JP2609231B2 - 標的ヌクレオチド配列アツセイのための方法、キツトおよび試薬複合体 - Google Patents
標的ヌクレオチド配列アツセイのための方法、キツトおよび試薬複合体Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は特に診断を目的とするポリヌクレオチドアツ
セイ、ならびにこの種のアツセイに用いるキツトおよび
ポリヌクレオチド試薬複合体に関する。
セイ、ならびにこの種のアツセイに用いるキツトおよび
ポリヌクレオチド試薬複合体に関する。
エス・イー・ダイアモンドらの米国特許出願第607,88
5号明細書（1984年５月７日出願、アライド・コーポレ
ーシヨンおよびジエネテイツクス・インステイチユート
社共同出願）（特開昭61−31100号公報）には、試料核
酸の標的ヌクレオチド配列に関するポリヌクレオチド置
換アツセイ法が記載されている。この種のアツセイ法に
おいては、プローブポリヌクレオチドは測定すべき標的
ヌクレオチド配列に相補的なセグメント（標的結合領
域）を含む。第２のポリヌクレオチド（標識ポリヌクレ
オチドまたは信号鎖と呼ばれる）が相補的塩基対合によ
つて標的結合領域の少なくとも一部に結合している。使
用に際しては、プローブポリヌクレオチドおよび信号鎖
を含む試薬複合体に試料を接触させる。試料中の標的ヌ
クレオチド配列がプローブポリヌクレオチドの標的結合
領域に結合し、信号鎖を試薬複合体から置換する。置換
された信号鎖を次いで検出する。これは一般に分離工程
後に行われ、この工程には多くの場合試料が導入される
前に固体支持体に固定されたか、または置換工程後に固
体支持体に固定されたプローブポリヌクレオチドが関与
する。均質な様式で（分離工程なしに）実施しうる具体
例はごくわずかに示されているにすぎない。
5号明細書（1984年５月７日出願、アライド・コーポレ
ーシヨンおよびジエネテイツクス・インステイチユート
社共同出願）（特開昭61−31100号公報）には、試料核
酸の標的ヌクレオチド配列に関するポリヌクレオチド置
換アツセイ法が記載されている。この種のアツセイ法に
おいては、プローブポリヌクレオチドは測定すべき標的
ヌクレオチド配列に相補的なセグメント（標的結合領
域）を含む。第２のポリヌクレオチド（標識ポリヌクレ
オチドまたは信号鎖と呼ばれる）が相補的塩基対合によ
つて標的結合領域の少なくとも一部に結合している。使
用に際しては、プローブポリヌクレオチドおよび信号鎖
を含む試薬複合体に試料を接触させる。試料中の標的ヌ
クレオチド配列がプローブポリヌクレオチドの標的結合
領域に結合し、信号鎖を試薬複合体から置換する。置換
された信号鎖を次いで検出する。これは一般に分離工程
後に行われ、この工程には多くの場合試料が導入される
前に固体支持体に固定されたか、または置換工程後に固
体支持体に固定されたプローブポリヌクレオチドが関与
する。均質な様式で（分離工程なしに）実施しうる具体
例はごくわずかに示されているにすぎない。
この種の置換アツセイ法は米国特許第4,358,535号
（フアルコウら、1982年）に代表される従来のハイブリ
ツド形成によるアツセイ法と比べて、試料核酸の固定化
に伴う難点が除かれるという点で種々の利点をもつ（米
国特許出願第607,885号明細書）（特開昭61−31100号公
報）。しかし大部分の読取り（置換された標識ポリヌク
レオチドまたは信号鎖の測定）には分離工程が必要であ
る。
（フアルコウら、1982年）に代表される従来のハイブリ
ツド形成によるアツセイ法と比べて、試料核酸の固定化
に伴う難点が除かれるという点で種々の利点をもつ（米
国特許出願第607,885号明細書）（特開昭61−31100号公
報）。しかし大部分の読取り（置換された標識ポリヌク
レオチドまたは信号鎖の測定）には分離工程が必要であ
る。
米国特許出願第729,503号明細書（シー・バリーら、1
985年５月２日出願）（特開昭61−254856号公報）には
ポリヌクレオチド置換型の不均質アツセイ法が記載され
ており、この場合置換された信号鎖（標識ポリヌクレオ
チド）は特にその３′末端に消化可能なポリリボヌクレ
オチドセグメントをもつ。標的ヌクレオチド鎖による置
換、および分離ののち、この信号鎖が消化されて（特に
酵素ポリヌクレオチドホスホリラーゼにより）リボヌク
レオシドリン酸類（特に二リン酸）となり、こうして生
成したアデノシンリン酸類（特にアデノシン二リン酸）
が測定される。この測定は特にアデノシン三リン酸（AT
P）へのリン酸化、およびATPの測定（たとえばルシフエ
リンを用いるルシフエラーゼ触媒反応による）もしくは
リン酸化工程の副生物の測定（たとえばNADHおよび乳酸
デヒドロゲナーゼを用いるピルビン酸測定法）によつて
行われる。消化可能なポリリボヌクレオチドセグメント
を含む置換された信号鎖のアツセイに採用できる消化、
リン酸化および測定の各工程についてのより詳細な考察
に関しては、米国特許出願第729.502号明細書（シー・
バリーら）（米国特許4735897号）も参照されたい。
985年５月２日出願）（特開昭61−254856号公報）には
ポリヌクレオチド置換型の不均質アツセイ法が記載され
ており、この場合置換された信号鎖（標識ポリヌクレオ
チド）は特にその３′末端に消化可能なポリリボヌクレ
オチドセグメントをもつ。標的ヌクレオチド鎖による置
換、および分離ののち、この信号鎖が消化されて（特に
酵素ポリヌクレオチドホスホリラーゼにより）リボヌク
レオシドリン酸類（特に二リン酸）となり、こうして生
成したアデノシンリン酸類（特にアデノシン二リン酸）
が測定される。この測定は特にアデノシン三リン酸（AT
P）へのリン酸化、およびATPの測定（たとえばルシフエ
リンを用いるルシフエラーゼ触媒反応による）もしくは
リン酸化工程の副生物の測定（たとえばNADHおよび乳酸
デヒドロゲナーゼを用いるピルビン酸測定法）によつて
行われる。消化可能なポリリボヌクレオチドセグメント
を含む置換された信号鎖のアツセイに採用できる消化、
リン酸化および測定の各工程についてのより詳細な考察
に関しては、米国特許出願第729.502号明細書（シー・
バリーら）（米国特許4735897号）も参照されたい。
均質アツセイ様式で操作される、置換信号鎖の消化お
よび消化生成物アデノシンリン酸の測定により置換型ポ
リヌクレオチドアツセイ法を行う技術が見出された。従
つて本発明は、 （１）（ａ）（ｉ）プリン／ピリミジン塩基の水素結合
を介してDNA標的ヌクレオチド配列に塩基対結合しうる
プローブポリヌクレオチド、および（ii）プリン／ピリ
ミジン塩基対の水素結合を介して、プローブポリヌクレ
オチドがDNA標的ヌクレオチド配列に結合しうる領域と
少なくとも一部は共通である領域のプローブポリヌクレ
オチドに塩基対結合したRNA信号鎖ポリヌクレオチドの
試薬複合体を供給し； （ｂ）該試薬複合体を、DNA標的ヌクレオチド配列が存
在する場合これがプローブポリヌクレオチドに結合し、
RNA信号鎖ポリヌクレオチドを試薬複合体から置換する
条件下で試料と接触させ； （ｃ）置換されたRNA信号鎖ポリヌクレオチドを分離す
ることなく、試薬複合体中に残存するRNA信号鎖ポリヌ
クレオチドに対して選択的に消化し、 そして； （ｄ）置換されたRNA信号鎖ポリヌクレオチドの消化に
よる消化生成物の存在を検出する工程よりなる、生物学
的試料のDNA中における標的ヌクレオチド配列の存在を
調べる方法 を提供する。
よび消化生成物アデノシンリン酸の測定により置換型ポ
リヌクレオチドアツセイ法を行う技術が見出された。従
つて本発明は、 （１）（ａ）（ｉ）プリン／ピリミジン塩基の水素結合
を介してDNA標的ヌクレオチド配列に塩基対結合しうる
プローブポリヌクレオチド、および（ii）プリン／ピリ
ミジン塩基対の水素結合を介して、プローブポリヌクレ
オチドがDNA標的ヌクレオチド配列に結合しうる領域と
少なくとも一部は共通である領域のプローブポリヌクレ
オチドに塩基対結合したRNA信号鎖ポリヌクレオチドの
試薬複合体を供給し； （ｂ）該試薬複合体を、DNA標的ヌクレオチド配列が存
在する場合これがプローブポリヌクレオチドに結合し、
RNA信号鎖ポリヌクレオチドを試薬複合体から置換する
条件下で試料と接触させ； （ｃ）置換されたRNA信号鎖ポリヌクレオチドを分離す
ることなく、試薬複合体中に残存するRNA信号鎖ポリヌ
クレオチドに対して選択的に消化し、 そして； （ｄ）置換されたRNA信号鎖ポリヌクレオチドの消化に
よる消化生成物の存在を検出する工程よりなる、生物学
的試料のDNA中における標的ヌクレオチド配列の存在を
調べる方法 を提供する。
この方法の好ましい形態においては、信号鎖は試薬複
合体において標的結合領域のヌクレオチドに結合した
３′末端リボヌクレオチドを含む。これはこのように結
合した状態ではポリヌクレオチドホスホリラーゼにより
消化されないが、置換されたのちはポリヌクレオチドホ
スホリラーゼになる。消化されて、リボヌクレオチド二
リン酸類となる。これにアデノシン二リン酸が含まれ、
これが測定される。
合体において標的結合領域のヌクレオチドに結合した
３′末端リボヌクレオチドを含む。これはこのように結
合した状態ではポリヌクレオチドホスホリラーゼにより
消化されないが、置換されたのちはポリヌクレオチドホ
スホリラーゼになる。消化されて、リボヌクレオチド二
リン酸類となる。これにアデノシン二リン酸が含まれ、
これが測定される。
本発明は （ａ）（ｉ）プリン／ピリミジン塩基の水素結合を介し
てDNA標的ヌクレオチド配列に塩基対結合しうるプロー
ブポリヌクレオチド、および（ii）プリン／ピリミジン
塩基対の水素結合を介して、プローブポリヌクレオチド
がDNA標的ヌクレオチド配列に結合しうる領域と少なく
とも一部は共通である領域のプローブポリヌクレオチド
に塩基対結合したRNA信号鎖ポリヌクレオチドの試薬複
合体であつて;RNA信号鎖ポリヌクレオチドの３′末端ヌ
クレオチドが試薬複合体中においてプローブポリヌクレ
オチドのヌクレオチドに結合しており；かつプローブポ
リヌクレオチドが３′−水酸基を有する未結合３′末端
リボヌクレオチドを含まないもの； （ｂ）一本鎖状の３′末端リボヌクレオチドに特異的な
消化酵素； （ｃ）消化酵素により生成したアデノシンリン酸類をAT
Pに変換するのに有効な反応体および酵素ならびに （ｄ）ATP、またはアデノシンリン酸類からATPへの転化
の副生物を検出するための手段 からなる、生物学的試料のDNA中のあらかじめ定められ
た標的ヌクレオチド配列の存在を測定するためのキツト
を提供する。
てDNA標的ヌクレオチド配列に塩基対結合しうるプロー
ブポリヌクレオチド、および（ii）プリン／ピリミジン
塩基対の水素結合を介して、プローブポリヌクレオチド
がDNA標的ヌクレオチド配列に結合しうる領域と少なく
とも一部は共通である領域のプローブポリヌクレオチド
に塩基対結合したRNA信号鎖ポリヌクレオチドの試薬複
合体であつて;RNA信号鎖ポリヌクレオチドの３′末端ヌ
クレオチドが試薬複合体中においてプローブポリヌクレ
オチドのヌクレオチドに結合しており；かつプローブポ
リヌクレオチドが３′−水酸基を有する未結合３′末端
リボヌクレオチドを含まないもの； （ｂ）一本鎖状の３′末端リボヌクレオチドに特異的な
消化酵素； （ｃ）消化酵素により生成したアデノシンリン酸類をAT
Pに変換するのに有効な反応体および酵素ならびに （ｄ）ATP、またはアデノシンリン酸類からATPへの転化
の副生物を検出するための手段 からなる、生物学的試料のDNA中のあらかじめ定められ
た標的ヌクレオチド配列の存在を測定するためのキツト
を提供する。
本発明はさらに、上記プローブポリヌクレオチドおよ
び上記RNA信号鎖ポリヌクレオチドからなる、上記の方
法およびキツトに用いる試薬複合体をも提供する。
び上記RNA信号鎖ポリヌクレオチドからなる、上記の方
法およびキツトに用いる試薬複合体をも提供する。
第１図は本発明の第１の実施態様を３部分に分けて
（第1A、1Bおよび1C図）示した略図であり、第1A図には
試薬複合体、第1B図には置換工程の中間段階、第1C図に
は置換された信号鎖の消化およびADPからATPへのリン酸
化を示す。
（第1A、1Bおよび1C図）示した略図であり、第1A図には
試薬複合体、第1B図には置換工程の中間段階、第1C図に
は置換された信号鎖の消化およびADPからATPへのリン酸
化を示す。
第2A図は本発明の第２の実施態様による試薬複合体の
略図である。
略図である。
第2B図は本発明の第３の実施態様による試薬複合体の
略図である。
略図である。
第2C図は本発明の第４の実施態様による試薬複合体の
略図である。
略図である。
第2D図は本発明の第５の実施態様による試薬複合体の
略図である。
略図である。
第3A、3B、3C、3Dおよび3E図は本発明の第６の実施態
様の各段階を順次示した略図である。
様の各段階を順次示した略図である。
第4A図は本発明の第７の実施態様による試薬複合体の
略図である。
略図である。
第4B図は信号鎖（もはや図示されていない）置換後の
第4A図の試薬複合体の略図である。
第4A図の試薬複合体の略図である。
本発明により提供され、本発明の方法およびキツトに
用いられる試薬複合体の基本的要素は、プローブポリヌ
クレオチドおよび信号鎖であり、これらは後記のように
相補的塩基対合によつてのみ相互に結合していてもよ
く、あるいはさらにリン酸／糖ポリヌクレオチド主鎖が
共有結合していてもよい（あるいはさらに共有結合また
は非共有結合していてもよい）。プローブポリヌクレオ
チドは測定される標的ヌクレオチド配列に相補的な標的
結合領域をもつ。米国特許出願第607,885号明細書（特
開昭61−31100号公報）に詳述されるように、標的結合
領域は標的ヌクレオチド配列に完全に相補的であつても
よく、あるいは一定数の不整合を含んでいてもよい。さ
らに標的結合領域は信号鎖結合領域（または標識ポリヌ
クレオチド結合領域、従つて図面においてはLBR）と呼
ばれる部分に分割されていることが好都合であり、試薬
中においてこの部分に信号鎖が相補的塩基対合により結
合している。米国特許第607,885号明細書の第1G図に示
されるように、信号鎖の他の少数の塩基が標的結合領域
外のプローブポリヌクレオチドの一部（残部結合領域、
またはRBR）に結合していてもよいが、このような残部
結合領域は存在しないことが好ましい。プローブポリヌ
クレオチドの標的結合領域中に通常存在する他の部分
（単数または複数）は試薬複合体において一本鎖であ
り、標的ヌクレオチド配列が信号鎖のヌクレオチド置換
前にこの領域に最初に結合しうるので初期結合領域（IB
R）と呼ばれる。米国特許第607,885号明細書に記載され
るように、標的結合領域の大きさは他と無関係に決定さ
れるのではなく、LBRおよびIBRの好ましい長さまたはよ
り好ましい長さの合計と考えることができる。信号鎖結
合領域（LBR）は好ましくはヌクレオチド少なくとも25
個の長さ、より好ましくはヌクレオチド50〜1000個の長
