JP2008522638A - 挿入又は欠失を有する配列の核酸分析についての組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
想定される方法及びキットは、一方の末端上で標識によって、他方の末端上で特有のタグ配列によって包含される識別配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドの複数を含む。ある好ましい態様において、識別配列はRNA反復単位であり、標的核酸の相補的なDNA反復単位とともにヘテロ二本鎖を形成し、識別剤はRNaseHである。このようなシステムを使用して、反復単位の数は、このような配列が一本鎖オリゴヌクレオチド中のDNA反復単位の所定の数に隣接する識別配列の加水分解によって単純に同定することができる。
Description
本出願は、2004年12月13日に出願されたシリアル番号第60/635,904号を有する、本発明者らの同時係属中の米国仮特許出願に対する優先性を主張する。
本発明の分野は、核酸分析であり、特に公知の標的配列内の塩基の存在及び/又は不在(例えば、反復単位、挿入、欠失)の分析、検出及び/又は決定である。
哺乳類及び他のゲノムが多くのDNA反復を含有しており、DNA反復は典型的にはクロマチン全体に見出され、単一ヌクレオチドから遺伝子全体に至るまで長さが変動することは十分に確立されている。例えば、哺乳類の、高度に反復するDNAは、しばしば、105ないし106コピーで、6ないし10塩基対の配列として非翻訳領域に見出されるのに対し、ヒストン、リボソームRNA、tRNA及びSMNなどの全長の遺伝子反復はしばしば、複数コピー(例えば、50ないし104コピー)のタンデムクラスターとして存在する。さらに他のDNA反復は、脆弱な染色体切断点(例えば、CCC反復)を形成し得るDNA複製中のミスマッチ(例えば、Alu反復)を生じ得る「ホットスポット」として存在する。さらに、多くの反復のコピー数はしばしば安定であるのに対し、多様な不安定な反復も公知である(例えば、DNA複製時のCAG反復)。
特定の大きさ、分布及び/又は配列特徴に応じて、DNA反復のタイプは、(a)テロメア中にしばしば見出され、典型的には様々な疾病症候群と関連するタンデム反復、(b)短い散在性の核要素(例えば、Alu:GCリッチ、280塩基対長、又はMariner要素80塩基対、TA隣接されている)、長い散在性の核要素(6ないし8kb、可変式配列)などの散在性の反復性DNA、(c)長い末端反復(典型的には1.5ないし10kb、可変式配列)を有する転移可能な要素、(d)DNAトランスポゾン(典型的には、読み取りフレームに隣接する二つの短い逆転した反復配列を含む。)、及び(e)しばしば多様な大きさを有し、特定の疾病パターンと関連する傾向にある三ヌクレオチド反復などの、多様な群へ分類され得る。
可動的な性質及び/又は配列の特徴により、DNA反復は、直接的な挿入性変異誘発(500個の新たな生殖系列突然変異のうち概ね1個が、転位可能因子によって引き起こされると考えられている。)、転位及び他の再配置を引き起こす非対立遺伝子反復間の不適切な組換え、並びにいくつかのタンパク質の、及び場合によってはアンチセンスRNAの不適切な産生を生じ得る強力なプロモーター領域の存在によって、ゲノムと負に相互作用し得る。これら及び他の理由のために、数多くのDNA反復が特定の疾病及び症候群(例えば、脊髄小脳失調症の様々な種類、ハンチントン病、統合失調症等)と関連付けられてきた。さらに、DNA反復の分布、コピー数及び/又は長さは、しばしば個体ごとに極めて可変的であるため、DNA含有試料を、比較的高い確度で、個体から得られたDNAと関連付けるために、DNA反復は、法医学的又は他の非医学的使用においても使用され得る。
この目的のため、数多くの方法及び検査がDNA反復を分析するために開発されてきた。例えば、反復のタイプ及び長さを同定するために、DNAは、手動又は自動化された様式で配列決定され得る。このような方法によって、特定の配列に関する具体的な知識なしに反復の同定が有利に可能となるが、一般に時間を消費し、しばしば不経済である。あるいは、DNA反復は、WO93/16197号において教示されるように、相補的なプローブを使用する直接的なハイブリダイゼーション及びオートラジオグラフィーを用いたRFLP分析によって、又はPCRによって同定され得る。RFLP法及びPCR法は比較的迅速で信頼性があるが、通例えば、反復の正確な数は決定されない。
さらに公知のアプローチにおいて、米国特許第5,695,933号、欧州特許第0552545号又は欧州特許第0246864号に記載されるように反復に相補的なオリゴの誘導された連結のためのハイブリダイゼーションテンプレートとして、DNA反復が利用されている。上述の方法と同様に、このような連結方法を使用する反復の同定は、しばしば迅速及び正確である。不運なことに、このような方法は、典型的には、反復のコピー数を正確に測定することができない。これら及び他の欠点を克服するため、米国特許第5,945,284号又は第6,309,829号にすでに記載されているように、不連続的プライマー伸長を使用し得る。ここで、プライマー伸長は、検出可能な標識の検出及びその後の除去により段階的に実施される。不連続な方法は、一般に、DNA反復の定量分析を可能にする。しかしながら、このような方法のほとんどは、相対的に時間を消費し、操作者の注意を必要とする傾向にある。
