ES2902174T3 - ADN de control metilado - Google Patents

Abstract

El uso de una composición que comprende: un complejo de un ácido nucleico B3GALT6 convertido por bisulfito y al menos un oligonucleótido, en donde al menos una porción de dicho oligonucleótido hibrida con dicho ácido nucleico B3GALT6, en donde dicho ácido nucleico B3GALT6 convertido por bisulfito se utiliza como marcador de referencia metilado y control interno que se procesa y detecta junto con el ADN marcador indicativo de enfermedad en ensayos de metilación.

Description

DESCRIPCIÓN

ADN de control metilado

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos Núm.

62/364.082, presentada el 19 de julio de 2016.

Campo de la invención

En el presente documento se proporciona tecnología que relaciona composiciones y métodos para analizar y cuantificar el ADN, p. ej., ADN metilado, en un sujeto. La tecnología se refiere al uso de un marcador de referencia metilado como control interno en ensayos de metilación en muestras tales como muestras sangre, plasma, heces o tejido de un sujeto.

Antecedentes

El ADN metilado se ha estudiado como una clase potencial de biomarcadores en los tejidos de la mayoría de los tipos de tumores. En muchos casos, las ADN metiltransferasas añaden un grupo metilo al ADN en los sitios de islas de citosina-fosfato-guanina (CpG) como control epigenético de la expresión génica. En un mecanismo biológicamente atractivo, se cree que los eventos de metilación adquiridos en regiones promotoras de genes supresores de tumores silencian la expresión, contribuyendo así a la oncogénesis. La metilación del ADN puede ser una herramienta de diagnóstico más estable química y biológicamente que la expresión de ARN o proteínas (Laird (2010) "Principles and challenges of genome-wide DNA methylation analysis" Nat Rev Genet 11: 191 -203). Además, en otros cánceres como el cáncer de colon esporádico, los marcadores de metilación ofrecen una excelente especificidad y son más informativos y sensibles que las mutaciones individuales del ADN (Zou et al (2007) "Highly methylated genes in colorectal neoplasia: implications for screening" CáncerEpidemiolBiomarkers Prev 16: 2686-96).

Los ácidos nucleicos de muestras de pacientes, p. ej., muestras de sangre, heces y tejido, que se analizan para detectar la presencia de mutaciones y/o el estado de metilación asociado con la enfermedad o el riesgo de enfermedad, normalmente pasan por una serie de etapas de procedimiento durante el análisis. Estas etapas pueden comprender, p. ej., filtración, precipitación, captura, lavado, elución y/o modificación química. Para el análisis de ADN para determinar el estado de metilación, p. ej., el porcentaje de metilación de un ADN de prueba, el procesamiento típicamente comprende el tratamiento con bisulfito para convertir bases dC no metiladas en restos dU, haciéndolos más fácilmente distinguibles de los restos metil-C que están protegidos de la conversión por bisulfito.

La cuantificación precisa de un ADN de prueba (p. ej., determinando el porcentaje de metilación, presencia y cantidad de ADN que porta una mutación, etc.) típicamente requiere normalización a un ácido nucleico de control, p. ej., un gen invariante endógeno que tiene características conocidas (p. ej., secuencia conocida, número de copias por célula conocido). La normalización de los controles para las variaciones muestra a muestra se pueden producir, por ejemplo, en el procesamiento de las muestras, la eficiencia del ensayo, etc., y permite una comparación precisa de datos muestra a muestra.

Los documentos US2016/168643A1 y US2016/194721A1 se relacionan con ZDHHC1 como marcador de referencia metilado y control interno.

Compendio

La invención se expone en las reivindicaciones adjuntas. Las realizaciones de la descripción que no caen dentro del alcance de dichas reivindicaciones se proporcionan únicamente con fines ilustrativos y no forman parte de la presente invención. En el presente documento se proporciona tecnología relacionada con la caracterización de muestras, p. ej., muestras de sangre, muestras de heces, etc., para determinar la presencia o ausencia y/o las cantidades de diferentes especies de ácidos nucleicos que, por ejemplo, pueden estar asociadas con un estado de salud de un sujeto. La tecnología se relaciona con el ADN de control metilado que se puede procesar y detectar junto con el ADN marcador metilado indicativo de enfermedad. La tecnología proporciona una composición que comprende un ácido nucleico B3GALT6. Una composición puede comprender un complejo de un ácido nucleico B3GALT6 convertido por bisulfito y al menos un oligonucleótido, en donde al menos una porción de dicho oligonucleótido se hibrida con dicho ácido nucleico B3GALT6. El ácido nucleico B3GALT6 puede ser una hebra de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o el complemento de la misma. El oligonucleótido no se limita a ningún tipo particular de oligonucleótido y puede comprender, p. ej., ADN, ARN y/o PNA (ácido peptidonucleico). El oligonucleótido puede ser un oligonucleótido cebador.

La composición puede comprender adicionalmente un oligonucleótido sonda de detección, comprendiendo el oligonucleótido sonda de detección una región que es complementaria a una porción de una hebra de ADN de B3GALT6. El oligonucleótido la sonda de detección puede comprender una región que es complementaria a una porción de SEQ ID NO: 2 o el complemento de la misma.

La sonda de detección no se limita a ninguna configuración en particular y, p. ej., puede ser una sonda de detección para su uso en PCR, LCR, ensayos de escisión invasiva, ensayos QuARTS de flap y/o cualquier ensayo de detección de ácido nucleico conocido por los expertos en la técnica, cuyos ejemplos se describen a continuación en el presente documento. Un oligonucleótido sonda de detección puede comprender una molécula informadora, p. ej., un radical reactivo o un fluoróforo. El oligonucleótido sonda de detección puede comprender una secuencia flap.

La composición que comprende el ácido nucleico B3GALT6 y el oligonucleótido puede comprender otros componentes. Por ejemplo, la composición comprende adicionalmente un casete FRET, una endonucleasa FEN-1 y/o una ADN polimerasa termoestable. Las composiciones descritas anteriormente pueden estar presentes juntas en una mezcla de reacción, p. ej., para un ensayo de detección de ácido nucleico. La mezcla de reacción puede comprender adicionalmente uno o más de un cebador, un oligonucleótido flap, una ADN polimerasa termoestable, una endonucleasa FEN-1 y/o un casete FRET.

La tecnología puede proporcionar un kit que comprende ácido nucleico relacionado con B3GALT6. Por ejemplo, la tecnología puede proporcionar un kit que comprende a) al menos un oligonucleótido, en donde al menos una porción del oligonucleótido hibrida específicamente con el ADN de B3GALT6 convertido por bisulfito; y b) reactivo de bisulfito. El al menos un oligonucleótido puede comprender una región que es complementaria a una porción de SEQ ID NO: 2 o un complemento de la misma. A modo de ejemplo y no de limitación, el oligonucleótido se puede seleccionar entre uno o más de un oligonucleótido de captura, un par de cebadores de ácido nucleico, una sonda de ácido nucleico y un oligonucleótido invasivo. El kit puede comprender adicionalmente un ADN metilado sintético que esencialmente no tiene homología con el ADN de mamífero para su uso, p. ej., como control de ejecución. El ADN metilado sintético es un ADN de pez cebra, p. ej., una porción sintética del gen rassfl de pez cebra.

La tecnología proporciona adicionalmente métodos para caracterizar muestras. El método puede comprender a) tratar el ADN de una muestra con un reactivo de bisulfito para producir ADN convertido por bisulfito, y b) amplificar una región del ADN convertido por bisulfito utilizando un par de cebadores de ácido nucleico, en donde la amplificación produce un producto amplificado que tiene una secuencia que comprende una región de SEQ ID NO: 2. El producto amplificado puede tener una secuencia que comprende la totalidad de SEQ ID NO: 2.

El método puede comprender adicionalmente una etapa de detección del producto amplificado con una sonda de detección. Como se discutió anteriormente, la sonda de detección no se limita a ninguna forma o función particular de la sonda de detección. La sonda de detección puede comprender una molécula informadora. La sonda de detección puede comprender una secuencia flap.

Breve descripción de los dibujos

Estas y otras características, aspectos y ventajas de la presente tecnología se comprenderán mejor con respecto a los siguientes dibujos:

La Figura 1 muestra un diagrama esquemático de una región diana del marcador B3GALT6 (rango hg19_dna = chr1:1163595-1163733 hebra = ) en forma no convertida y en forma tratada con bisulfito. Se muestran cebadores y sondas de ensayo de flap para la detección de ADN de B3GALT6 convertido por bisulfito.

La Figura 2 muestra un diagrama esquemático de una región diana de p-actina en forma no convertida y en forma tratada con bisulfito. Se muestran cebadores y sondas de ensayo de flap para la detección de ADN de p-actina convertido por bisulfito.

La Figura 3 proporciona un gráfico que compara la detección de ADN de B3GALT6 convertido por bisulfito con ADN de p-actina convertido por bisulfito en ADN extraído de 32 muestras de tejido pulmonar, como se describe en el Ejemplo 3.

La Figura 4 proporciona un gráfico que compara la detección de ADN de B3GALT6 convertido por bisulfito con ADN de p-actina convertido por bisulfito en ADN extraído de 118 muestras de plasma, como se describe en el Ejemplo 4.

La Figura 5 proporciona un gráfico que compara la detección de ADN de B3GALT6 convertido por bisulfito con ADN de p-actina convertido por bisulfito en ADN extraído de 297 muestras de plasma, como se describe en el Ejemplo 5.

Las Figuras 6A y 6B proporcionan gráficos que comparan el porcentaje de metilación de los genes marcadores CYP26C1 y NFIX, respectivamente, en el ADN extraído de 297 muestras de plasma, calculado utilizando B3GALT6 convertido por bisulfito o p-actina convertido por bisulfito como gen de referencia, como se describe en el Ejemplo 6.

Definiciones

Para facilitar la comprensión de la tecnología actual, a continuación se definen varios términos y frases. Se establecen definiciones adicionales a lo largo de la descripción detallada.

Como se utiliza en el presente documento, "un" o "uno" o "una" o "el" o "la" pueden significar uno o más de uno. Por ejemplo, "un" complemento puede significar un complemento o una pluralidad de complementos.

La frase de transición "que consiste esencialmente en" como se emplea en el presente documento limita el alcance a los materiales o etapas especificados "y aquellos que no afectan materialmente a las características básicas y novedosas" de la invención reivindicada, como se discute en In re Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 USPQ 461,463 (CCPA 1976). Por ejemplo, una composición "que consiste esencialmente en" elementos enumerados puede contener un contaminante no enumerado en un nivel tal que, aunque esté presente, el contaminante no altera la función de la composición citada en comparación con una composición pura, es decir, una composición "que consiste en" los componentes citados.

Como se emplea en el presente documento, el término "analito" debe interpretarse de manera amplia como cualquier compuesto, molécula, elemento, ión u otra sustancia de interés que se debe detectar, identificar o caracterizar.

Como se emplea en el presente documento, los términos "sujeto" y "paciente" se refieren a cualquier animal, tal como un perro, gato, ave, ganado y particularmente un mamífero, preferiblemente un ser humano. En algunos casos, el sujeto también es un "usuario" (y, por lo tanto, el usuario también es el sujeto o el paciente).

Como se emplea en el presente documento, el término "muestra" y "espécimen" se utilizan indistintamente y en los sentidos más amplios. En cierto sentido, se pretende que la muestra incluya un espécimen o cultivo obtenido de cualquier fuente, así como muestras biológicas y ambientales. Las muestras biológicas se pueden obtener de animales (incluidos seres humanos) y abarcan fluidos, sólidos, tejidos y gases. Las muestras biológicas incluyen productos sanguíneos, tales como plasma, suero, heces, orina y similares. Las muestras ambientales incluyen material ambiental tal como materia superficial, suelo, lodo, fango, biopelículas, agua, cristales y muestras industriales. Sin embargo, no se debe interpretar que tales ejemplos limiten los tipos de muestras aplicables a la presente invención.

Como se emplea en el presente documento, una "muestra remota" como se emplea en algunos contextos se refiere a una muestra recolectada indirectamente de un sitio que no es la fuente de la muestra de células, tejidos u órganos. Por ejemplo, cuando el material de muestra que se origina en el páncreas se evalúa en una muestra de heces (p. ej., no de una muestra tomada directamente de un páncreas), la muestra es una muestra remota.

El término "diana", cuando se utiliza en referencia a un método de captura, detección o análisis de ácidos nucleicos, generalmente se refiere a un ácido nucleico que tiene una característica, p. ej., una secuencia particular de nucleótidos que debe ser detectada o analizada, p. ej., en una muestra sospechosa de contener el ácido nucleico diana. Una diana puede ser un ácido nucleico que tiene una secuencia particular para la que es deseable determinar un estado de metilación. Cuando se utiliza en referencia a la reacción en cadena de la polimerasa, "diana" generalmente se refiere a la región de ácido nucleico unida por los cebadores utilizados para la reacción en cadena de la polimerasa. Por tanto, se busca que la "diana" se separe de otras secuencias de ácido nucleico que pueden estar presentes en una muestra. Un "segmento" se define como una región de ácido nucleico dentro de la secuencia diana. El término "molde de muestra" se refiere al ácido nucleico que se origina a partir de una muestra que se analiza para detectar la presencia de una diana.

El término "marcador", como se emplea en el presente documento, se refiere a una sustancia (p. ej., un ácido nucleico o una región de un ácido nucleico o una proteína) que se puede utilizar para distinguir células anormales. (p. ej., células cancerosas) de células normales, p. ej., basándose en la presencia, ausencia o estado (p. ej., estado de metilación) de la sustancia marcadora.

Como se emplea en el presente documento, el término "ADN de pez" es distinto del ADN de pez cebra y se refiere a ADN no diana exógeno aislado de peces. El término "exógeno", como se emplea en referencia al ADN no diana, se refiere a ADN no diana que se aísla y purifica de una fuente distinta a la fuente o muestra que contiene el ADN diana. Tal ADN exógeno se selecciona para que no se detecte mediante un ensayo configurado para detectar y/o cuantificar el ácido nucleico diana en la reacción a la que se añade el ADN exógeno. Por ejemplo, el ADN de pez purificado es ADN exógeno con respecto a una muestra que comprende ADN diana humano, p. ej., como se describe en la Patente de Estados Unidos Núm. 9.212.392. El ADN de pez purificado a granel está disponible comercialmente, p. ej., proporcionado en forma de ADN de esperma de bacalao y/o arenque (Roche Applied Science, Mannheim, Alemania) o ADN de salmón (USB/Affymetrix).

Como se emplea en el presente documento, el término "ADN de pez cebra" es distinto del ADN de pez y se refiere al ADN aislado de Danio rerio, o creado in vitro (p. ej., enzimáticamente sintéticamente) para que tenga una secuencia de nucleótidos que se encuentra en el ADN de Danio rerio. El ADN del pez cebra puede ser un ADN metilado añadido como un ADN de control detectable, p. ej., un control de proceso para verificar la recuperación de ADN a través de etapas de procesamiento de muestras.

Como se emplea en el presente documento, el término "locus" se refiere a una posición particular, p. ej., de una mutación, polimorfismo o un resto C en un dinucleótido CpG, dentro de una región o segmento definidos de ácido nucleico, tal como un gen o cualquier otra secuencia caracterizada en un cromosoma o molécula de ARN. Un locus no se limita a ningún tamaño o longitud particular, y se puede referir a una porción de un cromosoma, un gen, un elemento genético funcional o un solo nucleótido o par de bases. Como se emplea en el presente documento con referencia a los sitios CpG que pueden estar metilados, un locus se refiere al resto C en el dinucleótido CpG.

El término "amplificar" o "amplificación" en el contexto de los ácidos nucleicos se refiere a la producción de múltiples copias de un polinucleótido, o una porción del polinucleótido, típicamente partiendo de una pequeña cantidad del polinucleótido (p. ej., una sola molécula de polinucleótido), donde los productos de amplificación o amplicones son generalmente detectables. La amplificación de polinucleótidos abarca una variedad de procesos químicos y enzimáticos. La generación de múltiples copias de ADN a partir de una o unas pocas copias de una molécula de ADN diana o molde durante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o una reacción en cadena de la ligasa (LCR; véase, p. ej., la Patente de Estados Unidos Núm. 5.494.810) son formas de amplificación. Los tipos adicionales de amplificación incluyen, pero no se limitan a, PCR específica de alelo (véase, p. ej., la Patente de Estados Unidos Núm.

5.639.611), PCR de ensamblaje (véase, p. ej., la Patente de Estados Unidos Núm. 5.965.408), amplificación dependiente de helicasa (véase, p. ej., la Patente de Estados Unidos Núm. 7.662.594), PCR de inicio en caliente (véanse, p. ej., las Patentes de Estados Unidos Núm. 5.773.258 y 5.338.671), PCR específica de intersecuencia, PCR inversa (véase, p. ej., Triglia et al. (1988) Nucleic Acids Res., 16:8186), PCR mediada por ligación (véase, p. ej., Guilfoyle, R. et al., Nucleic Acids Research, 25:1854-1858 (1997); Patente de Estados Unidos Núm. 5.508.169), PCR específica de metilación (véase, p. ej., Herman, et al., (1996) PNAS 93 (13) 9821-9826), PCR con minicebador, amplificación de la sonda dependiente de ligación multiplex (véase, p. ej., Schouten, et al., (2002) Nucleic Acids Research 30(12): e57), PCR múltiplex (véase, p. ej., Chamberlain, et al., (1988) Nucleic Acids Research 16(23) 11141­ 11156; Ballabio, et al., (1990) Human Genetics 84(6) 571-573; Hayden, et al., (2008) BMC Genetics 9:80), PCR anidada, PCR de extensión por solapamiento (véase, p. ej., Higuchi, et al., (1988) Nucleic Acids Research 16 (15) 7351-7367), PCR en tiempo real (véase, p. ej., Higuchi, et al., (1992) Biotechnology 10:413-417; Higuchi, et al., (1993) Biotechnology 11:1026-1030), PCR de transcripción inversa (véase, p. ej., Bustin, S.A. (2000) J. Molecular Endocrinology 25:169-193), PCR en fase sólida, PCR entrelazada asimétrica térmica y PCR Touchdown (véase, p. ej., Don et al., Nucleic Acids Research (1991) 19(14) 4008; Roux, K. (1994) Biotechniques 16(5) 812-814; Hecker, et al., (1996) Biotechniques 20(3) 478-485). La amplificación de polinucleótidos también se puede lograr mediante PCR digital (véase, p. ej., Kalinina, et al., Nucleic Acids Research. 25; 1999-2004, (1997); Vogelstein y Kinzler, Proc Natl Acad Sci USA. 96; 9236-41, (1999); Publicación de Patente Internacional Núm. WO/05023091A2; Publicación de la Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. 20070202525).

