JPH02504110A - 核酸配列の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸配列の検出方法 本出願は１９８５年１２月５日出願の米国特許出願第８０５．２．７９号の一部 継続出願である。従って、該出願の内容は本出願に含まれるものとする。 発明の背景 本出願においては、種々の特許及び刊行物を参照及び引用した．これらの特許及 び刊行物は、本発明が所属する技術分野の現状の十分な理解に役立つものであり 、従ってその記載内容は全て本出願に含まれるものとする．米国特許出願第８０ ５，２７９号の大要は既に公開されている．例えば、１９８７年８月７日公開の 欧州特許出願第８６１１６９０６．８号を参照するとよい． 現行のＤＮＡブローブの方法論は、ターゲットＤＮＡをフィルターと直接接触さ せるかまたはアガロースゲルからのサザン転移法を介してフィルターと接触させ ることによってターゲットＤＮＡをニトロセルロースフィルターに結合させる原 理に基づく．次にＤＮＡを変性し、フィルターを加熱してしっかりと結合させる ．一般に、ＤＮＡの調製及びゲル流込み（ｒｕｎｎｉｎｇ）の処理にはかなり高 レベルの熟練技術を要し時間及び費用もかかる． 次の段階でプローブＤＮＡを調製する。プローブＤＮＡを調製するためには、３ ２ｐ標識ヌクレオチドを使用しニックトランスレーション、ポリヌクレオチドキ ナーゼまたはその他のポリメラーゼタイプの複写反応によって特異的ＤＮＡを放 射性標識する。調製したプローブＤＮＡと結合ターゲットＤＮＡとをハイブリダ イズさせる。適温で典型的には数時間ハイブリダイゼーションを進行させる。　 ＤＮＡプローブは、相補的塩基配列を有する結合ターゲットＤＮＡのいずれがと 会合してハイブリッドニ重ｆｉ　（ｄｕｐｌｅｘ）を形成する１次に非結合プロ ーブＤＮＡのごとき外来物質をフィルターから洗い落とし、放射性標識に感受性 のフィルムにフィルターを露光する。 １９８２年１２月２２日公開の欧州特許出願第０．０６７．５９７号（Ｂｅｎｄ ｅｒ等）は、オリゴヌクレオチド及びその製造方法を開示している。この方法で は、デオキシリボヌクレオチド鎖の特異的部位にリボヌクレオチド単位を組み込 んで、鎖を容易に開裂させる所定の開裂部位を形成する。この方法によって得ら れた産生物は、ヌクレオチド産生物とポリヌクレオチド産生物の混合物を分離す るために有効であると記載されてはいるが、Ｂｅｎｃｌｅｒ等は、１０−ブフラ グメントの増幅に基づくターゲット核酸分子の検出方法は教示していない。 １９８４年９月１３日公開の国際特許出願第Ｉ０８４１０３５２０号（Ｍａｌｃ ａｌ−等）は、核酸プローブと酵素含有マーカーとのタンデムハイブリダイゼー ションを利用する核酸配列の検出方法を開示している。該方法では、相補的ター ゲット配列を含むサンプルとプローブとをハイブリダイス条件下に接触させる。 ターゲット配列とのハイブリダイゼーションの前または後でプローブを、プロー ブの配列に相補的な配列を有する酵素標識マーカーポリヌクレオチドにハイブリ ダイゼーションによって結合させる。 米国特許第４，３５８，５３５号（Ｆａｌｋｏｗ等）は、対象となるターゲット 核酸配列に相補的な放射性標識ヌクレオチドプローブと、これらのプローブを使 用してターゲット核酸配列を生じた病原体の存在を検出する方法とを開示してい る。該方法では、プローブとのハイブリダイゼーション以前にまずターゲット核 酸配列を不活性担体に固定する０次いで、固定した核酸と放射性標識プローブと をハイブリダイズ条件下に接触させて固体担体上でハイブリダイゼーションを生 起する０次に、不活性担体上の標識の存在を検出することによってターゲット核 酸配列の存在を検査する。ががる系の欠点は、プローブ自体を固定できないこと である。 Ｆａｌｋｏ−等の方法において、ターゲット核酸配列でなく１０−ブが固定され た場合、固定されたプローブの標識分子は、プローブがターゲット核酸配列とハ イブリダイズしたか否かにかかわりなく固体担体に結合するであろう、その結果 、ターゲット核酸配列が検出できないことになる。 欧州特許出願公開第０．１１７，４４０号は非放射性の化学的標識ポリヌクレオ チドプローブ及びかがるプローブの使用方法を開示している。開示された方法は Ｆｉｌｋｏ−等の方法と同様に、ターゲット核酸配列をハイブリダイゼーション 以前に固体担体に固定する。 最近になって、蛍光タグまたは変色酵素系のごとき別の検出系が開発された。し かしながらかかる系は感度及びバックグラウンド（ノイズ）のレベルでかなり問 題を含む。 米国特許第４，３６２，８６７号（Ｐａｄｄｏｅｋ）は、ハイブリダイズして二 重鎖螺旋構造を形成する２つの相補的なデオキシヌクレオチド配列を含むハイブ リッド核酸構造を開示している。 ２つのデオキシヌクレオチドの間に１つのりボヌクレオチド配列が存在し、この リボヌクレオチド配列は前記デオキシヌクレオチドに共有結合している。この構 造が１つの単位を形成し、この単位中にヌクレオチド配列の繰返しは存在しない 。 米国特許第４，６８３，１９５号（Ｍｕ　Ｉ　Ｉ　ｉｓ等）は、ターゲット核酸 配列を増殖及び検出するために、核酸の別々の相補鎖を過剰モル量の２つのオリ ゴヌクレオチドプライマーで処理する方法を開示している。プライマーを延長し 所望の核酸配列の合成鋳型の機能を果たす相補的プライマー延長産物を形成する ことによって、増幅配列を検出する。この方法の欠点は、熱交換サイクル（ｔｈ ｅｒｍａｌ　ｃｙｃｌｉｎｇ）を要すること及び定温条件が欠如していることで ある。 米国特許第４，８８３，１９４号（Ｓａｉｋｉ等）は、制限部位を含む核酸配列 の１つの鎖に相補的なオリゴヌクレオチドプローブを使用して核酸配列の特異的 部位の有無を検出する方法を開示している。　