より最近では、質量分析の進歩により、巨大分子の分子量を決定する上での範囲及び精度が著しく向上しており、したがって、米国特許第6,764,822号又は第6,090,558号に教示されるように、DNA反復の分析に質量分析を応用することが可能となっている。質量分析は正確かつ迅速であるが、多様な欠点が残っている。とりわけ、質量分析は比較的高価であり、典型的には、高度に訓練された操作者を必要とする。
このように、核酸分析のための数多くの組成物及び方法が本分野において公知であるが、それらのすべて又は殆どすべてが一つ又はそれ以上の欠点を有している。従って、核酸の分析のための改善されたキット及び方法に対する需要がなお存在する。
発明の要約
本発明は、公知の標的配列内での突然変異、特に反復単位、挿入及び/又は欠失の有無の分析、検出及び/又は決定の組成物及び方法に関する。
本発明は、公知の標的配列内での突然変異、特に反復単位、挿入及び/又は欠失の有無の分析、検出及び/又は決定の組成物及び方法に関する。
最も好ましくは、想定される方法は、検査されるべきDNA中の反復に相補的な反復単位の可変数を含む一本鎖DNAオリゴヌクレオチドの複数を利用し、ここで、反復単位の最後又は反復単位の末端方向のセクションがRNAを含む。完全なハイブリッドを形成するオリゴ(すなわち、検査されるDNA中に同一又はより少ない反復単位の数を有するもの)が、RNaseHによって消化される。次いで、検査されるべきDNA中のDNA反復の定量は、RNaseH消化後の一本鎖DNAオリゴヌクレオチドの分析によって実施される。好ましくは、オリゴの各々は、担体上の所定の位置でハイブリダイズし、RNaseH消化は残存するオリゴから標識を分離させる。
本発明の主題の一態様において、検査キットは、各々がターゲティング配列へ連結された特有のタグ配列を有し、及び各々がターゲティング配列へ連結された特有の識別配列をさらに有する第1の一本鎖核酸の複数を含み、前記識別配列はさらに標識へ連結される。このような組成物及び方法において、特有の識別配列の各々は、識別条件下で、識別剤によって一本鎖核酸の少なくとも部分的な加水分解に適した配列を有し、これにより標識を特有のタグ配列から分離する。
最も好ましくは、一本鎖核酸の少なくとも一つは、ターゲティング配列がDNAを含み、及び識別配列がRNAを含む(識別配列は、典型的には、反復の複数の末端反復である。)であるキメラ分子であり、識別剤はRNaseHである。さらに好ましい態様において、標識は、光学的に検出可能な標識であり、したがって、特に適した標識は、多様なフルオロフォア、ルミノフォア、色素及び色素源から発色団への変換を触媒する酵素を含む。
キットとしてのパッケージの場合、一般的には、このようなキットは、(a)検査混合物を形成するための識別条件下で、核酸を含む試料を、一本鎖核酸の複数とインキュベートし、(b)各々が特有のタグ配列と相補的な配列を有し、及び所定の位置に位置する第2の一本鎖核酸の複数を有するチップへ前記検査混合物を適用し、(c)前記標識からの信号の複数を前記チップから獲得し、並びに(d)前記信号から遺伝子型を決定するための指示書も含むことが想定される。従って、さらに追加成分には、第2の一本鎖核酸の複数を有するチップ又は他の支持体が含まれ、第2の一本鎖核酸の各々は、特有のタグ配列に相補的であり、及び所定の位置又は個別に位置を指定できる固相(例えば、ビーズ、ストリップ等、ラマン分光法を使用する。)の上に位置する配列を有する。望ましい場合、RNaseH、ポリメラーゼ、末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ及び/又は標識したヌクレオチドを含む試薬が包含され得る。
従って、本発明の主題の別の態様において、核酸の遺伝子型を決定する方法は、試料核酸を第1の一本鎖核酸の複数とインキュベートして、これにより検査混合物を形成する工程を含み、ここで、第1の一本鎖核酸の各々は、ターゲティング配列ヘ連結される独特のタグ配列を有し、ターゲティング配列へ連結される特有の識別配列をさらに有し、識別配列はさらに標識へ連結される。別の工程において、識別剤は、識別条件下で検査混合物へ添加され、これにより標識を第1の一本鎖核酸の少なくとも一つから分離し、さらなる工程において、第1の一本鎖核酸からの標識の分離は、特有のタグ配列を使用して決定される。さらなる工程において、その後、遺伝子型は決定の工程から決定される。
試料核酸は、好ましくは、場合によりメチル化された核酸(例えば、アンプリコン、cDNA、ゲノムDNA等)を含む。想定されるさらなる態様において、特有のタグ配列及びターゲティング配列はDNAを含むのに対し、識別配列はRNAを含む。従って、特に適切な識別条件は、試料核酸を、第1の一本鎖核酸の複数のうちの少なくとも一つ、より典型的には少なくともいくつか、及び最も典型的にはすべてとハイブリダイズさせる条件である。さらに、分離を決定する工程は、第1の一本鎖核酸の複数を、チップの所定の位置に、特有のタグ配列を使用して結合すること、及び所定の位置にある標識からの信号(例えば、励起光による照明、又は反射された光の検出)について照会することを含むことが一般に好ましい。
