JPS6221062A - 標的ヌクレオチド配列アツセイのための方法、キツトおよび試薬複合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は特に診断を目的とするポリヌクレオチド９アツ
セイ、ならびにこの種のアッセイに用いるキットおよび
ポリヌクレオチド試薬複合体に関する。

ニス・イー・ダイアモンドらの米国特許出願筒６０７．
８８５号明細書（１９８４年５月７日出願、アライビ・
コーポレーションおよびジエネテイツクス・インステイ
チュート社共同出願）には、試料核酸の標的ヌクレオチ
ド配列に関するポリヌクレオチド９置換アツセイ法が記
載されている。この種のアッセイ法においては、プロー
ブポリヌクレオチドは測定すべき標的ヌクレオチド配列
に相補的なセグメント（標的結合領域）を含む。第２の
ポリヌクレオチド９（標識ポリヌクレオチドまたは信号
鎖と呼ばれる）が相補的塩基対合によって標的結合領域
の少なくとも一部に結合している。使用に際しては、プ
ローブポリヌクレオチドおよび信号鎖を含む試薬複合体
に試料を接触させる。試料中の標的ヌクレオチド９配列
がプローブポリヌクレオチドの標的結合領域に結合し、
信号鎖を試薬複合体から置換する。置換された信号鎖を
次いで検出する。これは一般に分離工程後に行われ、こ
の工程には多くの場合試料が導入される前に固体支持体
に固定されたか、または置換工程後に固体支持体に固定
されたプローブポリヌクレオチドが関与する。均質な様
式で（分離工程″なしに）実施しうる具体例はごくわず
かに示されているＫすぎない。

この種の置換アッセイ法は米国特許第 ４．３５８，５３５号（ファルコウら、１９８２年）に
代表される従来のハイブリッド形成によるアッセイ法と
比べて、試料核酸の固定化に伴う難点が除かれるという
点で種々の利点をもつ（米国特許出願筒６０７，８８５
号明細書）。しかし大部分の読取シ（置換された標識ポ
リヌクレオチド９または信号鎖の測定）には分離工程が
必要である。

米国特許出願筒７２９，５０３号明細書（シー・バリー
ら、１９８５年５月２日出願）にはポリヌクレオチド置
換型の不均質アッセイ法が記載されており、この場合置
換された信号鎖（標識ポリヌクレオチド９）は特にその
３′末端に消化可能なポリリボヌクレオチド９セグメン
トをもつ。標的ヌクレオチド鎖による置換、および分離
ののち、この信号鎖が消化されて（特に醪素ポリヌクレ
オチｒホスホリラーゼにより）リボヌクレオシドリン酸
類（特にニリン酸）となシ、こうして生成したアデノシ
ンリン酸類（特にアデノシンニリン酸）が測定される。

この測定は特にアデノシンニリン酸（ＡＴＰ）へのリン
酸化、およびＡＴＰの測定（たとえばルシフェリンを用
いるルシフェラーゼ触媒反応による）もしくはリン酸化
工程の副生物の測定（たとえばＮＡ　ＤＨおよび乳酸デ
ヒドロゲナーゼを用いるピルビン酸測定法）によって行
われる。消化可能なポリリボヌクレオチドセグメント９
を含む置換された信号鎖のアッセイに採用できる消化、
リン酸化および測定の各工程についてのより詳細な考察
に関しては、米国特許出願筒７２９．５０２号明細書（
シー・バリーら）も参照されたい。

均質アッセイ様式で操作される、置換信号鎖の消化およ
び消化生成物アデノシンリン酸の測定により置換型ポリ
ヌクレオチドアッセイ法を行う技術が見出された。従っ
て本発明は、 （１）（α）（ｉ）プリン／ピリミジン塩基の水素結合
を介してＤＮＡ標的ヌクレオチド配列に塩基対結合しう
るプローブポリヌクレオチド、および（１１）プリン／
ピリミジン塩基対の水素結合を介して、プローブポリヌ
クレオチドがＤＮＡ標的ヌクレオチド配列に結合しうる
領域と少なくとも一部は共通である領域のプローブポリ
ヌクレオチドに塩基対結合したＲＮＡ信号信号リヌクレ
オチドの試薬複合体を供給し； （ｂ）　　該試薬複合体を、ＤＮＡ標的ヌクレオチド配
列が存在する場合これがプローブポリヌクレオチドに結
合し、ＲＮＡ信号信号リヌクレオチドを試薬複合体から
置換する条件下で試料と接触させ；（ｃ）置換されたＲ
ＮＡ信号信号リヌクレオチドを分離することなく、試薬
複合体中に残存するＲＮＡ信号信号　＋７ヌクレオチド
に対して選択的に消化し、そして； （ｄ）　　置換されたＲＮＡ信号信号リヌクレオチドの
消化による消化生成物の存在を検出する工程よりなる、
生物学的試料のＤＮＡ中における標的ヌクレオチド配列
の存在を調べる方法を提供する。

この方法の好ましい形態においては、信号鎖は試薬複合
体において標的結合領域のヌクレオチドに結合した３′
末端リボヌクレオチドを含む。これはこのように結合し
た状態ではポリヌクレオチドホスホリラーゼにより消化
されないが、置換されたのちはポリヌクレオチドホスホ
リラーゼにより消化されて、リボヌクレオシド９ニリン
酸類となる。

これにアデノシンニリン酸が含まれ、これが測定される
。

本発明゛は （１１）（ａ）（ｉ）プリン／ピリミジン塩基の水素結
合を介してＤＮＡ標的標的ヌクレオチド列配列基対結合
しうるプローブポリヌクレオチド、および（１１）プリ
ン／ピリミジン塩基対の水素結合を介して、プローブポ
リヌクレオチドがＤＮＡ標的ヌクレオチド配列に結合し
うる領域と少なくとも一部は共通である領域のプローブ
ポリヌクレオチドに塩基対結合した沿私信号鎖ポリヌク
レオチドの試薬複合体であって；ＲＮＡ信号信号リヌク
レオチドの３′末端ヌクレオチド９が試薬複合体中にお
いてプローブポリヌクレオチドのヌクレオチドに結合し
ており；かつプローブポリヌクレオチドが３′−水酸基
を有する未結合３′末端リボヌクレオチドを含まないも
の；（１５）　　一本鎖状の３′末端リボヌクレオチド
９に特異的な消化酵素； （ｃ）　　消化酵素により生成したアデノシンリン酸類
をＡＴＰに変換するのに有効な反応体および酵素ならび
に （ｄ）　　ＡＴＰ、またはアデノシンリン酸類からＡＴ
Ｐへの転化の副生物を検出するための手段からなる、生
物学的試料のＤＮＡ中のあらかじめ定められた標的ヌク
レオチド配列の存在を測定するだめのキットを提供する
。

本発明はさらに、上記プローブポリヌクレオチドおよび
上記ＲＮＡ信号信号リヌクレオチドからなる、上記の方
法およびキットに用いる試薬複合体をも提供する。

第１図は本発明の第１の実施態様を３部分に分けて（第
１Ａ、ＩＢおよびＩＣ図）示した略図であり、第１Ａ図
には試薬複合体、第１Ｂ図には置換工程の中間段階、第
１Ｃ図には置換された信号鎖の消化およびＡＤＰからＡ
ＴＰへのリン酸化を示す。

第２Ａ図は本発明の第２の実施態様による試薬複合体の
略図である。

第２Ｂ図は本発明の第３の実施態様による試薬複合体の
略図である。

第２Ｃ図は本発明の第４の実施態様による試薬複合体の
略図である。

第２Ｄ図は本発明の第５の実施態様による試薬複合体の
略図である。

第３Ａ、３Ｂ、３Ｃ１３Ｄおよび３Ｂ図は本発明の第６
の実施態様の各段階を順次水した略図である。

第４Ａ図は本発明の第７の実施態様による試薬複合体の
略図である。

第４Ｂ図は信号鎖（もはや図示されていない）置換後の
第４Ａ図の試薬複合体の略図である。

本発明により提供され、本発明の方法およびキットに用
いられる試薬複合体の基本的要素は、プローブポリヌク
レオチド“および信号鎖であり、これらは後記のように
相補的塩基対合によってのみ相互に結合していてもよく
、あるいはさらにリン酸／糖ホＩＪヌクレオチド主鎖が
共有結合していてもよい（あるいはさらに共有結合また
は非共有結合していてもよい）。ブローブイリヌクレオ
チドは測定される標的ヌクレオチド配列に相補的な標的
結合領域をもつ。米国特許出願筒６０７，８８５号明細
書に詳述されるように、標的結合領域は標的ヌクレオチ
ド配列に完全に相補的であってもよく、あるいは一定数
の不整合を含んでいてもよい。

さらに標的結合領域は信号鋲結合領域（または標識ポリ
ヌクレオチド結合領域、従って図面においてはＬＢＨ）
と呼ばれる部分に分割されていることが好都合であり、
試薬中においてこの部分に信号鎖が相補的塩基対合によ
多結合している。米国特許第６０７，８８５号明細書の
第１Ｇ図に示されるように、信号鎖の他の少数の塩６基
が標的結合領域外のプローブポリヌクレオチドの一部（
残部結合領域、またはＲＢＲ）に結合していてもよいが
、このような残部結合領域は存在しないことが好ましい
。