５ａｉｋｉ等は、核酸即ちオリゴ ヌクレオチドプローブをそのままで使用してもよく、マたは該プローブが含む配 列を米国特許第４，６８３，２０２号に記載の方法で増幅させ感度の向上を図っ てもよいと教示している。しかしながらかかる増幅方法は前述の米国特許第４， ６８３，１９５号に固有の欠点から免れることができない。 光１５１月Ｊ、一 本発明は、（ａ）ターゲット核酸分子とターゲット分子よりも多量の相補的−重 鎖核酸プローブとを含む反応混合物を、プローブとターゲット核酸分子とが互い にハイブリダイズして二重鎖ターゲット−プローブ複合体を形成し得る条件下に 調製し、（ｂ）ターゲット核酸分子にハイブリダイズした少なくとも２つのプロ ーブフラグメントが形成され次いでプローブフラグメントが一重鎖になり従って ターゲット核酸分子が別のプローブとハイブリダイズ可能になるように、ハイブ リダイズしたプローブに所定配列内部で少なくとも１回ニックを導入し、（ｅ） プローブフラグメントを同定しこれによりターゲット核酸分子を検出する段階を 含むターゲット核酸分子の検出方法を提供する。 本発明はまた、（１）相補的または非相補的な１つ以上のデオキシリボヌクレオ チドに１端または両端で共有結合し得るターゲットデオキシリボ核酸分子を用い 、ターゲ・ントデオキシリボ核酸分子と該ターゲットデオキシリボ核酸分子に相 補的なりボヌクレオチド配列を有する一重鎖核酸プローブとを含む反応混合物を 、プローブとターゲットデオキシリボ核酸分子とが互いにハイブリダイズして二 重鎖ターゲットープローブ複合体を形成し得る条件下に調製し、（ｂ）ターゲッ トデオキシリボ核酸分子にハイブリダイズした少なくとも２つのプローブフラグ メントが形成されその結果としてプローブフラグメントが一重Ｍ蝶なりターゲッ トデオキシリボ核酸分子が別の１０−ブとハイブリダイズ可能になるように、ハ イブリダイズしたプローブに所定配列内部で少なくとも１回ニックを導入し、（ ｅ）プローブフラグメントを同定しこれによりターゲットデオキシリボ核酸分子 を検出する段階を含むターゲットデオキシリボ核酸分子の検出方法を提供する。 ・′　　の　　　ｔ・ 第１図は本発明のターゲット核酸分子の検出方法において自己増幅性及び反復性 構築に使用される核酸プローブを示す、核酸プローブのプール及びＲＮアーゼＨ のごときリボヌクレアーゼとターゲット核酸分子を含むサンプルとを反応させる 。−重鎖核酸プローブはターゲット核酸分子に相補的でありターゲット核酸分子 よりも多量である。ハイブリダイゼーションの結果として、二重鎖ターゲット− プローブ複合体が形成される。　ＲＮアーゼＨはハイブリダイズした二重鎖ＲＮ ＾−ＤＮ＾のＲＮ＾配列をニックまたは切除する。 かかるニック導入後に残るＤＮＡプローブフラグメントがターゲット分子から融 解して分離される。即ち非ハイブリダイズになる。得られた一重鎖プローブフラ グメントは同位体標識またはプローブフラグメントの長さの直接測定によって検 出可能である。実際には、プローブフラグメントを検出するために、核酸プロー ブに最初に配置した蛍光標識に結合させるか、または、−リン酸化したヌクレオ チド例えばアデノシン−リン酸を用いて＾ＴＰを生成させる。追加のプローブ分 子は遊離したターゲット分子と反応して反復配列を完成する。ＲＮアーゼｌは非 ハイブリダイズＲＮへをニックまたは開裂しない、かかる反復系の使用によって ターゲット分子を感度的１０−１〜約ＩＱ−２０で検出し得る。 の−’Ｉｆ一 本発明は、（ａ）ターゲット核酸分子とターゲット分子よりも多量の相補的−重 鎖核酸プローブとを含む反応混合物を、プローブとターゲット核酸分子とが互い にハイブリダイズして二重鎖ターゲット−プローブ複合体を形成し得る条件下に 調製し、（ｂ）ターゲット核酸分子にハイブリダイズした少なくとも２つのプロ ーブフラグメントが形成されその結果としてプローブフラグメントが一重鎖にな りターゲット核酸分子が別のプローブとハイブリダイズ可能になるように、ハイ ブリダイズしたプローブに所定配列内部で少なくとも１回ニックを導入し、（ｃ ）プローブフラグメントを同定しこれによりターゲット核酸分子を検出する段階 を含むターゲット核酸分子の検出方法を提供する。 １つの実施態様によれば、本発明は更に、前記段階（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）が 繰返されるターゲット核酸分子の検出方法を提供する。これらの段階のｈＡ遅し によって、ターゲット分子より多量、即ち過剰モル量の相補的−重鎖核酸プロー ブは、ターゲット分子を再使用し得る。即ち、反応混合物に含まれた別の核酸プ ローブがターゲット分子とハイブリダイズし得る。 本発明の実施に有用な核酸プローブは、構造：［ＮＡＩ−−−Ｒ−−−ＮＡ２コ ｎ 〔式中、Ｎ＾、及びＮＡ２は核酸配列、ＲはＲＮ＾配列、ｎは約１〜約１０の整 数〕で示される。 本発明の１つの実施態様において核酸１０−ブ中のＮ＾。 及びＮＡ２は夫々、約０〜約２０個のヌクレオチドを含み、Ｒは約１〜約１００ 個またはそれ以上のりボヌクレオチドを含み、ｎは約１〜約１０の整数である。 本発明の別の実施態様において核酸プローブ中のＮＡ、及びＮＡ２はＤＮＡ配列 である。別の実施態様においてＮＡ１及びＨＡ２はＲＮＡ配列である。更に別の 実施態様において核酸プローブは、ＮＡ、がＲＮＡまたはＤＮＡ配列でＨＡ、が ＲＮＡまたはＤＮＡ配列である構造を有する。 １つの実施態様においては、ハイブリダイズしたプローブを所定ＲＮＡ配列でニ ックするために、二重鎖リボヌクレアーゼを使用する。