想定されるさらなる態様において、核酸中の反復単位のコピー数を決定する方法は、二本鎖を形成するハイブリダイゼーション条件下で、一般式A−T−Rn−Rm’−Lの一本鎖核酸の複数を前記核酸と組み合わせる工程を有し、式中、Aは特有のタグDNA配列であり、TはターゲティングDNA配列であり、RはDNA反復配列であり、nは1と1000(又はそれ以上)の間(1及び1000を含む。)の整数であり、Rm’はRNA反復配列であり、mは1と100(又はそれ以上)の間の整数であり、Lは標識である。別の工程において、R’の少なくとも一部は、二本鎖中で、RNaseHを用いて加水分解され、ここにおいて、R’及び核酸中の反復単位が相補的な二本鎖を形成し、これによりLをAから分離し、並びに、さらに別の工程において、一本鎖核酸は、Aを用いて、チップの所定の位置上に固定される。次に、信号が所定の位置から測定される。典型的には、Tは少なくとも12塩基の長さを有し、核酸の一部と少なくとも90%の相補性を有する。このような方法は、R’が少なくとも部分的に加水分解された一本鎖核酸を選択的に標識する工程をさらに含み得、ここにおいて、標識の工程は、Lから識別可能な第2の標識を使用して実施される。
結果として、一般式A−T−Rn−Rm’−Lを有するキメラオリゴヌクレオチドが想定され、式中Aは特有のタグDNA配列であり、TはターゲティングDNA配列であり、RはDNA反復配列であり、nは1と1000(又はそれ以上)の間(1及び1000を含む。)の整数であり、Rm’はRNA反復配列であり、mは1と100(又はそれ以上)の間の整数であり、Lは標識又は他の何らかの識別因子である。
本発明の多様な目的、特性、態様及び利点は、本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な記述から、さらに明らかとなるであろう。
本発明者は、公知の標的配列内の塩基の存在及び/又は不存在(例えば、反復単位、挿入、欠失)が、異なる長さの識別配列を有し、及び標的遺伝子へハイブリダイズするプローブ核酸の複数を使用して簡便に決定され得ることを発見した。好ましいアッセイにおいて、プローブ核酸の各々は、特異的な長さの識別配列及び標識を含み、標的遺伝子内の塩基の存在又は不存在が、各プローブ核酸上の識別配列及び標識を推測する識別反応を使用して検出される。
例えば、想定される組成物及び方法のある態様において、検査キットは、一本鎖核酸の複数を有し、一本鎖核酸の各々は、5’末端上にタグ配列を有し、タグ配列の後には、(検査されるべきDNA中の反復要素に隣接した又は検査されるべきDNA中の反復要素を包む領域に、典型的には、少なくとも90%相補的な)ターゲティング配列が続く。ターゲティング配列の後に続くのは、検査されるべきDNA中の反復要素に少なくとも部分的に相補的である反復要素の複数であり、ここで、一本鎖核酸の複数の各々は、反復要素の異なる数を有する。反復要素の一連中の最後の反復要素は、識別配列として設定される。識別配列の具体的な選択及び組成に応じて、標識は、直接的に又は間接的に、識別配列へ連結される。最も好ましくは、識別配列は、識別条件下で識別剤によって一本鎖核酸の少なくとも部分的な加水分解に適した配列を有し、これにより特有のタグ配列から標識を分離する。
特に好ましいアッセイは、添付の図面に例示されている。ここで、図1において、5個の反復110−1ないし110−5を有する標的遺伝子100は、6個の異なるプローブ核酸120Aないし120Fとともにインキュベートされる。典型的には、プローブ核酸120Aないし120Fの各々は、バイオチップ(図示せず)上の抗タグに対応する個々の異なるタグ(122Aないし122F)を有し、ここで、抗タグは、バイオチップの所定の位置に固定される。(3’末端の方向にある)各プローブ核酸中のタグに続くのは、ハイブリダイゼーション条件下で配列特異的なハイブリダイゼーションを可能とする標的遺伝子(114)の一部と好ましくは完全に相補的な配列要素(斜線、124Aないし124F)である。(3’末端の方向にある)要素124Aないし124Fに続くのは、反復の所定の数126A−1ないし126F−6であり、ここに、各プローブ核酸は反復の異なる数を有する。
プローブ核酸120Aないし120Fの各反復セクションの後には、識別配列128Aないし128Fがあり、識別配列128Aないし128Fは、反復の一連における3’末端の反復を表し、RNAで構成される。これに対して、反復126A−1ないし126F−6は、典型的には、DNAで構成される。識別配列128Aないし128Fへ結合又は連結されるのは、(標的DNAとさらにハイブリダイズするように設定してもよく、又は設定しなくてもよいssDNAスペーサーS−AないしS−Fを介する)標識129Aないし129Fである。典型的には、標識はフルオロフォアであり、最も好ましくは3’末端Cys標識である。従って、(識別反復を包含する)反復の数が分析されるべきDNA中に見出される反復と等しいか又は下回る限り、オリゴヌクレオチドの非タグ部分は、ほとんどの実施形態において、分析されるべき遺伝子と二本鎖を形成することを認識すべきである。一旦、最後の反復が、分析されるべきDNAとハイブリダイズできなくなると、二本鎖は形成されない。図1において、識別する最後の反復中に120Aないし120Dによって形成された二本鎖は、DNA−RNAヘテロ二本鎖である。これに対して、120E及び120Fの識別する最後の反復中のRNA部分は、標的DNA中に相補的な結合対を有さず、従って、一本鎖RNAとして存在する。
