によって標識を付ける。この応用は図12Aおよび12Bに示
され、一本の鎖の上にあるポリマー鎖114を有する増幅
標的シーケンス112を示す。アッセイの目的は任意の、
そしてどちらかの、プライマープローブによって生成し
た1またはそれ以上のフラグメントがプローブシーケン
スに対し相補的なシーケンスを含むかどうかを決定する
ことである。この例では、フラグメント112は塩基シー
ケンスが既知のシーケンスプローブ118のそれに対して
相補的である領域116を含む。
ブリッド形成条件下に1個またはそれ以上の標識プロー
ブとハイブリッド形成され、ポリマー鎖を含むフラグメ
ント116の鎖にプローブ118を結合し、従って、上記のよ
うに、クロマトグラフィまたは電気泳動方法によって分
別することができる標識プローブを形成する。
32、136から成る二本鎖フラグメント130を修飾するため
の別の方法を示す。この示された具体例では、鎖132を
増幅中にフラグメントの1端でレポーター134を用いて
蛍光標識を付けた。フラグメント鎖は種々の方法、例え
ば標識dNTPの存在においてニックトランスレーションま
たはホモポリマーテイリングによって、またはレポータ
ー標識プライマーを用いるPCR増幅によってレポーター
標識を付けることができる。
の1本の鎖の異なるシーケンス領域にシーケンス特異的
に結合するために設計されたプローブ138、140、142を
含むプローブ構成物と混合する。代表としてプローブ13
8は、所望する領域に特異的な塩基シーケンスを有する
オリゴヌクレオチド144、および各異なるシーケンスプ
ローブに対して特有な移動性を与えるポリマー鎖146を
含む。
ってプローブ構成物中のプローブを用いて修飾され、プ
ローブ結合に対応する1またはそれ以上の二本鎖領域
と、フラグメント150のようなフラグメントを形成す
る。修飾フラグメントは1本鎖に標識を付け、反対側の
鎖プローブ中に1本またはそれ以上の選択された長さの
ポリマー鎖を用いて誘導される。
に分別され、各フラグメントを会合したポリマー鎖の数
と大きさに従ってフラグメントを分別する。
132はプローブ138、142を結合し、このようにして全部
のi+k個のポリマー鎖単位を有するように修飾され
た。フラグメントは、電気泳動により、フラグメントに
会合したポリマー鎖単位の全数に依存する移動時間で移
動するので、各フラグメントに会合したプローブを同定
することができる。この方法は、例えばゲノムDNA内の
既知のシーケンス間の距離を調べるため、または連結し
たシーケンスを同定するために用いることができる。
第3の一般的方法は、図13Aと13Bに示される。この方法
では、図に120で示されるような一本鎖標的ポリヌクレ
オチドは、標的の選択された領域に塩基特異的に結合す
るために設計されているプローブ122のような、複数の
プローブを含むプローブ構成物と反応する。代表とし
て、プローブ122は図1Aのプローブ20に似ていて、フリ
ーの3′末端OH基を有するオリゴヌクレオチド、および
その5′末端に有する選択された長さのポリマー鎖を含
む。
たように、少なくとも1個のレポーター標識dNTPの存在
で,DNAポリメラーゼIを用いて処理される。染料標識dN
TPsは市販の原料から合成することができる。例えば、
アミノ7−dUTP(クロンテク、パロアルト、CA)は標準
のカップリング条件下にフルオレセインNHSエステル
(モレキュラープローブ、ユージン,OR)と反応するこ
とができ、フルオレセイン標識dUTPを形成する。ポリメ
ラーゼは全部で4個のヌクレオシドトリホスフェートの
存在で、128で示されるような1個またはそれ以上の標
識ヌクレオチドを混入し、標的結合プローブの3′末端
を伸長し、各プローブシーケンスの特性を示しているポ
リマー鎖を有する所望の標識プローブを形成するのに効
果がある。あるいは、上記例においてプローブに混入し
た後、フルオレセインを修飾ヌクレオチド、例えばアミ
ノ−7−dUにカップリングすることができる。
うにクロマトグラフィまたは電気泳動によって分別し、
標的ヌクレオチドに含まれるシーケンスに対応する標識
プローブの移動度を同定する。
はプローブ構成物は、標的ポリヌクレオチド188の領域1
86のような、一本鎖標的ポリヌクレオチドの領域にシー
ケンス特異的に結合するために設計された複数のシーケ
ンス特異的プローブ、例えばプローブ184を含む。代表
として、プローブ184は、第1の一本鎖DNA切片192、お