El término "reacción en cadena de la polimerasa" ("PCR") se refiere al método de K.B. Mullis Patentes de Estados Unidos Núm. 4.683.195, 4.683.202, y 4.965.188, que describen un método para aumentar la concentración de un segmento de una secuencia diana en una mezcla de ADN o ARN genómico o de otro tipo, sin clonación ni purificación. Este procedimiento de amplificación de la secuencia diana consiste en introducir un gran exceso de dos cebadores oligonucleotídicos en la mezcla de ADN que contiene la secuencia diana deseada, seguido de una secuencia precisa de ciclos térmicos en presencia de una ADN polimerasa. Los dos cebadores son complementarios a sus respectivas hebras de la secuencia diana de doble hebra. Para efectuar la amplificación, la mezcla se desnaturaliza y a continuación, los cebadores se reasocian con sus secuencias complementarias dentro de la molécula diana. Después de la reasociación, los cebadores se extienden con una polimerasa para formar un nuevo par de hebras complementarias. Las etapas de desnaturalización, reasociación de cebadores y extensión con polimerasa se pueden repetir muchas veces (es decir, la desnaturalización, la reasociación y la extensión constituyen un "ciclo"; puede haber numerosos "ciclos") para obtener una alta concentración de un segmento amplificado de la secuencia diana deseada. La longitud del segmento amplificado de la secuencia diana deseada está determinada por las posiciones relativas de los cebadores entre sí y, por lo tanto, esta longitud es un parámetro controlable. En virtud del aspecto repetitivo del procedimiento, el método se denomina "reacción en cadena de la polimerasa" ("PCR"). Debido a que los segmentos amplificados deseados de la secuencia diana se convierten en las secuencias predominantes (en términos de concentración) en la mezcla, se dice que están "amplificados por PCR" y son "productos de PCR" o "amplicones". Los expertos en la técnica entenderán que el término "PCR" abarca muchas variantes del método descrito originalmente utilizando, p. ej., PCR en tiempo real, PCR anidada, PCR de transcripción inversa (RT-PCR), PCR de cebador único y cebada arbitrariamente, etc.

Como se emplea en el presente documento, el término "ensayo de detección de ácido nucleico" se refiere a cualquier método para determinar la composición de nucleótidos de un ácido nucleico de interés. El ensayo de detección de ácido nucleico incluye, pero no se limita a, métodos de secuenciación de ADN, métodos de hibridación de sondas, ensayos de escisión de estructura específica (p. ej., el ensayo INVADER, (Hologic, Inc.) y se describen, p. ej., en las Patentes de Estados Unidos Núm. 5.846.717, 5.985.557, 5.994.069, 6.001.567, 6.090.543, y 6.872.816; Lyamichev et al., Nat. Biotech., 17:292 (1999).), Hall et al., PNAS, EE. UU., 97:8272 (2000), y documento US 2009/0253142); métodos de escisión por apareamientos inadecuados con enzimas (p. ej., Variagenics, Patentes de Estados Unidos Núm. 6.110.684, 5.958.692, 5.851.770); reacción en cadena de la polimerasa (PCR), descrita anteriormente; métodos de hibridación ramificada (p. ej., Chiron, Patentes de Estados Unidos Núm. 5.849.481, 5.710.264, 5.124.246, y 5.624.802); replicación por círculo rodante p. ej., Patentes de Estados Unidos Núm. 6.210.884, 6.183.960 y 6.235.502); NASBA (p. ej., Patente de Estados Unidos Núm. 5.409.818); tecnología de balizas moleculares (p. ej., Patente de Estados Unidos Núm. 6.150.097); tecnología con sensores electrónicos (Motorola, Patentes de Estados Unidos Núm.

6.248.229, 6.221.583, 6.013.170, y 6.063.573); tecnología de sondas cíclicas (p. ej., Patentes de Estados Unidos Núm.

5.403.711, 5.011.769, y 5.660.988); métodos de amplificación de señales Dade Behring (p. ej., Patentes de Estados Unidos Núm. 6.121.001,6.110.677, 5.914.230, 5.882.867, y 5.792.614); reacción en cadena de la ligasa p. ej., Baranay Proc. Natl. Acad. Sci u Sa 88, 189-93 (1991)); y métodos de hibridación sándwich (p. ej., Patente de Estados Unidos Núm. 5.288.609).

El ácido nucleico diana se puede amplificar (p. ej., por PCR) y el ácido nucleico amplificado se puede detectar simultáneamente utilizando un ensayo de escisión invasivo. Los ensayos configurados para realizar un ensayo de detección (p. ej., ensayo de escisión invasiva) combinados con un ensayo de amplificación se describen en la Publicación de Patente de EE. UU. US 20090253142 A1 (Solicitud con Núm. de Serie 12/404.240). Las configuraciones de amplificación adicional más detección de escisión invasiva, denominadas método QuARTS, se describen en las Patentes de Estados Unidos Núm. 8.361.720; 8.715.937; 8.916.344; y 9.127.318. El término "estructura de escisión invasiva" como se emplea en el presente documento se refiere a una estructura de escisión que comprende i) un ácido nucleico diana, ii) un ácido nucleico aguas arriba fp. ej., un oligonucleótido invasivo o "INVASOR"), y iii) un ácido nucleico aguas abajo fp. ej., una sonda), donde los ácidos nucleicos aguas arriba y aguas abajo se reasocian con regiones contiguas del ácido nucleico diana, y donde se forma un solapamiento entre la porción 3' del ácido nucleico aguas arriba y el dúplex formado entre el ácido nucleico aguas abajo y el ácido nucleico diana. Se produce un solapamiento cuando una o más bases de los ácidos nucleicos aguas arriba y aguas abajo ocupan la misma posición con respecto a una base de ácido nucleico diana, tanto si las bases solapantes del ácido nucleico aguas arriba son complementarias con el ácido nucleico diana como si no, y tanto si esas bases son o no bases naturales o bases no naturales. La porción 3' del ácido nucleico aguas arriba que se solapa con el dúplex aguas abajo puede ser un radical químico no alcalino, tal como una estructura de anillo aromático, p. ej., como se divulga, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Núm. 6.090.543. Uno o más de los ácidos nucleicos pueden estar unidos entre sí, p. ej., a través de un enlace covalente, tal como un tallo-bucle de ácido nucleico, o a través de una conexión química que no sea de ácido nucleico fp. ej., una cadena multicarbonada). Como se emplea en el presente documento, el término "ensayo de endonucleasa flap" incluye ensayos de escisión invasiva "INVASOR" y ensayos QuARTS, como se describió anteriormente.

El término "sonda" se refiere a un oligonucleótido (p. ej., una secuencia de nucleótidos), ya sea de forma natural como en un producto digerido mediante enzimas de restricción purificado o producido sintéticamente, de forma recombinante o mediante amplificación por PCR, que es susceptible de hibridar con otro oligonucleótido de interés. Una sonda puede ser de hebra sencilla o de doble hebra. Las sondas son útiles en la detección, identificación y aislamiento de secuencias de genes particulares (p. ej., una "sonda de captura"). Se contempla que cualquier sonda utilizada de acuerdo con la presente divulgación se puede marcar con cualquier "molécula indicadora", de modo que sea detectable en cualquier sistema de detección, que incluye, pero no se limita a, enzimas (p. ej., ELISA, así como ensayos histoquímicos basados en enzimas), sistemas fluorescentes, radiactivos y luminiscentes. No existe limitación para ningún sistema de detección o marca en particular. Cuando se utiliza en referencia al ensayo de flap, el término se refiere a un oligonucleótido que interactúa con un ácido nucleico diana para formar una estructura de escisión en presencia de un oligonucleótido invasivo. Como se emplea en referencia a un ensayo de flap, los términos "sonda flap" y "oligonucleótido flap" se utilizan indistintamente.

El término "oligonucleótido invasivo" se refiere a un oligonucleótido que hibrida con un ácido nucleico diana en una ubicación adyacente a la región de hibridación entre una sonda y el ácido nucleico diana, en donde el extremo 3' del oligonucleótido invasivo comprende una porción fp. ej., un radical químico, o uno o más nucleótidos) que se solapa con la región de hibridación entre la sonda y la diana. El nucleótido terminal 3' del oligonucleótido invasivo puede formar o no pares de bases con un nucleótido en la diana. El oligonucleótido invasivo puede contener secuencias en su extremo 3' que son sustancialmente las mismas que las secuencias ubicadas en el extremo 5' de una porción del oligonucleótido sonda que se reasocia con la hebra diana.

El término "endonucleasa flap" o "FEN", como se emplea en el presente documento, se refiere a una clase de enzimas nucleolíticas, típicamente nucleasas 5', que actúan como endonucleasas específicas de estructura en estructuras de ADN con un dúplex que contiene un saliente 5' de hebra sencilla, o flap, en una de las hebras que es desplazada por otra hebra de ácido nucleico fp. ej., de manera que haya nucleótidos solapantes en la unión entre el ADN de hebra sencilla y de doble hebra). Las f En catalizan la escisión hidrolítica del enlace fosfodiéster en la unión del ADN de hebra sencilla y de doble hebra, liberando el saliente o flap. Las endonucleasas flap son revisadas por Ceska y Savers (Trends Biochem. Sci. 1998 23:331-336) y Liu et al. (Annu. Rev. Biochem. 2004 73: 589-615). Las FEN pueden ser enzimas individuales, enzimas de múltiples subunidades o pueden existir como una actividad de otra enzima o complejo proteico fp. ej., una ADN polimerasa).

Una endonucleasa de flap puede ser termoestable. Por ejemplo, la endonucleasa flap FEN-1 de organismos termófilos del grupo de las arqueas son termoestables típicamente. Como se emplea en el presente documento, el término "FEN-1" se refiere a una endonucleasa flap no polimerasa de un organismo eucariótico o del grupo de las arqueas. Véanse, p. ej., el documento WO 02/070755, y Kaiser M.W. et al. (1999) J. Biol. Chem., 274:21387.

Como se emplea en el presente documento, el término "flap escindida" se refiere a un oligonucleótido de hebra sencilla que es un producto de escisión de un ensayo de flap.

El término "casete", cuando se utiliza en referencia a una reacción de escisión de flap, se refiere a un oligonucleótido o combinación de oligonucleótidos configurados para generar una señal detectable en respuesta a la escisión de un oligonucleótido flap o sonda, p. ej., en una estructura de escisión primaria o primera formada en un ensayo de escisión de flap. El casete puede hibridar con un producto de escisión no diana producido por escisión de un oligonucleótido flap para formar una segunda estructura de escisión solapante, de modo que el casete pueda ser escindido a continuación, por la misma enzima, p. ej., una endonucleasa FEN-1.

El casete puede ser un solo oligonucleótido que comprende una porción de horquilla (es decir, una región en donde una porción del oligonucleótido de casete se hibrida con una segunda porción del mismo oligonucleótido en las condiciones de reacción, para formar un dúplex). Un casete puede comprender al menos dos oligonucleótidos que comprenden porciones complementarias que pueden formar un dúplex en las condiciones de reacción. El casete puede comprender una marca, p. ej., un fluoróforo. Un casete puede comprender radicales marcados que producen un efecto FRET.

Como se emplea en el presente documento, el término "FRET" se refiere a la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, un procedimiento en el que los radicales (p. ej., fluoróforos) transfieren energía p. ej., entre ellos, o desde un fluoróforo a un no fluoróforo (p. ej., una molécula extintora). En algunas circunstancias, FRET implica un fluoróforo donador excitado que transfiere energía a un fluoróforo aceptor de menor energía a través de una interacción dipolo-dipolo de corto alcance (p. ej., aproximadamente 10 nm o menos). En otras circunstancias, FRET implica una pérdida de energía de fluorescencia de un donador y un aumento de la fluorescencia en un fluoróforo aceptor. En otras formas más de FRET, la energía se puede intercambiar desde un fluoróforo donador excitado a una molécula no fluorescente (p. ej., una molécula de extinción "oscura"). FRET es conocida por los expertos en la técnica y se ha descrito (véase, p. ej., Stryer et al., 1978, Ann. Rev. Biochem., 47:819; Selvin, 1995, Methods Enzymol., 246:300; Orpana, 2004 Biomol Eng 21,45-50; Olivier, 2005 Mutant Res 573, 103-110).

En un ensayo de detección de flap ilustrativo, un oligonucleótido invasivo y un oligonucleótido flap hibridan con un ácido nucleico diana para producir un primer complejo que tiene un solapamiento como se describió anteriormente. Se incluye un "flap" o "brazo" no emparejado en el extremo 5' del oligonucleótido flap. El primer complejo es un sustrato para una endonucleasa flap, p. ej., una endonucleasa FEN-1, que escinde el oligonucleótido flap para liberar la porción de flap 5'. En una reacción secundaria, el producto de flap 5' liberado sirve como un oligonucleótido invasivo en un casete FRET para crear de nuevo la estructura reconocida por la endonucleasa flap, de modo que se escinde el casete FRET. Cuando el fluoróforo y el extintor se separan por escisión del casete FRET, se produce una señal fluorescente detectable por encima de la fluorescencia de fondo.

El término "tiempo real" como se emplea en el presente documento se refiere a la detección de amplificación de ácido nucleico o amplificación de señal mediante la detección o medición de la acumulación de productos o señal en la reacción mientras la reacción está en progreso, p. ej., durante la incubación o el ciclo térmico. Tal detección o medición se pueden producir continuamente, o se pueden producir en una pluralidad de puntos discretos durante el progreso de la reacción de amplificación, o puede ser una combinación. Por ejemplo, en una reacción en cadena de la polimerasa, la detección (p. ej., de fluorescencia) se puede producir continuamente durante todo o parte del ciclo térmico, o se puede producir transitoriamente, en uno o más puntos durante uno o más ciclos. La detección en tiempo real de reacciones de PCR o QuARTS se puede lograr determinando un nivel de fluorescencia en el mismo punto (p. ej., un punto de tiempo en el ciclo, o etapa de temperatura en el ciclo) en cada uno de una pluralidad de ciclos, o en cada ciclo. La detección en tiempo real de la amplificación también se puede denominar detección "durante" la reacción de amplificación.

Como se emplea en el presente documento, el término "conjunto de datos de amplificación cuantitativa" se refiere a los datos obtenidos durante la amplificación cuantitativa de la muestra diana, p. ej., ADN diana. En el caso de los ensayos de PCR cuantitativa o QuARTS, el conjunto de datos de amplificación cuantitativa es una colección de valores de fluorescencia obtenidos durante la amplificación, p. ej., durante una pluralidad o todos los ciclos térmicos. Los datos para la amplificación cuantitativa no se limitan a los datos recopilados en cualquier punto particular de una reacción, y la fluorescencia se puede medir en un punto discreto en cada ciclo o continuamente a lo largo de cada ciclo.

Las abreviaturas "Ct" y "Cp" como se emplean en el presente documento, en referencia a los datos recopilados durante los ensayos de PCR en tiempo real y PCR+INVASOR, se refieren al ciclo en el que la señal (p. ej., señal fluorescente) cruza un valor umbral predeterminado indicativo de señal positiva. Se han utilizado varios métodos para calcular el umbral que se utiliza como determinante de la señal frente a la concentración, y el valor se expresa generalmente como el "umbral de cruce" (Ct) o el "punto de cruce" (Cp). Se pueden utilizar valores de Cp o valores de Ct en los métodos presentados en el presente documento para el análisis de la señal en tiempo real para la determinación del porcentaje de constituyentes variantes y/o no variantes en un ensayo o muestra.

Como se emplea en el presente documento, los términos "complementario" o "complementariedad" utilizados en referencia a polinucleótidos (es decir, una secuencia de nucleótidos) se refieren a polinucleótidos relacionados por las reglas de emparejamiento de bases. Por ejemplo, la secuencia "5'-A-G-T-3', " es complementaria a la secuencia "3'-T-C-A-5'." La complementariedad puede ser "parcial", en la que solo algunas de las bases de los ácidos nucleicos coinciden según las reglas de emparejamiento bases. O puede haber complementariedad "completa" o "total" entre los ácidos nucleicos. El grado de complementariedad entre las hebras de ácidos nucleicos tiene efectos significativos sobre la eficacia y la fuerza de la hibridación entre las hebras de ácidos nucleicos. Esto reviste particular importancia en las reacciones de amplificación, así como en los métodos de detección que dependen de la unión entre ácidos nucleicos.

Como se emplea en el presente documento, el término "cebador" se refiere a un oligonucleótido, ya sea de origen natural, como en una digestión de restricción purificada, o producido sintéticamente, que es capaz de actuar como un punto de inicio de síntesis cuando se coloca en condiciones en las que se induce la síntesis de un el producto de extensión del cebador que es complementario a una hebra de ácido nucleico (p. ej., en presencia de nucleótidos y un agente inductor tal como un biocatalizador (p. ej., una ADN polimerasa o similar). El cebador es típicamente de hebra sencilla para una máxima eficacia en la amplificación, pero alternativamente puede ser parcial o completamente de doble hebra. La porción del cebador que hibrida con un ácido nucleico molde es suficientemente larga para cebar la síntesis de productos de extensión en presencia del agente inductor. Las longitudes exactas de los cebadores dependerán de muchos factores, incluida la temperatura, la fuente del cebador y el uso del método. Los cebadores pueden comprender marcas, etiquetas, radicales de captura, etc.