プローブ核酸が標的配列へハイブリダイズした後、識別は、図2に例示されている結果で、識別反応において達成される。ここで、RNaseH(図示せず)をハイブリッド(すなわち、標的遺伝子へハイブリダイズしたプローブ核酸)へ添加することにより、標的遺伝子の対応する部分へハイブリダイズしたそれらのRNA部分の消化がもたらされた。ここで、プローブ220Aないし220DのRNA部分(識別配列)は破壊され、その結果、(取り消し線によって表されるように)3’標識及びスペーサーが5’部分から除去された。識別配列がハイブリダイズしなかった残りのプローブ核酸220E及び220Fにおいて、標識は個々のスペーサーを介してプローブ核酸へ結合したままであった。残りの数及び成分に関しては、図1に記載されている項目についての同一の検討が、図2における項目に対して同様に当てはまる。
反応生成物の分析は、数多くの方法(以下参照)を使用して、この段階で実施することが可能である。しかしながら、プローブ−標的核酸が変性するか、あるいは分離されること、及びプローブ核酸がタグ:抗タグ相互作用を介してバイオチップへ結合することが特に好ましい。チップ上の抗タグの各々は所定の位置に存在し、1つの特異的なプローブ核酸のみを結合するので、標識のパターンは反復の数を決定するために使用できる。例えば、標識されていないスポットは、識別配列の標的遺伝子へのハイブリダイゼーションを可能とするプローブ核酸に対応するのに対し、バイオチップ上の標識されたスポットは、識別配列の標的遺伝子へのハイブリダイゼーションを許容しない核酸に対応する。もちろん、識別は、液体中に浸漬されてもよく、又は浸漬されなくてもよい別の固相上で実施し得ることも認識すべきである。例えば、ビーズが利用される場合、識別は、緩衝液中、ビーズ上で実施され得る。同様に、識別は、リアルタイム測定を使用して固相へのハイブリダイゼーションなしに実施してもよい。例えば、FRET(蛍光共鳴エネルギー転移)標識は、リアルタイムで識別するのに使用され得る。
本発明の主題のさらに好ましい態様において、図3に例示されているように、識別信号をさらに補助するために、カウンタ標識を使用することが可能である。例えば、特に元のプローブ核酸が(例えば、2’,3’−ジデオキシヌクレオチドによる)さらに別の標識されたヌクレオチドの酵素的連結に適していない3’末端部分を有していた場合には、カウンタ標識は、RNaseH反応の加水分解産物の3−OH基へ、使用する検出可能な標識(例えば、黒丸によって表されるCy5)を付加するポリメラーゼ反応によって達成され得る。ここで、プローブ320Aないし320Dの末端3−OH基へ、標識されたヌクレオチド330Aないし330Dを付加するために、ポリメラーゼを使用してカウンタ標識を達成した(図示せず)。プローブ320E及び320Fでは、プローブの3’末端がOH基を欠失しているので、このような反応は達成されなかった。残りの数及び成分に関しては、図1に記載されている項目についての同一の検討が、図3における項目に対して同様に当てはまる。
本発明の主題の別の態様において、プローブ核酸がかなり変動し得ること、及び数多くの修飾が本発明で使用するのに適していると考えられることが想定される。例えば、特定のプローブに対する特有のタグが一般に好ましいが、タグが独特である必要は必ずしもなく、又は存在する必要さえないことを理解すべきである。例えば、識別反応後の検出方法は、位置的な配置に依存しなくてもよく、特に、想定される検出方法は、質量差による検出を包含する。他の適切な方法のうち、質量分析、サイズ排除クロマトグラフィー又はゲル電気泳動は、識別反応において形成される産物の明確な同定を提供し得る。別の例において、特に各プローブが特有の標識を有する場合、タグは独特である必要はないが、親和性対の一パートナーであり得る。このような対の典型的な代表例には、ビオチン−アビジン/ストレプトアビジン、オリゴヒスチジン−NiNTA等が含まれる。したがって、タグは、存在してもよく、又は存在しなくてもよく、独特であるか又は同一であり得、オリゴヌクレオチド及び/又はペプチドを含み得る。しかしながら、特に好ましいタグは、5ないし100個のヌクレオチド(例えば、少なくとも10個、より典型的には少なくとも12個、さらにより典型的には少なくとも15個、及び最も典型的には少なくとも18個のヌクレオチド)の特有のオリゴヌクレオチド配列を含み、ここで、単一のハイブリダイゼーション条件下で、異なるタグの各々がチップ上でその相補的なカウンタパートと特異的にハイブリダイズする(及び標的DNA中のいずれの配列ともハイブリダイズしない)ように、配列が選択される。タグの具体的な性質に応じて、対応するカウンタパートは表面上(例えば、チップ上のオリゴ)に固定され得るか、若しくはマトリクス材料中(例えば、アガロース)に固定され得ること、又はカウンタパートが溶液中に溶解若しくは懸濁され得ることを理解すべきである。
