JP2839608B2 - 核酸配列の検出方法 - Google Patents

核酸配列の検出方法

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JP2839608B2 JP1505932A JP50593289A JP2839608B2 JP 2839608 B2 JP2839608 B2 JP 2839608B2 JP 1505932 A JP1505932 A JP 1505932A JP 50593289 A JP50593289 A JP 50593289A JP 2839608 B2 JP2839608 B2 JP 2839608B2
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Description

【発明の詳細な説明】 核酸配列の検出方法 本出願は1985年12月５日出願の米国特許出願第805,27
9号の一部継続出願である。従って、該出願の内容は本
出願に含まれるものとする。
発明の背景 本出願においては、種々の特許及び刊行物を参照及び
引用した。これらの特許及び刊行物は、本発明が所属す
る技術分野の現状の十分な理解に役立つものであり、従
ってその記載内容は全て本出願に含まれるものとする。
米国特許出願第805,279号の大要は既に公開されてい
る。例えば、1987年８月７日公開の欧州特許出願第8611
6906.8号を参照するとよい。
現行のDNAプローブの方法論は、ターゲットDNAをフィ
ルターと直接接触させるかまたはアガロースゲルからの
サザン転移法を介してフィルターと接触させることによ
ってターゲットDNAをニトロセルロースフィルターに結
合させる原理に基づく。次にDNAを変性し、フィルター
を加熱してしっかりと結合させる。一般に、DNAの調製
及びゲル流込み（running）の処理にはかなり高レベル
の熟練技術を要し時間及び費用もかかる。
次の段階でプローブDNAを調製する。プローブDNAを調
製するためには、32P標識ヌクレオチドを使用しニック
トランスレーション、ポリヌクレオチドキナーゼまたは
その他のポリメラーゼタイプの複写反応によって特異的
DNAを放射性標識する。調製したプローブDNAと結合ター
ゲットDNAとをハイブリダイズさせる。適温で典型的に
は数時間ハイブリダイゼーションを進行させる。DNAプ
ローブは、相補的塩基配列を有する結合ターゲットDNA
のいずれかと会合してハイブリッド二重鎖（duplex）を
形成する。次に非結合プローブDNAのごとき外来物質を
フィルターから洗い落とし、放射性標識に感受性のフィ
ルムにフィルターを露光する。
1982年12月22日公開の欧州特許出願第0,067,597号（B
ender等）は、オリゴヌクレオチド及びその製造方法を
開示している。この方法では、デオキシリボヌクレオチ
ド鎖の特異的部位にリボヌクレオチド単位を組み込ん
で、鎖を容易に開裂させる所定の開裂部位を形成する。
この方法によって得られた産生物は、ヌクレオチド産生
物とポリヌクレオチド産生物の混合物を分離するために
有効であると記載されてはいるが、Bender等は、プロー
ブフラグメントの増幅に基づくターゲット核酸分子の検
出方法は教示していない。
1984年９月13日公開の国際特許出願第W084/03520号
（Maleolm等）は、核酸プローブと酵素含有マーカーと
のタンデムハイブリダイゼーションを利用する核酸配列
の検出方法を開示している。該方法では、相補的ターゲ
ット配列を含むサンプルとプローブとをハイブリダイズ
条件下に接触させる。ターゲット配列とのハイブリダイ
ゼーションの前または後でプローブを、プローブの配列
に相補的な配列を有する酵素標識マーカーポリヌクレオ
チドにハイブリダイゼーションによって結合される。
米国特許第4,358,535号（Falkow等）は、対象となる
ターゲット核酸配列に相補的な放射性標識ヌクレオチド
プローブと、これらのプローブを使用してターゲット核
酸配列を生じた病原体の存在を検出する方法とを開示し
ている。該方法では、プローブとのハイブリダイゼーシ
ョン以前にまずターゲット核酸配列を不活性担体に固定
する。次いで固定した核酸と放射性標識プローブとをハ
イブリダイズ条件下に接触させて固体担体上でハイブリ
ダイゼーションを生起する。次に、不活性担体上の標識
の存在を検出することによってターゲット核酸配列の存
在を検査する。かかる系の欠点は、プローブ自体を固定
できないことである。Falkow等の方法において、ターゲ
ット核酸配列でなくプローブが固定された場合、固定さ
れたプローブの標識分子は、プローブがターゲット核酸
配列とハイブリダイズしたか否かにかかわりなく固体担
体に結合するであろう。その結果、ターゲット核酸配列
が検出できないことになる。
欧州特許出願公開第0,117、440号は非放射性の化学的
標識ポリヌクレオチドプローブ及びかかるプローブの使
用方法を開示している。開示された方法はFalkow等の方
法と同様に、ターゲット核酸配列をハイブリダイゼーシ
ョン以前に固体担体に固定する。
最近になって、蛍光タグまたは変色酵素系のごとき別
の検出系が開発された。しかしながらかかる系は感度及
びバックグラウンド（ノイズ）のレベルでかなり問題を