Como se emplea en el presente documento, el término "molécula de ácido nucleico" se refiere a cualquier molécula que contiene ácido nucleico, incluyendo, pero sin limitarse a, ADN o ARN. El término abarca secuencias que incluyen cualquiera de los análogos de bases conocidos de ADN y ARN, incluidos, pero son limitarse a, 4-acetilcitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinilcitosina, pseudoisocitosina, 5-(carboxihidroxil-metil)uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetil-aminometiluracilo, dihidrouracilo, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudo-uracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metil-citosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxi-amino-metil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarbonilmetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N-isopenteniladenina, éster metílico de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico de ácido N-uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina y 2,6-diaminopurina.

Como se emplea en el presente documento, el término "nucleobase" es sinónimo de otros términos en uso en la técnica, incluyendo "nucleótido", "desoxinucleótido", "resto de nucleótido", "resto de desoxinucleótido", "nucleótido trifosfato (NTP)" o desoxinucleótido trifosfato (dNTP).

Un "oligonucleótido" se refiere a un ácido nucleico que incluye al menos dos unidades de monómero de ácido nucleico (p. ej., nucleótidos), típicamente más de tres unidades de monómero y más típicamente más de diez unidades de monómero. El tamaño exacto de un oligonucleótido generalmente depende de varios factores, incluida la función o uso final del oligonucleótido. Para ilustrar adicionalmente, los oligonucleótidos tienen típicamente menos de 200 restos de longitud (p. ej., entre 15 y 100), sin embargo, como se emplea en el presente documento, también se pretende que el término abarque cadenas polinucleotídicas más largas. A menudo se hace referencia a los oligonucleótidos por su longitud. Por ejemplo, un oligonucleótido de 24 restos se denomina "polímero de 24 unidades". Típicamente, los monómeros de nucleósidos están conectados por enlaces fosfodiéster o análogos de los mismos, incluyendo fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato, fosforamidato y similares, incluidos contraiones asociados, p. ej., H+, NH4+, Na+ y similares, si tales contraiones están presentes. Adicionalmente, los oligonucleótidos son típicamente de hebra sencilla. Los oligonucleótidos se preparan opcionalmente mediante cualquier método adecuado, que incluye, pero no se limita a, el aislamiento de una secuencia natural o existente, la replicación o amplificación del ADN, la transcripción inversa, la clonación y la digestión por restricción de secuencias apropiadas o la síntesis química directa mediante un método tal como el método del fosfotriéster de Narang et al. (1979) Meth Enzymol. 68: 90-99; el método del fosfodiéster de Brown et al. (1979) Meth Enzymol. 68: 109-151; el método de la dietilfosforamidita de Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862; el método de triéster de Matteucci et al. (1981) J Am Chem Soc. 103: 3185-3191; métodos de síntesis automatizados; 0 el método de soporte sólido de la Patente de Estados Unidos Núm. 4.458.066, titulada "Process For Preparing Polynucleotides", presentada el 3 de julio de 1984 por Caruthers et al., u otros métodos conocidos por los expertos en la técnica.

Una "secuencia" de un biopolímero se refiere al orden y la identidad de las unidades de monómero. (p. ej., nucleótidos, aminoácidos, etc.j en el biopolímero. La secuencia (p. ej., secuencia de bases) de un ácido nucleico se lee típicamente en la dirección 5' a 3'.

Como se emplea en el presente documento, el término "gen" se refiere a una secuencia de ácido nucleico (p. ej., ADN) que comprende las secuencias codificantes necesarias para la producción de un polipéptido, precursor o ARN (p. ej., ARN no codificantes tales como ARN ribosómico, ARN de transferencia, ARN de espliceosoma, microARN). Un polipéptido o ARN no codificante puede estar codificado por una secuencia codificante de longitud completa o por cualquier porción de la secuencia codificante siempre que se conserven la actividad o las propiedades funcionales deseadas (p. ej., actividad enzimática, unión al ligando, transducción de señales, inmunogenicidad, etc.j del polipéptido de longitud completa o fragmento. El término también abarca la región codificante de un gen estructural y las secuencias ubicadas adyacentes a la región codificante en los extremos 5' y 3' para una distancia de aproximadamente 1 kb o más en cada extremo de manera que el gen corresponda a la longitud del ARNm de longitud completa. Las secuencias ubicadas 5' respecto de la región codificante y presentes en el ARNm se denominan secuencias 5' no traducidas. Las secuencias ubicadas 3' o aguas abajo de la región codificante y presentes en el ARNm se denominan secuencias 3' no traducidas. El término "gen" abarca tanto el ADNc como las formas genómicas de un gen. Una forma genómica o clon de un gen contiene la región codificante interrumpida con secuencias no codificantes denominadas "intrones" o "regiones intermedias" o "secuencias intermedias". Los intrones son segmentos de un gen que se transcriben a ARN nuclear (p. ej., ARNhn); los intrones pueden contener elementos reguladores (p. ej., potenciadores). Los intrones se eliminan o "empalman" del transcripto nuclear o primario; por lo tanto, los intrones están ausentes en el transcripto del ARN mensajero (ARNm). El ARNm funciona durante la traducción para especificar la secuencia o el orden de los aminoácidos en un polipéptido naciente.

Además de contener intrones, las formas genómicas de un gen también pueden incluir secuencias ubicadas tanto en el extremo 5’ como en el 3' de las secuencias que están presentes en el transcrito de ARN. Estas secuencias se denominan secuencias o regiones "flanqueantes" (estas secuencias flanqueantes están ubicadas 5’ o 3' con respecto a las secuencias no traducidas presentes en el transcrito de ARNm). La región flanqueante 5’ puede contener secuencias reguladoras tales como promotores y potenciadores que controlan o influyen en la transcripción del gen. La región flanqueante 3’ puede contener secuencias que dirigen la terminación de la transcripción, la escisión postranscripcional y la poliadenilación.

Como se emplea en el presente documento, "metilación" se refiere a la metilación de citosina en las posiciones C5 o N4 de la citosina, la posición N6 de la adenina u otros tipos de metilación de ácidos nucleicos. El ADN amplificado in vitro generalmente no está metilado ya que los métodos típicos de amplificación del ADN in vitro no conservan el patrón de metilación del molde de amplificación. Sin embargo, "ADN no metilado" o "ADN metilado" también pueden referirse a ADN amplificado cuyo molde original no estaba metilado o estaba metilado, respectivamente.

Por consiguiente, como se emplea en el presente documento, un "nucleótido metilado" o una "base de nucleótido metilado" se refiere a la presencia de un radical metilo en una base nucleotídica, donde el radical metilo no está presente en una base nucleotídica típica reconocida. Por ejemplo, la citosina no contiene un radical metilo en su anillo de pirimidina, pero la 5-metilcitosina contiene un radical metilo en la posición 5 de su anillo de pirimidina. Por lo tanto, la citosina no es un nucleótido metilado y la 5-metilcitosina es un nucleótido metilado. En otro ejemplo, la timina contiene un radical metilo en la posición 5 de su anillo de pirimidina; sin embargo, para los propósitos del presente documento, la timina no se considera un nucleótido metilado cuando está presente en el ADN, ya que la timina es una base nucleotídica típica del ADN.

Como se emplea en el presente documento, una "molécula de ácido nucleico metilado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que contiene uno o más nucleótidos metilados.

Como se emplea en el presente documento, un "estado de metilación", "perfil de metilación" y "estatus de metilación" de una molécula de ácido nucleico se refiere a la presencia de ausencia de una o más bases nucleotídicas metiladas en la molécula de ácido nucleico. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que contiene una citosina metilada se considera metilada (p. ej., el estado de metilación de la molécula de ácido nucleico es metilado). Una molécula de ácido nucleico que no contiene nucleótidos metilados se considera no metilada.

El estado de metilación de una secuencia de ácido nucleico en particular (p. ej., un marcador genético o una región de ADN como se describe en el presente documento) puede indicar el estado de metilación de cada base en la secuencia o puede indicar el estado de metilación de un subconjunto de las bases (p. ej., de una o más citosinas) dentro de la secuencia, o puede indicar información con respecto a la densidad de metilación regional dentro de la secuencia con o sin proporcionar información precisa de las ubicaciones dentro de la secuencia en la que se produce la metilación.

El estado de metilación de un locus de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico se refiere a la presencia o ausencia de un nucleótido metilado en un locus particular de la molécula de ácido nucleico. Por ejemplo, el estado de metilación de una citosina en el séptimo nucleótido de una molécula de ácido nucleico es metilado cuando el nucleótido presente en el séptimo nucleótido de la molécula de ácido nucleico es 5-metilcitosina. De manera similar, el estado de metilación de una citosina en el séptimo nucleótido de una molécula de ácido nucleico es no metilado cuando el nucleótido presente en el séptimo nucleótido de la molécula de ácido nucleico es citosina (y no 5-metilcitosina).

El estado de metilación se puede representar o indicar opcionalmente mediante un "valor de metilación" (p. ej., que representa una frecuencia, fracción, relación, porcentaje de metilación, etc.j Se puede generar un valor de metilación, por ejemplo, cuantificando la cantidad de ácido nucleico intacto presente después de la digestión de restricción con una enzima de restricción dependiente de metilación o comparando perfiles de amplificación después de la reacción con bisulfito o comparando secuencias de ácidos nucleicos tratados con bisulfito y sin tratar. En consecuencia, un valor, p. ej., un valor de metilación, representa el estado de metilación y, por lo tanto, se puede utilizar como un indicador cuantitativo del estatus de metilación en múltiples copias de un locus. Esto reviste particular utilidad cuando es deseable comparar el estado de metilación de una secuencia en una muestra con un valor umbral o de referencia.

Como se emplea en el presente documento, "frecuencia de metilación" o "porcentaje de metilación (%)" se refieren al número de casos en los que una molécula o locus están metilados con relación al número de casos en que la molécula o locus no están metilados.

Como tal, el estado de metilación describe el estado de metilación de un ácido nucleico. (p. ej., una secuencia genómica). Además, el estado de metilación se refiere a las características de un segmento de ácido nucleico en un locus genómico particular relevante para la metilación. Tales características incluyen, pero no se limitan a, si alguno de los restos de citosina (C) dentro de esta secuencia de ADN está metilado, la ubicación de los restos de C metilados, la frecuencia o el porcentaje de C metiladas en cualquier región particular de un ácido nucleico, y diferencias alélicas en la metilación debido a, p. ej., diferencia en el origen de los alelos. Los términos "estado de metilación", "perfil de metilación" y "estatus de metilación" también se refieren a la concentración relativa, concentración absoluta o patrón de C metilada o C no metilada en cualquier región particular de un ácido nucleico en una muestra biológica. Por ejemplo, si el resto o los restos de citosina (C) dentro de una secuencia de ácido nucleico están metilados, se puede denominar "hipermetilada" o con "aumento de metilación", mientras que si el resto o los restos de citosina (C) dentro de una secuencia de ADN no están metilados, se puede denominar "hipometilada" o que tiene "disminución de metilación". Asimismo, si los restos de citosina (C) dentro de una secuencia de ácido nucleico están metilados en comparación con otra secuencia de ácido nucleico (p. ej., de una región diferente o de un individuo diferente, etc.j esa secuencia se considera hipermetilada o que tiene un aumento de metilación en comparación con la otra secuencia de ácido nucleico. Alternativamente, si el resto o los restos de citosina (C) dentro de una secuencia de ADN no están metilados en comparación con otra secuencia de ácido nucleico (p. ej., de una región diferente o de un individuo diferente, etc.j esa secuencia se considera hipometilada o con disminución de metilación en comparación con la otra secuencia de ácido nucleico. Además, el término "patrón de metilación" como se emplea en el presente documento se refiere a los sitios colectivos de nucleótidos metilados y no metilados sobre una región de un ácido nucleico. Dos ácidos nucleicos pueden tener la misma o similar frecuencia de metilación o porcentaje de metilación, pero tener patrones de metilación diferentes cuando el número de nucleótidos metilados y no metilados es el mismo o similar en toda la región pero las ubicaciones de los nucleótidos metilados y no metilados son diferentes. Se dice que las secuencias están "metiladas diferencialmente" o que tienen una "diferencia en la metilación" o que tienen un "estado de metilación diferente" cuando difieren en la extensión (p. ej., una tiene aumento o disminución de metilación con relación a la otra), frecuencia o patrón de metilación. El término "metilación diferencial" se refiere a una diferencia en el nivel o patrón de metilación de ácido nucleico en una muestra positiva de cáncer en comparación con el nivel o patrón de metilación de ácido nucleico en una muestra negativa de cáncer. También se puede referir a la diferencia en los niveles o patrones entre los pacientes que tienen recidiva del cáncer después de la cirugía frente a pacientes que no tienen recidiva. La metilación diferencial y los niveles o patrones específicos de metilación del ADN son biomarcadores pronósticos y predictivos, p. ej., una vez que se han definido las características de corte o predictivas correctas.

La frecuencia del estado de metilación se puede utilizar para describir una población de individuos o una muestra de un solo individuo. Por ejemplo, un locus de nucleótidos que tiene una frecuencia de estado de metilación de 50% está metilado en 50% de los casos y no metilado en 50% de los casos. Tal frecuencia se puede utilizar, por ejemplo, para describir el grado en el que un locus de nucleótidos o una región de ácido nucleico están metilados en una población de individuos o una colección de ácidos nucleicos. Por lo tanto, cuando la metilación en una primera población o grupo de moléculas de ácido nucleico es diferente de la metilación en una segunda población o grupo de moléculas de ácido nucleico, la frecuencia del estado de metilación de la primera población o grupo será diferente de la frecuencia del estado de metilación de la segunda población o grupo. Tal frecuencia también se puede utilizar, por ejemplo, para describir el grado en el que un locus de nucleótidos o una región de ácido nucleico están metilados en un solo individuo. Por ejemplo, tal frecuencia se puede utilizar para describir el grado en el que un grupo de células de una muestra de tejido está metilado o no metilado en un locus de nucleótidos o región de ácido nucleico.

El término "altamente metilado" se refiere a ácidos nucleicos en los que un locus particular (p. ej., un dinucleótido CpG o un conjunto de dinucleótidos o región rica en CpG) se metila en un tipo de muestra o tipo de tejido particular a una velocidad que es mediblemente mayor que la observada para el locus comparable en el mismo ADN en otro tejido o tipo de muestra. "Altamente metilado" se puede referir a un único resto de C particular o a una tasa promedio de metilación a través de múltiples C en una región, como una fracción de las copias de ese locus en la muestra que se está analizando. Sin limitar el término a ningún nivel particular de metilación, un locus altamente metilado puede estar metilado >10%, preferiblemente >20% a 40%, más preferiblemente >50% a 75%, aún más preferiblemente entre 75% y 100%.

Como se emplea en el presente documento, un "locus de nucleótidos" se refiere a la ubicación de un nucleótido en una molécula de ácido nucleico. Un locus de nucleótidos de un nucleótido metilado se refiere a la ubicación de un nucleótido metilado en una molécula de ácido nucleico.

Típicamente, la metilación del ADN humano se produce en una secuencia de dinucleótidos que incluye una guanina y una citosina adyacentes donde la citosina está ubicada 5’ respecto de la guanina (también denominadas secuencias de dinucleótidos CpG). La mayoría de las citosinas dentro de los dinucleótidos CpG están metiladas en el genoma humano; sin embargo, algunas permanecen sin metilar en regiones genómicas específicas ricas en dinucleótidos CpG, conocidas como islas CpG (véase, p. ej., Antequera et al. (1990) Cell 62: 503-514).

Como se emplea en el presente documento, una "isla CpG" se refiere a una región rica en G:C de ADN genómico que contiene un mayor número de dinucleótidos CpG con relación al ADN genómico total. Una isla CpG puede tener al menos 100, 200 o más pares de bases de longitud, donde el contenido de G:C de la región es al menos 50% y la razón entre la frecuencia CpG observada y la frecuencia esperada es 0,6; en algunos casos, una isla CpG puede tener al menos 500 pares de bases de longitud, donde el contenido de G:C de la región es al menos 55%) y la razón entre la frecuencia CpG observada y la frecuencia esperada es 0,65. La frecuencia CpG observada sobre la frecuencia esperada se puede calcular de acuerdo con el método proporcionado por Gardiner-Garden et al. (1987) J. Mol. Biol.

196: 261-281. Por ejemplo, la frecuencia CpG observada sobre la frecuencia esperada se puede calcular de acuerdo con la fórmula R = (A x B)/(C x D), donde R es la razón entre la frecuencia CpG observada y la frecuencia esperada, A es el número de dinucleótidos CpG en una secuencia analizada, B es el número total de nucleótidos en la secuencia analizada, C es el número total de nucleótidos de C en la secuencia analizada y D es el número total de nucleótidos de G en la secuencia analizada. El estado de metilación se determina típicamente en las islas CpG, p. ej., en las regiones promotoras. Sin embargo, se apreciará que otras secuencias del genoma humano son propensas a la metilación del ADN, tales como CpA y CpT (véanse Ramsahoye (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 : 5237-5242; Salmon y Kaye (1970) Biochim. Biophys. Acta. 204: 340-351; Grafstrom (1985) Nucleic Acids Res. 13: 2827-2842; Nyce (1986) Nucleic Acids Res. 14: 4353-4367; Woodcock (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun. 145: 888-894).

Como se emplea en el presente documento, el término "célula de tejido" se refiere a cualquier célula de tejido en un organismo, p. ej., un organismo humano o animal, incluyendo, p. ej., células epiteliales, musculares, nerviosas y óseas. Las células de los tejidos no incluyen las células sanguíneas. Como se emplea en el presente documento, la sangre normalmente comprende plasma, glóbulos rojos, glóbulos blancos (incluidos leucocitos y linfocitos) y plaquetas. Los leucocitos incluyen neutrófilos, monocitos, eosinófilos y basófilos, y los linfocitos incluyen células T, células B y células asesinas naturales.