最も好ましくは、タグの後には、プローブがハイブリダイズするヌクレオチド配列に完全に又はほぼ完全に相補的な一本鎖DNA配列要素が(3’末端の方向に直接的又は間接的に)続く。このような配列要素は、プローブがハイブリダイズする標的遺伝子の所定の領域への結合事象の特異性を増大させ、プローブ中の第1の反復の、標的DNA中の第1の反復との結合を場合により整列させると考えられる。このような配列要素の長さは、好ましくは少なくとも8ないし12ヌクレオチド、より典型的には10ないし20ヌクレオチド、最も典型的には12ないし35ヌクレオチドである。さらに、配列要素は、DNAから合成され、(同じく、好ましくはDNAから合成される)タグ要素と連続していることが一般に好ましい。しかしながら、数多くの代替材料も、このような材料が標的DNAに対して特異的にハイブリダイズできる限り、適切であると考えられる。他の想定される材料のうち、別の適切な配列要素は、ペプチド核酸、1つ又はそれ以上の修飾されたヌクレオチド等を含み得る。
さらに、プローブ核酸中の配列要素の配列相補性は、標的遺伝子とともに必ずしも完全である必要がないことが想定される。例えば、適切な配列要素は、標的遺伝子内で突然変異した形態と、及び/又はSNPとハイブリダイズできるようにするための一つ又はそれ以上の縮重位置又は修飾されたヌクレオチドを含み得る。あるいは、ミスマッチは、予想される突然変異に対して又は望ましい場合には、アニーリング条件に対して調整するよう組み込まれ得る。従って、プローブ核酸と標的DNA間の配列相補性も100%未満であり得ることを認識すべきであり、想定される相補性には、95%と100%の間、90%と100%の間、及びさらには80%と100%の間の相補性が含まれる。
同様に、プローブ核酸中の一つの反復及び/複数の反復は、一本鎖DNAから形成されることが一般に好ましく、ここで、反復は配列要素と連続し、及び互いに連続している。しかしながら、適切な場合、スペーサー部分は、配列要素と第1の反復単位との間に含め得る。さらに、反復単位は標的反復に対して完全に相補的であることが一般に好ましい。しかしながら、別の態様において、相補性がより低くてもよい(例えば、95%と100%の間、90%と100%の間、及びさらには80%と100%の間)ことも想定される。
標的DNA中の反復の具体的な性質及び頻度に応じて、プローブ核酸中の反復数がかなり変動し得ることを理解すべきである。したがって、想定される反復数は、典型的には、1と数百(及びそれ以上)の間、より典型的には1と100の間、及び最も典型的には1と50の間である。その結果、本発明の主題に係るキット及び組成物は、1と数百個の間のプローブ核酸を含み得ることを理解すべきである。しかしながら、反復数が比較的高い場合、特定の長さが省略され得る。例えば、疾病が30反復を超える反復と関連する場合、想定されるキット及び組成物は、25ないし40反復を有するプローブヌクレオチドを含み得る。さらに、反復の漸増は、単一反復の漸増に限定される必要はないが、より高くてもよい。例えば、反復の比較的幅広い範囲がある遺伝子について公知である場合、キット及び組成物は、20、30、40、50等の反復を有するプローブヌクレオチドを含みうることが想定される。あるいは、一つ又はそれ以上の反復は、核酸であってもよく、又は核酸でなくてもよいスペーサーで置換し得る。反復の適切な長さは、好ましくは1と100ヌクレオチドの間、より好ましくは1と50ヌクレオチドの間、及び最も好ましくは1と20ヌクレオチドの間である。しかしながら、より長い反復も、本発明での使用に適していると考えられる。
従って、反復の具体的な性質に応じて、固相合成を使用して、又は適切なテンプレートの転写をインビトロで使用して、プローブ核酸を合成的に調製し得ることに注意すべきである。次いで、タグ、識別配列、又は他の部分を付加することによって、さらなる修飾をインビトロで行い得る。
識別配列に関して、識別配列が、一つの反復の少なくとも一部を表し、少なくとも部分的に相補的な標的DNAへのハイブリダイゼーションの区別を可能にする異なる物理化学的特徴を有し、一連の反復の3’末端に好ましく配置されることが想定される。最も好ましくは、識別配列は、標的DNAの反復に対して完全に相補的であり、反復全体にわたる配列を有する。しかしながら、別の態様において、相補性のより低い程度も適切であると考えられる。同様に、識別配列の一部のみが識別するように設計し得る。さらに、識別配列が反復配列に限定される必要はないが、標的核酸中に存在することが公知であるか、又は推測される欠失又は挿入に対して相補的な配列でもあり得ることを認識すべきである。したがって、想定されるプローブ核酸は、挿入、欠失、スプライシング変異等を決定するためにも利用され得ることを認識すべきである。