プローブポリヌクレオチドの標的結合領域中に通常存在
する他の部分（単数または複数）は試薬複合体において
一本鎖であり、標的ヌクレオチド配列が信号鎖のヌクレ
オチド置換前にこの領域に最初に結合′シラるので初期
結合領域（ＩＢＲ）と呼ばれる。米国特許第６０７，８
８５号明細書に記載されるように、標的結合領域の大き
さは他と無関係に決定されるのではなく、ＬＢＨおよび
ＩＢＲの好ましい長さまたはより好ましい長さの合計と
考えることができる。信号鋲結合領域（ＬＢＨ）は好ま
しくはヌクレオチド少なくとも２５個の長さ、より好ま
しくはヌクレオチド５０〜１０００個の長さ、最も好ま
しくはヌクレオチ）”　３００〜１０００個の長さであ
る。初期結合領域は好ましくはヌクレオチド少なくとも
２０個の長さ、より好ましくはヌクレオトド少なくとも
５００個の長さ、最も好ましくはヌクレオチドゝ約５０
０ＪＪ１００Ｏ個の長さである。信号鋲結合領域（ＬＢ
Ｈ）は標的結合領域（ＴＢＲ）の一端または一端付近に
あって、単一の連続した初期結合領域（ＩＢＲ）が信号
鋲結合領域（ＬＢＲ）の一部ではない標的結合領域（Ｔ
ＢＲ）の本質的にすべてであることが好ましい。しかし
後記の第２Ｃ図に示すように、信号鋲結合領域（ＬＢＲ
）が標的結合領域（ＴＢＲ）の−瑞垣外、の位置にあっ
てもよく、この場合は初期結合領域が２か所（ＩＢＲ−
１およびＩＢＲ−２）存在するであろう。

プローブポリヌクレオチドゝはＤＮＡまたはＲＮＡであ
るか、あるいはデオキシリボヌクレオテト８およびリボ
ヌクレオチド８の双方であってもよい（特にブロックコ
ポリマー構造の場合）。本発明の場合、アンセイすべき
標的ヌクレオチドゝ配列は一般にＤＮＡであって、ＲＮ
Ａではない。試料ＲＮＡが存在する場合、これを前処理
しくたとえば３′末端を誘導体化することにより）、こ
れらの試料ＲＮＡを本発明の後続の消化工程において消
化されないものにすることができる。本発明の多くの形
態の場合のようにプローブポリヌクレオチドがＤＮＡで
ある場合、本発明に用いるブローズポリヌクレオチｌ−
”［は米国特許出願筒６０７，８８５号明細書に記載さ
れたものに比べて何ら特別な拘束はない。プローブポリ
ヌクレオチドがＲＮＡであるか、またはりボヌクレオチ
「を含むヘテロポリヌクレオチド９である場合、プロー
ブポリヌクレオチドのリボヌクレオチドセグメントは、
試薬複合体が無傷である限り後記の消化酵素または方法
によって消化されてはならない。たとえばポリヌクレオ
チド９ホスホリラーゼその他の構造感受性の前進性酵素
（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅθｎｚｙｍｅ　）をこの工程に
用いる場合、末端３′−リボヌクレオチド９セグメント
が試薬複合体において相補的塩基対合によって結合して
いるのでない限シ、プローブポリヌクレオチドはこのセ
グメントを含んではならない（含む場合、後記のように
、また第３Ａ図および第４Ａ図に示されるように、この
セグメントは相補的塩基対合によって信号鎖のヌクレオ
チドに結合していることが好ましい）。

本発明の方法、キットおよび試薬複合体に用いられる信
号鎖ポリヌクレオチド９は少なくともりポヌクレオチド
セグメントを含み、ＲＮＡであることが好ましい。本発
明の重要な特色は、これらのヌクレオチド１セグメント
がプローブポリヌクレオチドからいったん置換されると
後記の消化酵素または工程によって消化されうるが、信
号鎖が相補的塩基対合によってプローブポリヌクレオチ
ド９に結合したままである限シこれらの酵素または工程
によって消化されてはならないという点である。簡単に
するために、まず信号鎖は全体的にＲＮＡであると仮定
する。信号鎖がデオキシリボヌクレオテト９をも含む実
施態様は自明である。

米国特許出願第６０７，８８５号の場合のよ・うに信号
鎖の少なくとも一部が相補的塩基対合により、標的結合
領域と少なくとも一部は共通である（好ましくは全体が
標的結合領域内に含まれる）プローブポリヌクレオチド
９部分に結合している。この対合によりこのセグメント
および信号鎖全体が消化から保護されるべきである。従
って消化が前進性の酵素、たとえばポリヌクレオチドホ
スホリラーゼである場合、この対合は信号鎖の３′末端
を含むべきである。この３′末端の対合によって、信号
鎖全体がこの種の前進性酵素による消化に対して保護さ
れる。

非前進性の消化酵素を単独で、または前進性の消化酵素
と組合わせて使用してもよい。この種の酵素が信号鎖す
ボヌクレオチドセグメント（末端にないセグメントをも
含む）を消化しうる場合、普通は信号鎖のりボヌクレオ
テド部分全体が試薬複合体において相補的塩基対合によ
り結合していること、特にプローブポリヌクレオチド９
のヌクレオチドに結合している必要がある。しかし前進
性の消化酵素のみを用いる実施態様に関しては、信号鎖
の一部（大きな部分であることが適切である）が一本鎖
状のリボヌクレオチド９であってもよい。

信号鎖の３′末端は結合しているので、信号鎖のこの一
本鎖セグメント（すなわち遊離セグメント）は普通は、
相補的塩基対合によりプローブポリヌクレオチドに結合
している対合セグメン）　（ＰＳ）よシも信号鋲頭部に
近い方（すなわち５′末端付近）にある（第１Ａおよび
４Ａ図参照）。このように本発明の多くの実施態様にお
いてプローブポリヌクレオチド９ＰはＤＮＡであり、信
号鎖ｓｓはＲＮＡであり、信号鎖の対合セグメント（Ｐ
Ｓ）は相補的塩基対合によって、プローブポリヌクレオ
チド９Ｐの標的結合領域ＴＢＲの一部である（かつ好ま
しくはその末端にある）信号鎖結合領域ＬＢＨに結合し
ている。

本発明の他の形態においては、プローブポリヌクレオチ
ドは試薬複合体中において、後記の消化酵素または消化
工程による消化に対して保護された比法である。たとえ
ば前進性酵素を用いる実施態様を考えると、ＲＮＡプロ
ーブポリヌクレオチドの３′末端は試薬複合体において
遮断されていなければならない。ある形の遮断はプロー
ブポリヌクレオチドを置換後も前進性酵素による消化か
ら保護し続けるであろう。この形態には共有結合した環
状の、すなわち３′ヘアピン状ＲＮＡプローブポリヌク
レオチド（従って遊離３′末端を含まない）、ならびに
３′末端が化学的に誘導体化されるか（たとえば末端３
′−水酸基へのリン酸付加により、または過ヨウ素酸塩
による酸化ののち水素化ボウ素ナトリウムで還元するこ
とにょシ）、３′末端がデオキシリボヌクレオテｒで延
長されるか、または支持体に付着することにょシ誘導体
化されたＲＮＡプローブポリヌクレオチド９の使用が含
まれる。しかしＲＮＡプローブポリヌクレオチドの３′
末端が試薬複合体において、信号鎖の対合セグメントへ
の相補的塩基対合のみによって遮断されていることが好
ましい。たとえば別個のＲＮＡプローブポリヌクレオチ
ドを別個の信号鎖に、それぞれの３′末端が相補的塩基
対合によって他方のヌクレオテｒに結合する様式でハイ
ブリッド形成しうる。この種の試薬複合体を第４Ａ図に
示す。あるいはプローブポリヌクレオチド９の３′末端
がそれ自身上へループ状に逆転してハイブリッド形成し
、これにより信号鎖およびプローブが連続したポリヌク
レオチド（特に連続したＲＮＡポリヌクレオチド）の一
部であってもよい。この種の試薬複合体を第３Ａ図に示
す。この実施態様においては、プロ一プボリヌクレオチ
ドは３′末端を含まず、対合セグメントＰＳが標的結合
領域ＴＢＲの信号鋲結合領域ＬＢＨから置換されると、
前進型酵素は対合セグメント全体を消化し、中間セグメ
ントエＳ　（これは信号鎖ま力はプローズヌクレオチド
の一部、またはそれぞれの一部と考えられる）全体を消
化し、次いで（場合により）標的結合領域全体を消化す
るであろう本発明の試薬複合体およびキットを使用する
際には、また本発明方法によれば、被分析試料を濃縮し
、処理してそのＤＮＡを検出可能な形に変えるまず音波
処理、抽出その他の物理的または化学的処理によってＤ
ＮＡを組織（細胞、ウィルス）から放出させ、次いで核
酸画分を濃縮することが望ましい。本発明のある形態に
おいては、試料ＤＮＡを無作為に、もしぐは特定の位置
で切断しくたとえば制限酵素によＩ））、および／また
は変性することができる。処理法の例にはドデシル硫酸
ナトリウム（ＳＤＳ）もしくはチオンアン酸グアニジウ
ムによる変性、強アルカリ処理、蛋白質分解、リボヌク
レアーゼ・処理、フェノール抽出、またはこれらのある
種の組合せが含まれる。本発明に関しては内反ＲＮＡを
除くことが望ましく、また内反ＡＤＰおよびＡＴＰ　（
ある形態の本発明においては内反ＡＭＰ−も）を除くこ
、とが望ましいであろう。内反ＲＮＡはアルカリ性条件
（たとえばＮ（ＺＯＨ）にょシ除去でき、これによりニ
重らせんＤＮＡも変性される。内反、　　　ＡＴＰ、Ａ
ＤＰおよびＡＭＰは所望により酵素によって消費できる
（たとえばホスファターゼまたはピロホスファターゼを
用いる。これらはこの工程のの、　　ち不活化および／
または除去される）。しかし米国特許出願第７２９，５
０３号明細書に記載されるように、内反ＲＮＡが除去さ
れると、ある形態の本発明においては内反ＡＴＰ、　Ａ
ＤＰおよび（ある形態においては）　ＡＭＰを、本発明
の他の形態の場合のように化学的、生化学的または物理
的方法を採用してではなく、既知のバックグラウンド９
値として処理する（従ってこれらを数学的に処理する）
ことができる。