さ、最も好ましくはヌクレオチド300〜1000個の長さで
ある。初期結合領域は好ましくはヌクレオチド少なくと
も20個の長さ、より好ましくはヌクレオトド少なくとも
500個の長さ、最も好ましくはヌクレオチド約500〜約10
00個の長さである。信号鎖結合領域（LBR）は標的結合
領域（TBR）の一端または一端付近にあつて、単一の連
続した初期結合領域（IBR）が信号鎖結合領域（LBR）の
一部ではない標的結合領域（TBR）の本質的にすべてで
あることが好ましい。しかし後記の第2C図に示すよう
に、信号鎖結合領域（LBR）が標的結合領域（TBR）の一
端以外の位置にあつてもよく、この場合は初期結合領域
が２か所（IBR−１およびIBR−２）存在するであろう。
用いられる試薬複合体の基本的要素は、プローブポリヌ
クレオチドおよび信号鎖であり、これらは後記のように
相補的塩基対合によつてのみ相互に結合していてもよ
く、あるいはさらにリン酸／糖ポリヌクレオチド主鎖が
共有結合していてもよい（あるいはさらに共有結合また
は非共有結合していてもよい）。プローブポリヌクレオ
チドは測定される標的ヌクレオチド配列に相補的な標的
結合領域をもつ。米国特許出願第607,885号明細書（特
開昭61−31100号公報）に詳述されるように、標的結合
領域は標的ヌクレオチド配列に完全に相補的であつても
よく、あるいは一定数の不整合を含んでいてもよい。さ
らに標的結合領域は信号鎖結合領域（または標識ポリヌ
クレオチド結合領域、従つて図面においてはLBR）と呼
ばれる部分に分割されていることが好都合であり、試薬
中においてこの部分に信号鎖が相補的塩基対合により結
合している。米国特許第607,885号明細書の第1G図に示
されるように、信号鎖の他の少数の塩基が標的結合領域
外のプローブポリヌクレオチドの一部（残部結合領域、
またはRBR）に結合していてもよいが、このような残部
結合領域は存在しないことが好ましい。プローブポリヌ
クレオチドの標的結合領域中に通常存在する他の部分
（単数または複数）は試薬複合体において一本鎖であ
り、標的ヌクレオチド配列が信号鎖のヌクレオチド置換
前にこの領域に最初に結合しうるので初期結合領域（IB
R）と呼ばれる。米国特許第607,885号明細書に記載され
るように、標的結合領域の大きさは他と無関係に決定さ
れるのではなく、LBRおよびIBRの好ましい長さまたはよ
り好ましい長さの合計と考えることができる。信号鎖結
合領域（LBR）は好ましくはヌクレオチド少なくとも25
個の長さ、より好ましくはヌクレオチド50〜1000個の長
さ、最も好ましくはヌクレオチド300〜1000個の長さで
ある。初期結合領域は好ましくはヌクレオチド少なくと
も20個の長さ、より好ましくはヌクレオトド少なくとも
500個の長さ、最も好ましくはヌクレオチド約500〜約10
00個の長さである。信号鎖結合領域（LBR）は標的結合
領域（TBR）の一端または一端付近にあつて、単一の連
続した初期結合領域（IBR）が信号鎖結合領域（LBR）の
一部ではない標的結合領域（TBR）の本質的にすべてで
あることが好ましい。しかし後記の第2C図に示すよう
に、信号鎖結合領域（LBR）が標的結合領域（TBR）の一
端以外の位置にあつてもよく、この場合は初期結合領域
が２か所（IBR−１およびIBR−２）存在するであろう。
プローブポリヌクレオチドはDNAまたはRNAであるか、
あるいはデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオ
チドの双方であつてもよい（特にブロツクコポリマー構
造の場合）。本発明の場合、アツセイすべき標的ヌクレ
オチド配列は一般にDNAであつて、RNAではない。試料RN
Aが存在する場合、これを前処理し（たとえば３′末端
を誘導体化することにより）、これらの試料RNAを本発
明の後続の消化工程において消化されないものにするこ
とができる。本発明の多くの形態の場合のようにプロー
ブポリヌクレオチドがDNAである場合、本発明に用いる
プローブポリヌクレオチドには米国特許出願第607,885
号明細書（特開昭61−31100号公報）に記載されたもの
に比べて何ら特別な拘束はない。プローブポリヌクレオ
チドがRNAであるか、またはリボヌクレオチドを含むヘ
テロポリヌクレオチドである場合、プローブポリヌクレ
オチドのリボヌクレオチドセグメントは、試薬複合体が
無傷である限り後記の消化酵素または方法によつて消化
されてはならない。たとえばポリヌクレオチドホスホリ
ラーゼその他の構造感受性の前進性酵素（processiveen
zyme）をこの工程に用いる場合、末端３′−リボヌクレ
オチドセグメントが試薬複合体において相補的塩基対合
によつて結合しているのでない限り、プローブポリヌク
レオチドはこのセグメントを含んではならない（含む場
合、後記のように、また第3A図および第4A図に示される
ように、このセグメントは相補的塩基対合によつて信号
鎖のヌクレオチドに結合していることが好ましい）。
あるいはデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオ
チドの双方であつてもよい（特にブロツクコポリマー構
造の場合）。本発明の場合、アツセイすべき標的ヌクレ
オチド配列は一般にDNAであつて、RNAではない。試料RN
Aが存在する場合、これを前処理し（たとえば３′末端
を誘導体化することにより）、これらの試料RNAを本発
明の後続の消化工程において消化されないものにするこ
とができる。本発明の多くの形態の場合のようにプロー
ブポリヌクレオチドがDNAである場合、本発明に用いる
プローブポリヌクレオチドには米国特許出願第607,885
号明細書（特開昭61−31100号公報）に記載されたもの
に比べて何ら特別な拘束はない。プローブポリヌクレオ
チドがRNAであるか、またはリボヌクレオチドを含むヘ
テロポリヌクレオチドである場合、プローブポリヌクレ
オチドのリボヌクレオチドセグメントは、試薬複合体が
無傷である限り後記の消化酵素または方法によつて消化
されてはならない。たとえばポリヌクレオチドホスホリ
ラーゼその他の構造感受性の前進性酵素（processiveen
zyme）をこの工程に用いる場合、末端３′−リボヌクレ
オチドセグメントが試薬複合体において相補的塩基対合
によつて結合しているのでない限り、プローブポリヌク
レオチドはこのセグメントを含んではならない（含む場
合、後記のように、また第3A図および第4A図に示される
ように、このセグメントは相補的塩基対合によつて信号
鎖のヌクレオチドに結合していることが好ましい）。
本発明の方法、キツトおよび試薬複合体に用いられる
信号鎖ポリヌクレオチドは少なくともリボヌクレオチド
セグメントを含み、RNAであることが好ましい。本発明
の重要な特色は、これらのヌクレオチドセグメントがプ
ローブポリヌクレオチドからいつたん置換されると後記
の消化酵素または工程によつて消化されうるが、信号鎖
が相補的塩基対合によつてプローブポリヌクレオチドに
結合したままである限りこれらの酵素または工程によつ
て消化されてはならないという点である。簡単にするた
めに、まず信号鎖は全体的にRNAであると仮定する。信
号鎖がデオキシリボヌクレオチドをも含む実施態様は自
明である。
信号鎖ポリヌクレオチドは少なくともリボヌクレオチド
セグメントを含み、RNAであることが好ましい。本発明
の重要な特色は、これらのヌクレオチドセグメントがプ
ローブポリヌクレオチドからいつたん置換されると後記
の消化酵素または工程によつて消化されうるが、信号鎖
が相補的塩基対合によつてプローブポリヌクレオチドに
結合したままである限りこれらの酵素または工程によつ
て消化されてはならないという点である。簡単にするた
めに、まず信号鎖は全体的にRNAであると仮定する。信
号鎖がデオキシリボヌクレオチドをも含む実施態様は自
明である。
米国特許出願第607,885号明細書（特開昭61−31100号
公報）の場合のように信号鎖の少なくとも一部が相補的
塩基対合により、標的結合領域と少なくとも一部は共通
である（好ましくは全体が標的結合領域内に含まれる）
プローブポリヌクレオチド部分に結合している。この対
合によりこのセグメントおよび信号鎖全体が消化から保
護されるべきである。従つて消化が前進性の酵素、たと
えばポリヌクレオチドホスホリラーゼである場合、この
対合は信号鎖の３′末端を含むべきである。この３′末
端の対合によつて、信号鎖全体がこの種の前進性酵素に
よる消化に対して保護される。
公報）の場合のように信号鎖の少なくとも一部が相補的
塩基対合により、標的結合領域と少なくとも一部は共通
である（好ましくは全体が標的結合領域内に含まれる）
プローブポリヌクレオチド部分に結合している。この対
合によりこのセグメントおよび信号鎖全体が消化から保
護されるべきである。従つて消化が前進性の酵素、たと
えばポリヌクレオチドホスホリラーゼである場合、この
対合は信号鎖の３′末端を含むべきである。この３′末
端の対合によつて、信号鎖全体がこの種の前進性酵素に
よる消化に対して保護される。
非前進性の消化酵素を単独で、または前進性の消化酵
素と組合わせて使用してもよい。この種の酵素が信号鎖
リボヌクレオチドセグメント（末端にないセグメントを
も含む）を消化しうる場合、普通は信号鎖のリボヌクレ
オチド部分全体が試薬複合体において相補的塩基対合に
より結合していること、特にプローブポリヌクレオチド
のヌクレオチドに結合している必要がある。しかし前進
性の消化酵素のみを用いる実施態様に関しては、信号鎖
の一部（大きな部分であることが適切である）が一本鎖
状のリボヌクレオチドであつてもよい。信号鎖の３′末
端は結合しているので、信号鎖のこの一本鎖セグメント
（すなわち遊離セグメント）は普通は、相補的塩基対合
によりプローブポリヌクレオチドに結合している対合セ
グメント（PS）よりも信号鎖頭部に近い方（すなわち
５′末端付近）にある（第1Aおよび4A図参照）。このよ
うに本発明の多くの実施態様においてプローブポリヌク
レオチドＰはDNAであり、信号鎖SSはRNAであり、信号鎖
の対合セグメント（PS）は相補的塩基対合によつて、プ
ローブポリヌクレオチドＰの標的結合領域TBRの一部で
ある（かつ好ましくはその末端にある）信号鎖結合領域
LBRに結合している。
素と組合わせて使用してもよい。この種の酵素が信号鎖
リボヌクレオチドセグメント（末端にないセグメントを
も含む）を消化しうる場合、普通は信号鎖のリボヌクレ
オチド部分全体が試薬複合体において相補的塩基対合に
より結合していること、特にプローブポリヌクレオチド
のヌクレオチドに結合している必要がある。しかし前進
性の消化酵素のみを用いる実施態様に関しては、信号鎖
の一部（大きな部分であることが適切である）が一本鎖
状のリボヌクレオチドであつてもよい。信号鎖の３′末
端は結合しているので、信号鎖のこの一本鎖セグメント
（すなわち遊離セグメント）は普通は、相補的塩基対合
によりプローブポリヌクレオチドに結合している対合セ
グメント（PS）よりも信号鎖頭部に近い方（すなわち
５′末端付近）にある（第1Aおよび4A図参照）。このよ
うに本発明の多くの実施態様においてプローブポリヌク
レオチドＰはDNAであり、信号鎖SSはRNAであり、信号鎖
の対合セグメント（PS）は相補的塩基対合によつて、プ
ローブポリヌクレオチドＰの標的結合領域TBRの一部で
ある（かつ好ましくはその末端にある）信号鎖結合領域
LBRに結合している。
本発明の他の形態においては、プローブポリヌクレオ
チドは試薬複合体中において、後記の消化酵素または消
化工程による消化に対して保護されたRNAである。たと
えば前進性酵素を用いる実施態様を考えると、RNAプロ
ーブポリヌクレオチドの３′末端は試薬複合体において
遮断されていなければならない。ある形の遮断はプロー
ブポリヌクレオチドを置換後も前進性酵素による消化か
ら保護し続けるであろう。この形態には共有結合した環
状の、すなわち３′ヘアピン状RNAプローブポリヌクレ
オチド（従つて遊離３′末端を含まない）、ならびに
３′末端が化学的に誘導体化されるか（たとえば末端
３′−水酸基へのリン酸付加により、または過ヨウ素酸
塩による酸化ののち水酸化ホウ素ナトリウムで還元する
ことにより）、３′末端がデオキシリボヌクレオチドで
延長されるか、または支持体に付着することにより誘導
体化されたRNAプローブポリヌクレオチドの使用が含ま
れる。しかしRNAプローブポリヌクレオチドの３′末端
が試薬複合体において、信号鎖の対合セグメントへの相
補的塩基対合のみによつて遮断されていることが好まし
い。たとえば別個のRNAプローブポリヌクレオチドを別
個の信号鎖に、それぞれの３′末端が相補的塩基対合に
よつて他方のヌクレオチドに結合する様式でハイブリツ
ド形成しうる。この種の試薬複合体を第4A図に示す。あ
るいはプローブポリヌクレオチドの３′末端がそれ自身
上へループ状に逆転してハイブリツド形成し、これによ
り信号鎖およびプローブが連続したポリヌクレオチド
（特に連続したRNAポリヌクレオチド）の一部であつて
もよい。この種の試薬複合体を第3A図に示す。この実施
態様においては、プローブポリヌクレオチドは３′末端
を含まず、対合セグメントPSが標的結合領域TBRの信号
鎖結合領域LBRから置換されると、前進型酵素は対合セ
グメント全体を消化し、中間セグメントIS（これは信号
鎖またはプローブヌクレオチドの一部、またはそれぞれ
の一部と考えられる）全体を消化し、次いで（場合によ
り）標的結合領域全体を消化するであろう。
チドは試薬複合体中において、後記の消化酵素または消
化工程による消化に対して保護されたRNAである。たと
えば前進性酵素を用いる実施態様を考えると、RNAプロ
ーブポリヌクレオチドの３′末端は試薬複合体において
遮断されていなければならない。ある形の遮断はプロー
ブポリヌクレオチドを置換後も前進性酵素による消化か
ら保護し続けるであろう。この形態には共有結合した環
状の、すなわち３′ヘアピン状RNAプローブポリヌクレ
オチド（従つて遊離３′末端を含まない）、ならびに
３′末端が化学的に誘導体化されるか（たとえば末端
３′−水酸基へのリン酸付加により、または過ヨウ素酸
塩による酸化ののち水酸化ホウ素ナトリウムで還元する
ことにより）、３′末端がデオキシリボヌクレオチドで
延長されるか、または支持体に付着することにより誘導
体化されたRNAプローブポリヌクレオチドの使用が含ま
れる。しかしRNAプローブポリヌクレオチドの３′末端
が試薬複合体において、信号鎖の対合セグメントへの相
補的塩基対合のみによつて遮断されていることが好まし
い。たとえば別個のRNAプローブポリヌクレオチドを別
個の信号鎖に、それぞれの３′末端が相補的塩基対合に
よつて他方のヌクレオチドに結合する様式でハイブリツ
ド形成しうる。この種の試薬複合体を第4A図に示す。あ
るいはプローブポリヌクレオチドの３′末端がそれ自身
上へループ状に逆転してハイブリツド形成し、これによ
り信号鎖およびプローブが連続したポリヌクレオチド
（特に連続したRNAポリヌクレオチド）の一部であつて
