CN109642228A - 甲基化对照dna - Google Patents
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Abstract
本文提供与用于分析来自受试者的甲基化DNA的组合物和方法相关的技术。本技术还涉及使用内源性甲基化DNA作为用于标记基因甲基化测定的内部对照。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年7月19日提交的美国临时专利申请62/364,082的优先权益，所述申请全文以引用方式并入本文。
技术领域
本文提供与用于分析和定量受试者中的DNA例如甲基化DNA的组合物和方法相关的技术。本技术涉及在来自受试者的样品诸如血液、血浆、粪便或组织样品的甲基化测定中使用甲基化参考标记作为内部对照。
背景技术
甲基化DNA已作为大部分肿瘤类型的组织中的潜在生物标记类别来研究。在许多情况下，DNA甲基转移酶将甲基添加到DNA的作为基因表达的表观遗传控制的胞嘧啶-磷酸酯-鸟嘌呤(CpG)岛位点处。在生物吸引机制中，肿瘤抑制基因的启动子区域内的获得性甲基化事件被认为使表达沉默，因此造成肿瘤形成。DNA甲基化可为比RNA或蛋白质表达更具化学和生物学稳定性的诊断工具(Laird(2010)“Principlesandchallengesofgenome-wideDNAmethylationanalysis”NatRevGenet 11:191–203)。另外，在其他癌症如散发性结肠癌的情况下，甲基化标记提供优异特异性并且比单独DNA突变更具广泛信息性且更敏感(Zou等人(2007)“Highly methylated genes in colorectal neoplasia:implicationsfor screening”Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 16:2686–96)。
针对与疾病或疾病风险相关联的突变的存在和/或甲基化状态进行分析的来自患者样品例如血液、粪便和组织样品的核酸通常在分析期间通过多个方法步骤。这些步骤可包括例如过滤、沉淀、捕获、洗涤、洗脱和/或化学修饰。为了分析DNA以确定甲基化状况，例如测试DNA的甲基化百分比，处理通常包括用亚硫酸氢盐处理以将未甲基化dC碱基转化成dU残基，使得它们更容易与受保护免于亚硫酸氢盐转化的甲基-C残基区分。
测试DNA的准确定量(例如，确定甲基化百分比、携带突变的DNA的存在和量等)通常需要归一化到对照核酸，例如具有已知特性的内源性不变基因(例如，已知序列、已知的每个细胞的拷贝数目)。样品与样品变化的归一化对照可在例如样品处理、测定效率等中出现并且允许准确的样品与样品数据比较。
发明概要
本文提供与对于例如可能与受试者健康状况相关的不同核酸种类的存在或不存在和/或量来表征样品例如血液样品、粪便样品等相关的技术。本技术涉及可与指示疾病的甲基化标记DNA并行处理和检测的甲基化对照DNA。在一些实施方案中，本技术提供包含B3GALT6核酸的组合物。例如，在一些实施方案中，提供一种组合物，其包含亚硫酸氢盐转化的B3GALT6核酸和至少一种寡核苷酸的复合物，其中所述寡核苷酸的至少一部分与所述B3GALT6核酸杂交。在优选的实施方案中，B3GALT6核酸为包含核苷酸序列SEQ ID NO:2或其互补序列的DNA链。寡核苷酸不限于任何特定类型的寡核苷酸，并且可包括例如DNA、RNA和/或PNA(肽核酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸为引物寡核苷酸。
在一些实施方案中，组合物还包含检测探针寡核苷酸，所述检测探针寡核苷酸包含于B3GALT6DNA链的一部分互补的区域。在某些优选的实施方案中，检测探针寡核苷酸包含与SEQ ID NO:2或其互补序列的一部分互补的区域。
检测探针不限于任何特定的配置并且例如可为用于PCR、LCR、侵入性裂解测定、QuARTS瓣状测定和/或本领域技术人员已知的任何合适检测测定中的检测探针，所述测定中的一些在下文中描述。在一些实施方案中，检测探针寡核苷酸包含报告分子，例如反应性部分或荧光团。在一些实施方案中，检测探针寡核苷酸包含瓣状序列。
包含B3GALT6核酸和寡核苷酸的组合物可包含其他组分。例如，在一些实施方案中，组合物还包含FRET盒、FEN-1核酸内切酶和/或热稳定性DNA聚合酶。在一些实施方案中，上文所述的组合物一起存在于反应混合物中，例如用于核酸检测测定。在一些实施方案中，反应混合物还包含引物、瓣状寡核苷酸、热稳定性DNA聚合酶、FEN-1核酸内切酶和/或FRET盒中的一种或多种。
在一些实施方案中，本技术提供一种包含B3GALT6相关核酸的试剂盒。例如，在一些实施方案中，本技术提供一种试剂盒，所述试剂盒包含a)至少一种寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的至少一部分与亚硫酸氢盐转化的B3GALT6DNA特异性杂交；以及b)亚硫酸氢盐试剂。在一些优选的实施方案中，至少一种寡核苷酸包含与SEQ ID NO:2或其互补序列的一部分互补的区域。作为实例且为非限制性的，在一些实施方案中，寡核苷酸选自捕获寡核苷酸、核酸引物对、核酸探针和侵入性寡核苷酸中的一种或多种。在一些实施方案中，试剂盒还包括与哺乳动物DNA基本上不具有同源性的用作例如运行对照的合成的甲基化DNA。在优选的实施方案中，合成的甲基化DNA为斑马鱼DNA，例如斑马鱼rassf1基因的合成部分，如美国临时专利申请序列号62/364,049所述的。
本技术进一步提供表征样品的方法。在一些实施方案中，所述方法包括a)用亚硫酸氢盐试剂处理来自样品的DNA以产生亚硫酸氢盐转化的DNA，以及b)使用核酸引物对扩增亚硫酸氢盐转化的DNA的区域，其中所述扩增产生包含区域SEQ ID NO:2的序列的扩增产物。在一些优选的实施方案中，扩增产物具有包含实体SEQ ID NO:2的序列。
在一些实施方案中，所述方法还包括用检测探针检测扩增产物的步骤。如上文所讨论的，检测探针不限于任何特定形式或功能的检测探针。在一些实施方案中，检测探针包含报告分子，在一些实施方案中检测探针包含瓣状序列。
附图简述
参照以下附图，本技术的这些和其他特征、方面和优点将变得更加容易理解：
图1示出呈未转化形式和亚硫酸氢盐处理形式的B3GALT6(hg19_dna范围＝chr1:1163595-1163733链＝+)标记靶标区域的示意图。示出用于检测亚硫酸氢盐转化的B3GALT6DNA的瓣状测定引物和探针。
图2示出呈未转化形式和亚硫酸氢盐处理形式的β-肌动蛋白靶标区域的示意图。示出用于检测亚硫酸氢盐转化的β-肌动蛋白DNA的瓣状测定引物和探针。
图3提供比较在从32种肺组织样品提取的DNA中亚硫酸氢盐转化的B3GALT6DNA与亚硫酸氢盐转化的β-肌动蛋白DNA的检测的图表，如实施例3所述。
图4提供比较在从118种血浆样品提取的DNA中亚硫酸氢盐转化的B3GALT6DNA与亚硫酸氢盐转化的β-肌动蛋白DNA的检测的图表，如实施例4所述。
图5提供比较在从297种血浆样品提取的DNA中亚硫酸氢盐转化的B3GALT6DNA与亚硫酸氢盐转化的β-肌动蛋白DNA的检测的图表，如实施例5所述。
图6A和图6B分别提供比较在从297种血浆样品提取的DNA中使用亚硫酸氢盐转化的B3GALT6或亚硫酸氢盐转化的β-肌动蛋白作为参考基因计算的CYP26C1和NFIX标记基因的甲基化百分比，如实施例6所述。
定义
为了有助于理解本技术，在下文中定义了大量术语和短语。附加的定义在整个详细描述中阐述。
如本文所用的短语“在一个实施方案中”不一定指相同的实施方案，尽管它可能指相同的实施方案。此外，如本文所用的短语“在另一个实施方案中”不一定指不同的实施方案，尽管它可能指不同的实施方案。因此，如下文所述，在不脱离本发明的范围或精神的情况下，本发明的各种实施方案可容易地组合。
如本文所用的，“一个/种(a/an)”或“所述(the)”可以意指一个或多于一个。例如，“一个”小部件可意指一个小部件或多个小部件。
如在本申请的权利要求书中所用的过渡短语“基本上由…组成”将权利要求的范围限制为指定材料或步骤“和不实质改变要求保护的发明的一种或多种基本和新颖特征的那些”，如In re Herz,537F.2d549,551-52,190 USPQ 461,463(CCPA 1976)中所讨论的。例如，“基本上由所陈述元素组成”的组合物可以含有一定水平的未陈述污染物，使得尽管存在，但是所述污染物不会改变所陈述组合物与纯组合物，即“基本上由所陈述组分组成”的组合物相比的功能。
如本文所用，术语“分析物”应广泛理解为有待检测、鉴别或表征的任何目标化合物、分子、元素、离子或其他物质。
如本文所用，术语“受试者”和“患者”是指任何动物，诸如狗、猫、鸟、家畜，并且特别是哺乳动物，优选地为人类。在一些情况下，受试者也为“使用者”(并且因此使用者也为受试者或患者)。
如本文所用，术语“样品”和“样本”可互换使用并且以最广泛含义使用。在一种意义上，样品旨在包括从任何来源获得的试样或培养物，以及生物和环境样品。生物样品可从动物(包括人类)获得，并且涵盖流体、固体、组织和气体。生物样品包括血液产品，诸如血浆、血清、粪便、尿液等。环境样品包括环境材料诸如地表物质、土壤、泥、烂泥、生物膜、水、晶体和工业样品。然而，此类实例不应解释为限制适用于本发明的样品类型。
如本文所用，如一些上下文中所用的“远程样品”涉及从并非样品的细胞、组织或器官来源的位点间接收集的样品。例如，当源于胰腺的样品材料在粪便样品(例如，并非来自从胰腺直接获取的样品)中评定时，则所述样品为远程样品。
术语“靶标”当参考核酸捕获、检测或分析方法使用时是指具有有待检测或分析的特性例如特定核苷酸序列的核酸，例如在疑似含有靶标核酸的样品中。在一些实施方案中，靶标为具有希望确定其甲基化状况的特定序列的核酸。当参考聚合酶链反应使用时，“靶标”通常是指由用于聚合酶链反应的引物结合的核酸的区域。因此，“靶标”争取从可存在于样品中的其他核酸序列中分选出来。“区段”被定义为在靶标序列内的核酸区域。术语“样品模板”是指来源于对靶标的存在进行分析的样品的核酸。
如本文所用的术语“标记”是指可以用于例如基于标记物质的存在、不存在或状况(例如甲基化状态)区分非正常细胞(例如癌细胞)与正常细胞的物质(例如核酸或核酸的区域或蛋白质)。
如本文所用，术语“鱼DNA”不同于斑马鱼DNA并且是指从鱼类分离的外源性非靶标DNA。如参考非靶标DNA所用的术语“外源性”是指从除含有靶标DNA的来源或样品之外的来源分离和纯化的非靶标DNA。此类外源性DNA被选择为通过配置成检测和/或定量添加了外源性DNA的反应物中的靶标核酸的测定未能检测到。例如，纯化的鱼DNA为相对于包含人类靶标DNA的样品的外源性DNA，例如，如美国专利号9,212,392所述的，所述专利以引用的方式并入本文。大量纯化的鱼DNA为可商购获得的，例如以鳕鱼和/或鲱鱼精DNA(RocheApplied Science,Mannheim,Germany)或鲑鱼DNA(USB/Affymetrix)形式提供。
如本文所用，术语“斑马鱼DNA”不同于鱼DNA并且是指从斑马鱼中分离的DNA或者在体外形成(例如，酶促、合成)以具有来自斑马鱼的DNA中可见的核苷酸序列的DNA，例如，如07/19/2016提交的美国临时专利申请序列号62/364,049所述，所述申请全文以引用的方式并入本文中。在优选的实施方案中，斑马鱼DNA为作为可检测对照DNA，例如用于验证通过样品处理步骤进行的DNA回收的方法对照添加的甲基化DNA。
如本文所用，术语“基因座”是指核酸限定区域或区段，诸如染色体或RNA分子上的基因或任何其他表征的序列内的特定位置，例如，突变、多态性或CpG二核苷酸内的C残基的位置。基因座不限于任何特定尺寸或长度并且可以是指染色体、基因、功能性遗传元件或单个核苷酸或碱基对的一部分。如本文参考可甲基化的CpG位点所用的，基因座是指CpG二核苷酸中的C残基。
在核酸背景下术语“扩增(amplifying/amplification)”是指多核苷酸或所述多核苷酸的一部分的多个拷贝的产生，其通常由少量多核苷酸(例如单一多核苷酸分子)开始，其中扩增产物或扩增子通常是可检测的。多核苷酸的扩增涵盖多种化学和酶促过程。在聚合酶链反应(PCR)或连接酶链反应(LCR；参见例如美国专利号5,494,810；全文以引用方式并入本文中)期间由靶标或模板DNA分子的一个或几个拷贝生成多个DNA拷贝是扩增的形式。另外的扩增类型包括但不限于等位基因特异性PCR(参见例如美国专利号5,639,611；全文以引用的方式并入本文)、装配PCR(参见例如美国专利号5,965,408；全文以引用的方式并入本文)、解旋酶依赖性扩增(参见例如美国专利号7,662,594；全文以引用的方式并入本文)、热启动PCR(参见例如美国专利号5,773,258和5,338,671；其各自全文以引用的方式并入本文)、序列间特异性PCR、反向PCR(参见例如Triglia等人(1988)Nucleic Acids Res.,16:8186；全文以引用的方式并入本文)、连接介导的PCR(参见例如Guilfoyle,R.等人,Nucleic Acids Research,25:1854-1858(1997)；美国专利号5,508,169；其各自全文以引用的方式并入本文),methylation-specific PCR(参见例如Herman等人,(1996)PNAS 93(13)9821-9826；全文以引用的方式并入本文)、微型引物PCR、多重连接依赖性探针扩增(参见例如Schouten等人,(2002)Nucleic Acids Research 30(12):e57；全文以引用的方式并入本文)、多重PCR(参见例如Chamberlain等人,(1988)Nucleic Acids Research 16(23)11141-11156；Ballabio等人,(1990)Human Genetics 84(6)571-573；Hayden等人,(2008)BMC Genetics 9:80；其各自全文以引用的方式并入本文)、嵌套式PCR、重叠延伸PCR(参见例如Higuchi等人,(1988)Nucleic Acids Research 16(15)7351-7367；全文以引用的方式并入本文)、实时PCR(参见例如Higuchi等人,(1992)Biotechnology10:413-417；Higuchi等人,(1993)Biotechnology 11:1026-1030；其各自全文以引用的方式并入本文)、逆转录PCR(参见例如Bustin,S.A.(2000)J.Molecular Endocrinology 25:169-193；全文以引用的方式并入本文)、固相PCR、热不对称交错PCR以及递降PCR(参见例如Don等人,Nucleic AcidsResearch(1991)19(14)4008；Roux,K.(1994)Biotechniques 16(5)812-814；Hecker等人,(1996)Biotechniques 20(3)478-485；其各自全文以引用的方式并入本文)。多核苷酸扩增也使用数字PCR实现(参见例如Kalinina等人,Nucleic Acids Research.25；1999-2004,(1997)；Vogelstein和Kinzler,Proc Natl Acad Sci USA.96；9236-41,(1999)；国际专利公布号WO/05023091A2；美国专利公布号20070202525；其各自全文以引用的方式并入本文)。