よび一本鎖RNA領域196を含む第2の切片194から成る結
合ポリマー190のプローブを含む。結合ポリマーの第1
の切片に取り付けられたポリマー鎖198は、上記のよう
に、結合ポリマーに、特有の移動性を与える。レポータ
ー200は結合ポリマーの第2の切片に取り付けられる。
特に、ポリマー鎖およびレポーターはRNA領域の反対側
にあり、この領域の選択的開裂はプローブを第1の切片
および取り付けられたポリマー鎖にレポーターから分離
するであろう。
イブリッド形成条件下に標的ポリヌクレオチドと反応
し、シーケンス特異的方法でプローブを相補的標的領域
に結合する。図16Aに見られるように、これは各結合プ
ローブにおいてRNA/DNA二本鎖の領域を生成する。反応
混合物は今は、RNaseHのような、二本鎖RNA/DNAを選択
的に切断することができる(Duck)ヌクレアーゼで処理
して、従って各プローブをそのRNA結合領域中で切断す
る。
ってクロマトグラフィまたは電気泳動によって遊離オリ
ゴヌクレオチドとして移動する修飾した標識プローブ
を、各特異的に結合するプローブに対して変性し脱離す
る。代替の具体例では(図示していない)、ポリマー鎖
はプローブのレポーター側に取り付けられ、従ってRNAs
e処理は一部の結合ポリマーを放出し、残りのプローブ
(ポリマー鎖とレポーターを含む)の移動性を変えて、
従って開裂していないプローブについてプローブの移動
性を変化させる。
体例では、プローブ修飾はアニーリングしたプローブか
ら(その5′末端を越えて)標的ポリヌクレオチド上流
までアニーリングしたプライマーを伸長する間に行われ
る。この伸長はまた5′ないし3′エキソヌクレアーゼ
活性(Holland)を組み込むDNAポリメラーゼによって生
成される。本方法は、関心のあるシーケンス領域224を
もつ標的ポリヌクレオチド222を示す図18に示される。
この方法でのプローブはポリマーの5′末端付近にサブ
ユニット229をもつ結合ポリマー228を含むプローブ226
によって例示される。この塩基にポリマー鎖230および
標識プローブ232(これはポリマー鎖のフリー末端に取
り付けることができる)が取り付けられている。また図
には、領域224の上流で、標的にシーケンス特異的に結
合するために設計されているプライマー234が示され
る。
よび1組のプライマー、例えばプライマー234は、ハイ
ブリッド形成条件下に標的ポリヌクレオチドと反応し、
会合したプローブおよび上流プライマーを標的の異なる
シーケンス領域に結合する。標的および取り付けたプロ
ーブは全4個のヌクレオシドトリホスフェートの存在で
上記ポリメラーゼで処理し、図18Bの複数のxによって
示すように、5′ないし3′方向においてプライマーを
重合する。ポリメラーゼが隣接するプローブの5′末端
に達すると、それはプローブを標的領域から置換し、ま
た5′末端サブユニットをプローブから開裂して取り去
る。図18Bに示すように、プローブからのサブユニット2
29の開裂は塩基229、レポーター232、および特有の移動
度をプローブに与えるポリマー鎖230から成る標識プロ
ーブ234を脱離する。
の種類の開裂法が実施されることは認識されるだろう;
ポリメラーゼ活性につながらないエキソヌクレアーゼ活
性を使用する(例えば、E.ColiポリメラーゼIからのN
末端選択的開裂フラグメントおよびバクテリオファージ
λのエキソヌクレアーゼ)、一定のDNAポリメラーゼの
3′→5′校正エキソヌクレアーゼ活性を使用する(こ
の場合ポリマー鎖198とレポーターFは好ましくはプロ
ーブの3′末端に取り付けられ、この3′末端は図17A
の鋳型ポリヌクレオチド188に不適正な1個またはそれ
以上のヌクレオチドを含む)、または制限エンドヌクレ
アーゼのような広範囲のシーケンス特異的エンドヌクレ
アーゼのいくつかを用いる。これらの場合のすべては、
好適な具体例は、開裂部位の同じ側にレポーターとポリ
マー鎖を配置し、それらが開裂に続いて共有結合するよ
うにする。追加のポリマー鎖は標識を付けていないプロ
ーブから標識を付けたプローブを最適に分離するため、
レポーターから開裂部位の反対側のプローブに付加する
かまたは付加しないことができる。
た標的ポリヌクレオチドからのプローブ捕獲と脱離を含
む。図19Aは複数のプローブ、例えばプローブ24−246
を、Ri、Rj、およびRnのような、関係のある異なるシー
ケンス領域を含む標的ポリヌクレオチド248への付加を
