KR20150110494A - 재배열 인플루엔자 a 바이러스 - Google Patents
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Abstract
재배열 인플루엔자 A 바이러스의 제조를 위한 새로운 인플루엔자 공여 균주가 제공된다.
Description
본 발명은 부분적으로 생물의학 첨단개발국(BARDA)에 의해 부여받은 승인 번호 HHSO10020100061C 하에 정부 지지로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 가진다.
기술분야
본 발명은 인플루엔자 A 바이러스 재배열(reassortment) 분야에 있다. 나아가 본 발명은 인플루엔자 A 바이러스에 대해 보호하기 위한 백신을 제조하는 것에 관한 것이다.
인플루엔자 감염에 대한 가장 효과적인 보호는 순환하는 균주에 대한 백신접종이고, 가능한 빨리 백신 제조를 위한 인플루엔자 바이러스를 생성하는 것이 중요하다.
야생형 인플루엔자 바이러스들은 보통 알과 세포 배양물에서 저역가로 성장한다. 백신 제조를 위해 더 잘 성장하는 바이러스 균주를 얻기 위하여 현재 통상적으로 실시하는 것은 순환하는 백신 균주를 더 빠르게 성장하는 고수율 공여 균주로 재배열하는 것이다. 이것은 배양 숙주를 순환하는 인플루엔자 균주(백신 균주) 및 고수율 공여 균주로 공-감염시키고, 백신 균주로부터 헤마글루티닌(HA)과 뉴라미니다제(NA) 절편 및 공여 균주로부터의 다른 바이러스 절편들(즉 PB1, PB2, PA, NP, M1, M2, NS1 및 NS2를 코드화하는 것들)을 함유하는 재배열 바이러스를 선택함으로써 이루어질 수 있다. 다른 접근법은 인플루엔자 바이러스를 역유전학에 의해 재배열하는 것이다(예를 들면 참고문헌 1 및 2 참조).
참고문헌 3은 A/Texas/1/77로부터의 PB1 유전자 절편, A/New Caledonia/20/99로부터의 HA 및 NA 절편, A/Puerto Rico/8/34로부터 유도된 변형된 PA 절편 및 A/Puerto Rico/8/34로부터의 나머지 바이러스 절편을 함유하는 재배열 인플루엔자 바이러스가 세포에서 증가된 성장을 나타내는 것을 보고하고 있다.
현재 백신 제조를 위해 인플루엔자 바이러스를 재배열하기 위한 공여 균주는 단지 제한된 수가 있을 뿐이고, 가장 통상적으로 사용되는 균주는 A/Puerto Rico/8/34 (A/PR/8/34) 균주이다. 그러나, A/PR/8/34 골격 절편을 포함하는 재배열 인플루엔자 바이러스는 항상 효과적인 백신 제조를 보장할 정도로 충분히 잘 성장하지 않는다. 그러므로, 인플루엔자 바이러스 재배열을 위한 추가의 개선된 공여 균주를 제공할 필요성이 해당 기술분야에 존재한다.
본 발명자들은 놀랍게도 둘 또는 그것보다 많은 인플루엔자 공여 균주로부터의 골격 절편들을 포함하는 인플루엔자 바이러스가 동일한 공여 균주로부터의 모든 골격 절편을 함유하는 재배열 인플루엔자 A 바이러스와 비교하여 배양 숙주(특히 세포 배양물)에서 더 빠르게 성장할 수 있다는 것을 발견하였다. 특히, 발명자들은 두 개의 상이한 고수율 공여 균주로부터 유도된 골격 절편들을 포함하는 인플루엔자 바이러스가 두 개의 원래 공여 균주 중 어느 하나의 단독으로 만들어진 재배열체(reassortant)보다 표적 백신-관련 HA/NA 유전자를 가지는 재배열체를 고수율로 생성할 수 있음을 발견하였다.
둘 또는 그것보다 많은 인플루엔자 공여 균주로부터의 골격 절편들을 가지는 재배열 인플루엔자 A 바이러스는 상이한 인플루엔자 A 균주로부터의 HA 절편 및 PB1 절편을 포함할 수 있다. 이들 재배열 인플루엔자 바이러스에서 PB1 절편은 바람직하게는 백신 균주와 동일한 인플루엔자 바이러스 HA 하위유형을 가지는 공여 바이러스로부터 유래된다. 예를 들어 PB1 절편 및 HA 절편은 둘 다 H1 하위유형을 가지는 인플루엔자 바이러스로부터 유래될 수 있다. 재배열 인플루엔자 A 바이러스는 또한 상이한 인플루엔자 바이러스 HA 하위유형을 가지는 상이한 인플루엔자 A 균주로부터의 HA 절편과 PB1 절편을 포함할 수 있는데, 이때 PB1 절편은 H3 HA 하위유형을 가지는 인플루엔자 바이러스로부터 유래되지 않고 및/또는 HA 절편은 H1 또는 H5 HA 하위유형을 가지는 인플루엔자 바이러스로부터 유래되지 않는다. 예를 들어 PB1 절편은 H1 바이러스로부터 유래될 수 있고 및/또는 HA 절편은 H3 인플루엔자 바이러스로부터 유래될 수 있다.
본 발명은 또한 PB1 절편이 A/California/07/09 인플루엔자 균주로부터 유래되는 둘 또는 그것보다 많은 인플루엔자 공여 균주로부터의 골격 절편들을 가지는 재배열 인플루엔자 A 바이러스를 제공한다. 이 절편은 SEQ ID NO:22의 서열돠 적어도 95%의 동일성 또는 100% 동일성을 가질 수 있다. 재배열 인플루엔자 A 바이러스는 H1 HA 하위유형을 가질 수 있다. 발명의 본 측면에 따르는 재배열 인플루엔자 바이러스는 A/California 07/09로부터의 HA 및/또는 NA 절편을 포함하지 않을 것임이 인지될 것이다.
재배열 인플루엔자 A 바이러스가 둘 또는 세 개의 공여 균주로부터의 골격 절편을 포함하는 경우에, 각각의 공여 균주는 재배열 인플루엔자 A 바이러스의 하나 이상의 골격 절편을 제공할 수 있지만, 공여 균주의 하나 또는 둘은 단지 단일 골격 절편만을 제공할 수 있다.
재배열 인플루엔자 A 바이러스가 2, 3, 4 또는 5개의 공여 균주로부터의 골격 절편을 포함하는 경우에, 공여 균주 중 하나 또는 둘은 재배열 인플루엔자 A 바이러스의 하나 이상의 골격 절편을 제공할 수 있다. 일반적으로 재배열 인플루엔자 A 바이러스는 6개 이상의 골격 절편을 포함할 수 없다. 따라서, 예를 들어 만약 공여 균주들 중 하나가 5개의 바이러스 절편을 제공한다면, 재배열 인플루엔자 A 바이러스는 총 2개의 상이한 공여 균주들로부터의 골격 절편만을 포함할 수 있다.
재배열 인플루엔자 A 바이러스가 A/Texas/1/77로부터의 PB1 절편을 포함하는 경우에, A/Puerto Rico/8/34로부터의 PA, NP 또는 M 절편을 포함하지 않는 것이 바람직하다. 재배열 인플루엔자 A 바이러스가 A/Puerto Rico/8/34로부터의 PA, NP 또는 M 절편을 포함하는 경우에는, A/Texas/1/77로부터의 PB1 절편을 포함하지 않는 것이 바람직하다. 일부 구체예에서, 발명은 A/Texas/1/77로부터의 PB1 절편 및 A/Puerto Rico/8/34로부터의 PA, NP 또는 M 절편을 가지는 재배열 인플루엔자 A 바이러스를 포함하지 않는다. A/Texas/1/77로부터의 PB1 절편은 SEQ ID NO:27의 서열을 가질 수 있고, A/Puerto Rico/8/34로부터의 PA, NP 또는 M 절편은 각각 SEQ ID NO:28, 29 또는 30의 서열을 가질 수 있다.
발명의 인플루엔자 A 바이러스 균주는 MDCK 세포에서 및/또는 알에서 동시에 및 동일한 성장 조건 하에서 동일한 인플루엔자 공여 균주로부터의 모든 골격 절편을 포함하는 재배열 인플루엔자 균주들과 비교하여 더 높은 바이러스 역가로 성장할 수 있다.
발명은 또한 공여 균주로부터 적어도 하나의 골격 바이러스 절편을 포함하는 재배열 인플루엔자 A 바이러스를 제공하는데, 이때 공여 균주는 A/California/07/09 인플루엔자 균주이다. 적어도 하나의 골격 바이러스 절편이 PA 절편일 때, 그것은 SEQ ID NO:15의 서열과 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일성을 가지는 서열을 가질 수 있다. 적어도 하나의 골격 바이러스 절편이 PB1 절편일 때, 그것은 SEQ ID NO:16의 서열과 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일성을 가지는 서열을 가질 수 있다. 적어도 하나의 골격 바이러스 절편이 PB2 절편일 때, 그것은 SEQ ID NO:17의 서열과 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일성을 가지는 서열을 가질 수 있다. 적어도 하나의 골격 바이러스 절편이 NP 절편일 때, 그것은 SEQ ID NO:18의 서열과 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일성을 가지는 서열을 가질 수 있다. 적어도 하나의 골격 바이러스 절편이 M 절편일 때, 그것은 SEQ ID NO:19의 서열과 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일성을 가지는 서열을 가질 수 있다. 적어도 하나의 골격 바이러스 절편이 NS 절편일 때, 그것은 SEQ ID NO:20의 서열과 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일성을 가지는 서열을 가질 수 있다.
적어도 하나의 골격 절편은 이전 단락에서 논의된 것과 같이, A/California/07/09 인플루엔자 균주로부터 유도될 수 있다. 바람직한 재배열 인플루엔자 A 바이러스는 A/California/07/09 인플루엔자 균주로부터의 PB1 절편을 포함한다. 발명자들은 이 골격 절편을 포함하는 인플루엔자 A 바이러스가 배양 숙주에서 잘 성장하는 것을 보여주었다. 재배열 인플루엔자 A 바이러스는 A/California/07/09가 아닌 인플루엔자 바이러스로부터의 모든 다른 골격 절편을 포함할 수 있다.
재배열 인플루엔자 A 바이러스는 A/California/07/09로부터의 PB1 절편 및 인플루엔자 균주 PR8-X로부터의 다른 모든 골격 절편을 포함할 수 있다. PR8-X의 절편들은 SEQ ID NO:1 (PA), SEQ ID NO:2 (PB1), SEQ ID NO:3 (PB2), SEQ ID NO:4 (NP), SEQ ID NO:5 (M), SEQ ID NO:6 (NS), SEQ ID NO:7 (HA) 또는 SEQ ID NO:8 (NA)의 서열들을 가진다. 그러므로 발명의 인플루엔자 바이러스는 SEQ ID NO:1의 서열에 대해 적어도 95% 또는 99% 동일성을 가지는 PA 절편, SEQ ID NO:3의 서열에 대해 적어도 95% 또는 99% 동일성을 가지는 PB2 절편, SEQ ID NO:5의 서열에 대해 적어도 95% 또는 99% 동일성을 가지는 M 절편, SEQ ID NO:4의 서열에 대해 적어도 95% 또는 99% 동일성을 가지는 NP 절편 및/또는 SEQ ID NO:6의 서열에 대해 적어도 95% 또는 99% 동일성을 가지는 NS 절편으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 게놈 절편을 포함할 수 있다. 재배열 인플루엔자 A 바이러스는 또한 SEQ ID NO:1 및/또는 3 내지 6의 서열을 가지는 하나 또는 그 이상의 바이러스 절편을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 재배열 인플루엔자 균주는 이 단락에서 언급된 게놈 절편을 모두 포함한다. 이 구체예는 발명자들이 그런 재배열 인플루엔자 A 바이러스가 세포 배양물 및 부화 계란(embryonated hens egg)에서 특히 잘 성장하는 것을 발견했기 때문에 바람직하다.
일반적으로 재배열 인플루엔자 바이러스는 각각의 골격 절편 중 하나만을 함유할 것이다. 예를 들어 인플루엔자 바이러스가 A/California/07/09로부터의 PB1 절편을 포함할 때, 그것은 동시에 다른 인플루엔자 A 공여 균주로부터의 PB1 절편을 포함하지는 않을 것이다.
골격 바이러스 절편들은 특이한 배양 숙주에서의 배양을 위해 생략될 수 있다. 예를 들어 재배열 인플루엔자 바이러스가 포유류 세포에서 배양되는 경우, 배양 숙주에서의 최적 성장을 위해 바이러스 절편들 중 적어도 하나를 조정하는 것이 유익하다. 예를 들어 발현 숙주가 개과의 세포, 예컨대 MDCK 셀라인인 경우, 바이러스 절편은 세포에서 바이러스 성장을 최적화시키는 서열을 가질 수 있다. 그로써, 발명의 재배열 인플루엔자 바이러스는 쌍방식 배열 알고리즘을 사용하여 SEQ ID NO:3에 대해 정렬될 때 SEQ ID NO:3의 아미노산 389에 해당하는 위치에 라이신을 가지거나, 및/또는 쌍방식 배열 알고리즘을 사용하여 SEQ ID NO:3에 대해 정렬될 때 SEQ ID NO:3의 아미노산 559에 해당하는 위치에 아스파라긴을 가지는 PB2 게놈 절편을 포함할 수 있다. 또한 PA 게놈 절편이 쌍방식 배열 알고리즘을 사용하여 SEQ ID NO:1에 대해 정렬될 때 SEQ ID NO:1의 아미노산 327에 해당하는 위치에 라이신을 가지거나, 및/또는 쌍방식 배열 알고리즘을 사용하여 SEQ ID NO:1에 대해 정렬될 때 SEQ ID NO:1의 아미노산 444에 해당하는 위치에 아스파르트산을 가지거나, 및/또는 쌍방식 배열 알고리즘을 사용하여 SEQ ID NO:1에 대해 정렬될 때 SEQ ID NO:1의 아미노산 675에 해당하는 위치에 아스파르트산을 가지는, 발명에 따르는 재배열 인플루엔자 바이러스가 제공된다. 발명의 재배열 인플루엔자 균주는 또한 쌍방식 배열 알고리즘을 사용하여 SEQ ID NO:4에 대해 정렬될 때 SEQ ID NO:4의 아미노산 27에 해당하는 위치에 쓰레오닌을 가지거나, 및/또는 쌍방식 배열 알고리즘을 사용하여 SEQ ID NO:4에 대해 정렬될 때 SEQ ID NO:4의 아미노산 375에 해당하는 위치에 아스파라긴을 가지는 NP 게놈 절편을 가질 수 있다. 변이체 인플루엔자 균주는 또한 이들 돌연변이 중 둘 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 변이체 인플루엔자 바이러스는 상기 확인된 두 가지의 아미노산 변화를 모두 가지는 변이체 PB2 절편, 및/또는 상기 확인된 세 가지의 아미노산 변화를 모두 함유하는 PA 및/또는 상기 확인된 두 가지의 아미노산 변화를 모두 함유하는 N 절편을 함유하는 것이 바람직하다. 인플루엔자 A 바이러스는 H1 균주일 수 있다.
다르게는, 또는 그 외에, 재배열 인플루엔자 바이러스는 쌍방식 배열 알고리즘을 사용하여 SEQ ID NO:2에 대해 정렬될 때 SEQ ID NO:2의 아미노산 200에 해당하는 위치에 아이소로이신을 가지거나, 및/또는 쌍방식 배열 알고리즘을 사용하여 SEQ ID NO:2에 대해 정렬될 때 SEQ ID NO:2의 아미노산 338에 해당하는 위치에 아스파라긴을 가지거나, 및/또는 쌍방식 배열 알고리즘을 사용하여 SEQ ID NO:2에 대해 정렬될 때 SEQ ID NO:2의 아미노산 529에 해당하는 위치에 아이소로이신을 가지거나, 및/또는 쌍방식 배열 알고리즘을 사용하여 SEQ ID NO:2에 대해 정렬될 때 SEQ ID NO:2의 아미노산 591에 해당하는 위치에 아이소로이신을 가지거나, 및/또는 쌍방식 배열 알고리즘을 사용하여 SEQ ID NO:2에 대해 정렬될 때 SEQ ID NO:2의 아미노산 687에 해당하는 위치에 히스티딘을 가지거나, 및/또는 쌍방식 배열 알고리즘을 사용하여 SEQ ID NO:2에 대해 정렬될 때 SEQ ID NO:2의 아미노산 754에 해당하는 위치에 라이신을 가지는 PB1 절편을 포함할 수 있다.
바람직한 쌍방식 배열 알고리즘은 Needleman-Wunsch 글로벌 배열 알고리즘[4]으로, 디폴트 매개변수를 사용한다(예컨대 갭 오프닝 페널티 = 10.0, 갭 연정 페널티 = 0.5, EBLOSUM62 기록 매트릭스를 사용함). 이 알고리즘은 편리하게도 EMBOSS 패키지에서 needle 도구에서 실시된다.
발명은 발명의 재배열 인플루엔자 A 바이러스를 제조하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 (i) 배양 숙주 안에 골격 바이러스 절편이 둘 또는 그 이상의 인플루엔자 균주로부터 유래되는 인플루엔자 A 바이러스를 제조하기 위해 필요로 하는 바이러스 절편들을 코드화하는 하나 또는 그 이상의 발현 구성물(들)을 도입하는 단계; 및 (ii) 재배열 바이러스를 제조하기 위하여 그 배양 숙주를 배양하는 단계 및 임의로 (iii) 단계 (ii)에서 얻어진 바이러스를 정제하는 단계를 포함한다. 이들 방법에서, HA와 PB1 절편은 동일한 인플루엔자 HA 하위유형을 가지는 상이한 인플루엔자 균주로부터 유래될 수 있거나, HA 및 PB1 절편은 상이한 HA 하위유형을 가지는 상이한 인플루엔자 균주로부터 유래될 수 있는데, 단 PB1 절편은 H3 HA 하위유형을 가지는 인플루엔자 바이러스로부터 유래되지 않고 및/또는 HA 절편은 H1 또는 H5 HA 하위유형을 가지는 인플루엔자 바이러스로부터 유래되지 않아야 한다. PB1 골격 바이러스 절편은 A/California/07/09로부터 유래될 수 있다. 하나 또는 그 이상의 발현 구성물은 추가로 PR8-X로부터의 PB2, PA, NP, M 또는 NS 절편 또는 SEQ ID NO:9 및/또는 11 내지 14에 대해 적어도 90% 또는 100% 동일성을 가지는 절편들 중 하나 또는 그 이상을 코드화할 수 있다. 발현 구성물(들)은 PB1 절편이 A/California 07/09로부터 유래될 때 A/California 07/09로부터의 HA 및/또는 NA 절편들을 코드화할 수 없다.
적어도 하나의 발현 구성물은 SEQ ID NO:22의 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있다.
어떤 구체예에서, 적어도 하나의 발현 구성물은 A/Texas/1/77 인플루엔자 균주로부터의 PB1 절편을 코드화하지 않는다.
방법은 추가로 (iv) 단계 (ii) 또는 단계 (iii)에서 얻어진 바이러스로 배양 숙주를 감염시키는 단계; (v) 단계 (iv)로부터의 배양 숙주를 배양하여 추가의 바이러스를 생성하는 단계; 및 임의로 (vi) 단계 (v)에서 얻어진 바이러스를 정제하는 단계를 포함할 수 있다.
발명은 또한 (a) 발명의 재배열 바이러스로 배양 숙주를 감염시키는 단계; (b) 단계 (a)로부터의 숙주를 배양하여 바이러스를 생성시키는 단계; 및 임의로 (c) 단계 (b)에서 얻어진 바이러스를 정제하는 단계를 포함하는, 인플루엔자 바이러스의 제조 방법을 제공한다.
발명은 또한 (d) 상기에서 기술된 구체예들 중 어느 하나의 방법에 의해 바이러스를 제조하는 단계 및 (e) 바이러스로부터 백신을 제조하는 단계를 포함하는, 백신의 제조 방법을 제공한다.
발명은 인플루엔자 A 바이러스의 절편들을 코드화하는 vRNA를 포함하는 하나 또는 그 이상의 발현 구성물(들)을 포함하는 발현 시스템을 제공하는데, 이때 발현 구성물(들)은 동일한 인플루엔자 HA 하위유형을 가지는 두 개의 상이한 인플루엔자 균주로부터의 HA 및 PB1 절편을 코드화하거나 상이한 인플루엔자 바이러스 HA 하위유형을 가지는 두 개의 상이한 인플루엔자 균주로부터의 HA 및 PB1 절편을 코드화하며, 이때 PB1 절편은 H3 HA 하위유형을 가지는 인플루엔자 바이러스로부터 유래되지 않고 및/또는 PB1 절편은 H1 또는 H5 HA 하위유형을 가지는 인플루엔자 바이러스로부터 유래되지 않는다.
발명은 또한 인플루엔자 A 바이러스의 절편들을 코드화하는 vRNA를 포함하는 하나 또는 그 이상의 발현 구성물(들)을 포함하는 발현 시스템을 제공하는데, 이때 발현 구성물(들)은 A/California/07/09의 PB1 절편을 코드화한다. 발현 구성물(들)은 추가로 PR8-X로부터의 PB2, NP, NS, M 및/또는 PA 절편들 중 하나 또는 그 이상을 코드화하는 vRNA를 포함할 수 있다. 그로써 발현 구성물(들)은 SEQ ID NO:9 및/또는 11 내지 14의 서열들과 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성, 적어도 99%의 동일성 또는 100%의 동일성을 가지는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 발현 구성물(들)은 PR8-X로부터의 PB2, NP, NS, M 및 PA 절편을 모두 코드화하는 것이 바람직하다.
발명은 또한 발명의 발현 시스템을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 이들 숙주 세포는 발현 시스템의 발현 구성물(들)로부터 인플루엔자 A 바이러스를 발현할 수 있다.
발명의 발현 시스템에 사용될 수 있는 발현 구성물들이 또한 제공된다. 예를 들어 발명은 동일한 구성물 상에서 발명에 따르는 재배열 인플루엔자 균주의 골격 절편을 코드화하는 발현 구성물을 제공한다.
공여 균주
인플루엔자 공여 균주는 전형적으로 재배열 인플루엔자 바이러스에 골격 절편들을 제공하는 균주이지만, 그것들은 때로는 또한 바이러스의 NA 절편을 제공할 수 있다. 그러나 통상적으로 재배열 인플루엔자 바이러스의 HA 및 NA 절편은 둘 다 HA 절편을 제공하는 인플루엔자 균주인 백신 균주로부터 유래될 것이다.
발명자들은 놀랍게도 동일한 HA 하위유형을 가지는 두 개의 상이한 인플루엔자 A 균주로부터의 HA 및 PB1 절편을 포함하는 재배열 인플루엔자 A 바이러스가 상이한 HA 하위유형을 갖는 바이러스로부터의 HA 및 PB1 절편을 포함하는 재배열 인플루엔자 바이러스에 비교하여 훨씬 더 빠르게 배양 숙주에서 성장할 수 있다는 것을 발견하였다. 이들 재배열 인플루엔자 바이러스는 바람직하게도 적어도 2개의 공여 균주로부터의 골결 절편들을 가진다.
동일한 HA 하위유형을 가지는 인플루엔자 바이러스의 PB1 절편은 통상 상이한 HA 하위유형을 가지는 인플루엔자 바이러스의 PB1 절편보다 더 높은 수준의 동일성을 가질 것이다. 예를 들어 H1 균주 A/California/07/09의 PB1 절편을 사용한 Blast 연구는 H1 HA 하위유형을 가지는 인플루엔자 균주들만이 PB1 절편에서 높은 동일성을 가진 것을 밝혀냈다. 마찬가지로, H3 균주 A/Wisconsin/67/2005의 PB1 절편을 사용한 Blast 연구는 H3 HA 하위유형을 가지는 인플루엔자 바이러스만이 이 바이러스의 PB1 절편에 대한 높은 수준의 동일성을 가진 것을 보여주었다.
발명자들은 적어도 두 개의 공여 균주로부터의 골격 절편들을 가지고 A/California/07/09로부터의 PB1 절편을 포함하는 재배열 인플루엔자 A 바이러스가 배양 숙주에서 특히 잘 성장하는 것을 추가로 발견하였다. 이들 재배열 인플루엔자 바이러스는 바람직하게는 적어도 두 개의 공여 균주로부터의 골격 균주를 가진다. 재배열 인플루엔자 바이러스는 A/California/07/09로부터의 PB1 절편과 H1 하위유형을 가지는 인플루엔자 바이러스의 HA 절편을 포함할 수 있다.
A/California/07/09의 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 절편을 함유하는 인플루엔자 바이러스가 또한 공여 균주로서 사용될 수 있다.
발명은 SEQ ID NO:9 내지 14 또는 21 내지 26의 서열에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 99%의 동일성을 가지는 바이러스 절편을 가지는 공여 균주로 실시될 수 있다. 예를 들어 유전자 코드의 축퇴성으로 인해, 상이한 서열을 가지는 여러 핵산에 의해 코드화된 동일한 폴리펩티드를 가지는 것이 가능하다. 그러므로 발명은 SEQ ID NO:1 내지 8 또는 15 내지 20의 서열과 동일한 폴리펩티드를 코드화하는 바이러스 절편들로 실시될 수 있다. 예를 들어 SEQ ID NO:31 및 32의 핵산 서열은 그것들이 동일한 바이러스 단백질을 코드화는 경우에도 단지 73%의 동일성을 가진다.
발명은 또한 SEQ ID NO:9 내지 22에 의해 코드화된 폴리펩티드 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 가지는 폴리펩티드를 코드화하는 바이러스 절편들로 실시될 수 있다.
DNA와 아미노산 서열의 변화는 또한 바이러스의 계대 중에 일어날 수 있는 자발적인 돌연변이로부터 유래될 수 있다. 그런 변이체 인플루엔자 균주 또한 발명에서 사용될 수 있다.
재배열 바이러스
발명은 둘 또는 그 이상의 인플루엔자 공여 균주로부터 골격 절편을 포함하는 재배열 인플루엔자 바이러스를 제공한다. 이들 재배열 인플루엔자 바이러스는 사이한 인플루엔자 A 균주로부터의 HA 절편 및 PB1 절편을 포함할 수 있지만, 단 HA 및 PB1 절편은 동일한 인플루엔자 바이러스 HA 하위유형을 가지는 인플루엔자 바이러스로부터 유래되어야 한다. 그것들은 또한 상이한 인플루엔자 바이러스 HA 하위유형을 가지는 상이한 인플루엔자 A 균주로부터의 HA 절편 및 PB1 절편을 포함할 수 있지만, PB1 절편은 H3 HA 하위유형을 가지는 인플루엔자 바이러스로부터 유래되지 않거나 및/또는 HA 절편은 H1 또는 H5 HA 하위유형을 가지는 인플루엔자 바이러스로부터 유래되지 않아야 한다.
추가로 A/California/07/09로부터의 PB1 절편을 포함하는 둘 또는 그 이상의 상이한 공여 균주로부터의 골격 절편을 가지는 재배열 인플루엔자 바이러스가 제공된다.
PB1 및 PB2 절편은 동일한 공여 균주로부터 유래될 수 있다.
인플루엔자 바이러스는 분할된 네거티브 가닥의 RNA 바이러스다. 인플루엔자 A 및 B 바이러스는 8개의 절편(NP, M, NS, PA, PB1, HA 및 NA)을 가지는 한편, 인플루엔자 C 바이러스는 7개를 가진다. 발명의 재배열 바이러스는 둘 또는 그 이상의 공여 균주로부터의 골격 절편들, 또는 A/California/07/09로부터의 적어도 하나(즉 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개)의 골격 바이러스 절편을 함유한다. 골격 바이러스 절편은 HA 또는 NA를 코드화하지 않는 것들이다. 그러므로 골격 절편은 전형적으로 인플루엔자 바이러스의 PB1, PB2, PA, NP, Mi, M2, NSi 및 NS2 폴리펩티드를 코드화할 것이다.
