PL219128B1 - Genetycznie zmodyfikowane atenuowane chimerowe wirusy grypy, preparat szczepionki, kompozycja farmaceutyczna, kompozycja farmaceutyczna do zastosowania oraz zastosowania takich wirusów - Google Patents

Genetycznie zmodyfikowane atenuowane chimerowe wirusy grypy, preparat szczepionki, kompozycja farmaceutyczna, kompozycja farmaceutyczna do zastosowania oraz zastosowania takich wirusów

Info

Publication number
PL219128B1
PL219128B1 PL398576A PL39857699A PL219128B1 PL 219128 B1 PL219128 B1 PL 219128B1 PL 398576 A PL398576 A PL 398576A PL 39857699 A PL39857699 A PL 39857699A PL 219128 B1 PL219128 B1 PL 219128B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
protein
amino acid
influenza
strain
virus
Prior art date
Application number
PL398576A
Other languages
English (en)
Other versions
PL398576A1 (pl
Inventor
Peter Palese
Thomas Muster
Adolf Garcia-Sastre
Original Assignee
Sinai School Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27376229&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL219128(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Sinai School Medicine filed Critical Sinai School Medicine
Publication of PL398576A1 publication Critical patent/PL398576A1/pl
Publication of PL219128B1 publication Critical patent/PL219128B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A61K39/17—Newcastle disease virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/205—Rhabdoviridae, e.g. rabies virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/543—Mucosal route intranasal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16132—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/16143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16151—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16161—Methods of inactivation or attenuation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16161—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2760/16162—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16171—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16221—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16232—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16241—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/16243—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16251—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16261—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2760/16262—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16271—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
    • C12N2760/18122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
    • C12N2760/18134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18522—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
    • C12N2760/20222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
    • C12N2760/20234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem niniejszego wynalazku są genetycznie zmodyfikowane atenuowane chimerowe wirusy grypy, których genomy zawierają segmenty wirusa grypy kodujące sekwencję heterologiczną, zawierające skrócone białko NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym te genetycznie zmodyfikowane wirusy grypy mają zaburzony fenotyp antagonistyczny wobec interferonu. Przedmiotem niniejszego wynalazku jest również preparat szczepionki zawierający dowolnego z takich wirusów grypy oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca dowolnego z takich wirusów grypy oraz taka kompozycja do zastosowania w indukcji odpowiedzi immunologicznej, do zastosowania w leczeniu lub profilaktyce tworzenia guzów nowotworowych oraz do zastosowania w profilaktyce lub leczeniu choroby zakaźnej. Ponadto przedmiotem wynalazku są zastosowania takich wirusów grypy do wytwarzania leku do profilaktyki lub leczenia choroby zakaźnej, do indukowania odpowiedzi immunologicznej, oraz do profilaktyki tworzenia guzów nowotworowych lub leczenia guzów nowotworowych.
1. Wprowadzenie
Niniejszy wynalazek dotyczy ogólnie, atenuowanych wirusów o ujemnej nici RNA mających zaburzoną zdolność do antagonizacji odpowiedzi komórkowej na interferon (IFN), jak również zastosowania takich atenuowanych wirusów w szczepionce oraz preparatach farmaceutycznych. Wynalazek dotyczy także wykorzystania i zastosowania układów z niedoborem IFN do selekcji, identyfikacji i namnażania takich atenuowanych wirusów.
W szczególnej postaci realizacji wynalazek odnosi się do atenuowanych wirusów grupy mających modyfikacje w genie NS1, które zmniejszają lub eliminują zdolność produktu genu NS1 do antagonizowania odpowiedzi komórkowej wobec IFN. Zmutowane wirusy replikują in vivo, lecz wykazują zmniejszoną patogenność, a zatem są odpowiednie do zastosowania w żywych szczepionkach wirusowych, oraz preparatach farmaceutycznych.