示す。代表として、プローブ240は、結合ポリマー250、
このプローブに特有の移動度を与えるポリマー鎖252、
およびポリマー鎖に取り付けられたレポーター254を含
む。図に示した具体例では、各異なるシーケンスのプロ
ーブは特有の移動度を達成するため異なる長さのポリマ
ー鎖をもつ。
に標的ポリヌクレオチドと反応する。図19Aに示した方
法では、プローブ240、242、および246の各々はそれぞ
れ、標的ポリヌクレオチドの領域Ri、Rj、およびRnの相
補的シーケンスとハイブリッド形成する。この例では、
標的ポリヌクレオチドはプローブ244に相補的な領域を
含まず、このプローブは結合していないと仮定する。
ポリヌクレオチドを固定するように処理される。これは
本実施例では、標的ポリヌクレオチドの領域R1に相補的
であるオリゴヌクレオチドプローブ262を用いて誘導さ
れた固体支持体260を付加し、このようにして図19Bに示
したように、固体支持体に標的を結合することによって
行われる。支持体および取り付けた標的とプローブは洗
浄して、非特異的に結合したプローブ、例えばプローブ
244を除去する。最後の処理工程では、洗浄した固体支
持体混合物を変性して、結合したプローブ、例えばプロ
ーブ240、242、および246を脱離し、これらのプローブ
を次に、上記のように、電気泳動またはクロマトグラフ
ィによって分別し、この分別した標識プローブの特有の
電気泳動位置に基づいて、標的シーケンスを同定する。
のように合致しているか高く評価されるだろう。本方法
は複数の標的シーケンスを単一のアッセイフォーマット
でアッセイすることができ、シーケンス特異的標識プロ
ーブと会合した異なるポリマー鎖の移動度に従ってシー
ケンスを迅速に同定する。
動方法で、一本鎖および二本鎖のオリゴヌクレオチドを
分離することができる。特に、本方法は、すべてが似て
いるかまたは同じ大きさの複数のオリゴヌクレオチドを
有効に分別することができる。この特徴の1つの利点は
本方法で用いられるプローブ中のポリヌクレオチド部位
がすべて似ているかまたは同じ大きさをもつことがで
き、従って殆ど同じハイブリッド形成動力学および熱力
学(Tm)で標的シーケンスを用いてハイブリッド形成で
きることである。
成することができる。一つの方法では、選択された数の
ユニットのポリマー鎖を直接オリゴヌクレオチド上で、
従来の固相合成方法によって形成することができる。
の例を記載するものである。これらの実施例は例示であ
るが、本発明の範囲を制限するものではない。
チルクロリド、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチ
ルアミン、酢酸、ピリジン、メタンスルホニルクロリ
ド、水素化ナトリウム、2−シアノエチル−N,N,N′,
N′−テトライソプロピルホスホロジアミダイトは、ア
ルドリッチ、ミルウォーキィ、WIから入手した。ジイソ
プロピルアミンテトラゾール塩、FAM−NHS/DMSO、JOE−
NHS/DMSOおよびTAMRA−NHS/DMSOは、アプライド・バイ
オシステムズ(ABI)、フォスターシティ、CAから入手
した。LAN(リンカーアームヌクレオチド)5′−ジメ
トキシル−トリチル−5−(N−(7−トリフルオロア
セチルアミノヘプチル)−3−アクリルアミド)−2′
−デオキシウリジン−3′−ホスホルアミダイトはモレ
キュラーバイオシステムズ インコーポレイテッド、サ
ンジエゴ、CAから入手した。
ア、ウップサラ、スウェーデンから入手した。誘導オリ
ゴヌクレオチドは1.5ml/分の流速と0.1Mトリエチルアン
モニウムアセテート/水pH7.0およびアセトニトリルの
グラジエントを使用してABI RP−300(C8)カラム(4.6
×220mm)を用いてLC精製した。DNA合成器:380B、ABI、
フォスターシティ、CA。
およびシェパルツのものと似ている。
シド(HEO) 27.0g(95.6ミリモル)のHEOを100mlのピリミジンに
溶解した。この溶液に室温で10時間かけて、27.0グラム
(79.7ミリモル)のジメトキシトリチルクロリドの150m
lピリミジン溶液を添加した。反応物を、室温で終夜撹
拌した(15時間)。溶媒を減圧除去し残渣を150mlのEtO
Acと100mlのH2O、2×100mlの塩水に入れ、有機相をNa2
SO4で乾燥させた。溶媒を除去して暗燈色の油(38.36
g)を与えた。粗物質を200gのキーゼルゲル60を用いて