Como se emplea en el presente documento, un reactivo que modifica un nucleótido de la molécula de ácido nucleico en función del estado de metilación de la molécula de ácido nucleico, o un reactivo específico de metilación, se refiere a un compuesto o composición u otro agente que pueden cambiar la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico de una manera que refleje el estado de metilación de la molécula de ácido nucleico. Los métodos para tratar una molécula de ácido nucleico con tal reactivo pueden incluir poner en contacto la molécula de ácido nucleico con el reactivo, junto con etapas adicionales, si se desea, para lograr el cambio deseado de secuencia de nucleótidos. Tal cambio en la secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico puede dar como resultado una molécula de ácido nucleico en la que cada nucleótido metilado se modifica a un nucleótido diferente. Tal cambio en la secuencia de nucleótidos de ácido nucleico puede dar como resultado una molécula de ácido nucleico en la que cada nucleótido no metilado se modifica a un nucleótido diferente. Tal cambio en la secuencia de nucleótidos de ácido nucleico puede dar como resultado una molécula de ácido nucleico en la que cada uno de un nucleótido seleccionado que no está metilado (p. ej., cada citosina no metilada) se modifica a un nucleótido diferente. El uso de tal reactivo para cambiar la secuencia de nucleótidos de ácido nucleico puede dar como resultado una molécula de ácido nucleico en la que cada nucleótido que es un nucleótido metilado (p. ej., cada citosina metilada) se modifica a un nucleótido diferente. Como se emplea en el presente documento, el uso de un reactivo que modifica un nucleótido seleccionado se refiere a un reactivo que modifica un nucleótido de los cuatro nucleótidos típicos en una molécula de ácido nucleico (C, G, T y A para ADN y C, G, U, y A para ARN), de modo que el reactivo modifica un nucleótido sin modificar los otros tres nucleótidos. Tal reactivo puede modificar un nucleótido seleccionado no metilado para producir un nucleótido diferente. En otro ejemplo, tal reactivo puede desaminar nucleótidos de citosina no metilados. Un reactivo ilustrativo es bisulfito.

El término "reactivo de bisulfito" se refiere a un reactivo que comprende bisulfito, disulfito, hidrogenosulfito o combinaciones de los mismos, útil como se describe en el presente documento para distinguir entre secuencias de dinucleótidos CpG metilados y no metilados. Los métodos de dicho tratamiento son conocidos en la técnica (p. ej., documento PCT/EP2004/011715 y documento WO 2013/116375). El tratamiento con bisulfito se puede realizar en presencia de disolventes desnaturalizantes tales como, pero sin limitarse a, n-alquilenglicol o dimetiléter dietilenglicol (DME), o en presencia de dioxano o derivados de dioxano. Los disolventes desnaturalizantes se pueden utilizar a concentraciones entre 1% y 35% (v/v). La reacción con bisulfito se puede llevar a cabo en presencia de captadores tales como, pero sin limitarse a, derivados de cromano, p. ej., ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico o ácido trihidroxibenzoico y derivados del mismo, p. ej., ácido gálico (véase: documento PCT/EP2004/011715). La reacción con bisulfito puede comprender el tratamiento con hidrogenosulfito de amonio, p. ej., como se describe en el documento WO 2013/116375.

El término "ensayo de metilación" se refiere a cualquier ensayo para determinar el estado de metilación de una o más secuencias de dinucleótidos CpG dentro de una secuencia de un ácido nucleico.

El término "MS AP-PCR" (reacción en cadena de la polimerasa cebada arbitrariamente sensible a la metilación) se refiere a la tecnología reconocida en la técnica que permite un escaneo global del genoma utilizando cebadores ricos en CG para centrarse en las regiones con mayor probabilidad de contener dinucleótidos CpG, y descrita por Gonzalgo et al. (1997) Cancer Research 57 : 594-599.

El término "MethyLight™" se refiere al mecanismo de PCR en tiempo real basada en fluorescencia reconocida en la técnica descrita por Eads et al. (1999) Cancer Res. 59: 2302-2306.

El término "HeavyMethyl™" se refiere a un ensayo en donde las sondas de bloqueo específicas de metilación (también denominadas en el presente documento bloqueadores) que cubren posiciones CpG entre, o cubiertas por, los cebadores de amplificación permiten la amplificación selectiva específica de metilación de una muestra de ácido nucleico.

El término "Ms-SNuPE" (Extensión de Cebador de Nucleótido Unico sensible a Metilación) se refiere al ensayo reconocido en la técnica descrito por Gonzalgo y Jones (1997) Nucleic Acids Res.25 : 2529-2531.

El término "MSP" (PCR específica de metilación) se refiere al ensayo de metilación reconocido en la técnica descrito por Herman et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 : 9821-9826, y por la Patente de Estados Unidos Núm.

5.786.146.

El término "COBRA" (Análisis de restricción de bisulfito combinado) se refiere al ensayo de metilación reconocido en la técnica descrito por Xiong y Laird (1997) Nucleic Acids Res. 25: 2532-2534.

El término "MCA" (amplificación de isla CpG metilada) se refiere al ensayo de metilación descrito por Toyota et al. (1999) Cáncer Res. 59 : 2307-12, y en el documento WO 00/26401A1.

Como se emplea en el presente documento, el término "kit" se refiere a cualquier sistema de suministro para suministrar materiales. En el contexto de los ensayos de reacción, tales sistemas de suministro incluyen sistemas que permiten el almacenamiento, transporte o suministro de reactivos de reacción (p. ej., oligonucleótidos, enzimas, etc. en los recipientes apropiados) y/o materiales de apoyo (p. ej., tampones, instrucciones escritas para realizar el ensayo etc.) de un lugar a otro. Por ejemplo, los kits incluyen uno o más recintos (p. ej., cajas) que contienen los reactivos de reacción relevantes y/o materiales de soporte. Como se emplea en el presente documento, el término "kit fragmentado" se refiere a sistemas de suministro que comprenden dos o más recipientes separados que contienen cada uno una subporción de los componentes totales del kit. Los contenedores se pueden suministrar al destinatario previsto juntos o por separado. Por ejemplo, un primer recipiente puede contener una enzima para utilizar en un ensayo, mientras que un segundo recipiente contiene oligonucleótidos.

El término "sistema" como se emplea en el presente documento se refiere a una colección de artículos para su uso con un propósito concreto. Los artículos pueden comprender instrucciones de uso, como información suministrada en p. ej., un artículo, en papel o en soporte grabable (p. ej., DVD, CD, memoria USB, etc.). Las instrucciones pueden dirigir a un usuario a una ubicación en línea, p. ej., una página web.

Como se emplea en el presente documento, el término "información" se refiere a cualquier recopilación de hechos o datos. En referencia a la información almacenada o procesada utilizando uno o varios sistemas informáticos, incluidos, pero sin limitarse a, Internet, el término se refiere a cualquier dato almacenado en cualquier formato (p. ej., analógico, digital, óptico, etc.). Como se emplea en el presente documento, el término "información relacionada con un sujeto " se refiere a hechos o datos pertenecientes a un sujeto (p. ej., un ser humano, una planta o un animal). El término "información genómica" se refiere a información perteneciente a un genoma que incluye, pero no se limita a, secuencias de ácido nucleico, genes, porcentaje de metilación, frecuencias alélicas, niveles de expresión de ARN, expresión de proteínas, fenotipos correlacionados con genotipos, etc. "Información de frecuencia de alelos" se refiere a hechos o datos relacionados con frecuencias de alelos, que incluyen, pero no se limitan a, identidades de alelos, correlaciones estadísticas entre la presencia de un alelo y una característica de un sujeto (p. ej., un sujeto humano), la presencia o ausencia de un alelo en un individuo o población, el porcentaje de probabilidad de que un alelo esté presente en un individuo que tenga una o más características concretas, etc.

Descripción detallada

La invención se expone en las reivindicaciones adjuntas. Las realizaciones de la descripción que no caen dentro del alcance de dichas reivindicaciones se proporcionan únicamente con fines ilustrativos y no forman parte de la presente invención. En el presente documento se proporciona tecnología relacionada con la realización de ensayos para la detección y cuantificación de ADN, p. ej., ADN metilado. En particular, la tecnología se refiere a controles internos para tales ensayos de metilación.

La presente divulgación proporciona un marcador denominado "B3GALT6" para su uso como marcador de metilación y control interno. El gen de la p-actina (ACTB) se utiliza a menudo como diana de control interno en ensayos que detectan ADN metilado. Sin embargo, ACTB no contiene islas CpG metiladas y, por lo tanto, tras la conversión con bisulfito, pierde todos los restos de citosina, lo que da como resultado una secuencia altamente rica en AT que puede ser problemática para el diseño de cebadores y sondas (p. ej., para ensayos multiplex con ADN que tienen un mayor contenido de GC, se deben utilizar sondas y cebadores más largos para lograr el mismo rango de Tm para ACTB, y la complejidad de secuencia reducida de ACTB convertido aumenta el riesgo de reactividad cruzada de cebadores y sondas con otro ADN en la reacción). Adicionalmente, se ha determinado que el ADN de ACTB sufre una conversión por bisulfito a un ritmo más rápido que los marcadores de ADN metilado, lo que dificulta la obtención de parámetros de conversión por bisulfito optimizados para el marcador de ACTB y los marcadores de ADN metilado en la misma muestra.

Durante el desarrollo de la presente tecnología, se determinó que B3GALT6 es ADN altamente metilado que se puede utilizar como un ADN de control alternativo. Durante el desarrollo de la tecnología, se determinó que el ADN de B3GALT6 se comporta de manera similar a los ADN marcadores metilados durante la conversión por bisulfito. Como las C metiladas no se convierten durante el tratamiento con bisulfito, el uso de un ADN metilado como ADN de control interno en lugar de la p-actina proporciona un control interno que mantiene la complejidad de su secuencia tras la conversión y que permite el uso de oligonucleótidos más cortos en los ensayos de detección de ADN, p. ej., PCR y/o ensayos de endonucleasa flap tales como el ensayo QuARTS descrito a continuación.

I. Genes de control metilados

En ensayos que detectan y cuantifican ADN rico en CpG metilado que ha sufrido una conversión por bisulfito, es habitual detectar también un gen de control presente en la misma muestra, verificando el gen de control la entrada de ADN en el ensayo independientemente de la fuente (p. ej., cáncer, normal, heces, tejido). Tal gen de control se utiliza, por ejemplo, para normalizar los datos del número de copias de ADN obtenidos en ensayos en diferentes muestras, para mostrar con precisión niveles de marcadores asociados a enfermedades más altos o más bajos muestra a muestra.

Para que un gen de normalización de un ensayo de metilación funcione mejor, debe cumplir con varios criterios. Un gen normalizador ideal, por ejemplo: 1) debería estar igualmente presente tanto en el tejido normal como en el enfermo; 2) debe tener aproximadamente el mismo contenido de GC que los genes/marcadores de prueba que se están analizando (p. ej., marcadores de ADN en los que la hipermetilación es un indicador de un estado de enfermedad); 3) deben reaccionar de la misma manera que los genes/marcadores de prueba a los tratamientos de muestras de precuantificación (pre-PCR), tales como la conversión por bisulfito; y 4) debe tener una eficiencia de amplificación por PCR similar a la de los genes/marcadores de prueba que se están analizando.

El gen de la p-actina, un gen que se utiliza típicamente como gen de normalización para la detección de ADN marcadores metilados, no tiene el mismo contenido de GC y metilación de CpG que los marcadores de metilación asociados con enfermedades tales como el cáncer y el adenoma (p. ej., vimentina, septina 9, NDRG4, BMP3), por lo que no se comporta como tales ADN marcadores en la conversión por bisulfito antes de la PCR o en la amplificación por PCR.

Los experimentos descritos en el presente documento identificaron genes (p. ej., B3GALT6) que están altamente metilados en tejido normal y canceroso y en glóbulos blancos. Los genes descritos en el presente documento se utilizan para normalizar los niveles de marcadores en pacientes y muestras.

II. Ensayos de detección de metilación

Los marcadores descritos en el presente documento (p. ej., B3GALT6, en particular), encuentran uso en una variedad de ensayos de detección de metilación como reactivos de normalización e indicadores de estados patológicos.

El método utilizado con más frecuencia para analizar un ácido nucleico en busca de la presencia de 5-metilcitosina se basa en el método de bisulfito descrito por Frommer, et al. para la detección de 5-metilcitosinas en el ADN (Frommer et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1827-31) o variaciones de los mismos. El método del bisulfito para mapear las 5-metilcitosinas se basa en la observación de que la citosina, pero no la 5-metilcitosina, reacciona con el ion hidrogenosulfito (también conocido como bisulfito). La reacción generalmente se realiza de acuerdo con los siguientes etapas: primero, la citosina reacciona con el hidrogenosulfito para formar una citosina sulfonada. A continuación, la desaminación espontánea del intermedio de reacción sulfonado da como resultado un uracilo sulfonado. Finalmente, el uracilo sulfonado se desulfona en condiciones alcalinas para formar uracilo. La detección es posible ya que las bases de uracilo se emparejan con adenina (comportándose así como timina), mientras que las bases de 5-metilcitosina se emparejan con guanina (comportándose así como citosina). Esto hace posible la discriminación de citosinas metiladas de citosinas no metiladas mediante, p. ej., secuenciación genómica por bisulfito (Grigg G y Clark S, Bioessays (1994) 16: 431-36; Grigg G, DNA Sec. (1996) 6: 189-98), PCR específica de metilación (MSP) como se divulga, p. ej., en la Patente de Estados Unidos Núm. 5.786.146, o utilizando un ensayo que comprende la escisión de la sonda específica de secuencia, p. ej., un ensayo de endonucleasa flap QuARTS (véase, p. ej., Zou et al. (2010) "Sensitive quantification of methylated markers with a novel methylation specific technology" Clin Chem 56 : A199; Patente de Estados Unidos Núm. 8.361.720, y Solicitudes de Patente de Estados Unidos Núm. de Ser.; 12/946.745; 12/946.752, y 61/705.603).

Algunas tecnologías convencionales están relacionadas con métodos que comprenden encerrar el ADN que se debe analizar en una matriz de agarosa, evitando así la difusión y renaturalización del ADN (el bisulfito solo reacciona con el ADN de hebra sencilla), y reemplazando las etapas de precipitación y purificación por una diálisis rápida (Olek A et al. (1996) "A modified and improved method for bisulfite based cytosine methylation analysis" Nucleic Acids Res. 24 : 5064-6). Por tanto, es posible analizar células individuales para determinar el estado de metilación, lo que ilustra la utilidad y sensibilidad del método. Rein, T. et al. (1998) Nucleic Acids Res. 26 : 2255 proporcionan una descripción general de los métodos convencionales para detectar 5-metilcitosina.

La técnica del bisulfito generalmente implica amplificar fragmentos cortos y específicos de un ácido nucleico conocido después de un tratamiento con bisulfito, y a continuación, analizar el producto mediante secuenciación (Olek y Walter (1997) Nat. Genet. 17: 275-6) o una reacción de extensión del cebador (Gonzalgo y Jones (1997) Nucleic Acids Res.

25 : 2529-31; documento w O 95/00669; Patente de Estados Unidos Núm. 6.251.594) para analizar las posiciones individuales de citosina. Algunos métodos utilizan digestión enzimática (Xiong y Laird (1997) Nucleic Acids Res. 25: 2532-4). La detección por hibridación también se ha descrito en la técnica (Olek et al., documento WO 99/28498). Además, se ha descrito el uso de la técnica del bisulfito para la detección de metilación con respecto a genes individuales (Grigg y Clark (1994) Bioessays 16: 431-6; Zeschnigk et al. (1997) Hum Mol Genet. 6 : 387-95; Feil et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22: 695; Martin et al. (1995) Gene 157: 261-4; documento WO 9746705; documento WO 9515373).

Se pueden utilizar varios procedimientos de ensayo de metilación junto con el tratamiento con bisulfito de acuerdo con la presente tecnología. Estos ensayos permiten la determinación del estado de metilación de uno o una pluralidad de dinucleótidos CpG (p. ej., islas CpG) dentro de una secuencia de ácido nucleico. Tales ensayos implican, entre otras técnicas, secuenciación de ácido nucleico tratado con bisulfito, PCR (para amplificación específica de secuencia), análisis de transferencia Southern y uso de enzimas de restricción sensibles a la metilación.

Por ejemplo, la secuenciación genómica se ha simplificado para el análisis de patrones de metilación y distribuciones de 5-metilcitosina mediante el uso de tratamiento con bisulfito (Frommer et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 1827-1831). Además, la digestión con enzimas de restricción de productos de PCR amplificados a partir de ADN convertido por bisulfito se utiliza para evaluar el estado de metilación p. ej., como describen Sadri y Hornsby (1997) Nucí. Acids Res. 24 : 5058-5059 o como se incorpora en el método conocido como COBRA (Análisis de Restricción con Bisulfito Combinado) (Xiong y Laird (1997) Nucleic Acids Res. 25 : 2532-2534).

El análisis COBRA™ es un ensayo de metilación cuantitativo útil para determinar los niveles de metilación del ADN en loci específicos en pequeñas cantidades de ADN genómico (Xiong y Laird, Nucleic Acids Res. 25: 2532-2534, 1997). Brevemente, la digestión con enzimas de restricción se utiliza para revelar diferencias de secuencia dependientes de metilación en productos de PCR de ADN tratado con bisulfito de sodio. Las diferencias de secuencia dependientes de la metilación se introducen primero en el ADN genómico mediante un tratamiento convencional con bisulfito de acuerdo con el procedimiento descrito por Frommer et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1827-1831,1992). La amplificación por PCR del ADN convertido por bisulfito se realiza a continuación, utilizando cebadores específicos para las islas CpG de interés, seguido de digestión con endonucleasas de restricción, electroforesis en gel y detección utilizando sondas de hibridación marcadas específicas. Los niveles de metilación en la muestra de ADN original están representados por las cantidades relativas de producto de PCR digerido y no digerido de una manera linealmente cuantitativa en un amplio espectro de niveles de metilación de ADN. Además, esta técnica se puede aplicar de forma fiable al ADN obtenido a partir de muestras de tejido incluidas en parafina microdi seccionadas.