もよい。この種の試薬複合体を第3A図に示す。この実施
態様においては、プローブポリヌクレオチドは３′末端
を含まず、対合セグメントPSが標的結合領域TBRの信号
鎖結合領域LBRから置換されると、前進型酵素は対合セ
グメント全体を消化し、中間セグメントIS（これは信号
鎖またはプローブヌクレオチドの一部、またはそれぞれ
の一部と考えられる）全体を消化し、次いで（場合によ
り）標的結合領域全体を消化するであろう。
本発明の試薬複合体およびキツトを使用する際には、
また本発明方法によれば、被分析試料を濃縮し、処理し
てそのDNAを検出可能な形に変える。まず音波処理、抽
出その他の物理的または化学的処理によつてDNAを組織
（細胞、ウイルス）から放出させ、次いで核酸画分を濃
縮することが望ましい。本発明のある形態においては、
試料DNAを無作為に、もしくは特定の位置で切断し（た
とえば制限酵素により）、および／または変性すること
ができる。処理法の例にはドデシル硫酸ナトリウム（SD
S）もしくはチオシアン酸グアニジウムによる変性、強
アルカリ処理、蛋白質分解、リボヌクレアーゼ処理、フ
エノール抽出、またはこれらのある種の組合せが含まれ
る。本発明に関しては内原RNAを除くことが望ましく、
また内原ADPおよびATP（ある形態の本発明においては内
原AMPも）を除くことが望ましいであろう。内原RNAはア
ルカリ性条件（たとえばNaOH）により除去でき、これに
より二重らせんDNAも変性される。内原ATP、ADPおよびA
MPは所望により酵素によつて消費できる（たとえばホス
フアターゼまたはピロホスフアターゼを用いる。これら
はこの工程ののち不活化および／または除去される）。
しかし米国特許出願第729,503号明細書に記載されるよ
うに、内原RNAが除去されると、ある形態の本発明にお
いては内原ATP、ADPおよび（ある形態においては）AMP
を、本発明の他の形態の場合のように化学的、生化学的
または物理的方法を採用してではなく、既知のバツクグ
ラウンド値として処理する（従つてこれらを数学的に処
理する）ことができる。
また本発明方法によれば、被分析試料を濃縮し、処理し
てそのDNAを検出可能な形に変える。まず音波処理、抽
出その他の物理的または化学的処理によつてDNAを組織
（細胞、ウイルス）から放出させ、次いで核酸画分を濃
縮することが望ましい。本発明のある形態においては、
試料DNAを無作為に、もしくは特定の位置で切断し（た
とえば制限酵素により）、および／または変性すること
ができる。処理法の例にはドデシル硫酸ナトリウム（SD
S）もしくはチオシアン酸グアニジウムによる変性、強
アルカリ処理、蛋白質分解、リボヌクレアーゼ処理、フ
エノール抽出、またはこれらのある種の組合せが含まれ
る。本発明に関しては内原RNAを除くことが望ましく、
また内原ADPおよびATP（ある形態の本発明においては内
原AMPも）を除くことが望ましいであろう。内原RNAはア
ルカリ性条件（たとえばNaOH）により除去でき、これに
より二重らせんDNAも変性される。内原ATP、ADPおよびA
MPは所望により酵素によつて消費できる（たとえばホス
フアターゼまたはピロホスフアターゼを用いる。これら
はこの工程ののち不活化および／または除去される）。
しかし米国特許出願第729,503号明細書に記載されるよ
うに、内原RNAが除去されると、ある形態の本発明にお
いては内原ATP、ADPおよび（ある形態においては）AMP
を、本発明の他の形態の場合のように化学的、生化学的
または物理的方法を採用してではなく、既知のバツクグ
ラウンド値として処理する（従つてこれらを数学的に処
理する）ことができる。
塩基処理は内原RNAを処理するための特に好ましい形
態である。ヌクレオチドへの変換が不十分であつたとし
ても残存するポリリボヌクレオチドは一般に３′末端リ
ン酸を含むからである。PNPは３′末端リン酸を含むポ
リリボヌクレオチドをヌクレオシド二リン酸に変換する
活性をほとんどもたない。
態である。ヌクレオチドへの変換が不十分であつたとし
ても残存するポリリボヌクレオチドは一般に３′末端リ
ン酸を含むからである。PNPは３′末端リン酸を含むポ
リリボヌクレオチドをヌクレオシド二リン酸に変換する
活性をほとんどもたない。
採用できる抽出法のうちではボロネート（boronate）
による抽出法が好ましい。これらは隣接水酸基を含む分
子（たとえばRNA、リボヌクレオシドおよびリボヌクレ
オシドリン酸類に存在する）を捕獲するが、DNAは溶出
させるからである。
による抽出法が好ましい。これらは隣接水酸基を含む分
子（たとえばRNA、リボヌクレオシドおよびリボヌクレ
オシドリン酸類に存在する）を捕獲するが、DNAは溶出
させるからである。
試料がこうして調製されると、これを本発明の試薬複
合体と混合する。その後、分離する必要がないので、こ
の混合または接触は全体として溶液中で行うことが好ま
しい。しかし、これよりも好ましくはないが本発明のあ
る形態においては試料核酸および試薬複合体のうち一方
または両方を固相上に固定化する。成核反応（uncleati
on）（試料核酸の標的ヌクレオチド配列がプローブポリ
ヌクレオチドの標的結合領域にハイブリツド形成する初
期の反応）の機構は、米国特許出願第607,885号明細書
に記載されたもの、あるいは米国特許出願第684,305号
明細書（エム・コリンズら、1984年12月20日出願、審査
中）（特開昭60−244300号公報）に記載された機構のい
ずれかであると思われる。コリンズらの上記明細書に記
載された組換え蛋白質の不在下では、成核反応は普通の
試薬複合体のプローブポリヌクレオチドの初期結合領域
IBRにおいて起こるであろう。この種の成核反応は米国
特許出願第684,308号明細書（ジエイ・アイ・ウイリア
ムズら）（特開昭61−31100号公報）に記載の容積排除
型ポリマー（たとえばポリ（エチレンオキシド））によ
り、あるいは米国特許出願第684,305号明細書（エム・
コリンズら）（特開昭60−244300号公報）に記載の蛋白
質により、または後記のDNA/DNAらせん型促進剤（ネト
ロプシンまたはデイスタマイシンＡ）により促進でき
る。置換に際して存在するATPはrecA蛋白質が有効であ
るのには不十分である場合、ATP依存性でない他の蛋白
質、たとえばGene32蛋白質（ポリアミド補助因子を含
む）、または大腸菌の一本鎖結合蛋白質がなお有用であ
ろう。たとえばエス・シー・コワルチコフスキー（S.C.
Kowalczykowski）らの“ジ・エンザイムズ”、XIV巻、3
73−444頁（1981）を参照されたい。さらに、後続の消
化により生成したADPがリン酸化されてATPとなり、これ
がADP産生を伴う置換（rec蛋白質により加水分解された
ATPから、また置換された鎖から誘導されたADPから）の
促進に際してrecAを活性化するカスケードも考慮され
る。
合体と混合する。その後、分離する必要がないので、こ
の混合または接触は全体として溶液中で行うことが好ま
しい。しかし、これよりも好ましくはないが本発明のあ
る形態においては試料核酸および試薬複合体のうち一方
または両方を固相上に固定化する。成核反応（uncleati
on）（試料核酸の標的ヌクレオチド配列がプローブポリ
ヌクレオチドの標的結合領域にハイブリツド形成する初
期の反応）の機構は、米国特許出願第607,885号明細書
に記載されたもの、あるいは米国特許出願第684,305号
明細書（エム・コリンズら、1984年12月20日出願、審査
中）（特開昭60−244300号公報）に記載された機構のい
ずれかであると思われる。コリンズらの上記明細書に記
載された組換え蛋白質の不在下では、成核反応は普通の
試薬複合体のプローブポリヌクレオチドの初期結合領域
IBRにおいて起こるであろう。この種の成核反応は米国
特許出願第684,308号明細書（ジエイ・アイ・ウイリア
ムズら）（特開昭61−31100号公報）に記載の容積排除
型ポリマー（たとえばポリ（エチレンオキシド））によ
り、あるいは米国特許出願第684,305号明細書（エム・
コリンズら）（特開昭60−244300号公報）に記載の蛋白
質により、または後記のDNA/DNAらせん型促進剤（ネト
ロプシンまたはデイスタマイシンＡ）により促進でき
る。置換に際して存在するATPはrecA蛋白質が有効であ
るのには不十分である場合、ATP依存性でない他の蛋白
質、たとえばGene32蛋白質（ポリアミド補助因子を含
む）、または大腸菌の一本鎖結合蛋白質がなお有用であ
ろう。たとえばエス・シー・コワルチコフスキー（S.C.
Kowalczykowski）らの“ジ・エンザイムズ”、XIV巻、3
73−444頁（1981）を参照されたい。さらに、後続の消
化により生成したADPがリン酸化されてATPとなり、これ
がADP産生を伴う置換（rec蛋白質により加水分解された
ATPから、また置換された鎖から誘導されたADPから）の
促進に際してrecAを活性化するカスケードも考慮され
る。
初期結合領域IBRにおけるこの成核反応に続いて、標
識ヌクレオチド配列とプローブポリヌクレオチドとの二
本鎖形成が信号鎖結合領域LBR内へと移行する。米国特
許出願第607,885号明細書（特開昭61−31100号公報）の
1A−1Eに関連してより詳細に記載されたように、信号鎖
結合領域LBR内で顕微鏡的現象（そこにはジツパー開閉
反応（zipping/unzipping）と記載されている）が起こ
ると思われるが、一般にはごく短期間内に標的ヌクレオ
チド配列が信号鎖の対合セグメントをプローブポリヌク
レオチドの標的結合領域から全体的に置換するであろ
う。信号鎖がプローブポリヌクレオチドと別個のポリヌ
クレオチドである場合、この時点でこれは全体的にプロ
ーブポリヌクレオチドから離脱するであろう。しかしプ
ローブポリヌクレオチドと信号鎖が連続したポリヌクレ
オチドの一部をなしている場合、共有結合は残存するで
あろうが、信号鎖を含む部分の連続鎖は全体として一本
鎖状に変換されるであろう。
識ヌクレオチド配列とプローブポリヌクレオチドとの二
本鎖形成が信号鎖結合領域LBR内へと移行する。米国特
許出願第607,885号明細書（特開昭61−31100号公報）の
1A−1Eに関連してより詳細に記載されたように、信号鎖
結合領域LBR内で顕微鏡的現象（そこにはジツパー開閉
反応（zipping/unzipping）と記載されている）が起こ
ると思われるが、一般にはごく短期間内に標的ヌクレオ
チド配列が信号鎖の対合セグメントをプローブポリヌク
レオチドの標的結合領域から全体的に置換するであろ
う。信号鎖がプローブポリヌクレオチドと別個のポリヌ
クレオチドである場合、この時点でこれは全体的にプロ
ーブポリヌクレオチドから離脱するであろう。しかしプ
ローブポリヌクレオチドと信号鎖が連続したポリヌクレ
オチドの一部をなしている場合、共有結合は残存するで
あろうが、信号鎖を含む部分の連続鎖は全体として一本
鎖状に変換されるであろう。
プローブポリヌクレオチドがDNAであり、信号鎖対合
セグメントがRNAである本発明の実施態様においては、
置換に際してRNAとDNAの二重らせんよりもDNAとDNAの
（すなわち標的ヌクレオチド配列とプローブポリヌクレ
オチドの）二重らせんの形成の方を促進する追加の試薬
を用いることが考慮される。この種の促進剤にはネトロ
プシンおよびジスタマイシンＡが含まれる。この種の促
進剤は特に本発明および米国特許出願第729,503号（特
開昭61−254856号公報）の発明に有用であるが、これら
はRNA信号鎖または標識ポリヌクレオチドをDNAプローブ
ポリヌクレオチドから、標的ヌクレオチド配列を含むDN
A競合体（試料）によつて置換するいずれの場合にも使
用できる。
セグメントがRNAである本発明の実施態様においては、
置換に際してRNAとDNAの二重らせんよりもDNAとDNAの
（すなわち標的ヌクレオチド配列とプローブポリヌクレ
オチドの）二重らせんの形成の方を促進する追加の試薬
を用いることが考慮される。この種の促進剤にはネトロ
プシンおよびジスタマイシンＡが含まれる。この種の促
進剤は特に本発明および米国特許出願第729,503号（特
開昭61−254856号公報）の発明に有用であるが、これら
はRNA信号鎖または標識ポリヌクレオチドをDNAプローブ
ポリヌクレオチドから、標的ヌクレオチド配列を含むDN
A競合体（試料）によつて置換するいずれの場合にも使
用できる。
この置換反応の結果、RNA信号鎖ポリヌクレオチドが
溶液中へ放出されるか、またはそれらの３′末端が遊離
する（あるいは他の形で消化可能となる）。そこでこれ
らは消化され、消化生成物アデノシンリン酸が後記に従
つて測定される。
溶液中へ放出されるか、またはそれらの３′末端が遊離
する（あるいは他の形で消化可能となる）。そこでこれ
らは消化され、消化生成物アデノシンリン酸が後記に従
つて測定される。
しかし本発明のある形態においては、置換反応を受け
た試薬複合体の標的結合領域TBRもアデノシンリン酸源
として作用する可能性がある。このような標的結合領域
TBRは、置換反応後にはDNA標的ヌクレオチド配列とDNA/
RNA（またはＡ）二重らせん構造を形成していることは
認められるであろう。これは標的結合領域がリボヌクレ
オチドセグメントである場合にのみ適用され、標的結合
領域がデオキシリボヌクレオチドセグメントである場合
には適用されないであろう。この種のRNA/DNAらせんの
消化は以下のように行われる。エンドヌクレアーゼ型の
リボヌクレアーゼＨ（RNアーゼＨ）活性をもつ酵素を存
在させ、または添加して、上記のDNA/RNAまたは“A"形
らせんの一部であるRNAセグメントを選択的に消化する
ことができる。これはエンドヌクレアーゼであるため、
これは一般にRNA標的結合領域を切断して、遊離３′水
酸基をもつ一連の短いリボヌクレオチドにするであろう
（一般にヌクレオチド６〜10個の長さ。この長さはRNア
ーゼＨ消化パラメーターにより制御される）。適宜な温
度および濃度の条件下では、これらの短いリボヌクレオ
チドは自然にDNA標的ヌクレオチド配列から会合解除さ
れるであろう。これらのオリゴリボヌクレオチドは離脱
すると置換された信号鎖ポリヌクレオチドを同じ様式で
後記のように消化されうる。従つてポリヌクレオチドホ
スホリラーゼを消化工程に用いる場合、こうして遊離し
た標的結合領域のオリゴリボヌクレオチドおよび置換さ
れた信号鎖ポリヌクレオチドを共に前進的に消化してリ
ボヌクレオシドリン酸類にするであろう。RNアーゼＨに
よる消化がすべてまたは実質的にすべての標的結合領域
のヌクレオチドを標的ヌクレオチド配列から会合解除す
るのに十分である場合、標的ヌクレオチド配列は他の試
薬複合体分子の初期結合領域に成核反応しうる状態とな
り、置換工程が繰り返される。しかし若干の部分のRNA
標的結合領域がDNA標的ヌクレオチド配列に付着したま
まであつても置換はなお可能であり、この場合、置換に
よつて信号鎖ポリヌクレオチドが第２試薬複合体から置