术语“聚合酶链反应”(“PCR”)是指K.B.Mullis美国专利号4,683,195、4,683,202和4,965,188的方法，所述文献描述了一种用于在未克隆或扩增的情况下增加基因组或其他DNA或RNA的混合物中靶标序列区段的浓度的方法。这种用于扩增靶标序列的方法由以下各项组成：将大量的两种寡核苷酸引物引入到含有所需靶标序列的DNA混合物中，接着在DNA聚合酶存在下引入热循环的精确序列。两种引物与双链靶标序列的相应链互补。为了实现扩增，使混合物变性并且然后使引物退火到其在靶标分子内的互补序列上。在退火后，使用聚合酶延伸所述引物以便形成一对新的互补链。变性、引物退火和聚合酶延伸的步骤可重复许多次(即，变性、退火和延伸构成一个“循环”；可存在许多个“循环”)，以获得高浓度的所需靶标序列的扩增区段。所需靶标序列的扩增区段的长度通过所述引物相对于彼此的相对位置来确定，并且因此，此长度为可控制的参数。通过重复所述过程的方面，所述方法被称为“聚合酶链反应”(“PCR”)。因为靶标序列的所需扩增区段在混合物中变成主要序列(就浓度而言)，所以它们被称为“PCR扩增的”并且是“PCR产物”或“扩增子”。本领域技术人员将理解，术语“PCR”涵盖最初描述的使用例如实时PCR、嵌套式PCR、逆转录PCR(RT-PCR)、单一引物和任意引物PCR等的方法的许多变体。
如本文所用，术语“核酸检测测定”是指确定目标核酸的核苷酸组成的任何方法。核酸检测测定包括但不限于DNA测序方法、探针杂交方法、结构特异性裂解测定(例如，INVADER测定，(Hologic,Inc.)并且描述于例如美国专利号5,846,717、5,985,557、5,994,069、6,001,567、6,090,543和6,872,816；Lyamichev等人,Nat.Biotech.,17:292(1999),Hall等人,PNAS,USA,97:8272(2000),以及US2009/0253142，其各自出于所有目的全文以引用的方式并入本文)；酶错配裂解方法(例如，Variagenics，美国专利号6,110,684、5,958,692、5,851,770，其全文以引用的方式并入本文)；以上所述的聚合酶链反应(PCR)；分支杂交方法(例如，Chiron，美国专利号5,849,481、5,710,264、5,124,246和5,624,802，其全文以引用的方式并入本文)；滚环式复制(例如，美国专利号6,210,884、6,183,960和6,235,502，其全文以引用的方式并入本文)；NASBA(例如，美国专利号5,409,818，其全文以引用的方式并入本文)；分子信标技术(例如，美国专利号6,150,097，其全文以引用的方式并入本文)；E-传感器技术(Motorola，美国专利号6,248,229、6,221,583、6,013,170和6,063,573，其全文以引用的方式并入本文)；环状探针技术(例如美国专利号5,403,711、5,011,769和5,660,988，其全文以引用的方式并入本文)；Dade Behring信号扩增方法(例如美国专利号6,121,001、6,110,677、5,914,230、5,882,867和5,792,614，其全文以引用的方式并入本文)；连接酶链反应(例如，Baranay Proc.Natl.Acad.Sci USA 88,189-93(1991))；以及夹心杂交方法(例如，美国专利号5,288,609，其全文以引用的方式并入本文)。
在一些实施方案中，靶标核酸被扩增(例如，通过PCR)并且扩增的核酸同时使用侵入性裂解测定来检测。配置用于执行检测测定(例如侵入性裂解测定)的测定与扩增测定的组合描述于美国专利公布US 20090253142 Al(申请序列号12/404,240)中，所述专利出于所有目的全文以引用的方式并入本文。额外扩增加上侵入性裂解检测配置(称为QuARTS方法)描述于美国专利号8,361,720；8,715,937；8,916,344；以及9,127,318，其出于所有目的全文以引用的方式并入本文。如本文所用的术语“侵入性裂解结构”是指包含以下各项的裂解结构：i)靶标核酸、ii)上游核酸(例如，侵入性或“INVADER”寡核苷酸)以及iii)下游核酸(例如，探针)，其中所述上游和下游核酸退火至靶标核酸的连续区域，并且其中重叠在上游核酸的3′部分与介于下游核酸与靶标核酸之间形成的双链体之间形成。在以下情况下发生重叠：来自上游和下游核酸的一个或多个碱基占据与靶标核酸碱基相同的位置，无论所述上游核酸的一个或多个重叠碱基是否与靶标核酸互补，并且无论那些碱基是否是天然碱基或非天然碱基。在一些实施方案中，上游核酸的与下游双链体重叠的3′部分是非碱基化学部分，诸如芳族环结构，例如，如美国专利号6,090,543所公开的，所述专利全文以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，核酸中的一个或多个可彼此附接，例如通过共价键诸如核酸茎环，或者通过非核酸化学键(例如多碳链)。如本文所用，术语“瓣状核酸内切酶测定”包括如以上所述的“INVADER”侵入性裂解测定和QuARTS测定。
术语“探针”是指下述寡核苷酸(例如核苷酸的序列)：所述寡核苷酸无论是在纯化的限制性消化中天然存在或合成、重组或通过PCR扩增产生，能够与另一种目标寡核苷酸杂交。探针可为单链或双链。探针适用于检测、鉴别和分离特定基因序列(例如“捕获探针”)。预期在一些实施方案中，本发明中所用的任何探针可以用任何“报告分子”标记，使得在任何检测系统中可检测，所述检测系统包括但不限于酶(例如ELISA以及酶基组织化学测定)、荧光、放射性和发光系统。不希望本发明限于任何特定系统或标签。当参考瓣状测定使用时，所述术语是指与靶标核酸相互作用以在侵入性寡核苷酸存在下形成裂解结构的寡核苷酸。如参考瓣状测定所用，术语“瓣状探针”和“瓣状寡核苷酸”可互换使用。
术语“侵入性寡核苷酸”是指在与探针和靶标核酸之间的杂交区域相邻的位置处与靶标核酸杂交的寡核苷酸，其中侵入性寡核苷酸的3'端包含与探针和靶标之间的杂交区域重叠的部分(例如化学部分或一个或多个核苷酸)。侵入性寡核苷酸的3'端核苷酸可以或可以不与靶标中的核苷酸碱基配对。在一些实施方案中，侵入性寡核苷酸在其3'端含有与位于探针寡核苷酸的退火至靶链的部分的5'端处的序列基本上相同的序列。
如本文所用的术语“瓣状核酸内切酶”或“FEN”是指在具有含有单链5'突出部的双链体或在由核酸另一条链置换(例如，使得在单链和双链DNA之间的接合处存在重叠核苷酸)的一条链上具有瓣状物的DNA结构上用作结构特异性核酸内切酶的一类溶核酶，通常为5'核酸酶。FEN催化磷酸二酯键在单链和双链DNA的接点处水解裂解，从而释放突出部或瓣状物。瓣状核酸内切酶由Ceska和Savers(Trends Biochem.Sci.1998 23:331-336)和Liu等人(Annu.Rev.Biochem.200473:589-615；所述文献全文以引用方式并入本文)审查。FEN可为单个酶、多亚基酶，或者可作为另一种酶或蛋白质复合物(例如，DNA聚合酶)的活性而存在。
瓣状核酸内切酶可为热稳定性的。例如，来自古细菌嗜热生物体的FEN-1瓣状核酸内切酶是典型热稳定性的。如本文所用，术语“FEN-1”是指来自真核生物或古细菌生物体的非聚合酶瓣状核酸内切酶。参见例如WO 02/070755和Kaiser M.W.等人(1999)J.Biol.Chem.,274:21387，所述文献出于所有目的全文以引用方式并入本文中。
如本文所用，术语“裂解瓣状物”是指为瓣状测定的裂解产物的单链寡核苷酸。
术语“盒”当参考瓣状裂解反应使用时是指配置成响应于瓣状物或探针寡核苷酸的裂解(例如在瓣状裂解测定中形成的初级结构或第一裂解结构)而生成可检测信号的寡核苷酸或寡核苷酸组合。在优选的实施方案中，所述盒与通过裂解瓣状寡核苷酸产生的非靶标裂解产物杂交以形成二级重叠裂解结构，使得所述盒然后可由同一酶例如FEN-1核酸内切酶裂解。
在一些实施方案中，所述盒是包含发夹部分的单一寡核苷酸(即，其中盒寡核苷酸的一个部分与同一寡核苷酸的第二部分在反应条件下杂交以形成双链体的区域)。在其他实施方案中，盒包含至少两个寡核苷酸，其包含可在反应条件下形成双链体的互补部分。在优选的实施方案中，盒包含标签，例如荧光团。在特别优选的实施方案中，盒包含产生FRET效应的标记部分。
如本文所用，术语“FRET”是指荧光共振能量转移，这是其中部分(例如荧光团)例如在其本身中或从荧光团到非荧光团(例如淬灭剂分子)转移能量的过程。在一些情况下，FRET涉及经由短范围(例如约10nm或更小)偶极-偶极相互作用将能量转移到低能量受体荧光团的激发的供体荧光团。在其他情况下，FRET涉及来自供体的荧光能量的损失和受体荧光团中的荧光增加。还在其他形式的FRET中，能量可以从激发的供体荧光团交换至非荧光分子(例如，“黑暗”淬火分子)。FRET为本领域技术人员已知的并且已得到描述(参见例如Stryer等人,1978,Ann.Rev.Biochem.,47:819；Selvin,1995,Methods Enzymol.,246:300；Orpana,2004Biomol Eng 21,45-50；Olivier,2005Mutant Res 573,103-110，所述文献各自全文以引用方式并入本文)。
在示例性瓣状检测测定中，侵入性寡核苷酸和瓣状寡核苷酸与靶标核酸杂交以产生具有如上所述的重叠的第一复合物。在瓣状寡核苷酸的5'端上包含未配对“瓣状物”或“臂”。第一复合物为瓣状核酸内切酶例如FEN-1核酸内切酶的底物，所述核酸内切酶裂解瓣状寡核苷酸以释放5'瓣状部分。在次级反应中，释放的5'瓣状产物用作FRET盒上的侵入性寡核苷酸，以再次形成由瓣状核酸内切酶识别的结构，使得FRET盒得到切割。当荧光团和淬灭剂通过裂解FRET盒来分离时，产生高于背景荧光的可检测荧光信号。
如本文所用的术语“实时”是指通过检测或测量在反应进行中时，例如在孵育或热循环期间反应中的产物或信号积累来检测核酸扩增或信号扩增。此检测或测量可同时发生，或者其可在扩增反应过程期间的多个离散点时发生，或者其可为组合。例如，在聚合酶链反应中，可在全部或部分热循环期间同时发生检测(例如荧光检测)，或者可在一个或多个循环期间的一个或多个点时瞬时发生检测。在一些实施方案中，PCR或QuARTS反应的实时检测通过确定在多个循环中的每个循环中或在每个循环中的同一点(例如循环中的时间点或循环中的温度步骤)时的荧光水平来实现。扩增的实时检测也可称为在扩增反应“期间”的检测。
如本文所用，术语“定量扩增数据集”是指在靶标样品例如靶标DNA的定量扩增期间获得的数据。在定量PCR或QuARTS测定的情况下，定量扩增数据集为在扩增期间，例如在多个热循环或全部热循环期间获得的荧光值的集合。定量扩增的数据不限于在反应的任何特定点时收集的数据，并且应该可在每个循环的离散点时测量或贯穿每个循环连续测量。
如本文参考值实时PCR和PCR+INVADER测定期间收集的数据使用的缩写“Ct”和“Cp”是指跨越预定阈值的信号(例如荧光信号)指示正信号的循环。已使用各种方法计算用作信号对比浓度的决定因素的阈值，并且所述值通常表示为“跨越阈值”(Ct)或“跨越点”(Cp)。Cp值或Ct值可用于本文呈现的用于分析实时信号以确定测定或样品中变体和/或非变体组成的百分比的方法的实施方案中。
如本文所用，参考多核苷酸(即核苷酸序列)使用的术语“互补的”和“互补性”是指通过碱基配对规则相关的多核苷酸(即，核苷酸的序列)。例如，序列“5′-A-G-T-3′”与序列“3′-T-C-A-5′”互补。互补性可为“部分的”，其中仅一些核酸碱基根据碱基配对规则匹配。或者，在核酸之间可存在“完全”或“总体”互补性。在核酸链之间的互补程度对核酸链之间的杂交的效率和强度具有明显影响。这在扩增反应以及取决于核酸之间的结合的检测方法中特别重要。
如本文所用，术语“引物”是指下述寡核苷酸：所述寡核苷酸无论是在纯化的限制酶切消化中天然存在还是以合成方式产生，当置于其中诱导与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下(例如，在核苷酸和诱导剂诸如生物催化剂(例如DNA聚合酶等)存在下)时能够用作合成起始点。为了获得扩增中的最大效率，引物通常为单链，但是可替代地为部分或完全双链。引物的与模板核酸杂交的部分必须足够长以在诱导剂存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度取决于许多因素，包括温度、引物来源和使用方法。引物可包括标记、标签、捕获部分等。