塩基処理は内反ＲＮＡを処理するための特に好ましい形
態である。ヌクレオチドへの変換が不十分　　−であっ
たとしても残存するポリリボヌクレオチドは一般に３′
末端リン酸を含むからである。ＰＮＰは３′末端リン酸
を含むポリリボヌクレオチドをヌクレオシドニリン酸に
変換する活性をほとんどもたない。

採用できる抽出法のうちではボロネート（ｂｏｒｏｎａ
ｔｅ）による抽出法が好ましい。これらは隣接水酸基を
含む分子（たとえばＲＮＡ、リボヌクレアーゼおよびリ
ボヌクレオシドリン酸類に存在する）を捕獲するが、Ｄ
ＮＡは溶出させるからである。

試料がこうして調製されると、これを本発明の試薬複合
体と混合する。その後、分離する必要がないので、この
混合または接触は全体として溶液中で行うことが好まし
い。しかし、これよシも好ましくはないが本発明のある
形態においては試料核酸および試薬複合体のうち一方ま
たは両方を固相上に固定化する。成核反応（ｎｕｃｌｅ
ａｔｉｏｎ）　（試料核酸の標的ヌクレオチド配列がプ
ローブポリヌクレオチドの標的結合領域にハイブリッド
形成する初期の反応）の機構は、米国特許出願第６０７
，８８５号明細書に記載されたもの、あるいは米国特許
出願第６８４，３０５号明細書（エム・コリンズら、１
９８４年１２月２０日出願、審査中）に記載された機構
のいずれかであると思われる。コリンズらの上記明細書
に記載された組換え蛋白質の不在下では、成核反応は普
通は試薬複合体のプローブポリヌクレオチドの初期結合
領域ＩＢＨにおいて起こるであろう。この種の成核反応
は米国特許出願第６８４．３０８号明・測置（：）エイ
・アイ・ウィリアムスら）に記載の容積排除型ポリマー
（たとえばポリ（エチレンオキシド”））により、ある
いは米国特許出願第６８４，３０５号明細書（エム・コ
リンズら）に記載の蛋白質にょシ、または後記のＤＮＡ
／ＤＮＡらせん型促進剤（ネトロブシンまたはディ艮タ
マイシンＡ）Ｋよシ促進できる。置換に際して存在する
ＡＴＰはｒｅｃ　Ａ蛋白質が有効であるのべは不十分で
ある場合、ＡＴＰ依存性でない他の蛋白質、たとえば（
ｒｅｎｅ３２蛋白質（ポリアミド補助因子を含む）、ま
たは犬腸醒の一本鎖結合彊白質がなお有用であろう。た
とえばニス・シー・コヮルチコフスキー（Ｓ、Ｃ，Ｋｏ
ｗａ’ｌｃｚｙｋｏｗｓｋｉ）らの”ジーエンザイムズ
”、メル巻、３７３−４４４頁（１９８１）を参照され
たい。さらに、後続の消化により生成したＡＤＰがリン
酸化されてＡＴＰとなり、これがＡＤＰ産生を伴う置換
（ｒｅｃ蛋白質により加水分解されたＡＴＰから、また
置換された鎖から誘導されたＡＤＰから）の促進に際し
てｒｅｃ　Ａを活性化するカスケード９も考慮される。

初期結合領域ＩＢＨにおけるこの成核反応に続いて、標
的結合配列とプローブポリヌクレオチド９との二本鎖形
成が信号鎖結合領域ＬＢＲ内へと移行する。米国特許出
願第６０７，８８５号明細書の１Ａ−ＩＥに関連してよ
シ詳細に記載されたように、信号鎖結合領域ＬＢＲ内で
顕微鏡的現象（そこにはジッパ−開閉反応（ｚｉｐｐｉ
ｎｇ／ｕｎｚｉｐｐｉｎｇ　）と記載されている）が起
こると思われるが、一般にはごく短期間内に標的ヌクレ
オチド配列が信号鎖の対合セグメントをプローブポリヌ
クレオチド９の標的結合領域から全体的に置換するであ
ろう。信号鎖がプローブポリヌクレオチド９と別個のポ
リヌクレオチドである場合、この時点でこれは全体的に
プローブポリヌクレオチドから離脱するであろう。しか
しプローブポリヌクレオチドと信号鎖が連続したポリヌ
クレオチドの一部をなしている場合、共有結合は残存す
るであろうが、信号鎖を含む部分の連続鎖は全体として
一本鎖状に変換されるであろう。

プローブポリヌクレオチド９がＤＮＡであり、信号鎖対
合セグメントがＲＮＡである本発明の実施態様において
は、置換に際してＲＮＡとＤＮＡの二重らせんよシもＤ
ＮＡとＤＮＡの（すなわち標的ヌクレオチド９配列とプ
ローブポリヌクレオチドの）二重らせんの形成の方を促
進する追加の試薬を用いることが考慮される。この種の
促進剤にはネトロブシンおよびジスタマイシンＡが含ま
れる。この種の促進剤は特に本発明および米国特許出願
第７２９，５０３号の発明に有用であるが、これらはＲ
ＮＡ信号信号たは標識ポリヌクレオチドをＤＮＡプロー
ブポリヌクレオチド９から、標的ヌクレオチド９配列を
含むＤＮＡ競合体（試料）によって置換するいずれの場
合にも使用できる。

この置換反応の結果、ＲＮＡ信号信号リヌクレオチドが
溶液中へ放出されるか、またはそれらの３′末端が遊離
する（あるいは他の形で消化可能となる）。そこでこれ
らは消化され、消化生成物アデノシンリン酸が後記に従
って測定される。

しかし本発明のある形態においては、置換反応を受けた
試薬複合体の標的結合領域ＴＢＲもアデノシンリン酸源
として作用する可能性がある。このような標的結合領域
ＴＢＲは、直換反応後にはＤＮＡ標的標的ヌクレオチド
列配列ＮＡ／ＲＮＡ　（またはＡ）二重らせん構造を形
成していることは認められるであろう。これは標的結合
領域がリボヌクレオチドセグメントである場合にのみ適
用され、標的結合領域がデオキシリボヌクレオナト９セ
グメントである場合には適用されないであろう。この種
のＲＮＡ／　ＤＮＡらせんの消化は以下のように行われ
る。

エンド９ヌクレアーゼ型のりボヌクレアーゼＨ（ＲＮア
ーゼＨ）活性をもつ酵素を存在させ、または添加して、
上記のＤＮＡ／ＲＮＡまたは”Ａ′”形らせんの一部で
あるＲＮＡセグメントを選択的に消化することができる
。これはエンドヌクレアーゼであルタめ、これは一般に
ＲＮＡ標的結合領域を切断して、遊離３′水酸基をもつ
一連の短いリボヌクレオチド０にするであろう（一般に
ヌクレオチド°６〜１０個の長さ。この長さは鼎アーゼ
Ｈ消化パラメーターにより制御され心。適宜な温度およ
び濃度の条件下では、これらの短いリボヌクレオチド９
は自然にＤＮＡ標的ヌクレオチド配列から会合解除され
るであろう。これらのオリゴリボヌクレオチド９は離脱
すると置換された信号鎖ポリヌクレオチドと同じ様式で
後記のように消化されうる。従ってポリヌクレオチド９
ホスホリラーゼを消化工程に用いる場合、こうして遊離
した標的結合領域のオリゴリボヌクレオチドおよび置換
された信号鎖ポリヌクレオチド９を共に前進的に消化し
てリボヌクレオシド９リン酸類にするであろう。類アー
ゼＨによる消化がすべてまたは実質的にすべての標的結
合領域のヌクレオチドを標的ヌクレオチド９配列から会
合解除するのに十分である場合、標的ヌクレオチド配列
は他の試薬複合体分子の初期結合領域に成核反応しうる
状態となり、置換工程が繰り返される。

しかし若干の部分のＲＮＡ標的結合領域がＤＮＡ標的ヌ
クレオチド配列に付着したままであっても置換はなお可
能であり、この場合、置換によって信号銀ポリヌクレオ
チドが第２試薬複合体から置換され、かつ残存オリゴリ
ボヌクレオチド９片が標的ヌクレオチド配列から置換さ
れる。

上記のように暇アーゼＨ活性を用いて本発明の置換アッ
セイ法による信号を増強することは、遊離３′末端を含
まないプローブＲＮＡを用いて試料ＤＮＡとの”Ａ”形
らせんを形成するノ・イブリット９形成（置換ではない
）アッセイ法にも適用できる。

この種のアッセイにおいては、プローブ／試料ノ１イブ
リット９形成が起こった場合に（起こった場合にのみ）
、ＰＮＰ消化性ＲＮＡ　（遊離３′末端を含む）がＲＮ
Ｎアーゼ間裂によって生成する。