本発明の主題の特に好ましい態様において、識別配列は、RNAから少なくとも部分的に作られ、これによりプローブヌクレオチドと標的DNAとの間に形成されるDNA:RNAヘテロ二本鎖を、RNaseH消化に対して感受性とする。あるいは、識別配列は、メチル化感受性制限酵素(例えば、HpaII、MspI、HhaI、NotI、BclI、BspPI、Acc65I、Bme1390I、BseLI、BstXI、CfrI等)による消化に対して感受性とすることもできる。このような実施形態において、タグ、配列要素及び反復は、メチル化(例えば、5−メチルシトシン、N4−メチルシトシン、5−ヒドロキシメチルシトシン、5−ヒドロキシメチルウラシル又はN6−メチルアデニンを使用する、部分的に又は完全に重複するdam又はdcmメチル化)を包含するのに対し、識別配列(ここではssDNAから合成される)はメチル化されていない。従って、識別配列を含むプローブヌクレオチド中の反復の数が標的DNA中の反復の数と同一であり、又は下回る条件の下でのみ、非メチル化制限部位の形成により、識別配列に制限が生じる。同様に、及び特にプローブヌクレオチドが固相上で合成的に調製される場合、本来感受性の制限部位を制限に対して非感受性とするために、修飾されたヌクレオチドを反復中に使用し得る。次いで、最後の反復は対応する非修飾ヌクレオチドを含み、これにより感受性制限部位を生成する。
標的DNA中の識別配列及び最後の反復の二本鎖形成は、標的DNA中の最後の反復に隣接する核酸部分に少なくとも部分的に相補的なスペーサーの付加によってさらに安定化され得る。このようなスペーサーは、典型的には、1と50ヌクレオチドの間、より典型的には8と30ヌクレオチドの間、及び最も典型的には12と18ヌクレオチドの間である。一般には好ましいが、スペーサーを完全に省略し得ることも想定される。
標識に関して、標識が識別配列及びスペーサーの少なくとも一部へ共有結合されること、並びに放射分析的に又は光学的に又はその他自動化された様式で検出可能であることが一般に好ましい。したがって、標識及び他の検討事項に応じて、検出の方法は適宜変動し得る。しかしながら、標識が蛍光、発光及びラマン活性部分の検出のうち少なくとも一つの自動化された検出を使用して光学的に検出されることが一般に好ましい。あるいは、検出は、視覚的検出、シンチグラフィーによる検出及び/又はX線検出を使用して実施し得る。さらに、特に標識が存在しない場合、識別反応の反応産物の検出は、(例えば、電気泳動又は質量分析を使用する)サイズ分離、親和性分離等によってなされ得る。望ましい場合、標識はシグナル発生部分と、特に色素源基質を色素へ、又は発光源化合物を発光性化合物へ変換する酵素とも置換され得る。さらに想定される標識は、次いで可視化され、又はその他検出され得る親和性マーカーを含む。
従って、想定される化合物は特に、式A−T−Rn−Rm’−Lを有するキメラオリゴヌクレオチドを含み、式中Aは独特のタグDNA配列であり、TはターゲティングDNA配列であり、RはDNA反復配列であり、nは1と1000の間の整数(1及び1000を含む。)であり、Rm’はRNA反復配列(好ましくはRと同一であるか、又はRに対応する塩基配列を有する。)であり、nは1と100の間の整数であり、Lは標識である。
プローブ核酸の5’末端においてタグから標識が分離したことを確認するために、カウンタ染色を利用し得る。最も典型的には、このようなカウンタ染色は、識別反応後にプローブ核酸を修飾する可能性に依存する。例えば、プローブ核酸は、第1の標識の分離が起こったプローブ核酸に結合できるに過ぎない、光学的に又はその他検出可能な二次標識で標識され得る。本分野で公知の標識の様式は数多く存在し、このような様式のすべてが本発明での使用に適していると考えられる。しかしながら、特に好ましい様式は、一つ又はそれ以上の経口標識されたヌクレオチドの、プローブ核酸の3−’OH基への転移を包含する。2’,3’−ジデオキシヌクレオチド(2’,3’−ジデオキシヌクレオチドには、さらなるヌクレオチドが付加できない。)との識別反応の前にプローブ核酸が終結すれば、このような反応は高度に特異的にすることができる。本発明の主題のより好ましくない態様において、スペーサーは標識で標識され得ること、及び所定の位置へ抗タグを結合できるように、スペーサーが所定の様式で抗タグへ結合するタグを含むことも想定される。次いで、その位置からの信号の検出は、正の識別反応(例えば、識別配列の加水分解)の指標となる。
あるいは、識別事象(例えば、RNA加水分解、制限等)の検出は、一本鎖核酸の固相へのハイブリダイゼーションなしに実施することができ、特に好ましい別の態様において、検出は溶液中でリアルタイムで実施される。例えば、特に識別事象が3’末端に3’−ヒドロキシ基を生じる場合、検出は、各異なる一本鎖核酸が物理的に離れた位置に配備される検査アッセイにおけるリアルタイムPCRを使用して実施することができる(例えば、複数ウェルプレート、反応毛細管等)。ここで、相補的な鎖の生成は、インターカレート色素を使用して測定することが可能である。あるいは、特に各識別反応が離れた位置で実施される場合、識別事象を同定するためにFRET標識を利用し得る。