如本文所用，术语“核酸分子”是指任何含有核酸的分子，包括但不限于DNA或RNA。这个术语涵盖包含任何具有已知的DNA和RNA碱基类似物的序列，包括但不限于：4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、氮丙啶胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧羟基-甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基胺甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基-胺甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基-氨基-甲基-2-硫尿嘧啶、βD-甘露糖基Q核苷(queosine)、5'-甲氧羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基醋酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基醋酸、氧基丁氧核苷(oxybutoxosine)、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧基醋酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基醋酸、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶及2,6-二氨基嘌呤。
如本文所用，术语“核碱基”与本领域使用的其他术语同义，所述其他术语包括“核苷酸”、“脱氧核苷酸”、“核苷酸残基”、“脱氧核苷酸残基”、“核苷酸三磷酸酯(NTP)”或脱氧核苷酸三磷酸酯(dNTP)。
“寡核苷酸”是指包含至少两个核苷酸单体单元(例如，核苷酸)，通常超过三个单体单元并且更通常地大于十个单体单元的核酸。寡核苷酸的精确尺寸通常取决于各种因素，包括最终功能或寡核苷酸的使用。为了进一步说明，寡核苷酸通常为小于200个残基长度(例如，15与100个之间)，然而，如本文所用，所述术语还旨在包括更长的多核苷酸链。寡核苷酸通常由其长度指示。例如，24个残基寡核苷酸被称为“24聚体”。通常，核苷单体通过磷酸二酯键或其类似物连接，包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、硫苯胺磷酸酯、酰苯胺磷酸酯、氨基磷酸酯等，包括相关抗衡离子，例如H+、NH4 +、Na+等，如果此类抗衡离子存在的话。另外，寡核苷酸通常为单链的。寡核苷酸任选地通过任何适合的方法制备，所述方法包括但不限于现有或天然序列的分离、DNA复制或扩增、逆转录、适当序列的克隆和限制性消化或通过如下方法进行直接化学合成：诸如Narang等人(1979)MethEnzymol.68:90-99的磷酸三酯方法；Brown等人.(1979)Meth Enzymol.68:109-151的磷酸二酯方法；Beaucage等人.(1981)Tetrahedron Lett.22:1859-1862的二乙基亚磷酰胺方法；Matteucci等人(1981)J Am Chem Soc.103:3185-3191的三酯方法；自动化合成方法；或者1984年7月3日颁布的、题为“Process For Preparing Polynucleotides”的、Caruthers等人的美国专利号4,458,066的固体支持方法，或者本领域技术人员已知的其他方法。所有这些参考文献以引用的方式并入。
生物聚合物的“序列”是指生物聚合物中单体单元(例如，核苷酸、氨基酸等)的顺序和同一性。核酸的序列(例如碱基序列)通常在5′至3′方向中读取。
如本文所用，术语“基因”是指核酸(例如，DNA)序列，其包含产生多肽、前体或RNA(例如，非编码RNA，诸如核糖体RNA、转移RNA、剪接体RNA、微小RNA)所需要的编码序列。多肽或非编码RNA可由全长编码序列或编码序列的任何部分来编码，只要全长或片段多肽的所需活性或功能性质(例如，酶活性、配体结合、信号转导、免疫原性等)得以保留。此术语也涵盖结构基因的编码区域以及与编码区域相邻位于5'和3'末端上、在任一个末端上达约1kb或更长的距离的序列，以使得基因对应于全长mRNA的长度。位于编码区域的5′并且存在于mRNA上的序列被称为5′非翻译序列。位于编码区域的3′或下游并且存在于mRNA上的序列被称为3′非翻译序列。术语“基因”涵盖基因的cDNA和基因组形式。基因的基因组形式或克隆含有以被称为“内含子”或“插入区域”或“插入序列”的非编码序列来间断的编码区域。内含子是转录至核RNA(例如，hnRNA)中的基因节段；内含子可含有调控元件(例如增强子)。内含子从核或原始转录物中去除或“剪除”；因此，内含子不存在于信使RNA(mRNA)转录物中。mRNA在翻译期间起作用以指定新生多肽中的氨基酸的序列或顺序。
除了含有内含子以外，基因的基因组形式还可包括位于RNA转录物上存在的5'和3'末端序列上的序列。这些序列被称为“侧接”序列或区域(这些侧接序列位于存在于mRNA转录物上的非翻译序列5'或3')。5'侧接区域可含有控制或影响基因转录的调控序列如启动子和增强子。3'侧接区域可含有引导转录终止、转录后裂解和多聚腺苷酸化的序列。
如本文所用，“甲基化”是指在胞嘧啶的位置C5或N4处的胞嘧啶甲基化、腺嘌呤的N6位置处的甲基化、或其他类型的核酸甲基化。体外扩增的DNA通常是未甲基化的，因为典型体外DNA扩增方法不会保留扩增模板的甲基化模式。然而，“未甲基DNA”或“甲基化DNA”也可以是指扩增的DNA，其初始模板分别为未甲基化或甲基化的。
因此，如本文所用，“甲基化核苷酸”或“甲基化核苷酸碱基”是指甲基部分中核苷酸碱基上的存在，其中甲基部分不存在于所识别的典型核苷酸碱基中。例如，胞嘧啶在其嘧啶环上不含有甲基部分，但是5-甲基胞嘧啶在其嘧啶环的位置5处含有甲基部分。因此，胞嘧啶不是甲基化核苷酸并且5-甲基胞嘧啶是甲基化核苷酸。中另一个实例中，胸腺嘧啶在其嘧啶环的位置5处含有甲基部分；然而，出于本文中的目的，胸腺嘧啶当存在于DNA中时不被视为甲基化核苷酸，因为胸腺嘧啶是DNA的典型核苷酸碱基。
如本文所用，“甲基化核酸分子”是指含有一个或多个甲基化核苷酸的核酸分子。
如本文所用，核酸分子的“甲基化状态”、“甲基化特征”和“甲基化状况”是指一种或多种甲基化核苷酸碱基在核酸分子中的存在或不存在。例如，含有甲基化胞嘧啶的核酸分子被认为是甲基化的(例如核酸分子的甲基化状态是甲基化的)。不含有任何核苷酸的核酸分子被认为是未甲基化的。
特定核酸序列(例如，如本文所述的基因标记或DNA区域)的甲基化状态可以指示序列中每个碱基的甲基化状态，或者可以指示序列内所述碱基(例如一个或多个胞嘧啶)的子集的甲基化状态，或者可以在提供或不提供序列内甲基化出现的位置的精确信息的情况下指示关于序列内的区域甲基化密度的信息。
核酸分子中核苷酸基因座的甲基化状态是指在核酸分子中的特定基因座处的甲基化核苷酸的存在或不存在。例如，当存在于核酸分子的第7个核苷酸处的核苷酸是5-甲基胞嘧啶时，在核酸分子中的第7个核苷酸处的胞嘧啶的甲基化状态是甲基化的。类似地，当存在于核酸分子的第7个核苷酸处的核苷酸是胞嘧啶(并且不是5-甲基胞嘧啶)时，在核酸分子中的第7个核苷酸处的胞嘧啶的甲基化状态是未甲基化的。
甲基化状况可以任选地由“甲基化值”表示或指示(例如表示甲基化频率、分数、比率、存在等)。甲基化值可以例如通过定量在用甲基化依赖性限制性酶进行限制性消化之后存在的完整核酸的量或者通过比较亚硫酸氢盐反应之后的扩增特征或者通过比较亚硫酸氢盐处理的和未处理的核酸的序列来生成。因此，值(例如甲基化值)表示甲基化状况并且可因此用作跨越基因座的多个拷贝的甲基化状况的定量指示物。当希望比较样品中的序列的甲基化状况与阈值或参考值时，这是特别有用的。
如本文所用，“甲基化频率”或“甲基化百分比(％)”是指分子或基因座为甲基化的情况数目相对于分子或基因座为未甲基化的情况的数目。
这样，甲基化状态描述了核酸(例如基因组序列)的甲基化的状态。另外，甲基化状态是指在特定基因组基因座处的核酸区段与甲基化相关的特征。此类特征包括但不限于此DNA序列内的任何胞嘧啶(C)残基是否为甲基化的、一个或多个甲基化C残基的位置、贯穿核酸的任何特定区域的甲基化C的频率或百分比以及由于例如等位基因起点的差异而导致的甲基化等位基因差异。术语“甲基化状态”、“甲基化特征”和“甲基化状况”也是指在生物样品中贯穿核酸的任何特定区域的甲基化C或未甲基化C的相对浓度、绝对浓度或模式。例如，如果核酸序列内的一个或多个胞嘧啶(C)残基是甲基化的，则其可称为“超甲基化”或具有“增加的甲基化”，而如果DNA序列内的一个或多个胞嘧啶(C)残基是未甲基化的，则其可称为“去甲基化”或具有“减少的甲基化”。同样地，如果核酸序列内的一个或多个胞嘧啶(C)残基与另一个核酸序列(例如来自不同区域或来自不同个体等)相比是甲基化的，则该序列被认为与其他核酸序列相比是超甲基化的或具有增加的甲基化。或者，如果DNA序列内的一个或多个胞嘧啶(C)残基与另一个核酸序列(例如来自不同区域或来自不同个体等)相比是未甲基化的，则该序列被认为与其他核酸序列相比是去甲基化的或具有减少的甲基化。另外，如本文所用的术语“甲基化模式”是指在核酸的一个区域上的甲基化和未甲基化核苷酸的集合性位点。当甲基化和未甲基化核苷酸的数目贯穿所述区域是相同或类似的但是甲基化和未甲基化核苷酸的位置是不同的时，两种核酸可具有相同或类似的甲基化频率或甲基化百分比，但是具有不同的甲基化模式。当序列的甲基化程度(例如一个相对于另一个具有增加或减少的甲基化)、频率或模式不同时，所述序列被认为是“差异甲基化的”或具有“甲基化差异”或具有“不同的甲基化状态”。术语“差异甲基化”是指癌症阳性样品中的核酸甲基化水平或模式与癌症阴性样品中的核酸甲基化水平或模式相比的差异。其也可以是指在手术之后具有癌症复发的患者对比不具有复发的患者之间的水平或模式的差异。DNA甲基化的差异甲基化和特定水平或模式是预后和预测的生物标记，例如一旦已定义正确截止值或预测特征。
甲基化状态频率可以用于描述个体群体或来自单一个体的样品。例如，具有50％甲基化状态频率的核苷酸基因座在50％情况下是甲基化的并且在50％情况下是未甲基化的。此频率可以用于例如描述在个体群体或核酸集合中核苷酸基因座或核酸区域甲基化的程度。因此，当第一核酸分子群体或集合中的甲基化不同于第二核酸分子群体或集合中的甲基化时，第一群体或集合的甲基化状态或频率将不同于第二群体或集合的甲基化状态频率。此频率也可以用于例如描述在单一个体中核苷酸基因座或核酸区域甲基化的程度。例如，此频率可以用于描述来自组织样品的一组细胞在核苷酸基因座或核酸区域处是甲基化或未甲基化的程度。
术语“高度甲基化”是指其中在特定样品类型或组织类型中特定基因座(例如CpG二核苷酸或二核苷酸集合或富含CpG区域)以可测量地大于对于另一种组织或样品类型中的相同DNA中的相当基因座观察到的比率甲基化的核酸。“高度甲基化”可以是指单一的特定C残基或一个区域内多个C中的甲基化作为正在测定的样品中的该基因座的拷贝的分数的平均比率。在未将所述术语限制为任何特定甲基化水平的情况下，在一些实施方案中，高度甲基化基因座可为>10％甲基化，优选地>20％至40％，更优选地>50％至75％，还更优选地在75％与100％之间。
如本文所用，“核苷酸基因座”是指核苷酸在核酸分子中的位置。甲基化核苷酸的核苷酸基因座是指甲基化核苷酸在核酸分子中的位置。
通常，人类DNA的甲基化出现于包括相邻鸟嘌呤和胞嘧啶的二核苷酸序列(也称为CpG二核苷酸序列)上，在所述二核苷酸序列中胞嘧啶位于鸟嘌呤的5'处。在人类基因组中CpG二核苷酸内的大部分胞嘧啶是甲基化的，然而一些胞嘧啶在富含特定CpG二核苷酸的基因组区域(也称为CpG岛)中保持未甲基化(参见例如Antequera等人(1990)Cell 62:503–514)。
如本文所用，“CpG岛”是指相对于总基因组DNA含有增加数目的CpG二核苷酸的基因组DNA的富含G:C的区域。CpG岛可为至少100、200或更多个碱基对长度，其中所述区域的G:C含量为至少50％并且所观察到的CpG频率相对于预期频率的比率为0.6；在一些情况下，CpG岛可为至少500个碱基对长度，其中所述区域的G:C含量为至少55％)并且所观察到的CpG频率相对于预期频率的比率为0.65。所观察到的CpG频率相对于预期频率可以根据Gardiner-Garden等人(1987)J.Mol.Biol.196:261–281中提供的方法来计算。例如，所观察到的CpG频率相对于预期频率可以根据公式R＝(A×B)/(C×D)计算，其中R是所观察到的CpG频率相对于预期频率的比率，A是所分析序列中CpG二核苷酸的数目，B是所分析序列中核苷酸的总数目，C是所分析序列中C核苷酸的总数目，并且D是所分析序列中G核苷酸的总数目。通常确定在CpG岛中，例如在启动子区域处的甲基化状态。尽管应当理解，人类基因组中的其他序列易于DNA甲基化诸如CpA和CpT(参见Ramsahoye(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:5237–5242；Salmon和Kaye(1970)Biochim.Biophys.Acta.204:340–351；Grafstrom(1985)Nucleic Acids Res.13:2827–2842；Nyce(1986)Nucleic Acids Res.14:4353–4367；Woodcock(1987)Biochem.Biophys.Res.Commun.145:888-894)。
如本文所用，术语“组织细胞”是指身体内，例如人类或动物身体内的任何组织细胞，包括例如上皮细胞、肌肉、神经和骨细胞。组织细胞不包括血液细胞。如本文所用，血液通常包含血浆、红血细胞、白雪细胞(包括白细胞和淋巴细胞)以及血小板。白细胞包括中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞，并且淋巴细胞包括T细胞、B细胞和自然杀伤细胞。
如本文所用，随着核酸分子甲基化状态的变化而修饰核酸分子的核苷酸的试剂或者甲基化特异性试剂是指可以反映核酸分子的甲基化状态的方式改变核酸分子的核苷酸序列的化合物或组合物或其他试剂。用此试剂处理核酸分子的方法可包括将核酸分子与试剂接触，根据需要与额外步骤结合以实现核苷酸序列的所需改变。核酸分子的核苷酸序列的此改变可产生其中每个甲基化核苷酸被修饰成不同核苷酸的核酸分子。核酸分子核苷酸序列的此改变可产生其中每个未甲基化核苷酸被修饰成不同核苷酸的核酸分子。核酸分子核苷酸序列的此改变可产生其中每个未甲基化的所选核苷酸(例如每个未甲基化的胞嘧啶)被修饰成不同核苷酸的核酸分子。使用此试剂改变核酸分子核苷酸序列可产生其中为甲基化核苷酸的每个核苷酸(例如每个甲基化的胞嘧啶)被修饰成不同核苷酸的核酸分子。如本文所用，修饰所选核苷酸的试剂的使用是指修饰核酸分子中四种通常出现的核苷酸(对于DNA为C、G、T和A并且对于RNA为C、G、U和A)的一个核苷酸的试剂，使得试剂修饰一个核苷酸而不修饰其他三个核苷酸。在一个示例性实施方案中，此试剂修饰未甲基化的所选核苷酸以产生不同的核苷酸。在另一个示例性实施方案中，此试剂可使未甲基化胞嘧啶核苷酸脱氨基。示例性试剂是亚硫酸氢盐。