Los reactivos típicos (p. ej., como se puede encontrar en un kit típico basado en COBRA™) para el análisis de COBRA™ pueden incluir, pero sin limitarse a: cebadores de PCR para loci específicos (p. ej., genes específicos, marcadores, regiones de genes, regiones de marcadores, secuencia de ADN tratada con bisulfito, isla CpG, etc.,); enzima de restricción y tampón apropiado; oligonucleótido de hibridación de genes; oligonucleótido de hibridación de control; kit de marcaje de quinasa para sonda de oligonucleótidos; y nucleótidos marcados. Además, los reactivos de conversión de bisulfito pueden incluir: tampón de desnaturalización de ADN; tampón de sulfonación; reactivos o kits de recuperación de ADN (p. ej., precipitación, ultrafiltración, columna de afinidad); tampón de desulfonación; y componentes de recuperación de ADN.

Ensayos tales como "MethyLight™" (una técnica de PCR en tiempo real basada en fluorescencia) (Eads et al., Cancer Res. 59: 2302-2306, 1999), reacciones de Ms-SNuPE™ (Extensión de Cebador de Nucleótido Único sensible a Metilación) (Gonzalgo y Jones, Nucleic Acids Res. 25: 2529-2531, 1997), PCR específica de metilación ("MSP"; Herman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9821-9826, 1996; Patente de Estados Unidos Núm. 5.786.146), y amplificación de isla CpG metilada ("MCA"; Toyota et al., Cancer Res. 59: 2307-12, 1999) se utilizan solos o combinados con uno o más de estos métodos.

La técnica del ensayo "HeavyMethyl™" es un método cuantitativo para evaluar las diferencias de metilación basándose en la amplificación específica de metilación del ADN tratado con bisulfito. Las sondas de bloqueo específicas de metilación ("bloqueadores") que cubren las posiciones de CpG entre, o cubiertas por, los cebadores de amplificación permiten la amplificación selectiva específica de metilación de una muestra de ácido nucleico.

El término ensayo "HeavyMethyl™ MethyLight™" se refiere a un ensayo HeavyMethyl™ MethyLight™, que es una variación del ensayo MethyLight™, en donde el ensayo MethyLight™ se combina con sondas de bloqueo específicas de metilación que cubren las posiciones CpG entre los cebadores de amplificación. El ensayo HeavyMethyl™ también se puede utilizar combinado con cebadores de amplificación específicos de metilación.

Los reactivos típicos (p. ej., como se puede encontrar en un kit típico basado en MethyLight™) para el análisis HeavyMethyl™ pueden incluir, pero sin limitarse a: cebadores de PCR para loci específicos (p. ej., genes específicos, marcadores, regiones de genes, regiones de marcadores, secuencia de ADN tratada con bisulfito, isla CpG o secuencia de ADN tratada con bisulfito o isla CpG, etc.); oligonucleótidos de bloqueo; tampones y desoxinucleótidos de PCR optimizados; y polimerasa Taq.

La MSP (PCR específica de metilación) permite evaluar el estado de metilación de prácticamente cualquier grupo de sitios CpG dentro de una isla CpG, independientemente del uso de enzimas de restricción sensibles a la metilación (Herman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. Us a 93: 9821-9826, 1996; Patente de Estados Unidos Núm. 5.786.146). Brevemente, el ADN se modifica con bisulfito de sodio, que convierte las citosinas no metiladas, pero no las metiladas, en uracilo, y los productos se amplifican posteriormente con cebadores específicos para ADN metilado frente a ADN no metilado. La MSP requiere solo pequeñas cantidades de ADN, es sensible a alelos metilados al 0,1% de un locus de isla CpG dado y se puede realizar en ADN extraído de muestras incluidas en parafina. Los reactivos típicos (p. ej., como se puede encontrar en un kit típico basado en MSP) para el análisis de MSP pueden incluir, pero sin limitarse a: cebadores de PCR metilados y no metilados para loci específicos (p. ej., genes específicos, marcadores, regiones de genes, regiones de marcadores, secuencia de ADN tratada con bisulfito, isla CpG, etc.,); tampones y desoxinucleótidos de PCR optimizados y sondas específicas.

El ensayo MethyLight™ es un ensayo de metilación cuantitativo de alto rendimiento que utiliza PCR en tiempo real basada en fluorescencia (p. ej., TaqMan®) que no requiere manipulaciones adicionales después del etapa de PCR (Eads et al., Cancer Res. 59: 2302-2306, 1999). Brevemente, el proceso MethyLight™ comienza con una muestra mixta de ADN genómico que se convierte, en una reacción con bisulfito de sodio, en un grupo mixto de diferencias de secuencia dependientes de metilación según procedimientos convencionales (el procedimiento con bisulfito convierte los restos de citosina no metilados en uracilo). A continuación, se realiza una PCR basada en fluorescencia en una reacción "sesgada", p. ej., con cebadores de PCR que se solapan con dinucleótidos CpG conocidos. La discriminación de secuencia se produce tanto a nivel del proceso de amplificación como a nivel del proceso de detección de fluorescencia.

El ensayo MethyLight™ se utiliza como prueba cuantitativa de patrones de metilación en un ácido nucleico, p. ej., una muestra de ADN genómico, en donde la discriminación de secuencia se produce al nivel de la hibridación de la sonda. En una versión cuantitativa, la reacción de PCR proporciona una amplificación específica de metilación en presencia de una sonda fluorescente que se solapa con un sitio de metilación putativo concreto. Se proporciona un control no sesgado de la cantidad de ADN de entrada mediante una reacción en la que ni los cebadores ni la sonda se superponen a ningún dinucleótido CpG. Alternativamente, se logra una prueba cualitativa de metilación genómica sondeando el grupo de PCR sesgado con oligonucleótidos de control que no cubren los sitios de metilación conocidos (p. ej., una versión basada en fluorescencia de las técnicas HeavyMethyl™ y MSP) o con oligonucleótidos que cubren sitios potenciales de metilación.

El proceso MethyLight™ se utiliza con cualquier sonda adecuada (p. ej. una sonda "TaqMan®", una sonda Lightcycler®, etc.,). Por ejemplo, en algunas aplicaciones, el ADN genómico de doble hebra se trata con bisulfito de sodio y se somete a uno de los dos conjuntos de reacciones de PCR utilizando sondas TaqMan®, p. ej., con cebadores de MSP y/u oligonucleótidos bloqueadores HeavyMethyl y una sonda TaqMan®. La sonda TaqMan® está marcada de forma dual con moléculas fluorescentes "informadoras" y "extintoras" y está diseñada para ser específica para una región de contenido de GC relativamente alto, de modo que se derrita a una temperatura aproximadamente 10°C más alta en el ciclo de PCR que los cebadores directos o inversos. Esto permite que la sonda TaqMan® permanezca completamente hibridada durante el etapa de reasociación/extensión de PCR. A medida que la polimerasa Taq sintetiza enzimáticamente una nueva hebra durante la PCR, eventualmente llegará a la sonda TaqMan® reasociada. La actividad endonucleasa 5’ a 3' de la polimerasa Taq desplazará a continuación la sonda TaqMan® al digerirla para liberar la molécula indicadora fluorescente para la detección cuantitativa de su señal ahora sin extinguir utilizando un sistema de detección fluorescente en tiempo real.

Los reactivos típicos (p. ej., como se puede encontrar en un kit típico basado en MethyLight™) para el análisis MethyLight™ pueden incluir, pero sin limitarse a: cebadores de PCR para loci específicos (p. ej., genes específicos, marcadores, regiones de genes, regiones de marcadores, secuencia de ADN tratada con bisulfito, isla CpG, etc.); Sondas TaqMan® o Lightcycler®; tampones y desoxinucleótidos de PCR optimizados; y polimerasa Taq.

El ensayo QM™ (metilación cuantitativa) es una prueba cuantitativa alternativa para patrones de metilación en muestras de ADN genómico, en donde la discriminación de secuencia se produce al nivel de hibridación de la sonda. En esta versión cuantitativa, la reacción de PCR proporciona una amplificación no sesgada en presencia de una sonda fluorescente que se solapa con un sitio de metilación putativo concreto. Se proporciona un control no sesgado de la cantidad de ADN de entrada mediante una reacción en la que ni los cebadores ni la sonda se superponen a ningún dinucleótido CpG. Alternativamente, se logra una prueba cualitativa de metilación genómica sondeando el grupo de PCR sesgado con oligonucleótidos de control que no cubren los sitios de metilación conocidos (una versión basada en fluorescencia de las técnicas HeavyMethyl™ y MSP) o con oligonucleótidos que cubren los sitios de metilación potenciales.

El proceso QM ™ se puede utilizar con cualquier sonda adecuada, p. ej., Sondas "TaqMan®", sondas Lightcycler®, en proceso de amplificación. Por ejemplo, el ADN genómico de doble hebra se trata con bisulfito de sodio y se somete a cebadores no sesgados y la sonda TaqMan®. La sonda TaqMan® está marcada de forma dual con moléculas fluorescentes "informadoras" y "extintoras", y está diseñada para ser específica para una región de contenido de GC relativamente alto, de modo que se derrita a una temperatura aproximadamente 10°C más alta en el ciclo de PCR que los cebadores directos o inversos. Esto permite que la sonda TaqMan® permanezca completamente hibridada durante el etapa de reasociación/extensión de PCR. A medida que la polimerasa Taq sintetiza enzimáticamente una nueva hebra durante la PCR, eventualmente llegará a la sonda TaqMan® hibridada. La actividad de la endonucleasa 5’ a 3' de la polimerasa Taq desplazará la sonda TaqMan® al digerirla para liberar la molécula indicadora fluorescente para la detección cuantitativa de su señal ahora sin extinguir utilizando un sistema de detección fluorescente en tiempo real. Los reactivos típicos (p. ej., como se puede encontrar en un kit típico basado en QM™) para el análisis QM ™ pueden incluir, pero sin limitarse a: cebadores de PCR para loci específicos (p. ej., genes específicos, marcadores, regiones de genes, regiones de marcadores, secuencia de ADN tratada con bisulfito, isla CpG, etc.); Sondas TaqMan® o Lightcycler®; tampones y desoxinucleótidos de PCR optimizados; y polimerasa Taq.

La técnica Ms-SNuPE™ es un método cuantitativo para evaluar las diferencias de metilación en sitios CpG específicos según el tratamiento con bisulfito del ADN, seguido de la extensión del cebador de un solo nucleótido (Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25: 2529-2531, 1997). Brevemente, el ADN genómico se hace reaccionar con bisulfito de sodio para convertir la citosina no metilada en uracilo sin modificar la 5-metilcitosina. A continuación, se realiza la amplificación de la secuencia diana deseada utilizando cebadores de PCR específicos para ADN convertido por bisulfito, y el producto resultante se aísla y se utiliza como molde para el análisis de metilación en el sitio CpG de interés. Se pueden analizar pequeñas cantidades de ADN (p. ej., secciones de patología microdiseccionadas) y evitar la utilización de enzimas de restricción para determinar el estatus de metilación en los sitios CpG.

Los reactivos típicos (p. ej., como se puede encontrar en un kit típico basado en Ms-SNuPE™) para el análisis Ms-SNuPE™ pueden incluir, pero sin limitarse a: cebadores de PCR para loci específicos (p. ej., genes específicos, marcadores, regiones de genes, regiones de marcadores, secuencia de ADN tratada con bisulfito, isla CpG, etc.); tampones y desoxinucleótidos de PCR optimizados; kit de extracción en gel; cebadores de control positivo; cebadores de Ms-SNuPE™ para loci específicos; tampón de reacción (para la reacción Ms-SNuPE); y nucleótidos marcados. Además, los reactivos de conversión de bisulfito pueden incluir: tampón de desnaturalización de ADN; tampón de sulfonación; reactivos o kit de recuperación de ADN (p. ej., precipitación, ultrafiltración, columna de afinidad); tampón de desulfonación; y componentes de recuperación de ADN.

La Secuenciación por Bisulfito de Representación Reducida (RRBS) comienza con el tratamiento con bisulfito del ácido nucleico para convertir todas las citosinas no metiladas en uracilo, seguido de la digestión con enzimas de restricción (p. ej., mediante una enzima que reconoce un sitio que incluye una secuencia CG tal como MspI) y la secuenciación completa de los fragmentos después de acoplarse a un ligando adaptador. La elección de la enzima de restricción enriquece los fragmentos para las regiones densas de CpG, reduciendo el número de secuencias redundantes que pueden mapear en múltiples posiciones de genes durante el análisis. Como tal, la RRBS reduce la complejidad de la muestra de ácido nucleico seleccionando un subconjunto (p. ej., mediante selección de tamaño utilizando electroforesis en gel preparativa) de fragmentos de restricción para secuenciación. A diferencia de la secuenciación por bisulfito de genoma completo, cada fragmento producido por la digestión con enzimas de restricción contiene información de metilación del ADN para al menos un dinucleótido CpG. Como tal, la RRBS enriquece la muestra en promotores, islas CpG y otras características genómicas con una alta frecuencia de sitios de corte de enzimas de restricción en estas regiones y, por lo tanto, proporciona un ensayo para evaluar el estado de metilación de uno o más loci genómicos.

Un protocolo típico para RRBS comprende las etapas de digerir una muestra de ácido nucleico con una enzima de restricción tal como MspI, rellenar salientes y colas de A, adaptadores de ligación, conversión por bisulfito y PCR. Véanse, p. ej., et al. (2005) "Genome-scale DNA methylation mapping of clinical samples at single-nucleotide resolution" Nat Methods 7 : 133-6; Meissner et al. (2005) "Reduced representation bisulfite sequencing for comparative high-resolution DNA methylation analysis" Nucleic Acids Res. 33: 5868-77.

Se puede utilizar un ensayo cuantitativo de amplificación de señal y diana en tiempo real específico de alelo (QuARTS) para evaluar el estado de metilación. Se producen tres reacciones secuencialmente en cada ensayo QuARTS, incluida la amplificación (reacción 1) y la escisión de la sonda diana (reacción 2) en la reacción primaria; y escisión de FRET y generación de señal fluorescente (reacción 3) en la reacción secundaria. Cuando el ácido nucleico diana se amplifica con cebadores específicos, una sonda de detección específica con una secuencia flap se une libremente al amplicón. La presencia del oligonucleótido invasivo específico en el sitio de unión de la diana hace que una nucleasa 5’, p. ej., una endonucleasa FEN-1, libere la secuencia flap cortando entre la sonda de detección y la secuencia flap. La secuencia flap es complementaria a una porción no en horquilla de un casete FRET correspondiente. Por consiguiente, la secuencia flap funciona como un oligonucleótido invasivo en el casete FRET y efectúa una escisión entre el fluoróforo del casete FRET y un extintor, que produce una señal fluorescente. La reacción de escisión puede cortar múltiples sondas por diana y así liberar múltiples fluoróforos por flap, proporcionando una amplificación exponencial de la señal. QuARTS puede detectar múltiples dianas en un solo pocillo de reacción mediante el uso de casetes FRET con diferentes tintes. Véase, p. ej., Zou et al. (2010) "Sensitive quantification of methylated markers with a novel methylation specific technology" Clin Chem 56: A199).

El término "reactivo de bisulfito" se refiere a un reactivo que comprende bisulfito, disulfito, hidrogenosulfito o combinaciones de los mismos, útil como se describe en el presente documento para distinguir entre secuencias de dinucleótidos CpG metilados y no metilados. Los métodos de dicho tratamiento son conocidos en la técnica (p. ej., documento PCT/EP2004/011715 y documento WO 2013/116375). El tratamiento con bisulfito puede realizarse en presencia de disolventes desnaturalizantes tales como, pero sin limitarse a, n-alquilenglicol o dimetiléter de dietilenglicol (DME), o en presencia de dioxano o derivados de dioxano. Los disolventes desnaturalizantes se pueden utilizar a concentraciones entre 1% y 35% (v/v). La reacción del bisulfito se puede llevar a cabo en presencia de captadores tales como, pero sin limitarse a, derivados de cromano, p. ej., ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico o ácido trihidroxibenzoico y derivados del mismo, p. ej., ácido gálico (véase: documento PCT/EP2004/011715). La reacción con bisulfito puede comprender el tratamiento con hidrogenosulfito de amonio, p. ej., como se describe en el documento WO 2013/116375.

El ADN tratado con bisulfito se puede purificar antes de la cuantificación. Esto se puede llevar a cabo por cualquier medio conocido en la técnica, tal como, pero sin limitarse a, ultrafiltración, p. ej., mediante columnas Microcon™ (fabricadas por Millipore™). La purificación se lleva a cabo de acuerdo con un protocolo del fabricante modificado (véase, p. ej., documento PCT/EP2004/011715). El ADN tratado con bisulfito se puede unir a un soporte sólido, p. ej., una cuenta magnética, y se producen la desulfonación y el lavado mientras el ADN está unido al soporte. Se proporcionan tales ejemplos, p. ej., en el documento WO 2013/116375. El ADN unido al soporte puede estar listo para un ensayo de metilación inmediatamente después de la desulfonación y el lavado del soporte. El ADN desulfonado se puede eluir del soporte antes del ensayo.

Los fragmentos del ADN tratado se pueden amplificar utilizando conjuntos de oligonucleótidos cebadores de acuerdo con la presente divulgación (p. ej., véase la Tabla 2) y una enzima de amplificación. La amplificación de varios segmentos de ADN se puede realizar simultáneamente en un recipiente de reacción. Típicamente, la amplificación se lleva a cabo mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

El estatus de metilación de las posiciones de CpG dentro o cerca de un marcador se puede detectar mediante el uso de oligonucleótidos cebadores específicos de metilación. Esta técnica (MSP) ha sido descrita, p. ej., en las Patentes de Estados Unidos Núm. 5.786.146 y 6.265.171 de Herman. El uso de cebadores específicos del estatus de metilación para la amplificación de ADN tratado con bisulfito permite la diferenciación entre ácidos nucleicos metilados y no metilados. Los pares de cebadores MSP contienen al menos un cebador que hibrida con un dinucleótido CpG tratado con bisulfito. Por tanto, la secuencia de dichos cebadores comprende al menos un dinucleótido CpG. Los cebadores de MSP específicos para ADN no metilado contienen una "T" en la posición correspondiente a la posición C en el CpG.