바이러스는 또한 예를 들어 참고문헌 6에 기술된 것과 같이 기능성 NS 단백질을 코드화하지 않는 NS 절편을 함유할 수 있다. 재배열 바이러스는 전형적으로 공여 균주로부터의 HA 및 NA를 코드화하는 절편을 함유하지 않겠지만, 발명의 공여 균주로부터의 두 가지 모두가 아니라 HA 또는 NA 중 어느 하나를 포함하는 재배열 바이러스가 또한 고려될 수 있다.
재배열 바이러스가 단일 공여 균주로부터의 골격 절편을 포함하는 재배열체일 때, 재배열 바이러스는 일반적으로 1:7, 2:6, 3:5, 4:4, 5:3, 6:2 또는 7:1의 비율로 공여 균주와 백신 균주로부터의 절편들을 포함할 것이다.
공여 균주로부터의 대부분의 절편을, 특히 6:2의 비율로 가지는 것이 전형적이다. 재배열 바이러스가 공여 균주로부터의 골격 절편을 포함할 때, 재배열 바이러스는 일반적으로 1:1:6, 1:2:5, 1:3:4, 1:4:3, 1:5:2, 1:6:1 , 2:1:5, 2:2:4, 2:3:3, 2:4:2, 2:5:1, 3:1:2, 3:2:1, 4:1:3, 4:2:2, 4:3:1, 5:1:2, 5:2:1 또는 6:1:1의 비율로 첫 번째 공여 균주, 두 번째 공여 균주 및 백신 균주로부터의 절편들을 포함할 것이다.
바람직하게는, 재배열 바이러스는 공여 균주의 HA 절편을 함유하지 않는데, 이것이 인플루엔자 바이러스의 주요 백신 항원을 코드화하고, 따라서 백신 균주로부터 유래해야 하기 때문이다. 그러므로 발명의 재배열 바이러스는 바람직하게는 적어도 HA 절편 및 전형적으로는 백신 균주로부터 HA 및 NA 절편을 가진다.
발명은 또한 하나 이상의 백신 균주로부터의 바이러스 절편을 포함하는 재배열체를 포함하는데, 이때 그 재배열체는 본 발명에 따르는 골격을 포함해야 한다. 예를 들어 재배열 인플루엔자 바이러스는 한 공여 균주로부터의 HA 절편 및 상이한 공여 균주로부터의 NA 절편을 포함할 수 있다.
발명의 재배열 바이러스는 야생형 백신 균주보다 더 높은 바이러스 역가로 성장할 수 있는데, 그것으로부터 재배열 바이러스의 바이러스 절편(들)의 일부가 동시에(예를 들어 12시간, 24시간, 48시간 또는 72시간) 및 동일한 성장 조건 하에서 유도된다. 바이러스 역가는 해당 기술분야에 공지된 표준 방법에 의해 측정될 수 있다. 발명의 재배열 바이러스는 동일한 시간틀에서 및 동일한 조건 하에서 야생형 백신 균주의 바이러스 역가보다 적어도 10% 더 높거나, 적어도 20% 더 높거나, 적어도 50% 더 높거나, 적어도 100% 더 높거나, 적어도 200% 더 높거나, 적어도 500% 더 높거나 또는 적어도 1000% 더 높은 바이러스 역가를 이룰 수 있다.
발명은 유행병뿐 아니라 유행기 사이의(계절성) 인플루엔자 백신 균주를 재배열하기에 적당하다. 재배열 인플루엔자 균주는 인플루엔자 A 바이러스 HA 하위유형 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 또는 H16을 함유할 수 있다. 그것들은 인플루엔자 A 바이러스 NA 하위유형 Nl, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 또는 N9를 함유할 수 있다. 발명의 재배열 인플루엔자 바이러스에 사용된 백신 균주가 계절성 인플루엔자 균주인 경우에, 백신 균주는 H1 또는 H3 하위유형을 가질 수 있다. 발명의 한 측면으로 백신 균주는 H1N1 또는 H3N2 균주이다. 재배열 인플루엔자 균주는 또한 인플루엔자 B 균주의 HA 절편을 함유할 수 있다.
발명에 사용하기 위한 백신 균주는 또한 유행병 균주 또는 잠재적으로 유행병 균주일 수 있다. 유행병 발생을 유발하도록 균주에 잠재력을 제공하는 유행병 인플루엔자 균주의 특성은 다음과 같다: (a) 현재 순환하는 인간 균주의 헤마글루티닌에 비교하여 새로운 헤마글루티닌, 즉 10년에 걸쳐 인간 집단에서 명백하지 않은 것(예컨대 H2)을 함유하거나, 또는 이전에는 인간 집단에서 전혀 찾아볼 수 없었던(예컨대 일반적으로 조류 집단에서만 발견되었던 H5, H6 또는 H9) 것이어서, 인간 집단은 균주의 헤마글루티닌에 대해 면역학적으로 원시적이 될 것이고; (b) 인간 집단에서 수평적으로 전파될 수 있으며; (c) 인간에 대해 병원성이다. H5 헤마글루티닌 유형을 가지는 백신 균주는 재배열 바이러스가 유행병 인플루엔자, 예컨대 H5N1 균주에 대해 면역시키기 위한 백신에 사용되는 경우에 바람직하다. 다른 가능한 균주로는 H5N3, H9N2, H2N2, H71 및 H7N7, 및 어떠한 다른 잠재적으로 유행병으로 떠오르는 균주들을 포함한다. 발명은 특히 비-인간 동물 집단으로부터 인간으로 확산될 수 있거나 확산된 잠재적인 유행병 바이러스 균주, 예를 들면 돼지-기원 H1N1 인플루엔자 균주에 대해 보호하기 위한 백신에 사용하기 위한 재배열 바이러스를 제조하기에 적당하다.
발명의 재배열 인플루엔자 균주는 California/4/09 균주로부터의 HA 절편 및/또는 NA 절편을 포함할 수 있다.
백신 균주로서 사용될 수 있는 균주는 내성 유행병 균주[8]를 포함하여, 항바이러스 요법에 내성인(예컨대 오셀타미비어[7] 및/또는 자나미비어에 대해 내성인) 균주들을 포함한다.
기능성 NS 단백질을 코드화하지 않는 NS 절편을 함유하는 재배열 바이러스는 또한 본 발명의 범주 내에 있다. NS1 녹아웃 돌연변이는 참고문헌 6에 기술되어 있다. 이들 NS1-돌연변이 바이러스 균주는 특히 살아있는 감쇄된 인플루엔자 백신의제조에 적당하다.
발명의 방법에 사용된 '두 번째 인플루엔자 균주'는 사용된 공여 균주와 상이하다.
역유전학
발명은 특히 역유전학 기법을 통한 발명의 재배열 인플루엔자 바이러스의 제조에 적당하다. 이들 기법에서, 바이러스는 발현 시스템을 사용하는 배양 숙주에서 제조된다.
한 측면으로, 발현 시스템은 동일한 HA 하위유형을 가지는 상이한 인플루엔자 균주들로부터의 HA 및 PB1 절편을 코드화할 수 있다. 그것은 또한 상이한 HA 하위유형을 가지는 상이한 인플루엔자 균주로부터의 HA 및 PB1 절편을 코드화하는데, PB1 절편은 H3HA 하위유형을 가지는 인플루엔자 바이러스로부터 유래하지 않거나 및/또는 HA 절편은 H1 또는 H5HA 하위유형을 가지는 인플루엔자 바이러스로부터 유래하지 않아야 한다. 발현 시스템은 A/California/07/09로부터의 PB1 절편을 코드화할 수 있다. 이들 구체예에서, 시스템은 다른 인플루엔자 공여 균주, 예를 들어 PR8-X로부터의 절편 NP, M, NS, PA 및/또는 PB2 중 적어도 하나를 코드화할 수 있다.
인플루엔자 A 및 B 바이러스에 대한 역유전학은 복제 및 전사를 개시하기 위해 필요한 4개의 단백질((PB1, PB2, PA 및 핵단백질) 및 8개의 바이러스 게놈 절편 전부를 발현하기 위해 12개의 플라스미드로 실시될 수 있다. 그러나 구성물의 수를 줄이기 위하여, 다수의 RNA 중합효소 I 전사 카세트(바이러스 RNA 합성에 대해)가 단일 플라스미드 상에 포함될 수 있고(예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 전부 8개의 인플루엔자 vRNA 절편), RNA 중합효소 II 프로모터를 가지는 다수의 단백질-코딩 영역(예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 인플루엔자 rnRNA 전사물을 코드화하는 서열)이 다른 플라스미드상에 있다[9]. 또한 pol I 프로모터의 제어 하에 하나 또는 그 이상의 인플루엔자 vRNA 및 동일한 플라스미드 상의 다른 프로모터, 특히 pol II 프로모터의 제어 하에 하나 또는 그 이상의 인플루엔자 단백질 코딩 영역을 포함하는 것도 가능하다. 이것은 바람직하게는 2-방향성 플라스미드를 사용함으로써 이루어진다.
참고문헌 9 방법의 바람직한 측면은 다음을 포함한다: (a) 단일 발현 구성물 상에 PB1, PB2 및 PA mRNA-코드화 영역; 및 (b) 단일 발현 구성물 상에 8개의 모든 vRNA 코드화 절편. 한 발현 구성물 상에 뉴라미니다제(NA) 및 헤마글루티닌(HA) 절편과 다른 발현 구성물 상에 6개의 다른 바이러스 절편을 포함하는 것은 특히 통상적으로 NA 및/또는 HA 절편에 돌연변이를 가지는 새롭게 떠오르는 인플루엔자 바이러스 균주로서 바람직하다. 그러므로 별도의 발현 구성물 상에 HA 및/또는 NA 절편을 가지는 장점은 HA 및 NA 서열을 포함하는 벡터만이 대체될 필요가 있다는 것이다. 그로써 발명의 한 측면으로, 백신 균주의 NA 및/또는 HA 절편은 한 발현 구성물 상에 포함될 수 있고, HA 및/또는 NA 절편(들)을 배제한 발명의 공여 균주(들)로부터의 vRNA 코드화 절편들은 상이한 발현 구성물 상에 포함된다. 그로써 발명은 발명의 공여 균주의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 vRNA 코드화 골격 바이러스 절편을 포함하는 발현 구성물을 제공한다. 발현 구성물은 기능성 HA 및/또는 NA 단백질을 생성하는 HA 및/또는 NA 바이러스 절편을 포함하지 않을 수 있다.
공지된 역유전학 시스템은 pol I 프로모터, 박테리아 RNA 중합효소 프로모터, 박테리오파지 중합효소 프로모터 등으로부터 원하는 바이러스 RNA(vRNA) 분자를 코드화하는 DNA 분자를 발현하는 것을 포함한다. 인플루엔자 바이러스가 생명주기를 개시하기 위하여 바이러스 중합효소의 존재를 필요로 하기 때문에, 시스템은 또한 이들 단백질을 제공할 수 있는데, 예컨대 시스템은 두 가지 유형의 DNA의 발현이 완전한 감염성 바이러스의 조립을 유도하도록 바이러스 중합효소 단백질을 코드화하는 DNA 분자를 추가로 포함한다. 바이러스 중합효소를 단백질로서 공급하는 것도 가능하다.
역유전학이 인플루엔자 vRNA의 발현에 사용되는 경우에, 해당 기술분야의 숙련자들에게는 상호 참조되는 서열 요소들의 정확한 공간배치가 복제를 개시하기 위한 중합효소에 중효하다는 것이 명백할 것이다. 그러므로 바이러스 RNA를 코드화하는 DNA 분자가 pol I 프로모터와 종결 서열 사이에 정확하게 배치되는 것이 중요하지만, 이런 배치는 역유전학 시스템을 사용하여 작업하는 사람들의 능력 내에 있다.
재조합 바이러스를 제조하기 위하여, 세포는 비리온을 조립하는 데 필요한 바이러스 게놈의 모든 절편을 발현해야 한다. 본 발명의 발현 구성물에 클론된 DNA는 바람직하게는 모든 바이러스 RNA 및 단백질을 제공하지만, 비록 헬퍼 바이러스를 사용하지 않는 시스템이 바람직하긴 해도 RNA와 단백질의 일부를 제공하는 헬퍼 바이러스를 사용하는 것도 가능하다. 인플루엔자 바이러스가 분할된 바이러스기 때문에, 바이러스 게놈은 통상적으로 발명의 방법에서 하나 이상의 발현 구성물을 사용하여 발현될 것이다. 그러나 또한 단일 발현 구성물 상에 바이러스 게놈의 하나 또는 그 이상의 절편 또는 심지어 모든 절편을 조합하는 것도 고려된다.
어떤 구체예에서, 숙주 세포에서 부속 단백질의 발현을 유도하는 발현 구성물이 또한 포함될 것이다. 예를 들어 역유전학 시스템의 일부로서 비-바이러스 세린 프로테아제(예컨대 트립신)를 발현시키는 것이 유익할 수 있다.
발현 구성물
발명의 발현 시스템에 사용된 발현 구성물은 일-방향성 또는 이방향성 발현 구성물일 수 있다. 하나 이상의 이식유전자가 방법에 사용되는 경우(동일하거나 상이한 발현 구성물 상에서) 일-방향성 및/또는 이방향성 발현을 사용하는 것이 가능하다.
인플루엔자 바이러스는 감염성을 위해 단백질을 필요로 하기 때문에, 일반적으로 이-방향성 발현 구성물을 사용하는 것이 바람직한데, 왜냐하면 이것이 숙주 세포에 의해 요구되는 발현 구성물의 총 수를 감소시키기 때문이다. 그러므로, 발명의 방법은 유전자 또는 cDNA가 상류의 pol II 프로모터와 하류의 비-내인성 pol I 프로모터 사이에 위치한 적어도 하나의 이-방향성 발현 구성물을 활용할 수 있다. pol II 프로모터로부터 유전자 또는 cDNA의 전사는 단백질로 번역될 수 있는 캡핑된 포지티브-센스 바이러스 mRNA를 생성하는 한편, 비-내인성 pol I 프로모터로부터의 전사는 네거티브-센스 vRNA를 생성한다. 이-방향성 발현 구성물은 이-방향성 발현 벡터일 수 있다.
이-방향성 발현 구성물은 동일한 구성물로부터 상이한 방향으로(즉 5'에서 3'으로 및 3'에서 5'으로) 발현을 구동하는 적어도 두 개의 프로모터를 함유한다. 두 개의 프로모터는 동일한 이중 가닥의 DNA의 상이한 가닥에 작동가능하게 연결될 수 있다. 바람직하게는, 프로모터들 중 하나는 pol I 프로모터이고 다른 프로모터들 중 적어도 하나는 pol II 프로모터이다. 이것은 pol I 프로모터가 캡핑되지 않은 vRNA를 발현하기 위해 사용될 수 있는 한편 pol II 프로모터는 계속해서 단백질로 번역될 수 있는 mRNA를 전사하기 위해 사용될 수 있고, 그로써 동일한 구성물로부터 RNA 및 단백질의 동시 발현을 허용할 수 있기 때문에 유용하다. 하나 이상의 발현 구성물이 발현 시스템 내에서 사용되는 경우에, 프로모터들은 내인성 및 비-내인성 프로모터의 혼합물일 수 있다.
발현 구성물에 사용된 pol I 및 II 프로모터들은 숙주 세포가 유도되는 동일한 분류 순서로부터 유기체에 대해 내인성일 수 있다. 다르게는, 프로모터들은 숙주 세포와 상이한 분류 순서로 유기체로부터 유도될 수 있다. 용어 "순서"는 종래의 분류상의 등급을 말하는 것으로, 순서의 예시는 영장류, 설치류, 육식 동물류, 유대목류, 고래류 등이다. 인간과 침팬지는 동일한 분류 순서에 있지만(영장류), 인간과 개는 상이한 순서에 있다(영장류 대 육식 동물류). 예를 들어 인간 pol I 프로모터는 개의 세포(예컨대 MDCK 세포)에서 바이러스 절편을 발현하기 위해 사용될 수 있다[10].
발현 구성물은 전형적으로 RNA 전사 종결 서열을 포함할 것이다. 종결 서열은 내인성 종결 서열 또는 숙주 세포에 대해 내인성이 아닌 종결 서열일 수 있다. 적당한 종결 서열은 해당 기술분야의 숙련자들에게 명백할 것이고, 그것에 한정되는 것은 아니지만 RNA 중합효소 I 전사 종결 서열, RNA 중합효소 II 전사 종결 서열 및 리보자임을 포함한다. 나아가, 발현 구성물은 mRNA에 대한 하나 또는 그 이상의 폴리아데닐화 신호를, 그것의 발현이 pol II 프로모터에 의해 제어되는 유전자의 단부에 함유할 수 있다.
발현 시스템은 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11 또는 적어도 12개의 발현 구성물을 함유할 수 있다.
발현 구성물은 벡터, 예컨대 플라스미드 또는 다른 에피솜성 구성물일 수 있다. 그런 벡터는 전형적으로 적어도 하나의 박테리아 및/또는 진핵생물 복제 기원을 포함할 것이다. 나아가, 벡터는 원핵세포 또는 진핵세포에서의 선택을 허용하는 선택가능한 마커를 포함할 수 있다. 그런 선택가능한 마커의 예시로는 항생물질에 대한 내성을 부여하는 유전자, 예컨대 암피실린 또는 카나마이신이다. 벡터는 추가로 DNA 서열의 클로닝을 용이하게 하기 위한 하나 또는 다수의 클로닝 부위를 포함할 수 있다.
대안으로서, 발현 구성물은 선형 발현 구성물일 수 있다. 그런 선형 발현 구성물은 전형적으로 어떠한 증폭 및/또는 선택 서열을 함유하지 않을 것이다. 그러나 그런 증폭 및/또는 선택 서열을 포함하는 선형 구성물 또한 본 발명의 범주 내에 있다. 참고문헌 11은 각 바이러스 절편에 대한 개별적인 선형 발현 구성물을 묘사하는 선형 발현 구성물을 기술한다. 또한 하나 이상, 예를 들면 2, 3, 4, 5 또는 6개의 바이러스 절편을 동일한 선형 발현 구성물 상에 포함하는 것도 가능하다. 그런 시스템은 예를 들면 참고문헌 12에 기술되어 있다.
발현 구성물은 해당 기술분야에 알려져 있는 방법들을 사용하여 생성될 수 있다. 그런 방법들은 예를 들면 참고문헌 13에 기술되어 있다. 발현 구성물이 선형 발현 구성물인 경우에, 그것을 숙주 세포에 도입시키기 전에 단일 제한 효소 부위를 활용하여 선형화하는 것이 가능하다. 다르게는, 적어도 두 개의 제한 효소 부위를 사용하여 벡터로부터 발현 구성물을 잘라내는 것이 가능하다. 나아가 또한 핵산 증폭 기법을 사용하여(예컨대 PCR에 의해) 그것을 증폭시킴으로써 선형 발현 구성물을 얻는 것도 가능하다.
발명의 시스템에 사용된 발현 구성물은 비-박테리아 발현 구성물일 수 있다. 이것은 구성물이 그 안에 코드화된 바이러스 RNA 절편의 진핵세포에서의 발현을 구동시킬 수 있지만, 박테리아에서의 구성물의 증식에 필요할 성분들을 포함하지 않은 것을 의미한다. 그러므로 구성물은 박테리아 복제 기원(ori)을 포함하지 않을 것이며, 보통은 박테리아 선택 마커(예컨대 항생물질 내성 마커)를 포함하지 않을 것이다. 그런 발현 구성물은 참고로 포함되는 참고문헌 14에서 기술된다.
발현 구성물은 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 발현 구성물은 화학적 합성에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 제조될 수 있다. 화학적 합성에 의해 발현 구성물을 제조하기에 적당한 방법은 예를 들면 참고로 포함되는 참고문헌 14에서 기술된다.
발명의 발현 구성물은 해당 기술분야의 숙련자들에게 알려져 있는 어떠한 기법을 사용하여 숙주 세포 안에 도입될 수 있다. 예를 들어 발명의 발현 구성물은 일렉트로포레이션, DEAE-덱스트란, 칼슘 포스페이트 침전, 리포솜, 마이크로주입 또는 마이크로입자-폭발을 사용함으로써 숙주 세포 안에 도입될 수 있다.
세포
본 발명에 사용하기 위한 배양 숙주는 관심의 바이러스를 생성할 수 있는 어떠한 진핵세포일 수 있다. 발명은 전형적으로 셀라인을 사용하겠지만, 예를 들어 일차 세포도 대안으로서 사용될 수 있다. 세포는 전형적으로 포유류 또는 조류의 것일 수 있다. 적당한 포유류 세포로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 햄스터, 소, 영장류(인간 및 원숭이를 포함함) 및 개의 세포를 포함한다. 다양한 세포 유형이 사용될 수 있는데, 예컨대 신장 세포, 섬유아세포, 망막 세포, 폐 세포 등이 사용될 수 있다. 적당한 햄스터 세포의 예시는 BHK21 또는 HKCC로 명명되는 셀라인이다. 적당한 원숭이 세포는 예컨대 아프리카 녹색 원숭이 세포, 예컨대 베로 셀라인에서와 같은 신장 세포이다[15 내지 17]. 적당한 개 세포는 예컨대 CLDK 및 MDCK 셀라인에서와 같은 신장 세포이다.
추가로 적당한 세포는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 CHO; 293T; BHK; MRC 5; PER.C6 [18]; FRhL2; WI-38 등을 포함한다. 적당한 세포는 예컨대 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션(ATCC)[19]으로부터, Coriell Cell Repositories[20]로부터 또는 European Collection of Cell Cultures(ECACC)로부터 광범위하게 입수가능하다. 예를 들어 ATCC는 카탈로그 번호 CCL 81, CCL 81.2, CRL 1586 및 CRL-1587 하에 다양한 상이한 베로 세포를 공급하고, 카탈로그 번호 CCL34 하에 MDCK 세포를 공급한다. PER.C6는 기탁 번호 96022940 하에 ECACC로부터 입수가능하다.
발명에 사용하기에 바람직한 세포는 Madin Darby 개의 신장으로부터 유도된 MDCK 세포이다[21 내지 23]. 원래의 MDCK 세포는 ATCC로부터 CCL 34로서 입수가능하다. MDCK 세포의 유도체가 사용되는 것이 바람직하다. 그런 유도체는 예를 들면 참고문헌 21에 기술되었는데, 그 참고문헌은 현탁 배양물에서의 성장을 위해 적응된 MDCK 세포를 개시한다('MDCK 33016' 또는 '33016-PF', DSM ACC 2219로서 기탁됨; 참고문헌 21 참조). 나아가, 참고문헌 24는 혈청이 없는 배양물에서 현탁액으로 성장하는 MDCK-유도 세포를 개시한다("B-702", FERM BP-7449로서 기탁됨). 어떤 구체예에서, 사용된 MDCK 셀라인은 종양형성원일 수 있다. 또한 비-종양형성 MDCK 세포를 사용하는 것도 고려된다. 예를 들어 참고문헌 25는 비 종양형성 MDCK 세포, 이를테면 'MDCK-S'(ATCC PTA-6500), 'MDCK-SF101'(ATCC PTA-6501), 'MDCK-SF102'(ATCC PTA-6502) 및 'MDCK-SF103'(ATCC PTA-6503)을 개시한다. 참고문헌 26은 'MDCK.5F1' 세포(ATCC CRL 12042)를 포함하여, 감염에 대해 높은 민감성을 가지는 MDCK 세포를 개시한다.
본 발명의 방법을 시행하기 위하여 하나 이상의 세포 유형의 혼합물을 사용하는 것이 가능하다. 그러나, 발명의 방법은 단일 세포 유형, 예컨대 단클론성 세포를 사용하여 시행되는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에 사용된 세포는 단일 셀라인으로부터 유래된다. 나아가, 동일한 셀라인은 바이러스를 재배열하기 위해 및 바이러스의 어떠한 후속적인 증식을 위해 사용될 수 있다.
바람직하게는, 세포는 오명물의 통상적인 공급원을 피하기 위하여 혈청 없이 배양된다. 진핵세포 배양을 위한 다양한 혈청-없는 배지가 해당 기술분야의 숙련자들에게 알려져 있다(예컨대 이스코브스 배지, 울트라 CHO 배지(BioWhittaker), EX-CELL(JRH Biosciences)). 나아가, 단백질-없는 배지도 사용될 수 있다(예컨대 PF-CHO(JRH Biosciences)). 그렇지 않으면, 복제용 세포는 또한 관례적인 혈청-함유 배지(예컨대 MEM 또는 0.5% 내지 10%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM 배지)에서 배양될 수 있다.
세포는 점착 배양물로 또는 부유 상태로 존재할 수 있다.
관례적 재배열
전통적으로 인플루엔자 바이러스는 배양 숙주, 통상적으로 알을 공여 균주와 백신 균주로 공-감염시킴으로써 재배열된다. 재배열 바이러스는 백신 균주의 HA 및/또는 NA 단백질을 함유하는 재배열 바이러스를 선택하기 위하여 공여 균주의 HA 및/또는 NA 단백질에 대한 특이성을 가지는 항체를 첨가함으로써 선택된다. 이 처리를 여러 계대 거치면 빠르게 성장하는, 백신 균주의 HA 및/또는 NA 단백질을 함유하는 재배열 바이러스를 선택할 수 있다.
발명은 이들 방법에 사용하기에 적당하다. 상이한 HA 및/또는 NA 하위유형을 가지는 백신 균주를 사용하는 것이 이것이 재배열 바이러스에 대한 선택을 용이하게 하기 때문에 공여 균주(들)과 비교하여 더 쉬울 수 있다. 그러나, 또한 공여 균주(들)로서, 및 발명의 어떤 측면에서는 그것이 바람직하게 때문에 동일한 HA 및/또는 NA 하위유형을 가지는 백신 균주를 사용하는 것도 가능하다. 이 경우, 공여 균주(들)의 HA 및/또는 NA 단백질에 대해 바람직한 특이성을 가지는 항체들이 활용될 수 있어야 한다.
바이러스 제조
한 구체예에서, 발명은 (a) 발명의 재배열 바이러스로 배양 숙주를 감염시키는 단계; (b) 단계 (a)로부터의 숙주를 배양하여 바이러스를 제조하는 단계; 및 (c) 단계 (b)에서 제조된 바이러스를 정제하는 단계를 포함하는 인플루엔자 바이러스의 제조 방법을 제공한다.
배양 숙주는 세포 또는 부화 계란일 수 있다. 발명의 이 측면에서 세포가 배양숙주로서 사용되는 경우, 세포 배양 조건(예컨대 온도, 세포 밀도, pH 값 등)은 사용된 셀라인 및 바이러스에 대해 광범위에 걸쳐 가변적이고 용도의 필요조건에 따라 조정될 수 있다. 그러므로 다음의 정보는 단순히 지침을 나타낸다.
상기 언급된 것과 같이, 세포는 바람직하게는 혈청-없는 또는 단백질-없는 배지에서 배양된다.
세포의 증식은 해당 기술분야의 숙련자들에게 알려져 있는 방법들을 따라 수행될 수 있다. 예를 들어 세포는 원심분리 또는 여과와 같은 통상적인 지지체 방법을 사용하여 관류 시스템에서 배양될 수 있다. 더욱이 세포는 발명에 따라 감염 전 공급-배치 시스템에서 증식될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 배양 시스템은 세포는 초기에 배치 시스템으로 배양되고 배지 중의 영양소(또는 영양소의 일부)의 고갈은 농축된 영양소의 조절된 공급에 의해 보충되는 공급-배치 시스템으로 언급된다. 감염 전 세포의 증식 중에 배지의 pH 값은 pH 6.6 내지 pH 7.8의 값, 특히 pH 7.2와 pH 7.3의 값으로 조정되는 것이 유익할 수 있다. 세포의 배양은 바람직하게는 30 내지 40℃의 온도에서 일어난다. 감염된 세포에서 배양될 때(단계 b), 세포는 바람직하게는 30℃ 내지 36℃의 온도에서 또는 32℃ 내지 34℃ 또는 33℃에서 배양된다. 이것은, 이런 온도 범위에서의 감염 세포의 인큐베이션이 백신으로 제형될 때 개선된 효율을 유발하는 바이러스의 제조를 유발한다고 밝혀졌기 때문에 특히 바람직하다[27].