2%のメタノール−塩化メチレンで溶出するシリカゲル
クロマトグラフィによって精製した(シリカゲルはトリ
エチルアミンで塩基性化した)。適当な画分を一緒にし
て29,52g(50.49ミリモル)の化合物1を与えた。DMT保
護HEO(図2の化合物1)の分析を示す:1 HNMR(300MHzCDCl3)δ7.5−6.8(m、13H芳香族)、 3.75(S、6H、OCH3)、3.6(20H、m、OCH2−CH2O)、 3.5(2H、m、CH2−OH)、3.2(2H、t、CH2ODMT)。
および0.029g(0.17ミリモル)のテトラゾールジイソプ
ロピルアンモニウム塩を不活性雰囲気下に10mlの塩化メ
チレンに溶解させた。これに0.59グラムの2−シアノエ
チルテトライソプロピルホスホルアミダイトを添加し、
混合物を終夜室温で撹拌した。反応混合物をNaHCO3の飽
和溶液、塩水で洗浄しNa2SO4で乾燥させた。溶媒を除去
して1.58gの粗精油を与え、生成物をフラッシュクロマ
トグラフィによってシリカゲルに通して50%EtOAc−ヘ
キサンで溶出して精製した(シリカゲルはトリエチルア
ミンで塩基性化した)。0.8g(1.3ミリモル)の精製ホ
スホルアミダイト(図2の化合物2)を回収した。
Oを10.4g(17.8ミリモル)溶解した。溶液を氷冷し、4.
59g(35.6ミリモル)のジイソプロピルエチルアミンを
添加し、次に2.06g(26.7ミリモル)の塩化メタンスル
ホニルを添加した。反応混合物を30分間撹拌し次にNaHC
O3の飽和溶液、塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥させた。溶
媒を減圧除去し11.93gのメシレート(図2の化合物3)
を与えた。
新たに蒸留したテトラヒドロフランの懸濁液に10℃で1
分間かけて10.14g(36.0ミリモル)のヘキサエチレング
リコールを添加し、混合物を室温で30分間撹拌した。こ
れに、上記実施例1Cからの11.93g(17.9ミリモル)のHE
Oメシレートの50mlテトラヒドロフラン溶液を添加し
た。反応混合物を40−50℃まで3時間暖めて、その後に
溶媒を減圧除去して、残渣を150mlの塩化メチレンに入
れた。これを3×100mlのH2O、塩水で洗浄し、Na2SO4で
乾燥させた。溶媒を減圧除去して粗精油(13.37g)を与
えた。これを上記実施例1Aと同様にシリカゲルクロマト
グラフィによって精製した。10.0gのDMT保護HEO二量体
(11.8ミリモル)を回収した。物質の分析(図2の化合
物4)を示す:1 HNMR(300MHzCDCl3)δ7.5−6.8(m、13H芳香族)、 3.75(S、6H、OCH3)、3.6(20H、m、OCH2−CH2O)、 3.5(2H、m、CH2−OH)、3.2(2H、t、CH2ODMT)。
合物5) 実施例1Dからの1g(1.17ミリモル)のDMT保護HEOの二
量体および20mg(0.12ミリモル)のテトラゾールジイソ
プロピルアンモニウム塩を不活性雰囲気下、10mlの塩化
メチレンに溶解した。これに室温で0.409g(1.35ミリモ
ル)の2−シアノエチルテトライソプロピルホスホルジ
アミダイトを添加した。15時間後、反応物を飽和NaHC
O3、塩水で洗浄しNa2SO4で乾燥させた。溶媒を減圧除去
し粗油(1.44g)を得た、これを実施例1Bのようにフラ
ッシュクロマトグラフィで精製した。0.76g(0.73ミリ
モル)の精製した生成物を回収した。精製した物質(図
2の化合物5)の分析を示す:31 P−NMR(CD3CN、H分断):δ151(S)。
の合成 この実施例に記載した反応を図3に示す。
4−ジイソシアネート(TDC)(17.0ml)に30−35℃でア
ルゴン下に適下した。氷浴を使用して発熱反応をコント
ロールした。室温で終夜反応させ;熱いヘキサン(10
×)で洗浄し過剰のジイソシアネートを除去し;そして
減圧化に濃縮して粗ビスイソシアネート生成物(化合物
6、図3)を琥珀色の油(30g)として生成した。
ングリコール(7.0ml)のジクロロメタン(25ml)溶液
を室温で1時間撹拌し次にジブチルチンジラウレート
(0.1ml、アルドリッチ)を添加し、室温で22時間撹拌
し;ジクロロメタンで希釈し水(4×20ml)で洗浄し;
乾燥(MgSO4)させ;そして減圧下に濃縮して粗ジオー
ル生成物(化合物7、図3)を琥珀色の油(4.6g)とし
て得た。
2時間かけてアルゴン下に室温で、上記粗ジオール(4.