換され、かつ残存オリゴリボヌクレオチド片が標的ヌク
レオチド配列から置換される。
た試薬複合体の標的結合領域TBRもアデノシンリン酸源
として作用する可能性がある。このような標的結合領域
TBRは、置換反応後にはDNA標的ヌクレオチド配列とDNA/
RNA（またはＡ）二重らせん構造を形成していることは
認められるであろう。これは標的結合領域がリボヌクレ
オチドセグメントである場合にのみ適用され、標的結合
領域がデオキシリボヌクレオチドセグメントである場合
には適用されないであろう。この種のRNA/DNAらせんの
消化は以下のように行われる。エンドヌクレアーゼ型の
リボヌクレアーゼＨ（RNアーゼＨ）活性をもつ酵素を存
在させ、または添加して、上記のDNA/RNAまたは“A"形
らせんの一部であるRNAセグメントを選択的に消化する
ことができる。これはエンドヌクレアーゼであるため、
これは一般にRNA標的結合領域を切断して、遊離３′水
酸基をもつ一連の短いリボヌクレオチドにするであろう
（一般にヌクレオチド６〜10個の長さ。この長さはRNア
ーゼＨ消化パラメーターにより制御される）。適宜な温
度および濃度の条件下では、これらの短いリボヌクレオ
チドは自然にDNA標的ヌクレオチド配列から会合解除さ
れるであろう。これらのオリゴリボヌクレオチドは離脱
すると置換された信号鎖ポリヌクレオチドを同じ様式で
後記のように消化されうる。従つてポリヌクレオチドホ
スホリラーゼを消化工程に用いる場合、こうして遊離し
た標的結合領域のオリゴリボヌクレオチドおよび置換さ
れた信号鎖ポリヌクレオチドを共に前進的に消化してリ
ボヌクレオシドリン酸類にするであろう。RNアーゼＨに
よる消化がすべてまたは実質的にすべての標的結合領域
のヌクレオチドを標的ヌクレオチド配列から会合解除す
るのに十分である場合、標的ヌクレオチド配列は他の試
薬複合体分子の初期結合領域に成核反応しうる状態とな
り、置換工程が繰り返される。しかし若干の部分のRNA
標的結合領域がDNA標的ヌクレオチド配列に付着したま
まであつても置換はなお可能であり、この場合、置換に
よつて信号鎖ポリヌクレオチドが第２試薬複合体から置
換され、かつ残存オリゴリボヌクレオチド片が標的ヌク
レオチド配列から置換される。
上記のようにRNアーゼＨ活性を用いて本発明の置換ア
ツセイ法による信号を増強することは、遊離３′末端を
含まないプローブRNAを用いて試料DNAとの“A"形らせん
を形成するハイブリツド形成（置換ではない）アツセイ
法にも適用できる。この種のアツセイにおいては、プロ
ーブ／試料ハイブリツド形成が起こつた場合に（起こつ
た場合にのみ）、PNP消化性RNA（遊離３′末端を含む）
がRNアーゼＨ開裂によつて生成する。
ツセイ法による信号を増強することは、遊離３′末端を
含まないプローブRNAを用いて試料DNAとの“A"形らせん
を形成するハイブリツド形成（置換ではない）アツセイ
法にも適用できる。この種のアツセイにおいては、プロ
ーブ／試料ハイブリツド形成が起こつた場合に（起こつ
た場合にのみ）、PNP消化性RNA（遊離３′末端を含む）
がRNアーゼＨ開裂によつて生成する。
本発明の消化工程においては、置換反応が起こつた場
合に（起こつた場合にのみ）少なくとも信号鎖リボヌク
レオチドが（および前記のように場合によりプローブポ
リヌクレオチドも）消化される。この種の消化は大腸菌
RNアーゼIIまたはラツト肝アルカリRNアーゼＩなどの酵
素によつて行われる。こられは一本鎖のリボヌクレオシ
ドセグメントを攻撃し、これらのセグメントをリボヌク
レオシド一リン酸（アデノシン一リン酸（AMP）を含
む）に変える（リボヌクレオシドリン酸に関するこれお
よび以下の記述はすべて５′−リン酸を意味するものと
解すべきである）。しかし３′末端から前進的に進行す
る消化工程のための酵素（たとえば蛇毒ホスホジエステ
ラーゼ）を用いること、特にリボヌクレオシド二リン酸
（アデノシン二リン酸（ADP）を含む）を産生する前進
性酵素を用いることが好ましい。アデノシン二リン酸を
産生するこれらの前進性酵素は、これらがリン酸部分を
溶液中で無機ホスフエートから各３′末端ヌクレオチド
へ転移させて対応するリボヌクレオシド二リン酸を形成
するので、一般にポリリボヌクレオチドホスホリラーゼ
（PNP）として知られている。これらの酵素は一般にリ
ボヌクレオチドセグメントの３′末端に付着し、一般に
３′末端が末端OHをもちかつ一本鎖であるリボヌクレオ
チドのみを攻撃するであろう。しかし、消化されるポリ
ヌクレオチドセグメント全体が一本鎖である必要はな
い。ただし存在する二本鎖（特に内部対合）は十分に短
かく、またこれらが一本鎖であるときポリヌクレオチド
ホスホリラーゼがこれらのセグメントを前進するのに十
分な頻度で会合解除しなければならない。
合に（起こつた場合にのみ）少なくとも信号鎖リボヌク
レオチドが（および前記のように場合によりプローブポ
リヌクレオチドも）消化される。この種の消化は大腸菌
RNアーゼIIまたはラツト肝アルカリRNアーゼＩなどの酵
素によつて行われる。こられは一本鎖のリボヌクレオシ
ドセグメントを攻撃し、これらのセグメントをリボヌク
レオシド一リン酸（アデノシン一リン酸（AMP）を含
む）に変える（リボヌクレオシドリン酸に関するこれお
よび以下の記述はすべて５′−リン酸を意味するものと
解すべきである）。しかし３′末端から前進的に進行す
る消化工程のための酵素（たとえば蛇毒ホスホジエステ
ラーゼ）を用いること、特にリボヌクレオシド二リン酸
（アデノシン二リン酸（ADP）を含む）を産生する前進
性酵素を用いることが好ましい。アデノシン二リン酸を
産生するこれらの前進性酵素は、これらがリン酸部分を
溶液中で無機ホスフエートから各３′末端ヌクレオチド
へ転移させて対応するリボヌクレオシド二リン酸を形成
するので、一般にポリリボヌクレオチドホスホリラーゼ
（PNP）として知られている。これらの酵素は一般にリ
ボヌクレオチドセグメントの３′末端に付着し、一般に
３′末端が末端OHをもちかつ一本鎖であるリボヌクレオ
チドのみを攻撃するであろう。しかし、消化されるポリ
ヌクレオチドセグメント全体が一本鎖である必要はな
い。ただし存在する二本鎖（特に内部対合）は十分に短
かく、またこれらが一本鎖であるときポリヌクレオチド
ホスホリラーゼがこれらのセグメントを前進するのに十
分な頻度で会合解除しなければならない。
主な消化酵素が前進性である（たとえばPNPまたはSV
P）本発明のある種の好ましい形態においては、他の消
化酵素が存在してもよい。この種の他の消化酵素はたと
えば置換された信号鎖の内部対合により形成される可能
性のある短いRNA/RNAらせんセグメントに対して選択的
なある形のものであり、その例にはコブラ毒RNアーゼ、
ラツト肝アルカリRNアーゼＩ、および大腸菌RNアーゼII
が含まれる。この種の補助消化酵素は末端３′水酸基を
後続の前進性酵素による攻撃のために残しておくべきで
あり、アデノシンの５′炭素における結合を開裂しない
ことが好ましい（両条件をコブラ毒RNアーゼは満た
す）。この種の補助消化酵素は一般に標的結合領域がDN
Aである場合にのみ用いられる。他の場合にはこの第２
の酵素が無傷の試薬複合体のRNA/RNAセグメントを開裂
し、偽信号を発すると思われるからである。
P）本発明のある種の好ましい形態においては、他の消
化酵素が存在してもよい。この種の他の消化酵素はたと
えば置換された信号鎖の内部対合により形成される可能
性のある短いRNA/RNAらせんセグメントに対して選択的
なある形のものであり、その例にはコブラ毒RNアーゼ、
ラツト肝アルカリRNアーゼＩ、および大腸菌RNアーゼII
が含まれる。この種の補助消化酵素は末端３′水酸基を
後続の前進性酵素による攻撃のために残しておくべきで
あり、アデノシンの５′炭素における結合を開裂しない
ことが好ましい（両条件をコブラ毒RNアーゼは満た
す）。この種の補助消化酵素は一般に標的結合領域がDN
Aである場合にのみ用いられる。他の場合にはこの第２
の酵素が無傷の試薬複合体のRNA/RNAセグメントを開裂
し、偽信号を発すると思われるからである。
５′末端に対して選択的な前進性酵素が得られるなら
ば、５′末端ヌクレオチドが相補的塩基対合によつてプ
ローブの標的結合領域に結合した信号鎖ポリヌクレオチ
ドセグメントを用いて試薬複合体を構成することができ
るであろう。そのキツトおよび方法は適宜３′末端を
５′末端に変更した前記のものに相当するであろう。こ
の種のキツトの候補となる酵素は大腸菌RNアーゼＶであ
る。これは活性のために原核生物蛋白質生合成酵素を必
要とするが、RNAを５′末端から３′末端へ前進的に消
化する。
ば、５′末端ヌクレオチドが相補的塩基対合によつてプ
ローブの標的結合領域に結合した信号鎖ポリヌクレオチ
ドセグメントを用いて試薬複合体を構成することができ
るであろう。そのキツトおよび方法は適宜３′末端を
５′末端に変更した前記のものに相当するであろう。こ
の種のキツトの候補となる酵素は大腸菌RNアーゼＶであ
る。これは活性のために原核生物蛋白質生合成酵素を必
要とするが、RNAを５′末端から３′末端へ前進的に消
化する。
この消化工程によりADP（または場合によりAMP）が生
成すると、これは好ましくはピルビン酸キナーゼまたは
クレアチンキナーゼなどの酵素反応によつてリン酸化さ
れてATPとなる。この種の反応には適宜な高エネルギー
リン酸系の補助因子（有機ホスフエート）を伴う（それ
ぞれホスホエノールピルビン酸およびクレアチンリン
酸）。その後のATPまたは副生物（たとえばピルビン
酸）の検出は米国特許出願第729,502号および第729,503
号明細書の記載に従つて行うことができる。
成すると、これは好ましくはピルビン酸キナーゼまたは
クレアチンキナーゼなどの酵素反応によつてリン酸化さ
れてATPとなる。この種の反応には適宜な高エネルギー
リン酸系の補助因子（有機ホスフエート）を伴う（それ
ぞれホスホエノールピルビン酸およびクレアチンリン
酸）。その後のATPまたは副生物（たとえばピルビン
酸）の検出は米国特許出願第729,502号および第729,503
号明細書の記載に従つて行うことができる。
これらの明細書中により十分に記載されるように、上
記リン酸化に用いられる酵素および有機ホスフエートは
PNPによる消化に際して存在して、さもなければ可逆的
であるPNP反応を消化終了の方向へ駆動することが好ま
しい。このリン酸化に際して生成するATPは一般的検出
手段のいずれによつても検出でき、これにはたとえばル
シフエリンを用いる発光性ルシフエラーゼ触媒反応が含
まれる。あるいはリン酸化工程の副生物（特にピルビン
酸）を一般的手段により測定することができ、これには
たとえばNADHを用いる乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）触
媒反応によるピルビン酸の測定が含まれる。これらの場
合、NADHの消失を追跡することにより（光化学的に、ま
たは螢光により）、消化工程により生成したADPと、従
つて試料の核酸（DNA）中の標的ヌクレオチド配列の存
在および量と関数関係にある値が得られる。これらの検
出工程についても米国特許出願第729,502号（米国特許4
735897号）および第729,503号各明細書（特開昭61−254
856号公報）中により詳細に記載されている。
記リン酸化に用いられる酵素および有機ホスフエートは
PNPによる消化に際して存在して、さもなければ可逆的
であるPNP反応を消化終了の方向へ駆動することが好ま
しい。このリン酸化に際して生成するATPは一般的検出
手段のいずれによつても検出でき、これにはたとえばル
シフエリンを用いる発光性ルシフエラーゼ触媒反応が含
まれる。あるいはリン酸化工程の副生物（特にピルビン
酸）を一般的手段により測定することができ、これには
たとえばNADHを用いる乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）触
媒反応によるピルビン酸の測定が含まれる。これらの場
合、NADHの消失を追跡することにより（光化学的に、ま
たは螢光により）、消化工程により生成したADPと、従
つて試料の核酸（DNA）中の標的ヌクレオチド配列の存
在および量と関数関係にある値が得られる。これらの検
出工程についても米国特許出願第729,502号（米国特許4
735897号）および第729,503号各明細書（特開昭61−254
856号公報）中により詳細に記載されている。
方法および試薬複合体に関する上記の記述に基づい
て、本発明による試薬キツトの種々の形態が明らかにな
るであろう。たとえば下記の要素が一般に試薬キツト中
に存在する。
て、本発明による試薬キツトの種々の形態が明らかにな
るであろう。たとえば下記の要素が一般に試薬キツト中
に存在する。
A.試薬複合体、 B.消化酵素（補助因子を含む）、 C.リン酸化酵素（補助因子および補助反応体を含む）、 D.検出システム。
本発明の多くの形態において、置換助剤、たとえばポ
リエチレングリコール（米国特許出願第684,308号明細
書参照。ジエイ・アイ・ウイリアムズら、1984年12月20
日）（特開昭61−31100号公報）または組換え蛋白質、
たとえば大腸菌からのrecA蛋白質（前記で引用した米国
特許出願第684,305号明細書に記載、コリンズら）（特
開昭60−244300号公報）も使用できる。ただしATP依存
性酵素（たとえばrecA蛋白質）を用いて置換を促進する
場合、補助因子として導入されたATPはいずれも置換後
に、かつ消化前に除去されるかまたは補償されなければ
ならない。
リエチレングリコール（米国特許出願第684,308号明細
書参照。ジエイ・アイ・ウイリアムズら、1984年12月20
日）（特開昭61−31100号公報）または組換え蛋白質、
たとえば大腸菌からのrecA蛋白質（前記で引用した米国
特許出願第684,305号明細書に記載、コリンズら）（特
開昭60−244300号公報）も使用できる。ただしATP依存
性酵素（たとえばrecA蛋白質）を用いて置換を促進する
場合、補助因子として導入されたATPはいずれも置換後
に、かつ消化前に除去されるかまたは補償されなければ
ならない。
前記のように最初のADP産生（置換された鎖の消化に
よる）、ATPへの誘導、recA活性化（副生物ADPからATP
への再リン酸化を伴う）、および後続の置換の促進によ
りカスケードを生じることができる。
よる）、ATPへの誘導、recA活性化（副生物ADPからATP
への再リン酸化を伴う）、および後続の置換の促進によ
りカスケードを生じることができる。
これらの成分の一定の組合せを一緒に包装することが
好ましい。別個に包装する場合はこれらを一緒に反応混
合物に導入することが好ましい。この組合せには特にリ
ン酸化酵素（その補助因子を含む）および消化酵素（特
にポリヌクレオチドホスホリラーゼ）が含まれる。AMP
を産生する消化酵素を用いる場合（蛇毒ホスホジエステ
ラーゼ）、この消化酵素は普通はそれ自身不可逆的に消
化するので、一般にはリン酸化酵素をこの消化酵素と共