かがるリボヌクレアーゼ は、ハイブリダイズした二重ｇＤＮＡ−ＲＮ＾からリボ核酸配列をニックまたは 切除する０本発明の実施に有用なりボヌクレアーゼの例はＲＮアーゼＢである。 　ＥｘｏＤＩ及び逆転写酵素のごとき別のりボヌクレアーゼ及び酵素もＲＮＡ− ＤＮＡからＲＮＡをニックまたは切除するために適当である。 本発明の分子は、核酸配列Ｎ＾１またはＮＡ、の一方または両方に結合された検 出可能マーカーを有していてもよい、このマーカーは、検出可能ないかなる分子 または試薬から成ってもよい、かる検出可能分子の例は、放射性同位体、放射性 標識分子、蛍光分子、蛍光抗体、酵素または化学発光触媒である。その他の適当 なマーカーは、酵素、蛍光分子またはその他の検出可能分子でタグ標識した特異 的タンパク質に結合し得るリガンドである。適当なリガンドの一例は、アビジン またはストレプトアビジンに結合するビオチンである。 本発明の１つの実施態様においては、核酸プローブを固体担体に固定する。別の 実施態様においては、核酸プローブを検出可能マーカーで標識する。 核酸配列Ｎ＾１及びＮＡ２がＤＮＡのとき、前記のＲ部分は、１９８５年１２月 ５日出願の米国特記出願第８０５，２７９号で使用した「切れ易い結合」なる用 語で適切に表現できる。かかる結合は、分子自体またはターゲット核酸分子の核 酸配列の開裂または分裂を全く生じさせることなく開裂または分裂できる。 本明細書において、かかる「切れ易い結合」、即ちＲは、２つの核酸配列に結合 し、結合した核酸配列の開裂を生じさせることなく選択的に開裂し得る任意の化 学的結合構造を意味する。「切れ易い結合」は単一結合でもよくまたは多単位配 列でもよい０本文中のＲはリボ核！１ｍ　（ＲＮＡ）配列を示す。 本発明のプローブとして有用な分子においてれが１より大きい値を有する分子で は、単位Ｎ＾、−−−Ｒ−−−Ｎ＾、が繰返し存在する。各繰返し単位は同じで もよくまたはランダムもしくは所定パターンで変化していてもよい、各繰返し単 位中のＮＡ、、ｔたはＮＡ、または両者が変化していてもよい、ＮＡ。 またはＮＡ、の変化は、繰返し中の１つの単位と直後の単位との間で核酸配列が 異なっているような変化でもよい、この変化はまた、繰返し中の１つの単位と直 後の単位との間で、夫々の単位に含まれるＮＡ１及びＮＡ２の各々の塩基の数が 多少とも異なるようなランダムな変化でもよい、ｎ＝３でＮＡ１及びＮＡ２の両 方が変化するランダム変化の一例は、Ｎ＾ビーＲ−−−ＮＡ、−−−ＮＡ、＋− −−Ｒ−−−ＮＡ、°−−−ＮＡ、”−−−Ｒ−−−ＮＡ２″である。 ｎ＝４でＮＡ、及びＮＡ２の両方が変化するパターン的変化の一例は、 ＮＡ、−−−Ｒ−−−ＮＡ、−−−ＮＡ、＋−−−Ｒ−−−ＮＡ２°−−−ＮＡ 、−−−Ｒ−−−ＮＡ２−−−ＮＡ、’−−−Ｒ−−−Ｎ＾、゛である。 上記の両方の例で、各単位を結合している実線は水素結合または共有結合から成 る化学結合である。 また、繰返し単位の変化が、「切れ易い結合」、即ちＲの変化であってもよい、 その場合にはＲ１即ちｒ切れ易い結合」のりボヌクレオチドの配列が変化してい る。Ｒ１即ち「切れ易い」結合中のりボヌクレオチド配列の変化も前記のごとく ランダムでもよくパターン的でもよい、また、繰返し単位の変化が、ＮＡ３、Ｎ Ａ２または「切れ易い結合」、即ちＲの前記のごとき変化を組み合わせて含んで いてもよく、これらの変化がランダムでもよくパターン的でもよい。 比較的長さが短く従ってターゲット核酸分子に高度に特異的である核酸プローブ の使用によって最良結果が得られることは当業者に容易に理解されよう、相補的 核酸１０−ブ中のヌクレオチドの総数を増加させるよりもむしろ制限することに よって、ターゲット核酸分子の高ゲイン−低ノイズ検出が達成できる。 検出すべきターゲット核酸の種類、核酸プローブの構造、即ちプローブがＤＮＡ −ＲＮＡハイブリッドであるかまたはＲＮＡ配列単独から構成されているか、等 を含む多数の要因に従って核酸プローブの全長を変更し得ることは当業者に容易 に理解されよう、　ＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列からプローブを構築する場合には 、ＲＮＡプローブフラグメントがターゲット核酸分子にハイブリダイズして維持 されるように、Ｒ部分即ち「切れ易い結合」がニックまたは切除し易くなってい ることが重要である。この点で、プローブフラグメントを本発明方法で一重鎖に するために、Ｒ部分、即ち「切れ易い結合」がヌクレオチド約８〜約１０個のＤ ＮＡ配列間に存在するのが有利である、但しこれは必須要件ではない。 プローブがＲＮＡ配列だけから構築される場合、ＲＮアーゼ■またはＥｘｏ　ｍ のごとき二重鎖リボヌクレアーゼを使用するとニック導入が特に容易である。　 ＲＮＡ配列だけから構築された直線状のＲＮ＾プローブが特に有用である。その 第１の理由は酵素によって産生され易いことにあり、第２の理由は、上記リボヌ クレアーゼのごときニック導入試薬によってニックまたは開裂され易い開裂部位 を多数有することにある。従って、直線状ＲＮ＾プローブは、ＤＮＡ−ＲＮ＾ハ イブリッドプローブのように「切れ易い結合」に依存しない。 本発明はまた、（ａ）相補的または非相補的な１つ以上のデオキシリボヌクレオ チドに１端または両端で共有結合し得るターゲットデオキシリボ核酸分子を用い 、ターゲットデオキシリボ核酸分子と該ターゲットデオキシリボ核酸分子に相補 的なりボヌクレオチド配列を有する一重鎖核酸プローブとを含む反応混合物を、 プローブとターゲットデオキシリボ核酸分子とが互いにハイブリダイズし二重鎖 ターゲット−プローブ複合体を形成し得る条件下に調製し、（ｂ）ターゲットデ オキシリボ核酸分子にハイブリダイズした少なくとも２つのプローブフラグメン トが形成されその結果としてプローブフラグメントが一重鎖になりターゲットデ オキシリボ核酸分子が別のプローブとハイブリダイズ可能になるように、ハイブ リダイズしたプローブに所定配列内部で少なくとも１回ニックを導入し、（ｃ） プローブフラグメントを同定しこれによりターゲットデオキシリボ核酸分子を検 出する段階を含むターゲットデオキシリボ核酸分子の検出方法を提供する。 １つの実施Ｓ様において、本発明は、前記段階（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）が繰返 されるターゲットデオキシリボ核酸分子の検出方法を提供する。 本発明のターゲットデオキシリボ核酸の検出方法に有用な一重鎖核酸プローブは 約１０〜約２０００のりボヌクレオチドを含む、かかる核酸プローブ中のりボヌ クレオチドの数はターゲットデオキシリボ核酸、所要感度、等に従って広い範囲 で変更できることが当業者に容易に理解されよう。段階（ａ）で反応混合物を調 製する際に、当業界で公知の方法を用いてターゲットデオキシリボ核酸分子をＤ ＮＡ配列に変換し得る。 本発明の更に別の実施ＦＪ様では、段階（ｂ）でハイブリダイズプローブにニッ クを導入するために、二重鎖リボヌクレアーゼを用いる。更に別の実施態様では 、かかるリボヌクレアーゼがＲＮアーゼＨでもよい、　ＲＮアーゼＢ様活性を有 する別の酵素、例えばＥｘａ　ｍ及び逆転写酵素等もある。これら及びその他の 酵素は本発明の方法の変形方法または非変形方法のいずれにも適している。 前記段階（ａ）で反応混合物を形成する際に、ターゲット核酸分子とターゲット 分子より多量、即ち過剰モル量の相補的−重鎖核酸プローブとを、１０−ブとタ ーゲットとが互いにハイブリダイズでき二重鎖ターゲット−プローブ複合体を形 成できるようなハイブリダイゼーション条件下に混合する。 前記段１１１（ｂ）でハイブリダイズプローブをニックするために、例えば酵素 的方法を用いてもよい、即ち、ハイブリダイズしたプローブとハイブリダイズプ ローブ中の所定配列をニック即ち切除し得る試薬とを接触させる０本発明の実施 において、かかる所定配列はｒ切れ易い結合」、即ちＲまたはＲＮＡ配列を含む 。 典型的には、ターゲット核酸分子とターゲット分子より過剰の標識相補的−重鎖 核酸プローブと適当なバッファ中で合せて反応混合物を調製する。このように調 製された反応混合物を約り０℃〜約４５℃、ａＳには約３７℃の温度で約５分〜 約３０分閲または６０分閲以内またはアニーリング所要時間だけインキュベート する。 ハイブリダイズしたターゲット及びプローブを含む反応混合物を次に、約り０℃ 〜約４５℃最適には約３７℃で更に時間をかけてニック導入用試薬と結合させる 。この時間は約５分〜約６０分であるが、たいていの場合は３０分で十分である 。 ハイブリダイゼーション、ニック導入及び−重鎖プローブフラグメントの形成の 段階の繰返しを含む反復反応は、短時間例えば数ミリ秒のオーダで生じる。 ハイブリダイズした二重鎖ターゲット−プローブ複合体に対し、この複合体の所 定の配列、例えばＲまたは「切れ易い結合」を少なくとも１回ニックすることに よって、ターゲット核酸分子にハイブリダイズした少なくとも２つのプローブフ ラグメントを形成させると、ターゲット−プローブ複合体中のハイブリダイズプ ローブ配列のサイズ変化の結果として一重鎖になったハイブリダイズプローブフ ラグメントが残る０例えば、２０量体（モノマー）二重鎖ＤＮＡ配列は３７℃で アニーリングされハイブリダイズして維持される。 ニック導入後に、２つの８−デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）塩基配列間に 介在する４−リボヌクレオチド（ＲＮＡ）が、リボヌクレアーゼ例えばＲＮアー ゼＨまたはＥｘｏ　ｍによって切除されたと想定すると、残りの２つの８量体の ハイブリダイズプローブフラグメントはターゲット−プローブ複合体から融解し て分離する。これらの−重鎖プローブフラグメントを公知方法を用いて同定しタ ーゲット核酸分子を検出する。 （以下余白） ＾−Ｔ及びＧ−Ｃ塩基対は、短いオリゴマーの場合約２°／塩基対及び４°／塩 基対のＴ、をそれぞれ呈する。ハイブリダイズしたターゲット−プローブ複合体 において＾−Ｔ及びＣ−Ｃ塩基対の比が等しいとすると、各対合ヌクレオチドの 融解温度は平均約３°／塩基対となる。 ステップ（Ｃ）でのプローブフラグメントの同定とそれによるターゲット核酸分 子の検出とは幾つかの方法で実施できる。ステップ（ｃ）での同定及び検出は標 識方法に従属し、即ち核酸プローブに予め付加されたか、または上述のステップ （ｂ）で発生する検出可能なマーカーの種類に従属する。 例えば、ターゲット核酸分子の検出を蛍光ラベルとの結合または＾ＴＰ産生によ って実現し得る０例えばプローブの全体がリボ核＠　（ＲＮＡ）配列から成る場 合、ニック導入ステップ（ｂ）で得られる１０−ブフラグメントはモノヌクレオ チドから短いオリゴヌクレオチドまでであり得る。このようなフラグメントは、 その検出に有利に用い得る独得の５′−リン酸基を有する。そのようなフラグメ ントの一つであるアデノシン５′−リン酸（５′−八ＭＰ）は、ＡＴＰ産生酵素 系に供給し、その後ルシフェリンールシフェラーゼ測光読み出し系と結合させる ことができる。他の検出方法として、生成したプローブフラグメントを、例えば 高速液体クロマトグラフィー（ＥＰＬＣ）を用いて直接検出することが可能であ る。 本発明の方法を、ターゲット核酸分子検出用の高利得−低雑音増幅系の達成に用 い得ることも、当業者には理解されよう、−重鎖核酸プローブは、デオキシリボ 核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）配列から成るものであれリボ核ｆｉ　（ ＲＮＡ）配列のみから成るものであれ、例えばＲＮアーゼＢなどの一定の二重鎖 リボヌクレアーゼの作用に対して完全に安定である。