산소 부분압력은 감염 전 배양 중에, 바람직하게는 25% 내지 95%의 값으로, 특히 35% 내지 60%의 값으로 조정될 수 있다. 발명의 맥락에서 서술된 산소 부분압력에 대한 값은 공기의 포화도를 토대로 한다. 세포의 감염은 배치 시스템에서 약 8 내지 25x105 세포/mL, 바람직하게는 배치 시스템에서 약 5 내지 20x106 세포/mL의 세포 밀도에서 일어난다. 세포는 10-8 내지 10, 바람직하게는 0.0001 내지 0.5의 바이러스 용량(MOI 값, "감염 다중도"; 감염 시점에서 세포당 바이러스 유닛의 수에 해당함)으로 감염될 수 있다.
바이러스는 점착 배양물로 또는 부유 상태로 세포 상에서 성장할 수 있다. 마이크로담체 배양물이 사용될 수 있다. 그러므로 어떤 구체예에서, 세포는 부유 상태로의 성장에 대해 조정될 수 있다.
발명에 따르는 방법은 또한 바이러스 또는 그것에 의해 생성된 단백질의 수확 및 분리를 포함한다. 바이러스 또는 단백질의 분리 중에, 세포는 배양 배지로부터 분리, 여과 또는 한외여과와 같은 표준 방법들에 의해 분리된다. 바이러스 또는 단백질은 그런 다음 해당 기술분야의 숙련자들에게 충분히 알려져 있는 방법들, 예컨대 구배 원심분리, 여과, 침전, 크로마토그래피 등에 따라 농축된 후 정제된다. 또한 발명에 따르면 바이러스는 정제 중이나 후에 비활성화되는 것이 바람직하다. 바이러스 비활성화는 정제과정 내의 어느 시점에서든지, 예를 들면 β-프로피오락톤 또는 포름알데하이드에 의해 일어날 수 있다.
배양 숙주는 알일 수 있다. 백신을 위한 인플루엔자 바이러스 성장에 대한 현재의 표준 방법은 부화된 SPF 계란을 사용하는데, 바이러스는 알 내용물(요막액)로부터 정제된다. 또한 알을 통해 바이러스를 계대시키고 계속해서 그것을 세포 배양물에서 증식시키는 것과 그 역도 가능하다.
백신
발명은 백신을 제조하기 위한 방법에 따라 제조된 바이러스를 활용한다.
백신(특히 인플루엔자 바이러스에 대한 백신)은 일반적으로 살아있는(생) 바이러스 또는 비활성화된 바이러스 중 어느 하나를 토대로 한다. 비활성화된 백신은 전체 비리온, '분열(split)' 비리온 또는 정제된 표면 항원을 토대로 할 수 있다. 항원은 또한 비로좀의 형태로 제공될 수 있다. 발명은 이들 백신 유형 중 어느 것이든지 제조를 위해 사용될 수 있다.
비활성화된 바이러스가 사용되는 경우, 백신은 전체 비리온, 분열 비리온 또는 정제된 표면 항원을 포함할 수 있다(인플루엔자에 대해서는 헤마글루티닌을 포함하고, 통상적으로 뉴라미니다제도 포함한다). 바이러스를 비활성화하기 위한 화학적인 수단은 유효량의 다음 제제들 중 하나 또는 그 이상으로 처리하는 것을 포함한다: 계면활성제, 포름알데하이드, β-프로피오락톤, 메틸렌블루, 소랄렌, 카르복시풀러렌(C60), 바이너리(binary) 에틸아민, 아세틸 에틸렌아민 또는 그것들의 조합. 바이러스 비활성화의 비-화학적 방법은 해당 기술분야에 알려져 있는데, 예를 들면 UV 광 또는 감마선 조사이다.
비리온은 바이러스-함유 유체, 예컨대 요막액이나 세포 배양 상층액으로부터 다양한 방법에 의해 수확될 수 있다. 예를 들어 정제 과정은 비리온을 파괴하기 위해 계면활성제를 포함하는 선형 슈크로스 구배 용액을 사용하는 띠 원심분리를 포함할 수 있다. 그런 다음 항원은 다이아필트레이션에 의한 임의의 희석 후에 정제될 수 있다.
스플릿 비리온은 하위비리온 제제를 제조하기 위하여 정제된 비리온을 계면활성제(예컨대 에틸 에테르, 폴리소르베이트 80, 데옥시콜레이트, 트라이-N-부틸 포스페이트, 트리톤 X-100, 트리톤 N101, 세틸트라이메틸암모늄 브로마이드, Tergitol NP9 등)로 처리함으로써, 이를테면 '트윈-에테르' 분열 공정에 의해 얻어진다. 인플루엔자 바이러스를 분할하는 방법들은 예를 들면 해당 기술분야에 잘 알려져 있다. 참고문헌 28 내지 33 참조. 바이러스의 분할은 전형적으로 감염성이거나 비-감염성인 전체 바이러스를 파괴 농도의 분열제로 파괴하거나 단편화시킴으로써 수행된다. 분열은 바이러스 단백질의 전체 또는 부분적인 용해를 유발하여 바이러스의 통합성을 변경시킨다. 바람직한 분열제는 비-이온성 및 이온성(예컨대 양이온성) 계면활성제, 예를 들면 알킬글리코시드, 알킬싸이오글리코시드, 아실 슈가, 설포베타인, 베타인, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, N,N-다이알킬-글루카미드, 헤카메그, 알킬페녹시-폴리에톡시에탄올, NP9, 4차 암모늄 화합물, 사르코실, CTAB(세틸 트라이메틸 암모늄 브로마이드), 트라이-N-부틸 포스페이트, 세타블론, 미리스틸트라이메틸암모늄 염, 리포펙틴, 피로펙타민, 및 DOT-MA, 옥틸- 또는 노닐페녹시 폴리옥시에탄올(예컨대 트리톤 계면활성제, 예컨대 트리톤 X-100 또는 트리톤 N101), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르(트윈 계면활성제), 폴리옥시에틸렌 에테르, 폴리옥시에틸렌 에스테르 등이다. 유용한 한 가지 분열 과정은 나트륨 데옥시콜레이트 및 포름알데하이드의 연속 효과를 사용하고, 분열은 초기 비리온 정제 중에(예컨대 슈크로스 밀도 구배 용액 중에서) 일어날 수 있다. 그러므로 분열 과정은 비리온-함유 물질의 정화(비-비리온 물질의 제거를 위함), 수확된 비리온의 농축(예컨대 흡착 방법, 예컨대 CaHPO4 흡착을 사용함), 비-비리온 물질로부터 전체 비리온의 분리, 밀도 구배 원심분리 단계에서 분열제를 사용한 비리온의 분열(예컨대 나트륨 데옥시콜레이트와 같은 분열제를 함유한 슈크로스 구배를 사용함), 및 바람직하지 않은 물질을 제거하기 위한 여과(예컨대 한외여과)를 포함한다. 분열 비리온은 인산 나트륨-완충된 등장성 염화나트륨 용액에 유용하게 재현탁될 수 있다. 분열 인플루엔자 백신의 예시는 EGRIVACTM, FLUARIXTM, FLUZONETM 및 FLUSHIELDTM 제품이다.
정제된 인플루엔자 바이러스 표면 항원 백신은 표면 항원 헤마글루티닌, 및 전형적으로 또한 뉴라미니다제를 포함한다. 이들 단백질을 정제된 형태로 제조하기 위한 방법은 해당 기술분야에 잘 알려져 있다. FLUVIRINTM, AGRIPPALTM and INFLUVACTM 제품은 인플루엔자 하위유닛 백신이다.
비활성화된 항원의 다른 형태는 비로좀이다[34](핵산 없는 바이러스-형 리포솜성 입자). 비로좀은 바이러스를 계면활성제로 용해시킨 후 이어서 뉴클레오캡시드를 제거하고 바이러스 당단백질을 함유하는 막을 재구성함으로써 제조될 수 있다. 비로좀을 제조하기 위한 대체 방법은 바이러스 막 당단백질을 과잉량의 인지질에 첨가하여 그것의 막에 바이러스 단백질을 가지는 리포좀을 얻는 것이다.
발명의 방법은 또한 생백신을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 그런 백신은 보통 비리온-함유 유체로부터 비리온을 정제함으로써 제조된다. 예를 들어 유체는 원심분리에 의해 정화되고, 완충제(예컨대 슈크로스, 인산 칼륨 및 일나트륨 글루타메이트 함유)로 안정화된다. 다양한 형태의 인플루엔자 바이러스 백신이 현재 입수가능하다(예컨대 참고문헌 35의 제 17 및 18장 참조). 생바이러스 백신은 Medlmmune의 FLUMISTTM 제품(3가 생바이러스 백신)을 포함한다.
바이러스는 감쇄될 수 있다. 바이러스는 온도-민감성일 수 있다. 바이러스는 저온-적응될 수 있다. 이들 세 가지 특징은 특히 생바이러스를 항원으로서 사용할 때 유용하다.
HA는 현재 비활성화된 인플루엔자 백신의 주요 면역원이고, 백신 용량은 전형적으로 SRID에 의해 측정된 HA 수준을 참조하여 표준화된다. 기존의 백신은 전형적으로 균주당 약 15㎍의 HA를 함유하지만, 예컨대 아동에 대해서, 또는 유행병 상황에서, 또는 보조제를 사용할 때에는 더 낮은 용량이 사용될 수 있다. 부분 용량, 예컨대 1/2(즉 균주당 7.5㎍의 HA), 1/4 및 1/8이 더 많은 용량처럼 (예컨대 3회 또는 9회 용량[36, 37]) 사용되었다. 그로써 백신은 인플루엔자 균주당 0.1 내지 150㎍, 바람직하게는 0.1 내지 50㎍, 예컨대 0.1 내지 20㎍, 0.1 내지 15㎍, 0.1 내지 10㎍, 0.1 내지 7.5㎍, 0.5 내지 5㎍ 등의 HA를 포함할 수 있다. 특정 용량은 균주당 예컨대 약 45, 약 30, 약 15, 약 10, 약 7.5, 약 5, 약 3.8, 약 3.75, 약 1.9, 약 1.5 등을 포함한다.
생백신의 경우, 용량은 HA 함량보다는 중간 조직 배양 감염성 용량(TCID50)에 의해 측정되고, 균주당 106 내지 108(바람직하게는 106.5 내지 107.5)의 TCID50이 전형적이다.
발명과 함께 사용된 인플루엔자 균주들은 야생형 바이러스에서 발견되는 것과 같은 천연 HA, 또는 변형 HA를 가질 수 있다. 예를 들어 조류 종에서 매우 병원성인 바이러스를 유발하는 결정기(예컨대 HA1/HA2 절단 부위 주변의 초-염기성 영역)를 제거하기 위하여 HA를 변형시키는 것이 알려져 있다. 역유전학의 사용은 그런 변형을 용이하게 한다.
발명의 조성물은 유행기 사이의 균주에 대한 면역화에 적당할 뿐만 아니라, 특히 유행병 또는 잠재적으로 유행병 균주에 대한 면역화에 유용하다. 발명은 비-인간 동물뿐 아니라 인간의 백신접종에 적당하다.
그것의 항원이 조성물에 유용하게 포함되는 다른 균주들은 유행병 내성 균주[39]를 포함하여 항바이러스 요법에 내성인(예컨대 오셀타미비어[38] 및/또는 자나미비어에 대해 내성인) 균주들이다.
발명의 조성물은 하나 또는 그 이상(예컨대 1, 2, 3, 4 또는 그 이상)의 인플루엔자 바이러스 균주, 이를테면 인플루엔자 A 바이러스 및/또는 인플루엔자 B 바이러스로부터의 항원(들)을 포함할 수 있는데, 단 적어도 하나의 인플루엔자 균주가 발명의 재배열 인플루엔자 균주여야 한다. 적어도 2, 적어도 3 또는 모든 항원이 발명의 재배열 인플루엔자 균주로부터 유래되는 조성물이 또한 고려된다. 백신이 하나 이상의 인플루엔자 균주를 포함하는 경우에, 상이한 균주들은 전형적으로 별도로 성장되고 바이러스가 수확되고 항원이 제조된 후에 혼합된다. 그로써 발명의 방법은 하나 이상의 인플루엔자 균주로부터의 항원들을 혼합하는 단계를 포함할 수 있다. 두 개의 인플루엔자 A 바이러스 균주 및 하나의 인플루엔자 B 바이러스 균주로부터의 항원을 포함하는 3가 백신이 전형적이다. 두 개의 인플루엔자 A 바이러스 균주 및 두 개의 인플루엔자 B 바이러스 균주, 또는 세 개의 인플루엔자 A 바이러스 균주 및 하나의 인플루엔자 B 바이러스 균주로부터의 항원을 포함하는 4가 백신 또한 유용하다[40].
약학적 조성물
발명에 따라 제조된 백신 조성물은 약학적으로 허용된다. 그런 조성물은 보통 항원 외의 성분들을 포함하는데, 예컨대 조성물은 전형적으로 하나 또는 그 이상의 약학적 담체(들) 및/또는 부형제(들)을 포함한다. 아래에서 기술되는 것과 같이, 보조제가 또한 포함될 수 있다. 그런 성분들에 대한 철저한 논의는 참고문헌 41에서 활용할 수 있다.
백신 조성물은 일반적으로 수성 형태일 수 있다. 그러나 일부 백신은 건조 형태로, 예컨대 주입가능한 고체 형태로 또는 패치 상의 건조되거나 중합된 제제 형태일 수 있다.
백신 조성물은 싸이오머살 또는 2-페녹시에탄올과 같은 보존제를 포함할 수 있다. 그러나 백신은 실질적으로 수은 물질이 없어야 하고(예컨대 5㎍/ml 미만), 예컨대 싸이오머살이 없어야 하는 것이 바람직하다[32, 42]. 수은을 함유하지 않는 백시니 보다 바람직하다. α-토코페폴 석시네이트가 수은 화합물에 대한 대체물로서 포함될 수 있다[32]. 보존제가 없는 백신이 특히 바람직하다.
등장성을 조절하기 위하여, 생리 염, 예컨대 나트륨 염을 포함하는 것이 바람직하다. 염화나트륨(NaCl)이 바람직한데, 그것은 1 내지 20mg/ml로 존재할 수 있다. 존재할 수 있는 다른 염은 염화칼륨, 인산 이수소 칼륨, 인산 이나트륨 탈수화물, 염화마그네슘, 염화칼슘 등을 포함한다.
다양한 조성물은 일반적으로 200 mOsm/kg 내지 400 mOsm/kg, 바람직하게는 240 내지 360 mOsm/kg, 보다 바람직하게는 290 내지 360 mOsm/kg의 범위에 속하는 오스몰 농도를 가질 것이다. 오스몰 농도는 이미 백신접종에 의해 유발된 통증에는 영향을 미치지 않는 것으로 보고되었지만[43], 그럼에도 불구하고 이 범위로 오스몰 농도를 유지하는 것이 바람직하다.
백신 조성물은 하나 또는 그 이상의 완충제를 포함할 수 있다. 전형적인 완충제는 다음을 포함한다: 인산염 완충제; 트리스 완충제; 보레이트 완충제; 석시네이트 완충제; 히스티딘 완충제(특히 알루미늄 하이드록사이드 보조제를 포함함); 또는 시트레이트 완충제. 완충제는 전형적으로 5 내지 20 mM 범위로 포함될 것이다.
백신 조성물의 pH는 일반적으로 5.0 내지 8.1, 보다 전형적으로는 6.0 내지 8.0, 예컨대 6.5 내지 7.5 또는 7.0 내지 7.8일 것이다. 그러므로 발명의 방법은 패키징 전에 벌크 백신의 pH를 조정하는 단계를 포함할 수 있다.
백신 조성물은 바람직하게는 멸균된다. 백신 조성물은 바람직하게는 비-발열원성, 예컨대 용량당 <1 EU(내독소 유닛, 표준 척도), 바람직하게는 용량당 <0.1 EU를 함유한다. 백신 조성물은 바람직하게는 글루텐이 없다.
발명의 백신 조성물은 특히 분열 또는 표면 항원 백신에 대해 계면활성제, 예컨대 폴리옥시에틸렌 솔비탄 에스테르 계면활성제('트윈스'로 알려져 있음), 옥토자이놀(예컨대 옥토자이놀-9(트리톤 X-100) 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올), 세틸 트라이메틸 암모늄 브로마이드('CTAB') 또는 나트륨 데옥시콜레이트를 포함할 수 있다. 계면활성제는 단지 미량으로 존재할 수 있다. 그러므로 백신은 각각 1 mg/ml 미만의 옥토자이놀-10 및 폴리소르베이트 80을 포함할 수 있다. 미량 중의 다른 잔여 성분들은 항생물질일 수 있다(예컨대 네오마이신, 카나마이신, 폴리믹신 B).
백신 조성물은 단일 면역화를 위한 물질을 포함하거나 다중 면역화를 위한 물질(예컨대 "다중용량" 키트)을 포함할 수 있다. 다중용량 배열에서는 보존제의 포함이 바람직하다. 다중용량 조성물에 보존제를 포함시키는 것에 대한 대안으로서(또는 그것에 더불어), 조성물은 물질의 제거를 위해 멸균 어댑터를 가지는 용기에 함유될 수 있다.
인플루엔자 백신은 전형적으로 약 0.5ml의 단위용량 부피로 투여되지만, 그것의 절반의 용량(즉 약 0.25ml)이 아동에게 투여될 수 있다.
조성물 및 키트는 바람직하게는 2 내지 8에서 보관된다. 조성물은 냉동되지 않아야 한다. 조성물은 이상적으로는 직사광선을 피해서 보관되어야 한다.
숙주 세포
DNA
바이러스가 분리되고 및/또는 셀라인 상에서 성장된 경우에, DNA의 어떠한 잠재적인 발암성 활성을 최소화하기 위하여, 최종 백신 중에 잔류하는 셀라인 DNA의 양을 최소화하는 것이 표준적인 실시이다.
그러므로 발명에 따라 제조된 백신 조성물은 바람직하게는 10ng 미만(바람직하게는 1ng 미만, 보다 바람직하게는 100pg 미만)의 잔류 숙주 세포 DNA를 함유하지만, 미량의 숙주 세포 DNA가 존재할 수 있다.
어떠한 잔류 숙주 세포 DNA의 평균 길이는 500bp 미만, 예컨대 400bp 미만, 300bp 미만, 200bp 미만, 100bp 미만 등인 것이 바람직하다.
오염 DNA는 백신 제조 중에 표준 정제 과정, 예컨대 크로마토그래피 등을 사용하여 제거될 수 있다. 잔류 숙주 세포 DNA의 제거는 예컨대 DNase를 사용함으로써 뉴클레아제 처리에 의해 증강될 수 있다. 숙주 세포 DNA 오염을 감소시키기 위한 편리한 방법은 참고문헌 44 및 45에 개시되며, 2-단계 처리를 포함하는데, 첫 번째는 바이러스 성장 중에 사용될 수 있는 DNase(예컨대 벤조나제)를 사용하고, 그런 다음 비리온 파괴 중에 사용될 수 있는 양이온성 계면활성제(예컨대 CTAB)를 사용한다. 알킬화제, 예컨대 β-프로피오락톤을 사용한 처리 또한 숙주 세포 DNA를 제거하기 위해 사용될 수 있고, 또한 비리온을 비활성화하기 위해 유익하게 사용될 수 있다[46].
보조제
발명의 조성물은 유익하게 보조제를 포함할 수 있고, 그것은 그 조성물을 수용하는 대상에서 유도된 면역 반응(체액성 및/또는 세포성)을 증강시키기 위해 기능할 수 있다. 바람직한 보조제는 수-중-유 에멀션을 포함한다. 다양한 그런 보조제가 알려져 있고, 그것들은 전형적으로 적어도 하나의 오일과 적어도 하나의 계면활성제를 포함하는데, 오일(들)과 계면활성제(들)은 생체 내 분해가능하고(대사가능함) 및 생체에 부합할 수 있다. 에멀션 중의 오일 방울은 일반적으로 직경이 5㎛ 미만이고, 이상적으로는 마이크론보다 작은 직경을 가지며, 이렇게 작은 크기는 안정한 에멀션을 제공하기 위한 마이크로유동화기로 수행된다. 220nm보다 작은 크기를 가지는 방울이 바람직한데, 그것들에 대해 필터 멸균이 수행될 수 있기 때문이다.
에멀션은 동물(예컨대 물고기) 또는 식물 공급원으로부터 유래한 오일과 같은 오일을 포함할 수 있다. 식물유에 대한 공급원은 땅콩류, 씨앗류 및 곡물류를 포함한다. 땅콩유, 대두유, 코코넛유 및 올리브유가 가장 통상적으로 활용되는 예시적인 땅콩 오일이다. 예컨대 호호바 콩으로부터 얻어진 호호바 오일이 사용될 수 있다. 씨앗 오일은 홍화유, 면실유, 해바라기씨유, 참기름 등을 포함한다. 곡물 그룹에서는 옥수수유가 가장 쉽게 활용될 수 있지만, 다른 곡물, 예컨대 밀, 귀리, 호밀, 쌀, 테프, 라이밀 등의 오일도 또한 사용될 수 있다. 글리세롤과 1,2-프로판다이올의 6 내지 10 탄소 지방산 에스테르는 씨앗 오일에서 자연적으로 발생하지는 않지만, 땅콩 및 씨앗 오일로부터 출발한 적절한 물질의 가수분해, 분리 및 에스테르화에 의해 제조될 수 있다. 포유류 젖으로부터의 지방 및 오일은 대사가능하고, 따라서 발명의 실시에 사용될 수 있다. 동물 공급원으로부터 순수한 오일을 얻기 위해 필요한 분리, 정제, 비누화에 대한 과정 및 다른 수단들은 해당 기술분야에 잘 알려져 있다. 대부분의 물고기는 쉽게 회수될 수 있는 대사가능한 오일을 함유한다. 예를 들어 대구 간유, 상어 간유 및 고래 기름, 예컨대 경랍은 본원에서 사용될 수 있는 여러 물고기 기름을 예시한다. 많은 분지된 사슬 오일은 5-탄소 아이소프렌 유닛으로 생화학적으로 합성되고 일반적으로 테르페노이드로 언급된다. 상어 간유는 본원에서 특히 바람직한, 스쿠알렌, 2,6,10,15,19,23-헥사메틸-2,6,10,14,18,22-테트라코사헥산으로서 알려져 있는 분지된 불포화 테르페노이드를 함유한다. 스쿠알렌에 대한 포화 유사체인 스쿠알란 또한 바람직한 오일이다. 스쿠알렌과 스쿠알란을 포함하여 물고기 오일은 상업적인 공급원으로부터 쉽게 입수가능하거나 해당 기술분야에 공지되어 있는 방법에 의해 얻어질 수 있다. 다른 바람직한 오일은 α-토코페롤(아래 참조)이다.
오일의 혼합물이 사용될 수 있다.
계면활성제는 그것들의 'HLB'(친수기/친유기 평형)에 의해 분류될 수 있다. 발명의 바람직한 계면활성제는 적어도 10, 바람직하게는 적어도 15, 보다 더 바람직하게는 적어도 16의 HLB를 가진다. 발명은 그것들에 한정되는 것은 아니지만 다음을 포함하는 계면활성제와 함께 사용될 수 있다: 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제(통상 Tween으로 언급된다), 특히 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80; DOWFAXTM 상표로 시판되는 에틸렌 옥사이드(EO), 프로필렌 옥사이드(PO) 및/또는 부틸렌 옥사이드(BO)의 공중합체, 예컨대 선형 EO/PO 블록 공중합체; 반복되는 에톡시(옥시-1,2-에탄다이일) 기의 수가 다를 수 있는 옥토자이놀, 옥토자이놀-9(트리톤 X-100 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올)이 특히 관심을 끌고; (옥틸페녹시)폴리에톡시에탄올(IGEPAL CA-630/NP-40); 인지질, 예컨대 포스파티딜콜린(레시틴); 노닐페놀 에톡실레이트, 예컨대 TergitolTM NP 시리즈; 라우릴, 세틸, 스테아릴 및 올레일 알코올로부터 유도된 폴리옥시에틸렌 지방 에테르(Brij 계면활성제로서 알려져 있음), 예컨대 트라이에틸렌글리콜 모노라우릴 에테르(Brij 30); 및 소르비탄 에스테르(통상 SPAN으로서 알려져 있음), 예컨대 소르비탄 트라이올레에이트(SPAN 85) 및 소르비탄 모노라우레이트. 비-이온성 계면활성제가 바람직하다. 에멀션에 포함되는 바람직한 계면활성제는 Tween 80(폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트), Span 85(소르비탄 트라이올레에이트), 레시틴 및 트리톤 X-100이다.
계면활성제의 혼합물, 예컨대 Tween 80/Span 85 혼합물이 사용될 수 있다. 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르, 예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트(Tween 80)와 옥토자이놀, 예컨대 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올(트리톤 X-100)의 조합이 또한 적당하다. 다른 유용한 조합은 라우레쓰 9 + 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 및/또는 옥토자이놀을 포함한다.
계면활성제의 바람직한 양(중량%)은 다음과 같다: 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르(예컨대 Tween 80) 0.01 내지 1%, 특히 약 0.1%; 옥틸- 또는 노닐페녹시 폴리옥시에탄올(예컨대 트리톤 X-100, 또는 트리톤 시리즈의 다른 계면활성제) 0.001 내지 0.1%, 특히 0.005 내지 0.02%; 폴리옥시에틸렌 에테르(예컨대 라우레쓰 9) 0.1 내지 20%, 바람직하게는 0.1 내지 10%, 특히 0.1 내지 1% 또는 약 0.5%.
백신이 분열 바이러스를 함유하는 경우, 그것은 수성상으로 자유 계면활성제를 함유하는 것이 바람직하다. 이것은 자유 계면활성제가 항원에 대해 "분열 효과"를 발휘하고, 그로써 그렇지 않은 경우 존재할 수 있을 어떠한 미분열 비리온 및/또는 비리온 응집체를 파괴할 수 있기 때문에 유익하다. 이것은 분열 바이러스 백신의 안전성을 개선시킬 수 있다[47].
바람직한 에멀션은 <1㎛, 예컨대 ≤750nm, ≤500nm, ≤400nm, ≤300nm, ≤250nm, ≤220nm, ≤200nm 또는 더 작은 평균 방울 크기를 가질 수 있다. 이런 방울 크기는 편리하게도 마이크로유동화와 같은 기법에 의해 이루어질 수 있다.
발명에 사용하기에 유용한 구체적인 수-중-유 에멀션 보조제는, 그것들에 한정되지는 않지만 다음을 포함한다:
● 스쿠알렌, Tween 80 및 Span 85의 마이크론 미만의 에멀션. 부피에 의한 에멀션의 조성은 약 5% 스쿠알렌, 약 0.5% 폴리소르베이트 80 및 약 0.5% Span 85일 수 있다. 중량의 관점에서 이들 비율은 4.3% 스쿠알렌, 0.5% 폴리소르베이트 80 및 0.5% Span 85이 된다. 이 보조제는 'MF59'[61-]로서 알려져 있고, 참고문헌 63의 제 10장 및 64의 제 12장에서 보다 상세하게 설명된다. MF59 에멀션은 유익하게도 시트레이트 이온, 예컨대 10mM의 나트륨 시트레이트 완충재를 포함한다.