に包装する必要はない。しかしこの場合、２種のリン酸
化酵素（補助因子を含む）を一緒に包装するかまたは一
緒に導入することが好ましい。たとえばミオキナーゼお
よびピルビン酸キナーゼを一緒に包装するか、または一
緒に導入する（それぞれ適宜な補助因子および補助反応
体、たとえばCTPおよびホスホエノールピルビン酸を含
む）。
好ましい。別個に包装する場合はこれらを一緒に反応混
合物に導入することが好ましい。この組合せには特にリ
ン酸化酵素（その補助因子を含む）および消化酵素（特
にポリヌクレオチドホスホリラーゼ）が含まれる。AMP
を産生する消化酵素を用いる場合（蛇毒ホスホジエステ
ラーゼ）、この消化酵素は普通はそれ自身不可逆的に消
化するので、一般にはリン酸化酵素をこの消化酵素と共
に包装する必要はない。しかしこの場合、２種のリン酸
化酵素（補助因子を含む）を一緒に包装するかまたは一
緒に導入することが好ましい。たとえばミオキナーゼお
よびピルビン酸キナーゼを一緒に包装するか、または一
緒に導入する（それぞれ適宜な補助因子および補助反応
体、たとえばCTPおよびホスホエノールピルビン酸を含
む）。
さらに本発明のある形態においては、酵素の貯蔵に際
して非特異的に生成するATPを使用中に妨害信号を与え
ない形（特にアデノシンおよび無機ホスフエート）に変
えるために、ATPアーゼ、アピラーゼ、ホスフアターゼ
またはピロホスフアターゼを１または２以上の成分中に
きわめて低い濃度で存在させることも考慮される。特に
この種の酵素をリン酸化酵素および検出システム用試薬
中に含有することが考慮される（LKBはこの種のATPアー
ゼを同様な理由からルシフエラーゼ試薬中に含有す
る）。ボロネートおよび他のヌクレオシドリン酸錯化剤
を同じ目的に用いることもできる。
して非特異的に生成するATPを使用中に妨害信号を与え
ない形（特にアデノシンおよび無機ホスフエート）に変
えるために、ATPアーゼ、アピラーゼ、ホスフアターゼ
またはピロホスフアターゼを１または２以上の成分中に
きわめて低い濃度で存在させることも考慮される。特に
この種の酵素をリン酸化酵素および検出システム用試薬
中に含有することが考慮される（LKBはこの種のATPアー
ゼを同様な理由からルシフエラーゼ試薬中に含有す
る）。ボロネートおよび他のヌクレオシドリン酸錯化剤
を同じ目的に用いることもできる。
第１図（第1A、1Bおよび1C図からなる）は本発明の
３′末端不含の第１の形態を示す。第1A図にはDNAプロ
ーブポリヌクレオチドＰおよびRNA信号鎖ポリヌクレオ
チドSSを含む試薬複合体が示されている。この形態にお
いては、プローブポリヌクレオチドＰの主要部分は分析
すべき標的ヌクレオチド配列に相補的な標的結合領域TB
Rである。標的結合領域TBRの一部である初期結合領域IB
Rは試薬複合体において一本鎖である。標的結合領域TBR
の他の部分、すなわち信号鎖結合領域LBRは相補的塩基
対合によつて信号鎖SSの一セグメントである対合セグメ
ントPSに結合している。信号鎖SSについてみると、対合
セグメントPSは尾部（３′末端に最も近い部分）を占
め、遊離セグメントFSは頭部（５′末端に最も近いセグ
メント）を占める。使用する際には、核酸（特に試料DN
A）を含む試料とこの試薬複合体を接触させる。標的ヌ
クレオチド配列を含む試料DNA片Ｇが第1A図に示す試薬
複合体と接触すると、これはまず初期結合領域IBRにお
いてハイブリツド形成しうる。
３′末端不含の第１の形態を示す。第1A図にはDNAプロ
ーブポリヌクレオチドＰおよびRNA信号鎖ポリヌクレオ
チドSSを含む試薬複合体が示されている。この形態にお
いては、プローブポリヌクレオチドＰの主要部分は分析
すべき標的ヌクレオチド配列に相補的な標的結合領域TB
Rである。標的結合領域TBRの一部である初期結合領域IB
Rは試薬複合体において一本鎖である。標的結合領域TBR
の他の部分、すなわち信号鎖結合領域LBRは相補的塩基
対合によつて信号鎖SSの一セグメントである対合セグメ
ントPSに結合している。信号鎖SSについてみると、対合
セグメントPSは尾部（３′末端に最も近い部分）を占
め、遊離セグメントFSは頭部（５′末端に最も近いセグ
メント）を占める。使用する際には、核酸（特に試料DN
A）を含む試料とこの試薬複合体を接触させる。標的ヌ
クレオチド配列を含む試料DNA片Ｇが第1A図に示す試薬
複合体と接触すると、これはまず初期結合領域IBRにお
いてハイブリツド形成しうる。
第1B図は信号鎖SSがプローブポリヌクレオチドの標的
結合領域TBRから試料核酸鎖Ｇによつて置換される中間
段階を示す。この中間構造において信号鎖の３′末端
（実際には対合セグメントPSの一部）はプローブポリヌ
クレオチドから置換されているが、信号鎖SSは相補的塩
基対合によつてプローブポリヌクレオチドの３′末端近
くの部分の標的結合領域TBRに結合したままである。米
国特許第607,885号明細書に記載した機構によつて、本
発明の第1B図に示した構造は、信号鎖SSがプローブポリ
ヌクレオチドＰから解離する地点まで左右にジツパー開
閉作用を受けるであろう。第1C図は試料核酸鎖Ｇの標的
ヌクレオチド配列とプローブポリヌクレオチドＰの標的
結合領域TBRとの間で置換終了後に形成されるDNA/DNAハ
イブリツドを示す。信号鎖SSはこの時点では置換され
て、一本鎖状で溶液中に存在する。同様に第1C図に示さ
れるように、酵素ポリヌクレオチドホスホリラーゼ（PN
P）は信号鎖SSの３′末端に付着し、このRNA信号鎖を
３′末端から前進的に消化する。この実施態様において
は、ポリヌクレオチドホスホリラーゼは対合セグメント
PS全体を前進的に消化し、次いで信号鎖SSの遊離セグメ
ントFS全体を前進的に消化する。第1C図に示されるよう
に、この消化によつて信号鎖ポリヌクレオチドのリボヌ
クレオチドすべてがヌクレオシド二リン酸として離脱し
うる。これはADP以外のヌクレオシド二リン酸ｘ個（xND
P）およびアデノシン二リン酸ｙ個（yADP）として示さ
れる。十分な量のピルビン酸キナーゼおよびホスホエノ
ールピルビン酸が存在する限り、ｙ分子のPEPがｙ分子
のADPと反応して（ピルビン酸キナーゼにより触媒され
る）ｙ分子のATPおよびｙ分子のピルビン酸を生成する
反応が起こるであろう。本方法においては、こうして生
成したATPまたはこうして生成したピルビン酸のいずれ
かが検出される。こうして検出された量は、試薬複合体
から置換された信号鎖ポリヌクレオチドの数と関数関係
にあり、この数は試料の核酸中に存在していた標的ヌク
レオチドセグメントの量と関数関係にあるであろう。
結合領域TBRから試料核酸鎖Ｇによつて置換される中間
段階を示す。この中間構造において信号鎖の３′末端
（実際には対合セグメントPSの一部）はプローブポリヌ
クレオチドから置換されているが、信号鎖SSは相補的塩
基対合によつてプローブポリヌクレオチドの３′末端近
くの部分の標的結合領域TBRに結合したままである。米
国特許第607,885号明細書に記載した機構によつて、本
発明の第1B図に示した構造は、信号鎖SSがプローブポリ
ヌクレオチドＰから解離する地点まで左右にジツパー開
閉作用を受けるであろう。第1C図は試料核酸鎖Ｇの標的
ヌクレオチド配列とプローブポリヌクレオチドＰの標的
結合領域TBRとの間で置換終了後に形成されるDNA/DNAハ
イブリツドを示す。信号鎖SSはこの時点では置換され
て、一本鎖状で溶液中に存在する。同様に第1C図に示さ
れるように、酵素ポリヌクレオチドホスホリラーゼ（PN
P）は信号鎖SSの３′末端に付着し、このRNA信号鎖を
３′末端から前進的に消化する。この実施態様において
は、ポリヌクレオチドホスホリラーゼは対合セグメント
PS全体を前進的に消化し、次いで信号鎖SSの遊離セグメ
ントFS全体を前進的に消化する。第1C図に示されるよう
に、この消化によつて信号鎖ポリヌクレオチドのリボヌ
クレオチドすべてがヌクレオシド二リン酸として離脱し
うる。これはADP以外のヌクレオシド二リン酸ｘ個（xND
P）およびアデノシン二リン酸ｙ個（yADP）として示さ
れる。十分な量のピルビン酸キナーゼおよびホスホエノ
ールピルビン酸が存在する限り、ｙ分子のPEPがｙ分子
のADPと反応して（ピルビン酸キナーゼにより触媒され
る）ｙ分子のATPおよびｙ分子のピルビン酸を生成する
反応が起こるであろう。本方法においては、こうして生
成したATPまたはこうして生成したピルビン酸のいずれ
かが検出される。こうして検出された量は、試薬複合体
から置換された信号鎖ポリヌクレオチドの数と関数関係
にあり、この数は試料の核酸中に存在していた標的ヌク
レオチドセグメントの量と関数関係にあるであろう。
第2A、2B、2Cおよび2D図は本発明の試薬複合体の他の
形態４種を示す。これらはそれぞれ第1A図に示した試薬
複合体と同様に、DNAプローブポリヌクレオチドＰおよ
びRNA信号鎖ポリヌクレオチドSSを含む。第2A図に示し
た形態の場合、信号鎖ポリヌクレオチドはプローブポリ
ヌクレオチドＰの５′末端に最も近い位置において、プ
ローブポリヌクレオチドＰの標的結合領域の一部（信号
鎖対合領域LBR）に結合する対合セグメントPSを含む。
従つて標的ヌクレオチド配列によるハイブリツド形成
は、普通は信号鎖結合領域LBRよりも３′末端に近い方
にある初期結合領域IBR内においてまず行われるであろ
う。従つて信号鎖ポリヌクレオチドSSの３′末端は置換
反応が終結して初めて置換されるであろう。従つて第1B
図に示すように置換は終結していないが信号鎖ポリヌク
レオチドSSの遊離３′末端が一本鎖状であり従つて消化
されうる構造は存在しない。これら２種の形態を比較す
ると、第１図の形態は置換反応の途中で消化が進行し、
置換反応を終結の方向へ駆動するのを助けるという利点
をもつ。しかし第2A図の形態は、標的ヌクレオチド配列
（その３′末端ではない）に関係する試料核酸鎖のため
消化が起こらないであろうという利点をもつ。
形態４種を示す。これらはそれぞれ第1A図に示した試薬
複合体と同様に、DNAプローブポリヌクレオチドＰおよ
びRNA信号鎖ポリヌクレオチドSSを含む。第2A図に示し
た形態の場合、信号鎖ポリヌクレオチドはプローブポリ
ヌクレオチドＰの５′末端に最も近い位置において、プ
ローブポリヌクレオチドＰの標的結合領域の一部（信号
鎖対合領域LBR）に結合する対合セグメントPSを含む。
従つて標的ヌクレオチド配列によるハイブリツド形成
は、普通は信号鎖結合領域LBRよりも３′末端に近い方
にある初期結合領域IBR内においてまず行われるであろ
う。従つて信号鎖ポリヌクレオチドSSの３′末端は置換
反応が終結して初めて置換されるであろう。従つて第1B
図に示すように置換は終結していないが信号鎖ポリヌク
レオチドSSの遊離３′末端が一本鎖状であり従つて消化
されうる構造は存在しない。これら２種の形態を比較す
ると、第１図の形態は置換反応の途中で消化が進行し、
置換反応を終結の方向へ駆動するのを助けるという利点
をもつ。しかし第2A図の形態は、標的ヌクレオチド配列
（その３′末端ではない）に関係する試料核酸鎖のため
消化が起こらないであろうという利点をもつ。
第2B図に示した試薬複合体の形態（実施例で用いた型
である）においては、信号鎖ポリヌクレオチドSSは試薬
複合体においてプローブポリヌクレオチドＰの信号鎖結
合領域LBRに結合したヌクレオチドのみを含む。従つて
この試薬複合体は信号鎖リボヌクレオチドセグメントを
攻撃する消化酵素（たとえばラツト肝アルカリRNアーゼ
Ｉ）と組合わせて使用できる。使用に際しては、この種
の試薬複合体はまず初期結合領域IBRにおいて標的ヌク
レオチド配列とハイブリツド形成しうる。次いで信号鎖
結合領域LBR全体にわたる連鎖置換が起こり、その結果
信号鎖ポリヌクレオチドSSがプローブポリヌクレオチド
Ｐから解離する。消化酵素がリボヌクレオチド二リン酸
を産生するならば、消化およびリン酸化は第1C図に示す
ように進行するであろう。消化酵素がリボヌクレオシド
一リン酸を産生する場合、米国特許出願第729,502号お
よび第729,503号各明細書（米国特許4735897号および特
開昭61−254856号公報）に、AMPがリン酸化される形態
に関して記述されるように、リン酸化は普通は２工程で
行われるであろう。
である）においては、信号鎖ポリヌクレオチドSSは試薬
複合体においてプローブポリヌクレオチドＰの信号鎖結
合領域LBRに結合したヌクレオチドのみを含む。従つて
この試薬複合体は信号鎖リボヌクレオチドセグメントを
攻撃する消化酵素（たとえばラツト肝アルカリRNアーゼ
Ｉ）と組合わせて使用できる。使用に際しては、この種
の試薬複合体はまず初期結合領域IBRにおいて標的ヌク
レオチド配列とハイブリツド形成しうる。次いで信号鎖
結合領域LBR全体にわたる連鎖置換が起こり、その結果
信号鎖ポリヌクレオチドSSがプローブポリヌクレオチド
Ｐから解離する。消化酵素がリボヌクレオチド二リン酸
を産生するならば、消化およびリン酸化は第1C図に示す
ように進行するであろう。消化酵素がリボヌクレオシド
一リン酸を産生する場合、米国特許出願第729,502号お
よび第729,503号各明細書（米国特許4735897号および特
開昭61−254856号公報）に、AMPがリン酸化される形態
に関して記述されるように、リン酸化は普通は２工程で
行われるであろう。
第2C図に示す第４の形態の試薬複合体は、そのヌクレ
オチドが完全にプローブポリヌクレオチドＰの標的結合
領域TBRの信号鎖結合領域LBRに結合した信号鎖ポリヌク
レオチドSSを含む。しかし信号鎖結合領域LBRは標的結
合領域TBRの末端にではなく、むしろその中央に位置す
る。従つて２つの初期結合領域IBR−１およびIBR−２が
プローブポリヌクレオチド内に存在する。従つて標的ヌ
クレオチド配列によるハイブリツド形成はまずIBR−１
またはIBR−２のいずれかにおいて行われ、最後に信号
鎖ポリヌクレオチドSSが信号鎖結合領域LBRから置換さ
れる。このような場合の置換は米国特許第684,305号明
細書（特開昭60−244300号公報）の例４に実験的に証明
されており、可能性のある機構は米国特許出願第607,88
5号明細書（米国特許4507363号）の第1F図に関連して記
述されている。第2C図の信号鎖ポリヌクレオチドは置換
されると消化およびリン酸化を受け、次いで前記実施態
様と同様に検出される。
オチドが完全にプローブポリヌクレオチドＰの標的結合
領域TBRの信号鎖結合領域LBRに結合した信号鎖ポリヌク
レオチドSSを含む。しかし信号鎖結合領域LBRは標的結
合領域TBRの末端にではなく、むしろその中央に位置す
る。従つて２つの初期結合領域IBR−１およびIBR−２が
プローブポリヌクレオチド内に存在する。従つて標的ヌ
クレオチド配列によるハイブリツド形成はまずIBR−１
またはIBR−２のいずれかにおいて行われ、最後に信号
鎖ポリヌクレオチドSSが信号鎖結合領域LBRから置換さ
れる。このような場合の置換は米国特許第684,305号明