含む。
米国特許第4,362,867号（Paddock）は、ハイブリダイ
ズして二重鎖螺旋構造を形成する２つの相補的なデオキ
シヌクレオチド配列を含むハイブリッド核酸構造を開示
している。２つのデオキシヌクレオチドの間に１つのリ
ボヌクレオチド配列が存在し、このリボヌクレオチド配
列は前記デオキシヌクレオチドに共有結合している。こ
の構造が１つの単位を形成し、この単位中にヌクレオチ
ド配列の繰返しは存在しない。
米国特許第4,683,195号（Mullis等）は、ターゲット
核酸配列を増殖及び検出するために、核酸の別々の相補
鎖を過剰モル量の２つのオリゴヌクレオチドプライマー
で処理する方法を開示している。プライマーを延長し所
望の核酸配列の合成鋳型の機能を果たす相補的プライマ
ー延長産物を形成することによって、増幅配列を検出す
る。この方法の欠点は、熱交換サイクル（thermal cycl
ing）を要すること及び定温条件が欠如していることで
ある。
米国特許第4,683,194号（Saiki等）は、制限部位を含
む核酸配列の１つの鎖に相補的なオリゴヌクレオチドプ
ローブを使用して核酸配列の特異的部位の有無を検出す
る方法を開示している。Saiki等は、核酸即ちオリゴヌ
クレオチドプローブをそのままで使用してもよく、また
該プローブが含む配列を米国特許第4,683,202号に記載
の方法で増幅させ感度の向上を図ってもよいと教示して
いる。しかしながらかかる増幅方法は前述の米国特許第
4,683,195号に固有の欠点から免れることができない。
発明の概要 本発明は、（ａ）ターゲット核酸分子とターゲット分
子よりも多量の相補的一重鎖核酸プローブとを含む反応
混合物を、プローブとターゲット核酸分子とが互いにハ
イブリダイズして二重鎖ターゲット−プローブ複合体を
形成し得る条件下に調製し、（ｂ）ターゲット核酸分子
にハイブリダイズした少なくとも２つのプローブフラグ
メントが形成され次いでプローブフラグメントが一重鎖
になり従ってターゲット核酸分子が別のプローブとハイ
ブリダイズ可能になるように、ハイブリダイズしたプロ
ーブに所定配列内部で少なくとも１回ニックを導入し、
（ｃ）プローブフラグメントを同定しこれによりターゲ
ット核酸分子を検出する段階を含むターゲット核酸分子
の検出方法を提供する。
本発明はまた、（ａ）相補的または非相補的な１つ以
上のデオキシリボヌクレオチドに１端または両端で共有
結合し得るターゲットデオキシリボ核酸分子を用い、タ
ーゲットデオキシリボ核酸分子と該ターゲットデオキシ
リボ核酸分子に相補的なリボヌクレオチド配列を有する
一重鎖核酸プローブとを含む反応混合物を、プローブと
ターゲットデオキシリボ核酸分子とが互いにハイブリダ
イズして二重鎖ターゲット−プローブ複合体を形成し得
る条件下に調製し、（ｂ）ターゲットデオキシリボ核酸
分子にハイブリダイズした少なくとも２つのプローブフ
ラグメントが形成されその結果としてプローブフラグメ
ントが一重鎖になりターゲットデオキシリボ核酸分子が
別んプローブとハイブリダイズ可能になるように、ハイ
ブリダイズしたプローブに所定配列内部で少なくとも１
回ニックを導入し、（ｃ）プローブフラグメントを同定
しこれによりターゲットデオキシリボ核酸分子を検出す
る段階を含むターゲットデオキシリボ核酸分子の検出方
法を提供する。
図面の簡単な説明 第１図は本発明のターゲット核酸分子の検出方法にお
いて自己増幅性及び反復性構築に使用される核酸プロー
ブを示す。核酸プローブのプール及びRNアーゼＨのごと
きリボヌクレアーゼとターゲット核酸分子を含むサンプ
ルとを反応させる。一重鎖核酸プローブはターゲット核
酸分子に相補的でありターゲット核酸分子よりも多量で
ある。ハイブリダイゼーションの結果として、二重鎖タ
ーゲット−プローブ複合体が形成される。RNアーゼＨは
ハイブリダイズした二重鎖RNA−DNAのRNA配列をニック
または切除する。
かかるニック導入後に残るDNAプローブフラグメント
がターゲット分子から融解して分離される。即ち非ハイ
ブリダイズになる。得られた一重鎖プローブフラグメン
トは同位体標識またはプローブフラグメントの長さの直
接測定によって検出可能である。実際には、プローブフ
ラグメントを検出するために、核酸プローブに最初に配
置した蛍光標識に結合させるか、または、一リン酸化し
たヌクレオチド例えばアデノシン一リン酸を用いてATP
を生成させる。追加のプローブ分子は遊離したターゲッ
ト分子と反応して反復配列を完成する。RNアーゼＨは非
ハイブリダイズRNAをニックまたは開裂しない。かかる
反復系の使用によってターゲット分子を感度約10-19〜
約10-20で検出し得る。
発明の詳細な説明 本発明は、（ａ）ターゲット核酸分子とターゲット分
子よりも多量の相補的一重鎖核酸プローブとを含む反応
混合物を、プローブとターゲット核酸分子とが互いにハ
イブリダイズして二重鎖ターゲット−プローブ複合体を
形成し得る条件下に調製し、（ｂ）ターゲット核酸分子
にハイブリダイズした少なくとも２つのプローブフラグ
メントが形成されその結果としてプローブフラグメント
が一重鎖になりターゲット核酸分子が別のプローブとハ
イブリダイズ可能になるように、ハイブリダイズしたプ