● 스쿠알렌, 토코페롤 및 폴리소르베이트 80의 에멀션. 에멀션은 포스페이트 완충된 식염수를 포함할 수 있다. 이들 에멀션은 2 내지 10% 스쿠알렌, 2 내지 10% 토코페롤 및 0.3 내지 3% Tween 80을 가질 수 있고, 스쿠알렌 토코페롤의 중량비는 바람직하게는 <1(예컨대 0.900인데, 그 이유는 이 비율이 보다 안정한 에멀션을 제공하기 때문이다. 스쿠알렌과 폴리소르베이트 80은 약 5:2의 부피비 또는 약 11:5의 중량비로 존재할 수 있다. 그로써 세 가지 성분(스쿠알렌, 토코페롤, 폴리소르베이트 80)은 1068:1186:485 또는 대략 55:61:25 정도의 중량비로 존재할 수 있다. 한 가지 그런 에멀션('ASO3')은 PBS에 Tween 80을 녹여 2% 용액을 만든 후, 이 용액 90ml을 (5g의 DL-α-토코페롤과 5ml의 스쿠알렌)의 혼합물과 혼합한 다음, 그 혼합물을 마이크로유동화함으로써 만들어질 수 있다. 그 결과의 에멀션은 마이크론 미만의 오일 방울, 예컨대 평균 직경이 100 내지 250 nm, 바람직하게는 약 180 nm인 오일 방울을 가질 수 있다. 에멀션은 또한 3-데-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A(3d MPL)를 포함할 수 있다. 이 유형의 다른 유용한 에멀션은 인간 용량당 0.5 내지 10mg의 스쿠알렌, 0.5 내지 11mg의 토코페롤 및 0.1 내지 4mg의 폴리소르베이트 80[53]을, 예컨대 상기 논의된 비율로 포함할 수 있다.
● 스쿠알렌, 토코페롤 및 트리톤 계면활성제(예컨대 트리톤 X-100)의 에멀션. 에멀션은 또한 3d-MPL(하기 참조)을 포함할 수 있다. 에멀션은 포스페이트 완충제를 함유할 수 있다.
● 폴리소르베이트(예컨대 폴리소르베이트 80), 트리톤 계면활성제(예컨대 트리톤 X-100) 및 토코페롤(예컨대 α-토코페롤 석시네이트)을 포함하는 에멀션. 에멀션은 이들 3가지 성분을 약 75:11:10(예컨대 750 ㎍/ml의 폴리소르베이트 80, 110 ㎍/ml의 트리톤 X-100 및 100 ㎍/ml의 α-토코페롤 석시네이트)의 중량 비율로 포함할 수 있고, 이들 농도는 항원으로부터 이들 성분의 어떠한 분포도 포함해야 한다. 에멀션은 또한 스쿠알렌을 포함할 수 있다. 에멀션은 또한 3d-MPL(아래 참조)을 포함할 수 있다. 수성 상은 포스페이트 완충제를 함유할 수 있다.
● 스쿠알렌, 폴리소르베이트 80 및 폴로옥사머 401("PluronicTM L121")의 에멀션. 에멀션은 포스페이트 완충된 식염수, pH 7.4에서 제형될 수 있다. 이 에멀션은 뮤라밀 다이펩티드에 대한 유용한 전달 비히클이고, "SAF-1' 보조제[54](0.05 내지 1% Thr-MDP, 5% 스쿠알렌, 2.5% 플루로닉 L121 및 0.2% 폴리소르베이트 80)에 쓰레오닐-MDP와 함께 사용되었다. 그것은 또한 "AF" 보조제[55](5% 스쿠알렌, 1.25% 플루로닉 L121 및 0.2% 폴리소르베이트 80)에서와 같이 Thr-MDP 없이 사용될 수 있다. 마이크로유동화가 바람직하다.
● 스쿠알렌, 수성 용매, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 친수성 비이온성 계면활성제(예컨대 폴리옥시에틸렌 (12) 세토스테아릴 에테르) 및 소수성 비이온성 계면활성제(예컨대 소르비탄 에스테르 또는 만니드 에스테르, 예컨대 소르비탄 모노올레에이트 또는 'Span 80')를 포함하는 에멀션. 에멀션은 바람직하게는 열가역적이거나 및/또는 적어도 90%의, 크기가 200 nm 미만인 오일 방울들(부피에 의함)을 포함한다[56]. 에멀션은 또한 알디톨; 저온보호제(예컨대 당, 예컨대 도데실말토시드 및/또는 슈크로오스); 및/또는 알킬폴리글리코시드 중 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 에멀션은 TLR4 아고니스트를 포함할 수 있다[57]. 그런 에멀션은 동결건조될 수 있다.
● 스쿠알렌, 폴록사머 105 및 Abil-Care의 에멀션[58]. 보조용 백신 중의 이들 성분의 최종 농도(중량)는 5% 스쿠알렌, 4% 폴록사머 105 (플루로닉 폴리올) 및 2% Abil-Care 85이다(Bis-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16 다이메티콘; 카프릴릭/카프릭 트라이글리세리드).
● 0.5 내지 50%의 오일, 0.1 내지 10%의 인지질 및 0.05 내지 5%의 비-이온성 계면활성제를 가지는 에멀션. 참고문헌 59에 기술된 것과 같이, 바람직한 인지질 성분은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤, 포스파티드산, 스핑고미엘린 및 카디오리핀이다. 마이크론 미만의 방울 크기가 유익하다.
● 비-대사성 오일(예컨대 광미네랄유) 및 적어도 하나의 계면활성제(예컨대 레시틴, Tween 80 또는 Span 80)의 마이크론 미만의 수-중-유 에멀션. 첨가제, 예컨대 QuilA 사포닌, 콜레스테롤, 사포닌-친유성 포합체(예컨대 참고문헌 60에 기술되고 지방족 아민을 데스아실사포닌에 글루쿠론산의 카르복실 기를 통해 첨가함으로써 제조된 GPI-0100), 다이메틸다이옥타데실암모늄 브로마이드 및/또는 N,N-다이옥타데실-N,N-비스 (2-하이드록시에틸)프로판다이아민이 포함될 수 있다.
● 사포닌(예컨대 QuilA 또는 QS21) 및 스테롤(예컨대 콜레스테롤)이 나선형 미셸로서 결합된 에멀션[61].
● 미네랄 오일, 비-이온성 친유성 에톡실화된 지방 알코올 및 비-이온성 친수성 계면활성제(예컨대 에톡실화된 지방 알코올 및/또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체)를 포함하는 에멀션[62].
● 미네랄 오일, 비-이온성 친유성 에톡실화된 지방 알코올 및 비-이온성 친유성 계면활성제(예컨대 에톡실화된 지방 알코올 및/또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체)를 포함하는 에멀션[62].
어떤 구체예에서, 에멀션은 전달시에 항원과 즉석으로 혼합될 수 있고, 그로써 보조제 및 항원은 패키징되었거나 분배된 백신에 별도로 유지될 수 있으며, 사용시 최종 제형에 대해 준비된다. 다른 구체예에서, 에멀션은 제조 중에 항원과 혼합되고, 그로써 조성물은 액체 보조된 형태로 패키징된다. 항원은 일반적으로 수성 형태로 있어서 백신이 최종적으로 두 개의 액체를 혼합함으로써 제조된다. 혼합되는 두 액체의 부피 비율은 다를 수 있지만(예컨대 5:1 내지 1:5) 일반적으로는 약 1:1이다. 성분들의 농도가 구체적인 에멀션에 대한 상기 설명에서 주어지는 경우, 이들 농도는 희석되지 않은 조성물에 대해 전형적이며, 그로써 항원 용액과의 혼합 후 농도는 감소될 것이다.
백신 조성물의 패키징
발명의 조성물에 적당한 용기(또는 키트 성분)는 바이알, 주사기(예컨대 일회용 주사기), 코용 스프레이 등을 포함한다. 이들 용기는 멸균되어야 한다.
조성물/성분이 바이알에 배치되는 경우, 바이알은 바람직하게는 유리 또는 플라스틱 물질로 만들어진다. 바이알은 바람직하게는 조성물이 바이알에 첨가되기 전에 멸균된다. 라텍스-민감성 환자가 겪는 문제점들을 피하기 위하여, 바이알은 바람직하게는 라텍스-없는 마개로 밀봉되며, 모든 패키징 물질에서 라텍스가 없는 것이 바람직하다. 바이알은 단일 용량의 백신을 포함하거나, 1회 이상의 용량('다중용량' 바이알), 예컨대 10회 용량을 포함할 수 있다. 바람직한 바이알은 무색 유리로 만들어진다.
바이알은 미리 충전된 주사기가 캡 안으로 삽입될 수 있어서, 주사기의 내용물이 바이알 안으로 밀려들어가고(예컨대 그 안의 동결건조된 물질을 재구성하기 위해) 바이알의 내용물이 주사기 안으로 제거될 수 있도록 적응된 캡(예컨대 Luer 락)을 가질 수 있다. 바이알로부터 주사기가 제거된 다음, 바늘이 부착되어 환자에게 조성물이 투여될 수 있다. 캡은 바람직하게는 밀봉 또는 커버 안에 배치되어 밀봉 또는 커버가 캡이 접근하기 전에 제거되어야 한다. 바이알은 특히 다중용량 바이알에 대해, 그것의 내용물의 멸균 제거를 허용하는 캡을 가질 수 있다.
성분이 주사기 안으로 패키징되는 경우, 주사기는 그것에 부착된 바늘을 가질 수 있다. 만약 바늘이 부착되지 않으면, 별도의 바늘이 조립 및 사용을 위해 주사기와 함께 공급될 수 있다. 그런 바늘은 케이스에 들어있을 수 있다. 안전 바늘이 바람직하다. 1-인치 23-게이지, 1-인치 25-게이지 및 5/8-인치 25-게이지 바늘이 전형적이다. 주사기에는 기록 유지를 용이하게 하기 위해 그 위에 롯트 번호, 인플루엔자 계절 및 내용물의 유효기간이 인쇄될 수 있는, 벗겨질 수 있는 라벨이 제공될 수 있다. 주사기의 플런저는 바람직하게는 흡인 중에 갑자기 플런저에서 쏟아지는 것을 방지하기 위한 마개를 가진다. 주사기는 라텍스 고무 캡 및/또는 플런저를 가질 수 있다. 일회용 주사기는 단일 용량의 백신을 함유한다. 주사기는 일반적으로 주사기의 부착 전에 팁을 밀봉하기 위한 팁 캡을 가질 것이고, 이 팁 캡은 바람직하게는 부틸 고무로 만들어진다. 만약 주사기와 바늘이 별도로 패키징된다면, 바늘은 바람직하게는 부틸 고무 쉴드로 피팅된다. 바람직한 주사기는 상표명 "팁-록(Tip-Lok)"TM으로 시판되는 것들이다.
용기는 예컨대 아동에게의 전달을 용이하게 하기 위하여 절반의 투여량을 나타내기 위해 표시될 수 있다. 예를 들어 0.5ml 용량을 함유하는 주사기는 0.25ml 부피를 나타내는 표시가 있을 수 있다.
유리 용기(예컨대 주사기 또는 바이알)가 사용되는 경우, 소다 석회 유리로부터 만들어진 것보다는 보로실리케이트 유리로부터 만들어진 용기를 사용하는 것이 바람직하다.
키트 또는 조성물은 백신의 상세한 설명, 예컨대 투여를 위한 지시사항, 백신 내 항원의 상세한 설명 등을 포함하는 소책자와 함께 패키징될 수 있다(예컨대 동일한 박스 안에). 지시사항은 또한 예컨대 백신접종에 이어지는 아나필락시 반응의 경우 쉽게 활용할 수 있는 아드레날린 용액을 유지하기 위한 경고 등을 함유할 수 있다.
치료 방법 및 백신의 투여
발명은 발명에 따라 제조된 백신을 제공한다. 이들 백신 조성물은 인간 또는 비-인간 동물 대상, 예컨대 돼지 또는 새들에 투여하기에 적당하고, 발명은 발명의 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 면역반응을 일으키는 방법을 제공한다. 발명은 또한 의약으로서 사용하기 위한 발명의 조성물을 제공하며, 대상에서 면역반응을 일으키기 위한 의약의 제조에 사용하기 위한 발명의 조성물의 용도를 제공한다.
이들 방법 및 용도에 의해 발생된 면역반응은 일반적으로 항체 반응, 바람직하게는 보호성 항체 반응을 포함할 것이다. 인플루엔자 바이러스 백신접종 후 항체 반응, 중화 능력 및 보호를 평가하기 위한 방법은 해당 기술분야에 잘 알려져 있다. 인간 연구는 인간 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌에 대한 항체 역가가 보호와 상관이 있음을 나타냈다(약 30 내지 40의 혈청 샘플 혈구 응집반응-억제 역가는 상동성 바이러스에 의한 감염으로부터 대략 50% 보호를 제공한다)[63]. 항체 반응은 전형적으로 혈구 응집반응 억제에 의해, 마이크로중화에 의해, 단일 방사상 면역확산(SRID)에 의해 및/또는 단일 방사상 용혈(SRH)에 의해 측정된다. 이들 측정 기법들은 해당 기술분야에 잘 알려져 있다.
발명의 조성물은 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 가장 바람직한 면역화 경로는 근육 내 주입(예컨대 팔 또는 다리 안으로)에 의한 것이지만, 다른 활용가능한 경로는 피하 주사, 비강 내[64 내지 66], 경구[67], 피내[68, 69], 피부 관통, 경피[70] 등을 포함한다.
발명에 따라 제조된 백신은 아동과 성인을 모두 치료하기 위해 사용될 수 있다. 인플루엔자 백신은 현재 주기적으로 및 6개월 이후 성인 면역화에 사용하도록 권장된다. 그러므로 인간 대상은 1세 미만, 1 내지 5세, 5 내지 15세, 15 내지 55세 또는 적어도 55세일 수 있다. 백신을 수용하기에 바람직한 대상은 고령자(예컨대 ≥50세, ≥60세 및 바람직하게는 ≥65세), 어린이(예컨대 ≤5세), 입원 중인 환자, 의료계 종사자, 군속 및 장병, 임산부, 만성 질환자 또는 면역결핍 환자들, 백신을 받기 전 7일 전에 항바이러스 화합물(예컨대 오셀타미비어 또는 자나미비어 화합물; 아래 참조)을 받은 대상, 계란 알러지가 있는 사람들 및 외국 여행중인 사람들이다. 백신은 이들 그룹에 대해서는 단독 사용이 적당하지 않지만, 집단에서는 보다 일반적으로 사용될 수 있다. 유행병 균주에 대해, 모든 연령군에 대한 투여가 바람직하다.
발명의 바람직한 조성물은 성인(18 내지 60세)에서 효능에 대한 CPMP 기준의 1,2 또는 3을 만족시키는데, 이들 기준은 (1) ≥70%의 항체방어; (2) ≥40%의 혈청전환; 및/또는 (3) ≥2.5-배의 GMT 증가이다. 고령자(>60세)에서 이들 기준은 (1) ≥60%의 항체방어; (2) ≥30%의 혈청전환; 및/또는 (3) ≥2-배의 GMT 증가이다. 이들 기준은 적어도 50명의 환자를 포함한 개방 라벨 연구를 토대로 한다.
치료는 단일 용량 스케줄이거나 다중 용량 스케줄에 의할 것일 수 있다. 다중 용량은 일차 면역화 스케줄에서 및/또는 부스터 면역화 스케줄에서 사용될 수 있다. 다중 용량 스케줄에서 다양한 용량은 동일하거나 상이한 경로에 의해, 예컨대 비경구 프라임 및 점막 부스트, 점막 프라임 및 비경구 부스트 등에 의해 제공될 수 있다. 1회 용량 이상(전형적으로 2회 용량)의 투여는 특히 면역학적으로 원시적인 환자들에서 유용한데, 예를 들면 이전에 인플루엔자 백신을 전혀 받아보지 못한 사람들, 또는 새로운 HA 하위유형(유행병 발생시처럼)에 대해 백신접종된 경우에 유용하다. 다중 용량은 전형적으로 적어도 1주 간격으로(예컨대 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 6주, 약 8주, 약 10주, 약 12주, 약 16주 등) 투여될 것이다.
발명에 의해 제조된 백신은 실질적으로 다른 백신과 동시에(예컨대 동일한 의료 상담 중에 또는 의료 전문가 또는 예방접종 센터에 방문시), 예컨대 실질적으로 홍역 백신, 볼거리 백신, 풍진 백신, MMR 백신, 수두 백신, MMRV 백신, 디프테리아 백신, 파상풍 백신, 백일해 백신, DTP 백신, 포합된 H. 인플루엔자 b형 백신, 비활성화된 폴리오바이러스 백신, B형 간염 바이러스 백신, 수막염구균 포합체 백신(예컨대 4가 A-C-W135-Y 백신), 호흡기 세포융합 바이러스 백신, 폐렴구균 포합체 백신 등과 동시에 투여될 수 있다. 폐렴구균 백신 및/또는 수막염구균 백신과 실질적으로 동시에 투여하는 것이 고령 환자에서는 특히 유용하다.
유사하게, 발명의 백신은 실질적으로 항바이러스 화합물, 특히 인플루엔자 바이러스에 대하여 활성인 항바이러스 화합물(예컨대 오셀타미비어 및/또는 자나미비어)과 동시에(예컨대 동일한 의료 상담 중에 또는 의료 전문가 또는 예방접종 센터에 방문시) 환자에게 투여될 수 있다. 이들 항바이러스는 뉴라미니다제 억제제, 예컨대 (3R,4R,5S)-4-아세틸아미노-5-아미노-3(1-에틸프로폭시)-1-사이클로헥센-1-카르복실산 또는 5-(아세틸아미노)-4-[(아미노이미노메틸)-아미노]-2,6-안하이드로-3,4,5-트라이데옥시-D-글리세로-D-갈락토논-2-에논산, 그것의 에스테르(예컨대 에틸 에스테르) 및 그것의 염(예컨대 포스페이트 염)을 포함한다. 바람직한 항바이러스는 (3R,4R,5S)-4-아세틸아미노-5-아미노-3(1-에틸프로폭시)-1-사이클로헥센-1-카르복실산, 에틸 에스테르, 오셀타미비어 포스페이트(TAMIFLUTM)로서도 알려져 있는 포스페이트(1:1)이다.
일반적 사항
용어 "포함하는"은 "포함하는"뿐 아니라 "이루어진"을 포함하는데, 예를 들면 X를 "포함하는" 조성물은 배타적으로 X로 구성될 수 있거나 추가의 어떤 것, 예컨대 X+Y를 포함할 수 있다.
단어 "실질적으로"는 "완전히"를 배제하지 않는데, 예를 들면 Y가 "실질적으로 없는" 조성물은 완전히 Y가 없을 수 있다. 필요하다면 단어 "실질적으로"는 발명의 정의로부터 생략될 수 있다.
수치 x와 관련하여 용어 "약"은 임의적인 것이고, 예를 들면 x±10%를 의미한다.
특수하게 명시되지 않는 한, 둘 또는 그 이상의 성분들을 혼합하는 단계를 포함하는 방법은 어떠한 특별한 혼합 순서를 필요로 하지 않는다. 그러므로 성분들은 어떠한 순서로든 혼합될 수 있다. 세 가지 성분이 있다면 두 가지 성분이 상호 조합된 후에 그 조합이 세 번째 성분과 조합될 수 있는 식이다.
방법의 다양한 단계들은 동시에 또는 상이한 시간에, 동일하거나 상이한 지리적 위치에서, 예컨대 나라에서, 동일하거나 상이한 사람들 또는 개체에 의해 수행될 수 있다.
동물(및 특히 소)의 물질이 세포 배양에 사용되는 경우, 그 물질들은 전염성 해면상 뇌병증(TSE)가 없는, 특히 광우병(BSE)이 없는 공급원으로부터 얻어져야 한다. 전체적으로 동물-유도 물질이 없는 세포를 배양하는 것이 바람직하다.
화합물이 조성물의 일부로서 신체에 투여되면 그 화합물은 다르게는 적당한 선구약물에 의해 대체될 수 있다.
두 개의 아미노산 서열 사이의 백분율 서열 동일성에 대한 언급은 배열되었을 때, 아미노산의 백분율이 두 서열을 비교할 때 동일한 것을 의미한다. 이 배열 및 % 상동성 또는 서열 동일성은 해당 기술분야에 공지되어 있는 소프트웨어 프로그램, 예를 들면 참고문헌 71의 단원 7.7.18에 기술된 것들을 사용하여 측정될 수 있다. 바람직한 배열은 12의 갭 오픈 페널티와 2의 갭 연장 페널티, 62의 BLOSUM 매트릭스를 포함하는 아핀 갭 연구를 사용하는 Smith-Waterman 상동성 연구 알고리즘에 의해 측정될 수 있다. Smith-Waterman 상동성 연구 알고리즘은 참고문헌 72에서 교시된다.
두 개의 핵산 서열 사이의 백분율 서열 동일성에 대한 언급은 배열되었을 때, 염기의 백분율이 두 서열을 비교할 때 동일한 것을 의미한다. 이 배열 및 % 상동성 또는 서열 동일성은 해당 기술분야에 공지되어 있는 소프트웨어 프로그램, 예를 들면 참고문헌 71의 단원 7.7.18에 기술된 것들을 사용하여 측정될 수 있다. 바람직한 배열 프로그램은 GCG Gap(Genetics Computer Group, Wisconsin, Suite Version 10.1)으로, 바람직하게는 오픈 갭=3과 연장 갭=1과 같은 디폴트 매개변수를 사용한다.
도 1은 (A) 유행병-유사 H1 균주(균주 1) 또는 (B) 두 번째 유행병-유사 균주(균주 2)로부터의 HA 및 NA 절편을 가지는 PR8-X 또는 #21 골격 중 어느 하나를 함유하는 역유전학-유도된 6:2 재배열체로 감염된 MDCK 세포 배양물로부터 감염 후 60시간 후에 수확된 슈크로스 구배-정제된 바이러스의 HA 함량(렉틴-포획 ELISA에 의해 측정됨)을 비교한다. 도 1a 및 1b에서, 민무늬 막대는 대조표준으로서의 참조 백신 균주(WHO-Collaborating Centre-공급된 균주로부터 유도됨)를 나타내고, 점무늬 막대는 PR8-X 골격을 함유하는 재배열 바이러스를 나타내며, 체크무늬 막대는 #21 골격을 함유하는 재배열 바이러스를 나타낸다. y-축은 ㎍/ml의 HA 수율을 나타낸다.
도 2는 (A) 전-유행병 H1 균주(균주 1) 및 (B) 두 번째 전-유행병 균주(균주 2)로부터의 HA 및 NA 절편을 가지는 PR8-X 또는 #21 골격 중 어느 하나를 함유하는 역유전학-유도된 6:2 재배열체로 감염된 MDCK 세포 배양물로부터 감염 후 60시간 후에 수확된 미정제 바이러스의 HA 함량(렉틴-포획 ELISA에 의해 측정됨)을 비교한다. 도 2a 및 2b에서, 민무늬 막대는 대조표준으로서의 참조 백신 균주(WHO-Collaborating Centre-공급된 균주로부터 유도됨)를 나타내고, 점무늬 막대는 PR8-X 골격을 함유하는 재배열 바이러스를 나타내며, 체크무늬 막대는 #21 골격을 함유하는 재배열 바이러스를 나타낸다. y-축은 ㎍/ml의 HA 수율을 나타낸다.
도 3은 H3 균주(균주 1)로부터의 HA 및 NA 절편을 가지는 PR8-X 또는 #21 골격 중 어느 하나를 함유하는 역유전학-유도된 6:2 재배열체로 감염된 MDCK 세포 배양물로부터 감염 후 60시간 후에 수확된 슈크로스-정제된 바이러스의 HA 수율(HPLC에 의해 측정됨)을 비교한다. 민무늬 막대는 대조표준으로서의 참조 백신 균주(WHO-Collaborating Centre-공급된 균주로부터 유도됨)를 나타내고, 점무늬 막대는 PR8-X 골격을 함유하는 재배열 바이러스를 나타내며, 체크무늬 막대는 #21 골격을 함유하는 재배열 바이러스를 나타낸다. y-축은 ㎍/ml의 HA 수율을 나타낸다.
도 4는 유행병-유사 H1 균주(균주 2)로부터의 HA 및 NA 절편을 가지는 PR8-X 또는 #21 골격 중 어느 하나로 만들어진 역유전학-유도된 6:2 재배열 바이러스 또는 참조 백신 균주로 감염된 부화 계란으로부터 감염 후 60시간 후에 수확된 바이러스의 바이러스 역가(초점 형성 분석(FFA)에 의해 측정됨; 도 4a) 및 HA 역가(렉틴-포획 ELISA에 의해 측정됨; 도 4b)를 비교한다. 도 4a에서, 개별적인 점은 단일 알로부터의 데이터를 나타낸다. 선은 개별적인 데이터 지점들의 평균을 나타낸다. y-축은 감염 단위/ml을 나타낸다. 도 4b에서, 민무늬 막대는 대조표준으로서의 참조 백신 균주(WHO-Collaborating Centre-공급된 균주로부터 유도됨)를 나타내고, 점무늬 막대는 PR8-X 골격을 함유하는 재배열 바이러스를 나타내며, 체크무늬 막대는 #21 골격을 함유하는 재배열 바이러스를 나타낸다. y-축은 모아진 알 샘플에 대한 ㎍/ml의 HA 수율을 나타낸다.
도 5는 #21 또는 #21C 골격 중 어느 하나와 유행병-유사 H1 균주(균주 2)로부터의 HA 및 NA 절편을 가지는 역유전학-유도된 6:2 재배열 바이러스 또는 참조 백신 균주로 감염된 MDCK 세포로부터 감염 후 60시간 후에 수확된 바이러스의 바이러스 역가(FFA에 의해 측정됨; 도 5a) 및 HA 역가(렉틴-포획 ELISA에 의해 측정됨; 도 5b)를 비교한다. 두 도면에서, 민무늬 막대는 대조표준으로서의 참조 백신 균주(WHO-Collaborating Centre-공급된 균주로부터 유도됨)를 나타내고, 점무늬 막대는 #21 골격으로 만들어진 재배열 바이러스를 나타내며, 체크무늬 막대는 골격을 포함하는 PR8-X PB2 절편에 두 개의 개-적응된 돌연변이(R389K, T559N)를 함유하는 변형된 #21 골격(#21C)으로 만들어진 재배열 바이러스를 나타낸다. 도 5a 및 5b에서 y-축은 각각 감염 단위/ml 및 ㎍/ml의 HA 수율을 나타낸다.
도 6은 PR8-X, #21 또는 #21C 골격 중 어느 하나와 상이한 유행병-유사 H1 균주(균주 1)로부터의 HA 및 NA 절편으로 만들어진 역유전학-유도된 6:2 재배열 바이러스로 감염된 MDCK 세포로부터 감염 후 60시간 후에 수확된 바이러스로부터의 바이러스 역가(FFA에 의해 측정됨)를 비교한다. 민무늬 막대는 PR8-X 골격을 나타내고, 점무늬 막대는 #21 골격을 나타내며, 체크무늬 막대는 골격을 포함하는 PR8-X PB2 절편에 두 개의 개-적응된 돌연변이(R389K, T559N)를 함유하는 #21C 골격을 나타낸다. y-축은 감염 단위/ml을 나타낸다.
도 7은 참조 백신 균주(WHO-Collaborating Centre-공급된 균주로부터 유도됨) 또는 PR8-X또는 #21C 골격 중 어느 하나와 유행병-유사 H1 균주(균주 1)로부터의 HA 및 NA 절편을 함유하는 역유전학-유도된 6:2 재배열 바이러스로 감염된 부화 계란으로부터 감염 후 60시간 후에 수확된 바이러스로부터의 HA 역가(적혈구 응집반응 분석에 의해 측정됨)를 비교한다. 개별적인 점들은 단일 알로부터의 데이터를 나타낸다. 선은 개별적인 데이터 지점들의 평균을 나타낸다. y-축은 HA 단위를 나타낸다.