このようなプローブがター ゲット核酸分子とハイブリダイズすると、「切れ易い結合」であってもなくとも よいＲＮＡ結合がリボヌクレアーゼ、即ち例えばＲＮアーゼＨによって消化され るようになる。 単なる説明のための一例として、プローブを、全長が２０個のヌクレオチドから 成り、そのうち最初の８個及びＲ後の８個のヌクレオチドがデオキシリボヌクレ オチドで、中の４個のヌクレオチドはりボヌクレオチドであるものとすることで 、本発明の方法の増幅段階を説明することができる。同一条件下に、２０量体（ モノマー）プローブは相補的なターゲットと安定なハイブリッドを形成するが、 ８量体（モノマー）プローブまたはプローブフラグメントは容易に融解して離れ 、即ちハイブリダイズしていない状態となる。 従って、ターゲット核酸分子とのハイブリダイゼーション後の２０量体プローブ は開裂可能となり、リボヌクレアーゼ、即ち例えばＲＮアーゼＢによって開裂し て、−重鎖核酸プローブがターゲット分子とハイブリダイズして二重鎖ターゲッ ト−プローブ複合体を生成した一次ハイブリダイゼーションの際と同一の条件の 下に容易に融解して離れる断片となる。 ハイブリダイゼーションを、通常程度に過剰なプローブを用い、かつ例えばＲＮ アーゼＨのような適当なりボヌクレアーゼを存在させて実現すると上述の系が反 復して（第１図参照）、開裂したプローブフラグメントを産生じ、このフラグメ ントは、例えば化学ルミネセンス、放射性同位元素などを用いる幾つかの公知方 法で検出することができる。 −次アンプリファイア即ちプローブは核酸特異性であり、不変条件下に機能する 。放射性同位元素で標識すれば、ＩＱ−４６モルのターゲットを検出する高利得 の初段検出が可能である。 全体がリボ核酸配列から成る直線状ＲＮＡプローブを形成した場合ＲＮアーゼＨ 反復の後に得られる生成物は、元のブローブの大きさに従属してモノヌクレオシ ドがらオリゴヌクレオチドまでである。しかし、各生成物は３’−ＯＢ末端を有 する。これらの末端には、ポリヌクレオチドホスホリラーゼまたはポリ＾ポリメ ラーゼのような適当なポリメラーゼをテールとして付加することができる。 このアプローチへの有用な付加手段は、プローブの５′末端にビオチンを配置し 、３′末端には例えばジデオキシのようなチェインターミネータ−ヌクレオチド を配置することである。プローブを、５′末端に“Ｕ”を有し、３′末端にも” Ｕ”を有するが中央の領域にはＵ″を有しないように設計した場合、及びそのよ うなプローブを適当な鋳型上でＴ７ＲＮ＾ポリメラーゼの作用によって形成した 場合、次の状況が維持されよう。 結合部位　　　　　　　　　　　　　　↑ランオフ転写のための 制限部位（任意） Ｔ７転写体くプローブ）重合のためのヌクレオシド三リン酸前駆体の比が ＾ＴＰ　　　　　　　　　　　　　１００ＣＴＰ　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　１００ＧＴＰ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１ ００ジデオキシＵＴＰ　　　　　　　　　１００ビオチニル化したＵＴＰ　　　 　　　１である場合、実質的にいずれの７０一ブ転写体もビオチニル化したりで 始まり、ジデオキシυで終わる。Ｒ初の塩基としてジデオキシυを選択すると、 重合は失敗する。即ち、ビオチニル化したＵでの開始は必須である。鋳型が過剰 に存在するのでほぼ総てのビオチニル化したＵが開始に用いられるため、及びジ デオキシＵの方がビオチニル化したＵより１００倍過剰であるため、３’Ｕはほ とんど常にジデオキシＵである。従って、検出の目的は酵素合成を介して達成で きる。得られるプローブは、３′位にジデオキシυが存在するためＲＮＮアーゼ 上よって切断されないとテールの付加ができず、蛍光塩基その他の検出可能分子 をテールとして付加したプローブの非ビオチニル化反応物質からの分離にはビオ チンを用いることができる。 核酸プローブの全体が、ターゲット分子と相補的であり、従って「切れ易い結合 」に依存しないＲＮ＾配列から成る場合はプローブに、ここに説明した本発明か ら十分に予測できる様々な変形を施すことが可能である。 例えば、リボ核酸プローブ、即ち全体がＲＮ＾配列から成るプローブを合成し、 その３′ヒドロキシル末端を任意にブロックすることができる。ブロッキングは 、リボ核酸プローブに“テール”を、ビオチン、過ヨウ素酸酸化したりボヌクレ オシドまたは親和性テールのようなりガントへの吸着により酵素的に付加するこ と、即ち例えばポリ屓ポリメラーゼ＾）テール付加によって行ない得る。プロー ブに付加した“テール”は、親和性単離及び信号発生に用いることができる。　 ＲＮ＾プローブの５′末端も任意に変更し得る８例えば、５′末端を非相同のＲ Ｎ＾／ＤＮ＾配列で延長し得、この場合はこの非相同配列を上記のようなリガン ド、即ち例えばビオチン、過ヨウ素！！！：酸化したりボヌクレオシドまたは親 和性テールに付着させ得る。この特別の例では、５′末端を蛍光塩基のような信 号ジェネレーターと結合させることも可能である。この構成を下図に示す。 Ｘ：　付着リガンドで、例えばビオチン、過ヨウ素酸酸化したりボヌクレオシド 、または親和性テール。 Ｙ：　蛍光塩基のような信号ジェネレーター。 このような構成中の非相同５′テールは、ターゲットと対になったＲＮ＾プロー ブの相同領域をＲＮＮアーゼ上ようなりボヌクレアーゼでニックすること、即ち 切除または咀噛することを可能にする。