术语“亚硫酸氢盐试剂”是指包含亚硫酸氢盐、焦亚硫酸盐、酸式亚硫酸盐或其组合的试剂，如本文所公开的，适用于区分甲基化与未甲基化CpG二核苷酸序列。所述处理的方法在本领域中是已知的(例如，PCT/EP2004/011715和WO 2013/116375，其各自全文以引用方式并入)。在一些实施方案中，亚硫酸氢盐处理在变性试剂(诸如但不限于正亚烷基二醇或二乙二醇二甲基醚(DME))存在下进行或在二氧杂环己烷或二氧杂环己烷衍生物存在下进行。在一些实施方案中，变性试剂以1％与35％(v/v)之间的浓度使用。在一些实施方案中，亚硫酸氢盐反应在清除剂存在下进行，所述清除剂诸如但不限于苯并二氢吡喃衍生物，例如6-羟基-2,5,7,8,-四甲基苯并二氢吡喃2-羧酸或三羟基苯甲酸以及其衍生物，例如没食子酸(参见：PCT/EP2004/011715，其全文以引用方式并入)。在某些优选的实施方案中，亚硫酸氢盐反应包括用亚硫酸氢铵处理，例如，如WO 2013/116375所述的。
术语“甲基化测定”是指用于确定核酸序列内一个或多个CpG二核苷酸序列的甲基化状态的任何测定。
术语“MS AP-PCR”(甲基化敏感性任意引物聚合酶链反应)是指本领域公认的技术，其允许使用富含CG的引物对基因组进行全面扫描以集中于最可能含有CpG二核苷酸的区域，并且通过Gonzalgo等人(1997)Cancer Research 57:594–599进行描述。
术语“MethyLightTM”是指通过Eads等人(1999)Cancer Res.59:2302–2306进行描述的本领域公认的基于荧光的实时PCR技术。
术语“HeavyMethylTM”是指一种测定，其中覆盖扩增引物之间的CpG位置或者由扩增引物覆盖的甲基化特异性阻断探针(在本文中也称为阻断剂)使得能够对核酸样品进行甲基化特异性选择性扩增。
术语“Ms-SNuPE”(甲基化敏感性单核苷酸引物延伸)是指通过Gonzalgo和Jones(1997)Nucleic Acids Res.25:2529–2531进行描述的本领域公认的测定。
术语“MSP”(甲基化特异性PCR)是指通过Herman等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:9821–9826并且通过美国专利号5,786,146进行描述的本领域公认的甲基化测定。
术语“COBRA”(组合亚硫酸氢盐限制性分析)是指通过Xiong和Laird(1997)Nucleic Acids Res.25:2532–2534进行描述的本领域公认的甲基化测定。
术语“MCA”(甲基化CpG岛扩增)是指通过Toyota等人(1999)Cancer Res.59:2307–12并在WO 00/26401A1中进行描述的甲基化测定。
如本文所用，术语“试剂盒”是指递送材料的任何递送系统。在反应测定的情况下，这类输送系统包括允许存储、运输反应试剂(例如，适当容器中的寡核苷酸、酶等)和/或支持材料(例如，缓冲剂、执行测定的书面指令等)或将其从一个位置输送至另一个位置的系统。举例来说，试剂盒包括一个或多个套罩(例如，盒)，其含有相关反应试剂和/或支持材料。如本文使用，术语“零散试剂盒”是指包括两个或更多个单独容器的输送系统，每个容器含有全部试剂盒组分的子部分。这些容器可共同或单独输送至预定接受者。举例来说，第一容器可含有用于测定的酶，而第二容器含有寡核苷酸。
如本文所用的术语“系统”是指出于特定目的使用的物品的集合。在一些实施方案中，物品包括使用说明书，作为例如物品、纸或可记录介质(例如DVD、CD、闪存驱动器等)上供应的信息。在一些实施方案中，说明书引导使用者到在线位置，例如网站。
如本文所用，术语“信息”是指事实或数据的任何集合。参考使用一个或多个计算机系统(包括但不限于因特网)储存或加工的信息，所述术语是指以任何格式(例如对话、数字、光等)存储的任何数据。如本文所用，术语“与受试者相关的信息”是指关于受试者(例如人类、植物或动物)的事实或数据。术语“基因组信息”是指关于基因组的信息，包括但不限于核酸序列、基因、甲基化百分比、等位基因频率、RNA表达水平、蛋白质表达、与基因型相关的表型等。“等位基因频率信息”是指关于等位基因频率的事实或数据，包括但不限于等位基因身份、等位基因的存在与受试者(例如人类受试者)的特征之间的统计相关性、个体或群体中等位基因的存在或不存在、等位基因存在于具有一种或多种特定特征的个体中的可能性百分比等。
具体实施方式
本文提供与进行用于检测和定量DNA例如甲基化DNA的测定相关的技术。特别地，本技术涉及用于此类甲基化测定的内部对照。
本公开的实施方案提供一种用作甲基化标记和内部对照的称为“B3GALT6”的标记。β-肌动蛋白(ACTB)基因通常在检测甲基化DNA的测定中用作内部对照靶标。然而，ACTB不含有甲基化CpG岛并且因此在亚硫酸氢盐转化时丧失全部胞嘧啶残基，这产生对于引物和探针设计可能有问题的高度富含AT的序列(例如，对于使用具有更高G-C含量的DNA的多重测定，必须使用更长探针和引物来实现ACTB的相同Tm范围，并且转化的ACTB的减小的序列复杂性增加引物和探针与反应物中的其他DNA的交叉反应性风险)。另外，已确定ACTBDNA以比甲基化DNA标记更快的速率经历亚硫酸氢盐转化，这使得难以实现同一样品中的ACTB标记和甲基化DNA标记的优化的亚硫酸氢盐转化参数。
在本技术的发展期间，确定B3GALT6为高度甲基化的DNA，其可用作替代性对照DNA。在本技术的发展期间，确定B3GALT6DNA在亚硫酸氢盐转化期间类似于甲基化标记DNA起作用。在亚硫酸氢盐处理期间甲基化C未转化时，使用甲基化DNA代替β-肌动蛋白作为内部对照DNA提供了在转化时维持其序列复杂性并允许在DNA检测测定例如PCR和/或瓣状核酸内切酶测定诸如下文所述的QuARTS测定中使用较短寡核苷酸的内部对照。
尽管本文的公开内容是指某些所说明的实施方案，但是应理解，这些实施方案通过举例而不是通过限制的方式呈现。
I.甲基化对照基因
在检测和定量已经历亚硫酸氢盐转化的甲基化富含CpG的DNA的测定中，典型的是还检测存在于同一种样品中的对照基因，所述对照基因验证所述测定中的DNA输入，无论来源如何(例如，癌症、正常、粪便、组织)。例如使用此对照基因以将不同样品的测定中获得的DNA拷贝数目数据归一化，以准确显示样品与样品的更高或更低的疾病相关性标记水平。
对于工作良好的甲基化测定归一化基因，应满足若干种标准。理想的归一化基因例如：1)应同样存在于正常和患病组织中；2)应与正在测定的一种或多种测试基因/一种或多种标记(例如，其中超甲基化为疾病状态的指示的DNA标记)大约相同的GC含量；3)应以与测试基因/标记相同的方式对预先定量(pre-PCR)样品处理诸如亚硫酸氢盐转化进行反应；并且4)应具有与正在测定的测试基因/标记的PCR扩增效率类似的PCR扩增效率。
β-肌动蛋白基因为通常用作用于检测甲基化标记DNA的归一化基因，其不具有与和疾病诸如癌症和腺瘤相关的甲基化标记(例如，vimentin、septin 9、NDRG4、BMP3)相同的GC含量和CpG甲基化，因此其不会在预先PCR亚硫酸氢盐转化或PCR扩增中像此类标记DNA一样起作用。
本文所述的实验鉴别在正常和癌症组织以及白血细胞中高度甲基化的基因(例如，B3GALT6)。本文所述的基因用于将患者和样品中的标记水平归一化。
II.甲基化检测测定
本文所述的标记(例如，特别地B3GALT6)在多种甲基化检测测定中用作归一化试剂和疾病状态的指示。
用于分析核酸是否存在5-甲基胞嘧啶的最频繁使用的方法是基于Frommer等人描述的用于检测DNA中的5-甲基胞嘧啶的亚硫酸氢盐方法(Frommer等人.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1827–31，出于所有目的全文以引用的方式明确并入本文)或其变型。映射5-甲基胞嘧啶的亚硫酸氢盐方法是基于以下观察：胞嘧啶而非5-甲基胞嘧啶与亚硫酸氢离子(也称为亚硫酸氢根)反应。所述反应通常根据以下步骤进行：首先，胞嘧啶与亚硫酸氢根反应以形成磺化嘧啶。接着，磺化反应中间体自发脱氨基产生磺化尿嘧啶。最终，磺化尿嘧啶在碱性条件下脱磺化以形成尿嘧啶。检测是可能的，因为尿嘧啶碱基与腺嘌呤配对(因此像胸腺嘧啶一样起作用)，而5-甲基胞嘧啶与鸟嘌呤配对(因此像胞嘧啶一样起作用)。这使得甲基化胞嘧啶与未甲基化胞嘧啶的辨别可以通过例如亚硫酸氢盐基因组测序(Grigg G和Clark S,Bioessays(1994)16:431–36；Grigg G,DNA Seq.(1996)6:189–98)、甲基化特异性PCR(MSP)(如例如美国专利号5,786,146所公开)、或使用包括序列特异性探针裂解的测定例如QuARTS瓣状核酸内切酶测定(参见例如Zou等人.(2010)“Sensitivequantification of methylated markers with a novel methylation specifictechnology”Clin Chem 56:A199；美国专利8,361,720和美国专利申请序列号；12/946,745；12/946,752以及61/705,603)来进行。
一些常规技术涉及包括以下的方法：将有待分析的DNA包封在琼脂糖基质中，从而防止DNA扩散和复性(亚硫酸氢盐仅与单链DNA反应)，以及用快速渗析置换沉淀和纯化步骤(Olek A等人.(1996)“A modified and improved method for bisulfite basedcytosine methylation analysis”Nucleic Acids Res.24:5064-6)。因此可以分析个别细胞的甲基化状况，说明所述方法的实用性和敏感性。用于检测5-甲基胞嘧啶的常规方法的概述由Rein,T.等人.(1998)Nucleic Acids Res.26:2255提供。
亚硫酸氢盐技术通常涉及在亚硫酸氢盐处理之后扩增已知核酸的短特异性片段，然后通过测序(Olek和Walter(1997)Nat.Genet.17:275–6)或引物延伸反应(Gonzalgo和Jones(1997)Nucleic Acids Res.25:2529–31；WO 95/00669；美国专利号6,251,594)测定产物以分析个别胞嘧啶位置。一些方法使用酶促消化(Xiong和Laird(1997)Nucleic AcidsRes.25:2532–4)。在本领域中也已描述通过杂交进行的检测(Olek等人,WO 99/28498)。另外，已描述用于对个别基因进行甲基化检测的亚硫酸氢盐技术的使用(Grigg和Clark(1994)Bioessays 16:431–6；Zeschnigk等人(1997)Hum Mol Genet.6:387–95；Feil等人(1994)Nucleic Acids Res.22:695；Martin等人(1995)Gene 157:261–4；WO 9746705；WO9515373)。
各种甲基化测定程序可以与根据本技术的亚硫酸氢盐处理结合使用。这些测定允许确定核酸序列内一个或多个CpG二核苷酸(例如，CpG岛)的甲基化状态。除其他技术之外，此类测定涉及亚硫酸氢盐处理的核酸的测序、PCR(用于序列特异性扩增)、DNA印迹分析以及使用甲基化敏感性限制性酶。
例如，已简化基因组测序以用于通过使用亚硫酸氢盐处理来分析甲基化模式和5-甲基胞嘧啶分布(Frommer等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1827–1831)。另外，由亚硫酸氢盐转化的DNA扩增的PCR产物的限制性酶消化可用于评定甲基化状态，例如，如Sadri和Hornsby(1997)Nucl.Acids Res.24:5058–5059所述的或者如称为COBRA(组合亚硫酸氢盐限制性分析)的方法中所体现的(Xiong和Laird(1997)Nucleic Acids Res.25:2532–2534)。
COBRATM分析时适用于测定少量基因组DNA中特定基因座处的DNA甲基化水平的定量甲基化测定(Xiong&Laird,Nucleic Acids Res.25:2532-2534,1997)。简言之，限制性酶消化用于揭示亚硫酸氢钠处理的DNA的PCR产物中的甲基化依赖性序列差异。甲基化依赖性序列差异首先通过根据Frommer等人描述的程序进行的标准亚硫酸氢盐处理引入到基因组DNA中(Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:1827-1831,1992)。亚硫酸氢盐转化的DNA的PCR扩增然后使用对目标CpG岛有特异性的引物进行，随后进行限制性核酸内切酶消化、凝胶电泳和使用特异性标记的杂交探针的检测。初始DNA样品中的甲基化水平以线性定量方式跨越广谱的DNA甲基化水平由相对量的消化和未消化PCR产物表示。另外，此技术可以可靠地应用于从显微切割的石蜡包埋的组织样品获得的DNA。
用于COBRATM分析的典型试剂(例如，如典型基于COBRATM的试剂盒中可见的)可以包括但不限于：用于特定基因座(例如，特定基因、标记、基因区域、标记区域、亚硫酸氢盐处理的DNA序列、CpG岛等)的PCR引物；限制性酶和适当缓冲液；基因杂交寡核苷酸；对照杂交寡核苷酸；用于寡核苷酸探针的激酶标记试剂盒；以及标记的核苷酸。另外，亚硫酸氢盐转化试剂可包括：DNA变性缓冲液；磺化缓冲液；DNA回收试剂或试剂盒(例如，沉淀、超滤、亲和力柱)；脱磺化缓冲液；以及DNA回收组分。
测定诸如“MethyLightTM”(基于荧光的实时PCR技术)(Eads等人.,Cancer Res.59:2302-2306,1999)、Ms-SNuPETM(甲基化敏感性单核苷酸引物延伸)反应(Gonzalgo&Jones,Nucleic Acids Res.25:2529-2531,1997)、甲基化特异性PCR(“MSP”；Herman等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:9821-9826,1996；美国专利号5,786,146)以及甲基化CpG岛扩增(“MCA”；Toyota等人,Cancer Res.59:2307-12,1999)单独使用或与这些方法中的一种或多种组合使用。