本発明の消化工程においては、置換反応が起こった場合
に（起こった場合にのみ）少なくとも信号鋼リボヌクレ
オシドが（および前記のように場合によりプローブポリ
ヌクレオチドも）消化すれる。この種の消化は大腸菌Ｒ
Ｎアーゼ■またはラット肝アルカリＲＮアーゼＩなどの
酵素、によって行われる。これらは一本鎖のりボヌクレ
オシビセグメントを攻撃し、これらのセグメントをリボ
ヌクレオシド９−リン酸（アデノシン−リン酸（ＡＭＰ
）を含む）に変える（リボヌクレオシド９リン酸に関す
るこれおよび以下の記述はすべて５′−リン酸を意味す
るものと解すべきである）。しかし３′末端から前進的
に進行する消化工程のための酵素（たとえば蛇毒ホスホ
ジェステラーゼ）を用いること、特にリボヌクレオシド
９ニリン酸（アデノシンニリン酸（ＡＤＰ　）を含む）
を産生ずる前進性酵素を用いることが好ましい。アデノ
シンニリン酸を産生ずるこれらの前進性酵素は、これら
がリン酸部分を溶液中で無機ホスフェートから各３′末
端ヌクレオチドへ転移させて対応するりボヌクレオシビ
ニリン酸を形成するので、一般に、ｄリリボヌクレオチ
ドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）として知られている。これ
らの酵素は一般にリボヌクレオチド９セグメントの３′
末端に付着し、一般に３′末端が末端ＯＨをもちかつ一
本鎖であるリボヌクレオチドのみを攻撃スるであろう。

しかし、消化されるポリヌクレオチＰセグメント全体が
一本鎖である必要はない。ただし存在する二本鎖（特に
内部対合）は十分に短かく、またこれらが一本鎖である
ときポリヌクレオチド９ホスホリラーゼがこれらのセグ
メントを前進するのに十分な頻度で会合解除しなければ
ならない。

主な消化酵素が前進性である（たとえばＰＮＰまたはｓ
ｖｐ　）本発明のある種の好ましい形態においては、他
の消化酵素が存在してもよい。この種の他の消化酵素は
たとえば置換された信号銀の内部対合により形成される
可能性のめる短いＲＮＡ／ＲＮＡらせんセグメントに対
して選択的なある形のものであり、その例にはコプラ毒
ＲＮアーゼ、ラット肝アルカＩＪＲＮアーゼＩ、および
大腸菌ＲＮアーゼ「が含まれる。この種の補助消化酵素
は末端３′水酸基を後続の前進性酵素による攻撃ゐため
に残しておくべきであり、アデノシンの５′炭素罠おけ
る結合を開裂しないことが好ましい（両条件をコプラ毒
ＲＮアーゼは満たす）。この種の補助消化酵素は一般に
標的結合領域がＤＮＡである場合にのみ用いられる。他
の場合にはこの第２の酵素が無傷の試薬複合体のＲＮＡ
　／　ＲＮＡセグメントを開裂し、偽信号を発すると思
われるからである。

５′末端に対して選択的な前進性酵素が得られるならば
、５′末端ヌクレオチドが相補的塩基対合によってプロ
ーブの標的結合領域に結合した信号銀ポリヌクレオチド
セグメントを用いて試薬複合体を構成することができる
であろう。そのキットおよび方法は適宜３′末端を５′
末端に変更した前記のものに相当するであろう。この種
のキットの候補となる酵素は大腸菌ＲＮアーゼＶである
。これは活性のために原核生物蛋白質生合成酵素を必要
とするが、ＲＮＡを５′末端から３′末端へ前進的に消
化する。

この消化工程によりＡＤＰ　（または場合によりＡＭＰ
　）が生成すると、これは好ましくはピルビン酸キナー
ゼまたはクレアチンキナーゼなどの酵１反応によってリ
ン酸化されてＡＴＰとなる。この種の反応には適宜な高
エネルギーリン酸系の補助因子（有機ホスフェート）を
伴う（それぞれホスホエノールピルビン酸およびクレア
チンリン酸）。

その後のＡＴＰまたは副生物（たとえばピルビン酸）の
検出は米国特許出願第７２９，５０２号および第７２９
．５０３号明細書の記載に従って行うことができる。

これらの明細書中により十分に記載されるように、上記
リン酸化に用いられる酵素および有機ホスフェートはＰ
ＮＰによる消化に際して存在して、さもなければ可逆的
であるＰＮＰ反応を消化終了の方向へ駆動することが好
ましい。このリン酸化に際して生成するＡＴＰは一般的
検出手段のいずれによっても検出でき、これにはたとえ
ばルシフェリンを用いる発光性ルシフェラーゼ触媒反応
が含まれる。あるいはリン酸化工程の副生物（特にピル
ビン酸）を一般的手段により測定することができ、これ
にはたとえばＮＡＤＨを用いる乳酸デヒドロゲナーゼ（
ＬＤＨ）触媒反応によるピルビン酸の測定が含まれる。

これらの場合、ＮＡＤＨの消失を追跡することにより（
光化学的に、または螢光により）、消化工程により生成
したＡＤＰと、従って試料の核酸（ＤＮＡ）中の標的ヌ
クレオチド配列の存在および量と関数関係にある値が得
られる。これらの検出工程についても米国特許出願第７
２９，５０２号および第７２９，５０３号各明細書測置
より詳細に記載されている。

方法および試薬複合体に関する上記の記述に基づいて、
本発明による試薬キットの種々の形態が明らかになるで
あろう。たとえば下記の要素が一般に試薬キット中に存
在する。

Ａ、試薬複合体、 Ｂ、消化酵素（補助因子を含む）、 Ｃ０ＩＪン酸化酵素（補助因子および補助反応体を含む
）、 Ｄ、検出システム。

本発明の多くの形態において、置換助剤、たとえばポリ
エチレングリコール（米国特許出願第６８４．３０ｓ号
明細書参照。ジエイ・アイ・ウィνアムズら、１９８４
年１２月２０日）または組換え蛋白質、たとえば大腸直
からのｒｅｃ　Ａ蛋白質（前記で引用した米国特許出願
第６８４，３０５号明細書に記載、コリンズら）も使用
できる。ただしＡＴＰ依存性酵素（たとえばｒｅｃＡ蛋
白質）を用いて置換を促進する場合、補助因子として導
入されたＡＴＰはいずれも置換後に、かつ消化前に除去
されるかまたは補償されなければならない。

前記のように最初のＡＤＰ産生（置換された鎖の消化に
よる）、ＡＴＰへの誘導、ｒｅｃ　Ａ活性化（副生物Ａ
ＤＰからＡＴＰへの再リン酸化を伴う）、および後続の
置換の促進によりカスケードを生じることができる。

これらの成分の一定の組合せを一緒に包装することが好
ましい。別個に包装する場合はこれらを一緒に反応混合
物に導入することが好ましい。この組合せには特にリン
酸化酵素（その補助因子を含む）および消化酵素（特に
ポリヌクレオチドポスホリラーゼ）が含まれる。ＡＭＰ
を産生ずる消化酵素を用いる場合（蛇毒ホスホジェステ
ラーゼ）、この消化酵素は普通はそれ自身不可逆的に消
化するので、一般にはリン酸化ひ素をこの消化酵素と共
に包装する必要はない。しかしこの場合、２種のリン酸
化酵素（補助因子を含む）を−緒に包装するかまたは一
緒に導入することが好ましい。たとえばミオキナーゼお
よびピルビン酸キナーゼを一緒に包装するか、または−
緒に導入する（それぞれ適宜な補助因子および補助反応
体、たとえばＣＴＰおよびホスホエノールピルビン酸を
含む）。

さらに本発明のある形態においては、酵素の貯蔵に際し
て非特異的に生成するＡＴＰを使用中に妨害信号を与え
ない形（特にアデノシンおよび無機ホスフェート）に変
えるために、ＡＴＰアーゼ、アビラーゼ、ホスファター
ゼまたはピロホスファターゼを１または２以上の成分中
にきわめて低い濃度で存在させることも考慮される。特
にこの種の酵素をリン酸化酵素および検出システム用試
薬中に含有することが考慮される（　ＬＫＢはこの種の
ＡＴＰアーゼを同様な理由からルシフェラーゼ試薬中に
含有する）。ボロネートおよび他のヌクレオシトリン酸
錯化剤を同じ目的に用いることもできる。

第１図（第１Ａ、ＩＢおよびＩＣ図からなる）は本発明
の３′末端不含の第１の形態を示す。第１Ａ図にはＤＮ
Ａプローブポリヌクレオチド９ＰおよびＲＮＡ信号信号
リヌクレオチ）”ＳＳを含む試薬複合体が示されている
。この形態においては、プローブポリヌクレオチドＰの
主要部分は分析すべき標的ヌクレオチド配列に相補的な
標的結合領域ＴＢＲである。標的結合領域ＴＢＨの一部
である初期結合領域ＩＢＲは試薬複合体において一本鎖
である。標的結合領域ＴＢＲの他の部分、すなわち信号
鎖結合領域ＬＢＨは相補的塩基対合によって信号鎖ＳＳ
の一セグメントである対合セグメントＰＳに結合してい
る。信号鎖ＳＳについてみると、対合セグメントＰＳは
尾部（３′末端に最、も：近い部分）を占め、遊離セグ
メン）ＦＳは頭部（５′末端に最も近いセグメント）を
占める。使用する際には、核酸（特に試料ＤＮＡ　）を
含む試料とこの試薬複合体を接触させる。標的ヌクレオ
チド配列を含む試料ＤＮＡ片Ｇが第１Ａ図に示す試薬複
合体と接触すると、これはまず初期結合領域ＩＢＨにお
いてノ・イブリッド形成しうる。

第１Ｂ図は信号鎖ＳＳがプローブポリヌクレオチドの標
的結合領域ＴＢＲから試料核酸鎖Ｇによって置換される
中間段階を示す。この中間構造において信号鎖の３′末
端（実際には対合セグメントＰＳ）一部）はプローブポ
リヌクレオチドから置換されているが、信号鎖ＳＳは相
補的塩基対合によってプローブポリヌクレオチド”の３
′末端近くの部分の標的結合領域ＴＢＨに結合したまま
である。米国特許第６０７．８８５号明細書に記載した
機構によって、本発明の第１Ｂ図に示した構造は、信号
鎖ＳＳがプローブポリヌクレオチド−Ｐから解離する地
点まで左右にジッパ−開閉作用を受けるであろう。