即ち、５′テール構成は、ポリヌクレオ シドリン酸（ＰＮＰ）またはポリメラーゼ＾（ポリΔ）テール付加に有効なフラ グメントを脱離する。このようなテールは、溶液から信号を引き出す親和性テー ルとして、または検出能を高める更に別のフラグメントとして用い得る。この構 成を下図に示す。 本発明の別の特徴において１反復核酸プローブは、抗体または抗原を検出するイ ムノアッセイに用い得る。その場合、競合的または非競合的イムノアッセイで抗 体がまたは抗原に、ホモポリマーであり得る核酸配列を付加することが可能であ る。 としての核酸 または としての核酸 競合的イムノアッセイの例として、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳ＾）を挙 げることができる。 本発明を、以下の実施例において詳述する。これらの実施例は本発明の理解の一 切となるように提示するものであり、Ｒ後に掲げた請求の範囲各項に記した本発 明を一切限定せず、また限定すると解釈されるべきでもない。 え菫１↓ 「　れ　い　ム　プローブのン 本発明の検出方法に有用であるプローブ分子を固体支持媒体（シリカゲルまたは 制御した多孔ガラス）上に、加水分解可能結合または恒常的（加水分解不能）結 合を用いて形成した。この合成には、公表されている化学的方法を用いた［＾１ ｖａｒａｄｏ−υｒｂｉｎａ、　Ｇ、、　Ｇ、　Ｍ、　５ａｔｈｅ、　Ｌ　Ｃ， Ｌｉｕ、　Ｍ、　Ｆ。 Ｃ１１ｌａｎ、　Ｐ、　Ｄ、　Ｄｕｃｋ、　Ｒ，Ｂｅｎｄｅｒ　ａｎｄ　Ｋ、　 Ｋ、　０ｇ１ｌｖｉｅ（１９８１）、　　＾ｕｔｏｍａｔｅｄ　　５ｙｎｔｈｅ ｓｉｓ　　ｏｆ　　Ｇｅｎｅ　　ＦｒａｇＩＤｅｎｔｓ。 ５ｃｉｅｎｃｅ　２１４：　２７０−２７４；　Ｒｏｂｅｒｔｓ、　Ｄ、　Ｍ、 、　Ｒ，Ｃｒｅａ、　Ｍ。 Ｍａｌｅｃｈａ、　Ｃ，＾Ｉｖａｒａｄｏ−Ｕｒｂｉｎａ、　Ｒ，１１，Ｃｈｉ ａｒｅｌｉｏ　ａｎｄＤ、　Ｍ、　Ｍａｔｔｅｒｓｏｎ　（１９８５）、　Ｃｈ ｅｍｉｃａ！　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｅｘ−ｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｒ　 ａ　Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ　ｇｅｎｅ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ｆｏｒ　ａ　５ｉｔ ｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 、　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ；　ＶａｎＢｏｏｍ、　　Ｊ、　　！（、ａｎｄ　　Ｃ， Ｔ、　　Ｉｉｔｒｅｅｓｍａｎ　　（１９８４）、　　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　５ ｙｎ−ｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｓｍａｌｌ　Ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉ ｄｅｓ　ｉｎ　５ｏｌｕｔｉｏｎ。 Ｉｎ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　−Ａ　Ｐｒａｅ ｔｉｃａｌ＾ｐｐｒｏａｃｂ　。 ｐｐ、　１５３−１８３．　Ｅｄ、　Ｍ、　Ｊ、　Ｇａ１ｔ、　ｒＲＬ　Ｐｒｅ ｓｓ］、標準的な保護されたデオキシヌクレオシドモノマーを市販製品から得、 一方保護されたデオキシウリジン及びリボヌクレオシドモノマーは公知手順で製 造した［Ｔｉ、　Ｃ，Ｓ、、　Ｂ、　Ｌ、　Ｇａｆｆｎｅｙａｎｄ　Ｒ，Ａ、　 Ｊｏｎｅｓ　（１９８２）、　Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ：　 Ｅｆｆｉ−ｅｉｅｎｔ　Ｏｎｅ　Ｆ１ａ５ｋ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｐｒ ｏｔｅｃｔ、ｅｄ　Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ。 Ｊ、　ＡＭ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、　１０４：　１３１６コ、合成は、各ＤＮ Ａ縮合については１０分、各ＲＮＡｍ台については１２分の周期を用いてＢ　ｌ ０ＬＯＧ　ＩＣＡＬＳ自動合成機で行なった。 次に示す１０−ブ構成を、様々な試験系で用いた。 「　　れ　　い　　ム　　プローブ Ｐ、　Ｌ、　＝固体サポートへの恒常的結合）１．　Ｌ、　＝固体サボー１〜へ の加水分解可能結合Ｘ、　ＭＲＣＯ４６： ５’ｄ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ）ｒ（υυＵＵＵＵＭ（７７７７７７７７７７丁 ）３’　　−Ｐ、　　Ｌ。 ２、　ＭＲＣＯ５９： ５’ｄ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ）ｒ（ＵＵＵＵ）ｄ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ ）３’　−Ｈ，Ｌ。 ３、８ＲＣＯ６０： ５’ｄ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ）Ｒ（υＵＵＬＩ）Ｄ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＴ Ｔ）３’　　−Ｅ、　　Ｌ。 ４、８ＲＣＯ６４： ５’ｄ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＭ（υＬＩＵＵＵｔｌＵＵ）ｄ（ＴＴＴＴＴ ＴＴＴＴＴ）３’　−Ｉｆ、　Ｌ。 ５、　ＭＲＣＯ６８： ５’ｄ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ）ｃｌ（ＵｔｌＵＵＵＵＵＵＭ（ＴＴＴ ＴＴＴＴＴＴＴ）３’　−Ｈ，Ｌ。 ６、　ＭＲＣＯ６９： ５’ｃｌ（（、（：ＧＴ＾＾ＣＧＣＣＡＧ）ｒ（Ｇ（：ＵＵＵＵ）ｄ（ＣＣＣＡ （：ＴＣＡＣ）３’　　−Ｂ、　　Ｌ。 ７、　ＭＲＣＯ７０： ５　’ｃｌ（［：ＧＧＴ＾＾ＣＧＣＣＡＩ：）ｒ（Ｇ（：ＵＵｔｌＵ）ｄ（ＣＣ ＣＡＧＴＣＡＣ）３’　−Ｐ、　Ｌ。 ８、　ＭＲＣＯ７１： ５’ｄ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ）ｒ（ＵＵ）ｄ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＴ Ｔ）３’　−、Ｈ，Ｌ。 プローブ分子１〜３及び５〜８は、膵ＲＮアーゼを含めた幾つかのＲＮアーゼに よって、及び塩基条件下（例えば０．５Ｍ　Ｎａ０Ｂ）に、リボヌクレオチドに おいて開裂可能であることが判明した。　ＲＮアーゼによる切断その他のルーチ ン作業のごく一般的な方法を、Ｈａｎｉａｔｉｓ等（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、 、　Ｅ、　Ｆ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈａｎｄ　Ｊ、　　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　　（１９ ８２）、　Ｎｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａ−ｔｏｒ ｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ）に見いだすことができる。 次のプローブ構成”な、本発明による方法に従って用いた。 ＃２６１．　　（９）　　５’ＣＣＡ（：Ｇ（：ＴＴｕｕｃｃｃＡｆ；ＴＣＡＣ Ｇ３’＃２６８　（１０）　５’＾ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣｃａｇＴＣＡ Ｃ［：ＡＣ３’＃２７１　（１１）　５’ＣＡＧＧＩｌ：ＴＴｕｇａｕｃｓｔＧ ＴＣＡＣＧＡＣ３’＃２７６　　（１，２）　５’ＴＡＣ＾＾ＡＣＡｅｅｅｅＣ ＡＡＴＡＴＴＧ３　’＃２８４　（１３）　５’ＴＡＧＡＣＴＴＴｇｃａａＣＴ ＣＴＴＧＧＴ３’ｆ２８６　（１４）　５’ａｃａａａｃａｃｃｃｃｃａａｕａ ｕｕ３’＃２８７　（１５）　５’ＣＣＡＧｇｇｕＴＴＴＣｃｃａＧＴＣ＾３′ ＃２９３　（１６）ビオチン−５’ＣＣＡＧ（：ｔｌ：ＴＴｕｕｃｃＣＡＧＴＣ ＡＣＧ３　”＃２９６　（１７）　５’ＴＴＴＴＴＴＴｇｇｇｇＴＴＴＴＴＴＴ ３’＃３００　（１８）　５’ＴＴＴＴＴＴＴｃｃｃｃＴＴＴＴＴＴＴ３’ｇ３ ０８　（１９）　５’ＴＡＧＣＴＴａａｕａａＴＴＣＧＡＴ３’＃３１１　　（ ２０）　　５’ＣＡＧＴＧＣａａｃａａＡＧＴＧＣＧ：３１３　（２１）　５’ ＣＡＣＴＧＣａｃａｃａＬＡＧＴＧＣ＾＃３１６　（２２）　５’（：ＴＴＴ＾ ＾＾ｇｕｃｕｇｃｃｃＡＡｌ；＾３′冑：　大文字はＤＮＡ、小文字はＲＮＡ、 上記配列の幾つかはＭ１３ファージと相補的であったが、総ての上記配列は該配 列のために構成された合成りＮＡツタ−ット相補配列を有した。 ＲＮアーゼＨでの”ネーシ；ン ２μｇの電気的に精製したプローブ（９〜２２）を添加して、次の諸成分を含有 する混合物を調製した。 ２μｇプローブ　　　　　　　　　　２ユ１４μＭ　ＡＴＰ　　　　　　　　　 　　　４μｍ１０Ｘ　ＫＢ（キナーゼＭｆｒ液）５μｍｃｌＢ、０　　　　　　 　　　　　　　３２μｍｐ３２　　ＡＴＰ　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　２．ｕ　　Ｉ　＝　２０ｕＣｉポリヌクレオチドキナー ゼ　　　５μＩ＝５単位混合物を、３７℃で４０分間インキュベートしてから熱 失活させた。その後混合物を、溶離液として脱イオン水を用いてセファデックス Ｇ−５０カラムに通した。（使い捨てカラムとして５ｕｎｅｏのトランスファー ピペット１５＋ａ＋ｏＸ　７．５ｍｍ使用。 シリコン化グラスウールで栓をし、またＧ−５０は１２１ｍまで充填、） ｓｏｏμＩ画分を１．５ｍｌ　Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管内に採集し、第一のピーク を選択した（普通、管３〜５個）０μ択した画分を速度ｖｔｃ濃ａｍで乾燥した 。管を総て一緒に１−ルし、無菌水中での最終濃度を０．１μｇ／μｌとした。 ′　　のための ムニＬムと：　　２μｇを２０μｍで稀釈して濃度０．１μｇ／μｌとする。こ の開始濃度を、１：１０の割合（蒸留水９０μｍ中に１０μｍ〉での連続的稀釈 によって所望濃度とする０反復反応のために、各反応混合物毎に１０μＩ（１０ ０ｎε）を用いた。 ・　たプローブ：　２μｇを２０μｌで稀釈する（０，１μ８７μｌ）。 この開始濃度を、１：１０の割合（蒸留水９０μｌ中に１０μｌ）での稀釈によ って０，０１μｇ／μｍとする。各反応混合物毎に１０μＩ　（１００ｎｇ）を 用いた。 えｌえＬ 反復反応のために、各プローブ（９〜２２）を別個に添加して、次の諸成分から 成る反応混合物を調製した。 蒸留水（無菌）中のプローブ　　　　　　　１０μ！（１００ｒ＋ｇ＞１０χＲ ＮアーゼＨ１！衝液　　　　　　　　　　３μ！