ローブに所定配列内部で少なくとも１回ニックを導入
し、（ｃ）プローブフラグメントを同定しこれによりタ
ーゲット核酸分子を検出する段階を含むターゲット核酸
分子の検出方法を提供する。
１つの実施態様によれば、本発明は更に、前記段階
（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）が繰返されるターゲット核酸
分子の検出方法を提供する。これらの段階の繰返しによ
って、ターゲット分子より多量、即ち過剰モル量の相補
的一重鎖核酸プローブは、ターゲット分子を再使用し得
る。即ち、反応混合物に含まれた別の核酸プローブがタ
ーゲット分子とハイブリダイズし得る。
本発明の実施に有用な核酸プローブは、構造： [NA1…Ｒ…NA2]n 〔式中、NA1及びNA2は核酸配列、ＲはRNA配列、ｎは約
１〜約10の整数〕で示される。
本発明の１つの実施態様において核酸プローブ中のNA
1及びNA2は夫々、約０〜約20個のヌクレオチドを含み、
Ｒは約１〜約100個またはそれ以上のリボヌクレオチド
を含み、ｎは約１〜約10の整数である。
本発明の別の実施態様において核酸プローブ中のNA1
及びNA2はDNA配列である。別の実施態様においてNA1及
びNA2はRNA配列である。更に別の実施態様において核酸
プローブは、NA1がRNAまたはDNA配列でNA2がRNAまたはD
NA配列である構造を有する。
１つの実施態様においては、ハイブリダイズしたプロ
ーブを所定RNA配列でニックするために、二重鎖リボヌ
クレアーゼを使用する。かかるリボヌクレアーゼは、ハ
イブリダイズした二重鎖DNA−RNAからリボ核酸配列をニ
ックまたは切除する。本発明の実施に有用なリボヌクレ
アーゼの例はRNアーゼＨである。ExoIII及び逆転写酵素
のごとき別のリボヌクレアーゼ及び酵素もRNA−DNAから
RNAをニックまたは切除するために適当である。
本発明の分子は、核酸配列NA1またはNA2の一方または
両方に結合された検出可能マーカーを有していてもよ
い。このマーカーは、検出可能ないかなる分子または試
薬から成ってもよい。かる検出可能分子の例は、放射性
同位体、放射性標識分子、蛍光分子、蛍光抗体、酵素ま
たは化学発光触媒である。その他の適当なマーカーは、
酵素、蛍光分子またはその他の検出可能分子でタグ標識
した特異的タンパク質に結合し得るリガンドである。適
当なリガンドの一例は、アビジンまたはストレプトアジ
ンに結合するビオチンである。
本発明の１つの実施態様においては、核酸プローブを
固体担体に固定する。別の実施態様においては、核酸プ
ローブを検出可能マーカーで標識する。
核酸配列NA1及びNA2がDNAのとき、前記のＲ部分は、1
985年12月５日出願の米国特許出願第805,279号で使用し
た「切れ易い結合」なる用語で適切に表現できる。かか
る結合は、分子自体またはターゲット核酸分子の核酸配
列の開裂または分裂を全く生じさせるとなく開裂または
分裂できる。本明細書において、かかる「切れ易い結
合」、即ちＲは、２つの核酸配列に結合し、結合した核
酸配列の開裂を生じさせることなく選択的に開裂し得る
任意の化学的結合構造を意味する。「切れ易い結合」は
単一結合でもよくまたは多単位配列でもよい。本文中の
Ｒはリボ核酸（RNA）配列を示す。
本発明のプローブとして有用な分子においてｎが１よ
り大きい値を有する分子では、単位NA1…Ｒ…NA2が繰返
し存在する。各繰返し単位は同じでもよくまたはランダ
ムもしくは所定パターンで変化していてもよい。各繰返
し単位中のNA1またはNA2または両者が変化していてもよ
い。NA1またはNA2の変化は、繰返し中の１つの単位と直
後の単位との間で核酸配列が異なっているような変化で
もよい。この変化はまた、繰返し中の１つの単位と直後
の単位との間で、夫々の単位に含まれるNA1及びNA2の各
々の塩基の数が多少とも異なるようなランダムな変化で
もよい。ｎ＝３でNA1及びNA2の両方が変化するランダム
変化の一例は、 NA1…Ｒ…NA2…NA1′…Ｒ…NA2′…NA1″…Ｒ…NA2″で
ある。
ｎ＝４でNA1及びNA2の両方が変化するパターン的変化
の一例は、 NA1…Ｒ…NA2…NA1′…Ｒ…NA2′…NA1…Ｒ…NA2…N
A1′…Ｒ…NA2′である。
上記の両方の例で、各単位を結合している実線は水素
結合または共有結合から成る化学結合である。
また、繰返し単位の変化が、「切れ易い結合」、即ち
Ｒの変化であってもよい。その場合にはＲ、即ち「切れ
易い結合」のリボヌクレオチドの配列が変化している。
Ｒ、即ち「切れ易い結合」結合中のリボヌクレオチド配
列の変化も前記のごとくランダムでもよくパターン的で
もよい。また、繰返し単位の変化が、NA1、NA2または
「切れ易い結合」、即ちＲの前記のごとき変化を組み合
わせて含んでいてもよく、これらの変化がランダムでも
よくパターン的でもよい。
比較的長さが短く従ってターゲット核酸分子に高度に
特異的である核酸プローブの使用によって最良結果が得
られることは当業者に容易に理解されよう。相補的核酸
プローブ中のヌクレオチドの総数を増加させるよりもむ
しろ制限することによって、ターゲット核酸分子の高ゲ
イン−低ノイズ検出が達成できる。
検出すべきターゲット核酸の種類、核酸プローブの構