細書（特開昭60−244300号公報）の例４に実験的に証明
されており、可能性のある機構は米国特許出願第607,88
5号明細書（米国特許4507363号）の第1F図に関連して記
述されている。第2C図の信号鎖ポリヌクレオチドは置換
されると消化およびリン酸化を受け、次いで前記実施態
様と同様に検出される。
第2D図はDNAプローブＰが検出される標的ヌクレオチ
ド配列に対し相補的な標的結合領域TBRを含むという点
では第2B図のものと類似の試薬複合体を示す。セグメン
トTBRの３′末端に一本鎖状の初期結合領域IBRがあり、
これにより第2B図の場合のように標的ヌクレオチド配列
による成核が促進される。
ド配列に対し相補的な標的結合領域TBRを含むという点
では第2B図のものと類似の試薬複合体を示す。セグメン
トTBRの３′末端に一本鎖状の初期結合領域IBRがあり、
これにより第2B図の場合のように標的ヌクレオチド配列
による成核が促進される。
第2D図のプローブＰの信号鎖結合領域（LBR）には相
補的塩基対合によつて一連の信号鎖（信号鎖SS−１、SS
−２、SS−３、SS−４およびSS−５と示される）が結合
している。実際にはこれら複数の信号鎖は第2B図の試薬
複合体を緩和に（短時間、低い酵素濃度において）RNア
ーゼＨで処理することによつて形成される。この処理に
よつて第2B図の信号鎖SSはランダムに切断され、断片SS
−１、SS−２、SS−３、SS−４およびSS−５が生成する
であろう。プローブ鎖Ｐへの結合がゆるすぎる断片はい
ずれも使用前にクロマトグラフイーにより除去すること
が望ましいであろう。第2D図に示すように断片SS−１〜
SS−５がすべて完全に結合しているが、若干の断片が
３′末端セグメントのみにおいて結合した試薬複合体
も、たとえば第1A図または第2A図の試薬複合体を緩和に
RNアーゼＨ消化することによつて得られる。
補的塩基対合によつて一連の信号鎖（信号鎖SS−１、SS
−２、SS−３、SS−４およびSS−５と示される）が結合
している。実際にはこれら複数の信号鎖は第2B図の試薬
複合体を緩和に（短時間、低い酵素濃度において）RNア
ーゼＨで処理することによつて形成される。この処理に
よつて第2B図の信号鎖SSはランダムに切断され、断片SS
−１、SS−２、SS−３、SS−４およびSS−５が生成する
であろう。プローブ鎖Ｐへの結合がゆるすぎる断片はい
ずれも使用前にクロマトグラフイーにより除去すること
が望ましいであろう。第2D図に示すように断片SS−１〜
SS−５がすべて完全に結合しているが、若干の断片が
３′末端セグメントのみにおいて結合した試薬複合体
も、たとえば第1A図または第2A図の試薬複合体を緩和に
RNアーゼＨ消化することによつて得られる。
使用に際しては、第2D図の試薬複合体を標的ヌクレオ
チド配列と接触させると、DNA/DNAハイブリツドがまず
初期結合領域IBRにおいて形成され、次いで順次信号鎖
結合領域LBR全体に形成される。DNA/DNA二重らせんがLB
Rにおいて形成されるのに伴つて、信号鎖SS−５、次い
でSS−４、次いでSS−３、次いでSS−２、最後にSS−１
が置換されるであろう。後続の工程でそれぞれ消化され
てヌクレオシドリン酸類となり（ADPまたはAMPを含
む）、AMPまたはADPが前記のようにリン酸化される。
チド配列と接触させると、DNA/DNAハイブリツドがまず
初期結合領域IBRにおいて形成され、次いで順次信号鎖
結合領域LBR全体に形成される。DNA/DNA二重らせんがLB
Rにおいて形成されるのに伴つて、信号鎖SS−５、次い
でSS−４、次いでSS−３、次いでSS−２、最後にSS−１
が置換されるであろう。後続の工程でそれぞれ消化され
てヌクレオシドリン酸類となり（ADPまたはAMPを含
む）、AMPまたはADPが前記のようにリン酸化される。
第3A図は本発明の試薬複合体の第６の形態を示す。こ
の場合、プローブポリヌクレオチドおよび信号鎖ポリヌ
クレオチドが連続したRNAポリヌクレオチド鎖の一部で
ある。この鎖の５′末端から前方へ、検出されるDNA標
的ヌクレオチド配列に相補的な標的結合領域TBR、中間
セグメントIS、および３′末端に対合セグメントPSが示
される。対合セグメントPSは標的結合領域TBRの一部
（信号鎖対合セグメントLBR）に相補的であるので、こ
れは試薬複合体においてRNA/RNA二本鎖部分を形成す
る。標的結合領域（この形態では標的結合領域TBRの
５′末端として示されている）の他の部分（初期結合領
域IBR）は一本鎖状である。この種の試薬複合体の製造
については米国特許出願第729,504号明細書（イー・エ
フ・フリツチおよびエム・コリンズ、1985年５月２日出
願、ジエネテイツクス・インステイチユート社に譲渡）
（米国特許5268266号）に記載されている。
の場合、プローブポリヌクレオチドおよび信号鎖ポリヌ
クレオチドが連続したRNAポリヌクレオチド鎖の一部で
ある。この鎖の５′末端から前方へ、検出されるDNA標
的ヌクレオチド配列に相補的な標的結合領域TBR、中間
セグメントIS、および３′末端に対合セグメントPSが示
される。対合セグメントPSは標的結合領域TBRの一部
（信号鎖対合セグメントLBR）に相補的であるので、こ
れは試薬複合体においてRNA/RNA二本鎖部分を形成す
る。標的結合領域（この形態では標的結合領域TBRの
５′末端として示されている）の他の部分（初期結合領
域IBR）は一本鎖状である。この種の試薬複合体の製造
については米国特許出願第729,504号明細書（イー・エ
フ・フリツチおよびエム・コリンズ、1985年５月２日出
願、ジエネテイツクス・インステイチユート社に譲渡）
（米国特許5268266号）に記載されている。
第3A図の試薬複合体は、適宜な標的ヌクレオチド配列
TNSを含む試料DNA核酸鎖Ｇと接触すると、第1Bおよび1C
図に関連して先きに述べたものと同様な様式で成核およ
び連鎖置換を行うであろう。連鎖置換が終了した時点
で、第3B図に示す中間構造が形成されているであろう。
この構造においては、連続RNA鎖の標的結合領域TBRはRN
A/DNA二本鎖の形で試料DNAポリヌクレオチド鎖Ｇの標的
ヌクレオチド配列TNSに結合しているであろう。RNAポリ
ヌクレオチドの残部（中間セグメントISおよび対合セグ
メントPSを含む）はこの二本鎖に結合してはいるが、一
本鎖状であろう。この時点で前進性の消化酵素（ポリヌ
クレオチドホスホリラーゼPNP）はRNA鎖の遊離３′末端
（対合セグメントPSの３′末端）に付着し、対合セグメ
ントPSおよび中間セグメントIS全体を消化することがで
きる。この消化が終了すると、第3C図に示すようにADP
以外のヌクレオチド二リン酸ｍ個（mNDP）およびアデノ
シン二リン酸ｎ個（nADP）が生成するであろう。プロー
ブポリヌクレオチドの消化されなかつた残部には、試料
鎖Ｇの標的ヌクレオチド配列TNS（デオキシリボヌクレ
オチドセグメントである）に結合した標的結合領域TBR
（リボヌクレオチドセグメントである）が含まれるであ
ろう。
TNSを含む試料DNA核酸鎖Ｇと接触すると、第1Bおよび1C
図に関連して先きに述べたものと同様な様式で成核およ
び連鎖置換を行うであろう。連鎖置換が終了した時点
で、第3B図に示す中間構造が形成されているであろう。
この構造においては、連続RNA鎖の標的結合領域TBRはRN
A/DNA二本鎖の形で試料DNAポリヌクレオチド鎖Ｇの標的
ヌクレオチド配列TNSに結合しているであろう。RNAポリ
ヌクレオチドの残部（中間セグメントISおよび対合セグ
メントPSを含む）はこの二本鎖に結合してはいるが、一
本鎖状であろう。この時点で前進性の消化酵素（ポリヌ
クレオチドホスホリラーゼPNP）はRNA鎖の遊離３′末端
（対合セグメントPSの３′末端）に付着し、対合セグメ
ントPSおよび中間セグメントIS全体を消化することがで
きる。この消化が終了すると、第3C図に示すようにADP
以外のヌクレオチド二リン酸ｍ個（mNDP）およびアデノ
シン二リン酸ｎ個（nADP）が生成するであろう。プロー
ブポリヌクレオチドの消化されなかつた残部には、試料
鎖Ｇの標的ヌクレオチド配列TNS（デオキシリボヌクレ
オチドセグメントである）に結合した標的結合領域TBR
（リボヌクレオチドセグメントである）が含まれるであ
ろう。
本発明のある形態においては、この対合セグメントPS
および中間セグメントISの消化によつて生成するnADPの
みを次いでリン酸化し、検出する。しかし本発明の他の
形態においては、リボヌクレアーゼＨ（RNアーゼＨ）が
存在し、あるいはこの時点で添加され、RNA/DNA二重ら
せんのRNAのみを選択的に消化するであろう。これを第3
C図の標的結合領域TBRを指す矢印により図示する。第3D
図は標的結合領域TBRに対するRNアーゼＨの作用によつ
て生成する可能性のあるRNAオリゴヌクレオチドを示
す。これらはそれぞれ一本鎖状で解離するのに十分なほ
ど短く、第3D図に示すようにポリヌクレオチドホスホリ
ラーゼPNPにより消化されて、ADP以外のヌクレオシド二
リン酸ｐ分子（pNDP）およびアデノシン二リン酸（qAD
P）を生成する。
および中間セグメントISの消化によつて生成するnADPの
みを次いでリン酸化し、検出する。しかし本発明の他の
形態においては、リボヌクレアーゼＨ（RNアーゼＨ）が
存在し、あるいはこの時点で添加され、RNA/DNA二重ら
せんのRNAのみを選択的に消化するであろう。これを第3
C図の標的結合領域TBRを指す矢印により図示する。第3D
図は標的結合領域TBRに対するRNアーゼＨの作用によつ
て生成する可能性のあるRNAオリゴヌクレオチドを示
す。これらはそれぞれ一本鎖状で解離するのに十分なほ
ど短く、第3D図に示すようにポリヌクレオチドホスホリ
ラーゼPNPにより消化されて、ADP以外のヌクレオシド二
リン酸ｐ分子（pNDP）およびアデノシン二リン酸（qAD
P）を生成する。
第3E図は第3C図に示した消化により生成したアデノシ
ン二リン酸（nADP）および第3D図に示した消化により生
成したアデノシン二リン酸（qADP）の双方のリン酸化を
示す。十分量のピルビン酸キナーゼおよびホスホエノー
ルピルビン酸（PEP）を用いると、（ｎ＋ｑ）PEPおよび
（ｎ＋ｑ）ADPが消費され、（ｎ＋ｑ）ピルビン酸分子
および（ｎ＋ｑ）ATP分子が生成する。これらの生成物
のいずれも検出できる。
ン二リン酸（nADP）および第3D図に示した消化により生
成したアデノシン二リン酸（qADP）の双方のリン酸化を
示す。十分量のピルビン酸キナーゼおよびホスホエノー
ルピルビン酸（PEP）を用いると、（ｎ＋ｑ）PEPおよび
（ｎ＋ｑ）ADPが消費され、（ｎ＋ｑ）ピルビン酸分子
および（ｎ＋ｑ）ATP分子が生成する。これらの生成物
のいずれも検出できる。
さらに試料鎖Ｇはここで第２の試薬複合体にハイブリ
ツド形成しうる。
ツド形成しうる。
前記第2D図に関して、試薬複合体はたとえば第2B図の
信号鎖SSをRNアーゼＨ（DNA/RNA二重らせんのRNA鎖に特
異的である）で消化することにより形成された複数の信
号鎖SS−１〜SS−５を含むものとして記述された。本文
に示したように、置換後の信号鎖SSまたは対合セグメン
トPSにおいて生成する可能性のあるRNA/DNA二重らせん
を消化する酵素を用いてもよい。ただしDNAプローブポ
リヌクレオチドを用いる第1A、2A、2B、2Cおよび2D図の
形態についてである。ここで用いる酵素（特に補助消化
酵素として）の例はコブラ毒RNアーゼである。
信号鎖SSをRNアーゼＨ（DNA/RNA二重らせんのRNA鎖に特
異的である）で消化することにより形成された複数の信
号鎖SS−１〜SS−５を含むものとして記述された。本文
に示したように、置換後の信号鎖SSまたは対合セグメン
トPSにおいて生成する可能性のあるRNA/DNA二重らせん
を消化する酵素を用いてもよい。ただしDNAプローブポ
リヌクレオチドを用いる第1A、2A、2B、2Cおよび2D図の
形態についてである。ここで用いる酵素（特に補助消化
酵素として）の例はコブラ毒RNアーゼである。
第4A図はプローブポリヌクレオチドＰおよび信号鎖SS
がそれぞれRNAである第７の形態を示す。対合セグメン
トPSが信号鎖SSの５′末端を含む。信号鎖結合領域LBR
はプローブポリヌクレオチドＰの３′末端を含む。対合
セグメントPSは相補的塩基対合により信号鎖結合領域LB
Rに結合しているので、両鎖とも前進性のみの消化酵素
による攻撃から保護されている。一本鎖セグメントFSお
よびTBRは末端を含む。
がそれぞれRNAである第７の形態を示す。対合セグメン
トPSが信号鎖SSの５′末端を含む。信号鎖結合領域LBR
はプローブポリヌクレオチドＰの３′末端を含む。対合
セグメントPSは相補的塩基対合により信号鎖結合領域LB
Rに結合しているので、両鎖とも前進性のみの消化酵素
による攻撃から保護されている。一本鎖セグメントFSお
よびTBRは末端を含む。
置換およびPNPによる消化を行うと、前記実施態様の
場合のように信号鎖SS全体が消化されるであろう。RNA
プローブポリヌクレオチドＰはこの段階では標的ヌクレ
オチド配列TNSを保有する試料DNAに結合しているであろ
う。ここで、先きに第3Cおよび3D図に関連して記述した
様式でさらにRNアーゼＨ、次いでPNPによる消化が行わ
れ、さらにADPが生成する。ADPの検出はこの実施態様に
おいても前記実施態様の場合と同様に行われる。
場合のように信号鎖SS全体が消化されるであろう。RNA
プローブポリヌクレオチドＰはこの段階では標的ヌクレ
オチド配列TNSを保有する試料DNAに結合しているであろ
う。ここで、先きに第3Cおよび3D図に関連して記述した
様式でさらにRNアーゼＨ、次いでPNPによる消化が行わ
れ、さらにADPが生成する。ADPの検出はこの実施態様に
おいても前記実施態様の場合と同様に行われる。
本発明を下記の実施例によりさらに説明する。
実施例１ RNA信号鎖の製造 ヌクレオチド52個の長さの合成RNAを下記に従つて構
成した。pSp64DNA10μｇをEcoRIエンドヌクレアーゼに
よる制限によつて線状化した。このDNAをフエノール、
クロロホルムおよびイソアミルアルコール（25:24:1）
の混合物で１回抽出した。水相と有機相を分離し、有機
相を等容積のTE（トリス塩酸10mM、pH8.0;EDTA1mM）緩
衝化した0.2M・NaClで再抽出したのち、プールした水相
をジエチルエーテル飽和した水で３回抽出し、エチルア
ルコールを75％（V/V）にまで添加することによりDNAを
再沈殿させた。この鋳型から下記に従つてRNAを製造し
た。各反応混合物（各成分はプロメガ・バイオテク社よ
り）はトリス塩酸40mM（pH7.5）、MgCl2 6mM、スペルミ
ジン2mM、NaCl10 mM、ジチオスレイトール10 mM、４種
のrNTPそれぞれ500μＭ、RNAシンセターゼ60単位、α〔
32P〕rATP10〜50mCi、およびEcoRI線状化pSp64DNA2mgを
含有していた。反応はSP6ポリメラーゼ45単位を最終容