蒸留水　　　　　　　　　　　 　　　　　７μｌターゲツトＤＮＡ（１μＢから０．０１ｆｔ）　　　　　１０ μ！反応混合物３０μｌを６５℃で１０分閲２及び３７℃で３０分間インキュベ ートした。各３０μ！反応混合物から、ＣＩ　（ＲＮアーゼＨ）コントロール： 　５μＩ＝１６．７ＢのプローブＣ２（時間３０分）コントロール：　５μＩ＝ 　１６．７ｎｇの１０−ブを取り＄した。 残りの反応混合物２０μｌに、上記コントロールｃ１と共にＲＮアーゼＢを次の ように添加した。 時間０分で１μｍ 時間１０分で１μ！ 時間２０分で１μｍ 反応混合物を３０分間インキュベートしな、各反応混合物に、コントロールとし てのプローブに等量のホルムアミド染料を加えたものを同量ずつ、加熱プレート を伴った８０゜ボルトの０．８ｍ鋤２０％アクリルアミド／７Ｍ尿素ゲル上で添 加した。 ターケ’ｙ　ｌ−Ｉ１１バイア９／亦譲フ１クーツー Ｆ’！ＧＵＲΣｌ Ｉ際調査報告

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．ターゲット核酸分子を検出する方法であって、（ａ）ターゲット核酸分子と 該ターゲット分子より多量の相補的一重鎖核酸プローブとを含む反応混合物を、 プローブとターゲット核酸分子とが互いにハイブリダイズして二重鎖ターゲット ープローブ複合体を生成するのを可能にする条件下に製造し、 （ｂ）ハイブリダイズしたプローブに所定配列内で少なくとも１回ニックを導入 して、ターゲット核酸分子とハイブリダイズした少なくとも２個のプローブフラ グメントを形成し、その際形成されたプローブフラグメントは一重鎖となり、そ れによってターゲット核酸分子の別のプローブとのハイブリダイゼーションが可 能となり、 （ｃ）プローブフラグメントを同定し、それによってターゲット核酸分子を検出 する ことを含む検出方法。
2. ２．ステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を繰り返すことを特徴とする請求項１に 記載の方法。
3. ３．一重鎖核酸プローブが構造 ［ＮＡ１−−−Ｒ−−−ＮＡ２］ｎ を有し、その際 ＮＡ１及びＮＡ２は核酸配列であり、 ＲはＲＮＡ配列であり、 ｎは約１から約１０の整数である ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
4. ４．ＮＡ１及びＮＡ２が約０個から約２０個のヌクレオチドを互いに独立に含み 、Ｒは約１個から約１００個のリボヌクレオチドを含み、ｎは約１から約１０の 整数であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
5. ５．ＮＡ１及びＮＡ２がＤＮＡ配列であることを特徴とする請求項３に記載の方 法。
6. ６．ＮＡ１及びＮＡ２がＲＮＡ配列であることを特徴とする請求項３に記載の方 法。
7. ７．ＨＡＩがＲＮＡまたはＤＨＡ配列であり、ＮＡ２もＲＮＡまたはＤＮＡ配列 であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
8. ８．ニック導入ステップを二重鎖リボヌクレアーゼで実施することを特徴とする 請求項３に記載の方法。
9. ９．リボヌクレアーゼがＲＮアーゼＨであることを特徴とする請求項８に記載の 方法。
10. １０．リボヌクレアーゼがＥｘｏＩＩＩであることを特徴とする請求項８に記載 の方法。
11. １１．核酸プローブを検出可能なマーカーで標識することを特徴とする請求項１ に記載の方法。
12. １２．核酸プローブを固体サポート上に固定することを特徴とする請求項１に記 載の方法。
13. １３．ターゲットデオキシリボ核酸分子を検出する方法であって、 （ａ）ターゲットデオキシリボ核酸分子と、一方または両方の末端でターゲット デオキシリボ核酸分子と相補的であってもなくともよい１個以上のデオキシリボ ヌクレオチドと共有結合し得る、ターゲットデオキシリボ核酸分子と相補的であ るリボヌクレオチド配列を有する一重鎖核酸プローブとを含む反応混合物を、プ ローブとターゲットデオキシリボ核酸分子とが互いにハイブリダイズして二重鎖 ターゲットープローブ複合体を生成するのを可能にする条件下に製造し、（ｂ） ハイブリダイズしたプローブに所定配列内で少なくとも１回ニックを導入して、 ターゲットデオキシリボ核酸分子とハイブリダイズした少なくとも２個のプロー ブフラグメントを形成し、その際形成されたプローブフラグメントは一重鎖とな り、それによってターゲット核酸分子の別のプローブとのハイブリダイゼーショ ンが可能となり、 （ｃ）プローブフラグメントを同定し、それによってターゲットデオキシリボ核 酸分子を検出することを含む検出方法。
14. １４．ステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を繰り返すことを特徴とする請求項１ ３に記載の方法。
15. １５．一重鎮核酸プローブが約１０個から約２０００個のリボヌクレオチドを含 むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
16. １６．ニック導入ステップを二重鎖リボヌクレアーゼで実施することを特徴とす る請求項１３に記載の方法。
17. １７．リボヌクレアーゼがＲＮアーゼＨであることを特徴とする請求項１６に記 載の方法。
18. １８．リボヌクレアーゼがＥｘｏＩＩＩであることを特徴とする請求項１６に記 載の方法。
19. １９．核酸プローブを検出可能なマーカーで標識することを特徴とする請求項１ ３に記載の方法。
20. ２０．核酸プローブを固体サポート上に固定することを特徴とする請求項１３に 記載の方法。