4g)とトリエチルアミン(0.6ml、アルドリッチ)のジ
クロロメタン(25ml)撹拌溶液に添加した。反応溶液を
室温で2時間撹拌し水で洗浄し;乾燥させ(MgSO4);
そして減圧下に濃縮して粗DMTアルコール生成物を琥珀
色の油(5.1g)として得た。粗DMTアルコールのカラム
クロマトグラフィ(トリエチルアミン中和シリカ、5%
6メタノール/ジクロロメタン)は精製したDMTアルコ
ール(化合物8、図3)を粘性琥珀色の油(0.72g)と
して与えた。化合物の分析を示す:1 H NMR/CDC13:δ6.7−7.5(m、ArH、19H)、 δ4.3(m、NC(O)OCH2、8H)、δ3.77(s、CH3O、6
H)、 δ3.55−3.75(m、CH2OCH2、62H)、δ3.2(t、DMTOC
H2、2H)、 δ2.15(m、CH3Ar、6H)。
スホロジアミダイト(0.20ml)をアルゴン下、室温で、
上記精製したDMTアルコールとテトラゾールジイソプロ
ピルアミン塩(12mg)の乾燥ジクロロメタン(5ml)撹
拌溶液に添加した。室温で4時間撹拌した後、NaHCO3溶
液を添加し40分間撹拌した。ジクロロメタン層をさらに
ジクロロメタンで希釈し、塩水で洗浄し;乾燥させ(Mg
SO4);そして減圧下に濃縮して粗ホスホルアミダイト
生成物(化合物9、図3)を琥珀色の油(0.88g)とし
て得た。31 P NMR(CDC13):151ppm。
図4Aと4Bに示す。
3′連結カルボキシフルオレセインポリスチレン支持体
(アプライドバイオシステムズ インコーポレイテッ
ド)を用いて調製し、または3′アミン−OH(オリゴヌ
クレオチド)CPG(クロンテク、パロアルト,CA)および
発表された方法(アプライド バイオシステムズ、カル
サーズ、コルネル)によるFAM−NHS(ABI)、およびア
プライドバイオシステムズ380B DNA合成器で標準のホス
ホルアミダイト化学を用いて調製することができる。
(0.1μモルオリゴヌクレオチド)をトリクロロ酢酸と
反応させて脱保護し、洗浄し、標準DNA合成サイクルを
用いて、次に実施例1のようなホスホルアミダイトーPE
Oポリマーの1つと反応させた。図4Aに示した具体例は1
2個のエチレンオキシドサブユニットをもつポリマー鎖
を用いている。誘導化オリゴヌクレオチド(図4Aの化合
物11)はトリチルでカラムから引き離され、集められた
生成物(図4の化合物12)は、ABI RP−300(C−8)
4.6×220mmカラムおよび0.1Mトリエチルアンモニウムア
セテート−水およびアセトニトリル溶媒系を用いて、液
体クロマトグラフィによって精製された。
リゴヌクレオチド 上記の実施例3Aからの支持体結合オリゴヌクレオチド
(0.1μモルオリゴヌクレオチド)(化合物10、図4B)
を、標準のDNA合成サイクルを用いる実施例2のように
調製されたホスホルアミダイト−PEOビスウレタントリ
ル結合ポリマー(図3の化合物9)と反応させた。誘導
化オリゴヌクレオチド(図4Bの化合物13)をカラムから
引き離し、トリチルで脱保護し,ABI RP−300(C−8)
4.6×220mmカラムおよび0.1Mトリエチルアンモニウムア
セテート−水およびアセトニトリル溶媒系を用いて、液
体クロマトグラフィで精製した。集められた生成物は酢
酸で脱保護した。誘導化オリゴヌクレオチドは図4Bで化
合物14として示される。
ダイト化学(図5の構成物15)を用いるABIモデル380B
DNA合成器で作成した。LANはTFA保護アミンを用いて塩
基修飾したデオキシウリジンホスホルアミダイト(モレ
キュラー バイオシステムズ インコーポレイテッド)
である。この26量体は1μモルカラムから合成後トリチ
ルオンマニュアルプロトコルを用いて作成される。この
カラム物質は10個の分離した0.1μモルカラムに分けら
れた。
し、1.5ml/分の流速および0.1Mトリエチルアンモニウム
アセテート−水pH7.0とアセトニトリルの溶媒グラジエ
ントを用いるABI RP−300(C−8)カラム(4.6×220m
m)を用いて最初HPLCによって精製した。以下に述べる
特定修飾の後、トリチル基を除去し、生成物を上記条件
を用いるHPLCによって単離した。
DMSO溶液(ABI)および40μlの1M NaHCO3/Na2CO3 pH9.