第１Ｃ図は試料核酸鎖Ｇの標的ヌクレオチド配列とプロ
ーブポリヌクレオチドＰの標的結合領域ＴＢＲとの間で
置換終了後に形成されるＤＮＡ／ＤＮＡハイブリット９
を示す。信号鎖ＳＳはこの時点では置換されて、一本鎖
状で溶液中に存在する。同様に第１Ｃ図に示されるよう
に、酵素ポリヌクレオチド９ホスホリラーゼ（ＰＮＰ　
）は信号鎖ＳＳの３′末端に付着し、とのＲＮＡ信号信
号３′末端から前進的に消化する。この実施態様におい
ては、ポＵヌクレオチド９ホスホリラーゼは対合セグメ
ントＰＳ全体を前進的に消化し、次いで信号鎖ＳＳの遊
離セグメン）ＦＳ全体を前進的に消化する。第１Ｃ図に
示されるように、この消化によって信号鎖ポリ妥クレオ
チド３のリボヌクレオチド９すべてがヌクレオンドニリ
ン酸として離脱しうる。これはＡＤＰ以外のヌクレオン
ドニリン酸Ｘ個（ｘＮＤＰ）およびアデノシンニリン酸
１個（ｙ　ＡＤＰ）として示される。十分な量のピルビ
ン酸キナーゼおよびホスホエノールピルビン酸が存在す
る限り、１分子のＰＥＰカｙ分子のＡＤＰと反応して（
ピルビン酸キナーゼにより触媒される）１分子のＡＴＰ
および１分子のピルビン酸を生成する反応が起こるであ
ろう。本方法においては、こうして生成したＡＴＰ−ｉ
たはこうして生成シたピルビン酸のいずれかが検出され
る。

こうして検出された惜は、試薬複合体から置換された信
号鎖ポリヌクレオチドの数と関数関係にあり、との数は
試料の核酸中に存在していた標的ヌクレオチド９セグメ
ントの量と関数関係にあるであろう。

第２Ａ、２Ｂ、２Ｃおよび２Ｄ図は本発明の試薬複合体
の他の形態４種を示す。これらはそれぞれ第１Ａ図に示
した試薬複合体と同様に、ＤＮＡプローブポリヌクレオ
チド３ＰおよびＲＮＡ信号信号リヌクレオチ）；”３３
を含む。第２Ａ図に示した形態の場合、信号鎖ポリヌク
レオチド９はブローブポリヌクレオチｒＰの５′末端に
最も近い位置において、ブローブポリヌクレオチ）＊Ｐ
の標的結合領域の一部（信号鎖対合領域ＬＢＨ）に結合
する対合セグメントｐｓ’６含む。従って標的ヌクレオ
チド配列によるハイブリット９形成は、普通は信号鎖結
合領域ＬＢＨよシも３′末端に近い方にある初期結合領
域ＩＢＲ内においてまず行われるであろう。従って信号
銀ポリヌクレオチ）”ＳＳの３′末端は置換反応が終結
して初めて置換されるであろう。従って第１Ｂ図に示す
ように置換は終結していないが信号鎖、６１Ｊヌクレオ
チｒｓｓの遊離３′末端が一本鎖状であり従って消化さ
れうる構造は存在しない。これら２種の形態を比較する
と、第１図の形態は置換反応の途中で消化が進行し、置
換反応を終結の方向へ駆動するのを助けるという利点を
もつ。しかし第２Ａ図の形態は、標的ヌクレオチド配列
（その３′末端ではない）に関係する試料核酸鎖のため
消化が起こらないであろうという利点をもつ。

第２Ｂ図に示した試薬複合体の形態（実施例で用いた型
である）においては、信号鎖ポリヌクレオチＫＳＳは試
薬複合体においてプローブポリヌクレオチｔａｐの信号
鋲結合領域ＬＢＨに結合したヌクレオチドのみを含む。

従ってこの試薬複合体は信号鋼リボヌクレオチドセグメ
ントを攻撃する消化酵素（たとえばラット肝アルカリＲ
ＮアーゼＩ）と、組合わせて使用できる。使用に際して
は、この種の試薬複合体はまず初期結合領域ＩＢＨにお
いて標的ヌクレオチド配列とノ・イブリッド形成しうる
。

次いで信号鎖結合領域ＬＢＨ全体にわたる連鎖置換が起
とシ、その結果信号銀ポリヌクレオテｒｓｓがプローブ
ポリヌクレオチドＰから解離する。消化酵素がリボヌク
レオチドニリン酸を産生ずるならば、消化およびリン酸
化は第１Ｃ図に示すように進行するであろう。消化酵素
がリボヌクレオシド−リン酸を産生ずる場合、米国特許
出願第７２９．５０２号および第７２９，５０３号各明
細書（前記で引用）に、ＡＭＰがリン酸化される形態に
関して記述されるように、リン酸イεは普通は２工程で
行われるであろう。

第２Ｃ図に示す第４の形態の試薬複合体は、そのヌクレ
オチドが完全にプローブポリヌクレオチドＰの標的結合
領域ＴＢＨの信号鋲結合領域Ｉ、ＢＨに結合した信号鎖
ポリヌクレオチド″ｓｓを含む。しかし信号鋲結合領域
ＬＢＨは標的結合領域ＴＢＨの末端にではなく、むしろ
その中央に位置する。従って２つの初期結合領域ＩＢＲ
−１およびＩＢＲ−２がプローブポリヌクレオチド内に
存在する。従って標的ヌクレオチド９配列によるハイブ
リッド形成はまｆ　ＩＢＲ−１またはＩＢＲ−２のいず
れかにおいて行われ、最後に信号鎖ポリヌクレオチド”
ｓｓが信号鋲結合領域ＬＢＨから置換される。このよう
な場合の置換は米国特許第６８４，３０５号明細書の例
４に実験的に証明されており、可能性のある機構は米国
特許出願第６０６，８８５号明細書の第１Ｆ図に関連し
て記述されている。第２Ｃ図の信号鎖ポリヌクレオチド
は置換されると消化およびリン酸化を受け、次いで前記
実施態様と同様に検出される。

第２Ｄ図はＤＮＡプローブＰが検出される標的ヌクレオ
チド８配列に対し相補的な標的結合領域ＴＢＲを含むと
いう点では第２Ｂ図のものと類似の試薬複合体を示す。

セグメン）　ＴＢＨの３′末端に一本鎖状の初期結合領
域ＩＢＲがあり、これにより第２Ｂ図の場合のように標
的ヌクレオチド８配列にょる成核が促進される。

第２Ｄ図のプローブＰの信号鋲結合領域（ＬＢＨ）には
相補的塩基対合によって一連の信号鎖（信号鎖５Ｓ−１
、ｓｓ　−２，５Ｓ−３，５Ｓ−４および５Ｓ−５と示
される）が結合している。実際にはこれら複数の信号鎖
は第２Ｂ図の試薬複合体を緩和に（短時間、低い酵素濃
度において）　ＲＮアーゼＨで処理することによって形
成される。この処理によって第２Ｂ図の信号鎖ＳＳはラ
ンダムに切断され、断片５Ｓ−１，５ｓ−２，５Ｓ−３
，５Ｓ−４および５Ｓ−５が生成するであろう。プロー
ブ鎖Ｐへの結合がゆるすぎる断片はいずれも使用前にク
ロマトグラフィーにより除去することが望ましいであろ
う。第２Ｄ図に示すように断片５Ｓ−１〜５Ｓ−５がす
べて完全に結合しているが、若干の断片が３′末端セグ
メントのみにおいて結合した試薬複合体も、たとえば第
１Ａ図または第２Ａ図の試薬複合一体を緩和にＲＮアー
ゼＨ消化することによって得られる。

使用に際しては、第２Ｄ図の試薬複合体を標的ヌクレオ
チド配列と接触させると、ＤＮＡ／ＤＮＡ　、・イブリ
ッドがまず初期結合領域ＩＢＨにおいて形成され、次い
で順次信号鋲結合領域ＬＢＨ全体に形成される。ＤＮＡ
／ＤＮＡ二重らせんがＬＢＨにおいて形成されるのに伴
って、信号鎖５Ｓ−５、次いで５Ｓ−４、次いで５Ｓ−
３、次いで５ｓ−２、最後に５Ｓ−１が置換されるであ
ろう。後続の工程でそれぞれ消化されてヌクレオシド９
リン酸類とな５　（ＡＤＰ４たはＡＭＰを含む）、ＡＭ
ＰまたはＡＤＰが前記のようにリン酸化される。

第３Ａ図は本発明の試薬複合体の第６の形態を示す。こ
の場合、プローブポリヌクレオチドおよび信号鋼ポリヌ
クレオチド９が連続したＲＮＡ　７１￥リヌクレオチド
鎖の一部である。この鎖の５′末端から前方へ、検出さ
れるＤＮＡ標的ヌクレオチド配列に相補的な標的結合領
域ＴＢＲ１中間セグメントエＳ、および３′末端に対合
セグメントＰＳが示される。

対合セグメントＰＳは標的結合領域ＴＢＨの一部（信号
鋼対合セグメントＬＢＨ）に相補的であるので、これは
試薬複合体においてＲＮＡ／ＲＮＡ二本鎖部分を形成す
る。標的結合領域（この形態では標的結合領域ＴＢＲの
５′末端として示されている）の他の部分（初期結合領
域ＩＢＲ）は一本鎖状である。