造、即ちプローブがDNA−RNAハイブリッドであるかまた
はRNA配列単独から構成さえているか、等を含む多数の
要因に従って核酸プローブの全長を変更し得ることは当
業者に容易に理解されよう。DNA配列及びRNA配列からプ
ローブを構築する場合には、RNAプローブフラグメント
がターゲット核酸分子にハイブリダイズして維持される
ように、Ｒ部分即ち「切れ易い結合」がニックまたは切
除し易くなっていることが重要である。この点で、プロ
ーブフラグメントを本発明方法で一重鎖にするために、
Ｒ部分、即ち「切れ易い結合」がヌクレオチド約８〜約
10個のDNA配列間に存在するのが有利である。但しこれ
は必須要件ではない。
プローブがRNA配列だけから構築される場合、RNアー
ゼＨまたはExoIIIのごとき二重鎖リボヌクレアーゼを使
用するとニック導入が特に容易である。RNA配列だけか
ら構築された直線状のRNAプローブが特に有用である。
その第１の理由は酵素によって産生され易いことにあ
り、第２の理由は、上記リボヌクレアーゼのごときニッ
ク導入試薬によってニックまたは開裂され易い開裂部位
を多数有することにある。従って、直線状RNAプローブ
は、DNA−RNAハイブリッドプローブのように「切れ易い
結合」に依存しない。
本発明はまた、（ａ）相補的または非相補的な１つ以
上のデオキシリボヌクレオチドに１端または両端で共有
結合し得るターゲットデオキシリボ核酸分子を用い、タ
ーゲットデオキシリボ核酸分子と該ターゲットデオキシ
リボ核酸分子に相補的なリボヌクレオチド配列を有する
一重鎖核酸プローブとを含む反応混合物を、プローブと
ターゲットデオキシリボ核酸分子とが互いにハイブリダ
イズし二重鎖ターゲット−プローブ複合体を形成し得る
条件下に調製し、（ｂ）ターゲットデオキシリボ核酸分
子にハイブリダイズした少なくとも２つのプローブフラ
グメントが形成されその結果としてプローブフラグメン
トが一重鎖になりターゲットデオキシリボ核酸分子が別
のプローブとハイブリダイズ可能になるように、ハイブ
リダイズしたプローブに所定配列内部で少なくとも１回
ニックを導入し、（ｃ）プローブフラグメントを同定し
これによりターゲットデオキシリボ核酸分子を検出する
段階を含むターゲットデオキシリボ核酸分子の検出方法
を提供する。
１つの実施態様において、本発明は、前記段階
（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）が繰返されるターゲットデオ
キシリボ核酸分子の検出方法を提供する。
本発明のターゲットデオキシリボ核酸の検出方法に有
用な一重鎖核酸プローブは約10〜約2000のリボヌクレオ
チドを含む。かかる核酸プローブ中のリボヌクレオチド
の数はターゲットデオキシリボ核酸、所要感度、等に従
って広い範囲で変更できることが当業者に容易に理解さ
れよう。段階（ａ）で反応混合物を調製する際に、当業
界で公知の方法を用いてターゲットデオキシリボ核酸分
子をDNA配列に変換し得る。
本発明の更に別の実施態様では、段階（ｂ）でハイブ
リダイズプローブにニックを導入するために、二重鎖リ
ボヌクレアーゼを用いる。更に別の実施態様では、かか
るリボヌクレアーゼがRNアーゼＨでもよい。RNアーゼＨ
様活性を有する別の酵素、例えばExoIII及び逆転写酵素
等もある。これら及びその他の酵素は本発明の方法の変
形方法または非変形方法のいずれにも適している。
前記段階（ａ）で反応混合物を形成する際に、ターゲ
ット核酸分子とターゲット分子より多量、即ち過剰モル
量の相補的一重鎖核酸プローブとを、プローブとターゲ
ットとが互いにハイブリダイズでき二重鎖ターゲット−
プローブ複合体を形成できるようなハイブリダイゼーシ
ョン条件下に混合する。
前記段階（ｂ）でハイブリダイズプローブをニックす
るために、例えば酵素的方法を用いてもよい。即ち、ハ
イブリダイズしたプローブとハイブリダイズプローブ中
の所定配列をニック即ち切除し得る試薬とを接触させ
る。本発明の実施において、かかる所定配列は「切れ易
い結合」、即ちＲまたはRNA配列を含む。
典型的には、ターゲット核酸分子とターゲト分子より
過剰の標識相補的一重鎖核酸プローブと適当なバッファ
中で合せて反応混合物を調製する。このように調製され
た反応混合物を約30℃〜約45℃、最適には約37℃の温度
で約５分〜約30分間または60分間以内またはアニーリン
グ所要時間だけインキュベートする。
ハイブリダイズしたターゲット及びプローブを含む反
応混合物を次に、約30℃〜約45℃最適には約37℃で更に
時間をかけてニック導入用試薬と結合される。この時間
は約５分〜約60分であるが、たいていの場合は30分で十
分である。ハイブリダイゼーション、ニック導入及び一
重鎖プローブフラグメントの形成の段階の繰返しを含む
反復反応は、短時間例えば数ミリ秒のオーダで生じる。
ハイブリダイズした二重鎖ターゲット−プローブ複合
体に対し、この複合体の所定の配列、例えばＲまたは
「切れ易い結合」を少なくとも１回ニックすることによ
って、ターゲット核酸分子にハイブリダイズした少なく
とも２つのプローブフラグメントを形成させると、ター
ゲット−プローブ複合体中のハイブリダイズプローブ配
列のサイズ変化の結果として一重鎖になったハイブリダ