特に好ましい態様において、想定されるキット及び組成物は、さらに、検査混合物を形成するための識別条件下で、核酸を含む試料を、一本鎖核酸の複数とともにインキュベートし、第二の一本鎖核酸(第二の一本鎖核酸の各々は、特有のタグ配列と相補的な配列を有し、及び所定の位置に位置する。)の複数を有するチップへ検査混合物を適用するための指示書を含む。このような使用説明書は、さらに、標識からの信号の複数をチップから獲得し、信号から遺伝子型(例えば、特定の突然変異、反復の数など)を決定するための助言を提供するであろう。
望ましい場合、想定されるキットは、第2の一本鎖核酸の複数を有するチップをさらに含み得、ここで、第2の一本鎖核酸の各々は、特有のタグ配列に対して相補的であり、及びチップ上の所定の位置に存在する配列を有する。さらに、又は場合によりこのようなキットは、RNaseH、ポリメラーゼ又は末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ及び/又は標識されたヌクレオチドを含む試薬も有し得る。
従って、核酸の遺伝子型を決定する方法は、試料核酸(例えば、場合によりメチル化されたアンプリコン、cDNA又はゲノムDNA)が第1の一本鎖核酸の複数とともにインキュベートされ、これにより検査混合物を形成する工程を含む。このような方法において、第1の一本鎖核酸の各々は、ターゲティング配列へ連結される特有のタグ配列を有すること、及びターゲティング配列へ連結される識別配列をさらに有することが一般に好ましく、ここで、識別配列は、標識へさらに連結される。別の工程において、識別剤は識別条件(例えば、試料核酸を第1の一本鎖核酸の複数の少なくとも一つ又はそれ以上、典型的にはすべてとハイブリダイズできる条件)下で検査混合物へ添加され、これにより標識を第1の一本鎖核酸の少なくとも一つから分離し、さらに別の工程において、標識の、第1の一本鎖核酸の少なくとも一つからの分離は、特有のタグ配列を使用して決定される。最終的に、遺伝子型は、決定の段階から推定される。
その結果、異なる観点からわかるように、核酸中の反復単位のコピー数を決定する方法は、一般式A−T−Rn−R’−Lの一本鎖核酸の複数を、二本鎖を形成するためのハイブリダイゼーション条件下で核酸と組み合わせる工程を含み、Aは特有のタグDNA配列であり、Tは場合により存在するターゲティングDNA配列であり、RはDNA反復配列であり、nは1と500(又はそれ以上)の整数であり、R’はRNA反復配列であり、Lは標識である。さらなる工程において、R’の少なくとも一部は、R’及び核酸中の反復単位が相補的な二本鎖を形成し、これによりLをAから分離する二本鎖中でRNaseHを使用することで加水分解され、さらに別の工程において、一本鎖核酸は、Aを使用してチップの所定の位置上へと結合される。さらなる工程において、信号は所定の位置から測定される。最も好ましくは、このような方法は、R’が少なくとも部分的に加水分解された一本鎖核酸を選択的に標識する工程を含み、ここで、標識の工程は、Lと区別できる第2の標識を使用して実施される。Tは、典型的には、少なくとも12塩基の長さを有し、核酸の一部と少なくとも90%の相補性を有する。
このように、核酸分析の具体的な態様及び用途を開示した。しかしながら、すでに記載されたもの以外に、本明細書中の本発明の概念から逸脱することなく、他のより多くの改変が可能であることは当業者に自明である。従って、本発明の主題は、添付の特許請求の範囲の精神以外に限定されるべきではない。さらに、明細書及び特許請求の両者を解釈する上で、すべての用語は、文脈に合致する可能な最も広義の態様で解釈されるべきである。特に、「を含む」及び「を含んでいる」という用語は、排他的でない態様で、要素、成分又は工程を指すものと解釈されるべきであり、参照された要素、成分又は工程は、明示的に参照されていない他の要素、成分又は工程とともに存在し、又は利用され、又は組み合され得ることを示す。さらに、参照により本明細書に組み入れられる参考文献中の用語の定義又は使用が、本明細書中に提供される用語の定義と一致しないか又は反対である場合には、本明細書中に提供される用語の定義が適用され、参照文献中の用語の定義は適用されない。
Claims (22)
- 各々がターゲティング配列(targeting sequence)に連結された特有のタグ配列を有し、および各々がターゲティング配列に連結された識別配列をさらに有し、識別配列がさらに標識に連結されている、複数の第一の一本鎖核酸を含み、並びに、
識別配列の各々が識別条件下で識別剤によって一本鎖核酸の少なくとも部分的な加水分解に適した配列を有し、これにより標識を特有のタグ配列から分離する、検査キット。 - 一本鎖核酸の少なくとも一つが、ターゲティング配列がDNAを含み、及び識別配列がRNAを含むキメラ分子である、請求項1に記載のキット。
- 識別剤がRNaseHである、請求項1に記載のキット。
- 識別配列の各々が反復配列を含み、および識別配列の各々が別個の反復数を有する、請求項1に記載のキット。
- 標識が、フルオロフォア、ルミノフォア、色素、ラマン活性部分および酵素からなる群から選択される、請求項1に記載のキット。