この種の試薬複合体の製造については米国特許出願筒７
２９，５０４号明細書（イー・エフ・フリッチおよびエ
ム・コリンズ、１９８５年５月２日出願、ジエネテイツ
クス・インステイチュート社に譲渡）に記載されている
。

第３Ａ図の試薬複合体は、適宜な標的ヌクレオチド配列
ＴＮＳを含む試料ＤＮＡ核酸鎖Ｇと接触すると、第１Ｂ
およびＩＣ図に関連して先きに述べたものと同様な様式
で成核および連鎖置換を行うであろう。連鎖置換が終了
した時点で、第３Ｂ図に示す中間構造が形成されている
であろう。この構造においては、連続ＲＮＡ鎖の標的結
合領域ＴＢＲはＲＮＡ／　ＤＮＡ二本鎖の形で試料ＤＮ
Ａポリヌクレオチド鎖Ｇの標的ヌクレオチド８配列ＴＮ
Ｓに結合しているであろう。ＲＮＡポリヌクレオチドの
残部（中間セグメントＩＳおよび対合セグメントＰＳを
含む）はこの二本鎖に結合してはいるが、一本鎖状であ
ろう。この時点で前進性の消化酵素（ポリヌクレオチド
ホスホリラーゼＰＮＰ　）はＲＮＡ鎖の遊離３′末端（
対合セグメン）ＰＳの３′末端）に付着し、対合セグメ
ントＰＳおよび中間セグメントＩＳ全体を消化すること
ができる。この消化が終了すると、第３Ｃ図に示すよう
にＡＤＰ以外のヌクレオチドゝニリン酸ｍ個（ｍＮＤＰ
）およびアデノシンニリン酸ル個（ＦＬＡＤＰ）が生成
するであろう。プローブポリヌクレオチドの消化されな
かった残部には、試料鋼Ｇの標的ヌクレオチド配列ＴＮ
Ｓ　（デオキシリボヌクレオチドゝセグメントである）
に結合した標的結合領域ＴＢＲ（リボヌクレオチドセグ
メントである）が含まれるであろう。

本発明のある形態においては、この対合セグメン）　Ｐ
Ｓおよび中間セグメントエＳの消化によって生成するｎ
　ＡＤＰのみを次いでリン酸化し、検出する。しかし本
発明の他の形態においては、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮ
アーゼＨ）が存在し、あるいはこの時点で添加され、Ｒ
ＮＡ　／　ＤＮＡ二重らせんのＲＮＡのみを選択的に消
化するであろう。これを第３Ｃ図の標的結合領域ＴＢＲ
を指す矢印により図示する。第３Ｄ図は標的結合領域Ｔ
ＢＲに対するＲＮアーゼＨの作用によって生成する可能
性のあるＲＮＡオリゴヌクレオチドを示す。これらはそ
れぞれ一本鎖状で解離するのに十分なほど短く、第３Ｄ
図に示すようにポリヌクレオチドホスホリラーゼＰＮＰ
により消化されて、ＡＤＰ以外のヌクレオシドニリン酸
２分子（ｐ　ＮＤＰ　）およびアデノシンニリン酸（ｑ
　ＡＤＰ　）を生成する。

第３Ｅ図は第３Ｃ図に示した消化により生成したアデノ
シンニリン酸（ｎ　ＡＤＰ　）および第３Ｄ図に示した
消化により生成したアデノシンニリン酸（ｑ　ＡＤＰ　
）の双方のリン酸化を示す。十分量のピルビン酸キナー
ゼおよびホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）　ｉ用い
ると、（ｎ＋ｑ）ＰＥＰおよび（ｒＬ＋−ｑ　）　ＡＤ
Ｐが消費され、（ｎ＋ｑ）ピルビン酸分子および（１Ｌ
＋ｑ）ＡＴＰ分子が生成する。これらの生成物のいずれ
も検出できる。

さらに試料鋼Ｇはここで第２の試薬複合体に・・イブリ
ッド形成しうる。

前記第２Ｄ図に関して、試薬複合体はたとえば第２Ｂ図
の信号鋼ｓｓをＲＮアーゼＨ（ＤＮＡ／ＲＮＡ二重らせ
んのＲＮＡ鎖に特異的である）で消化することにより形
成された複数の信号鋼５Ｓ−１〜５Ｓ−５を含むものと
して記述された。本文に示したように、置換後の信号鋼
ＳＳまたは対合セグメントＰＳにおいて生成する可能性
のあるＲＮＡ／ＤＮＡ二重らせんを消化する酵素を用い
てもよい。ただしＤＮＡブローブポリヌクレオテトゝを
用いる第１Ａ。

２Ａ、２Ｂ、２Ｇおよび２Ｄ図の形態についてである。

ここで用いる酵素（特に補助消化酵素として）の例はコ
ブラ毒ＲＮアーゼである。

第４Ａ図はプローブポリヌクレオチドＰおよび信号鎖Ｓ
ＳがそれぞれＲＮＡである第７の形態を示す。対合セグ
メン）　ＰＳが信号鎖ＳＳの５′末端を含む。信号鋲結
合領域ＬＢＨはプローブポリヌクレオチドＰの３′末端
を含む。対合セグメントＰＳは相補的塩基対合により信
号鎖結合領域ＬＢＨに結合しているので、測鎖とも前進
性のみの消化酵素による攻撃から保護されている。一本
鎖セグメントＦＳおよびＴＢＲは末端を含む。

置換およびＰＮＰによる消化を行うと、前記実施態様の
場合のように信号鎖ＳＳ全体が消化されるであろう。Ｒ
ＮＡプローブポリヌクレオチ）”Ｐはこの段階では標的
ヌクレオチド配列ＴＮＳを保有する試料ＤＮＡに結合し
ているであろう。ここで、先きに第３Ｃおよび３Ｄ図に
関連して記述した様式でさらにＲＮアーゼＨ１次いでＰ
ＮＰによる消化が行われ、さらにＡＤＰが生成する。Ａ
ＤＰの検出はこの実施態様においても前記実施態様の場
合と同様に行われる。

本発明を下記の実施例によりさらに説明する。

実施例　ｌ ＲＮＡ信号信号製造 ヌクレオチド５２個の長さの合成ＲＮＡを下記に従って
構成した。ｐＥ３ｐ　６４　ＤＮＡ　１０ＰｇをＥｃｏ
ＲＩエンドヌクレアーゼによる制限によって線状化した
。

このＤＮＡをフェノール、クロロホルムおよびインアミ
ルアルコール（２５：２４：１）の混合物で１回抽出し
た。水相と有機相を分離し、有機相を等容積（７）ＴＥ
（）リス塩酸ＩＱｍＭ、　７））（ｓ、ｏ　；　ＥＤＴ
Ａｌ　ｒｎＭ緩衝化した０、２　Ｍ　−ＮａＣ１で再抽
出したのち、プールした水相をジエチルエーテル飽和し
た水で３回抽出し、エチルアルコール’ｒ−７５％　（
Ｖ／Ｖ）にまで添加することによりＤＮＡを再沈殿させ
た。この鋳型から下記に従ってＲＮＡ＝ｉ製造した。各
反応混合物（各成分はプロメガ・バイオチク社よシ）は
トリス塩酸４０　ｒＩＭ（ＰＨ７，５）、Ｍｆ１２６　
ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、ＮａＧぎ１０ｍＭ、ジチオ
スレイトール１０ｍＭ、４種のｒＮＴＰそれぞれ５００
μＭ、ＲＮＡシンセターゼ６０単位、α［３２Ｐ　］　
ｒＡＴＰ　１０”＝　５０　ｍＧ１．、およびＥ。ｏＲ
工線状化ＰＥ３Ｐ　６４　ＤＮＡ　２ｑを含有していた
。反応はＳＰ６ポリメラーゼ４５単位を最終容積５０μ
ｉ中に添加することによって開始した。

３７℃で６０分間インキュベートしたのち、さらにＲＮ
Ａ　シンセターゼを６０単位およびＤＮアーゼ１を２単
位添加し、３７℃でさらに１５分間インキュベーション
を続けた。塩濃度を４Ｍ　−Ｎａ１ｌで４００ｍＭに調
整したのち、反応物を線状化ＤＮＡについて先きに記述
したように抽出した。フェノール−クロロホルム−イソ
アミルアルコール抽出シタ水相を１．５ｍ／セファデッ
クスＧ−５０スピンカラム上で遠心分離することにより
ヌクレオチドゝを定量的に除去した。Ｇ−５０画分をポ
リエチレンイミンセルロースクロマトグラフィー処理、
次いでセレ／コフによるα（３２Ｐ：ＩＡＴＰの計数に
より判定したヌクレオチド除去率は９９．５％以上であ
った。

階払−ＤＮＡハイブリッドの製造 特定のＲＮＡ製剤を種々の量の相補的“プローブ″′Ｄ
ＮＡで滴定し、ハイブリット９にＲＮＡとして９０〜９
５チの放射能が取シ込まれるのに必要な装入ＤＮＡとＲ
ＮＡの比を調べた（アガロースゲル電気泳動により判定
）。一定量の５２−　ｍｅｒ　ＲＮＡを数種の濃度（０
，０１〜０．１Ｂｇ／μｇ）のＭ２Ｓ、ｍア１１一本鎖
環状ＤＮＡに、０．２　Ｍ−ＮａＣ１およびＴＥ緩衝液
の存在下でハイノリツＰ形成させた。反応物を６５℃で
３０分間インキュベートしたのち、反応物を徐冷し、ハ
イブリッド形成度をアガロースゲル電気泳動により定量
し、次いで切断して遊離５２−ｍｅｒおよびハイブリッ
ドバンド 置換反応 ５２−ｍａｒ：Ｍ１３ｍｐｌ　１／−イプリツｌ−＋（
試薬複合体）を最終容積１０μｇにおいて、プローブＭ
１３ｍｐ１　１　ＤＮＡに対し等量のＭ　１　３　ｍｐ
　１　０競合体ＤＮＡの存在下または不在下で、６５℃
において１２０分間インキュイードした。プローブＤＮ
Ａと競合体ＤＮＡは同分子号であるので、この反応は競
合体対５２−　ｍａｒ標識プローブ鎖とほぼ１：１の比
率で継続した。