イズプローブフラグメントが残る。例えば、20量体（モ
ノマー）二重鎖DNA配列は37℃でアニーリングされハイ
ブリダイズして維持される。ニック導入後に、２つの８
−デオキシリボヌクレオチド（DNA）塩基配列間に介在
する４−リボヌクレオチド（RNA）が、リボヌクレアー
ゼ例えばRNアーゼＨまたはExoIIIによって切除されたと
想定すると、残りの２つの８量体のハイブリダイズプロ
ーブフラグメントはターゲット−プローブ複合体から融
解して分離する。これらの一重鎖プローブフラグメント
を公知方法を用いて同定しターゲット核酸分子を検出す
る。
Ａ−Ｔ及びＧ−Ｃ塩基対は、短いオリゴマーの場合約
２°／塩基対及び４°／塩基対のTmをそれぞれ呈する。
ハイブリダイズしたターゲット−プローブ複合体におい
てＡ−Ｔ及びＧ−Ｃ塩基対の比が等しいとすると、各対
合ヌクレオチドの融解温度は平均約３°／塩基対とな
る。
ステップ（ｃ）でのプローブフラグメントの同定とそ
れによるターゲット核酸分子の検出とは幾つかの方法で
実施できる。ステップ（ｃ）での同定及び検出は標識方
法に従属し、即ち核酸プローブに予め付加されたか、ま
たは上述のステップ（ｂ）で発生する検出可能なマーカ
ーの種類に従属する。例えば、ターゲット核酸分子の検
出を蛍光ラベルとの結合またはATP産生によって実現し
得る。例えばプローブの全体がリボ核酸（RNA）配列か
ら成る場合、ニック導入ステップ（ｂ）で得られるプロ
ーブフラグメントはモノヌクレオチドから短いオリゴヌ
クレオチドまでであり得る。このようなフラグメント
は、その検出に有利に用い得る独得の５′−リン酸基を
有する。そのようなフラグメントの一つであるアデノシ
ン５′−リン酸（５′−AMP）は、ATP産生酵素系に供給
し、その後ルシフェリン−ルシフェラーゼ測光読み出し
系と結合させることができる。他の検出方法として、生
成したプローブフラグメントを、例えば高速液体クロマ
トグラフィー（HPLC）を用いて直接検出することが可能
である。
本発明の方法を、ターゲット核酸分子検出用の高利得
−低雑音増幅系の達成に用い得ることも、当業者には理
解されよう。一重鎖核酸プローブは、デオキシリボ核酸
（DNA）及びリボ核酸（RNA）配列から成るものであれリ
ボ核酸（RNA）配列のみから成るものであれ、例えばRN
アーゼＨなどの一定の二重鎖リボヌクレアーゼの作用に
対して完全に安定である。このようなプローブがターゲ
ット核酸分子とハイブリダイズすると、「切れ易い結
合」であってもなくともよいRNA結合がリボヌクレアー
ゼ、即ち例えばRNアーゼＨによって消化されるようにな
る。
単なる説明のための一例として、プローブを、全長が
20個のヌクレオチドから成り、そのうち最初の８個及び
最後の８個のヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド
で、中の４個のヌクレオチドはリボヌクレオチドである
ものとすることで、本発明の方法の増幅段階を説明する
ことができる。同一条件下に、20量体（モノマー）プロ
ーブは相補的なターゲットと安定なハイブリッドを形成
するが、８量体（モノマー）プローブまたはプローブフ
ラグメントは容易に融解して離れ、即ちハイブリダイズ
していない状態となる。従って、ターゲット核酸分子と
のハイブリダイゼーション後の20量体プローブは開裂可
能となり、リボヌクレアーゼ、即ち例えばRNアーゼＨに
よって開裂して、一重鎖核酸プローブがターゲット分子
とハイブリダイズして二重鎖ターゲット−プローブ複合
体を生成した一次ハイブリダイゼーションの際と同一の
条件の下に容易に融解して離れる断片となる。
ハイブリダイゼーションを、通常程度に過剰なプロー
ブを用い、かつ例えばRNアーゼＨのような適当なリボヌ
クレアーゼを存在させて実現すると上述の系が反復して
（第１図参照）、開裂したプローブフラグメントを産生
し、このフラグメントは、例えば化学ルミネセンス、放
射性同位元素などを用いる幾つかの公知方法で検出する
ことができる。一次アンプリファイア即ちプローブは核
酸特異性であり、不変条件下に機能する。放射線同位元
素で標識すれば、10-20モルのターゲットを検出する高
井利得の初段検出が可能である。
全体がリボ核酸配列から成る直線状RNAプローブを形
成した場合RNアーゼＨ反復の後に得られる生成物は、元
のプローブの大きさに従属してモノヌクレオシドからオ
リゴヌクレオチドまでである。しかし、各生成物は３′
−OH未端を有する。これらの末端には、ポリヌクレオチ
ドホスホリラーゼまたはポリＡポリメラーゼのような適
当なポリメラーゼをテールとして付加することができ
る。
このアプローチへの有用な付加手段は、プローブの
５′末端にビオチンを配置し、３′末端には例えばジデ
オキシのようなチェインターミネータヌクレオチドを配
置することである。プローブを、５′未満に“U"を有
し、３′未満にも“U"を有するが中央の領域には“U"を
有しないように設計した場合、及びそのようなプローブ
を適当な鋳型上でT7RNAポリメラーゼの作用によって形
成した場合、次の状況が維持されよう。
T7転写体（プローブ）重合のためのヌクレオシド三リ