0と共にアミン標識26量体の溶液を添加してFAMを用いて
標識を付けた。2時間後、反応混合物はファーマシアPD
−10セファデックスG25Mカラム(ファーマシア)を通過
させ、集められた試料は次にHPLCで生成した。溶媒を除
去した後、試料を80%酢酸−水で脱トリチル化した。次
に溶媒は減圧で除去し、残渣は0.5mlのH2Oに入れて液体
クロマトグラフィによって精製した。
トは実施例4Aからのオリゴの5′末端に、固体支持体の
標準ホスホルアミダイト化学によって添加され、図5の
構成物16を生成した。4ユニットに対し1ユニットを分
離反応に添加した。得られたHEO修飾オリゴを上記のよ
うに固体支持体から切り離し(化合物17、図5)FAMで
標識を付け、上述したように精製した(化合物18、図
5)。
ように作成した。DMT保護ホスホルアミダイトHEOユニッ
トをこの25量体の5′末端に添加し、実施例4Bに記載し
たように精製した。
ユニットの付加 を有する25量体オリゴヌクレオチドを上述のように調製
しCPG支持体上で脱トリチル化した。25量体の5′−水
酸基を次に標準のホスホルアミダイト化学を用いるN−
MMT−C6アミノモディファイヤー(クロンテクラボラト
リーズ、パロアルト、CA;図6を化合物20)を用いて誘
導化した。モノメトキシトリチル基はDNA合成器の標準
トリチル開裂プロトコルを用いて除去し(図6の化合物
21を生成する)、そしてDNA合成カラムをFMOC化学を行
うことができるABIペプチド合成器に移した。
CH2O)7CH2CO2H(HAAユニット)の1またはそれ以上の
単量体を以下に述べる方法によって化合物21の5′末端
アミンに連続して付加した。合成が完了した後、得られ
たペプチドの末端アミンを、標準のペプチドキャッピン
グプロトコルを用いて無水酢酸でアセチル化し、図6の
式24で示される誘導化オリゴヌクレオチドを生成した。
通りである。1.5mlエッペンドルフチューブに50mg(82
μモル)のN−FNOC−H2N(CH2CH2O)7CH2CO2H、DMF中3
75μlの0.4Mジイソプロピルエチルアミン(DIEPA)、
およびヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBT)中375μ
lの0.2Mヒドロキシベンゾトリアゾールウロニウム塩を
入れた。CPG支持体に固定化しN−MMT−C6で誘導化した
25量体オリゴヌクレオチドを、3分間トリクロロ酢酸
(TCA)で反応させてABI394合成器カラムで脱トリチル
化した。脱トリチル化した生成物(図6の化合物21)を
1分間CH3CNで洗浄し次にアルゴンで乾燥させた。
ニットを用いて誘導化したオリゴヌクレオチド種を生成
した(図6の化合物24;n=1、2、3、または4)。
−H2N(CH2CH2O)7CH2CO2Hの溶液を注射器に入れ、10分
間固定化オリゴヌクレオチド(化合物21)のあちこちに
通し、これによって1のHAAユニットを含む新しいオリ
ゴヌクレオチド誘導体を形成した(化合物23、n=
1)。
ピペリジンの5×1mlの部分標本を用いて末端アミンか
らFMOC基を開裂させた。反応は各連続洗浄工程において
吸光度(300nm)の減少を追跡してモニターした。カラ
ムを次に20mlのDMFですすいだ。
るため、工程1と2を所望の数のHAAユニットに達する
までで繰り返した。
よって固体支持体から離し、化合物24を生成した。
された実施例5の25量体の粗混合物(図6の化合物24)
はABI RP−300逆相カラム(4.6×220mm、7μm、300Å
孔径)を備えたパーキンエルマーシリーズ410HPLCシス
テム用いて分けた。0.1Mトリエチルアンモニウムアセテ
ートpH7.0中10−25%のアセトニトリルの線形グラジエ
ントを30分以上、1.5ml/分の流速で使用した。得られた
クロマトグラムを図7に示す。
てCPG固体支持体に合成した。CPG支持オリゴヌクレオチ
ドの5′水酸基に標準のホスホルアミダイト化学を用い
るN−MMT−C6アミノモディファイヤーを添加した。N
−MMT−C6アミノモディファイヤーはクロンテック ラ
ボラトリイズ、パロアルト、CAから市販されているモノ
メトキシトリチル保護アミノ結合ホスホルアミダイトで
ある。このモノメトキシトリチル基はDNA合成器の標準
トリチル開裂プロトコルを用いて除去し、次いでDNA合