도 8은 PR8-X 골격 또는 개-적응된 중합효소 돌연변이를 함유하는 변형 PR8-X 골격 중 어느 하나와 유행병-유사 H1 균주(균주 1)로부터의 HA 및 NA 절편으로 만들어진 역유전학-유도된 6:2 재배열체로 감염된 MDCK 세포의 감염 후 상이한 시점에서 수확된 바이러스들의 감염 역가(FFA에 의해 측정됨)를 비교한다. 도 8a에서, 삼각형 마커를 포함한 점선은 PR8-X 골격을 나타내고 사각형 마커를 포함한 실선은 PR8-X PA 절편에 세 개의 개-적응된 돌연변이(E327K, N444D 및 N675D)를 함유한 변형된 PR8-X 골격 "PR8-X(cPA)"를 나타낸다. 도 8b에서, 삼각형 마커를 포함한 점선은 PR8-X 골격을 나타내고 원형 마커를 포함한 실선은 PR8-X NP 절편에 두 개의 개-적응된 돌연변이(A27T, E375N)를 함유한 변형된 PR8-X 골격 "PR8-X(cNP)"를 나타낸다. 두 도면에서 모두, x-축은 감염 후 시간을 나타내고 y-축은 감염 단위/ml을 나타낸다.
도 9는 PR8-X 또는 개-적응된 돌연변이를 함유하는 변형 PR8-X 골격 중 어느 하나와 H3 균주(균주 2)로부터의 HA 및 NA 절편으로 만들어진 역유전학-유도된 6:2 재배열 바이러스 또는 참조 백신 균주로 감염된 MDCK 세포의 감염 후 상이한 시점에서 수확된 바이러스들의 감염 역가(FFA에 의해 측정됨; 도 9a) 및 HA 역가(적혈구 응집반응 분석에 의해 측정됨; 도 9b)를 비교한다. 도 9a에서, x 마커를 포함한 점선은 참조 백신 균주(WHO-Collaborating Centre-공급된 균주로부터 유도됨)를 나타내고, 삼각형 마커를 포함한 점선은 PR8-X 골격을 나타내며, 사각형 마커를 포함한 실선은 PR8-X PA 절편에 세 개의 개-적응된 돌연변이(E327K, N444D 및 N675D)를 함유한 변형된 PR8-X 골격 "PR8-X(cPA)"를 나타내고, 원형 마커를 포함한 실선은 PR8-X NP 절편에 두 개의 개-적응된 돌연변이를 함유한 변형된 PR8-X 골격 "PR8-X(cNP)"를 나타낸다. 도 9b에서, 민무늬 막대는 참조 백신 균주(WHO-Collaborating Centre-공급된 균주로부터 유도됨)를 나타내고, 점무늬 막대는 PR8-X 골격을 나타내며, 체크무늬 막대는 PR8-X(cPA) 골격을 나타내고, 크로스-해치 무늬 막대는 PR8-X(cNP) 골격을 나타낸다. y-축은 감염 후 60 시간 후 시점으로부터의 HA 단위를 나타낸다.
도 10은 (A) H3 (균주 2) 또는 (B) 두 번째 H3 균주(균주 3) 또는 (C) 세 번째 H3(균주 4)로부터의 HA 및 NA 절편을 가지는 PR8-X 또는 #21 골격 중 어느 하나를 함유하는 역유전학-유도된 6:2 재배열체로 감염된 MDCK 세포 배양물로부터 감염 후 60시간 후에 수확된 슈크로스 구배-정제된 바이러스의 HA 함량(렉틴-포획 ELISA에 의해 측정됨)을 비교한다. 도 10a 및 10b에서, 민무늬 막대는 대조표준으로서의 참조 백신 균주(WHO-Collaborating Centre-공급된 균주로부터 유도됨)를 나타내고, 점무늬 막대는 PR8-X 골격을 함유하는 재배열 바이러스를 나타내며, 체크무늬 막대는 #21 골격을 함유하는 재배열 바이러스를 나타낸다. y-축은 ㎍/ml의 HA 수율을 나타낸다.
도 2는 (A) 전-유행병 H1 균주(균주 1) 및 (B) 두 번째 전-유행병 균주(균주 2)로부터의 HA 및 NA 절편을 가지는 PR8-X 또는 #21 골격 중 어느 하나를 함유하는 역유전학-유도된 6:2 재배열체로 감염된 MDCK 세포 배양물로부터 감염 후 60시간 후에 수확된 미정제 바이러스의 HA 함량(렉틴-포획 ELISA에 의해 측정됨)을 비교한다. 도 2a 및 2b에서, 민무늬 막대는 대조표준으로서의 참조 백신 균주(WHO-Collaborating Centre-공급된 균주로부터 유도됨)를 나타내고, 점무늬 막대는 PR8-X 골격을 함유하는 재배열 바이러스를 나타내며, 체크무늬 막대는 #21 골격을 함유하는 재배열 바이러스를 나타낸다. y-축은 ㎍/ml의 HA 수율을 나타낸다.
도 3은 H3 균주(균주 1)로부터의 HA 및 NA 절편을 가지는 PR8-X 또는 #21 골격 중 어느 하나를 함유하는 역유전학-유도된 6:2 재배열체로 감염된 MDCK 세포 배양물로부터 감염 후 60시간 후에 수확된 슈크로스-정제된 바이러스의 HA 수율(HPLC에 의해 측정됨)을 비교한다. 민무늬 막대는 대조표준으로서의 참조 백신 균주(WHO-Collaborating Centre-공급된 균주로부터 유도됨)를 나타내고, 점무늬 막대는 PR8-X 골격을 함유하는 재배열 바이러스를 나타내며, 체크무늬 막대는 #21 골격을 함유하는 재배열 바이러스를 나타낸다. y-축은 ㎍/ml의 HA 수율을 나타낸다.
도 4는 유행병-유사 H1 균주(균주 2)로부터의 HA 및 NA 절편을 가지는 PR8-X 또는 #21 골격 중 어느 하나로 만들어진 역유전학-유도된 6:2 재배열 바이러스 또는 참조 백신 균주로 감염된 부화 계란으로부터 감염 후 60시간 후에 수확된 바이러스의 바이러스 역가(초점 형성 분석(FFA)에 의해 측정됨; 도 4a) 및 HA 역가(렉틴-포획 ELISA에 의해 측정됨; 도 4b)를 비교한다. 도 4a에서, 개별적인 점은 단일 알로부터의 데이터를 나타낸다. 선은 개별적인 데이터 지점들의 평균을 나타낸다. y-축은 감염 단위/ml을 나타낸다. 도 4b에서, 민무늬 막대는 대조표준으로서의 참조 백신 균주(WHO-Collaborating Centre-공급된 균주로부터 유도됨)를 나타내고, 점무늬 막대는 PR8-X 골격을 함유하는 재배열 바이러스를 나타내며, 체크무늬 막대는 #21 골격을 함유하는 재배열 바이러스를 나타낸다. y-축은 모아진 알 샘플에 대한 ㎍/ml의 HA 수율을 나타낸다.
도 5는 #21 또는 #21C 골격 중 어느 하나와 유행병-유사 H1 균주(균주 2)로부터의 HA 및 NA 절편을 가지는 역유전학-유도된 6:2 재배열 바이러스 또는 참조 백신 균주로 감염된 MDCK 세포로부터 감염 후 60시간 후에 수확된 바이러스의 바이러스 역가(FFA에 의해 측정됨; 도 5a) 및 HA 역가(렉틴-포획 ELISA에 의해 측정됨; 도 5b)를 비교한다. 두 도면에서, 민무늬 막대는 대조표준으로서의 참조 백신 균주(WHO-Collaborating Centre-공급된 균주로부터 유도됨)를 나타내고, 점무늬 막대는 #21 골격으로 만들어진 재배열 바이러스를 나타내며, 체크무늬 막대는 골격을 포함하는 PR8-X PB2 절편에 두 개의 개-적응된 돌연변이(R389K, T559N)를 함유하는 변형된 #21 골격(#21C)으로 만들어진 재배열 바이러스를 나타낸다. 도 5a 및 5b에서 y-축은 각각 감염 단위/ml 및 ㎍/ml의 HA 수율을 나타낸다.
도 6은 PR8-X, #21 또는 #21C 골격 중 어느 하나와 상이한 유행병-유사 H1 균주(균주 1)로부터의 HA 및 NA 절편으로 만들어진 역유전학-유도된 6:2 재배열 바이러스로 감염된 MDCK 세포로부터 감염 후 60시간 후에 수확된 바이러스로부터의 바이러스 역가(FFA에 의해 측정됨)를 비교한다. 민무늬 막대는 PR8-X 골격을 나타내고, 점무늬 막대는 #21 골격을 나타내며, 체크무늬 막대는 골격을 포함하는 PR8-X PB2 절편에 두 개의 개-적응된 돌연변이(R389K, T559N)를 함유하는 #21C 골격을 나타낸다. y-축은 감염 단위/ml을 나타낸다.
도 7은 참조 백신 균주(WHO-Collaborating Centre-공급된 균주로부터 유도됨) 또는 PR8-X또는 #21C 골격 중 어느 하나와 유행병-유사 H1 균주(균주 1)로부터의 HA 및 NA 절편을 함유하는 역유전학-유도된 6:2 재배열 바이러스로 감염된 부화 계란으로부터 감염 후 60시간 후에 수확된 바이러스로부터의 HA 역가(적혈구 응집반응 분석에 의해 측정됨)를 비교한다. 개별적인 점들은 단일 알로부터의 데이터를 나타낸다. 선은 개별적인 데이터 지점들의 평균을 나타낸다. y-축은 HA 단위를 나타낸다.
도 8은 PR8-X 골격 또는 개-적응된 중합효소 돌연변이를 함유하는 변형 PR8-X 골격 중 어느 하나와 유행병-유사 H1 균주(균주 1)로부터의 HA 및 NA 절편으로 만들어진 역유전학-유도된 6:2 재배열체로 감염된 MDCK 세포의 감염 후 상이한 시점에서 수확된 바이러스들의 감염 역가(FFA에 의해 측정됨)를 비교한다. 도 8a에서, 삼각형 마커를 포함한 점선은 PR8-X 골격을 나타내고 사각형 마커를 포함한 실선은 PR8-X PA 절편에 세 개의 개-적응된 돌연변이(E327K, N444D 및 N675D)를 함유한 변형된 PR8-X 골격 "PR8-X(cPA)"를 나타낸다. 도 8b에서, 삼각형 마커를 포함한 점선은 PR8-X 골격을 나타내고 원형 마커를 포함한 실선은 PR8-X NP 절편에 두 개의 개-적응된 돌연변이(A27T, E375N)를 함유한 변형된 PR8-X 골격 "PR8-X(cNP)"를 나타낸다. 두 도면에서 모두, x-축은 감염 후 시간을 나타내고 y-축은 감염 단위/ml을 나타낸다.
도 9는 PR8-X 또는 개-적응된 돌연변이를 함유하는 변형 PR8-X 골격 중 어느 하나와 H3 균주(균주 2)로부터의 HA 및 NA 절편으로 만들어진 역유전학-유도된 6:2 재배열 바이러스 또는 참조 백신 균주로 감염된 MDCK 세포의 감염 후 상이한 시점에서 수확된 바이러스들의 감염 역가(FFA에 의해 측정됨; 도 9a) 및 HA 역가(적혈구 응집반응 분석에 의해 측정됨; 도 9b)를 비교한다. 도 9a에서, x 마커를 포함한 점선은 참조 백신 균주(WHO-Collaborating Centre-공급된 균주로부터 유도됨)를 나타내고, 삼각형 마커를 포함한 점선은 PR8-X 골격을 나타내며, 사각형 마커를 포함한 실선은 PR8-X PA 절편에 세 개의 개-적응된 돌연변이(E327K, N444D 및 N675D)를 함유한 변형된 PR8-X 골격 "PR8-X(cPA)"를 나타내고, 원형 마커를 포함한 실선은 PR8-X NP 절편에 두 개의 개-적응된 돌연변이를 함유한 변형된 PR8-X 골격 "PR8-X(cNP)"를 나타낸다. 도 9b에서, 민무늬 막대는 참조 백신 균주(WHO-Collaborating Centre-공급된 균주로부터 유도됨)를 나타내고, 점무늬 막대는 PR8-X 골격을 나타내며, 체크무늬 막대는 PR8-X(cPA) 골격을 나타내고, 크로스-해치 무늬 막대는 PR8-X(cNP) 골격을 나타낸다. y-축은 감염 후 60 시간 후 시점으로부터의 HA 단위를 나타낸다.
도 10은 (A) H3 (균주 2) 또는 (B) 두 번째 H3 균주(균주 3) 또는 (C) 세 번째 H3(균주 4)로부터의 HA 및 NA 절편을 가지는 PR8-X 또는 #21 골격 중 어느 하나를 함유하는 역유전학-유도된 6:2 재배열체로 감염된 MDCK 세포 배양물로부터 감염 후 60시간 후에 수확된 슈크로스 구배-정제된 바이러스의 HA 함량(렉틴-포획 ELISA에 의해 측정됨)을 비교한다. 도 10a 및 10b에서, 민무늬 막대는 대조표준으로서의 참조 백신 균주(WHO-Collaborating Centre-공급된 균주로부터 유도됨)를 나타내고, 점무늬 막대는 PR8-X 골격을 함유하는 재배열 바이러스를 나타내며, 체크무늬 막대는 #21 골격을 함유하는 재배열 바이러스를 나타낸다. y-축은 ㎍/ml의 HA 수율을 나타낸다.
새로운 공여 균주의 개발
고성장 공여 균주를 제공하기 위하여, 발명자들은 A/California/07/09의 PB1 절편과 PR8-X로부터의 모든 다른 골격 절편을 포함하는 재배열 인플루엔자 바이러스가 PR8-X로부터의 모든 골격 절편을 포함하는 재배열 인플루엔자 바이러스와 비교하여 개선된 성장 특성을 나타내는 것을 발견하였다. 이 인플루엔자 골격은 #21로서 언급된다.
초점-형성 분석(
FFA
)
FFA에 대하여, 미감염 MDCK 세포를 96 웰 플레이트에서 10% FCS가 첨가된 DMEM 100㎕ 중에 1.8x104 세포/웰의 밀도로 플레이팅한다. 다음날, 배지를 흡인하고 세포를 50㎕ 부피의 바이러스로 감염시킨다(DMEM + 1% FCS에 희석된 바이러스). 세포를 37℃에서 다음날까지 인큐베이션한다.
감염 후 여러 시점에서, 배지를 흡인하고 세포를 PBS로 1회 세척하였다. 50㎕의 빙-냉 50%/50% 아세톤-메탄올을 각 웰에 첨가하고, 이어서 -20℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 아세톤 믹스를 흡인하고 세포를 PBST(PBS + 0.1% Tween)로 1회 세척하였다. PBS 중의2% BSA 50㎕를 각 웰에 첨가하고 이어서 실온(RT)에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 항-NP의 1:6000 희석액 50㎕를 차단 완충액에 첨가하고 이어서 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 항체 용액을 흡인하고 세포를 PBST로 3회 세척하였다. 이차 항체(염소 항 마우스)를 50㎕의 차단 완충액 중에 1:2000 희석률로 첨가하고, 플레이트를 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 항체 용액을 흡인하고 세포를 PBST로 3회 세척하였다. 50㎕의 KPL True Blue를 각 웰에 첨가하고 10분 동안 인큐베이션하였다. True-Blue를 흡인하고 dH2O로 1회 세척함으로써 반응을 중지시켰다. 물을 흡인하고 세포를 건조되도록 놓아두었다.
PR8
-X 또는 #21 골격을 함유하는 재배열 바이러스의 성장 특성
바이러스 재배열에 대한 공여 균주로서 #21 균주의 적합성을 시험하기 위하여, 재배열 인플루엔자 바이러스를 다양한 인플루엔자 균주(동물 매개 감염성, 계절성 및 유행병-유사 균주를 포함함)로부터의 HA 및 NA 단백질 및 PR8-X 또는 #21 골격 중 어느 하나로부터의 다른 바이러스 절편을 함유하는 역유전학에 의해 제조한다. 이들 재배열 바이러스의 HA 함량, HA 수율 및 바이러스 역가를 측정한다. 대조표준으로서 PR8-X 또는 A/California/07/09로부터의 어떠한 골격 절편도 함유하지 않는 참조 백신 균주를 사용한다. 이들 바이러스를 부화 계란 또는 MDCK 세포 중 어느 하나에서 배양한다.
그 결과는 #21 골격을 함유하는 재배열 바이러스가 두 가지 계란 및 세포 배양물에서 모두 대조 바이러스 및 PR8-X로부터의 모든 골격 절편을 함유하는 바이러스와 비교하여 일관되게 더 높은 바이러스 역가 및 HA 수율을 제공하는 것으로 나타난다. 이런 차이는 PB1 절편에 기인하는데, 왜냐하면 이것이 #21 재배열체와 PR8-X 재배열체 사이의 유일한 차이이기 때문이다(도 1 내지 4 참조).
PR8
-X 또는 개 적응된
PR8
-X 골격을 함유하는 재배열 바이러스의 성장 특성
개-적응된 돌연변이가 PR8-X의 성장 특성에 미치는 효과를 시험하기 위하여, 발명자들은 돌연변이를 PR8-X의 PA 절편에(E327K, N444D 및 N675D) 또는 NP 절편에(A27T, E375N) 도입한다. 이들 골격은 각각 PR8-X(cPA) 및 PR8-X(cNP)로서 언급한다. PR8-X(cPA) 및 PR8-X(cNP) 골격 및 유행병-유사 H1 인플루엔자 균주(균주 1) 또는 H3 인플루엔자 균주(균주 2)의 HA 및 NA 절편을 함유하는 재배열 인플루엔자 바이러스를 제조한다. 대조표준으로서 PR8-X로부터의 어떠한 골격 절편도 함유하지 않는 참조 백신 균주를 사용한다. 재배열 인플루엔자 바이러스를 MDCK 세포에서 배양한다.
그 결과는 개-적응된 골격 절편을 함유하는 재배열 인플루엔자 바이러스가 미변형 PR8-X 골격 절편을 함유하는 재배열 인플루엔자 바이러스와 비교하여 일관되게 더 높은 바이러스 역가로 성장하는 것으로 나타난다(도 8 및 9 참조).
PR8
-X, #21 또는 #21C 골격을 함유하는 재배열 바이러스의 성장 특성
골격 절편의 개-적응된 돌연변이가 #21 골격의 성장 특성을 개선하는 지의 여부를 시험하기 위하여, 발명자들은 PR8-X PB2 절편에 돌연변이들(R389K, T559N)을 도입함으로써 #21 골격을 변형시킨다. 이 골격을 #21C로 언급한다. 재배열 인플루엔자 바이러스를, 두 개의 상이한 유행병-유사 H1 균주(균주 1 및 2)로부터의 HA 및 NA 단백질 및 PR8-X, #21 골격 또는 #21C 골격 중 어느 하나로부터의 다른 바이러스 절편을 함유하는 역유전학에 의해 제조한다. 대조표준으로서 PR8-X 또는 A/California/07/09로부터의 어떠한 골격 절편도 함유하지 않는 참조 백신 균주를 사용한다. 이들 바이러스를 MDCK 세포에서 배양한다. 이들 재배열 바이러스의 바이러스 수율을 측정한다. 유행병-유사 H1 균주(균주 1)로부터의 HA 및 NA 절편 및 PR8-X 또는 #21C 골격을 함유하는 재배열 인플루엔자 바이러스에 대해 HA 역가를 또한 측정한다.
그 결과는 #21C 골격을 함유하는 재배열 인플루엔자 바이러스가 PR8-X 골격 절편 또는 #21 골격만을 함유하는 재배열 인플루엔자 바이러스와 비교하여 일관되게 더 높은 바이러스 역가로 성장하는 것으로 나타난다(도 5, 6 및 7 참조). #21C 골격을 포함하는 재배열 인플루엔자 바이러스는 또한 PR8-X 재배열체와 비교하여 더 높은 HA 역가를 나타낸다.
발명은 단지 예시에 의해 기술되었고 변형이 이루어질 수 있지만 발명의 범주 및 사상 내에 유지되고 있다는 것이 인지될 것이다.