“HeavyMethylTM”测定技术是用于基于亚硫酸氢盐处理的DNA的甲基化特异性扩增来评定甲基化差异的定量方法。覆盖扩增引物之间的CpG位置或者由扩增引物覆盖的甲基化特异性阻断探针(“阻断剂”)使得能够对核酸样品进行甲基化特异性选择性扩增。
术语“HeavyMethylTMMethyLightTM”测定是指MethyLightTM测定变型的HeavyMethylTMMethyLightTM测定，其中MethyLightTM测定与覆盖扩增引物之间的CpG位置的甲基化特异性阻断探针组合。HeavyMethylTM测定也可以与甲基化特异性扩增引物组合使用。
用于HeavyMethylTM分析的典型试剂(例如，如典型基于MethyLightTM的试剂盒中可见的)可以包括但不限于：用于特定基因座(例如，特定基因、标记、基因区域、标记区域、亚硫酸氢盐处理的DNA序列、CpG岛或亚硫酸氢盐处理的DNA序列或CpG岛等)的PCR引物；阻断寡核苷酸；优化的PCR缓冲液和脱氧核苷酸；以及Taq聚合酶。
MSP(甲基化特异性PCR)允许独立于甲基化敏感性限制性酶的使用而评定CpG岛内事实上任何CpG位点组的甲基化状况(Herman等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:9821-9826,1996；美国专利号5,786,146)。简言之，DNA通过亚硫酸氢钠修饰，所述亚硫酸氢钠将未甲基化而非甲基化胞嘧啶转化成尿嘧啶，并且随后用对甲基化对比未甲基化DNA有特异性的引物扩增产物。MSP仅需要少量DNA，对给定CpG岛基因座的0.1％甲基化等位基因敏感，并且可以对从石蜡包埋的样品提取的DNA进行。用于MSP分析的典型试剂(例如，如典型基于MSP的试剂盒中可见的)可包括但不限于：用于特定基因座(例如，特定基因、标记、基因区域、标记区域、亚硫酸氢盐处理的DNA序列、CpG岛等)的甲基化和未甲基化PCR引物；优化的PCR缓冲液和脱氧核苷酸，以及特定探针。
MethyLightTM测定是利用基于荧光的实时PCR(例如)的高通量定量甲基化测定，其不需要在PCR步骤之后进一步操纵(Eads等人,Cancer Res.59:2302-2306,1999)。简言之，MethyLightTM过程以基因组DNA的混合样品开始，所述基因组DNA根据标准程序在亚硫酸氢钠反应中转化成甲基化依赖性序列差异的混合集合(亚硫酸氢盐过程将未甲基化胞嘧啶残基转化成尿嘧啶)。然后在“偏置的”反应中例如用重叠已知CpG二核苷酸的PCR引物进行基于荧光的PCR。在扩增过程的水平下并且在荧光检测过程的水平下进行序列辨别。
将MethyLightTM测定用作核酸(例如基因组DNA样品)中的甲基化模式的定量测试，其中序列辨别在探针杂交水平下发生。在定量型式中，PCR反应在重叠特定推定甲基化位点的荧光探针存在下提供甲基化特定扩增。其中引物和探针二者均不重叠任何CpG二核苷酸的反应提供一定量输入DNA的未偏置对照。或者，用于基因组甲基化的定性测试通过用不覆盖已知甲基化位点(例如，HeavyMethylTM和MSP技术的基于荧光的型式)的对照寡核苷酸或者用覆盖潜在甲基化位点的寡核苷酸探测偏置的PCR集合来实现。
MethyLightTM过程与任何适合探针(例如探针、探针等)一起使用。例如，在一些应用中，双链基因组DNA用亚硫酸氢钠处理并且经历使用探针，例如使用MSP引物和/或HeavyMethyl阻断剂寡核苷酸和探针进行的两组PCR反应之一。探针用荧光“报告基因”和“淬灭剂”分子双重标记并且被设计为对相对高GC含量的区域有特异性，使得其在PCR循环中在比正向或反向引物高约10℃的高温度下熔化。这允许探针在PCR退火/延长步骤期间保持完全杂交。随着Taq聚合酶在PCR期间酶促合成新链，它最终将到达退火的探针。Taq聚合酶5′至3′内切核苷酸活性将通过消化探针来置换所述探针以释放荧光报告分子，以使用实时荧光检测系统定量检测器新的未淬灭信号。
用于MethyLightTM分析的典型试剂(例如，如典型基于MethyLightTM的试剂盒中可见的)可以包括但不限于：用于特定基因座(例如，特定基因、标记、基因区域、标记区域、亚硫酸氢盐处理的DNA序列、CpG岛等)的PCR引物；或探针；优化的PCR缓冲液和脱氧核苷酸；以及Taq聚合酶。
QMTM(定量甲基化)测定是用于基因组DNA样品中的甲基化模式的替代性定量测试，其中序列辨别在探针杂交水平下发生。在此定量型式中，PCR反应在重叠特定推定甲基化位点的荧光探针存在下提供未偏置扩增。其中引物和探针二者均不重叠任何CpG二核苷酸的反应提供一定量输入DNA的未偏置对照。或者，用于基因组甲基化的定性测试通过用不覆盖已知甲基化位点(HeavyMethylTM和MSP技术的基于荧光的型式)的对照寡核苷酸或者用覆盖潜在甲基化位点的寡核苷酸探测偏置的PCR集合来实现。
QMTM过程可以与任何适合的探针，例如探针、探针一起用于扩增过程中。例如，双链基因组DNA用亚硫酸氢钠处理并且经历未偏置引物和探针。探针用荧光“报告基因”和“淬灭剂”分子双重标记并且被设计为对相对高GC含量的区域有特异性，使得其在PCR循环中在比正向或反向引物高约10℃的高温度下熔化出来。这允许探针在PCR退火/延长步骤期间保持完全杂交。随着Taq聚合酶在PCR期间酶促合成新链，它最终将到达退火的探针。Taq聚合酶5′至3′内切核苷酸活性将通过消化探针来置换所述探针以释放荧光报告分子，以使用实时荧光检测系统定量检测器新的未淬灭信号。用于QMTM分析的典型试剂(例如，如典型基于QMTM的试剂盒中可见的)可以包括但不限于：用于特定基因座(例如，特定基因、标记、基因区域、标记区域、亚硫酸氢盐处理的DNA序列、CpG岛等)的PCR引物；或探针；优化的PCR缓冲液和脱氧核苷酸；以及Taq聚合酶。
Ms-SNuPETM技术为用于基于DNA的亚硫酸氢盐处理评定在特定CpG位点处的甲基化差异的定量方法，随后进行单核苷酸引物延长(Gonzalgo和Jones,Nucleic Acids Res.25:2529-2531,1997)。简言之，基因组DNA与亚硫酸氢钠反应以将未甲基化胞嘧啶转化成尿嘧啶，同时留下5-甲基胞嘧啶未改变。然后使用对亚硫酸氢盐转化的DNA有特异性的PCR引物进行所需靶标序列的扩增，并且分离所得产物并将其用作在目标CpG位点处进行甲基化分析的模板。可以分析少量DNA(例如，显微切割病理切片)并且这避免利用限制性酶来确定CpG位点处的甲基化状况。
用于Ms-SNuPETM分析的典型试剂(例如，如典型基于Ms-SNuPETM的试剂盒中可见的)可以包括但不限于：用于特定基因座(例如，特定基因、标记、基因区域、标记区域、亚硫酸氢盐处理的DNA序列、CpG岛等)的PCR引物；优化的PCR缓冲液和脱氧核苷酸；凝胶提取试剂盒；阳性对照引物；用于特定基因座的Ms-SNuPETM引物；反应缓冲液(用于Ms-SNuPE反应)；以及标记的核苷酸。另外，亚硫酸氢盐转化试剂可包括：DNA变性缓冲液；磺化缓冲液；DNA回收试剂或试剂盒(例如，沉淀、超滤、亲和力柱)；脱磺化缓冲液；以及DNA回收组分。
简化基因组甲基化测序(RRBS)以核酸的亚硫酸氢盐处理开始，以将所有未甲基化胞嘧啶转化成尿嘧啶，随后进行限制性酶消化(例如，通过识别包括CG序列的位点的酶诸如MspI)并在偶合至衔接子配体之后对片段进行完全测序。限制性酶的选择丰富了CpG密集区域的片段，从而减少可在分析期间映射到多个基因位置的冗余序列的数目。这样，RRBS通过选择用于测序的限制性片段的子集(例如通过使用制备型凝胶电泳进行尺寸选择)来减小核酸样品的复杂性。与全基因组亚硫酸氢盐测序相反，通过限制性酶消化产生的每个片段含有至少一个CpG二核苷酸的DNA甲基化信息。这样，RRBS使样品富集在这些区域中具有高频率限制性酶切割位点的启动子、CpG岛和其他基因组特征部并且因此提供评定一个或多个基因组基因座的甲基化状态的测定。
RRBS的典型方案包括用限制性酶诸如MspI消化核酸样品、在突出部和A-尾部填充、连接衔接子、亚硫酸氢盐转化以及PCR的步骤。参见例如等人(2005)“Genome-scale DNAmethylation mapping of clinical samples at single-nucleotide resolution”NatMethods 7:133–6；Meissner等人.(2005)“Reduced representation bisulfitesequencing for comparative high-resolution DNA methylation analysis”NucleicAcids Res.33:5868–77。
在一些实施方案中，使用定量等位基因特异性实时靶标和信号扩增(QuARTS)测定来评价甲基化状态。三种反应依次在每个QuARTS测定中发生，包括初级反应中的扩增(反应1)和靶标探针裂解(反应2)；以及次级反应中的FRET裂解和荧光信号生成(反应3)。当用特定引物扩增靶标核酸时，具有瓣状序列的特定检测探针松散地结合扩增子。特定侵入性寡核苷酸在靶标结合位点处的存在使得5′核酸酶例如FEN-1核酸内切酶通过在检测探针与瓣状序列之间切割来释放瓣状序列。瓣状序列与对应FRET盒的非发夹部分互补。因此，瓣状序列用作FRET盒上的侵入性寡核苷酸并且在FRET盒荧光团与淬灭剂之间实现裂解，从而产生荧光信号。裂解反应可以每个靶标切割多个探针并且因此每个瓣状物释放多个荧光团，从而提供指数信号扩增。QuARTS可以在单个反应中通过使用具有不同染料的FRET盒良好检测多个靶标。参见例如Zou等人(2010)“Sensitive quantification of methylated markerswith a novel methylation specific technology”ClinChem 56:A199)。
术语“亚硫酸氢盐试剂”是指包含亚硫酸氢盐、焦亚硫酸盐、酸式亚硫酸盐或其组合的试剂，如本文所公开的，适用于区分甲基化与未甲基化CpG二核苷酸序列。所述处理的方法在本领域中是已知的(例如，PCT/EP2004/011715和WO 2013/116375，其各自全文以引用方式并入)。在一些实施方案中，亚硫酸氢盐处理在变性试剂(诸如但不限于正亚烷基二醇或二乙二醇二甲基醚(DME))存在下进行或在二氧杂环己烷或二氧杂环己烷衍生物存在下进行。在一些实施方案中，变性试剂以1％与35％(v/v)之间的浓度使用。在一些实施方案中，亚硫酸氢盐反应在清除剂存在下进行，所述清除剂诸如但不限于苯并二氢吡喃衍生物，例如6-羟基-2,5,7,8,-四甲基苯并二氢吡喃2-羧酸或三羟基苯甲酸以及其衍生物，例如没食子酸(参见：PCT/EP2004/011715，其全文以引用方式并入)。在某些优选的实施方案中，亚硫酸氢盐反应包括用亚硫酸氢铵处理，例如，如WO 2013/116375所述的。
在一些实施方案中，纯化亚硫酸氢盐处理的DNA，之后定量。这可以通过本领域已知的任何手段进行，诸如但不限于超滤，例如通过MicroconTM柱(由MilliporeTM制造)。根据修改的制造商方案进行纯化(参见例如，PCT/EP2004/011715，其全文以引用的方式并入本文)。在一些实施方案中，亚硫酸氢盐处理的DNA结合固体支持体，例如磁珠，并且在DNA结合支持体时进行脱磺化和洗涤。此类实施方案的实例提供于WO 2013/116375中。在某些优选的实施方案中，支持体结合的DNA准备好用于在支持体上进行脱磺化和洗涤之后立即进行甲基化测定。在一些实施方案中，在测定之前从支持体洗脱脱磺化DNA。
在一些实施方案中，使用根据本发明的引物寡核苷酸集合(例如参见表2)和扩增酶扩增处理的DNA的片段。若干DNA区段的扩增可以在一个反应容器中同时进行。通常，扩增使用聚合酶链反应(PCR)进行。
在所述方法的另一个实施方案中，在标记内或标记附近的CpG位置的甲基化状况通过使用甲基化特异性引物寡核苷酸来检测。此技术(MSP)已描述于例如Herman的美国专利号5,786,146和6,265,171中。使用甲基化状况特异性引物扩增亚硫酸氢盐处理的DNA允许区分甲基化核酸与未甲基化核酸。MSP引物对含有与亚硫酸氢盐处理的CpG二核苷酸杂交的至少一种引物。因此，所述引物的序列包含至少一种CpG二核苷酸。对未甲基化DNA有特异性的MSP引物在与CpG中的C位置对应的位置处含有“T”。
通过扩增获得的片段可携带直接或间接可检测的标记。在一些实施方案中，标记为荧光标记、放射性核素或具有可在质谱仪中检测到的典型质量的可拆卸分子片段。在所述标记为质量标记时，一些实施方案表明标记的扩增子具有单一正或负净电荷，允许在质谱仪中有更好的可检测性。检测可以通过例如基质辅助激光解吸/电离质谱法(MALDI)或者使用电喷雾质谱法(ESI)来进行和查看。
用于分离适用于这些测定技术的DNA的方法在本领域中是已知的。具体地，一些实施方案包括分离核酸，如美国专利申请序列号13/470,251(“Isolation of NucleicAcids”，公开为US 2012/0288868)所述的，所述申请全文以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，本文所述的标记用于对粪便样品进行的QuARTS测定中。在一些实施方案中，提供用于产生DNA样品的方法并且具体地是用于产生包含小体积(例如小于100、小于60微升)的高度纯化的低丰度核酸并且基本上和/或有效地不含抑制用于测试DNA样品的测定(例如，PCR、INVADER、QuARTS测定等)的物质的DNA样品的方法。此类DNA样品可用于诊断测定中，所述诊断测定定性地检测存在于从患者采集的样品中的基因、基因变体(例如等位基因)或基因修饰(例如甲基化)的存在或者定量测量它们的活性、表达或量。例如，一些癌症与特定突变体等位基因或特定甲基化状态的存在相关，并且因此检测和/或定量此类突变体等位基因或甲基化状态在癌症的诊断和治疗方面具有预测价值。
许多有价值的基因标记以极低的量存在于样品中并且产生此类标记的许多事件是罕见的。因此，甚至敏感性检测方法诸如PCR需要大量DNA以提供足够的低丰度靶标以满足或取代测定的检测阈值。此外，甚至少量抑制性物质的存在会损害涉及检测此少量靶标的这些测定的准确性和精确性。因此，本文提供了提供体积和浓度的必需管理以产生此类DNA样品的方法。
一些生物样品诸如粪便样品含有对PCR有抑制性的广泛多种不同的化合物。因此，DNA提取程序包括移除和/或灭活PCR抑制剂的方法。这样，在一些实施方案中，在实施例1中描述了处理并制备样品并且具体地但不排他地为用于从包含核酸的样品移除测定抑制剂的方法、洗脱和试剂盒。