積50μｌ中に添加することによつて開始した。37℃で60
分間インキユベートしたのち、さらにRNAシンセターゼ
を60単位およびDNアーゼ１を２単位添加し、37℃でさら
に15分間インキユベーシヨンを続けた。塩濃度を4M・Na
Clで400mMに調整したのち、反応物を線状化DNAについて
先きに記述したように抽出した。フエノール−クロロホ
ルム−イソアミルアルコール抽出した水相を1.5mlセフ
アデツクスＧ−50スピンカラム上で遠心分離することに
よりヌクレオチドを定量的に除去した。Ｇ−50画分をポ
リエチレンイミンセルロースクロマトグラフイー処理、
次いでセレンコフによるα〔32P〕ATPの計数により判定
したヌクレオチド除去率は99.5％以上であつた。
成した。pSp64DNA10μｇをEcoRIエンドヌクレアーゼに
よる制限によつて線状化した。このDNAをフエノール、
クロロホルムおよびイソアミルアルコール（25:24:1）
の混合物で１回抽出した。水相と有機相を分離し、有機
相を等容積のTE（トリス塩酸10mM、pH8.0;EDTA1mM）緩
衝化した0.2M・NaClで再抽出したのち、プールした水相
をジエチルエーテル飽和した水で３回抽出し、エチルア
ルコールを75％（V/V）にまで添加することによりDNAを
再沈殿させた。この鋳型から下記に従つてRNAを製造し
た。各反応混合物（各成分はプロメガ・バイオテク社よ
り）はトリス塩酸40mM（pH7.5）、MgCl2 6mM、スペルミ
ジン2mM、NaCl10 mM、ジチオスレイトール10 mM、４種
のrNTPそれぞれ500μＭ、RNAシンセターゼ60単位、α〔
32P〕rATP10〜50mCi、およびEcoRI線状化pSp64DNA2mgを
含有していた。反応はSP6ポリメラーゼ45単位を最終容
積50μｌ中に添加することによつて開始した。37℃で60
分間インキユベートしたのち、さらにRNAシンセターゼ
を60単位およびDNアーゼ１を２単位添加し、37℃でさら
に15分間インキユベーシヨンを続けた。塩濃度を4M・Na
Clで400mMに調整したのち、反応物を線状化DNAについて
先きに記述したように抽出した。フエノール−クロロホ
ルム−イソアミルアルコール抽出した水相を1.5mlセフ
アデツクスＧ−50スピンカラム上で遠心分離することに
よりヌクレオチドを定量的に除去した。Ｇ−50画分をポ
リエチレンイミンセルロースクロマトグラフイー処理、
次いでセレンコフによるα〔32P〕ATPの計数により判定
したヌクレオチド除去率は99.5％以上であつた。
RNA−DNAハイブリツドの製造 特定のRNA製剤を種々の量の相補的“プローブ"DNAで
滴定し、ハイブリツドにRNAとして90〜95％の放射能が
取り込まれるのに必要な装入DNAとRNAの比を調べた（ア
ガロースゲル電気泳動により判定）。一定量の52−merR
NAを数種の濃度（0.01〜0.1μg/μｌ）のM13mp11一本鎖
環状DNAに、0.2M・NaClおよびTE緩衝液の存在下でハイ
ブリツド形成させた。反応物を65℃で30分間インキユベ
ートしたのち、反応物を徐冷し、ハイブリツド形成度を
アガロースゲル電気泳動により定量し、次いで切断して
遊離52−merおよびハイブリツドバンドを計数した。
滴定し、ハイブリツドにRNAとして90〜95％の放射能が
取り込まれるのに必要な装入DNAとRNAの比を調べた（ア
ガロースゲル電気泳動により判定）。一定量の52−merR
NAを数種の濃度（0.01〜0.1μg/μｌ）のM13mp11一本鎖
環状DNAに、0.2M・NaClおよびTE緩衝液の存在下でハイ
ブリツド形成させた。反応物を65℃で30分間インキユベ
ートしたのち、反応物を徐冷し、ハイブリツド形成度を
アガロースゲル電気泳動により定量し、次いで切断して
遊離52−merおよびハイブリツドバンドを計数した。
置換反応 52−mer:M13mp11ハイブリツド（試薬複合体）を最終
容積10μｌにおいて、プローブM13mp11DNAに対し等量の
M13mp10競合体DNAの存在下または不在下で、65℃におい
て120分間インキユベートした。プローブDNAと競合体DN
Aは同分子量であるので、この反応は競合体対52−mer標
識プローブ鎖とほぼ1:1の比率で継続した。
容積10μｌにおいて、プローブM13mp11DNAに対し等量の
M13mp10競合体DNAの存在下または不在下で、65℃におい
て120分間インキユベートした。プローブDNAと競合体DN
Aは同分子量であるので、この反応は競合体対52−mer標
識プローブ鎖とほぼ1:1の比率で継続した。
置換されたRNAをヌクレオチドリン酸類の変換 置換後に反応物を、蒸留および脱イオンしたDEPC（ピ
ロ炭酸ジエチル）処理した水でNaCl 0.1Mとなるまで希
釈し、等容積の２×加リン酸分解キナーゼ反応混合物を
添加した。これによりNaCl 50mM、トリスHCl 100mM（pH
8.5）、２−メルカプトエタノール1 mM、MgCl210 mM、
オルトホスフエート10 mM、ホスホエノールピリビン酸2
0 mM、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ0.02単位、およ
びピルビン酸キナーゼ１単位の最終成分濃度となつた。
反応物を50℃で60分間インキユベートしたのち、ATP、A
DP、および消化不完全なRNA＋無傷のRNAの量をポリエチ
レンイミンセルロースクロマトグラフイーにより定量し
た。この置換および変換反応の結果を表１に示す。
ロ炭酸ジエチル）処理した水でNaCl 0.1Mとなるまで希
釈し、等容積の２×加リン酸分解キナーゼ反応混合物を
添加した。これによりNaCl 50mM、トリスHCl 100mM（pH
8.5）、２−メルカプトエタノール1 mM、MgCl210 mM、
オルトホスフエート10 mM、ホスホエノールピリビン酸2
0 mM、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ0.02単位、およ
びピルビン酸キナーゼ１単位の最終成分濃度となつた。
反応物を50℃で60分間インキユベートしたのち、ATP、A
DP、および消化不完全なRNA＋無傷のRNAの量をポリエチ
レンイミンセルロースクロマトグラフイーにより定量し
た。この置換および変換反応の結果を表１に示す。
実施例２ RNAの製造 以下の点を除いて上記と同様に23−merRNAの製造を行
つた。鋳型pSp64DNAをHinc II制限エンドヌクレアーゼ
で線状化した。フエノール抽出後の反応混合物を1.5ml
のバイオゲル（Bio Gel）Ｐ−６スピンカラムにより遠
心分離することによつて精製した。
つた。鋳型pSp64DNAをHinc II制限エンドヌクレアーゼ
で線状化した。フエノール抽出後の反応混合物を1.5ml
のバイオゲル（Bio Gel）Ｐ−６スピンカラムにより遠
心分離することによつて精製した。
ハイブリツドの製造 上記実施例１に記載した方法により、M13mp11プロー
ブ含有ハイブリツドに93％の水準の総RNAを取り込ませ
ることによりハイブリツドを製造した。
ブ含有ハイブリツドに93％の水準の総RNAを取り込ませ
ることによりハイブリツドを製造した。
置換反応 23−merRNA:M13mp11ハイブリツド（試薬複合体）を用
いて実施例１の記載と同様にして競合体M13mp10DNAを検
出した。ただし置換反応を50℃で１時間行つた。使用し
た他のM13mp10製剤は質量基準で23−merハイブリツドお
よび52−merハイブリツドの置換において有効性がより
低かつた（ここに示されていない）。
いて実施例１の記載と同様にして競合体M13mp10DNAを検
出した。ただし置換反応を50℃で１時間行つた。使用し
た他のM13mp10製剤は質量基準で23−merハイブリツドお
よび52−merハイブリツドの置換において有効性がより
低かつた（ここに示されていない）。
置換されたRNAをヌクレオチドリン酸に変換 ピルビン酸キナーゼおよびポリヌクレオチドホスホリ
ラーゼを用いる変換反応を実施例１に記載したと同様に
行つた。競合体（モル）対ハイブリツドプローブ鎖（モ
ル）の相対水準0.6および１における実験の結果を表２
に示す。
ラーゼを用いる変換反応を実施例１に記載したと同様に
行つた。競合体（モル）対ハイブリツドプローブ鎖（モ
ル）の相対水準0.6および１における実験の結果を表２
に示す。
実施例３ RNAの製造 ヌクレオチド195個のRNAの製造を下記により行つた。
PBR−322からの375BP Eco RI Bam HI断片を線状化した
のちのpSp65DNA中にEco RIおよびBam HI各制限エンドヌ
クレアーゼによりサブクローニングした。誘導体pSp65
−15DNAをEco RVにより線状化したのち、pSp65−15鋳型
を４種すべてのヌクレオシド三リン酸（α〔32P〕ATPを
含む）の存在下で転写することにより長さ195のRNAを製
造した。転写後にセフアデツクスＧ−50ゲル過により
RNAからヌクレオシド三リン酸を除去した。
PBR−322からの375BP Eco RI Bam HI断片を線状化した
のちのpSp65DNA中にEco RIおよびBam HI各制限エンドヌ
クレアーゼによりサブクローニングした。誘導体pSp65
−15DNAをEco RVにより線状化したのち、pSp65−15鋳型
を４種すべてのヌクレオシド三リン酸（α〔32P〕ATPを
含む）の存在下で転写することにより長さ195のRNAを製
造した。転写後にセフアデツクスＧ−50ゲル過により
RNAからヌクレオシド三リン酸を除去した。
ハイブリツドの製造 上記実施例１に記載した方法により、均一に〔32P〕
アデノシン標識したRNAを一本鎖M13mp8−20−C DNAハイ
ブリツドに90％の水準まで取り込ませることによつてハ
イブリツドを製造した。
アデノシン標識したRNAを一本鎖M13mp8−20−C DNAハイ
ブリツドに90％の水準まで取り込ませることによつてハ
イブリツドを製造した。
置換反応 ポリヌクレオチドホスホリラーゼ／ピルビン酸キナー
ゼ反応に用いた緩衝系から酵素を除いた系において置換
反応を行つた。置換、ならびにRNAから信号鎖ADPおよび
ATPへの転化を同時にかつ同一溶液中でルーテインに行
つた。この実施例の目的のために、置換工程および転化
工程を分けることにより置換および転化の各工程の定量
化を行うことができる。この反応混合物は実施例１に示
した成分のほかに195−merとM13mp8−20DNAとのハイブ
リツド（試薬複合体）0.5pmole、M13mp19 3/2競合体０
〜7mg、または等量のM13mp11非競合体DNAを最終容積20
μｌ中に含有していた。後者のDNAは195−mer RNAが結
合するM13mp8−20の領域に相補的な1.1kbの挿入体を含
まない点以外は競合体DNAに等しい。添加したNaCl OMま
たは0.10Mにおいて２組の反応を行い、イオン強度が置
換、ならびに後続の転化および被分析体DNAと対照DNA
（競合体ではない）の検出に与える影響を調べた。置換
反応混合物を65℃で30分間インキユベートしたのち、試
料を室温に取り出し、種々の量の装入競合体または対照
DNAを示す各反応物４μを1.5％アガロースゲル上におけ
る電気泳動により、置換度についてアツセイした。次い
で各反応混合物に、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ約
0.028単位およびピルビン酸キナーゼ0.4単位を含む１×
PNP/PK緩衝液12μｌを添加した。この反応混合物を50℃
で30分間インキユベートしたのち、各反応混合物４μｌ
をPEIセルロースに施した。試料を0.8M・LiClおよび0.8
M酢酸中でクロマトグラフイー処理したのち、RNA、ATP
およびADPに相当するスポツトを切り取り、セレンコフ
計数により定量した。各反応混合物の残りを蒸留した脱
イオン水で最終容積250μｌに調整し、標準試薬を用い
て、LKB1250ルミノメーターで生物発光により定量し
た。これらの分析の結果を表３および４に示す。表４の
遊離RNAの値9.8％はハイブリツド形成していない割合に
よる（上記の90％というハイブリツド形成効率を留意さ
れたい）。
ゼ反応に用いた緩衝系から酵素を除いた系において置換
反応を行つた。置換、ならびにRNAから信号鎖ADPおよび
ATPへの転化を同時にかつ同一溶液中でルーテインに行
つた。この実施例の目的のために、置換工程および転化
工程を分けることにより置換および転化の各工程の定量
化を行うことができる。この反応混合物は実施例１に示
した成分のほかに195−merとM13mp8−20DNAとのハイブ
リツド（試薬複合体）0.5pmole、M13mp19 3/2競合体０
〜7mg、または等量のM13mp11非競合体DNAを最終容積20
μｌ中に含有していた。後者のDNAは195−mer RNAが結
合するM13mp8−20の領域に相補的な1.1kbの挿入体を含
まない点以外は競合体DNAに等しい。添加したNaCl OMま
たは0.10Mにおいて２組の反応を行い、イオン強度が置
換、ならびに後続の転化および被分析体DNAと対照DNA
（競合体ではない）の検出に与える影響を調べた。置換
反応混合物を65℃で30分間インキユベートしたのち、試
料を室温に取り出し、種々の量の装入競合体または対照
DNAを示す各反応物４μを1.5％アガロースゲル上におけ
る電気泳動により、置換度についてアツセイした。次い
で各反応混合物に、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ約
0.028単位およびピルビン酸キナーゼ0.4単位を含む１×
PNP/PK緩衝液12μｌを添加した。この反応混合物を50℃
で30分間インキユベートしたのち、各反応混合物４μｌ
をPEIセルロースに施した。試料を0.8M・LiClおよび0.8
M酢酸中でクロマトグラフイー処理したのち、RNA、ATP
およびADPに相当するスポツトを切り取り、セレンコフ
計数により定量した。各反応混合物の残りを蒸留した脱
イオン水で最終容積250μｌに調整し、標準試薬を用い
て、LKB1250ルミノメーターで生物発光により定量し
た。これらの分析の結果を表３および４に示す。表４の
遊離RNAの値9.8％はハイブリツド形成していない割合に
よる（上記の90％というハイブリツド形成効率を留意さ
れたい）。
第１図は本発明の第１の実施態様を３部分に分けて（第
1A、1Bおよび1C図）示した略図であり、第1A図には試薬
複合体、第1B図には置換工程の中間段階、第1C図には置
換された信号鎖の消化およびADPからATPへのリン酸化を
示す。 第2A図は本発明の第２の実施態様による試薬複合体の略
図である。 第2B図は本発明の第３の実施態様による試薬複合体の略
図である。 第2C図は本発明の第４の実施態様による試薬複合体の略
図である。 第2D図は本発明の第５の実施態様による試薬複合体の略
図である。 第3A、3B、3C、3Dおよび3E図は本発明の第６の実施態様