成カラムを、FMOC化学を行うことができるABIペプチド
合成器に置いた。標準FMOCペプチド合成プロトコルを用
いて、4単位と8単位のアミノ酸ペプチドをCPG支持オ
リゴヌクレオチドの5′末端アミンに共役させた。合成
完了後、ペプチドの末端アミンを標準ペプチドキャッピ
ングプロトコルを用いてアセチル化した。
リゴヌクレオチドを支持体から開裂除去し上記のような
条件を用いるHPLCによって精製し、ペプチド−オリゴヌ
クレオチドAc−(Phe−Ala)2または を生成した。ペプチド−オリゴヌクレオチドをオリゴヌ
クレオチド標的の存在で実施例8に記載したように蛍光
標的オリゴヌクレオチドに結合させた。
基オリゴヌクレオチドを目標に定めさせた。標的へのプ
ローブハイブリッド形成およびハイブリッド形成したプ
ローブの連結反応は続けて次のように行った: ペプチド誘導オリゴヌクレオチド(50nM、20μl)、
および蛍光標識オリゴヌクレオチド(50nM、20μl)を
標的オリゴヌクレオチド(50nM、20μl);鮭精子DNA
(4ug/10μl、20μl);10×反応緩衝液(200mMトリス
・HCl pH7.6;1M KCl;100mM MgCl2;100mMジチオトレイト
ール;10mMニコチチンアミドアデニンジヌクレオチド)
(20μl);リガーゼ(30ユニット、100ユニット/μ
l、エピセントレ テクノロジイズ アンプリガーゼ、
マジソン、WI)および100μlの蒸留水と混合した。調
製した試料は50μlの油を塗りパーキンエルマーセッス
DNAサーマルサイクラー(ノーウォーク、CT)中で94℃
にて3分間加熱し、次に62℃にて60分間加熱した。
伝子のF508領域の1本鎖の部分をスパンするように設計
する。プローブ3と4は、遺伝子の反対側の鎖のF508領
域の同じ部分をスパンするように設計する。リガーゼ鎖
反応は公表された方法(ウィン−ディーン)に従って行
われた。簡単に述べると、LCRアッセイは、1リットル
につき100mmolのK+、10mmolのMg2+、10mmolのジチオト
レイトール、1mlのトリトンX−100、および1mmolのNAD
+を含む20mmol/lのトリス・HCl緩衝液中、pH7.6で行わ
れた。各100μl反応混合物は4個のオリゴヌクレオチ
ドおよび15Uの熱安定リガーゼ(エピセントル テクノ
ロジーズ、マジソン、WI)の各々を1pmolを含んでい
た。ヒトゲノムの複雑さを模倣するため、4μgの鰊精
子DNAを各反応混合物に添加した。反応はThin Walled G
ene−Amp(登録商標、パーキン−エルマー セチュス、
ノルウォーク、CT)反応管で100μlの無機油でオーバ
ーレイした100μlの部分標本で行った。全LCR反応はパ
ーキン−エルマー セシュス モデル9600熱循環器中で
30サイクルの94℃(10秒)および60℃(2分)で行っ
た。循環プロトコルの終わりに、反応物を4℃まで冷却
した。
Claims (12)
- 【請求項1】標的ポリヌクレオチドに、複数の異なるシ
ーケンスのプローブ対を付加し、各プローブ対は、標的
ポリヌクレオチド中の選択された1の標的シーケンスの
隣接部分にシーケンスにおいて相補的である2個のポリ
ヌクレオチドプローブエレメントを含み、プローブ対中
のエレメントが連結するとき、プローブ対の1個のエレ
メントは、篩分けマトリックス中に顕著な電気泳動移動
度を、会合したプローブ対に与える非ポリヌクレオチド
ポリマー鎖を含み、プローブ対中の他のエレメントは検
出できるレポーター標識を含み、 プローブ対を標的ポリヌクレオチドでハイブリッド形成
し、 標的と結合したプローブエレメントの末端サブユニット
が標的塩基と塩基対を形成したときに、標的結合プロー
ブの末端サブユニットを連結するため、有効な条件下で
ハイブリッド形成したポリヌクレオチドを処理し、 連結したプローブ対を標的ポリヌクレオチドから脱離
し、そして 脱離した、連結したプローブ対を篩分けマトリックス中
で電気泳動によって分離する、各工程から成る、標的ポ
リヌクレオチド中の複数の選択された標的シーケンスの
存在または不在を検出する方法。 - 【請求項2】プローブ対全部のポリヌクレオチド部分
は、連結した形態で、実質的に同じ長さである、請求項
1の方法。 - 【請求項3】前記脱離前に、前記連結したプローブ対が
プローブ結合および連結反応のサイクルを繰り返して増