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180 185 190
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545 550 555 560
Lys Ile Gln Trp Ser Gln Asn Pro Thr Met Leu Tyr Asn Lys Met Glu
565 570 575
Phe Glu Pro Phe Gln Ser Leu Val Pro Lys Ala Ile Arg Gly Gln Tyr
580 585 590
Ser Gly Phe Val Arg Thr Leu Phe Gln Gln Met Arg Asp Val Leu Gly
595 600 605
Thr Phe Asp Thr Ala Gln Ile Ile Lys Leu Leu Pro Phe Ala Ala Ala
610 615 620
Pro Pro Lys Gln Ser Arg Met Gln Phe Ser Ser Phe Thr Val Asn Val
625 630 635 640
Arg Gly Ser Gly Met Arg Ile Leu Val Arg Gly Asn Ser Pro Val Phe
645 650 655
Asn Tyr Asn Lys Ala Thr Lys Arg Leu Thr Val Leu Gly Lys Asp Ala
660 665 670
Gly Thr Leu Thr Glu Asp Pro Asp Glu Gly Thr Ala Gly Val Glu Ser
675 680 685
Ala Val Leu Arg Gly Phe Leu Ile Leu Gly Lys Glu Asp Lys Arg Tyr
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Gly Pro Ala Leu Ser Ile Asn Glu Leu Ser Asn Leu Ala Lys Gly Glu
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Lys Ala Asn Val Leu Ile Gly Gln Gly Asp Val Val Leu Val Met Lys
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Arg Lys Arg Asp Ser Ser Ile Leu Thr Asp Ser Gln Thr Ala Thr Lys
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Arg Ile Arg Met Ala Ile Asn
755
<210> 4
<211> 498
<212> PRT
<213> Influenza
<400> 4
Met Ala Ser Gln Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr Asp
1 5 10 15
Gly Glu Arg Gln Asn Ala Thr Glu Ile Arg Ala Ser Val Gly Lys Met
20 25 30
Ile Gly Gly Ile Gly Arg Phe Tyr Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu Lys
35 40 45
Leu Ser Asp Tyr Glu Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser Leu Thr Ile Glu
50 55 60
Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg Arg Asn Lys Tyr Leu Glu
65 70 75 80
Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Ile
85 90 95
Tyr Arg Arg Val Asn Gly Lys Trp Met Arg Glu Leu Ile Leu Tyr Asp
100 105 110
Lys Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Gln Ala Asn Asn Gly Asp Asp
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130 135 140
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145 150 155 160
Pro Arg Met Cys Ser Leu Met Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser
165 170 175
Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Val Gly Thr Met Val Met Glu
180 185 190
Leu Val Arg Met Ile Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Gln Val Arg Glu Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala Glu Phe Glu Asp Leu
245 250 255
Thr Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His
260 265 270
Lys Ser Cys Leu Pro Ala Cys Val Tyr Gly Pro Ala Val Ala Ser Gly
275 280 285
Tyr Asp Phe Glu Arg Glu Gly Tyr Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe
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305 310 315 320
Asn Pro Ala His Lys Ser Gln Leu Val Trp Met Ala Cys His Ser Ala
325 330 335
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435 440 445
Glu Ser Ala Arg Pro Glu Asp Val Ser Phe Gln Gly Arg Gly Val Phe
450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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<212> PRT
<213> Influenza
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1 5 10 15
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Ser Ser Ala Gly Leu Lys Asn Asp Leu Leu Glu Asn Leu Gln Ala Tyr
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Gln Lys Arg Met Gly Val Gln Met Gln Arg Phe Lys
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<211> 230
<212> PRT
<213> Influenza
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Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu Trp
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<213> Influenza
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<212> PRT
<213> Influenza
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1 5 10 15
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Phe Lys Ile Glu Lys Gly Lys Val Thr Lys Ser Ile Glu Leu Asn Ala
245 250 255
Pro Asn Ser His Tyr Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Asp Thr Asp Lys
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275 280 285
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Gly Val Phe Gly Asp Asn Pro Arg Pro Glu Asp Gly Thr Gly Ser Cys
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Gly Pro Val Tyr Val Asp Gly Ala Asn Gly Val Lys Gly Phe Ser Tyr
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355 360 365
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Ser Gly Tyr Ser Gly Ser Phe Val Gln His Pro Glu Leu Thr Gly Leu
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450
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<212> DNA
<213> Influenza
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ttcatcaatg agcaaggcga gtcaataatc gtagaacttg gtgatccaaa tgcacttttg 240
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agtatttgca acactacagg ggctgagaaa ccaaagtttc taccagattt gtatgattac 360
aaggagaata gatttatcga aattggagta acaaggagag aagttcacat atactatctg 420
gaaaaggcca ataaaattaa atctgagaaa acacacatcc acattttctc gttcactggg 480
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aaaattccaa agactaaaaa tatgaagaaa acaagtcagc taaagtgggc acttggtgag 1140
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aatgacaccg acgtggtaaa ctttgtgagc atggagtttt ctctcactga cccaagactt 1620
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gccataggcc aggtttcaag gcccatgttc ttgtatgtga gaacaaatgg aacctcaaaa 1740
attaaaatga aatggggaat ggagatgagg cgttgcctcc tccagtcact tcaacaaatt 1800
gagagtatga ttgaagctga gtcctctgtc aaagagaaag acatgaccaa agagttcttt 1860
gagaacaaat cagaaacatg gcccattgga gagtccccca aaggagtgga ggaaagttcc 1920
attgggaagg tctgcaggac tttattagca aagtcggtat tcaacagctt gtatgcatct 1980
ccacaactag aaggattttc agctgaatca agaaaactgc ttcttatcgt tcaggctctt 2040
agggacaacc ttgaacctgg gacctttgat cttggggggc tatatgaagc aattgaggag 2100
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catgcattga gttagttgtg gcagtgctac tatttgctat ccatactgtc caaaaaagta 2220
ccttgtttct act 2233
<210> 10
<211> 2341
<212> DNA
<213> Influenza
<400> 10
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tgcaatttat ttgaaaaatt cttccccagc agttcataca gaagaccagt cgggatatcc 2160
agtatggtgg aggctatggt ttccagagcc cgaattgatg cacggattga tttcgaatct 2220
ggaaggataa agaaagaaga gttcactgag atcatgaaga tctgttccac cattgaagag 2280
ctcagacggc aaaaatagtg aatttagctt gtccttcatg aaaaaatgcc ttgtttctac 2340
t 2341
<210> 11
<211> 2341
<212> DNA
<213> Influenza
<400> 11
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gagcaaggac aaactttatg gagtaaaatg aatgatgccg gatcagaccg agtgatggta 300
tcacctctgg ctgtgacatg gtggaatagg aatggaccaa taacaaatac agttcattat 360
ccaaaaatct acaaaactta ttttgaaaga gtagaaaggc taaagcatgg aacctttggc 420
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gtatcagcag atccactagc atctttattg gagatgtgcc acagcacaca gattggtgga 900
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agaacaagcg gatcatcagt caagagagag gaagaggtgc ttacgggaaa tcttcaaaca 1080
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aaagcagtca gaggtgatct gaatttcgtc aatagggcga atcagcgatt gaatcctatg 1320
catcaacttt taagacattt tcagaaggat gcgagagtgc tttttcaaaa ttggggagtt 1380
gaacctatcg acaatgtgat gggaatgatt gggatattgc ccgacatgac tccaagcatc 1440
gagatgtcaa tgagaggagt gagaatcagc aaaatgggtg tagatgagta ctccagcacg 1500
gagagggtag tggtgagcat tgaccgtttt ttgagaatcc gggaccaacg aggaaatgta 1560
ctactgtctc ccgaggaggt cagtgaaaca cagggaacag agaaactgac aataacttac 1620
tcatcgtcaa tgatgtggga gattaatggt cctgaatcag tattggtcaa tacctatcaa 1680
tggatcatca gaaactggga aactgttaaa attcagtggt cccagaaccc tacaatgcta 1740
tacaataaaa tggaatttga accatttcag tctttagtac ctaaggccat tagaggccaa 1800
tacagtgggt ttgtaagaac tctgttccaa caaatgaggg atgtgcttgg gacatttgat 1860
accgcacaga taataaaact tcttcccttc gcagccgctc caccaaagca aagtagaatg 1920
cagttctcct catttactgt gaatgtgagg ggatcaggaa tgagaatact tgtaaggggc 1980
aattctcctg tattcaacta taacaaggcc acgaagagac tcacagttct cggaaaggat 2040
gctggcactt taactgaaga cccagatgaa ggcacagctg gagtggagtc cgctgttctg 2100
aggggattcc tcattctggg caaagaagac aagagatatg ggccagcact aagcatcaat 2160
gaactgagca accttgcgaa aggagagaag gctaatgtgc taattgggca aggagacgtg 2220
gtgttggtaa tgaaacggaa acgggactct agcatactta ctgacagcca gacagcgacc 2280
aaaagaattc ggatggccat caattagtgt cgaatagttt aaaaacgacc ttgtttctac 2340
t 2341
<210> 12
<211> 1565
<212> DNA
<213> Influenza
<400> 12
agcaaaagca gggtagataa tcactcactg agtgacatca aaatcatggc gtctcaaggc 60
accaaacgat cttacgaaca gatggagact gatggagaac gccagaatgc cactgaaatc 120
agagcatccg tcggaaaaat gattggtgga attggacgat tctacatcca aatgtgcacc 180
gaactcaaac tcagtgatta tgagggacgg ttgatccaaa acagcttaac aatagagaga 240
atggtgctct ctgcttttga cgaaaggaga aataaatacc ttgaagaaca tcccagtgcg 300
ggaaaagatc ctaagaaaac tggaggacct atatacagga gagtaaacgg aaagtggatg 360
agagaactca tcctttatga caaagaagaa ataaggcgaa tctggcgcca agctaataat 420
ggtgacgatg caacggctgg tctgactcac atgatgatct ggcattccaa tttgaatgat 480
gcaacttatc agaggacaag agctcttgtt cgcaccggaa tggatcccag gatgtgctct 540
ctgatgcaag gttcaactct ccctaggagg tctggagccg caggtgctgc agtcaaagga 600
gttggaacaa tggtgatgga attggtcaga atgatcaaac gtgggatcaa tgatcggaac 660
ttctggaggg gtgagaatgg acgaaaaaca agaattgctt atgaaagaat gtgcaacatt 720
ctcaaaggga aatttcaaac tgctgcacaa aaagcaatga tggatcaagt gagagagagc 780
cggaacccag ggaatgctga gttcgaagat ctcacttttc tagcacggtc tgcactcata 840
ttgagagggt cggttgctca caagtcctgc ctgcctgcct gtgtgtatgg acctgccgta 900
gccagtgggt acgactttga aagggaggga tactctctag tcggaataga ccctttcaga 960
ctgcttcaaa acagccaagt gtacagccta atcagaccaa atgagaatcc agcacacaag 1020
agtcaactgg tgtggatggc atgccattct gccgcatttg aagatctaag agtattaagc 1080
ttcatcaaag ggacgaaggt gctcccaaga gggaagcttt ccactagagg agttcaaatt 1140
gcttccaatg aaaatatgga gactatggaa tcaagtacac ttgaactgag aagcaggtac 1200
tgggccataa ggaccagaag tggaggaaac accaatcaac agagggcatc tgcgggccaa 1260
atcagcatac aacctacgtt ctcagtacag agaaatctcc cttttgacag aacaaccatt 1320
atggcagcat tcaatgggaa tacagagggg agaacatctg acatgaggac cgaaatcata 1380
aggatgatgg aaagtgcaag accagaagat gtgtctttcc aggggcgggg agtcttcgag 1440
ctctcggacg aaaaggcagc gagcccgatc gtgccttcct ttgacatgag taatgaagga 1500
tcttatttct tcggagacaa tgcagaggag tacgacaatt aaagaaaaat acccttgttt 1560
ctact 1565
<210> 13
<211> 1027
<212> DNA
<213> Influenza
<400> 13
agcaaaagca ggtagatatt gaaagatgag tcttctaacc gaggtcgaaa cgtacgtact 60
ctctatcatc ccgtcaggcc ccctcaaagc cgagatcgca cagagacttg aagatgtctt 120
tgcagggaag aacaccgatc ttgaggttct catggaatgg ctaaagacaa gaccaatcct 180
gtcacctctg actaagggga ttttaggatt tgtgttcacg ctcaccgtgc ccagtgagcg 240
aggactgcag cgtagacgct ttgtccaaaa tgcccttaat gggaacgggg atccaaataa 300
catggacaaa gcagttaaac tgtataggaa gctcaagagg gagataacat tccatggggc 360
caaagaaatc tcactcagtt attctgctgg tgcacttgcc agttgtatgg gcctcatata 420
caacaggatg ggggctgtga ccactgaagt ggcatttggc ctggtatgtg caacctgtga 480
acagattgct gactcccagc atcggtctca taggcaaatg gtgacaacaa ccaatccact 540
aatcagacat gagaacagaa tggttttagc cagcactaca gctaaggcta tggagcaaat 600
ggctggatcg agtgagcaag cagcagaggc catggaggtt gctagtcagg ctagacaaat 660
ggtgcaagcg atgagaacca ttgggactca tcctagctcc agtgctggtc tgaaaaatga 720
tcttcttgaa aatttgcagg cctatcagaa acgaatgggg gtgcagatgc aacggttcaa 780
gtgatcctct cactattgcc gcaaatatca ttgggatctt gcacttgaca ttgtggattc 840
ttgatcgtct ttttttcaaa tgcatttacc gtcgctttaa atacggactg aaaggagggc 900
cttctacgga aggagtgcca aagtctatga gggaagaata tcgaaaggaa cagcagagtg 960
ctgtggatgc tgacgatggt cattttgtca gcatagagct ggagtaaaaa actaccttgt 1020
ttctact 1027
<210> 14
<211> 890
<212> DNA
<213> Influenza
<400> 14
agcaaaagca gggtgacaaa aacataatgg atccaaacac tgtgtcaagc tttcaggtag 60
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tccttgatcg gcttcgccga gatcagaaat ccctaagagg aaggggcagt actctcggtc 180
tggacatcaa gacagccaca cgtgctggaa agcagatagt ggagcggatt ctgaaagaag 240
aatccgatga ggcacttaaa atgaccatgg cctctgtacc tgcgtcgcgt tacctaactg 300
acatgactct tgaggaaatg tcaagggact ggtccatgct catacccaag cagaaagtgg 360
caggccctct ttgtatcaga atggaccagg cgatcatgga taagaacatc atactgaaag 420
cgaacttcag tgtgattttt gaccggctgg agactctaat attgctaagg gctttcaccg 480
aagagggagc aattgttggc gaaatttcac cattgccttc tcttccagga catactgctg 540
aggatgtcaa aaatgcagtt ggagtcctca tcggaggact tgaatggaat gataacacag 600
ttcgagtctc tgaaactcta cagagattcg cttggagaag cagtaatgag aatgggagac 660
ctccactcac tccaaaacag aaacgagaaa tggcgggaac aattaggtca gaagtttgaa 720
gaaataagat ggttgattga agaagtgaga cacaaactga agataacaga gaatagtttt 780
gagcaaataa catttatgca agccttacat ctattgcttg aagtggagca agagataaga 840
actttctcgt ttcagcttat ttagtactaa aaaacaccct tgtttctact 890
<210> 15
<211> 716
<212> PRT
<213> INFLUENZA VIRUS REASSORTMENT
<400> 15
Met Glu Asp Phe Val Arg Gln Cys Phe Asn Pro Met Ile Val Glu Leu
1 5 10 15
Ala Glu Lys Ala Met Lys Glu Tyr Gly Glu Asp Pro Lys Ile Glu Thr
20 25 30
Asn Lys Phe Ala Ala Ile Cys Thr His Leu Glu Val Cys Phe Met Tyr
35 40 45
Ser Asp Phe His Phe Ile Asp Glu Arg Gly Glu Ser Ile Ile Val Glu
50 55 60
Ser Gly Asp Pro Asn Ala Leu Leu Lys His Arg Phe Glu Ile Ile Glu
65 70 75 80
Gly Arg Asp Arg Ile Met Ala Trp Thr Val Val Asn Ser Ile Cys Asn
85 90 95
Thr Thr Gly Val Glu Lys Pro Lys Phe Leu Pro Asp Leu Tyr Asp Tyr
100 105 110
Lys Glu Asn Arg Phe Ile Glu Ile Gly Val Thr Arg Arg Glu Val His
115 120 125
Ile Tyr Tyr Leu Glu Lys Ala Asn Lys Ile Lys Ser Glu Lys Thr His
130 135 140
Ile His Ile Phe Ser Phe Thr Gly Glu Glu Met Ala Thr Lys Ala Asp
145 150 155 160
Tyr Thr Leu Asp Glu Glu Ser Arg Ala Arg Ile Lys Thr Arg Leu Phe
165 170 175
Thr Ile Arg Gln Glu Met Ala Ser Arg Ser Leu Trp Asp Ser Phe Arg
180 185 190
Gln Ser Glu Arg Gly Glu Glu Thr Ile Glu Glu Lys Phe Glu Ile Thr
195 200 205
Gly Thr Met Arg Lys Leu Ala Asp Gln Ser Leu Pro Pro Asn Phe Pro
210 215 220
Ser Leu Glu Asn Phe Arg Ala Tyr Val Asp Gly Phe Glu Pro Asn Gly
225 230 235 240
Cys Ile Glu Gly Lys Leu Ser Gln Met Ser Lys Glu Val Asn Ala Lys
245 250 255
Ile Glu Pro Phe Leu Arg Thr Thr Pro Arg Pro Leu Arg Leu Pro Asp
260 265 270
Gly Pro Leu Cys His Gln Arg Ser Lys Phe Leu Leu Met Asp Ala Leu
275 280 285
Lys Leu Ser Ile Glu Asp Pro Ser His Glu Gly Glu Gly Ile Pro Leu
290 295 300
Tyr Asp Ala Ile Lys Cys Met Lys Thr Phe Phe Gly Trp Lys Glu Pro
305 310 315 320
Asn Ile Val Lys Pro His Glu Lys Gly Ile Asn Pro Asn Tyr Leu Met
325 330 335
Ala Trp Lys Gln Val Leu Ala Glu Leu Gln Asp Ile Glu Asn Glu Glu
340 345 350
Lys Ile Pro Arg Thr Lys Asn Met Lys Arg Thr Ser Gln Leu Lys Trp
355 360 365
Ala Leu Gly Glu Asn Met Ala Pro Glu Lys Val Asp Phe Asp Asp Cys
370 375 380
Lys Asp Val Gly Asp Leu Lys Gln Tyr Asp Ser Asp Glu Pro Glu Pro
385 390 395 400
Arg Ser Leu Ala Ser Trp Val Gln Asn Glu Phe Asn Lys Ala Cys Glu
405 410 415
Leu Thr Asp Ser Ser Trp Ile Glu Leu Asp Glu Ile Gly Glu Asp Val
420 425 430
Ala Pro Ile Glu His Ile Ala Ser Met Arg Arg Asn Tyr Phe Thr Ala
435 440 445
Glu Val Ser His Cys Arg Ala Thr Glu Tyr Ile Met Lys Gly Val Tyr
450 455 460
Ile Asn Thr Ala Leu Leu Asn Ala Ser Cys Ala Ala Met Asp Asp Phe
465 470 475 480
Gln Leu Ile Pro Met Ile Ser Lys Cys Arg Thr Lys Glu Gly Arg Arg
485 490 495
Lys Thr Asn Leu Tyr Gly Phe Ile Ile Lys Gly Arg Ser His Leu Arg
500 505 510
Asn Asp Thr Asp Val Val Asn Phe Val Ser Met Glu Phe Ser Leu Thr
515 520 525
Asp Pro Arg Leu Glu Pro His Lys Trp Glu Lys Tyr Cys Val Leu Glu
530 535 540
Ile Gly Asp Met Leu Leu Arg Thr Ala Ile Gly Gln Val Ser Arg Pro
545 550 555 560
Met Phe Leu Tyr Val Arg Thr Asn Gly Thr Ser Lys Ile Lys Met Lys
565 570 575
Trp Gly Met Glu Met Arg Arg Cys Leu Leu Gln Ser Leu Gln Gln Ile
580 585 590
Glu Ser Met Ile Glu Ala Glu Ser Ser Val Lys Glu Lys Asp Met Thr
595 600 605
Lys Glu Phe Phe Glu Asn Lys Ser Glu Thr Trp Pro Ile Gly Glu Ser
610 615 620
Pro Arg Gly Val Glu Glu Gly Ser Ile Gly Lys Val Cys Arg Thr Leu
625 630 635 640
Leu Ala Lys Ser Val Phe Asn Ser Leu Tyr Ala Ser Pro Gln Leu Glu
645 650 655
Gly Phe Ser Ala Glu Ser Arg Lys Leu Leu Leu Ile Val Gln Ala Leu
660 665 670
Arg Asp Asn Leu Glu Pro Gly Thr Phe Asp Leu Gly Gly Leu Tyr Glu
675 680 685
Ala Ile Glu Glu Cys Leu Ile Asn Asp Pro Trp Val Leu Leu Asn Ala
690 695 700
Ser Trp Phe Asn Ser Phe Leu Thr His Ala Leu Lys
705 710 715
<210> 16
<211> 757
<212> PRT
<213> Influenza
<400> 16
Met Asp Val Asn Pro Thr Leu Leu Phe Leu Lys Ile Pro Ala Gln Asn
1 5 10 15
Ala Ile Ser Thr Thr Phe Pro Tyr Thr Gly Asp Pro Pro Tyr Ser His
20 25 30
Gly Thr Gly Thr Gly Tyr Thr Met Asp Thr Val Asn Arg Thr His Gln
35 40 45
Tyr Ser Glu Lys Gly Lys Trp Thr Thr Asn Thr Glu Thr Gly Ala Pro
50 55 60
Gln Leu Asn Pro Ile Asp Gly Pro Leu Pro Glu Asp Asn Glu Pro Ser
65 70 75 80
Gly Tyr Ala Gln Thr Asp Cys Val Leu Glu Ala Met Ala Phe Leu Glu
85 90 95
Glu Ser His Pro Gly Ile Phe Glu Asn Ser Cys Leu Glu Thr Met Glu
100 105 110
Val Val Gln Gln Thr Arg Val Asp Lys Leu Thr Gln Gly Arg Gln Thr
115 120 125
Tyr Asp Trp Thr Leu Asn Arg Asn Gln Pro Ala Ala Thr Ala Leu Ala
130 135 140
Asn Thr Ile Glu Val Phe Arg Ser Asn Gly Leu Thr Ala Asn Glu Ser
145 150 155 160
Gly Arg Leu Ile Asp Phe Leu Lys Asp Val Met Glu Ser Met Asn Lys
165 170 175
Glu Glu Ile Glu Ile Thr Thr His Phe Gln Arg Lys Arg Arg Val Arg
180 185 190
Asp Asn Met Thr Lys Lys Met Val Thr Gln Arg Thr Ile Gly Lys Lys
195 200 205
Lys Gln Arg Leu Asn Lys Arg Gly Tyr Leu Ile Arg Ala Leu Thr Leu
210 215 220
Asn Thr Met Thr Lys Asp Ala Glu Arg Gly Lys Leu Lys Arg Arg Ala
225 230 235 240
Ile Ala Thr Pro Gly Met Gln Ile Arg Gly Phe Val Tyr Phe Val Glu
245 250 255
Thr Leu Ala Arg Ser Ile Cys Glu Lys Leu Glu Gln Ser Gly Leu Pro
260 265 270
Val Gly Gly Asn Glu Lys Lys Ala Lys Leu Ala Asn Val Val Arg Lys
275 280 285
Met Met Thr Asn Ser Gln Asp Thr Glu Ile Ser Phe Thr Ile Thr Gly
290 295 300
Asp Asn Thr Lys Trp Asn Glu Asn Gln Asn Pro Arg Met Phe Leu Ala
305 310 315 320
Met Ile Thr Tyr Ile Thr Arg Asn Gln Pro Glu Trp Phe Arg Asn Ile
325 330 335
Leu Ser Met Ala Pro Ile Met Phe Ser Asn Lys Met Ala Arg Leu Gly
340 345 350
Lys Gly Tyr Met Phe Glu Ser Lys Arg Met Lys Ile Arg Thr Gln Ile
355 360 365
Pro Ala Glu Met Leu Ala Ser Ile Asp Leu Lys Tyr Phe Asn Glu Ser
370 375 380
Thr Lys Lys Lys Ile Glu Lys Ile Arg Pro Leu Leu Ile Asp Gly Thr
385 390 395 400
Ala Ser Leu Ser Pro Gly Met Met Met Gly Met Phe Asn Met Leu Ser
405 410 415
Thr Val Leu Gly Val Ser Ile Leu Asn Leu Gly Gln Lys Lys Tyr Thr
420 425 430
Lys Thr Ile Tyr Trp Trp Asp Gly Leu Gln Ser Ser Asp Asp Phe Ala
435 440 445
Leu Ile Val Asn Ala Pro Asn His Glu Gly Ile Gln Ala Gly Val Asp
450 455 460
Arg Phe Tyr Arg Thr Cys Lys Leu Val Gly Ile Asn Met Ser Lys Lys
465 470 475 480
Lys Ser Tyr Ile Asn Lys Thr Gly Thr Phe Glu Phe Thr Ser Phe Phe
485 490 495
Tyr Arg Tyr Gly Phe Val Ala Asn Phe Ser Met Glu Leu Pro Ser Phe
500 505 510
Gly Val Ser Gly Val Asn Glu Ser Ala Asp Met Ser Ile Gly Val Thr
515 520 525
Val Ile Lys Asn Asn Met Ile Asn Asn Asp Leu Gly Pro Ala Thr Ala
530 535 540
Gln Met Ala Leu Gln Leu Phe Ile Lys Asp Tyr Arg Tyr Thr Tyr Arg
545 550 555 560
Cys His Arg Gly Asp Thr Gln Ile Gln Thr Arg Arg Ser Phe Glu Leu
565 570 575
Lys Lys Leu Trp Asp Gln Thr Gln Ser Lys Val Gly Leu Leu Val Ser
580 585 590
Asp Gly Gly Pro Asn Leu Tyr Asn Ile Arg Asn Leu His Ile Pro Glu
595 600 605
Val Cys Leu Lys Trp Glu Leu Met Asp Asp Asp Tyr Arg Gly Arg Leu
610 615 620
Cys Asn Pro Leu Asn Pro Phe Val Ser His Lys Glu Ile Asp Ser Val
625 630 635 640
Asn Asn Ala Val Val Met Pro Ala His Gly Pro Ala Lys Ser Met Glu
645 650 655
Tyr Asp Ala Val Ala Thr Thr His Ser Trp Ile Pro Lys Arg Asn Arg
660 665 670
Ser Ile Leu Asn Thr Ser Gln Arg Gly Ile Leu Glu Asp Glu Gln Met
675 680 685
Tyr Gln Lys Cys Cys Asn Leu Phe Glu Lys Phe Phe Pro Ser Ser Ser
690 695 700
Tyr Arg Arg Pro Val Gly Ile Ser Ser Met Val Glu Ala Met Val Ser
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Arg Ala Arg Ile Asp Ala Arg Val Asp Phe Glu Ser Gly Arg Ile Lys
725 730 735
Lys Glu Glu Phe Ser Glu Ile Met Lys Ile Cys Ser Thr Ile Glu Glu
740 745 750
Leu Arg Arg Gln Lys
755
<210> 17
<211> 759
<212> PRT
<213> Influenza
<400> 17
Met Glu Arg Ile Lys Glu Leu Arg Asp Leu Met Ser Gln Ser Arg Thr
1 5 10 15
Arg Glu Ile Leu Thr Lys Thr Thr Val Asp His Met Ala Ile Ile Lys
20 25 30
Lys Tyr Thr Ser Gly Arg Gln Glu Lys Asn Pro Ala Leu Arg Met Lys
35 40 45
Trp Met Met Ala Met Arg Tyr Pro Ile Thr Ala Asp Lys Arg Ile Met
50 55 60
Asp Met Ile Pro Glu Arg Asn Glu Gln Gly Gln Thr Leu Trp Ser Lys
65 70 75 80
Thr Asn Asp Ala Gly Ser Asp Arg Val Met Val Ser Pro Leu Ala Val
85 90 95
Thr Trp Trp Asn Arg Asn Gly Pro Thr Thr Ser Thr Val His Tyr Pro
100 105 110
Lys Val Tyr Lys Thr Tyr Phe Glu Lys Val Glu Arg Leu Lys His Gly
115 120 125
Thr Phe Gly Pro Val His Phe Arg Asn Gln Val Lys Ile Arg Arg Arg
130 135 140
Val Asp Thr Asn Pro Gly His Ala Asp Leu Ser Ala Lys Glu Ala Gln
145 150 155 160
Asp Val Ile Met Glu Val Val Phe Pro Asn Glu Val Gly Ala Arg Ile
165 170 175
Leu Thr Ser Glu Ser Gln Leu Ala Ile Thr Lys Glu Lys Lys Glu Glu
180 185 190
Leu Gln Asp Cys Lys Ile Ala Pro Leu Met Val Ala Tyr Met Leu Glu