在一些实施方案中，样品包括例如来自胃肠、肺和其他癌症的血液、血清、血浆、胃分泌物、胰液、活检样品、来自活检物的显微切割细胞、脱落到管腔中的细胞和/或从粪便回收的细胞。在一些实施方案中，受试者是人类。样品可包括例如来自肺、肝、胆管、胰腺、胃、结肠、直肠、食管、小肠、阑尾、十二指肠、息肉、胆囊、肛门和/或腹膜的细胞、分泌物或组织。在一些实施方案中，样品包括细胞液、腹水、尿液、粪便、胰液、在内窥镜检查期间获得的流体、血液、黏液或唾液。在一些实施方案中，所述样品为粪便样品。
此类样品可以通过本领域已知的任何数目的手段获得，诸如技术人员将清楚的。例如，尿液和粪便样品可容易得到，而血液、腹水、血浆或胰液样品可通过例如使用针和注射器在胃肠外获得。无细胞或基本上无细胞样品可以通过使样品经历本领域技术人员已知的各种技术来获得，本技术包括但不限于离心和过滤。尽管通常优选的是不使用侵入性技术获得样品，但是获得诸如组织均质物、组织切片和活检物试样仍可为优选的。本技术不限于用于准备样品并提供用于测试的核酸的方法。例如，在一些实施方案中，使用直接基因捕获(例如，如美国专利号8,808,990和9,169,511以及WO 2012/155072所详述的)或通过相关方法从粪便样品或从血液或从血浆样品中分离DNA。
标记的分析可以单独进行或与一种测试样品内的额外标记同时进行。例如，若干种标记可以组合到用于有效处理多种样品并用于潜在提供更大诊断和/或预后准确性的一种测试中。另外，本领域技术人员将认识到测试来自同一位受试者的多个样品(例如，在连续时间点)的价值。系列样品的此测试可允许鉴别标记甲基化状态随着时间的改变。甲基化状态的改变以及甲基化状态的改变的不存在可以提供关于疾病状况的有用信息，包括但不限于鉴别从事件开始的近似时间、可挽救组织的存在和量、药物疗法的适当性、不同疗法的有效性以及受试者结果的鉴别，包括未来事件的风险。
生物标记的分析可以各种物理形式进行。例如，微升板或自动化的使用可以用于帮助处理大量测试样品。或者，可开发单一样品形式以例如在回廊走动或急诊室环境中及时帮助进行即时处理和诊断。
预期本技术的实施方案以试剂盒的形式提供。所述试剂盒包括本文所述的组合物、设备、装置等的实施方案和试剂盒的使用说明书。此类说明书描述了用于制备来自样品的分析物的适当方法，例如用于收集样品并由所述样品制备核酸的方法。试剂盒的个别组分被包装在适当容器和包装(例如，小瓶、箱、泡罩包装、安瓿、广口瓶、瓶、管等)中并且所述组分一起包装在适当容器(例如，一个或多个箱)中以方便存储、运输和/或由使用者使用试剂盒。应当理解，液体组分(例如缓冲液)可以冻干形式提供以由使用者重构。试剂盒可包括用于评定、验证和/或确保试剂盒的性能的对照或参考。例如，用于测定存在于样品中的核酸的量的试剂盒可包括对照，所述对照包括已知浓度的同一种或另一种用于比较的核酸并且在一些实施方案中为对于对照核酸有特异性的检测试剂(例如，引物)。试剂盒适用于在临床环境中使用并且在一些实施方案中适用于在使用者家中使用。在一些实施方案中，试剂盒的组分提供系统用于由样品制备核酸溶液的功能。在一些实施方案中，系统的某些组分由使用者提供。
III.其他应用
在一些实施方案中，诊断测定鉴别个体中疾病或病状的存在。在一些实施方案中，疾病为癌症(例如肺癌、肝癌、胃肠系统癌症)。
本公开不限于特定的标记。在一些实施方案中，利用异常甲基化与肿瘤相关的标记(例如，vimentin、septin 9、NDRG4中的一种或多种；还参见2014年12月12日提交的美国临时专利申请号62/091,053，其出于所有目的全文以引用的方式并入本文)。在一些实施方案中，测定还包括检测突变的KRAS基因(参见例如实施例1)。在一些实施方案中，测定还包括检测粪便样品中的血红蛋白(参见例如实施例1)。
在一些实施方案中，本技术涉及一种用于治疗患者(例如，患有肺癌、患有早期癌症或可能发展癌症的患者)的方法，所述方法包括确定如本文所提供的一种或多种标记的甲基化状态并基于确定所述甲基化状态的结果向患者施用治疗。所述治疗可为药物化合物、疫苗、执行手术、对患者成像、执行另一种测试的施用。优选地，所述使用是在临床筛选方法、预后评定方法、监测疗法的结果的方法中、鉴别最可能响应于特定治疗性治疗的患者的方法中、对患者或受试者成像的方法、以及用于药物筛选和开发的方法中。
在本技术的一些实施方案中，提供一种用于诊断受试者中的癌症的方法。如本文所用的术语“诊断(diagnosing/diagnosis)”是指技术人员可以评估并且甚至确定受试者是否罹患给定疾病或病状或在未来可能发展给定疾病或病状的方法。技术人员通常基于一个或多个诊断指示因子例如像生物标记(例如，本文所述的那些)做出诊断，所述生物标记的甲基化状态指示病状的存在、严重性或不存在。
连同诊断一起，临床癌症预后涉及确定癌症的侵袭性和肿瘤复发的可能性以计划最有效的疗法。如果可以做出更准确的预后或者甚至可以评定发展癌症的潜在风险，则可以选择适当疗法并且在一些情况下为患者选择较不严重的疗法。癌症生物标记的评定(例如，确定甲基化状态)适用于区分具有良好预后和/或发展癌症的低风险并将不需要疗法或需要有限疗法的受试者与更可能发展癌症或遭遇癌症复发并受益于更强烈的治疗的那些受试者。
这样，如本文所用的“做出诊断”或“诊断”进一步包括基于本文所公开的诊断生物标记(例如，本文所述的那些)的测量来确定发展癌症的风险或确定预后(这可提供预测临床结果(使用或未使用医学治疗))、选择适当治疗(或治疗是否将有效)或监测当前治疗以及潜在地改变治疗。另外，在本发明公开的主题的一些实施方案中，可以随着时间对生物标记进行多次确定以帮助诊断和/或预后。生物标记的暂时改变可以用于预测临床结果、监测癌症的进展、和/或监测针对癌症的适当疗法的功效。在此实施方案中，例如，可以预期在有效疗法过程期间看到生物样品中本文所公开的一种或多种生物标记(以及如果监测的话，潜在地一种或多种另外的生物标记)的甲基化状态的改变。
在一些实施方案中，本发明公开的主题进一步提供一种用于确定在受试者中是否开始或继续癌症的预防或治疗的方法。在一些实施方案中，所述方法包括提供在一个时间段内来自受试者的一系列生物样品；分析所述系列生物样品以确定在每种生物样品中本文所公开的至少一种生物标记的甲基化状态；以及比较每种生物样品中一种或多种生物标记的甲基化状态的任何可测量改变。生物标记的甲基化状态随着时间段的任何改变可以用于预测发展癌症的风险、预测临床结果、确定是否开始或继续癌症的预防或疗法和当前疗法是否有效于治疗癌症。例如，第一时间点可以选择在治疗开始之前并且第二时间点可以选择在治疗开始之后的一些时间。甲基化状态可以在从不同时间点获得的每种样品中测量并且标注定性和/或定量差异。来自不同样品的生物标记水平的甲基化状态的改变可能与癌症风险、预后、确定治疗功效和/或受试者中癌症的进展相关。
在优选的实施方案中，本发明的方法和组合物用于治疗或诊断早期阶段的疾病，例如在疾病症状出现之前的疾病。在一些实施方案中，本发明的方法和组合物用于治疗或诊断临床阶段的疾病。
正如所注，在一些实施方案中，可以对一种或多种诊断或预后生物标记做出多次测定，并且标记的临时改变可以用于确定诊断或预后。例如，诊断标记可以在初始时间测定并且在第二个时间再次测定。在此类实施方案中，标记从初始时间到第二个时间的增加可以诊断癌症的特定类型或严重性或者给定的预后。同样，标记从初始时间到第二个时间的减少可以指示癌症的特定类型或严重性或者给定的预后。另外，一种或多种标记的改变程度可能与癌症的严重性和未来的不良事件相关。技术人员将理解的是，当在某些实施方案中可以在多个时间点对同一种生物标记进行比较性测量时，也可以在一个时间点测量给定生物标记，并且在第二时间点测量第二生物标记，并且这些标记的比较可以提供诊断信息。
如本文所用，短语“确定预后”是指技术人员可以预测受试者的病状的过程或结果的方法。术语“预后”并不是指以100％准确性预测病状的过程或结果的能力或者甚至给定的过程或结果是基于生物标记的甲基化状态可预测的以或多或少可以发生。相反，本领域技术人员将理解术语“预后”是指某一过程或结果将发生的可能性增加；也就是说，与未表现出病状的那些个体相比，在表现出给定病状的受试者中更容易出现所述过程或结果。例如，在未表现出病状的个体(例如，具有一种或多种靶标基因的正常甲基化状态)中，给定结果(例如罹患癌症)的机会可能非常低。
在一些实施方案中，统计学分析使预后指示因子与不良结果的倾向相关联。例如，在一些实施方案中，与从未患有癌症的患者获得的正常对照样品中的甲基化状态不同的甲基化状态可以发信号表明受试者比具有更类似于对照样品中的甲基化状态的水平的受试者更可能罹患癌症，如通过统计学显著性水平所确定的。另外，甲基化状态相对于基线(例如“正常”)水平的改变可以反映受试者预后，并且甲基化状态的改变程度可能与不良事件的严重性相关。统计学显著性通常通过比较两个或更多个群体并且确定置信区间和/或p值来确定。参见例如Dowdy和Wearden,Statistics for Research,John Wiley&Sons,NewYork,1983，其全文以引用的方式并入本文。本发明主题的示例性置信区间为90％、95％、97.5％、98％、99％、99.5％、99.9％和99.99％，而示例性p值为0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001和0.0001。
在其他实施方案中，可以确定本文所公开的预后或诊断生物标记的甲基化状态的改变阈值，并且生物样品中生物标记的甲基化状态的改变程度简单地与甲基化状态的改变阈值相比较。本文所提供的生物标记的甲基化状态的优选阈值改变为约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约50％、约75％、约100％以及约150％。在其他实施方案中，可以建立“诺模图”，通过它，预后或诊断指示因子(生物标记或生物标记的组合)的甲基化状态与朝向给定结果的相关处置直接相关。技术人员利用此类诺模图知道将两个数值与此测量中的不确定性与标记浓度中的不确定性相同的理解相关联，因为引用个别样品测量值，而非群体平均值。
在一些实施方案中，对照样品与生物样品同时分析，使得从生物样品获得的结果可以与从对照样品获得的结果相比较。另外，预期可以提供标准曲线，其可以与生物样品的测定结果相比较。如果使用荧光标签，则此类标准曲线存在作为测定单元(例如荧光信号强度)的函数的生物标记的甲基化状态。使用从多个供体获得的样品，可以提供正常组织中的一种或多种生物标记的对照甲基化状态以及从患有化生的供体或从患有癌症的供体获得的组织中的一种或多种生物标记的“风险”水平的标准曲线。在所述方法的一些实施方案中，在鉴别从受试者获得的生物样品中的本文所提供的一种或多种标记的异常甲基化状态时，受试者被鉴别为患有化生。在所述方法的其他实施方案中，从受试者获得的生物样品中的一种或多种此类生物标记的异常甲基化状态的检测导致受试者鉴别为患有癌症。
在一些实施方案中，如果当与对照甲基化状态相比较时样品中至少一种生物标记的甲基化状态存在可测量的差异，则受试者诊断为患有癌症。相反，当在生物样品中鉴别甲基化状态无改变时，受试者可以鉴别为不含有癌症、未处于癌症的风险下或者具有低癌症风险。关于这一点，患有癌症或具有其风险的受试者可以与具有低癌症至基本上没有癌症或者没有癌症风险的患者区别开来。具有发展特定癌症例如胃肠癌的风险的那些受试者可以置于更强烈和/或规则的筛选方案下，包括例如内镜监测。在另一方面，具有低风险至基本上不具有风险的那些受试者可以避免经历侵入性筛选方法诸如内窥镜检查，直到在未来筛选时，例如根据本技术进行的筛选指示在那些受试者中出现癌症的风险。
如以上所提及的，根据本技术的方法的实施方案，检测一种或多种生物标记的甲基化状态的改变可为定性测定或者其可为定量测定。这样，将受试者诊断为患有肺癌或处于发展癌症的风险下的步骤指示进行某些阈值测量，例如生物样品中一种或多种生物标记的甲基化状态从预定对照甲基化状态发生改变。在所述方法的一些实施方案中，对照甲基化状态为生物标记的任何可检测甲基化状态。在其中对照样品与生物样品同时测试的所述方法的其他实施方案中，预定甲基化状态为对照样品中的甲基化状态。在所述方法的其他实施方案中，预定甲基化状态是基于标准曲线和/或由标准曲线鉴别。在所述方法的其他实施方案中，预定甲基化状态为明确的状态或状态范围。这样，可以部分基于正在实践的方法和所需特异性的实施方案等在本领域技术人员将清楚的可接受限制内选择预定甲基化状态。
此外，关于诊断方法，优选受试者是脊椎动物受试者。优选的脊椎动物是温血的；优选的温血脊椎动物是哺乳动物。优选的哺乳动物最优选地是人类。如本文所用，术语“受试者”包括人类和动物受试者二者。因此，本文中提供兽医治疗用途。因此，本技术提供了哺乳动物的诊断，诸如人类以及那些由于濒危而对人类具有重要意义的哺乳动物(诸如西伯利亚虎)；对人类具有经济价值的哺乳动物(诸如农场饲养的用于人类消费的动物)；和/或对人类具有社会价值的动物(诸如宠物或动物园中的动物)。这类动物的实例包括但不限于：食肉动物，诸如猫和狗；猪类，包括猪(pig)、猪(hog)和野猪；反刍动物和/或有蹄动物，诸如牛、公牛、绵羊、长颈鹿、鹿、山羊、野牛和骆驼；鳍足类动物；以及马。因此，还提供了家畜的诊断和治疗，包括但不限于驯养的猪类、反刍动物、有蹄动物、马(包括赛马)等等。本发明公开的主题还包括一种用于诊断受试者中的胃肠癌、肺癌或其他癌症的系统。所述系统可以例如作为商用试剂盒提供，所述商用试剂盒可用于在已收集生物样品的受试者中筛选癌症的风险或诊断癌症。根据本技术提供的示例性系统包括评定本文所述的标记的甲基化状态。
在某些实施方案中，本文所述的组合物、反应和/或方法用于多种诊断、医疗、分析和研究应用中，并且本发明不应视为限于任何特定领域或使用。然而，在特定实施方案中，本发明用于分析、检测、表征等来自粪便的核酸(例如，人类核酸、靶标核酸等)。用于本文所述的实施方案中的组合物、方法、装置等可见于例如美国专利号8,361,720；7,981,612；7,368,233；6,964,846；6,919,174；6,849,403；6,844,155；6,818,404；6,750,020；6,586,177；6,551,777；6,503,718；6,498,012；6,482,595；6,475,738；6,428,964；6,415,455；6,406,857；6,351,857；6,303,304；6,300,077；6,280,947；6,268,136；6,203,993；6,146,828；6,143,529；6,020,137；5,952,178；5,928,870；5,888,778；5,830,665；5,741,650；5,670,325；其各自出于任何目的全文以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，本文所述的组合物和方法用于例如定量等位基因特异性实时靶标和信号扩增测定(QuARTS测定)，例如，如美国专利号8,361,720；8,715,937；8,916,344；以及9,212,392所述。