置換されたＲＮＡをヌクレオチドリン酸類の変換置換後
に反応物を、蒸留および脱イオンしたＤＥＰＣ（ピロ炭
酸ジエチル）処理した水でＭａｉｌＯ２ＩＭとなるまで
希釈し、等容積の２×加リン酸分解キナーゼ反応混合物
を添加した。これによりＨａＣ４１５０ｍＭ、）リスＨ
（ＪｌｏｏｍＭ（ＰＨ８，５）、２−メルカプトエタ／
　−ル１　ｍＭ、　ＭｇＣｌ２１０　ｍＭ、　、ｔシト
ホスフェ−１−１０ｍＭ、ホスホエノールピルビン酸２
０７７１Ｍ、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ０．０２
　単位、およびピルビン酸キナーゼ１単位の最終成分濃
度となった。反応物を５０℃で６０分間インキュベート
したのち、ＡＴＰ、　ＡＤＰ、および消化不完全なＲＮ
Ａ÷無傷のＲＮＡ０量ヲポリエチレンイミンセルロース
クロマトグラフイーにより定量した。この置換および変
換反応の結果を表１に示す。

表１ ５２−ｍｅｒＲＮＡ　ノ１イブ！ｊ　ット”ノ置換ＡＴ
Ｐへの変換 総ＣＰＭ３に 対するチ １、ラムダＤＮＡは対照非競合ＤＮＡとして用いた。

２、ハイブリッドのプローブ鎖はＭ１３ｍｐＨＤＮＡで
あり、競合体はＭ１３ｍｐｌＱＤＮＡである。

３、ポリエチレンイミンセルロースクロマトグラフイー
によりアッセイ。

実施例　２ ＲＮＡの製造 以下の点を除いて上記と同様に２３−ｍθｒ　ＲＮＡの
製造を行った。鋳型ｐｓｌ）　６４　ＤＮＡをＨｉｎｃ
　１１制限エンド９ヌクレアーゼで線状化した。フェノ
ール抽出後の反応混合物を１．５　ｒｎｌのバイオゲル
（Ｂ１０Ｇｅ１）　Ｐ　−６スピンカラムにより遠心分
離することによって精製した。

ハイブリッドの製造 上記実施例１に記載した方法により、Ｍ１３ｍｐ１１プ
ローブ含有ハイブリッドに９３％の水準の総ＲＮＡを取
シ込ませることによりバイブリッドを製造した。

置換反応 ２３−ｍｅｒＲＮＡ：Ｍ１３ｍｐＨハイブリット区試薬
複合体）を用いて実施例１の記載と同様にして競合体Ｍ
　１３　ｍｐ　１０　ＤＮＡを検出し念。ただし置換反
応を５０℃で１時間行った。使用した他のＭ１３ｍｐ１
０製剤は質量基準で２３−　ｍａｒハイブリット９およ
び５２−ｍａｒハイズリットゝの置換において有効性が
より低かった（ここに示されていない）。

置換されたＲＮＡをヌクレオチドリン酸に変換ピルビン
酸キナーゼおよびポリヌクレオチドホスホリラーゼを用
いる変換反応を実施例１に記載したと同様に行った。競
合体（モル）対・・イブリット９プローブ鎖（モル）の
相対水準０．６および１における実験の結果を表２に示
す。

表２ 競合体／ハイプリントゝ”　　　　　　　　０．０　　
０．６　１．０遊離ＲＮＡの％（対・総ｃｐｍ）２２２
，３　２９，６　４３．８転化した％（対・総ｃｐｍ）
３： ＡＴＰ　　　　　　　　　１７．６　　２３，２　３８
．８ＡＤＰ　　　　　　　　　　３．２　　　６．６　
　７．８転化しなかった％（対・総ｃｐｍ）　’　　７
９．２　７０．２　５３．４１、数値は相対量のみを表
わす。

競合体はＤＮＡ　Ｍ　１３　ｍｐ　１０であり、プロー
ブ鎖はＭ　１３　ｍｐ　１１　テ６ル。

２、アガロースゲル電気泳動によりアッセイ。

３、ポリエチレンイミンセルロースクロマトグラフイー
によジアツセイ。

４、ハイブリッド形成したＲＮＡおよび長さ３以上のオ
リゴリボヌクレオチド９゜ 実施例　３ ＲＮＡの製造 ヌクレオチド″′１９５個のＲＮＡの製造を下記により
行った。ＰＢＲ−３２２からの３７５　ＢＰ　Ｅｃｏ　
ＲＩ　ＢａｍＨＩ断片を線状化したのちのｐｓｐ　６５
　ＤＮＡ中にＥｃ。

ＲＩおよびＢａｍ　ＨＩ各制限エンドゝヌクレアーゼに
よりサブクローニングした。誘導体ｐｓｐ　６５−１５
ＤＮＡｋ　Ｅｃｏ　ＲＶＫ　ヨ’）　ｌ軟化Ｌ７’ｃ（
７）チ、ｐＳｐ６５−１５鋳型を４種すべてのヌクレオ
シド二リン酸（α（３２ｐ）ＡＴＰを含む）の存在下で
転写することにより長さ１９５のＲＮＡを製造した。転
写後にセファデックスＧ−５ｏゲル濾過によ！Ｊ　ＲＮ
Ａ　Ｐらヌクレオシビ三リン酸を除去した。

ハイブリット９の製造 上記実施例１に記載した方法により、均一に（３２ｐ）
アデノシン標識したＲＮＡを一本鎖Ｍ　１３　ｍｐ８−
２０−ＣＤＮＡハイブリット９に９０チの水準まで取り
込ませることによってノ為イブリッドを製造した。

置換反応 ポリヌクレオチド９ホスホリラーゼ／ピルビン酸キナー
ゼ反応に用いた緩衝系から酵素を除いた系において置換
反応を行った。置換、ならびにＲＮＡから信号鎖ＡＤＰ
、ｔ、−よびＡＴＰへの転化を同時にかつ同一溶液中で
ルーティンに行った。この実施例の目的のために、置換
工程および転化工程を分けることにより置換および転化
の各工程の定量化を行うことができる。この反応混合物
は実施例１に示Ｌり成分ノｔｔ’ｉカＫ　１９５−　ｍ
ｅｒとＭ１３ｍｐ８−２０ＤＮＡとのハイブリット蛋試
薬複合体）　０．５　ｐｍｏｌｅ　、　Ｍ１３　ｍｐ　
１９３／２競合体０〜７７９、または等量のＭ１３ｍｐ
　１１非競合体ＤＮＡ　ｌ最終容積２０μｅ中に含有し
ていた。後者のＤＮＡは１９５−ｍｅｒＲＮＡが結合す
るＭ１３ｍｐ８−２０の領域に相補的な１．１　ｋｌ）
の挿入体を含まない点以外は競合体ＤＮＡに等しい。添
加したＮａ１ｌ　ＯＭまたは０．１０　Ｍにおいて２組
の反応を行い、イオン強度が置換、ならびに後続の転化
および被分析体ＤＮＡと対照ＤＮＡ　（競合体ではない
）の検出に与える影響を調べた。置換反応混合物を６５
℃で３０分間インキュベートしたのち、試料を室温に取
り出し、種々の量の装入競合体または対照ＤＮＡ　＝ｉ
示す各反応物４μを１．５チアガロースゲル上における
電気泳動により、置換度についてアッセイした。次いで
各反応混合物に、ポリヌクレオチドホスポリラーゼ約０
．０２８単位およびピルビン酸キナーゼ０．４単位を含
むＩ　Ｘ　ＰＮＰ／ＰＫ緩衝液１２μｉ添加した。この
反応混合物を５０℃で３０分間インキュベートしたのち
、各反応混合物４μｊをＰＥＩセルロースに施した。試
料をＱ、８Ｍ　−ＬｉＣｄおよび０，８Ｍ酢酸中でクロ
マトグラフィー処理したのち、ＲＮＡ、　ＡＴＰおよび
ＡＤＰに相当するスポットを切り取り、セレンコツ計数
により装置した。

各反応混合物の残りを蒸留した脱イオン水で最終容積２
５０μｌに調整し、標準試薬を用いて、ＬＫＢ１２５０
ルミノメータ−で生物発光により定量した。

これらの分析の結果を表３および４に示す。表４の遊離
ＲＮＡ０値９．８チはハイブリッド形成していない割合
による（上記の９０％というハイズリラド形成効率を留
意されたい）。

表３ １０　１１．５　９４．１０．８５．０３７７２０２１
．７８　４１．８　６２．８７．８２９．４１５０９０
０３３．５６　７２．３　４８．５１０．８４０．６２
４３８００４５．３４　８４．８　５４．８１２．１３
３．２３４５６００５７．１２　８６．９　４６．１６
．１４７．９４５２７００表４ １０　９．８　９４．０３．０３．０２３６２０２１．
７８　６０．２　６７．３６．９２５．８７５３４０３
３．５６７６．８　５４．９１０．１３５．０１４０８
００４５．３４８４．４　６５．７６．０２８．３１８
７８００５７．１２８８．１　４９，６１０．１４０．
４３５５２００１、アガロースゲル電気泳動により分析
。