195 200 205
Arg Glu Leu Val Arg Lys Thr Arg Phe Leu Pro Val Ala Gly Gly Thr
210 215 220
Gly Ser Val Tyr Ile Glu Val Leu His Leu Thr Gln Gly Thr Cys Trp
225 230 235 240
Glu Gln Met Tyr Thr Pro Gly Gly Glu Val Arg Asn Asp Asp Val Asp
245 250 255
Gln Ser Leu Ile Ile Ala Ala Arg Asn Ile Val Arg Arg Ala Ala Val
260 265 270
Ser Ala Asp Pro Leu Ala Ser Leu Leu Glu Met Cys His Ser Thr Gln
275 280 285
Ile Gly Gly Val Arg Met Val Asp Ile Leu Arg Gln Asn Pro Thr Glu
290 295 300
Glu Gln Ala Val Asp Ile Cys Lys Ala Ala Ile Gly Leu Arg Ile Ser
305 310 315 320
Ser Ser Phe Ser Phe Gly Gly Phe Thr Phe Lys Arg Thr Ser Gly Ser
325 330 335
Ser Val Lys Lys Glu Glu Glu Val Leu Thr Gly Asn Leu Gln Thr Leu
340 345 350
Lys Ile Arg Val His Glu Gly Tyr Glu Glu Phe Thr Met Val Gly Arg
355 360 365
Arg Ala Thr Ala Ile Leu Arg Lys Ala Thr Arg Arg Leu Ile Gln Leu
370 375 380
Ile Val Ser Gly Arg Asp Glu Gln Ser Ile Ala Glu Ala Ile Ile Val
385 390 395 400
Ala Met Val Phe Ser Gln Glu Asp Cys Met Ile Lys Ala Val Arg Gly
405 410 415
Asp Leu Asn Phe Val Asn Arg Ala Asn Gln Arg Leu Asn Pro Met His
420 425 430
Gln Leu Leu Arg His Phe Gln Lys Asp Ala Lys Val Leu Phe Gln Asn
435 440 445
Trp Gly Ile Glu Ser Ile Asp Asn Val Met Gly Met Ile Gly Ile Leu
450 455 460
Pro Asp Met Thr Pro Ser Thr Glu Met Ser Leu Arg Gly Ile Arg Val
465 470 475 480
Ser Lys Met Gly Val Asp Glu Tyr Ser Ser Thr Glu Arg Val Val Val
485 490 495
Ser Ile Asp Arg Phe Leu Arg Val Arg Asp Gln Arg Gly Asn Val Leu
500 505 510
Leu Ser Pro Glu Glu Val Ser Glu Thr Gln Gly Thr Glu Lys Leu Thr
515 520 525
Ile Thr Tyr Ser Ser Ser Met Met Trp Glu Ile Asn Gly Pro Glu Ser
530 535 540
Val Leu Val Asn Thr Tyr Gln Trp Ile Ile Arg Asn Trp Glu Ile Val
545 550 555 560
Lys Ile Gln Trp Ser Gln Asp Pro Thr Met Leu Tyr Asn Lys Met Glu
565 570 575
Phe Glu Pro Phe Gln Ser Leu Val Pro Lys Ala Thr Arg Ser Arg Tyr
580 585 590
Ser Gly Phe Val Arg Thr Leu Phe Gln Gln Met Arg Asp Val Leu Gly
595 600 605
Thr Phe Asp Thr Val Gln Ile Ile Lys Leu Leu Pro Phe Ala Ala Ala
610 615 620
Pro Pro Glu Gln Ser Arg Met Gln Phe Ser Ser Leu Thr Val Asn Val
625 630 635 640
Arg Gly Ser Gly Leu Arg Ile Leu Val Arg Gly Asn Ser Pro Val Phe
645 650 655
Asn Tyr Asn Lys Ala Thr Lys Arg Leu Thr Val Leu Gly Lys Asp Ala
660 665 670
Gly Ala Leu Thr Glu Asp Pro Asp Glu Gly Thr Ser Gly Val Glu Ser
675 680 685
Ala Val Leu Arg Gly Phe Leu Ile Leu Gly Lys Glu Asp Lys Arg Tyr
690 695 700
Gly Pro Ala Leu Ser Ile Asn Glu Leu Ser Asn Leu Ala Lys Gly Glu
705 710 715 720
Lys Ala Asn Val Leu Ile Gly Gln Gly Asp Val Val Leu Val Met Lys
725 730 735
Arg Lys Arg Asp Ser Ser Ile Leu Thr Asp Ser Gln Thr Ala Thr Lys
740 745 750
Arg Ile Arg Met Ala Ile Asn
755
<210> 18
<211> 319
<212> PRT
<213> Influenza
<400> 18
Met Ala Ser Gln Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr Gly
1 5 10 15
Gly Glu Arg Gln Asp Ala Thr Glu Ile Arg Ala Ser Val Gly Arg Met
20 25 30
Ile Gly Gly Ile Gly Arg Phe Tyr Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu Lys
35 40 45
Leu Ser Asp Tyr Asp Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser Ile Thr Ile Glu
50 55 60
Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg Arg Asn Lys Tyr Leu Glu
65 70 75 80
Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Ile
85 90 95
Tyr Arg Arg Val Asp Gly Lys Trp Met Arg Glu Leu Ile Leu Tyr Asp
100 105 110
Lys Glu Glu Ile Arg Arg Val Trp Arg Gln Ala Asn Asn Gly Glu Asp
115 120 125
Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Ile Met Ile Trp His Ser Asn Leu Asn
130 135 140
Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp
145 150 155 160
Pro Arg Met Cys Ser Leu Met Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser
165 170 175
Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Val Gly Thr Ile Ala Met Glu
180 185 190
Leu Ile Arg Met Ile Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg
195 200 205
Gly Glu Asn Gly Arg Arg Thr Arg Val Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn
210 215 220
Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Ala Gln Arg Ala Met Met Asp
225 230 235 240
Gln Val Arg Glu Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala Glu Ile Glu Asp Leu
245 250 255
Ile Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His
260 265 270
Lys Ser Cys Leu Pro Ala Cys Val Tyr Gly Leu Ala Val Ala Ser Gly
275 280 285
His Asp Phe Glu Arg Glu Gly Tyr Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe
290 295 300
Lys Leu Leu Gln Asn Ser Gln Val Val Ser Leu Met Arg Pro Asn
305 310 315
<210> 19
<211> 252
<212> PRT
<213> Influenza
<400> 19
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Tyr Val Leu Ser Ile Ile Pro
1 5 10 15
Ser Gly Pro Leu Lys Ala Glu Ile Ala Gln Arg Leu Glu Ser Val Phe
20 25 30
Ala Gly Lys Asn Thr Asp Leu Glu Ala Leu Met Glu Trp Leu Lys Thr
35 40 45
Arg Pro Ile Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe
50 55 60
Thr Leu Thr Val Pro Ser Glu Arg Gly Leu Gln Arg Arg Arg Phe Val
65 70 75 80
Gln Asn Ala Leu Asn Gly Asn Gly Asp Pro Asn Asn Met Asp Arg Ala
85 90 95
Val Lys Leu Tyr Lys Lys Leu Lys Arg Glu Ile Thr Phe His Gly Ala
100 105 110
Lys Glu Val Ser Leu Ser Tyr Ser Thr Gly Ala Leu Ala Ser Cys Met
115 120 125
Gly Leu Ile Tyr Asn Arg Met Gly Thr Val Thr Thr Glu Ala Ala Phe
130 135 140
Gly Leu Val Cys Ala Thr Cys Glu Gln Ile Ala Asp Ser Gln His Arg
145 150 155 160
Ser His Arg Gln Met Ala Thr Thr Thr Asn Pro Leu Ile Arg His Glu
165 170 175
Asn Arg Met Val Leu Ala Ser Thr Thr Ala Lys Ala Met Glu Gln Met
180 185 190
Ala Gly Ser Ser Glu Gln Ala Ala Glu Ala Met Glu Val Ala Asn Gln
195 200 205
Thr Arg Gln Met Val His Ala Met Arg Thr Ile Gly Thr His Pro Ser
210 215 220
Ser Ser Ala Gly Leu Lys Asp Asp Leu Leu Glu Asn Leu Gln Ala Tyr
225 230 235 240
Gln Lys Arg Met Gly Val Gln Met Gln Arg Phe Lys
245 250
<210> 20
<211> 219
<212> PRT
<213> Influenza
<400> 20
Met Asp Ser Asn Thr Met Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu Trp
1 5 10 15
His Ile Arg Lys Arg Phe Ala Asp Asn Gly Leu Gly Asp Ala Pro Phe
20 25 30
Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Lys Gly Arg Gly Asn
35 40 45
Thr Leu Gly Leu Asp Ile Glu Thr Ala Thr Leu Val Gly Lys Gln Ile
50 55 60
Val Glu Trp Ile Leu Lys Glu Glu Ser Ser Glu Thr Leu Arg Met Thr
65 70 75 80
Ile Ala Ser Val Pro Thr Ser Arg Tyr Leu Ser Asp Met Thr Leu Glu
85 90 95
Glu Met Ser Arg Asp Trp Phe Met Leu Met Pro Arg Gln Lys Ile Ile
100 105 110
Gly Pro Leu Cys Val Arg Leu Asp Gln Ala Ile Met Glu Lys Asn Ile
115 120 125
Val Leu Lys Ala Asn Phe Ser Val Ile Phe Asn Arg Leu Glu Thr Leu
130 135 140
Ile Leu Leu Arg Ala Phe Thr Glu Glu Gly Ala Ile Val Gly Glu Ile
145 150 155 160
Ser Pro Leu Pro Ser Leu Pro Gly His Thr Tyr Glu Asp Val Lys Asn
165 170 175
Ala Val Gly Val Leu Ile Gly Gly Leu Glu Trp Asn Gly Asn Thr Val
180 185 190
Arg Val Ser Glu Asn Ile Gln Arg Phe Ala Trp Arg Asn Cys Asp Glu
195 200 205
Asn Gly Arg Pro Ser Leu Pro Pro Glu Gln Lys
210 215
<210> 21
<211> 2151
<212> DNA
<213> Influenza
<400> 21
atggaagact ttgtgcgaca atgcttcaat ccaatgatcg tcgagcttgc ggaaaaggca 60
atgaaagaat atggggaaga tccgaaaatc gaaactaaca agtttgctgc aatatgcaca 120
catttggaag tttgtttcat gtattcggat ttccatttca tcgacgaacg gggtgaatca 180
ataattgtag aatctggtga cccgaatgca ctattgaagc accgatttga gataattgaa 240
ggaagagacc gaatcatggc ctggacagtg gtgaacagta tatgtaacac aacaggggta 300
gagaagccta aatttcttcc tgatttgtat gattacaaag agaaccggtt cattgaaatt 360
ggagtaacac ggagggaagt ccacatatat tacctagaga aagccaacaa aataaaatct 420
gagaagacac acattcacat cttttcattc actggagagg agatggccac caaagcggac 480
tacacccttg acgaagagag cagggcaaga atcaaaacta ggcttttcac tataagacaa 540
gaaatggcca gtaggagtct atgggattcc tttcgtcagt ccgaaagagg cgaagagaca 600
attgaagaaa aatttgagat tacaggaact atgcgcaagc ttgccgacca aagtctccca 660
ccgaacttcc ccagccttga aaactttaga gcctatgtag atggattcga gccgaacggc 720
tgcattgagg gcaagctttc ccaaatgtca aaagaagtga acgccaaaat tgaaccattc 780
ttgaggacga caccacgccc cctcagattg cctgatgggc ctctttgcca tcagcggtca 840
aagttcctgc tgatggatgc tctgaaatta agtattgaag acccgagtca cgagggggag 900
ggaataccac tatatgatgc aatcaaatgc atgaagacat tctttggctg gaaagagcct 960
aacatagtca aaccacatga gaaaggcata aatcccaatt acctcatggc ttggaagcag 1020
gtgctagcag agctacagga cattgaaaat gaagagaaga tcccaaggac aaagaacatg 1080
aagagaacaa gccaattgaa gtgggcactc ggtgaaaata tggcaccaga aaaagtagac 1140
tttgatgact gcaaagatgt tggagacctt aaacagtatg acagtgatga gccagagccc 1200
agatctctag caagctgggt ccaaaatgaa ttcaataagg catgtgaatt gactgattca 1260
agctggatag aacttgatga aataggagaa gatgttgccc cgattgaaca tatcgcaagc 1320
atgaggagga actattttac agcagaagtg tcccactgca gggctactga atacataatg 1380
aagggagtgt acataaatac ggccttgctc aatgcatcct gtgcagccat ggatgacttt 1440
cagctgatcc caatgataag caaatgtagg accaaagaag gaagacggaa aacaaacctg 1500
tatgggttca ttataaaagg aaggtctcat ttgagaaatg atactgatgt ggtgaacttt 1560
gtaagtatgg agttctcact cactgacccg agactggagc cacacaaatg ggaaaaatac 1620
tgtgttcttg aaataggaga catgctcttg aggactgcga taggccaagt gtcgaggccc 1680
atgttcctat atgtgagaac caatggaacc tccaagatca agatgaaatg gggcatggaa 1740
atgaggcgct gccttcttca gtctcttcag cagattgaga gcatgattga ggccgagtct 1800
tctgtcaaag agaaagacat gaccaaggaa ttctttgaaa acaaatcgga aacatggcca 1860
atcggagagt cacccagggg agtggaggaa ggctctattg ggaaagtgtg caggacctta 1920
ctggcaaaat ctgtattcaa cagtctatat gcgtctccac aacttgaggg gttttcggct 1980
gaatctagaa aattgcttct cattgttcag gcacttaggg acaacctgga acctggaacc 2040
ttcgatcttg gggggctata tgaagcaatc gaggagtgcc tgattaatga tccctgggtt 2100
ttgcttaatg catcttggtt caactccttc ctcacacatg cactgaagta g 2151
<210> 22
<211> 2341
<212> DNA
<213> Influenza
<400> 22
agcgaaagca ggcaaaccat ttgaatggat gtcaatccga ctctactttt cctaaaaatt 60
ccagcgcaaa atgccataag caccacattc ccttatactg gagatcctcc atacagccat 120
ggaacaggaa caggatacac catggacaca gtaaacagaa cacaccaata ctcagaaaag 180
ggaaagtgga cgacaaacac agagactggt gcaccccagc tcaacccgat tgatggacca 240
ctacctgagg ataatgaacc aagtgggtat gcacaaacag actgtgttct agaggctatg 300
gctttccttg aagaatccca cccaggaata tttgagaatt catgccttga aacaatggaa 360
gttgttcaac aaacaagggt agataaacta actcaaggtc gccagactta tgattggaca 420
ttaaacagaa atcaaccggc agcaactgca ttggccaaca ccatagaagt ctttagatcg 480
aatggcctaa cagctaatga gtcaggaagg ctaatagatt tcttaaagga tgtaatggaa 540
tcaatgaaca aagaggaaat agagataaca acccactttc aaagaaaaag gagagtaaga 600
gacaacatga ccaagaagat ggtcacgcaa agaacaatag ggaagaaaaa acaaagactg 660
aataagagag gctatctaat aagagcactg acattaaata cgatgaccaa agatgcagag 720
agaggcaagt taaaaagaag ggctatcgca acacctggga tgcagattag aggtttcgta 780
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gtagggggca atgaaaagaa ggccaaactg gcaaatgttg tgagaaagat gatgactaat 900
tcacaagaca cagagatttc tttcacaatc actggggaca acactaagtg gaatgaaaat 960
caaaatcctc gaatgttcct ggcgatgatt acatatatca ccagaaatca acccgagtgg 1020
ttcagaaaca tcctgagcat ggcacccata atgttctcaa acaaaatggc aagactaggg 1080
aaagggtaca tgttcgagag taaaagaatg aagattcgaa cacaaatacc agcagaaatg 1140
ctagcaagca ttgacctgaa gtacttcaat gaatcaacaa agaagaaaat tgagaaaata 1200
aggcctcttc taatagatgg cacagcatca ctgagtcctg ggatgatgat gggcatgttc 1260
aacatgctaa gtacggtctt gggagtctcg atactgaatc ttggacaaaa gaaatacacc 1320
aagacaatat actggtggga tgggctccaa tcatccgacg attttgctct catagtgaat 1380
gcaccaaacc atgagggaat acaagcagga gtggacagat tctacaggac ctgcaagtta 1440
gtgggaatca acatgagcaa aaagaagtcc tatataaata agacagggac atttgaattc 1500
acaagctttt tttatcgcta tggatttgtg gctaatttta gcatggagct acccagcttt 1560
ggagtgtctg gagtaaatga atcagctgac atgagtattg gagtaacagt gataaagaac 1620
aacatgataa acaatgacct tggacctgca acggcccaga tggctcttca attgttcatc 1680
aaagactaca gatacacata taggtgccat aggggagaca cacaaattca gacaagaaga 1740
tcatttgagt taaagaagct gtgggatcaa acccaatcaa aggtagggct attagtatca 1800
gatggaggac caaacttata caatatacgg aatcttcaca ttcctgaagt ctgcttaaaa 1860
tgggagctaa tggatgatga ttatcgggga agactttgta atcccctgaa tccctttgtc 1920
agtcataaag agattgattc tgtaaacaat gctgtggtaa tgccagccca tggtccagcc 1980
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tctattctca acacaagcca aaggggaatt cttgaggatg aacagatgta ccagaagtgc 2100
tgcaatctat tcgagaaatt tttccctagc agttcatata ggagaccggt tggaatttct 2160
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ggacggatca agaaagaaga gttctctgag atcatgaaga tctgttccac cattgaagaa 2280
ctcagacggc aaaaataatg aatttaactt gtccttcatg aaaaaatgcc ttgtttctac 2340
t 2341
<210> 23
<211> 2280
<212> DNA
<213> Influenza
<400> 23
atggagagaa taaaagaact gagagatcta atgtcgcagt cccgcactcg cgagatactc 60
actaagacca ctgtggacca tatggccata atcaaaaagt acacatcagg aaggcaagag 120
aagaaccccg cactcagaat gaagtggatg atggcaatga gatacccaat tacagcagac 180
aagagaataa tggacatgat tccagagagg aatgaacaag gacaaaccct ctggagcaaa 240
acaaacgatg ctggatcaga ccgagtgatg gtatcacctc tggccgtaac atggtggaat 300
aggaatggcc caacaacaag tacagttcat taccctaagg tatataaaac ttatttcgaa 360
aaggtcgaaa ggttgaaaca tggtaccttc ggccctgtcc acttcagaaa tcaagttaaa 420
ataaggagga gagttgatac aaaccctggc catgcagatc tcagtgccaa ggaggcacag 480
gatgtgatta tggaagttgt tttcccaaat gaagtggggg caagaatact gacatcagag 540
tcacagctgg caataacaaa agagaagaaa gaagagctcc aggattgtaa aattgctccc 600
ttgatggtgg cgtacatgct agaaagagaa ttggtccgta aaacaaggtt tctcccagta 660
gccggcggaa caggcagtgt ttatattgaa gtgttgcact taacccaagg gacgtgctgg 720
gagcagatgt acactccagg aggagaagtg agaaatgatg atgttgacca aagtttgatt 780
atcgctgcta gaaacatagt aagaagagca gcagtgtcag cagacccatt agcatctctc 840
ttggaaatgt gccacagcac acagattgga ggagtaagga tggtggacat ccttagacag 900
aatccaactg aggaacaagc cgtagacata tgcaaggcag caatagggtt gaggattagc 960
tcatctttca gttttggtgg gttcactttc aaaaggacaa gcggatcatc agtcaagaaa 1020
gaagaagaag tgctaacggg caacctccaa acactgaaaa taagagtaca tgaagggtat 1080
gaagaattca caatggttgg gagaagagca acagctattc tcagaaaggc aaccaggaga 1140
ttgatccagt tgatagtaag cgggagagac gagcagtcaa ttgctgaggc aataattgtg 1200
gccatggtat tctcacagga ggattgcatg atcaaggcag ttaggggcga tctgaacttt 1260
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gatgcaaaag tgcttttcca gaactgggga attgaatcca tcgacaatgt gatgggaatg 1380
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tttttaaggg ttagagatca aagagggaac gtactattgt ctcccgaaga agtcagtgaa 1560
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cagcaaatgc gggatgtgct tgggacattt gacactgtcc aaataataaa acttctcccc 1860
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gacaagagat atggcccagc attaagcatc aatgaactga gcaatcttgc aaaaggagag 2160
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tctagcatac ttactgacag ccagacagcg accaaaagaa ttcggatggc catcaattag 2280
<210> 24
<211> 958
<212> DNA
<213> Influenza
<400> 24
atggcgtctc aaggcaccaa acgatcatat gaacaaatgg agactggtgg ggagcgccag 60
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caagtaagag aaagtcgaaa cccaggaaac gctgagattg aagacctcat tttcctggca 780
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tatgggcttg cagtagcaag tgggcatgac tttgaaaggg aagggtactc actggtcggg 900
atagacccat tcaaattact ccaaaacagc caagtggtca gcctgatgag accaaatg 958
<210> 25
<211> 982
<212> DNA
<213> Influenza
<400> 25
atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gttctttcta tcatcccgtc aggccccctc 60
aaagccgaga tcgcgcagag actggaaagt gtctttgcag gaaagaacac agatcttgag 120
gctctcatgg aatggctaaa gacaagacca atcttgtcac ctctgactaa gggaatttta 180
ggatttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgctttgtc 240
caaaatgccc taaatgggaa tggggacccg aacaacatgg atagagcagt taaactatac 300
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actggtgcac ttgccagttg catgggcctc atatacaaca ggatgggaac agtgaccaca 420
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tctcacagac agatggctac taccaccaat ccactaatca ggcatgaaaa cagaatggtg 540
ctggctagca ctacggcaaa ggctatggaa cagatggctg gatcgagtga acaggcagcg 600
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tgtcaacata gagctagagt aa 982
<210> 26
<211> 865
<212> DNA
<213> Influenza
<400> 26
atggactcca acaccatgtc aagctttcag gtagactgtt tcctttggca tatccgcaag 60
cgatttgcag acaatggatt gggtgatgcc ccattccttg atcggctccg ccgagatcaa 120
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gactggttca tgctcatgcc taggcaaaag ataataggcc ctctttgcgt gcgattggac 360
caggcgatca tggaaaagaa catagtactg aaagcgaact tcagtgtaat ctttaaccga 420
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tcaccattac cttctcttcc aggacatact tatgaggatg tcaaaaatgc agttggggtc 540
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acaactactg cttgaagtag aacaagagat aagagctttc tcgtttcagc ttatttaatg 840
ataaaaaaca cccttgtttc tactg 865
<210> 27
<211> 758
<212> PRT
<213> Influenza
<400> 27
Met Asp Val Asn Pro Thr Leu Leu Phe Leu Lys Ile Pro Ala Gln Asn
1 5 10 15
Ala Ile Ser Thr Thr Phe Pro Tyr Thr Gly Asp Pro Pro Tyr Ser His
20 25 30
Gly Thr Gly Thr Gly Tyr Thr Met Asp Thr Val Asn Arg Thr His Gln
35 40 45
Tyr Ser Glu Lys Gly Lys Trp Thr Thr Asn Thr Glu Thr Gly Ala Pro
50 55 60
Gln Leu Asn Pro Ile Asp Gly Pro Leu Pro Glu Asp Asn Glu Pro Ser
65 70 75 80
Gly Tyr Ala Gln Thr Asp Cys Val Leu Glu Ala Met Ala Phe Leu Glu
85 90 95
Glu Ser His Pro Gly Ile Phe Glu Asn Ser Cys Leu Glu Thr Met Glu
100 105 110
Val Val Gln Gln Thr Arg Val Asp Arg Leu Thr Gln Gly Arg Gln Thr
115 120 125
Tyr Asp Trp Thr Leu Asn Arg Asn Gln Pro Ala Ala Thr Ala Leu Ala
130 135 140
Asn Thr Ile Glu Val Phe Arg Ser Asn Gly Leu Thr Ala Asn Glu Ser
145 150 155 160
Gly Arg Leu Ile Asp Phe Leu Lys Asp Val Met Glu Ser Met Asp Lys
165 170 175
Glu Glu Ile Glu Ile Thr Thr His Phe Gln Arg Lys Arg Arg Val Arg
180 185 190
Asp Asn Met Thr Lys Lys Met Val Thr Gln Arg Thr Ile Gly Lys Lys
195 200 205
Lys Gln Arg Val Asn Lys Arg Ser Tyr Leu Ile Arg Ala Leu Thr Leu
210 215 220
Asn Thr Met Thr Lys Asp Ala Glu Arg Gly Lys Leu Lys Arg Arg Ala
225 230 235 240
Ile Ala Thr Pro Gly Met Gln Ile Arg Gly Phe Val Tyr Phe Val Glu
245 250 255
Thr Leu Ala Arg Ser Ile Cys Glu Lys Leu Glu Gln Ser Gly Leu Pro
260 265 270
Val Gly Gly Asn Glu Lys Lys Ala Lys Leu Ala Asn Val Val Arg Lys
275 280 285
Met Met Thr Asn Ser Gln Asp Thr Glu Leu Ser Phe Thr Ile Thr Gly
290 295 300
Asp Asn Thr Lys Trp Asn Glu Asn Gln Asn Pro Arg Met Phe Leu Ala
305 310 315 320
Met Ile Thr Tyr Ile Thr Lys Asn Gln Pro Glu Trp Phe Arg Asn Ile
325 330 335
Leu Ser Ile Ala Pro Ile Met Phe Ser Asn Lys Met Ala Arg Leu Gly
340 345 350
Lys Gly Tyr Met Phe Glu Ser Lys Arg Met Lys Leu Arg Thr Gln Ile
355 360 365
Pro Ala Glu Met Leu Ala Ser Ile Asp Leu Lys Tyr Phe Asn Glu Ser
370 375 380
Thr Arg Lys Lys Ile Glu Lys Ile Arg Pro Leu Leu Ile Asp Gly Thr
385 390 395 400
Ala Ser Leu Ser Pro Gly Met Met Met Gly Met Phe Asn Met Leu Ser
405 410 415
Thr Val Leu Gly Val Ser Ile Leu Asn Leu Gly Gln Lys Lys Tyr Thr
420 425 430
Lys Thr Thr Tyr Trp Trp Asp Gly Leu Gln Ser Ser Asp Asp Phe Ala
435 440 445
Leu Ile Val Asn Ala Pro Asn His Glu Gly Ile Gln Ala Gly Val Asp
450 455 460
Arg Phe Tyr Arg Thr Cys Lys Leu Val Gly Ile Asn Met Ser Lys Lys
465 470 475 480
Lys Ser Tyr Ile Asn Arg Thr Gly Thr Phe Glu Phe Thr Ser Phe Phe
485 490 495
Tyr Arg Tyr Gly Phe Val Ala Asn Phe Ser Met Glu Leu Pro Ser Phe
500 505 510
Gly Val Ser Gly Ile Asn Glu Ser Ala Asp Met Ser Ile Gly Val Thr
515 520 525
Val Ile Lys Asn Asn Met Ile Asn Asn Asp Leu Gly Pro Ala Thr Ala
530 535 540
Gln Met Ala Leu Gln Leu Phe Ile Lys Asp Tyr Arg Tyr Thr Tyr Arg
545 550 555 560
Cys His Arg Gly Asp Thr Gln Ile Gln Thr Arg Arg Ser Phe Glu Leu
565 570 575
Lys Lys Leu Trp Glu Gln Thr Arg Ser Lys Ala Gly Leu Leu Val Ser
580 585 590
Asp Gly Gly Pro Asn Leu Tyr Asn Ile Arg Asn Leu His Ile Pro Glu
595 600 605
Val Cys Leu Lys Trp Glu Leu Met Asp Glu Asp Tyr Gln Gly Arg Leu
610 615 620
Cys Asn Pro Leu Asn Pro Phe Val Ser His Lys Glu Ile Glu Ser Val
625 630 635 640
Asn Asn Ala Val Val Met Pro Ala His Gly Pro Ala Lys Ser Met Glu
645 650 655
Tyr Asp Ala Val Ala Thr Thr His Ser Trp Ile Pro Lys Arg Asn Arg
660 665 670
Ser Ile Leu Asn Thr Ser Gln Arg Gly Ile Leu Glu Asp Glu Gln Met
675 680 685
Tyr Gln Lys Cys Cys Asn Leu Phe Glu Lys Phe Phe Pro Ser Ser Ser
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Lys Glu Glu Phe Ser Glu Ile Met Lys Ile Cys Ser Thr Ile Glu Glu
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Leu Arg Arg Gln Lys Gln
755
<210> 28
<211> 716
<212> PRT
<213> Influenza
<400> 28
Met Glu Asp Phe Val Arg Gln Cys Phe Asn Pro Met Ile Val Glu Leu
1 5 10 15
Ala Glu Lys Thr Met Lys Glu Tyr Gly Glu Asp Leu Lys Ile Glu Thr
20 25 30
Asn Lys Phe Ala Ala Ile Cys Thr His Leu Glu Val Cys Phe Met Tyr
35 40 45
Ser Asp Phe His Phe Ile Asn Glu Gln Gly Glu Ser Ile Ile Val Glu
50 55 60
Leu Gly Asp Pro Asn Ala Leu Leu Lys His Arg Phe Glu Ile Ile Glu
65 70 75 80
Gly Arg Asp Arg Thr Met Ala Trp Thr Val Val Asn Ser Ile Cys Asn
85 90 95
Thr Thr Gly Ala Glu Lys Pro Lys Phe Leu Pro Asp Leu Tyr Asp Tyr
100 105 110
Lys Glu Asn Arg Phe Ile Glu Ile Gly Val Thr Arg Arg Glu Val His
115 120 125
Ile Tyr Tyr Leu Glu Lys Ala Asn Lys Ile Lys Ser Glu Lys Thr His
130 135 140
Ile His Ile Phe Ser Phe Thr Gly Glu Glu Met Ala Thr Lys Ala Asp
145 150 155 160
Tyr Thr Leu Asp Glu Glu Ser Arg Ala Arg Ile Lys Thr Arg Leu Phe
165 170 175