实验
在与癌症例如直肠癌的测试相关的技术的实施方案的发展期间，实验表明使用甲基化对照DNA将提供改进的测试。因此，本文提供包含甲基化DNA对照靶标的技术，所述对照靶标当与样品(例如来自患者)中的实验靶标(例如甲基化标记基因)平行地处理和检测时生成特定信号。具体地，本文所提供的对照包括与一种或多种标记DNA平行地从样品中提取的、在亚硫酸氢盐转化期间转化的并且存在用于通过核酸检测测定例如QuARTS甲基化测定来检测的转化的序列的各种核酸靶标。
实施例1
样品制备方法
用于DNA分离和QUARTS测定的方法
以下提供用于在分析和之前进行DNA分离的示例性方法和示例性QUARTS测定，诸如可以根据本技术的实施方案使用。在此实施例中描述了QuARTS技术对来自粪便和不同组织样品的DNA的应用，但是本技术容易应用于其他核酸样品，例如，如其他实施例中所示的。
任选地，斑马鱼DNA，例如，如美国临时专利申请序列号62/364,049所述地制备的合成DNA可作为用于分离、亚硫酸氢盐转化和/或DNA检测测定的运行对照添加到如本文所述的样品中。例如，可在添加裂解物缓冲液之前、在添加蛋白酶K等之前或之后可将0.4ng/μL鱼DNA稀释液(从鲑鱼、鳕鱼和/或鲱鱼分离的大量基因组DNA，例如，如美国专利号9,212,392所述)中的100μl 120个拷贝/μL合成甲基化斑马鱼DNA添加到样品例如血浆样品中，并且连同标记和参考DNA一起检测。
从粪便样品收集靶标DNA。
在塑料料斗中收集完整粪便。防腐剂缓冲液例如150mM EDTA、500mM Tris-Cl和10mM NaCl(pH 9.0)例如以约4ml/克粪便添加到粪便中，并且缓冲粪便可以直接使用或归档在-80℃下。
用于从粪便样品分离靶标核酸的示例性程序：
1.例如用缓冲液将粪便样品均质化以形成粪便均质物。例如通过离心或过滤处理均质物以分配残余固体与流体以产生“粪便悬浮液”。
2.处理粪便上清液以移除测定抑制剂(例如，使用聚乙烯聚吡咯烷酮，如美国专利号8,993,341所述，所述专利全文以引用的方式并入本文)，从而产生“澄清的上清液”。
3.将十毫升澄清的上清液(表示大约4克粪便的当量)与硫氰酸胍(GTC)混合至最终浓度2.4M；
4.然后将混合物在90℃水浴中加热10分钟以使存在于粪便中的DNA(和蛋白质)变性。
5.将含有与一个或多个目标靶标序列(“靶标特异性捕获探针”)互补的共价附接(偶合)的寡核苷酸的顺磁性颗粒添加到样品中。然后将样品(例如，在环境温度下，约22℃–25℃)孵育一小时以使靶标DNA与磁性颗粒上的捕获探针杂交。
6.使澄清的上清液、GTC和颗粒的混合物暴露于磁场以分离颗粒(此时含有与捕获探针杂交的靶标DNA)与粪便上清液/GTC混合物，将其转移到新管中。参见例如美国专利申请序列号13/089,116，其以引用的方式并入本文中。
可以重复变性/杂交/分离循环(步骤4-6)，例如至少四次或更多次，以从相同粪便上清液样品连续提取不同靶标DNA。
FFPE组织DNA
使用QIAamp DNA FFPE组织试剂盒(Qiagen Sciences,Germantown,MD)从福尔马林固体的石蜡包埋(FFPE)组织分离DNA。
来自细胞和血浆的DNA分离
对于细胞系，基因组DNA可以使用例如“RSC ccfDNA血浆试剂盒(Promega Corp.,Madison,WI)从细胞条件培养基中分离。遵循试剂盒方案，使用1mL细胞条件培养基(CCM)替代血浆，并且根据试剂盒程序进行处理。
用于从血浆分离DNA的替代性示例性程序如下：
●向4mL血浆样品中添加300μL蛋白酶K(20mg/mL)并将其混合。
●将3μL的1μg/μL鱼DNA稀释液添加到血浆蛋白酶K混合物中。
●将2mL血浆裂解缓冲液添加到血浆中。
血浆裂解缓冲液为：
-4.3M硫氰酸胍
-10％IGEPAL CA-630(辛基苯氧基聚(乙烯氧基)乙醇，支链)
(5.3g IGEPAL CA-630与45mL 4.8M硫氰酸胍组合)
●在55℃下在500rpm振荡下将混合物孵育1小时。
●添加3mL血浆裂解缓冲液并且混合。
●添加200μL磁二氧化硅结合珠粒(16μg珠粒/μL}并且再次混合。
●添加2mL 100％异丙醇并且混合。
●在30℃下在500rpm振荡下孵育30分钟。
●将一个或多个管置于磁体上并且使珠粒集中。抽出并丢弃上清液。
●将750μL GuHCl-EtOH添加到含有结合珠粒的容器中并且混合。
GuHCl-EtOH洗涤缓冲液为：
-3M GuHCl(盐酸胍)
-57％EtOH(乙醇)
●在400rpm下振荡1分钟。
●将样品转移到深孔板或2mL微量离心管中。
●将管置于磁体上并且使珠粒集中10分钟。抽出并丢弃上清液。
●将1000μL洗涤缓冲液(10mM Tris HCl、80％EtOH)添加到珠粒中，并且在30℃下在振荡下孵育3分钟。
●将管置于磁体上并且使珠粒集中。抽出并丢弃上清液。
●将500μL洗涤缓冲液添加到珠粒中，并且在30℃下在振荡下孵育3分钟。
●将管置于磁体上并且使珠粒集中。抽出并丢弃上清液。
●添加250μL洗涤缓冲液，并且在30℃下在振荡下孵育3分钟。
●将管置于磁体上并且使珠粒集中。抽出并丢弃其余缓冲液。
●添加250μL洗涤缓冲液，并且在30℃下在振荡下孵育3分钟。
●将管置于磁体上并且使珠粒集中。抽出并丢弃其余缓冲液。
●在70℃下将珠粒干燥15分钟，同时振荡。
●将125μL洗脱缓冲液(10mM Tris Hcl pH 8.0、0.1mM EDTA)添加到珠粒中，并且在65℃下在振荡下孵育25分钟。
●将管置于磁体上并且使珠粒集中10分钟。
●抽出含有DNA的上清液并且将其转移到新容器或管中。
DNA的亚硫酸氢盐转化
用于甲基化测试的DNA使用亚硫酸氢盐使用例如EZ-96DNA甲基化试剂盒(ZymoResearch,Irvine CA)或使用亚硫酸氢铵处理，如美国专利号9,315,853和美国临时专利申请号62/249,097所述，其各自全文以引用的方式并入。
用亚硫酸氢盐试剂处理DNA以转化未甲基化胞嘧啶残基的示例性方法如下：
I.使用亚硫酸氢铵使DNA磺化
1.在每个管中，将64μL DNA、7μL 1N NaOH和9μL含有0.2mg/mL BSA和0.25mg/mL鱼DNA的载体溶液组合。
2.在42℃下孵育20分钟。
3.添加120μL 45％亚硫酸氢铵并在66°下孵育75分钟。
4.在4℃下孵育10分钟。
II.使用磁珠脱磺化
材料
磁珠(Promega MagneSil Paramagnetic Particles，Promega目录号AS1050，16μg/μL)。
结合缓冲液：6.5-7M盐酸胍。
转化后洗涤缓冲液：80％乙醇和10mM Tris HCl(pH 8.0)。
脱磺化缓冲液：70％异丙醇，选择0.1N NaOH用于脱磺化缓冲液。
使用任何适当的装置或技术混合样品以在基本上如下文所述的温度和混合速度下混合或孵育样品。例如，可以使用热混合器(Eppendorf)混合或孵育样品。示例性脱磺化如下：
1.通过将瓶涡旋1分钟来将珠粒原液彻底混合。
2.将50μL珠粒等分到2.0mL管中(例如，来自USA Scientific)。
3.将750μL结合缓冲液添加到珠粒中。
4.添加150μL来自步骤I的磺化DNA。
5.混合(例如，在30℃下1000RPM持续30分钟)。
6.将管置于磁体支架并且将其留在适当位置上5分钟。在将管置于支架上的情况下，移出并丢弃上清液。
7.添加1,000μL洗涤缓冲液。混合(例如，在30℃下1000RPM持续3分钟)。
8.将管置于磁体支架并且将其留在适当位置上5分钟。在将管置于支架上的情况下，移出并丢弃上清液。
9.添加250μL洗涤缓冲液。混合(例如，在30℃下1000RPM持续3分钟)。
10.将管置于磁道上；在1分钟后移出并丢弃上清液。
11.添加200μL脱磺化缓冲液。混合(例如，在30℃下1000RPM持续5分钟)。
12.将管置于磁道上；在1分钟后移出并丢弃上清液。
13.添加250μL洗涤缓冲液。混合(例如，在30℃下1000RPM持续3分钟)。
14.将管置于磁道上；在1分钟后移出并丢弃上清液。
15.将250μL洗涤缓冲液添加到管中。混合(例如，在30℃下1000RPM持续3分钟)。
16.将管置于磁道上；在1分钟后移出并丢弃上清液。
17.在30℃下在盖打开的情况下将所有管孵育15分钟。
18.从磁道移除管并且将70μL洗脱缓冲液直接添加到珠粒中。
19.用洗脱缓冲液孵育珠粒(例如，在40℃下1000RPM持续45分钟)。
20.将管置于磁道上约一分钟；移出并保存上清液。
然后将转化的DNA用于预扩增和/或瓣状核酸内切酶测定，如下文所述。
QuARTS瓣状核酸内切酶测定
QuARTS技术将基于聚合酶的靶标DNA扩增过程与侵入性基于裂解的信号扩增过程组合。本技术描述于例如美国专利号8,361,720；8,715,937；8,916,344；以及9,212,392，其各自以引用的方式并入本文。由QuARTS反应生成的荧光信号以与实时PCR类似的方式监测并且允许定量样品中靶标核酸的量。
示例性QuARTS反应通常包含约400-600nmol/l(例如，500nmol/l)每种引物和检测探针、约100nmol/l侵入性寡核苷酸、约600-700nmol/l每种FRET盒(FAM，例如，如由Hologic,Inc.在商业上供应；HEX，例如，如由BioSearch Technologies在商业上供应；以及Quasar 670，例如，如由BioSearch Technologies在商业上供应)、6.675ng/μl FEN-1核酸内切酶(例如，2.0,Hologic,Inc.)、30μl反应体积中的1个单元的Taq DNA聚合酶(例如，DNA聚合酶，Promega Corp.,Madison,WI)、10mmol/l 3-(正吗啉代)丙磺酸(MOPS)、7.5mmol/l MgCl2以及250μmol/l每种dNTP。示例性QuARTS循环条件如下表所示。在一些应用中，定量循环(Cq)的分析提供样品中靶标DNA链(例如，拷贝数)的初始数目的测量。
大体积亚硫酸氢盐转化的DNA的多重靶向预扩增
为了预先扩增大部分或所有来自输入样品的亚硫酸氢盐处理的DNA，可在单一大体积多重扩增反应中使用大体积的处理的DNA。例如，使用例如如上所述的MaxwellPromega血液试剂盒AS1400从细胞系(例如，DFCI032细胞系(腺癌)；H1755细胞系(神经内分泌)提取DNA。DNA为亚硫酸氢盐转化的，例如，如上文所述的。
例如在含有以下各项的反应混合物中进行预先扩增：7.5mM MgCl2、10mM MOPS、0.3mM Tris-HCl、pH 8.0、0.8mM KCl、0.1μg/μL BSA、0.0001％Tween-20、0、0001％IGEPALCA-630、250μM每种dNTP、寡核苷酸引物(例如，对于12种靶标、12个引物对/24个引物，以等摩尔量计(包括但不限于例如200-500nM每种引物的范围)，或者其中个别引物浓度被调整以平衡不同靶标区域的扩增效率)、0.025个单位/μL HotStart GoTaq浓度以及20体积％至50体积％的亚硫酸氢盐处理的靶标DNA(例如，10μL靶标DNA到50μL反应混合物中或者50μL靶标DNA到125μL反应混合物中)。选择对于反应的体积和扩增容器而言适当的热循环时间和温度。例如，反应可如下循环
在热循环之后，将预扩增反应的等分试样(例如，10μL)在10mM Tris-HCl pH8.0、0.1mM EDTA中在具有或不具有鱼DNA的情况下稀释到500μL。将稀释的预扩增的DNA的等分试样(例如，10μL)用于QuARTS PCR-瓣状测定中，例如，如上文所述的。还参见2015年10月30日提交的美国专利申请序列号62/249,097，其出于所有目的以引用的方式并入本文中。
实施例2
B3GALT6测定对亚硫酸氢盐转化的人类基因组DNA和从FFPE结肠组织样品提取的DNA的测试
将亚硫酸氢盐转化的普通甲基化人类DNA标准物(目录号D5015(Zymo research))在20ng/uL鱼DNA中稀释至1ng和0.1ng/μL。使用Qiagen miniKit方案从FFPE滑片固定的样品中提取来自结肠组织的DNA并且使用Zymo EZ DNA转化试剂盒#D5001用亚硫酸氢盐处理。
在20ng/μL鱼DNA中将含有具有亚硫酸氢盐转化的B3GALT6或亚硫酸氢盐转化的β-肌动蛋白的序列的插入片段的EcoRI消化的pUC57质粒稀释到2000、200、20和2链/μL。
程序：
1)制备以下10X寡核苷酸混合物和20X酶混合物：
10x寡核苷酸混合物1(B3GALT6和β-肌动蛋白双链体)：
| 寡核苷酸 | 最终浓度(μM) |
| B3GALT6正向引物 | 2 |
| B3GALT6反向引物 | 2 |
| B3GALT6探针(臂5) | 5 |
| β-肌动蛋白BT正向引物1 | 2 |
| β-肌动蛋白BT反向引物1 | 2 |
| β-肌动蛋白BT探针(臂3) | 5 |
| A3QUASAR FRET盒 | 5 |
| A5FAM FRET盒 | 5 |
| dNTP | 2500 |
20X酶混合物：
200mM MOPS,pH 7.5，
150mM MgCl2，
6.38mM Tris-HCl，pH 8.0,
15.94mM KCl，
2μg/μL BSA，
0.16％Tween-20，
0.16％IGEPAL CA-630，
25％甘油，
146ng/μL裂解酶2.0，
1个单位/μL HotStart GoTaq聚合酶
2)将以下各项分布到96孔板中的孔中：
| 组分 | <u>μL储备</u>反应物 |
| 20X酶混合物 | 1.5 |
| 10X寡核苷酸混合物 | 3 |
| 水 | 15.5 |