Los fragmentos obtenidos mediante la amplificación pueden portar un marcador detectable directa o indirectamente. Los marcadores pueden ser marcadores fluorescentes, radionúclidos o fragmentos de moléculas desprendibles que tienen una masa típica que se puede detectar en un espectrómetro de masas. Cuando dichos marcadores son marcadores de masa, se puede hacer que los amplicones marcados tengan una sola carga neta positiva o negativa, lo que permite una mejor detectabilidad en el espectrómetro de masas. La detección se puede realizar y visualizar mediante, p. ej., espectrometría de masas por ionización/desorción láser asistida por matriz (MALDI) o mediante espectrometría de masas por pulverización de electrones (ESI).

Se conocen en la técnica métodos para aislar ADN adecuados para estas tecnologías de ensayo. En particular, puede estar comprendido el aislamiento de ácidos nucleicos como se describe en la Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. de Ser. 13/470.251 ("Isolation of Nucleic Acids", publicado como documento US 2012/0288868).

Los marcadores descritos en el presente documento pueden encontrar uso en ensayos QuARTS realizados en muestras de heces. Se pueden proporcionar métodos para producir muestras de ADN y, en particular, los métodos para producir muestras de ADN que comprenden ácidos nucleicos altamente purificados y de baja abundancia en un pequeño volumen (p. ej., menos de 100, menos de 60 microlitros) y que están sustancial y/o efectivamente libres de sustancias que inhiben los ensayos utilizados para analizar las muestras de ADN (p. ej., PCR, INVASOR, ensayos QuARTS, etc.). Tales muestras de ADN encuentran uso en ensayos de diagnóstico que detectan cualitativamente la presencia o miden cuantitativamente la actividad, expresión o cantidad de un gen, una variante de gen (p. ej., un alelo), o una modificación genética (p. ej., metilación) presente en una muestra tomada de un paciente. Por ejemplo, algunos cánceres se correlacionan con la presencia de alelos mutantes particulares o estados de metilación particulares y, por tanto, la detección y/o cuantificación de tales alelos mutantes o estados de metilación tienen valor predictivo en el diagnóstico y tratamiento del cáncer.

Muchos marcadores genéticos valiosos están presentes en cantidades extremadamente bajas en las muestras y muchos de los eventos que producen tales marcadores son raros. En consecuencia, incluso los métodos de detección sensibles, tales como la PCR, requieren una gran cantidad de ADN para proporcionar una diana de baja abundancia suficiente para alcanzar o superar el umbral de detección del ensayo. Por otra parte, la presencia de cantidades incluso bajas de sustancias inhibidoras compromete la exactitud y precisión de estos ensayos dirigidos a detectar cantidades tan bajas de una diana. Por consiguiente, en el presente documento se proporcionan métodos que proporcionan la gestión necesaria del volumen y la concentración para producir tales muestras de ADN.

Algunas muestras biológicas, tales como las muestras de heces, contienen una amplia variedad de compuestos diferentes que inhiben la PCR. Por tanto, los procedimientos de extracción de ADN incluyen métodos para eliminar y/o inactivar inhibidores de la PCR. Como tal, el procesamiento y la preparación de muestras y en particular, pero no exclusivamente, los métodos, sistemas y kits para eliminar inhibidores de ensayo de muestras que comprenden ácidos nucleicos se describen en el Ejemplo 1.

La muestra puede comprender sangre, suero, plasma, secreciones gástricas, jugo pancreático, muestras de biopsia, p. ej., de cánceres gastrointestinales, pulmonares y de otro tipo, células microdiseccionadas de una biopsia, células desprendidas en el lumen y/o células recuperadas de las heces. El sujeto puede ser humano. La muestra puede incluir células, secreciones o tejidos de, por ejemplo, pulmón, hígado, conductos biliares, páncreas, estómago, colon, recto, esófago, intestino delgado, apéndice, duodeno, pólipos, vesícula biliar, ano y/o peritoneo. La muestra puede comprender líquido celular, ascitis, orina, heces, líquido pancreático, líquido obtenido durante la endoscopia, sangre, moco o saliva. La muestra puede ser una muestra de heces.

Tales muestras se pueden obtener por cualquier número de medios conocidos en la técnica, como será evidente para el experto en la materia. Por ejemplo, las muestras de orina y heces se pueden obtener fácilmente, mientras que las muestras de sangre, ascitis, suero o líquido pancreático se pueden obtener por vía parenteral utilizando una aguja y una jeringa, por ejemplo. Se pueden obtener muestras libres de células o sustancialmente libres de células sometiendo la muestra a diversos mecanismos conocidos por los expertos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, centrifugación y filtración. Aunque generalmente se prefiere que no se utilicen técnicas invasivas para obtener la muestra, aún puede ser preferible obtener muestras tales como productos homogeneizados de tejido, secciones de tejido y especímenes de biopsia. La tecnología no se limita a los métodos utilizados para preparar las muestras y proporcionar un ácido nucleico para la prueba. Por ejemplo, un ADN se puede aislar de una muestra de heces o de sangre o de una muestra de plasma utilizando captura directa de genes, p. ej., como se detalla en las Patentes de Estados Unidos Núm. 8.808.990 y 9.169.511, y en el documento WO 2012/155072, o mediante un método relacionado.

El análisis de marcadores se puede realizar por separado o simultáneamente con marcadores adicionales dentro de una muestra de prueba. Por ejemplo, se pueden combinar varios marcadores en una prueba para el procesamiento eficiente de múltiples muestras y para proporcionar potencialmente una mayor precisión de diagnóstico y/o pronóstico. Además, un experto en la técnica reconocería el valor de analizar múltiples muestras (por ejemplo, en puntos de tiempo sucesivos) del mismo sujeto. Tal prueba de muestras en serie puede permitir la identificación de cambios en los estados de metilación de los marcadores a lo largo del tiempo. Los cambios en el estado de metilación, así como la ausencia de cambios en el estado de metilación, pueden proporcionar información útil sobre el estado de la enfermedad que incluye, pero no se limita a, la identificación del tiempo aproximado desde el inicio del evento, la presencia y la cantidad de tejido recuperable, la idoneidad de las terapias con medicamentos, la efectividad de varias terapias y la identificación del resultado del sujeto, incluido el riesgo de eventos futuros.

El análisis de biomarcadores se puede realizar en una variedad de formatos físicos. Por ejemplo, el uso de placas de microtitulación o la automatización se pueden utilizar para facilitar el procesamiento de un gran número de muestras de prueba. Alternativamente, se podrían desarrollar formatos de muestra única para facilitar el tratamiento y el diagnóstico inmediatos de manera oportuna, por ejemplo, en el transporte ambulatorio o en la sala de emergencias.

La tecnología se puede proporcionar en forma de kit. Los kits pueden comprender composiciones, dispositivos, aparatos, etc. descrito en el presente documento, y las instrucciones de uso del kit. Tales instrucciones describen métodos apropiados para preparar un analito a partir de una muestra, p. ej., para recolectar una muestra y preparar un ácido nucleico a partir de la muestra. Los componentes individuales del kit están empaquetados en envases y embalajes adecuados (p. ej., viales, cajas, envases tipo burbuja, ampollas, frascos, botellas, tubos y similares) y los componentes se empaquetan juntos en un recipiente apropiado (p. ej., una caja o cajas) para un almacenamiento, envío y/o uso convenientes por parte del usuario del kit. Se entiende que los componentes líquidos (p. ej., un tampón) se puede proporcionar en forma liofilizada para ser reconstituida por el usuario. Los kits pueden incluir un control o referencia para evaluar, validar y/o asegurar el rendimiento del kit. Por ejemplo, un kit para analizar la cantidad de un ácido nucleico presente en una muestra puede incluir un control que comprende una concentración conocida del mismo u otro ácido nucleico para comparar y, por ejemplo, un reactivo de detección (p. ej., un cebador) específico para el ácido nucleico de control. Los kits son apropiados para su uso en un entorno clínico y, por ejemplo, para su uso en el hogar de un usuario. Los componentes de un kit pueden proporcionar las funcionalidades de un sistema para preparar una solución de ácido nucleico a partir de una muestra. El usuario puede proporcionar ciertos componentes del sistema.

III. Otras aplicaciones

Los ensayos de diagnóstico pueden identificar la presencia de una enfermedad o afección en un individuo. La enfermedad puede ser cáncer (p. ej., cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer del sistema gastrointestinal).

La presente divulgación no se limita a marcadores particulares. Se pueden utilizar marcadores cuya metilación aberrante esté asociada con una neoplasia (p. ej., uno o más de vimentina, septina 9, NDRG4). Un ensayo puede comprender adicionalmente la detección de genes KRAS mutados (Véase p. ej., el Ejemplo 1). Los ensayos pueden comprender adicionalmente la detección de hemoglobina en muestras de heces (Véase p. ej., el Ejemplo 1).

La tecnología se relaciona con un método para tratar a un paciente (p. ej., un paciente con cáncer, con cáncer en estadio temprano o que puede desarrollar cáncer), el método comprende determinar el estado de metilación de uno o más marcadores como se proporciona en el presente documento y administrar un tratamiento al paciente basado en los resultados de determinar el estado de metilación. El tratamiento puede ser la administración de un compuesto farmacéutico, una vacuna, la realización de una cirugía, la obtención de imágenes del paciente, la realización de otra prueba. Preferiblemente, dicho uso es en un método de escrutinio clínico, un método de evaluación del pronóstico, un método de seguimiento de los resultados de la terapia, un método para identificar a los pacientes con mayor probabilidad de responder a un tratamiento terapéutico particular, un método de obtención de imágenes de un paciente o sujeto y un método para la detección y el desarrollo de fármacos.

Se proporciona un método para diagnosticar un cáncer en un sujeto. Los términos "diagnosticar " y "diagnóstico" como se emplean en el presente documento se refieren a métodos mediante los cuales el experto en la técnica puede estimar e incluso determinar si un sujeto padece una enfermedad o afección determinadas o puede desarrollar una enfermedad o afección determinadas en el futuro. El experto en la técnica a menudo realiza un diagnóstico basándose en uno o más indicadores de diagnóstico, tales como por ejemplo un biomarcador (p. ej., los descritos en el presente documento), cuyo estado de metilación es indicativo de la presencia, gravedad o ausencia de la afección.

Junto con el diagnóstico, el pronóstico clínico del cáncer se relaciona con la determinación de la agresividad del cáncer y la probabilidad de recurrencia del tumor para planificar la terapia más eficaz. Si se puede realizar un pronóstico más preciso o incluso se puede evaluar un riesgo potencial de desarrollar el cáncer, se puede elegir la terapia apropiada y, en algunos casos, una terapia menos severa para el paciente. La evaluación (p. ej., determinando el estado de metilación) de los biomarcadores del cáncer es útil para separar a los sujetos con buen pronóstico y/o bajo riesgo de desarrollar cáncer que no necesitarán terapia o necesitarán una terapia limitada de aquellos con más probabilidades de desarrollar cáncer o sufrir una recurrencia del cáncer que podrían beneficiarse de tratamientos más intensivos.

Como tal, "realizar un diagnóstico" o "diagnosticar", como se emplean en el presente documento, incluyen adicionalmente la determinación de un riesgo de desarrollar cáncer o la determinación de un pronóstico, que puede proporcionar la predicción de un resultado clínico (con o sin tratamiento médico), la selección de un tratamiento apropiado (o si el tratamiento sería efectivo), o el seguimiento de un tratamiento actual y potencialmente el cambio de tratamiento, basándose en la medida de los biomarcadores de diagnóstico (p. ej., los descritos en el presente documento) divulgados en el presente documento. Adicionalmente, se pueden realizar múltiples determinaciones de los biomarcadores a lo largo del tiempo para facilitar el diagnóstico y/o pronóstico. Se puede utilizar un cambio temporal en el biomarcador para predecir un resultado clínico, realizar un seguimiento de la progresión del cáncer y/o realizar un seguimiento de la eficacia de las terapias apropiadas dirigidas contra el cáncer. En tales circunstancias, se podría esperar ver un cambio en el estado de metilación de uno o más biomarcadores descritos en el presente documento (y potencialmente uno o más biomarcadores adicionales, si se realizara un seguimiento) en una muestra biológica a lo largo del tiempo durante el curso de una terapia eficaz.

La materia objeto de la presente divulgación proporciona además un método para determinar si iniciar o continuar la profilaxis o el tratamiento de un cáncer en un sujeto. El método puede comprender proporcionar una serie de muestras biológicas del sujeto durante un período de tiempo; analizar la serie de muestras biológicas para determinar un estado de metilación de al menos un biomarcador divulgado en el presente documento en cada una de las muestras biológicas; y comparar cualquier cambio medible en los estados de metilación de uno o más de los biomarcadores en cada una de las muestras biológicas. Cualquier cambio en los estados de metilación de los biomarcadores durante el período de tiempo se puede utilizar para predecir el riesgo de desarrollar cáncer, predecir el resultado clínico, determinar si iniciar o continuar la profilaxis o terapia del cáncer y si una terapia actual está tratando eficazmente el cáncer. Por ejemplo, se puede seleccionar un primer punto de tiempo antes del inicio de un tratamiento y se puede seleccionar un segundo punto de tiempo en algún momento después del inicio del tratamiento. Los estados de metilación se pueden medir en cada una de las muestras tomadas de diferentes puntos de tiempo y se pueden observar diferencias cualitativas y/o cuantitativas. Un cambio en los estados de metilación de los niveles de biomarcadores de las diferentes muestras puede correlacionarse con el riesgo de cáncer, el pronóstico, la determinación de la eficacia del tratamiento y/o la progresión del cáncer en el sujeto.

Los métodos y composiciones descritos en el presente documento pueden ser para el tratamiento o diagnóstico de una enfermedad en un estadio temprano, por ejemplo, antes de que aparezcan los síntomas de la enfermedad. Los métodos y composiciones descritos en el presente documento pueden ser para el tratamiento o diagnóstico de una enfermedad en un estadio clínico.

Como se señaló, se pueden realizar múltiples determinaciones de uno o más biomarcadores de diagnóstico o pronóstico, y se puede utilizar un cambio temporal en el marcador para determinar un diagnóstico o pronóstico. Por ejemplo, se puede determinar un marcador de diagnóstico en un momento inicial y nuevamente en un segundo momento. En tales circunstancias, un aumento en el marcador desde el momento inicial hasta el segundo momento puede ser diagnóstico de un tipo o gravedad particular de cáncer, o un pronóstico dado. Asimismo, una disminución del marcador desde el momento inicial hasta el segundo momento puede ser indicativa de un tipo o gravedad particular de cáncer, o de un pronóstico determinado. Además, el grado de cambio de uno o más marcadores puede estar relacionado con la gravedad del cáncer y los eventos adversos futuros. El experto en la técnica comprenderá que, si bien se pueden realizar mediciones comparativas del mismo biomarcador en múltiples puntos de tiempo, también se puede medir un biomarcador dado en un punto de tiempo y un segundo biomarcador en un segundo punto de tiempo, y una comparación de estos marcadores puede proporcionar información de diagnóstico.

Como se emplea en el presente documento, la frase "determinar el pronóstico" se refiere a métodos mediante los cuales el experto en la técnica puede predecir el curso o resultado de una afección en un sujeto. El término "pronóstico" no se refiere a la capacidad de predecir el curso o resultado de una afección con 100% de precisión, o incluso que es predeciblemente más o menos probable que se produzcan un curso o resultado dados basándose en el estado de metilación de un biomarcador. En cambio, el experto en la técnica comprenderá que el término "pronóstico" se refiere a una mayor probabilidad de que se produzcan un determinado curso o resultado; es decir, que es más probable que se produzcan un curso o resultado en un sujeto que presenta una afección determinada, en comparación con aquellos individuos que no presentan la afección. Por ejemplo, en individuos que no presentan la afección (p. ej., que tienen un estado de metilación normal de uno o más genes diana), la posibilidad de un resultado dado (p. ej., padecer un cáncer) puede ser muy baja.

Un análisis estadístico puede asociar un indicador de pronóstico con una predisposición a un resultado adverso. Por ejemplo, un estado de metilación diferente al de una muestra de control normal obtenida de un paciente que no tiene cáncer puede indicar que un sujeto tiene más probabilidades de sufrir un cáncer que los sujetos con un nivel que es más similar al estado de metilación en la muestra de control, según lo determinado por un nivel de significación estadística. Además, un cambio en el estado de metilación desde un nivel inicial (p. ej., "normal") puede reflejar el pronóstico del sujeto, y el grado de cambio en el estado de metilación puede estar relacionado con la gravedad de los eventos adversos. La significación estadística a menudo se determina comparando dos o más poblaciones y determinando un intervalo de confianza y/o un valor p. Véase, p. ej., Dowdy y Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, Nueva York, 1983. Los intervalos de confianza ilustrativos del presente tema son 90%, 95%, 97,5%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% y 99,99%, mientras que los valores p ilustrativos son 0,1, 0,05, 0,025, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001 y 0,0001.

Se puede establecer un grado umbral de cambio en el estado de metilación de un biomarcador de pronóstico o diagnóstico divulgado en el presente documento, y el grado de cambio en el estado de metilación del biomarcador en una muestra biológica se compara simplemente con el grado umbral de cambio en el estado de metilación. Un cambio de umbral preferido en el estado de metilación para los biomarcadores proporcionados en el presente documento es aproximadamente 5%, aproximadamente 10%, aproximadamente 15%, aproximadamente 20%, aproximadamente 25%, aproximadamente 30%, aproximadamente 50%, aproximadamente 75%, aproximadamente 100% y aproximadamente 150%. Se puede establecerse un "nomograma", mediante el cual un estado de metilación de un indicador de pronóstico o diagnóstico (biomarcador o combinación de biomarcadores) está directamente relacionado con una disposición asociada hacia un resultado dado. El experto en la técnica está familiarizado con el uso de tales nomogramas para relacionar dos valores numéricos con el entendimiento de que la incertidumbre en esta medición es la misma que la incertidumbre en la concentración del marcador ya que se hacen referencia a las mediciones de muestras individuales, no a promedios de población.