ン酸前駆体の比が ATP 100 CTP 100 GTP 100 ジデオキシUTP 100 ビチオニル化したUTP 1 である場合、実質的にいずれのプローブ転写体もビオチ
ニル化したＵで始まり、ジデオキシＵで終わる。最初の
塩基としてジデオキシＵを選択すると、重合は失敗す
る。即ち、ビオチニル化したＵでの開始は必須である。
鋳型が過剰に存在するのでほぼ総てのビオチニル化した
Ｕが開始に用いられるため、及びジデオキシＵの方がビ
オチニル化したＵより100倍過剰であるため、３′Ｕは
ほとんど常にジデオキシＵである。従って、検出の目的
は酵素合成を介して達成できる。得られるプローブは、
３′位にジデオキシＵの存在するためRNアーゼＨによっ
て切断されないとテールの付加ができず、蛍光塩基その
他の検出可能分子をテールとして付加したプローブの非
ビオチニル化反応物質からの分離にはビオチンを用いる
ことができる。
核酸プローブの全体が、ターゲット分子と相補的であ
り、従って「切れ易い結合」に依存しないRNA配列から
成る場合はプローブに、ここに説明した本発明から十分
に予測できる様々な変形を施すことが可能である。
例えば、リボ核酸プローブ、即ち全体がRNA配列から
成るプローブを合成し、その３′ヒロドキシル末端を任
意にブロックすることができる。ブロッキングは、リボ
核酸プローブに“テール”を、ビオチン、過ヨウ素酸酸
化したリボヌクレオシドまたは親和性テールのようなリ
ガンドへの吸着により酵素的に付加すること、即ち例え
ばポリＡ（ポリメラーゼＡ）テール付加によって行ない
得る。プローブに付加した“テール”は、親和性単離及
び信号発生に用いることができる。RNAプローブの５′
末端も任意に変更し得る。例えば、５′末端を非相同の
RNA/DNA配列で延長し得、この場合はこの非相同配列を
上記のようなリガンド、即ち例えばビオチン、過ヨウ素
酸酸化したリボヌクレオシドまたは親和性テールに付着
させ得る。この特別の例では、５′未満を蛍光塩基のよ
うな信号ジェネレーターと結合させることも可能であ
る。この構成を下図に示す。
X:付着リガンドで、例えばビオチン、過ヨウ素酸酸化し
たリボヌクレイシド、または親和性テール。
Y:蛍光塩基のような信号ジェネレーター。
このような構成中の非相同５′テールは、ターゲット
と対になったRNAプローブの相同領域をRNアーゼＨのよ
うなリボヌクレアーゼでニックすること、即ち切除また
咀嚼することを可能にする。即ち、５′テール構成は、
ポリヌクレオシドリン酸（PNP）またはポリメラーゼＡ
（ポリＡ）テール付加に有効なフラグメントを脱離す
る。このようなテールは、溶液から信号を引き出す親和
性テールとして、または検出能を高める更に別のフラグ
メントとして用い得る。この構成を下図に示す。
本発明の別の特徴において、反復核酸プローブは、抗
体または抗原を検出するイムノアッセイに用い得る。そ
の場合、競合的または非競合的イムノアッセイで抗体か
または抗原に、ホモポリマーであり得る核酸配列を付加
することが可能である。
競合的イムンアッセイの例として、酵素結合イムノア
ッセイ（ELISA）を挙げることができる。
本発明を、以下に実施例において詳述する。これらの
実施例は本発明の理解の一助となるように提示するもの
であり、最後に掲げた請求の範囲各項に記した本発明を
一切限定せず、また限定すると解釈されるべきでもな
い。
実施例１ 「切れ易い結合」プローブの形成 本発明の検出方法に有用であるプローブ分子を固体支
持媒体（シリカゲルまたは制御した多孔ガラス）上に、
加水分解可能結合または恒常的（加水分解不能）結合を
用いて形成した。この合成には、公表されている化学的
方法を用いた［Alvarado−Urbina,G.,G.M.Sathe,W.C.Li
u,M.F.Gillan、P.D.Duck,R.Bender and K.K.Ogilvie（1
981）,Automated Synthesis of Gene Fragments,Scienc
e 214:270−274;Roberts,D.M.,R.Crea,M.Malecha,G.Alv
arado−Urbina,R.H.Chiarello and D.M.Watterson（198
5）,Chemical Synthesis and Expression of a Calmodu
lin gene designed for a Site−Specific Mutagenesi
s,Biochemistry,in press;Van Boom,J.H.and C.T.Wrees
man（1984）,Chemical Synthesis of Small Oligoribon
ucleotides in Solution,In Oligonucleotide Synthesi
s−A Practical Approach,pp.153−183,Ed.M.J.Gait,IR
L Press］。標準的な保護されたデオキシヌイクレオシ
ドモノマーを市販製品から得、一方保護されたデオキシ
ウリジン及びリボヌクレオシドモノマーは公知手順で製
造した［Ti,G.S.,B.L.Gaffney and R.A.Jones（1982）,
Transient Protection:Efficient One Flask Synthesis
of Protected Nucleosides,J.AM.Chem.Soc.104:131