| 样品* | 10 |
| 总体积 | 20 |
*对于样品，使用以下平板布置图，添加10uL 1ng/μL Zymo标准DNA、10μL 0.1ng/μL Zymo标准物或10μL从组织提取的DNA：
3)用光学密封物密封板并放置到LightCycler 480并且允许如下所述的曲线：
4)基于存在于每种寡核苷酸混合物中的校准物质粒计算Zymo基因组DNA和从组织分离的DNA的量。
数据概括在下表中：
这些数据显示B3GALT6信号在大量基因组DNA和从FFPE结肠组织样品中提取的DNA中观察到。
实施例3
B3GALT6测定对从癌症和正常组织样品提取的DNA进行的测试
使用Qiagen miniKit方案从32种肺组织样品的FFPE滑片提取DNA，其中添加的斑马鱼rassf1合成DNA作为方法对照。如实施例1中所述用亚硫酸氢铵对样品进行亚硫酸氢盐转化。将以20ng/μL鱼DNA稀释的含有亚硫酸氢盐转化的B3GALT6或亚硫酸氢盐转化的β肌动蛋白的插入物的EcoRI消化的pUC57的质粒校准物用于定量校准。如实施例1中所述进行三重QuARTS测定。
结果在图3中示出。在肺样品中在B3GALT6与β肌动蛋白之间观测到良好相关性。由于测定检测到通过甲基化来防止序列转化的DNA，转化的β-肌动蛋白与B3GALT6之间的拷贝数目差异与β-肌动蛋白与B3GALT6之间的不同甲基化水平一致(即，全部β-肌动蛋白DNA为甲基化的并转化成匹配其测定引物和探针的序列，而B3GALT6的部分为未甲基化的并且被设计为检测甲基化的B3GALT6DNA的测定寡核苷酸不会匹配未甲基化的亚硫酸氢盐转化的部分)。
实施例4
B3GALT6测定对血浆样品的测试
使用基于二氧化硅的提取从来自癌症和正常患者的118种血浆样品(各自4mL)提取DNA并且用如实施例1所述地亚硫酸氢盐处理。将以20ng/μL鱼DNA稀释的含有具有亚硫酸氢盐转化的B3GALT6或β肌动蛋白的序列的插入DNA的EcoRI消化的pUC57的质粒校准物用于定量校准。
使用如实施例1所述的QuARTS测定来测定样品并且结果示出在图4中。在血浆样品中在B3GALT6与β-肌动蛋白之间观察到良好相关性，无论样品所采集的受试者的疾病状态如何。
实施例5
B3GALT6测定对额外血浆样品的测试
对于扩大的样品集合(包括来自正常受试者和患有肺癌的受试者的样品)，将B3GALT6与作为参考靶标的β-肌动蛋白相比较。使用基于二氧化硅的提取从来自癌症和正常患者的297种血浆样品集合(2mL)提取DNA并且用如实施例1所述地亚硫酸氢盐处理。将以20ng/μL鱼DNA稀释的含有具有亚硫酸氢盐转化的B3GALT6或亚硫酸氢盐处理的β肌动蛋白的序列的插入DNA的EcoRI消化的pUC57的质粒校准物用于定量校准。如实施例1中对于多重QuARTS测定所述的，使用初始扩增中的12次循环进行三重QuARTS测定。
结果示出在图5中，其比较了B3GALT6和β-肌动蛋白靶标各自的检测链的计数。这些数据显示无论疾病状态如何，在B3GALT6与β-肌动蛋白之间观察到良好相关性，这显示B3GALT6作为甲基化参考基因的适合性。
实施例6
比较作为参考基因用于计算标记基因的甲基化％的B3GALT6和β-肌动蛋白
使用QuARTS测定进一步分析实施例5中所述的297种血浆样品的甲基化标记CYP26C1和NFIX的存在。图6A和图6B比较作为参考用于计算来自血浆样品的DNA中的这些标记基因的甲基化％的亚硫酸氢盐处理的β-肌动蛋白或亚硫酸氢盐处理的B3GALT6。
实施例7
B3GALT6作为肺细胞中的参考基因的测试
培养二十种肺细胞系并使用Qiagen Miniblood试剂盒提取其DNA。如实施例1中所述用亚硫酸氢铵对提取的DNA进行处理。将以20ng/μL鱼DNA稀释的含有具有亚硫酸氢盐转化的B3GALT6或亚硫酸氢盐处理的β肌动蛋白的序列的插入DNA的EcoRI消化的pUC57的质粒校准物用于定量校准。如实施例1中所述进行多重QuARTS测定。下表所示结果证实B3GALT6参考标记存在于全部测试的肺细胞类型中。
以上说明书中所提及的所有公开和专利出于所有目的以引用的方式整体并入本文。本技术的所描述的组合物、方法和用途的各种修改和变化对于本领域技术人员是显而易知的，而不背离所描述的技术的范围和精神。虽然已结合具体的示例性实施方案描述了本技术，但应理解的是，要求保护的本发明不应不适当地局限于这些具体的实施方案。事实上，对药理学、生物化学、医学科学或相关领域的技术人员来说显而易见的用于执行本发明的所描述模式的各种修改意图在以下权利要求的范围内。
序列表
<110> EXACT SCIENCES公司
<120> 甲基化对照DNA
<130> EXCT-34708/WO-1/ORD
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<160> 13
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 139
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
ggccacacag gcccactctg gccctctgag cccccggcgg acccagggca ttcaaggagc 60
ggctctgggc tgccagcgca ggcctccgcg caaacacagc aggctggaag tggcgctcat 120
caccggcacg tcttcccag 139
<210> 2
<211> 139
<212> DNA
<213> 智人
<400> 2
ggttatatag gtttattttg gttttttgag ttttcggcgg atttagggta tttaaggagc 60
ggttttgggt tgttagcgta ggttttcgcg taaatatagt aggttggaag tggcgtttat 120
tatcggtacg tttttttag 139
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 3
ggtttatttt ggttttttga gttttcgg 28
<210> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 4
tccaacctac tatatttacg cgaa 24
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 5
gacgcggagg cggatttagg g 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 6
ccacggacgg cggatttagg g 21
<210> 7
<211> 224
<212> DNA
<213> 智人
<400> 7
ctctgacctg agtctccttt ggaactctgc aggttctatt tgctttttcc cagatgagct 60
ctttttctgg tgtttgtctc tctgactagg tgtctaagac agtgttgtgg gtgtaggtac 120
taacactggc tcgtgtgaca aggccatgag gctggtgtaa agcggccttg gagtgtgtat 180
taagtaggtg cacagtaggt ctgaacagac tccccatccc aaga 224
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 8
ttttgatttg agtttttttt ggaattttgt aggttttatt tgtttttttt tagatgagtt 60
ttttttttgg tgtttgtttt tttgattagg tgtttaagat agtgttgtgg gtgtaggtat 120
taatattggt ttgtgtgata aggttatgag gttggtgtaa agtggttttg gagtgtgtat 180
taagtaggtg tatagtaggt ttgaatagat tttttatttt aaga 224
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gtgtttgttt ttttgattag gtgtttaaga 30
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<212> DNA
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ctttacacca acctcataac cttatc 26
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<220>
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agccggtttt ccggctgaga ctccgcgtc 29
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 13
agccggtttt ccggctgaga cgtccgtgg 29
Claims (27)
1.一种组合物，其包含：
亚硫酸氢盐转化的B3GALT6核酸和至少一种寡核苷酸的复合物，其中所述寡核苷酸的至少一部分与所述B3GALT6核酸杂交。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述B3GALT6核酸为包含核苷酸序列SEQ ID NO:2或其互补序列的DNA链。
3.如权利要求2所述的组合物，其包含检测探针寡核苷酸，其中所述检测探针寡核苷酸包含于所述DNA链的一部分互补的区域。
4.如权利要求3所述的组合物，其中所述检测探针寡核苷酸包含与SEQ ID NO:2或其互补序列的一部分互补的区域。
5.如权利要求4所述的组合物，其中所述检测探针寡核苷酸包含报告分子。
6.如权利要求5所述的组合物，其中所述报告分子包括荧光团。
7.如权利要求3-6中任一项所述的组合物，其中所述检测探针寡核苷酸包含瓣状序列。
8.如权利要求7所述的组合物，其还包含FRET盒。
9.如权利要求1-8中任一项所述的组合物，其还包含FEN-1核酸内切酶。
10.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其还包含热稳定性DNA聚合酶。
11.一种反应混合物，其包含如权利要求1-10中任一项所述的组合物。
12.如权利要求11所述的反应混合物，其还包含引物、报告寡核苷酸、热稳定性DNA聚合酶、FEN-1核酸内切酶和FRET盒中的一种或多种。
13.一种试剂盒，其包含：
a)至少一种寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的至少一部分与亚硫酸氢盐转化的B3GALT6DNA特异性杂交；以及
b)亚硫酸氢盐试剂。
14.如权利要求13所述的试剂盒，其包含至少一种寡核苷酸，所述寡核苷酸包含与SEQID NO:2或其互补序列的一部分互补的区域。
15.如权利要求13或权利要求14所述的试剂盒，其中所述寡核苷酸选自捕获寡核苷酸、核酸引物对、核酸探针和侵入性寡核苷酸中的一种或多种。
16.一种表征样品的方法，所述方法包括：
a)用亚硫酸氢盐试剂处理来自样品的DNA以产生亚硫酸氢盐转化的DNA；
b)使用核酸引物对扩增所述亚硫酸氢盐转化的DNA的区域，其中所述扩增产生具有包含SEQ ID NO:2的区域的序列的扩增产物。
17.如权利要求16所述的方法，其还包括使用检测探针检测所述扩增产物的步骤。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述检测探针包含报告分子。
19.如权利要求17所述的方法，其中所述检测探针包含瓣状序列。
20.如权利要求16-19中任一项所述的方法，其中所述扩增产物具有包含SEQ ID NO:2的序列。
21.一种表征样品的方法，所述方法包括：
a)用亚硫酸氢盐试剂处理来自受试者的样品的DNA以产生亚硫酸氢盐处理的DNA样品；
b)测量在所述亚硫酸氢盐处理的DNA样品中的至少一种亚硫酸氢盐转化的甲基化标记DNA的量；
c)测量在所述亚硫酸氢盐处理的DNA样品中的亚硫酸氢盐转化的B3GALT6 DNA的量；
以及
d)比较所述亚硫酸氢盐处理的DNA样品中所述至少一种亚硫酸氢盐转化的甲基化标记DNA的量与亚硫酸氢盐转化的B3GALT6DNA的量，以确定来自受试者的所述样品中所述至少一种甲基化标记DNA的量。
22.如权利要求21所述的方法，其中测量所述亚硫酸氢盐处理的DNA样品中至少一种亚硫酸氢盐转化的甲基化标记DNA的所述量和亚硫酸氢盐转化的B3GALT6 DNA的所述量包括使用核酸引物对扩增所述亚硫酸氢盐转化的DNA的区域，其中所述扩增产生包含所述至少一种甲基化标记DNA的区域的至少一种扩增产物和包含所述B3GALT6 DNA的区域的扩增产物。
23.如权利要求21或权利要求22所述的方法，其中所述至少一种亚硫酸氢盐转化的甲基化标记DNA包括至少两种亚硫酸氢盐转化的甲基化标记DNA。
24.如权利要求22或权利要求23所述的方法，其中包含所述B3GALT6 DNA的区域的所述扩增产物具有包含SEQ ID NO:2或其互补序列的区域的核酸序列。
25.一种在来自受试者的血液样品中定量指示实体组织肿瘤的甲基化标记DNA的量的方法，所述方法包括：
a)测量来自受试者的血液样品中的甲基化第一标记DNA的量，其中受试者的实体组织中的所述第一标记DNA的甲基化指示所述组织中的肿瘤；
b)测量所述血液样品中的甲基化第二标记DNA的量，其中所述第二标记DNA在正常组织和白细胞中为甲基化的；
以及
c)比较所述血液样品中所述甲基化第一标记DNA与所述甲基化第二标记DNA的量以确定所述血液样品中所述第一标记DNA的甲基化的部分。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述第二标记DNA包含B3GALT6 DNA。
27.如权利要求25所述的方法，其中所述测量包括使用根据权利要求16-20中任一项所述的方法。
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