Thr Ile Arg Gln Glu Met Ala Ser Arg Gly Leu Trp Asp Ser Phe Arg
180 185 190
Gln Ser Glu Arg Gly Glu Glu Thr Ile Glu Glu Arg Phe Glu Ile Thr
195 200 205
Gly Thr Met Arg Lys Leu Ala Asp Gln Ser Leu Pro Pro Asn Phe Ser
210 215 220
Ser Leu Glu Asn Phe Arg Ala Tyr Val Asp Gly Phe Glu Pro Asn Gly
225 230 235 240
Tyr Ile Glu Gly Lys Leu Ser Gln Met Ser Lys Glu Val Asn Ala Arg
245 250 255
Ile Glu Pro Phe Leu Lys Thr Thr Pro Arg Pro Leu Arg Leu Pro Asn
260 265 270
Gly Pro Pro Cys Ser Gln Arg Ser Lys Phe Leu Leu Met Asp Ala Leu
275 280 285
Lys Leu Ser Ile Glu Asp Pro Ser His Glu Gly Glu Gly Ile Pro Leu
290 295 300
Tyr Asp Ala Ile Lys Cys Met Arg Thr Phe Phe Gly Trp Lys Glu Pro
305 310 315 320
Asn Val Val Lys Pro His Glu Lys Gly Ile Asn Pro Asn Tyr Leu Leu
325 330 335
Ser Trp Lys Gln Val Leu Ala Glu Leu Gln Asp Ile Glu Asn Glu Glu
340 345 350
Lys Ile Pro Lys Thr Lys Asn Met Lys Lys Thr Ser Gln Leu Lys Trp
355 360 365
Ala Leu Gly Glu Asn Met Ala Pro Glu Lys Val Asp Phe Asp Asp Cys
370 375 380
Lys Asp Val Gly Asp Leu Lys Gln Tyr Asp Ser Asp Glu Pro Glu Leu
385 390 395 400
Arg Ser Leu Ala Ser Trp Ile Gln Asn Glu Phe Asn Lys Ala Cys Glu
405 410 415
Leu Thr Asp Ser Ser Trp Ile Glu Leu Asp Glu Ile Gly Glu Asp Val
420 425 430
Ala Pro Ile Glu His Ile Ala Ser Met Arg Arg Asn Tyr Phe Thr Ser
435 440 445
Glu Val Ser His Cys Arg Ala Thr Glu Tyr Ile Met Lys Gly Val Tyr
450 455 460
Ile Asn Thr Ala Leu Leu Asn Ala Ser Cys Ala Ala Met Asp Asp Phe
465 470 475 480
Gln Leu Ile Pro Met Ile Ser Lys Cys Arg Thr Lys Glu Gly Arg Arg
485 490 495
Lys Thr Asn Leu Tyr Gly Phe Ile Ile Lys Gly Arg Ser His Leu Arg
500 505 510
Asn Asp Thr Asp Val Val Asn Phe Val Ser Met Glu Phe Ser Leu Thr
515 520 525
Asp Pro Arg Leu Glu Pro His Lys Trp Glu Lys Tyr Cys Val Leu Glu
530 535 540
Ile Gly Asp Met Leu Ile Arg Ser Ala Ile Gly Gln Val Ser Arg Pro
545 550 555 560
Met Phe Leu Tyr Val Arg Thr Asn Gly Thr Ser Lys Ile Lys Met Lys
565 570 575
Trp Gly Met Glu Met Arg Arg Cys Leu Leu Gln Ser Leu Gln Gln Ile
580 585 590
Glu Ser Met Ile Glu Ala Glu Ser Ser Val Lys Glu Lys Asp Met Thr
595 600 605
Lys Glu Phe Phe Glu Asn Lys Ser Glu Thr Trp Pro Ile Gly Glu Ser
610 615 620
Pro Lys Gly Val Glu Glu Ser Ser Ile Gly Lys Val Cys Arg Thr Leu
625 630 635 640
Leu Ala Lys Ser Val Phe Asn Ser Leu Tyr Ala Ser Pro Gln Leu Glu
645 650 655
Gly Phe Ser Ala Glu Ser Arg Lys Leu Leu Leu Ile Val Gln Ala Leu
660 665 670
Arg Asp Asn Leu Glu Pro Gly Thr Phe Asp Leu Gly Gly Leu Tyr Glu
675 680 685
Ala Ile Glu Glu Cys Leu Ile Asn Asp Pro Trp Val Leu Leu Asn Ala
690 695 700
Ser Trp Phe Asn Ser Phe Leu Thr His Ala Leu Ser
705 710 715
<210> 29
<211> 326
<212> PRT
<213> Influenza
<400> 29
Met Ala Ser Gln Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr Asp
1 5 10 15
Gly Glu Arg Gln Asn Ala Thr Glu Ile Arg Ala Ser Val Gly Lys Met
20 25 30
Ile Gly Gly Ile Gly Arg Phe Tyr Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu Lys
35 40 45
Leu Ser Asp Tyr Glu Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser Leu Thr Ile Glu
50 55 60
Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg Arg Asn Lys Tyr Leu Glu
65 70 75 80
Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Ile
85 90 95
Tyr Arg Arg Val Asn Gly Lys Trp Met Arg Glu Leu Ile Leu Tyr Asp
100 105 110
Lys Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Gln Ala Asn Asn Gly Asp Asp
115 120 125
Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Met Met Ile Trp His Ser Asn Leu Asn
130 135 140
Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp
145 150 155 160
Pro Arg Met Cys Ser Leu Met Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser
165 170 175
Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Val Gly Thr Met Val Met Glu
180 185 190
Leu Val Arg Met Ile Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg
195 200 205
Gly Glu Asn Gly Arg Lys Thr Arg Ile Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn
210 215 220
Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Ala Gln Lys Ala Met Met Asp
225 230 235 240
Gln Val Arg Glu Ser Arg Asp Pro Gly Asn Ala Glu Phe Glu Asp Leu
245 250 255
Thr Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His
260 265 270
Lys Ser Cys Leu Pro Ala Cys Val Tyr Gly Pro Ala Val Ala Ser Gly
275 280 285
Tyr Asp Phe Glu Arg Glu Gly Tyr Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe
290 295 300
Arg Leu Leu Gln Asn Ser Gln Val Tyr Ser Leu Ile Arg Pro Asn Glu
305 310 315 320
Asn Pro Ala His Lys Ser
325
<210> 30
<211> 252
<212> PRT
<213> Influenza
<400> 30
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Tyr Val Leu Ser Ile Ile Pro
1 5 10 15
Ser Gly Pro Leu Lys Ala Glu Ile Ala Gln Arg Leu Glu Asp Val Phe
20 25 30
Ala Gly Lys Asn Thr Asp Leu Glu Val Leu Met Glu Trp Leu Lys Thr
35 40 45
Arg Pro Ile Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe
50 55 60
Thr Leu Thr Val Pro Ser Glu Arg Gly Leu Gln Arg Arg Arg Phe Val
65 70 75 80
Gln Asn Ala Leu Asn Gly Asn Gly Asp Pro Asn Asn Met Asp Lys Ala
85 90 95
Val Lys Leu Tyr Arg Lys Leu Lys Arg Glu Ile Thr Phe His Gly Ala
100 105 110
Lys Glu Ile Ser Leu Ser Tyr Ser Ala Gly Ala Leu Ala Ser Cys Met
115 120 125
Gly Leu Ile Tyr Asn Arg Met Gly Ala Val Thr Thr Glu Val Ala Phe
130 135 140
Gly Leu Val Cys Ala Thr Cys Glu Gln Ile Ala Asp Ser Gln His Arg
145 150 155 160
Ser His Arg Gln Met Val Thr Thr Thr Asn Pro Leu Ile Arg His Glu
165 170 175
Asn Arg Met Val Leu Ala Ser Thr Thr Ala Lys Ala Met Glu Gln Met
180 185 190
Ala Gly Ser Ser Glu Gln Ala Ala Glu Ala Met Glu Val Ala Ser Gln
195 200 205
Ala Arg Gln Met Val Gln Ala Met Arg Thr Ile Gly Thr His Pro Ser
210 215 220
Ser Ser Ala Gly Leu Lys Asn Asp Leu Leu Glu Asn Leu Gln Ala Tyr
225 230 235 240
Gln Lys Arg Met Gly Val Gln Met Gln Arg Phe Lys
245 250
<210> 31
<211> 2299
<212> DNA
<213> Influenza
<400> 31
aatatggaaa gaataaaaga gctaaggaat ctgatgtcac aatctcgcac tcgcgagata 60
cttacaaaaa ctactgtaga ccacatggcc ataatcaaga aatacacatc aggaagacag 120
gagaaaaacc catcacttag aatgaaatgg atgatggcaa tgaaataccc aattacagca 180
gataaaagga taacggaaat gattcctgaa agaaatgagc aaggacagac attatggagt 240
aaagtgaatg atgccggatc agaccgagtg atgatatcac ccctggctgt gacatggtgg 300
aacagaaatg gaccagtggc aagtactatt cactatccaa aaatctacaa aacttacttt 360
gaaaaggttg aaaggttaaa acatggaacc tttggccctg tacactttag aaaccaagtc 420
aaaatacgcc gaagagtcga cataaatcct ggtcatgcag acctcagcgc caaggaggca 480
caggatgtaa ttatggaagt tgttttccct aatgaagtgg gagccagaat actaacatca 540
gaatcgcaat taacgataac caaggagaaa aaagaagaac tccagaattg caaaatttcc 600
cctttgatgg ttgcatacat gttagagagg gaacttgtcc gcaaaacgag atttctcccg 660
gttgctggtg gaacaagcag tgtgtacatt gaagttttgc atttaacaca ggggacatgc 720
tgggagcaga tgtacactcc aggtggggag gtgaggaatg atgatgttga tcaaagccta 780
attattgctg ctaggaacat agtgagaaga gctgcagtat cagcagatcc actagcatct 840
ttattagaaa tgtgccatag cacacagatt ggtgggacaa ggatggtgga tattctcagg 900
caaaatccaa cagaagaaca agctgtggat atatgcaaag cagcaatggg gctgagaatc 960
agttcatcct tcagttttgg cggattcaca tttaagagaa caagtggatc atcagtcaaa 1020
agggaggaag aagtgctcac gggcaatctg caaacattga agctaactgt gcatgaggga 1080
tatgaagagt tcacaatggt tgggaaaagg gcaacagcta tactcagaaa agcaaccagg 1140
agattgattc aactaatagt gagtggaaga gacgaacagt caatagtcga agcaatagtt 1200
gtagcaatgg tattctcaca agaagattgc atggtaaaag cagttagagg tgatctgaat 1260
ttcgttaata gagcgaatca gcggttgaat cccatgcatc aacttttgag acattttcag 1320
aaggatgcta aagtactttt cttaaattgg ggaattgaac ctatcgacaa tgtgatggga 1380
atgattggga tattacctga tatgactcca agtaccgaga tgtcaatgag aggagtgaga 1440
gtcagcaaaa tgggtgtaga tgaatactcc aatgctgaaa gggtagtggt gagcattgac 1500
cgttttttga gagtccggga ccaaagagga aatgtactac tgtctccaga ggaagtcagt 1560
gaaacacagg gaacagagaa actgacaata acttactctt catcaatgat gtgggagatt 1620
aatggccctg agtcagtgtt gatcaatacc tatcagtgga tcatcagaaa ctgggagact 1680
gttaaaattc agtggtctca gaaccctaca atgctataca ataaaatgga attcgagcca 1740
tttcagtctc tagtccctaa ggccattaga ggccaataca gtgggtttgt tagaactcta 1800
tttcaacaaa tgagggatgt gcttgggacc tttgacacaa ctcagataat aaaacttctt 1860
ccctttgcag ccgctccacc aaagcaaagt agaatgcaat tctcatcatt gactgtgaat 1920
gtgaggggat caggaatgag aatacttgta aggggtaatt ctccagtatt caactacaac 1980
aagaccacta agagactcac agtcctcgga aaggatgctg gcactttaac tgaagaccca 2040
gatgaaggca cagctggagt ggaatctgct gttctaaggg gattcctcat tctaggcaaa 2100
gaagatagaa gatatgggcc agcattaagc atcaatgaat tgagcaacct tgcgaaaggg 2160
gaaaaagcta atgtgctaat tgggcaaggg gacgtagtgt tggtaatgaa acgaaaacgg 2220
gactctagca tacttactga cagccagaca gcgaccaaaa gaattcggat ggccatcaat 2280
taatttcgaa taatttaaa 2299
<210> 32
<211> 2277
<212> DNA
<213> Influenza
<400> 32
atggaacgca ttaaagaact gcgcaacctg atgagccaga gccgcacccg cgaaattctg 60
accaaaacca ccgtggatca tatggcgatt attaaaaaat ataccagcgg ccgccaggaa 120
aaaaacccga gcctgcgcat gaaatggatg atggcgatga aatatccgat taccgcggat 180
aaacgcatta ccgaaatgat tccggaacgc aacgaacagg gccagaccct gtggagcaaa 240
gtgaacgatg cgggcagcga tcgcgtgatg attagcccgc tggcggtgac ctggtggaac 300
cgcaacggcc cggtggcgag caccattcat tatccgaaaa tttataaaac ctattttgaa 360
aaagtggaac gcctgaaaca tggcaccttt ggcccggtgc attttcgcaa ccaggtgaaa 420
attcgccgcc gcgtggatat taacccgggc catgcggatc tgagcgcgaa agaagcgcag 480
gatgtgatta tggaagtggt gtttccgaac gaagtgggcg cgcgcattct gaccagcgaa 540
agccagctga ccattaccaa agaaaaaaaa gaagaactgc agaactgcaa aattagcccg 600
ctgatggtgg cgtatatgct ggaacgcgaa ctggtgcgca aaacccgctt tctgccggtg 660
gcgggcggca ccagcagcgt gtatattgaa gtgctgcatc tgacccaggg cacctgctgg 720
gaacagatgt ataccccggg cggcgaagtg cgcaacgatg atgtggatca gagcctgatt 780
attgcggcgc gcaacattgt gcgccgcgcg gcggtgagcg cggatccgct ggcgagcctg 840
ctggaaatgt gccatagcac ccagattggc ggcacccgca tggtggatat tctgcgccag 900
aacccgaccg aagaacaggc ggtggatatt tgcaaagcgg cgatgggcct gcgcattagc 960
agcagcttta gctttggcgg ctttaccttt aaacgcacca gcggcagcag cgtgaaacgc 1020
gaagaagaag tgctgaccgg caacctgcag accctgaaac tgaccgtgca tgaaggctat 1080
gaagaattta ccatggtggg caaacgcgcg accgcgattc tgcgcaaagc gacccgccgc 1140
ctgattcagc tgattgtgag cggccgcgat gaacagagca ttgtggaagc gattgtggtg 1200
gcgatggtgt ttagccagga agattgcatg gtgaaagcgg tgcgcggcga tctgaacttt 1260
gtgaaccgcg cgaaccagcg cctgaacccg atgcatcagc tgctgcgcca ttttcagaaa 1320
gatgcgaaag tgctgtttct gaactggggc attgaaccga ttgataacgt gatgggcatg 1380
attggcattc tgccggatat gaccccgagc accgaaatga gcatgcgcgg cgtgcgcgtg 1440
agcaaaatgg gcgtggatga atatagcaac gcggaacgcg tggtggtgag cattgatcgc 1500
tttctgcgcg tgcgcgatca gcgcggcaac gtgctgctga gcccggaaga agtgagcgaa 1560
acccagggca ccgaaaaact gaccattacc tatagcagca gcatgatgtg ggaaattaac 1620
ggcccggaaa gcgtgctgat taacacctat cagtggatta ttcgcaactg ggaaaccgtg 1680
aaaattcagt ggagccagaa cccgaccatg ctgtataaca aaatggaatt tgaaccgttt 1740
cagagcctgg tgccgaaagc gattcgcggc cagtatagcg gctttgtgcg caccctgttt 1800
cagcagatgc gcgatgtgct gggcaccttt gataccaccc agattattaa actgctgccg 1860
tttgcggcgg cgccgccgaa acagagccgc atgcagttta gcagcctgac cgtgaacgtg 1920
cgcggcagcg gcatgcgcat tctggtgcgc ggcaacagcc cggtgtttaa ctataacaaa 1980
accaccaaac gcctgaccgt gctgggcaaa gatgcgggca ccctgaccga agatccggat 2040
gaaggcaccg cgggcgtgga aagcgcggtg ctgcgcggct ttctgattct gggcaaagaa 2100
gatcgccgct atggcccggc gctgagcatt aacgaactga gcaacctggc gaaaggcgaa 2160
aaagcgaacg tgctgattgg ccagggcgat gtggtgctgg tgatgaaacg caaacgcgat 2220
agcagcattc tgaccgatag ccagaccgcg accaaacgca ttcgcatggc gattaac 2277
Claims (56)
- 둘 또는 그 이상의 공여 균주로부터의 골격 절편들을 포함하는 재배열 인플루엔자 A 바이러스로서, HA 절편 및 PB1 절편은 동일한 인플루엔자 바이러스 HA 하위유형을 가지는 상이한 인플루엔자 A 균주로부터 유래되는 재배열 인플루엔자 A 바이러스.
- 골격 절편 PA, PB1, PB2, NP, NS 및 M을 포함하는 재배열 인플루엔자 A 바이러스로서, 골격 절편은 둘 또는 그 이상의 공여 균주로부터 유래되고, 인플루엔자 A 바이러스는 HA 및 NA 절편을 더 포함하며, HA 및 PB1 절편은 동일한 인플루엔자 바이러스 HA 하위유형을 가지는 상이한 인플루엔자 A 균주로부터 유래되는 재배열 인플루엔자 A 바이러스.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, HA 절편 및 PB1 절편은 H1 인플루엔자 균주로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 재배열 인플루엔자 A 바이러스.
- 둘 또는 그 이상의 공여 균주로부터의 골격 절편들을 포함하는 재배열 인플루엔자 A 바이러스로서, HA 절편 및 PB1 절편은 상이한 인플루엔자 바이러스 HA 하위유형을 가지는 상이한 인플루엔자 A 균주로부터 유래되고, PB1 절편은 H3 HA 하위유형을 가지는 인플루엔자 바이러스로부터 유래되지 않으며 및/또는 HA 절편은 H1 또는 H5 HA 하위유형을 가지는 인플루엔자 바이러스로부터 유래되지 않는 재배열 인플루엔자 A 바이러스.
- 제 4항에 있어서, PB1 절편은 H1 바이러스로부터 유래되고 및/또는 HA 절편은 H3 인플루엔자 바이러스로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 재배열 인플루엔자 A 바이러스.
- 둘 또는 그 이상의 공여 균주로부터의 골격 절편들을 포함하는 재배열 인플루엔자 A 바이러스로서, 적어도 하나의 골격 절편은 A/California/07/09 인플루엔자 균주로부터 유래되는 재배열 인플루엔자 A 바이러스.
- 골격 절편 PA, PB1, PB2, NP, NS 및 M을 포함하는 재배열 인플루엔자 A 바이러스로서, 골격 절편들은 둘 또는 그 이상의 공여 균주로부터 유래되고 적어도 하나의 골격 절편은 A/California/07/09 인플루엔자 균주로부터 유래되는 재배열 인플루엔자 A 바이러스.
- 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 적어도 하나의 골격 절편은 PB1 절편인 것을 특징으로 하는 재배열 인플루엔자 바이러스.
- 제 8항에 있어서, PB1 절편은 SEQ ID NO:16의 서열과 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 가지는 것을 특징으로 하는 재배열 인플루엔자 바이러스.
- 제 9항에 있어서, PB1 절편은 SEQ ID NO:16의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 재배열 인플루엔자 바이러스.
- 제 6항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, HA 절편은 H1 인플루엔자 균주로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 재배열 인플루엔자 바이러스.
- 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, PB1 절편 및 PB2 절편은 동일한 공여 균주로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 재배열 인플루엔자 A 바이러스.
- 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 게놈 절편을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 재배열 인플루엔자 A 바이러스:
a) SEQ ID NO:1의 서열에 대해 적어도 95% 또는 99%의 동일성을 가지는 PA 절편,
b) SEQ ID NO:3의 서열에 대해 적어도 95% 또는 99%의 동일성을 가지는 PB2 절편,
c) SEQ ID NO:5의 서열에 대해 적어도 95% 또는 99%의 동일성을 가지는 M 절편,
d) SEQ ID NO:4의 서열에 대해 적어도 95% 또는 99%의 동일성을 가지는 NP 절편 및/또는
e) SEQ ID NO:6의 서열에 대해 적어도 95% 또는 99%의 동일성을 가지는 NS 절편. - 제 13항에 있어서, 바이러스는 SEQ ID NO:1의 서열에 대해 95%의 동일성을 가지는 PA 절편, SEQ ID NO:3의 서열에 대해 95%의 동일성을 가지는 PB2 절편, SEQ ID NO:5의 서열에 대해 95%의 동일성을 가지는 M 절편, SEQ ID NO:4의 서열에 대해 95%의 동일성을 가지는 NP 절편 및 SEQ ID NO:6의 서열에 대해 95%의 동일성을 가지는 NS 절편을 포함하는 것을 특징으로 하는 재배열 인플루엔자 A 바이러스.
- 제 14항에 있어서, 바이러스는 SEQ ID NO:1의 서열을 가지는 PA 절편, SEQ ID NO:3의 서열을 가지는 PB2 절편, SEQ ID NO:5의 서열을 가지는 M 절편, SEQ ID NO:4의 서열을 가지는 NP 절편 및 SEQ ID NO:6의 서열을 가지는 NS 절편을 포함하는 것을 특징으로 하는 재배열 인플루엔자 A 바이러스.
- 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 2, 3 또는 4개의 공여 균주로부터의 골격 절편들을 포함하며, 각각의 공여 균주는 하나 이상의 골격 절편을 제공하는 것을 특징으로 하는 재배열 인플루엔자 A 바이러스.
- 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 둘 또는 그 이상의 공여 균주들로부터의 골격 절편들을 포함하며, PB1 절편은 A/Texas/1/77 인플루엔자 균주로부터 유래되지 않는 것을 특징으로 하는 재배열 인플루엔자 A 바이러스.
- 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 둘 또는 그 이상의 공여 균주들로부터의 골격 절편들을 포함하며, 적어도 PA, NP 또는 M 절편은 A/Puerto Rico/8/34로부터 유래되지 않는 것을 특징으로 하는 재배열 인플루엔자 A 바이러스.
- 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 게놈 절편은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 재배열 인플루엔자 A 바이러스:
a) 쌍방식 배열 알고리즘을 사용하여 SEQ ID NO:3에 대해 배열될 때, SEQ ID NO:3의 아미노산 389에 해당하는 위치에 라이신을 가지는 PB2 게놈 절편; 및/또는
b) 쌍방식 배열 알고리즘을 사용하여 SEQ ID NO:3에 대해 배열될 때, SEQ ID NO:3의 아미노산 559에 해당하는 위치에 아스파라긴을 가지는 PB2 게놈 절편; 및/또는
c) 쌍방식 배열 알고리즘을 사용하여 SEQ ID NO:1에 대해 배열될 때, SEQ ID NO:1의 아미노산 327에 해당하는 위치에 라이신을 가지는 PA 게놈 절편; 및/또는
d) 쌍방식 배열 알고리즘을 사용하여 SEQ ID NO:1에 대해 배열될 때, SEQ ID NO:1의 아미노산 444에 해당하는 위치에 아스파르트산을 가지는 PA 게놈 절편; 및/또는
e) 쌍방식 배열 알고리즘을 사용하여 SEQ ID NO:1에 대해 배열될 때, SEQ ID NO:1의 아미노산 675에 해당하는 위치에 아스파르트산을 가지는 PA 게놈 절편; 및/또는
f) 쌍방식 배열 알고리즘을 사용하여 SEQ ID NO:4에 대해 배열될 때, SEQ ID NO:4의 아미노산 27에 해당하는 위치에 쓰레오닌을 가지는 NP 게놈 절편; 및/또는
g) 쌍방식 배열 알고리즘을 사용하여 SEQ ID NO:4에 대해 배열될 때, SEQ ID NO:4의 아미노산 375에 해당하는 위치에 아스파라긴을 가지는 NP 게놈 절편 - 제 19항에 있어서, PB2 절편은 쌍방식 배열 알고리즘을 사용하여 SEQ ID NO:3에 대해 배열될 SEQ ID NO:3의 아미노산 389에 해당하는 위치에 라이신 및 SEQ ID NO:3의 아미노산 559에 해당하는 위치에 아스파라긴을 가지는 것을 특징으로 하는 재배열 인플루엔자 A 균주.
- 제 19항에 있어서, PA 게놈 절편은 쌍방식 배열 알고리즘을 사용하여 SEQ ID NO:1에 대해 배열될 SEQ ID NO:1의 아미노산 327에 해당하는 위치에 라이신; SEQ ID NO:1의 아미노산 444에 해당하는 위치에 아스파르트산 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 675에 해당하는 위치에 아스파르트산을 가지는 것을 특징으로 하는 재배열 인플루엔자 A 균주.
- 제 19항에 있어서, NP 게놈 절편은 쌍방식 배열 알고리즘을 사용하여 SEQ ID NO:4에 대해 배열될 SEQ ID NO:4의 아미노산 27에 해당하는 위치에 쓰레오닌 및 SEQ ID NO:4의 아미노산 375에 해당하는 위치에 아스파라긴을 가지는 것을 특징으로 하는 재배열 인플루엔자 A 균주.
- 제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 균주는 제 20항의 PB2 게놈 절편, 제 21항의 PA 게놈 절편 및 제 22항의 NP 게놈 절편을 포함하는 것을 특징으로 하는 재배열 인플루엔자 A 균주.
- 제 19항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 인플루엔자 A 균주는 H1 균주인 것을 특징으로 하는 인플루엔자 A 균주.
- (i) 배양 숙주에 인플루엔자 A 바이러스를 생성하기 위해 필요한 바이러스 절편들을 코드화하는 하나 또는 그 이상의 발현 구성물(들)을 도입하는 단계, 이때 발현 구성물(들)은 둘 또는 그 이상의 공여 균주로부터의 골격 절편들을 코드화하고 HA 및 PB1 게놈 절편은 동일한 인플루엔자 HA 하위유형을 가지는 상이한 인플루엔자 균주로부터 유래되며;
(ii) 배양 숙주를 배양하여 재배열 바이러스를 제조하는 단계를 포함하는,
재배열 인플루엔자 A 바이러스의 제조 방법. - 제 25항에 있어서, 발현 구성물(들)은 A/Texas/1/77 인플루엔자 균주로부터 유래되는 PB1 절편을 코드화하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
- (i) 배양 숙주에 인플루엔자 A 바이러스를 생성하기 위해 필요한 바이러스 절편들을 코드화하는 하나 또는 그 이상의 발현 구성물(들)을 도입하는 단계, 이때 발현 구성물(들)은 둘 또는 그 이상의 공여 균주로부터의 골격 절편들을 코드화하고 PB1 골격 바이러스 절편은 A/California/07/09로부터 유래되며;
(ii) 배양 숙주를 배양하여 재배열 바이러스를 제조하는 단계를 포함하는,
재배열 인플루엔자 A 바이러스의 제조 방법. - 제 25항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 발현 구성물은 SEQ ID NO:22의 서열과 적어도 90% 또는 100%의 동일성을 가지는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 25항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 구성물(들)은 SEQ ID NO:9 및/또는 11 내지 14의 서열과 적어도 90%의 동일성 또는 100%의 동일성을 가지는 서열 중 하나 또는 그 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 29항에 있어서, 발현 구성물(들)은 SEQ ID NO:9 및 11 내지 14의 서열과 적어도 90%의 동일성 또는 100%의 동일성을 가지는 모든 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 26항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 있어서, HA 절편은 H1 인플루엔자 바이러스로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 25항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii)에서 얻어진 재배열 바이러스를 정제하는 단계 (iii)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- (a) 제 1항 내지 제 24항의 재배열 인플루엔자 바이러스로 배양 숙주를 감염시키는 단계; (b) 단계 (a)로부터의 숙주를 배양하여 바이러스를 생성시키는 단계; 및 임의로 (c) 단계 (b)에서 생성된 바이러스를 정제하는 단계를 포함하는, 인플루엔자 바이러스의 제조 방법.
- (a) 제 33항의 방법에 의해 바이러스를 제조하는 단계 및 (b) 그 바이러스로부터 백신을 제조하는 단계를 포함하는, 백신의 제조 방법.
- 제 33항 또는 제 34항에 있어서, 배양 숙주가 부화 계란인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 33항 또는 제 34항에 있어서, 배양 숙주는 포유류 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 36항에 있어서, 세포는 MDCK, Vero 또는 PerC6 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 37항에 있어서, 세포는 점착하면서 성장하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 37항에 있어서, 세포는 부유하면서 성장하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 39항에 있어서, MDCK 세포는 셀라인 MDCK 33016(DSM ACC2219)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 34항 내지 제 40항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 바이러스를 비활성화시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 34항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 있어서, 백신은 전체 비리온 백신인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 34항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 있어서, 백신은 분열 비리온 백신인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 34항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 있어서, 백신은 표면 항원 백신인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 34항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 있어서, 백신은 비로좀성 백신인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 34항 내지 제 45항 중 어느 한 항에 있어서, 백신은 용량당 10ng 미만의 잔류 숙주 세포 DNA를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 있어서, 인플루엔자 균주 중 적어도 하나는 H1, H2, H5, H7 또는 H9 하위유형의 것인 것을 특징으로 하는 방법.
- 인플루엔자 A 바이러스의 절편들을 코드화하는 vRNA를 포함하는 하나 또는 그 이상의 발현 구성물(들)을 포함하는 발현 시스템으로서, 발현 구성물(들)은 둘 또는 그 이상의 인플루엔자 공여 균주로부터의 골격 바이러스 절편들을 코드화하고, HA 및 PB1 절편은 동일한 인플루엔자 HA 하위유형을 가지는 두 개의 상이한 인플루엔자 균주로부터 유래되는 발현 시스템.
- 인플루엔자 A 바이러스의 절편들을 코드화하는 vRNA를 포함하는 하나 또는 그 이상의 발현 구성물(들)을 포함하는 발현 시스템으로서, 발현 구성물(들)은 둘 또는 그 이상의 인플루엔자 공여 균주로부터의 골격 바이러스 절편들을 코드화하고, HA 및 PB1 절편은 상이한 인플루엔자 바이러스 HA 하위유형을 가지는 두 개의 상이한 인플루엔자 균주로부터 유래되며, 발현 구성물(들)은 H3 HA 하위유형을 가지는 인플루엔자 바이러스로부터의 PB1 절편을 코드화하지 않고 및/또는 발현 구성물(들)은 H1 또는 H5 HA 하위유형을 가지는 인플루엔자 바이러스로부터의 HA 절편을 코드화하지 않으며, 발현 시스템은 인플루엔자 A 바이러스의 절편들을 코드화하는 vRNA를 포함하는 하나 또는 그 이상의 발현 구성물(들)을 포함하고, 이때 발현 구성물(들)은 둘 또는 그 이상의 인플루엔자 공여 균주로부터의 골격 바이러스 절편들을 코드화하며, PB1 절편은 A/California/07/09로부터 유래되는 발현 시스템.
- 제 48항 또는 제 49항에 있어서, 발현 구성물(들)은 PR8-X로부터의 PB2, NP, NS, M 및 PA 절편들을 코드화하는 vRNA를 더 포함할 수 있는 것을 특징으로 하는 발현 시스템.
- 제 48항 내지 제 50항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 발현 구성물은 SEQ ID NO:22의 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 가지는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 시스템.
- 제 48항 내지 제 51항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 구성물(들)은 SEQ ID NO:9 및/또는 11 내지 14의 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 가지는 서열들 중 하나 또는 그 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 시스템.
- 제 52항에 있어서, 발현 구성물(들)은 SEQ ID NO:9 및 11 내지 14의 서열들과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 가지는 모든 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 시스템.
- 제 48항 내지 제 53항 중 어느 한 항의 발현 시스템을 포함하는 숙주 세포.
- 제 54항에 있어서, 숙주 세포는 포유류 세포인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
- 제 55항에 있어서, 숙주 세포는 MDCK, Vero 또는 PerC6 세포인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
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