Se puede analizar una muestra de control al mismo tiempo que la muestra biológica, de modo que los resultados obtenidos de la muestra biológica puedan compararse con los resultados obtenidos de la muestra de control. Además, se contempla que se puedan proporcionar curvas patrón con las que se puedan comparar los resultados del ensayo para la muestra biológica. Tales curvas patrón presentan estados de metilación de un biomarcador en función de las unidades de ensayo, p. ej., intensidad de la señal fluorescente, si se utiliza una marca fluorescente. Utilizando muestras tomadas de múltiples donantes, se pueden proporcionar curvas patrón para controlar los estados de metilación de uno o más biomarcadores en tejido normal, así como para los niveles de "riesgo" de uno o más biomarcadores en tejido tomados de donantes con metaplasia o de donantes con cáncer. En ciertos métodos, se puede identificar que un sujeto tiene metaplasia al identificar un estado de metilación aberrante de uno o más marcadores proporcionados en el presente documento en una muestra biológica obtenida del sujeto. En otros métodos, la detección de un estado de metilación aberrante de uno o más de tales biomarcadores en una muestra biológica obtenida del sujeto puede dar como resultado que se identifique que el sujeto tiene cáncer.

Se puede diagnosticar que el sujeto tiene cáncer si, en comparación con un estado de metilación de control, hay una diferencia medible en el estado de metilación de al menos un biomarcador en la muestra. Por el contrario, cuando no se identifica ningún cambio en el estado de metilación en la muestra biológica, se puede identificar que el sujeto no tiene cáncer, no tiene riesgo de cáncer o tiene un riesgo bajo de cáncer. A este respecto, los sujetos que tienen cáncer o riesgo del mismo se pueden diferenciar de los sujetos que tienen un riesgo bajo o sustancialmente nulo de cáncer o riesgo del mismo. Aquellos sujetos que tienen riesgo de desarrollar un cáncer en particular, p. ej., cáncer gastrointestinal, se puede colocar en un programa de escrutinio más intensivo y/o regular, que incluye, p. ej., vigilancia endoscópica. Por otro lado, aquellos sujetos que tienen un riesgo bajo o sustancialmente nulo pueden evitar ser sometidos a métodos de detección invasivos tales como la endoscopia, hasta que un examen futuro, por ejemplo, un examen realizado de acuerdo con la tecnología actual, indique que ha aparecido un riesgo de cáncer en esos sujetos.

Como se mencionó anteriormente, dependiendo de los métodos de la presente tecnología, la detección de un cambio en el estado de metilación de uno o más biomarcadores puede ser una determinación cualitativa o puede ser una determinación cuantitativa. Como tal, el etapa de diagnostico de que un sujeto tiene, o está en riesgo de desarrollar, un cáncer indica que se realizan ciertas mediciones de umbral, p. ej., el estado de metilación de uno o más biomarcadores en la muestra biológica varía de un estado de metilación de control predeterminado. El estado de metilación de control puede ser cualquier estado de metilación detectable del biomarcador. En otros métodos en los que se analiza una muestra de control al mismo tiempo que la muestra biológica, el estado de metilación predeterminado puede ser el estado de metilación en la muestra de control. En otros métodos, el estado de metilación predeterminado puede basarse y/o identificarse mediante una curva patrón. En otros métodos, el estado de metilación predeterminado puede ser un estado específico o un intervalo de estados. Como tal, se puede elegir el estado de metilación predeterminado, dentro de límites aceptables que serán evidentes para los expertos en la técnica, basándose en parte en el método que se está practicando y la especificidad deseada, etc.

Adicionalmente, con respecto a los métodos de diagnóstico, un sujeto preferido es un sujeto vertebrado. Un vertebrado preferido tiene sangre caliente; un vertebrado de sangre caliente preferido es un mamífero. Un mamífero preferido es lo más preferiblemente un ser humano. Como se emplea en el presente documento, el término "sujeto" incluye tanto sujetos humanos como animales. Por lo tanto, en el presente documento se proporcionan usos terapéuticos veterinarios. Como tal, la presente tecnología proporciona el diagnóstico de mamíferos tales como seres humanos, así como de aquellos mamíferos de importancia debido a que están en peligro de extinción, tales como los tigres siberianos; de importancia económica, tales como los animales criados en granjas para el consumo humano; y/o animales de importancia social para los seres humanos, tales como los animales que se mantienen como mascotas o en zoológicos. Los ejemplos de tales animales incluyen, pero no se limitan a: carnívoros tales como gatos y perros; súidos, incluidos cochinillos, cerdos y jabalíes; rumiantes y/o ungulados tales como vacas, bueyes, ovejas, jirafas, ciervos, cabras, bisontes y camellos; pinnípedos y caballos. Por lo tanto, también se proporciona el diagnóstico y tratamiento de ganado, incluidos, pero sin limitarse a, cerdos domesticados, rumiantes, ungulados, caballos (incluidos caballos de carreras) y similares. La materia actualmente divulgada incluye adicionalmente un sistema para diagnosticar cánceres gastrointestinales, pulmonares u otros en un sujeto. El sistema se puede proporcionar, por ejemplo, como un kit comercial que se puede utilizar para escrutar un riesgo de cáncer o diagnosticar un cáncer en un sujeto del que se ha recogido una muestra biológica. Un sistema ilustrativo proporcionado de acuerdo con la presente tecnología incluye evaluar el estado de metilación de un marcador descrito en el presente documento.

Las composiciones, mezclas de reacción y/o métodos descritos en el presente documento pueden encontrar uso en una variedad de aplicaciones de diagnóstico, médicas, analíticas y de investigación, y la invención no debe verse como limitada a ningún campo o uso particular. Sin embargo, la presente invención encuentra uso en el análisis, detección, caracterización, etc. de ácido nucleico (p. ej., ácido nucleico humano, ácido nucleico diana, etc.) de las heces. Las composiciones, métodos, dispositivos, etc. para su uso como se describe en el presente documento se encuentran en, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Núm. 8.361.720; 7.981.612; 7.368.233; 6.964.846; 6.919.174; 6.849.403; 6.844.155; 6.818.404; 6.750.020; 6.586.177; 6.551.777; 6.503.718; 6.498.012; 6.482.595; 6.475.738; 6.428.964; 6.415.455; 6.406.857; 6.351.857; 6.303.304; 6.300.077; 6.280.947; 6.268.136; 6.203.993; 6.146.828; 6.143.529; 6.020.137; 5.952.178; 5.928.870; 5.888.778; 5.830.665; 5.741.650; 5.670.325. Las composiciones y métodos descritos en el presente documento pueden encontrar uso en, por ejemplo, un ensayo cuantitativo de amplificación de señal y diana en tiempo real específico de alelo (ensayo QuARTS), como se describe en, p. ej., las Patentes de Estados Unidos Núm. 8.361.720; 8.715.937; 8.916.344; y 9.212.392.

Experimentación

Durante el desarrollo de tecnología relacionada con las pruebas de cáncer, p. ej., cáncer de pulmón, los experimentos sugirieron que el uso de un ADN de control metilado proporcionaría una prueba mejorada. En consecuencia, en el presente documento se proporcionan tecnologías que comprenden dianas de control de ADN metilado que generan señales específicas cuando se procesan y detectan en paralelo con dianas experimentales (p. ej., genes marcadores metilados) en una muestra (p. ej., de un paciente). En particular, los controles proporcionados en el presente documento comprenden varias dianas de ácido nucleico que se extraen de una muestra en paralelo con uno o más ADN marcadores, que se convierten durante la conversión con bisulfito y que presentan una secuencia convertida para la detección mediante ensayos de detección de ácido nucleico. p. ej., ensayos de metilación QuARTS.

Ejemplo 1

Métodos de preparación de muestras

Métodos de aislamiento de ADN y ensayo QUARTS

A continuación se proporciona un método ilustrativo para el aislamiento de ADN antes del análisis, y un ensayo QUARTS ilustrativo, tal como se puede utilizar de acuerdo con la tecnología. En este ejemplo se describe la aplicación de la tecnología QuARTS al ADN de heces y varias muestras de tejido, pero la tecnología se aplica fácilmente a otras muestras de ácido nucleico, p. ej., como se muestra en otros ejemplos.

Opcionalmente, se puede añadir ADN de pez cebra, p. ej., ADN sintético a las muestras como se describe en el presente documento como un control de ejecución para el aislamiento, la conversión por bisulfito y/o el ensayo de detección de ADN. Por ejemplo, se pueden añadir 100 gl de 120 copias/gL de ADN sintético de pez cebra metilado en 0,4 ng/gl de diluyente de ADN de pez (ADN genómico a granel aislado de salmón, bacalao y/o arenque, como se describe, p. ej., en la Patente de Estados Unidos Núm. 9.212.392) a una muestra, p. ej., una muestra de plasma, antes de la adición de un tampón de lisis, antes o después de la adición de proteinasa K, etc. y detectar junto con los ADN marcadores y de referencia.

Recolección de ADN diana de muestras de heces

Las heces completas se recogen en cubos de plástico. Se añade un tampón conservante, p. ej., EDTA 150 mM, Tris-Cl 500 mM y NaCl 10 mM, (pH 9,0) a las heces, p. ej., aproximadamente 4 ml por gramo de heces, y las heces tamponadas se pueden utilizar directamente o guardar a -80°C.

Procedimiento ilustrativo para el aislamiento de ácidos nucleicos diana de muestras de heces:

1. Se homogeneiza una muestra de heces, p. ej., con un tampón, para formar un producto homogeneizado de heces. El producto homogeneizado se trata para separar los sólidos residuales del fluido, p. ej., por centrifugación o filtración, para producir un "sobrenadante de heces".

2. El sobrenadante de las heces se trata para eliminar los inhibidores del ensayo (p. ej., con polivinilpolipirrolidona, como se describe en la Patente de Estados Unidos Núm. 8.993.341), produciendo "sobrenadante clarificado".

3. Se mezclan diez mililitros de sobrenadante clarificado (que representa un equivalente de aproximadamente 4 gramos de heces) con tiocianato de guanidina (GTC) hasta una concentración final de 2,4 M;

4. A continuación, la mezcla se calienta en un baño de agua a 90°C durante 10 minutos para desnaturalizar el ADN (y las proteínas) presentes en las heces.

5. Se añaden a la muestra partículas paramagnéticas que contienen oligonucleótidos unidos covalentemente (acoplados) complementarios a la secuencia o secuencias diana de interés ("sondas de captura específicas de la diana"). A continuación, la muestra se incuba (p. ej., a temperatura ambiente, aproximadamente 22-25°C) durante una hora para permitir la hibridación del ADN diana con las sondas de captura sobre las partículas magnéticas.

6. La mezcla de sobrenadante clarificado, GTC y partículas se expone a un campo magnético para separar las partículas (que ahora contienen ADN diana hibridado con las sondas de captura) de la mezcla de sobrenadante de heces/GTC, que se transfiere a un nuevo tubo. Véase, p. ej., el documento US 2012-0262260A1.

El ciclo de desnaturalización/hibridación/separación (etapas 4 a 6) se puede repetir, p. ej., como mínimo cuatro o más veces para extraer en serie diferentes ADN diana de la misma muestra de sobrenadante de heces.

ADN de tejido FFPE

El ADN de tejido incluido en parafina, fijado con formalina (FFPE) se aísla utilizando el kit de tejido QIAamp DNA FFPE (Qiagen Sciences, Germantown, MD).

Aislamiento de ADN de células y plasma.

Para las líneas celulares, el ADN genómico se puede aislar de los medios acondicionados con células utilizando, por ejemplo, el "Maxwell® RSC ccfDNA Plasma Kit (Promega Corp., Madison, WI). Siguiendo el protocolo del kit, se utiliza 1 mL de medio acondicionado con células (CCM) en lugar de plasma y se procesa de acuerdo con el procedimiento del kit.

Un procedimiento ilustrativo alternativo para aislar ADN del plasma es el siguiente:

• A una muestra de plasma de 4 mL, se le añaden 300 pl de proteinasa K (20 mg/mL) y mezcla.

• Añadir 3 pL de 1 pg/pL de diluyente de ADN de pez a la mezcla de plasma-proteinasa K.

• Añadir 2 mL de tampón de lisis de plasma al plasma.

El tampón de lisis de plasma es:

- tiocianato de guanidina 4,3 M

- IGEPAL CA-630 (octilfenoxi poli(etilenoxi)etanol, ramificado) del 10%

(5,3 g de IGEPAL CA-630 combinado con 45 mL de tiocianato de guanidina 4,8 M)

• Incubar las mezclas a 55°C durante 1 hora con agitación a 500 rpm.

• Añadir 3 mL de tampón de lisis de plasma y mezclar.

• Añadir 200 pL de cuentas de unión de sílice magnética (16 pg de cuentas/pL} y volver a mezclar.

• Añadir 2 mL de isopropanol del 100% y mezclar.

• Incubar a 30°C durante 30 minutos con agitación a 500 rpm.

• Colocar el tubo o los tubos sobre el imán y dejar que las cuentas se acumulen. Aspirar y desechar el sobrenadante.

• Añadir 750 pl de GuHCl-EtOH al recipiente que contiene las cuentas de unión y mezclar.

El tampón de lavado GuHCl-EtOH es:

- GuHCl (hidrocloruro de guanidina) 3M

- EtOH (alcohol etílico) del 57%

• Agitar a 400 rpm durante 1 minuto.

• Transferir las muestras a una placa de pocillos profundos o tubos de microcentrífuga de 2 mL.

• Colocar los tubos sobre el imán y dejar que las cuentas se acumulen durante 10 minutos. Aspirar y desechar el sobrenadante.

• Añadir 1000 pl de tampón de lavado (Tris HCl 10 mM, EtOH del 80%) a las cuentas e incubar a 30°C durante 3 minutos con agitación.

• Colocar los tubos sobre el imán y dejar que las cuentas se acumulen. Aspirar y desechar el sobrenadante.

• Añadir 500 pL de tampón de lavado a las cuentas e incubar a 30°C durante 3 minutos con agitación.

• Colocar los tubos sobre el imán y dejar que las cuentas se acumulen. Aspirar y desechar el sobrenadante.

• Añadir 250 pl de tampón de lavado e incubar a 30°C durante 3 minutos con agitación.

• Colocar los tubos sobre el imán y dejar que las cuentas se acumulen. Aspirar y desechar el tampón restante.

• Añadir 250 pl de tampón de lavado e incubar a 30°C durante 3 minutos con agitación.

• Colocar los tubos sobre el imán y dejar que las cuentas se acumulen. Aspirar y desechar el tampón restante.

• Secar las cuentas a 70°C durante 15 minutos, con agitación.

• Añadir 125 pl de tampón de elución (Tris HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 0,1 mM) a las cuentas e incubar a 65°C durante 25 minutos con agitación.

• Colocar los tubos sobre el imán y dejar que las cuentas se acumulen durante 10 minutos.

• Aspirar y transferir el sobrenadante que contiene el ADN a un nuevo recipiente o tubo.

Conversión por b isulfito del ADN

El ADN para las pruebas de metilación se trata con bisulfito utilizando, p. ej., el kit de metilación de ADN EZ-96 (Zymo Research, Irvine CA) o utilizando hidrogenosulfito de amonio como se describe en Patente de Estados Unidos Núm.

9.315.853.

Un método ilustrativo de tratamiento de ADN con un reactivo de bisulfito para convertir restos de citosina no metilados es el siguiente:

I. Sulfonación de ADN utilizando hidrogenosulfito de amonio

1. En cada tubo, combinar 64 pL de ADN, 7 pL de NaOH 1 N y 9 pL de solución portadora que contenga 0,2 mg/mL de BSA y 0,25 mg/mL de ADN de pez.

2. Incubar a 42°C durante 20 minutos.

3. Añadir 120 pL de hidrogenosulfito de amonio al 45% e incubar a 66°durante 75 minutos.

4. Incubar a 4°C durante 10 minutos.

II. Desulfonación mediante cuentas magnéticas

Materiales

Cuentas magnéticas (Partículas Paramagnéticas Promega MagneSil, número de catálogo de Promega AS1050, 16 pg/pL).

Tampón de unión: hidrocloruro de guanidina 6,5-7 M.

Tampón de lavado posterior a la conversión: etanol del 80% con Tris HCl 10 mM (pH 8,0).

Tampón de desulfonación: alcohol isopropílico del 70%, se seleccionó NaOH 0,1 N para el tampón de desulfonación. Las muestras se mezclan utilizando cualquier dispositivo o tecnología apropiados para mezclar o incubar muestras a las temperaturas y velocidades de mezcla esencialmente como se describe a continuación. Por ejemplo, se puede utilizar un Thermomixer (Eppendorf) para mezclar o incubar muestras. Una desulfonación ilustrativa es la siguiente:

1. Mezclar bien la provisión de partida de cuentas sometiendo la botella a agitación vorticial durante 1 minuto.

2. Colocar alícuotas de 50 pl de cuentas en un tubo de 2,0 mL (p. ej., de USA Scientific).

3. Añadir 750 pL de tampón de unión a las cuentas.

4. Añadir 150 pL de ADN sulfonado de la etapa I.

5. Mezclar (p. ej., 1000 RPM a 30°C durante 30 minutos).

6. Colocar el tubo sobre el soporte magnético y dejar en su lugar durante 5 minutos. Con los tubos en el soporte, retirar y desechar el sobrenadante.

7. Añadir 1000 pL de tampón de lavado. Mezclar (p. ej., 1000 RPM a 30°C durante 3 minutos).

8. Colocar el tubo sobre el soporte magnético y dejar en su lugar durante 5 minutos. Con los tubos en el soporte, retirar y desechar el sobrenadante.

9. Añadir 250 pL de tampón de lavado. Mezclar (p. ej., 1000 RPM a 30°C durante 3 minutos).

10. Colocar el tubo sobre una rejilla magnética; retirar y desechar el sobrenadante después de 1 minuto.

11. Añadir 200 pL de tampón de desulfonación. Mezclar (p. ej., 1000 RPM a 30°C durante 5 minutos).

12. Colocar el tubo sobre una rejilla magnética; retirar y desechar el sobrenadante después de 1 minuto.

13. Añadir 250 pL de tampón de lavado. Mezclar (p. ej., 1000 RPM a 30°C durante 3 minutos).

14. Colocar el tubo sobre una rejilla magnética; retirar y desechar el sobrenadante después de 1 minuto.

15. Añadir 250 pL de tampón de lavado al tubo. Mezclar (p. ej., 1000 RPM a 30°C durante 3 minutos).

16. Colocar el tubo sobre una rejilla magnética; retirar y desechar el sobrenadante después de 1 minuto.

17. Incubar todos los tubos a 30°C con la tapa abierta durante 15 minutos.

18. Retirar el tubo de la rejilla magnética y añadir 70 pL de tampón de elución directamente a las cuentas. 19. Incubar las cuentas con tampón de elución (p. ej., 1000 RPM a 40°C durante 45 minutos).