- (a)検査混合物を形成するための識別条件下で、核酸を含む試料を、一本鎖核酸の複数とともにインキュベートし、(b)各々が特有のタグ配列と相補的な配列を有し、及び所定の位置に位置する第2の一本鎖核酸の複数を有するチップへ検査混合物を適用し、(c)標識からの信号の複数をチップから獲得し、並びに(d)信号から遺伝子型を決定するための指示書をさらに含む、請求項1に記載のキット。
- 各々が特有のタグ配列に相補的な配列を有し、及び所定の位置に位置する第2の一本鎖核酸の複数を有するチップをさらに含む、請求項1に記載のキット。
- RNaseHを含む試薬、ポリメラーゼまたは末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼを含む試薬、および標識化されたヌクレオチドを包む試薬のうちの少なくとも一つをさらに含む、請求項1に記載のキット。
- 核酸の遺伝子型を決定する方法であり、第一の一本鎖核酸の複数とともに、試料核酸をインキュベートし、これにより検査混合物を形成すること(第一の一本鎖核酸の各々がターゲティング配列へ連結された独特のタグ配列を有し、及びターゲティング配列へ連結された識別配列をさらに有し、識別配列がさらに標識に連結されている。);
識別条件下で識別剤を検査混合物へ添加し、これにより標識を第1の一本鎖核酸のうちの少なくとも一つから分離すること;
特有のタグ配列を使用して、第1の一本鎖核酸のうちの少なくとも一つからの標識の分離を決定すること、並びに;
決定の工程から遺伝子型を推定すること;
を含む、方法。 - 試料核酸が、アンプリコン、cDNAおよびゲノムDNAからなる群から選択される、場合によりメチル化された核酸を含む、請求項9に記載の方法。
- 特有のタグ配列およびターゲティング配列がDNAを含み、並びに識別配列がRNAを含む、請求項9に記載の方法。
- 標識が、フルオロフォア、ルミノフォア、色素、ラマン活性部分および酵素からなる群から選択される、請求項9に記載の方法。
- 識別条件が、試料核酸の、第1の一本鎖核酸の複数の全てとのハイブリダイゼーションを可能とする条件である、請求項9に記載の方法。
- 識別剤がRNaseHまたはメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼである、請求項9に記載の方法
- 分離を決定する工程が、特有のタグ配列を使用して、第1の一本鎖核酸の複数をチップの所定の位置に結合すること、及び所定の位置の標識からの信号について照会することを含む、請求項9に記載の方法。
- 二本鎖を形成するためのハイブリダイゼーション条件下で、一般式A−T−Rn−R’−L(式中、Aは特有のタグDNA配列であり、TはターゲティングDNA配列であり、RはDNA反復配列であり、nは1と500の間の整数(1及び500を含む。)であり、R’はRNA反復配列であり、およびLは標識である。)の一本鎖核酸の複数を核酸と組み合わせること、
RNaseHを使用して、二本鎖中のR’の少なくとも一部を加水分解すること(R’および核酸中の反復単位は、相補的な二本鎖を形成し、これによりLをAから分離する。)、
Aを使用して、チップの所定の位置上に一本鎖核酸を結合すること、および
所定の位置からの信号を測定すること、
を含む、核酸中の反復単位のコピー数を決定する方法。 - R’が少なくとも部分的に加水分解された一本鎖核酸を選択的に標識化する工程をさらに含み、標識化の工程がLと識別可能な第二の標識を使用して実施される、請求項16に記載の方法。
- Tが少なくとも12塩基の長さを有し、及び核酸の一部と少なくとも90%の相補性を有する、請求項16に記載の方法。
- 加水分解の工程がRNaseHを使用して実施される、請求項16に記載の方法。
- Aが特有のタグDNA配列であり、TがターゲティングDNA配列であり、RがDNA反復配列であり、nが1と500の間の整数(1及び500を含む。)であり、R’がRNA反復配列であり、およびLが標識である式A−T−Rn−R’−Lを有するキメラオリゴヌクレオチド。
- 二本鎖を形成するためのハイブリダイゼーション条件下で、一般式T−Rn−R’−L*(TはターゲティングDNA配列であり、RはDNA反復配列であり、nは1と500の間の整数(1及び500を含む。)であり、R’がRNA反復配列であり、およびL*が場合により使用される標識であることを含み、並びに前記一本鎖核酸の各々は3’−OH末端を有しない。)の一本鎖核酸の複数を核酸と組み合わせること、
R’および核酸中の反復単位が相補的な二本鎖を形成し、これにより3’−OH末端を生じる場合、識別剤を使用してR’の少なくとも一部を加水分解すること、
(a)場合により標識化される少なくとも一つのヌクレオチドを前記3’−OH末端へ付加すること、または(b)ヌクレオチドの複数を前記3’−OH末端へ付加し、及び付加されたヌクレオチドを標識すること、並びに
標識を溶液中で検出すること
を含む、核酸中の反復単位のコピー数を決定する方法。 - 検出の工程がリアルタイムで実施される、請求項21に記載の方法。
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