6］。合成は、各DNA縮合については10分、各RNA縮合に
ついては12分の周期を用いてBIOLOGICALS自動合成機で
行なった。
次に示すプローブ構成を、様々な試験系で用いた。
プローブ分子１〜３及び５〜８は、膵RNアーゼを含め
た幾つかのRNアーゼによって、及び塩基条件下（例えば
0.5M NaOH）に、リボヌクレオチドにおいて開裂可能で
あることが判明した。RNアーゼによる切断その他のルー
チン作用のごく一般的な方法を、Maniatis等（Maniati
s,T.,E.F.Fritsch and J.Sambrook（1982）,Molecular
Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Lab
oratory）に見いだすことができる。
実施例２ 次のプローブ構成*を、本発明による方法に従って用
いた。
*：大文字はDNA。小文字はRNA。上記配列の幾つかはM13
ファージと相補的であったが、総ての上記配列は該配列
のために構成された合成DNAターゲット相補配列を有し
た。
RNアーゼＨでのキネーション及び反復 ２μｇの電気的に精製したプローブ（９〜22）を添加
して、次の諸成分を含有する混合物を調製した。
２μｇプローブ 2μl ４μM ATP 4μl 10X KB（キナーゼ緩衝液） 5μｌ dH2O 32μｌ P32ATP 2μｌ＝20uCi ポリヌクレオチドキナーゼ 5μｌ＝５単位 混合物を、37℃で40分間インキュベートしてから熱失
活させた。その後混合物を、溶離液として脱イオン水を
用いてセファデックスＧ−50カラムに通した。（使い捨
てカラムとしてSancoのトランスファーピペット15mm×
7.5mm使用。シリコン化グラスウールで栓をし、またＧ
−50は12mmまで充填。） 500μｌ画分を1.5ml Eppendorf管内に採集し、第一の
ピークを選択した（普通、管３〜５個）。選択した画分
を速度vac濃縮機で乾燥した。管を総て一緒にプール
し、無菌水中での最終濃度を0.1μg/μｌとした。
反復反応のための稀釈 ターゲット:2μｇを20μｌで稀釈して濃度0.1μg/μｌ
とする。この開始濃度を、1:10の割合（蒸留水90μｌ中
に10μｌ）での連続的稀釈によって所望濃度とする。反
復反応のために、各反応混合物毎に10μｌ（100ng）を
用いた。
標識したプローブ:2μｇを20μｌで稀釈する（0.1μg/
μｌ）。この開始濃度を、1:10の割合（蒸留水90μｌ中
に10μｌ）での稀釈によって0.01μg/μｌとする。各反
応混合物毎に10μｌ（100ng）を用いた。
反復反応 反復反応のために、各プローブ（９〜22）を別個に添
加して、次の諸成分から成る反応混合物を調製した。
蒸留水（無菌）中のプローブ 10μｌ（100ng） 10X RNアーゼＨ緩衝液 ３μｌ 蒸留水 ７μｌ ターゲットDNA（１μｇから0.01fg） 10μｌ 反応混合物30μｌを65℃で10分間、及び37℃で30分間
インキュベートした。各30μｌ反応混合物から、 C1（RNアーゼＨ）コントロール:5μｌ＝16.7ngのプロー
ブ C2（時間30分）コントロール:5μｌ＝16.7ngのプローブ を取り出した。
残りの反応混合物20μｌに、上記コントロールC1と共
にRNアーゼＨを次のように添加した。
時間０分で１μｌ 時間10分で１μｌ 時間20分で１μｌ 反応混合物を30分間インキュベートした。各反応混合
物に、コントロールとしてのプローブに等量のホルムア
ミド染料を加えたものを同量ずつ、加熱プレートを伴っ
た800ボルトの0.8mm20％アクリルアミド/7M尿素ゲル上
で添加した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭62−21062（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−190086（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12N 15/09 C07H 21/02 - 21/04 G01N 33/50 ＢＩＯＳＹＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (18)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ターゲット核酸分子を検出する方法であっ
    て、 （ａ）ターゲット核酸分子と該ターゲット分子より多量
    の実質的に相補的な一重鎖核酸プローブとを含む反応混
    合物を、プローブとターゲット核酸分子とが互いにハイ
    ブリダイズして二重鎖ターゲット−プローブ複合体を生
    成するのを可能にする条件下に製造し、ここで該プロー
    ブは、構造 [NA 1 -S-NA 2 ] n を有し、NA 1 およびNA 2 は核酸配列であり、そしてＳは、
    NA 1 またはNA 2 の核酸配列、あるいはNA 1 またはNA 2 配列に
    ハイブリダイズし得るターゲット核酸配列の核酸配列を
    開裂または分裂することなく開裂または分裂し得る切れ