幅される、請求項1の方法。 - 【請求項4】各プローブ中の第2のプローブエレメント
が、(i)会合した標的シーケンスの同じ部分において
代替シーケンスに相補的であり、そして(ii)異なる検
出できるレポーターで誘導される2個の代替シーケンス
オリゴヌクレオチドを含み、前記検出が、(a)プロー
ブと会合した標的シーケンスを同定する各プローブのサ
イン電気泳動移動度、および(b)その標的シーケンス
の突然変異状態を同定するサインレポーター標識に従っ
て、各前記標的シーケンスの突然変異状態を決定するこ
とを含む、請求項1の方法。 - 【請求項5】前記非ポリヌクレオチドポリマーは、ポリ
エチレンオキシド、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリ
ペプチド、オリゴ糖、およびポリウレタン、ポリアミ
ド、ポリスルホンアミド、ポリスルホキシド、およびそ
れらのブロックコポリマーから成る群から選ばれ、荷電
したまたは荷電していない連結基によって連結した複数
のサブユニットの単位から成るポリマーを含む、請求項
1の方法。 - 【請求項6】前記ハイブリッド形成が固体支持体上で固
定化された標的ポリヌクレオチドで行われ;そして前記
脱離前に、固定化した標的ポリヌクレオチドを洗浄して
シーケンス特異的方法で標的ポリヌクレオチドに結合し
ていないプローブ対を除去する、請求項1の方法。 - 【請求項7】標的ポリヌクレオチドに複数の異なるシー
ケンスのプローブ対を付加し、各プローブ対は、標的ポ
リヌクレオチド中の選択された1の標的シーケンスの隣
接部位にシーケンスにおいて相補的である2個のポリヌ
クレオチドプローブエレメントを含み、プローブ対中の
エレメントの1個は、プローブ対中のエレメントが連結
するとき、クロマトグラフィによる分離媒体に特徴のあ
る顕著な溶出を会合したプローブ対に与える非ポリヌク
レオチドポリマー鎖を含み、そしてプローブ対中の他の
エレメントは検出できるレポーター標識を含み、 プローブ対を標的ポリマーヌクレオチドでハイブリッド
形成し、 標的と結合したプローブエレメントの末端サブユニット
が標的塩基と塩基対を形成したときに、標的結合プロー
ブの末端サブユニットを連結するため、有効な条件下で
ハイブリッド形成したポリヌクレオチドを処理し、 連結したプローブ対を標的ポリヌクレオチドから脱離
し、そして 脱離した、連結したプローブ対をクロマトグラフィによ
る媒体中でクロマトグラフィによって分離する、各工程
から成る、標的ポリヌクレオチド中の複数の選択された
標的シーケンスの存在または不在を検出する方法。 - 【請求項8】プローブ対全部のポリヌクレオチド部分
は、連結した形態で、実質的に同じ長さである、請求項
7の方法。 - 【請求項9】前記脱離前に、前記連結したプローブ対が
プローブ結合および連結反応のサイクルを繰り返して増
幅される、請求項7の方法。 - 【請求項10】各プローブ中の第2のプローブエレメン
トが、(i)会合した標的シーケンスの同じ部分におい
て代替シーケンスに相補的であり、そして(ii)異なる
検出できるレポーターで誘導される2個の代替シーケン
スオリゴヌクレオチドを含み、前記検出が、(a)プロ
ーブと会合した標的シーケンスを同定する各プローブの
サイン溶出特性、および(b)その標的シーケンスの突
然変異状態を同定するサインレポーター標識に従って、
各前記標的シーケンスの突然変異状態を決定することを
含む、請求項7の方法。 - 【請求項11】前記非ポリヌクレオチドポリマーは、ポ
リエチレンオキシド、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポ
リペプチド、オリゴ糖、およびポリウレタン、ポリアミ
ド、ポリスルホンアミド、ポリスルホキシド、およびそ
れらのブロックコポリマーから成る群から選ばれ、荷電
したまたは荷電していない連結基によって連結した複数
のサブユニットの単位から成るポリマーを含む、請求項
7の方法。 - 【請求項12】前記ハイブリッド形成が固体支持体上で
固定化された標的ポリヌクレオチドで行われ;そして前
記脱離前に、固定化した標的ポリヌクレオチドを洗浄し
てシーケンス特異的方法で標的ポリヌクレオチドに結合
していないプローブ対を除去する、請求項7の方法。
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