の各段階を順次示した略図である。 第4A図は本発明の第７の実施態様による試薬複合体の略
図である。 第4B図は信号鎖（もはや図示されていない）置換後の第
4A図の試薬複合体の略図である。 これらの図面において各記号は下記のものを表わす。 P:プローブ鎖;TBR:標的結合領域;IBR:初期結合領域;LB
R:信号鎖（標識）結合領域;SS:信号鎖;PS:対合セグメン
ト;FS:遊離セグメント;IS:中間セグメント;G:試料DNA
鎖;TNS:標的ヌクレオチド配列;PNP:ポリヌクレオチドホ
スホリラーゼ;PEP:ホスホエノールピルビン酸。
1A、1Bおよび1C図）示した略図であり、第1A図には試薬
複合体、第1B図には置換工程の中間段階、第1C図には置
換された信号鎖の消化およびADPからATPへのリン酸化を
示す。 第2A図は本発明の第２の実施態様による試薬複合体の略
図である。 第2B図は本発明の第３の実施態様による試薬複合体の略
図である。 第2C図は本発明の第４の実施態様による試薬複合体の略
図である。 第2D図は本発明の第５の実施態様による試薬複合体の略
図である。 第3A、3B、3C、3Dおよび3E図は本発明の第６の実施態様
の各段階を順次示した略図である。 第4A図は本発明の第７の実施態様による試薬複合体の略
図である。 第4B図は信号鎖（もはや図示されていない）置換後の第
4A図の試薬複合体の略図である。 これらの図面において各記号は下記のものを表わす。 P:プローブ鎖;TBR:標的結合領域;IBR:初期結合領域;LB
R:信号鎖（標識）結合領域;SS:信号鎖;PS:対合セグメン
ト;FS:遊離セグメント;IS:中間セグメント;G:試料DNA
鎖;TNS:標的ヌクレオチド配列;PNP:ポリヌクレオチドホ
スホリラーゼ;PEP:ホスホエノールピルビン酸。
Claims (17)
- 【請求項１】（ａ）（ｉ）プリン／ピリミジン塩基の水
素結合を介してDNA標的ヌクレオチド配列に塩基対結合
しうるプローブポリヌクレオチド、および（ii）プリン
／ピリミジン塩基対の水素結合を介して、プローブポリ
ヌクレオチドがDNA標的ヌクレオチド配列に結合しうる
領域と少なくとも一部は共通である領域のプローブポリ
ヌクレオチドに塩基対結合したRNA信号鎖ポリヌクレオ
チドの試薬複合体を供給し； （ｂ）該試薬複合体を、DNA標的ヌクレオチド配列が存
在する場合これがプローブポリヌクレオチドに結合し、
RNA信号鎖ポリヌクレオチドを試薬複合体から置換する
条件下で試料と接触させ； （ｃ）置換されたRNA信号鎖ポリヌクレオチドを分離す
ることなく、試薬複合体中に残存するRNA信号鎖ポリヌ
クレオチドに対して選択的に消化し、 そして； （ｄ）置換されたRNA信号鎖ポリヌクレオチドの消化に
よる消化生成物の存在を検出する工程よりなる、生物学
的試料のDNA中における標的ヌクレオチド配列の存在を
調べる方法。 - 【請求項２】検出工程（ｄ）が消化工程（ｃ）で生成し
たアデノシンリン酸類の存在および量と関数関係にある
量の検出可能な酵素反応生成物を産生する酵素反応系を
供給することによりなる、特許請求の範囲第１項に記載
の方法。 - 【請求項３】接触工程（ｂ）、消化工程（ｃ）および検
出工程（ｄ）がすべて溶液中で、中間の分離なしに行わ
れる、特許請求の範囲第２項に記載の方法。 - 【請求項４】RNA信号鎖ポリヌクレオチドの３′末端ヌ
クレオチドが試薬複合体中においてプローブポリヌクレ
オチドのヌクレオチドに結合し、プローブポリヌクレオ
チドが未結合の３′末端リボヌクレオチドを含まず；か
つ 消化工程（ｃ）がリボヌクレオチド類を一本鎖３′末端
から前進的に消化することによりなる、特許請求の範囲
第２項に記載の方法。 - 【請求項５】プローブポリヌクレオチドの３′末端ヌク
レオチドがデオキシリボヌクレオチドである。特許請求
の範囲第４項に記載の方法。 - 【請求項６】プローブポリヌクレオチドの３′末端ヌク
レオチドがリボヌクレオチドであり、試薬複合体中にお
いてRNA信号鎖ポリヌクレオチドのヌクレオチドに結合
している、特許請求の範囲第４項に記載の方法。 - 【請求項７】消化工程（ｃ）がリボヌクレオチド類を一
本鎖３′末端から前進的にポリヌクレオチドホスホリラ
ーゼおよび無機ホスフェートにより消化することよりな
り、検出工程（ｄ）がリボヌクレオチド二リン酸類のう
ちアデノシン二リン酸（ADP）をリン酸化してアデノシ
ン三リン酸（ATP）にすることよりなる、特許請求の範
囲第１項ないし第６項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項８】ADPをリン酸化する工程において過剰の有
機ホスフェート化合物を使用し、かつADPおよび有機ホ
スフェート化合物からのATPの産生を触媒するのに有効
なキナーゼ酵素を使用する、 特許請求の範囲第７項に記載の方法。 - 【請求項９】過剰の有機ホスフェート化合物およびキナ
ーゼ酵素が消化工程（ｃ）において反応混合物中に存在
し、これにより消化工程（ｃ）がADPリン酸化工程によ
り終結に向けて駆動される、特許請求の範囲８項に記載
の方法。 - 【請求項１０】信号鎖ポリヌクレオチドとプローブポリ
ヌクレオチドの二重らせんがDNA/RNA二重らせんセグメ
ントであり、消化工程（ｃ）において一本鎖ポリリボヌ
クレオチドセグメントを消化してリボヌクレオチドリン
酸類にする第１消化酵素、およびRNA/RNA二重らせんセ
グメントのホスホジエステル結合を選択的に開裂して
３′ヒドロキシ末端を生じる第２消化酵素を使用するこ
とよりなる、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項１１】（ａ）（ｉ）プリン／ピリミジン塩基の
水素結合を介してDNA標的ヌクレオチド配列に塩基対結
合しうるプローブポリヌクレオチド、および（ii）プリ
ン／ピリミジン塩基対の水素結合を介して、プローブポ
リヌクレオチドがDNA標的ヌクレオチド配列に結合しう
る領域と少なくとも一部は共通である領域のプローブポ
リヌクレオチドに塩基対結合したRNA信号鎖ポリヌクレ
オチドの試薬複合体であって;RNA信号鎖ポリヌクレオチ
ドの３′末端ヌクレオチドが試薬複合体中においてプロ
ーブポリヌクレオチドのヌクレオチドに結合しており；
かつプローブポリヌクレオチドが３′−水酸基を有する
未結合３′末端リボヌクレオチドを含まないもの； （ｂ）一本鎖状の３′末端リボヌクレオチドに特異的な
消化酵素； （ｃ）消化酵素により生成したアデノシンリン酸類をAT
Pに変換するのに有効な反応体及び酵素、ならびに （ｄ）ATP、またはアデノシンリン酸類からATPへの転化
の副生物を検出するための手段、 を含んでなる、 前記試薬複合体を、DNA標的ヌクレオチド配列が存在す
る場合これがプローブポリヌクレオチドに結合し、RNA
信号鎖ポリヌクレオチドを試薬複合体から置換する条件
下で試料と接触させ； 置換されたRNA信号鎖ポリヌクレオチドを分離すること
なく、試薬複合体中に残存するRNA信号鎖ポリヌクレオ
チドに対して選択的に消化し、そして； 置換されたRNA信号鎖ポリヌクレオチドの消化による消
化生成物の存在を検出する工程よりなる、生物学的試料
のDNA中における標的ヌクレオチド配列の存在を調べる
方法に使用するためのキット。 - 【請求項１２】消化酵素がポリヌクレオチドホスホリラ
ーゼであり、キットがさらに無機ホスフェートを含み、
従って消化酵素より生成するアデノシンリン酸類がヌク
レオチド二リン酸類である、特許請求の範囲第11項に記
載のキット。 - 【請求項１３】消化酵素により生成したアデノシンリン
酸類をATPに変換するのに有効な反応体および酵素が、
それぞれ有機ホスフェート化合物およびADPからATPを産
生するのに有効な過剰の有機ホスフェート化合物および
キナーゼ酵素である、特許請求の範囲第12項に記載のキ
ット。 - 【請求項１４】ポリヌクレオチドホスホリラーゼ、有機
ホスフェート化合物およびキナーゼ酵素が一緒に包装さ
れている特許請求の範囲第13項に記載のキット。 - 【請求項１５】プローブポリヌクレオチドがDNAであ
る、特許請求の範囲第11項ないし第14項のいずれか１項
に記載のキット。 - 【請求項１６】さらにRNA/RNA二重らせんセグメント中
のリボヌクレオチドホスホジエステル結合に特異的な第
２の消化酵素を含む、特許請求の範囲第15項に記載のキ
ット。 - 【請求項１７】（ｉ）プリン／ピリミジン塩基の水素結
合を介してDNA標的ヌクレオチド配列に塩基対結合しう
るプローブポリヌクレオチド、および （ii）プリン／ピリミジン塩基対の水素結合を介して、
プローブポリヌクレオチドがDNA標的ヌクレオチド配列
に結合しうる領域と少なくとも一部は共通である領域の
プローブポリヌクレオチドに塩基対結合したRNA信号鎖
ポリヌクレオチドからなる試薬複合体であって;RNA信号
鎖ポリヌクレオチドの３′末端ヌクレオチドが試薬複合
体においてプローブポリヌクレオチドのヌクレオチドに
結合しており；かつプローブポリヌクレオチドが３′−
水酸基を有する未結合３′末端リボヌクレオチドを含ま
ない試薬複合体であって、 該試薬複合体を、DNA標的ヌクレオチド配列が存在する
場合これがプローブポリヌクレオチドに結合し、RNA信
号鎖ポリヌクレオチドを試薬複合体から置換する条件下
で試料と接触させ； 置換されたRNA信号鎖ポリヌクレオチドを分離すること
なく、試薬複合体中に残存するRNA信号鎖ポリヌクレオ
チドに対して選択的に消化し、そして； 置換されたRNA信号鎖ポリヌクレオチドの消化による消
化生成物の存在を検出する工程よりなる、生物学的試料
のDNA中における標的ヌクレオチド配列の存在を調べる
方法に使用するための上記試薬複合体。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/755,996 US4795701A (en) | 1985-07-17 | 1985-07-17 | Homogeneous polynucleotide displacement assay method kit and reagent complex |
| US755996 | 1985-07-17 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6221062A JPS6221062A (ja) | 1987-01-29 |
| JP2609231B2 true JP2609231B2 (ja) | 1997-05-14 |
Family
ID=25041575
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61144666A Expired - Lifetime JP2609231B2 (ja) | 1985-07-17 | 1986-06-20 | 標的ヌクレオチド配列アツセイのための方法、キツトおよび試薬複合体 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4795701A (ja) |
| EP (1) | EP0212067B1 (ja) |
| JP (1) | JP2609231B2 (ja) |
| CA (1) | CA1272939A (ja) |
| DE (1) | DE3675842D1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US5011769A (en) * | 1985-12-05 | 1991-04-30 | Meiogenics U.S. Limited Partnership | Methods for detecting nucleic acid sequences |
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| US5200314A (en) * | 1990-03-23 | 1993-04-06 | Chiron Corporation | Polynucleotide capture assay employing in vitro amplification |
| US5451502A (en) * | 1990-05-04 | 1995-09-19 | Oncor, Inc. | Restriction amplification assay |
| US5445933A (en) * | 1992-09-15 | 1995-08-29 | Boehringer Mannheim Corporation | Strand displacement assay and complex useful therefor |
| JP2675496B2 (ja) * | 1992-10-27 | 1997-11-12 | 新日本製鐵株式会社 | 金属試料中微量成分の高精度分析装置 |
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-
1985
- 1985-07-17 US US06/755,996 patent/US4795701A/en not_active Expired - Fee Related
-
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- 1986-05-05 EP EP86106119A patent/EP0212067B1/en not_active Expired
- 1986-05-05 DE DE8686106119T patent/DE3675842D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-06-20 JP JP61144666A patent/JP2609231B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1986-07-11 CA CA000513576A patent/CA1272939A/en not_active Expired
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6096553A (ja) * | 1983-10-28 | 1985-05-30 | 株式会社神戸製鋼所 | セメント原料粉末の焼成方法 |
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| JPS6221062A (ja) | 1987-01-29 |
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| EP0212067B1 (en) | 1990-11-28 |
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| DE3675842D1 (de) | 1991-01-10 |
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