20. Colocar los tubos sobre una rejilla magnética durante aproximadamente un minuto; retirar y guardar el sobrenadante.

El ADN convertido se utiliza a continuación, en ensayos de preamplificación y/o endonucleasa flap, como se describe a continuación.

Ensayo de endonucleasa flap QuARTS

La tecnología QuARTS combina un procedimiento de amplificación de ADN diana basado en polimerasa con un procedimiento de amplificación de señal invasivo basado en escisión. La tecnología se describe, p. ej., en las Patentes de Estados Unidos Núm. 8.361.720; 8.715.937; 8.916.344; y 9.212.392. La señal de fluorescencia generada por la reacción de QuARTS se controla de una manera similar a la PCR en tiempo real y permite la cuantificación de la cantidad de ácido nucleico diana en una muestra.

Una reacción de QuARTS ilustrativa típicamente comprende aproximadamente 400-600 nmoles/l (p. ej., 500 nmoles/l) de cada cebador y sonda de detección, aproximadamente 100 nmoles/l del oligonucleótido invasivo, aproximadamente 600-700 nmoles/l de cada casete FRET (FAM, p. ej., suministrado comercialmente por Hologic, Inc.; HEX, p. ej., suministrado comercialmente por BioSearch Technologies; y Quasar 670, p. ej., suministrado comercialmente por BioSearch Technologies), 6.675 ng/pl de endonucleasa FEN-1 (p. ej., Cleavase® 2.0, Hologic, Inc.), 1 unidad de ADN polimerasa Taq en un volumen de reacción de 30 pl (p. ej., ADN polimerasa GoTaq®, Promega Corp., Madison, WI), 10 mmoles/l de ácido 3-(n-morfolino)propanosulfónico (MOPS), 7,5 mmoles/l de MgCl² y 250 pmoles/l de cada dNTP. En la tabla siguiente se muestran ejemplos de condiciones de ciclación de QuARTS. En algunas aplicaciones, el análisis del ciclo de cuantificación (C^q) proporciona una medida del número inicial de hebras de ADN diana (p. ej., número de copia) en la muestra.

Preamplificación multiplexada dirigida de ADN convertido por b isu lfito de gran volumen

Para preamplificar la mayor parte o la totalidad del ADN tratado con bisulfito de una muestra de entrada, se puede utilizar un gran volumen del ADN tratado en una única reacción de amplificación multiplex de gran volumen. Por ejemplo, el ADN se extrae de una línea celular (p. ej., línea celular DFCI032 (adenocarcinoma); línea celular H1755 (neuroendocrina)), utilizando, por ejemplo, el kit de sangre Maxwell Promega Núm. AS1400, como se describió anteriormente. El ADN se convierte con bisulfito, p. ej., como se describió anteriormente.

Se realiza una preamplificación, por ejemplo, en una mezcla de reacción que contiene MgCl27,5 mM, MOPS 10 mM, Tris-HCl 0,3 mM, pH 8,0, KCl 0,8 mM, 0,1 pg/pL de BSA, Tween-20 al 0,0001%, IGEPAL CA-630 0,0001%, 250 pM cada dNTP, cebadores oligonucleotídicos, (p. ej., para 12 dianas, 12 pares de cebadores/24 cebadores, en cantidades equimolares (incluidos, pero sin limitarse a, los intervalos de, p. ej., 200-500 nM cada cebador), o con concentraciones de cebador individuales ajustadas para equilibrar las eficacias de amplificación de las diferentes regiones diana), 0,025 unidades/pL de concentración GoTaq HotStart y de 20 a 50% en volumen de ADN diana tratado con bisulfito (p. ej., 10 pL de ADN diana en una mezcla de reacción de 50 pL, o 50 pL de ADN diana en una mezcla de reacción de 125 pL). Los tiempos y temperaturas de los ciclos térmicos se seleccionan para que sean apropiados para el volumen de la reacción y el recipiente de amplificación. Por ejemplo, las reacciones se pueden ciclar de la siguiente manera

Después de los ciclos térmicos, se diluyen alícuotas de la reacción de preamplificación (p. ej., 10 pl) hasta 500 pl en Tris-HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 0,1 mM, con o sin ADN de pez. Se utilizan alícuotas del a Dn preamplificado diluido (p. ej., 10 pL) en un ensayo PCR para flap de QuARTS, p. ej., como se describió anteriormente.

Ejemplo 2

Prueba del ensayo B3GALT6 en ADN genómico humano convertido por b isu lfito y ADN extraído de muestras de tejido de colon FFPE

El Patrón de ADN Humano Metilado Universal Convertido por Bisulfito, Núm. de catálogo D5015 (Zymo Research) se diluyó hasta 1 ng y 0,1 ng por pL en 20 ng/uL de ADN de pez. El ADN de un tejido de colon se extrajo de muestras FFPE montadas en portaobjetos utilizando el protocolo del miniKit Qiagen y se trató con bisulfito utilizando el kit de conversión de ADN Zymo eZ Núm. D5001.

Los plásmidos pUC57 digeridos con EcoRI que contenían un fragmento de inserto que tenía la secuencia de B3GALT6 convertido por bisulfito o de p-actina convertida por bisulfito se diluyeron en 20 ng/pl de ADN de pez a niveles de 2000, 200, 20 y 2 hebras/pl.

Procedimiento:

1) Preparar la siguiente mezcla de oligonucleótidos 10X y mezcla de enzimas 20X:

10x Mezcla de Oligos 1 (bíplex de B3GALT6 y B-actina):

20X Mezcla de enzimas:

MOPS 200 mM, pH 7,5,

MgCl2150 mM,

Tris-HCl 6,38 mM, pH 8,0,

KCl 15,94 mM,

2 pg/pL de BSA,

Tween-20 al 0,16%,

IGEPAL CA-630 al 0,16%,

Glicerol 25%,

146 ng/pL de Cleavase 2.0,

1 unidad/pL polimerasa GoTaq HotStart

2) Distribuir lo siguiente a los pocillos en una placa de 96 pocillos:

* Para las muestras, añadir 10 uL de ADN patrón de Zymo a 1 ng/pL, 10 pL de patrón de Zymo a 0,1 ng/pL o 10 pi­ de ADN extraído de tejido utilizando la siguiente disposición de placa:

3) Sellar la placa con el sello óptico y colocarla en LightCycler 480 y ejecutar el perfil que se describe a continuación:

4) Calcular las cantidades de ADN genómico de Zymo y del ADN aislado de los tejidos basándose en los plásmidos calibradores presentes en cada mezcla de oligonucleótidos.

Los datos se resumen en la siguiente tabla:

Estos datos muestran que la señal de B3GALT6 se observa tanto en el ADN genómico a granel como en el ADN extraído de muestras de tejido de colon FFPE.

Ejemplo 3

Prueba del ensayo B3GALT6 en ADN extraído de muestras de tejido canceroso y normal

Se extrajo ADN de portaobjetos FFPE de 32 muestras de tejido pulmonar utilizando el protocolo del miniKit Qiagen, con ADN sintético de pez cebra rassfl añadido como control de procedimiento. Las muestras fueron convertidas con bisulfito con bisulfito de amonio como se describe en el Ejemplo 1. Se utilizaron calibradores de plásmidos de insertos que contenían pUC57 digerido con EcoRI para B3GALT6 convertido por bisulfito o p-actina convertida por bisulfito, diluidos en 20 ng/pL de ADN de pez, para la calibración cuantitativa. Los ensayos QuARTS T ríplex se realizaron como se describe en el Ejemplo 1.

Los resultados se muestran en la Fig. 3. Se observa una buena correlación entre B3GALT6 y p-actina en muestras de pulmón. Puesto que el ensayo detecta ADN que ha sido protegido de la conversión de secuencia por metilación, las diferencias en el número de copias entre la p-actina y B3GALT6 convertidos son compatibles con los diferentes niveles de metilación entre la p-actina y B3GALT6 (es decir, la todo el ADN de p-actina está sin metilar y se convierte en una secuencia que coincide con sus cebadores y sondas de ensayo, mientras que una fracción de B3GALT6 no está metilada y los oligonucleótidos de ensayo diseñados para detectar el ADN de B3GALT6 metilado no coinciden con la fracción convertida por bisulfito no metilada).

Ejemplo 4

Prueba del ensayo B3GALT6 en muestras de plasma

Se extrajo ADN de 118 muestras de plasma (4 mL cada una) de pacientes con cáncer y normales utilizando extracción a base de sílice y se trató con bisulfito como se describe en el Ejemplo 1. Se utilizaron calibradores de plásmido de pUC57 digerido con EcoRI que contenía ADN insertado que tenía las secuencias de B3GALT6 o p-actina convertidos por bisulfito diluidos en 20 ng/pL de ADN de pez para la calibración cuantitativa.

Las muestras se analizaron utilizando el ensayo QuARTS como se describe en el Ejemplo 1 y los resultados se muestran en la Fig. 4. Se observa una buena correlación entre B3GALT6 y p-actina en muestras de plasma independientemente del estado de enfermedad del sujeto del que se toman las muestras.

Ejemplo 5

Prueba del ensayo B3GALT6 en muestras de plasma adicionales

Se comparó B3GALT6 con p-actina como diana de referencia en un conjunto ampliado de muestras que comprendía tanto sujetos normales como pacientes que tenían cáncer de pulmón. Se extrajo ADN de un conjunto de 297 muestras de plasma (2 mL) de pacientes con cáncer y normales utilizando extracción a base de sílice y se trató con bisulfito como se describe en el Ejemplo 1. Se utilizaron calibradores de plásmido de pUC57 digerido con EcoRI que contenían ADN insertado que tenía la secuencia de B3GALT6 convertido por bisulfito o p-actina convertida por bisulfito, diluida en 20 ng/pL de ADN de pez, para la calibración cuantitativa. Los ensayos QuARTS Tríplex se realizaron como se describe para los ensayos de QuARTS Múltiplex en el Ejemplo 1, utilizando 12 ciclos en la amplificación inicial.

Los resultados se muestran en la Fig. 5, que compara los recuentos de hebras detectadas para cada una de las dianas B3GALT6 y p-actina. Estos datos muestran que se observa una buena correlación entre B3GALT6 y p-actina independientemente del estado de la enfermedad, lo que muestra la idoneidad de B3GALT6 como gen de referencia metilado.

Ejemplo 6

Comparación de B3GALT6 y p-actina como genes de referencia para calcular el % de metilación de genes marcadores

Las 297 muestras de plasma descritas en el Ejemplo 5 se analizaron adicionalmente utilizando el ensayo QuARTS para determinar la presencia de marcadores de metilación CYP26C1 y NFIX. Las Fig. 6A y 6B comparan p-actina tratada con bisulfito o B3GALT6 tratado con bisulfito como referencia para calcular el % de metilación de estos genes marcadores en el ADN de las muestras de plasma.

Ejemplo 7

Prueba de B3GALT6 como gen de referencia en células pulmonares

Se cultivaron veinte líneas de células pulmonares y su ADN se extrajo utilizando el kit Qiagen Miniblood. El ADN extraído se trató con bisulfito de amonio como se describe en el Ejemplo 1. Se utilizaron calibradores de plásmido de pUC57 digerido con EcoRI que contenía ADN insertado con la secuencia de B3GALT6 convertido por bisulfito o pactina convertida por bisulfito, diluido en 20 ng/pL de ADN de pez para la calibración cuantitativa. Los ensayos QuARTS Múltiplex se realizaron como se describe en el Ejemplo 1. Los resultados, que se muestran en la tabla siguiente, demuestran que el marcador de referencia B3GALT6 está presente en todos los tipos de células pulmonares sometidos a prueba.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. El uso de una composición que comprende:

un complejo de un ácido nucleico B3GALT6 convertido por bisulfito y al menos un oligonucleótido, en donde al menos una porción de dicho oligonucleótido hibrida con dicho ácido nucleico B3GALT6,

en donde dicho ácido nucleico B3GALT6 convertido por bisulfito se utiliza como marcador de referencia metilado y control interno que se procesa y detecta junto con el ADN marcador indicativo de enfermedad en ensayos de metilación.

2. El uso de la composición de la reivindicación 1, en donde dicho ácido nucleico B3GALT6 es una hebra de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o el complemento de la misma.

3. El uso de la composición de la reivindicación 2, comprendiendo adicionalmente la composición un oligonucleótido sonda de detección, en donde el oligonucleótido sonda de detección comprende una región que es complementaria a una porción de dicha hebra de ADN,

en donde el oligonucleótido sonda de detección comprende preferiblemente una región que es complementaria a una porción de SEQ ID NO: 2 o el complemento de la misma,

en donde dicho oligonucleótido sonda de detección comprende adicionalmente preferiblemente una molécula indicadora, y donde dicha molécula indicadora comprende preferiblemente un fluoróforo.

4. El uso de la composición de la reivindicación 3, en donde dicho oligonucleótido sonda de detección comprende una secuencia de flap, y preferiblemente comprende adicionalmente un casete FRET.

5. El uso de la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, comprendiendo adicionalmente la composición una endonucleasa FEN-1 y/o una ADN polimerasa termoestable.

6. El uso de la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicha composición está compuesta por una mezcla de reacción, comprendiendo dicha mezcla de reacción preferiblemente adicionalmente uno o más de un cebador, un oligonucleótido indicador, una ADN polimerasa termoestable, una endonucleasa FEN-1, y un casete FRET.

7. Un método para caracterizar una muestra, que comprende:

a) tratar el ADN de una muestra de un sujeto con un reactivo de bisulfito para producir una muestra de ADN tratada con bisulfito;

b) medir una cantidad de al menos un ADN marcador de metilación convertido por bisulfito en la muestra de ADN tratada con bisulfito;

c) medir una cantidad de ADN de B3GALT6 convertido por bisulfito en la muestra de ADN tratada con bisulfito, en donde dicho ADN de B3GALT6 convertido por bisulfito se utiliza como marcador de referencia metilado y control interno junto con dicho ADN marcador metilado en la etapa b); y

d) comparar la cantidad de dicho al menos un ADN marcador de metilación convertido por bisulfito y la cantidad de ADN de B3GALT6 convertido por bisulfito en la muestra de ADN tratada con bisulfito para determinar una cantidad del al menos un ADN marcador de metilación en dicha muestra de un sujeto, preferiblemente

en donde la medición de dicha cantidad de al menos un ADN marcador de metilación convertido por bisulfito y dicha cantidad de ADN de B3GALT6 convertido por bisulfito en dicha muestra de ADN tratada con bisulfito comprende regiones de amplificación de dicho ADN convertido por bisulfito utilizando pares de cebadores de ácido nucleico, en donde dicha amplificación produce al menos un producto amplificado que comprende una región de dicho al menos un ADN marcador de metilación, y un producto amplificado que comprende una región de dicho ADN de B3GALT6 y/o

en donde dicho al menos un ADN marcador de metilación convertido por bisulfito comprende al menos dos ADN marcadores de metilación convertidos por bisulfito,

adicionalmente preferiblemente

en donde dicho producto amplificado que comprende una región de dicho ADN de B3GALT6 tiene una secuencia de ácido nucleico que comprende una región de SEQ ID NO: 2, o un complemento de la misma.

8. Un método para cuantificar, en una muestra de sangre de un sujeto, la cantidad de un ADN marcador metilado que es indicativa de un tumor en un tejido sólido, comprendiendo el método:

a) medir una cantidad de un primer ADN marcador metilado en una muestra de sangre de un sujeto, en donde la metilación de dicho primer ADN marcador en un tejido sólido en un sujeto es indicativa de un tumor en dicho tejido;

b) medir una cantidad de un segundo ADN marcador metilado en dicha muestra de sangre, en donde dicho segundo ADN marcador está metilado en tejido normal y en leucocitos, y en donde dicho segundo ADN marcador comprende ADN de B3GALT6 y se utiliza como marcador de referencia y control interno que se procesa y detecta junto con dicho primer ADN marcador metilado; y

c) comparar las cantidades de dicho primer ADN marcador metilado y dicho segundo ADN marcador metilado en dicha muestra de sangre para determinar una fracción de dicho primer ADN marcador en dicha muestra de sangre que está metilada.

9. El método de la reivindicación 8, en donde dicha medición comprende utilizar un método seleccionado entre uno de los siguientes:

i) un método que comprende:

- tratar el ADN de una muestra con un reactivo de bisulfito para producir ADN convertido por bisulfito; - amplificar una región de dicho ADN convertido por bisulfito utilizando un par de cebadores de ácido nucleico, en donde dicha amplificación produce un producto amplificado que tiene una secuencia que comprende una región de SEQ ID NO: 2;

ii) un método como se define en i), que comprende adicionalmente una etapa de detección del producto amplificado con una sonda de detección, en donde dicha sonda de detección comprende preferiblemente una molécula informadora y/o una secuencia flap;

iii) un método como se define en i) o ii), en donde dicho producto amplificado tiene una secuencia que comprende SEQ ID NO: 2.

10. El uso de un kit en un método según las reivindicaciones 7-9, comprendiendo dicho kit:

a) al menos un oligonucleótido, en donde al menos una porción de dicho oligonucleótido hibrida específicamente con el ADN de B3GALT6 convertido por bisulfito; y

b) reactivo de bisulfito.

11. El uso del kit de la reivindicación 10, comprendiendo dicho kit al menos un oligonucleótido que comprende una región que es complementaria a una porción de SEQ ID NO: 2 o un complemento de la misma.

12. El uso del kit de la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en donde dicho oligonucleótido se selecciona entre uno o más de un oligonucleótido de captura, un par de cebadores de ácido nucleico, una sonda de ácido nucleico y un oligonucleótido invasivo.