    易い結合である、 （ｂ）ハイブリダイズしたプローブに所定配列内で少な
    くとも１回ニックを導入して、ターゲット核酸分子とハ
    イブリダイズした少なくとも２個のプローブフラグメン
    トを形成し、その際形成されたプローブフラグメントは
    一重鎖となり、それによってターゲット核酸分子の別の
    プローブとのハイブリダイゼーションが可能となり、 （ｃ）ステップ（ａ）および（ｂ）を繰り返し；そして （ｄ）プローブフラグメントを同定し、そしてそれによ
    ってターゲット核酸分子を検出する ことを含む検出方法。
  2. 【請求項２】一重鎖核酸プローブが構造 [NA1…Ｒ…NA2]n を有し、その際 NA1及びNA2は核酸配列であり、 ＲはRNA配列であり、 ｎは１から10の整数である ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】NA1及びNA2が０個から20個のヌクレオチド
    を互いに独立に含み、Ｒは１個から100個のリボヌクレ
    オチドを含み、ｎは１から10の整数であることを特徴と
    する請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】NA1及びNA2がDNA配列であることを特徴と
    する請求項２に記載の方法。
  5. 【請求項５】NA1及びNA2がRNA配列であることを特徴と
    する請求項２に記載の方法。
  6. 【請求項６】NA1がRNAまたはDNA配列であり、NA2もRNA
    またはDNA配列であることを特徴とする請求項２に記載
    の方法。
  7. 【請求項７】ニック導入ステップを二重鎖リボヌクレア
    ーゼで実施することを特徴とする請求項２に記載の方
    法。
  8. 【請求項８】リボヌクレアーゼがRNアーゼＨであること
    を特徴とする請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】リボヌクレアーゼがExoIIIであることを特
    徴とする請求項７に記載の方法。
  10. 【請求項１０】核酸プローブを検出可能なマーカーで標
    識することを特徴とする請求項１に記載の方法。
  11. 【請求項１１】核酸プローブを固体サポート上に固定す
    ることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  12. 【請求項１２】ターゲットデオキシリボ核酸分子を検出
    する方法であって、 （ａ）ターゲットデオキシリボ核酸分子と、一方または
    両方の末端でターゲットデオキシリボ核酸分子と相補的
    であってもなくてもよい１個以上のデオキシリボヌクレ
    オチドと共有供給し得る、ターゲットデオキシリボ核酸
    分子と実質的に相補的であるリボヌクレオチド配列を有
    する一重鎖核酸プローブとを含む反応混合物を、プロー
    ブとターゲットデオキシリボ核酸分子とが互いにハイブ
    リダイズして二重鎖ターゲット−プローブ複合体を生成
    するのを可能にする条件下に製造し、ここで該プローブ
    は、構造 [NA 1 -S-NA 2 ] n を有し、NA 1 およびNA 2 は核酸配列であり、Ｓは、NA 1 ま
    たはNA 2 の核酸配列、あるいはNA 1 またはNA 2 配列にハイ
    ブリダイズし得るターゲット核酸配列の核酸配列を開裂
    または分裂することなく開裂または分裂し得る切れ易い
    結合である、 （ｂ）ハイブリダイズしたプローブに所定配列内で少な
    くとも１回ニックを導入して、ターゲットデオキシリボ
    核酸分子とハイブリダイズした少なくとも２個のプロー
    ブフラグメントを形成し、その際形成されたプローブフ
    ラグメントは一重鎖となり、それによってターゲット核
    酸分子の別のプローブとのハイブリダイゼーションが可
    能となり、 （ｃ）ステップ（ａ）および（ｂ）を繰り返し；そして （ｄ）プローブフラグメントを同定し、そしてそれによ
    ってターゲットデオキシリボ核酸分子を検出する ことを含む検出方法。
  13. 【請求項１３】一重鎖核酸プローブが10個から2000個の
    リボヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項12に記
    載の方法。
  14. 【請求項１４】ニック導入ステップを二重鎖リボヌクレ
    アーゼで実施することを特徴とする請求項12に記載の方
    法。
  15. 【請求項１５】リボヌクレアーゼがRNアーゼＨであるこ
    とを特徴とする請求項14に記載の方法。
  16. 【請求項１６】リボヌクレアーゼがExoIIIであることを
    特徴とする請求項14に記載の方法。
  17. 【請求項１７】核酸プローブを検出可能なマーカーで標
    識することを特徴とする請求項12に記載の方法。
  18. 【請求項１８】核酸プローブを固体サポート上に固定す
    ることを特徴とする請求項12に記載の方法。
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