２０．＋？リエテレンイミンセルロースクロマトクラフ
イーにより分析。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の第１の実施態様を３部分に分けて（第
１Ａ、ＩＢおよびＩＣ図）示した略図であり、第１Ａ図
には試薬複合体、第１Ｂ図には置換工程の中間段階、第
１Ｃ図には置換された信号銀の消化およびＡＤＰからＡ
ＴＰへのリン酸化を示す。 第２Ａ図は本発明の第２の実施態様による試薬複合体の
略図である。 第２Ｂ図は本発明の第３の実施態様による試薬複合体の
略図である。 第２Ｃ図は本発明の第４の実施態様による試薬複合体の
略図である。 第２Ｄ図は本発明の第５の実施態様による試薬複合体の
略図である。 第３Ａ、３Ｂ、３Ｃ，３Ｄおよび３Ｅ図は本発明の第６
の実施態様の各段階を順次水した略図である。 第４Ａ図は本発明の第７の実施態様による試薬複合体の
略図である。 第４Ｂ図は信号銀（もはや図示されていない）置換後の
第４Ａ図の試薬複合体の略図である。 これらの図面において各記号は下記のものを表わす。 Ｐニブローブ鎖；　　　ＴＢＲ：標的結合領域；ＩＢＲ
：初期結合領域；ＬＢＲ：信号銀（標識）結合領域；Ｓ
Ｓ：信号銀；　　　　　ＰＳ：対合セグメント；ＦＳ：
遊離セグメント；工ｓ：中間セグメント；Ｇ：試料ＤＮ
Ａ鎖；　　　ＴＮＳ：標的ヌクレオチド配列；ＰＮＰ　
：ポリヌクレオチドホスホリラーゼ；ＰＥＰ　：ホスホ
エノールピルビン酸。 特許出願人　　アライト９・コーポレーションＦＩＧ、
　　ＩＣ ＦＩＧ、３Ｂ

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）（ｉ）プリン／ピリミジン塩基の水素結合
   を介してＤＮＡ標的ヌクレオチド配列に塩基対結合しう
   るプローブポリヌクレオチド、および（ｉｉ）プリン／
   ピリミジン塩基対の水素結合を介して、プローブポリヌ
   クレオチドがＤＮＡ標的ヌクレオチド配列に結合しうる
   領域と少なくとも一部は共通である領域のプローブポリ
   ヌクレオチドに塩基対結合したＲＮＡ信号鎖ポリヌクレ
   オチドの試薬複合体を供給し； （ｂ）該試薬複合体を、ＤＮＡ標的ヌクレオチド配列が
   存在する場合これがプローブポリヌクレオチドに結合し
   、ＲＮＡ信号鎖ポリヌクレオチドを試薬複合体から置換
   する条件下で試料と接触させ； （ｃ）置換されたＲＮＡ信号鎖ポリヌクレオチドを分離
   することなく、試薬複合体中に残存するＲＮＡ信号鎖ポ
   リヌクレオチドに対して選択的に消化し、そして； （ｄ）置換されたＲＮＡ信号鎖ポリヌクレオチドの消化
   による消化生成物の存在を検出する 工程よりなる、生物学的試料のＤＮＡ中における標的ヌ
   クレオチド配列の存在を調べる方法。
2. （２）検出工程（ｄ）が消化工程（ｃ）で生成したアデ
   ノシンリン酸類の存在および量と関数関係にある量の検
   出可能な酵素反応生成物を産生する酵素反応系を供給す
   ることよりなる、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
3. （３）接触工程（ｂ）、消化工程（ｃ）および検出工程
   （ｄ）がすべて溶液中で、中間の分離なしに行われる、
   特許請求の範囲第２項に記載の方法。
4. （４）ＲＮＡ信号鎖ポリヌクレオチドの３′末端ヌクレ
   オチドが試薬複合体中においてプローブポリヌクレオチ
   ドのヌクレオチドに結合し、プローブヌクレオチドが未
   結合の３′末端リボヌクレオチドを含まず；かつ 消化工程（ｃ）がリボヌクレオチド類を一本鎖３′末端
   から前進的に消化することよりなる、 特許請求の範囲第２項に記載の方法。
5. （５）プローブポリヌクレオチドの３′末端ヌクレオチ
   ドがデオキシリボヌクレオチドである、特許請求の範囲
   第４項に記載の方法。
6. （６）プローブポリヌクレオチドの３′末端ヌクレオチ
   ドがリボヌクレオチドであり、試薬複合体中においてＲ
   ＮＡ信号鎖ポリヌクレオチドのヌクレオチドに結合して
   いる、特許請求の範囲第４項に記載の方法。
7. （７）検出工程（ｃ）がリボヌクレオチド類を一本鎖３
   ′末端から前進的にポリヌクレオチドホスホリラーゼお
   よび無機ホスフェートにより消化することよりなり、検
   出工程（ｄ）がリボヌクレオチド二リン酸類のうちアデ
   ノシン二リン酸（ＡＤＰ）をリン酸化してアデノシン三
   リン酸（ＡＴＰ）にすることよりなる、特許請求の範囲
   第１項ないし第６項のいずれかに記載の方法。
8. （８）ＡＤＰをリン酸化する工程において過剰の有機ホ
   スフェート化合物を使用し、かつＡＤＰおよび有機ホス
   フェート化合物からのＡＴＰの産生を触媒するのに有効
   なキナーゼ酵素を使用する、特許請求の範囲第７項に記
   載の方法。
9. （９）過剰の有機ホスフェート化合物およびキナーゼ酵
   素が消化工程（ｃ）において反応混合物中に存在し、こ
   れにより消化工程（ｃ）がＡＤＰリン酸化工程により終
   結に向けて駆動される、特許請求の範囲第８項に記載の
   方法。
10. （１０）信号鎖ポリヌクレオチドとプローブポリヌクレ
    オチドの二重らせんがＤＮＡ／ＲＮＡ二重らせんセグメ
    ントであり、消化工程（ｃ）において一本鎖ポリリボヌ
    クレオチドセグメントを消化してリボヌクレオチドリン
    酸類にする第１消化酵素、およびＲＮＡ／ＲＮＡ二重ら
    せんセグメントのホスホジエステル結合を選択的に開裂
    して３′ヒドロキシ末端を生じる第２消化酵素を使用す
    ることよりなる、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
11. （１１）（ａ）（ｉ）プリン／ピリミジン塩基の水素結
    合を介してＤＮＡ標的ヌクレオチド配列に塩基対結合し
    うるプローブポリヌクレオチド、および（ｉｉ）プリン
    ／ピリミジン塩基対の水素結合を介して、プローブポリ
    ヌクレオチドがＤＮＡ標的ヌクレオチド配列に結合しう
    る領域と少なくとも一部は共通である領域のプローブポ
    リヌクレオチドに塩基対結合したＲＮＡ信号鎖ポリヌク
    レオチドの試薬複合体であって；ＲＮＡ信号鎖ポリヌク
    レオチドの３′末端ヌクレオチドが試薬複合体中におい
    てプローブポリヌクレオチドのヌクレオチドに結合して
    おり；かつプローブポリヌクレオチドが３′−水酸基を
    有する未結合３′末端リボヌクレオトドを含まないもの
    ； （ｂ）一本鎖状の３′末端リボヌクレオチドに特異的な
    消化酵素； （ｃ）消化酵素により生成したアデノシンリン酸類をＡ
    ＴＰに変換するのに有効な反応体および酵素、ならびに （ｄ）ＡＴＰ、またはアデノシンリン酸類からＡＴＰへ
    の転化の副生物を検出するための手段、からなる、生物
    学的試料のＤＮＡ中のあらかじめ定められた標的ヌクレ
    オチド配列の存在を測定するためのキット。
12. （１２）消化酵素がポリヌクレオチドホスホリラーゼで
    あり、キットがさらに無機ホスフェートを含み、従って
    消化酵素により生成するアデノシンリン酸類がヌクレオ
    チド二リン酸類である、特許請求の範囲第１１項に記載
    のキット。
13. （１３）反応体および酵素（ｃ）が有機ホスフェート化
    合物およびＡＤＰからＡＴＰを産生するのに有効な過剰
    の有機ホスフェート化合物およびキナーゼ酵素からなる
    、特許請求の範囲第１２項に記載のキット。
14. （１４）ポリヌクレオチドホスホリラーゼ、有機ホスフ
    ェート化合物およびキナーゼ酵素が一緒に包装されてい
    る、特許請求の範囲第１３項に記載のキット。
15. （１５）プローブポリヌクレオチドがＤＮＡである、特
    許請求の範囲第１１項ないし第１４項のいずれかに記載
    のキット。
16. （１６）さらにＲＮＡ／ＲＮＡ二重らせんセグメント中
    のリボヌクレオチドホスホジエステル結合に特異的な第
    ２の消化酵素を含む、特許請求の範囲第１５項に記載の
    キット。
17. （１７）（ｉ）プリン／ピリミジン塩基の水素結合を介
    してＤＮＡ標的ヌクレオチド配列に塩基対結合しうるプ
    ローブポリヌクレオチド、および （ｉｉ）プリン／ピリミジン塩基対の水素結合を介して
    、プローブポリヌクレオチドがＤＮＡ標的ヌクレオチド
    配列に結合しうる領域と少なくとも一部は共通である領
    域のプローブポリヌクレオチドに塩基対結合したＲＮＡ
    信号鎖ポリヌクレオチド からなる試薬複合体であって； ＲＮＡ信号鎖ポリヌクレオチドの３′末端ヌクレオチド
    が試薬複合体においてプローブポリヌクレオチドのヌク
    レオチドに結合しており；かつプローブポリヌクレオチ
    ドが３′−水酸基を有する未結合３′末端リボヌクレオ
    チドを含まない試薬複合体。