2. Tło wynalazku
2.1 Wirus grypy
Rodziny wirusów, zawierających osłonkowany RNA o pojedynczej nici genomu o ujemnej polarności (antysensownego), klasyfikuje się w grupach, mających genomy niesegmentowane (Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae i Borna Disease Virus) lub mające genomy segmentowane (Othomyxoviridae, Bunyaviridae i Arenaviridae). Rodzina Orthomyxoviridae, opisywana szczegółowo poniżej, i stosowana w niniejszych przykładach, obejmuje wirusy grypy, wirusy typu A, B i C, jak również wirusy Thogoto i Dhori oraz wirusa zakaźnej anemii łososi.
Wiriony grypy składają się z wewnętrznego rdzenia rybonukleoproteinowego (nukleokapsyd w postaci helisy), zawierającego genom o pojedynczej nici RNA, oraz zewnętrznej osłonki lipoproteinowej powleczonej wewnątrz białkiem matriksowym (M1). Segmentowany genom wirusa grypy A składa się z ośmiu cząsteczek (siedem dla grypy C), o liniowej ujemnej polarności, RNA o pojedynczych niciach, które kodują dziesięć polipeptydów, w tym: białka polimerazy RNA zależne od RNA (PB2, PB1 i PA) oraz nukleoproteinę (NP), która tworzy nukleokapsyd; białka błony matriksowej (M1, M2); dwie glikoproteiny powierzchniowe, które wystają z osłonki zawierającej lipid: hemaglutyninę (HA) i jądrowe białko eksportowe (NEP). Transkrypcja i replikacja genomu ma miejsce w jądrze, a montowanie zachodzi poprzez składanie na błonie plazmatycznej. Wirusy mogą ponownie mieszać geny w czasie mieszanych infekcji.
Wirus grypy adsorbuje się poprzez HA do sialilooligosacharydów w glikoproteinach i glikolipidach błony komórkowej. Po endocytozie wirionu, zachodzą zmiany konformacyjne w cząsteczce HA wewnątrz endosomu komórkowego, które ułatwiają fuzję błonową, stymulując w ten sposób pozbawienie osłonki. Nukleokapsyd migruje do jądra, gdzie mRNA wirusa ulega transkrypcji. Wirusowy mRNA ulega transkrypcji przez unikalny mechanizm, w którym endonukleazy wirusowe odcinają czapeczkowany koniec 5' z heterologicznych mRNA komórki, które następnie służą jako startery do transkrypcji matryc RNA wirusa przez transkryptazę wirusową. Terminacja transkryptu zachodzi w miejscach 15 do 22 zasad od końców ich matryc, gdzie sekwencje oligo(U) działają jako sygnały do dodawania śladów poli(A). Z ośmiu tak wytworzonych wirusowych cząsteczek RNA, sześć jest informacjami monocistronowymi, które ulegają transakcji bezpośrednio do białek, reprezentujących HA, NA, NP i białka polimerazy wirusowej, PB2, PB1 i PA. Inne dwa transkrypty przechodzą splicing, po czym każdy daje dwa mRNA, które ulegają translakcji w różnych ramkach odczytu, wytwarzając M1, M2, NS1 i NEP. Innymi słowy, osiem segmentów wirusowego RNA koduje dziesięć białek: dziewięć strukturalnych i jedno niestrukturalne.
PL 219 128 B1
Omówienie genów wirusa grypy i ich produktów białkowych, ukazuje się w tabeli 1 poniżej. T a b e l a 1.
Segmenty RNA genomu wirusa grypy i produkty kodowaniaa
Segment Długość b (nukleotydy) Kodowany (polipeptydc) Długość d (aminokwasy) Cząsteczki na wirion Komentarz
2341 PB2 759 30-60 Składnik transkryptazy RNA; wiązanie czapeczkowanego RNA; komórki gospodarza
2 2341 PB1 757 30-60 Składnik transkryptazy RNA; inicjacja transkrypcji
3 2233 PA 7i6 30-60 Składnik transkryptazy RNA
4 1778 HA 566 500 Hemaglutynina; trimer; glikoproteina; osłonki; pośredniczy w przyłączaniu do komórek
5 1565 NP 498 1000 Nukleoproteina; związana z RNA; strukturalny składnik transkryptazy RNA
6 1413 NA 454 100 Neuraminidaza; tetramer; glikoproteina osłonki
7 1027 Mi 252 3000 Białko matrycowe, powleka wnętrze osłonki
M2 96 ? Strukturalne białko w błonie plazmatycznej; złożony mRNA
8 890 NSi 230 Białko nie strukturalne; funkcja nieznana
NEP 121 ? Jądrowe białko eksportowe; złożony mRNA
a Zaadaptowane z R.A. Lamb i P.W. Choppin (1983), Annual Review of Biochemistry, tom 52, 467-506 b Dla szczepu A/PR/8/34 c Określone w próbach biochemicznych i genetycznych d Określone w analizie sekwencji nukleotydowej i sekwencjonowaniu białka
Genom wirusa grypy A zawiera osiem segmentów RNA o pojedynczej nici o ujemnej polarności, kodującego jedno białko niestrukturalne i dziewięć strukturalnych. Białko niestrukturalne NS1 jest powszechne w komórkach zakażonych wirusem grypy, lecz nie zostało wykryte w wirionach. NS1 jest fosfoproteiną znajdującą się w jądrze wcześnie podczas zakażenia, a także w cytoplazmie w czasie późniejszym cyklu wirusowego (King i inni 1975, Virology 64: 378). Badania z mutantami grypy wrażliwymi na temperaturę (ts) z uszkodzeniami w genie NS sugerowały, że białko NS1 jest regulatorem transkrypcyjnym i postranskrypcyjnym mechanizmów, dzięki którym wirus jest zdolny do hamowania ekspresji genu komórki gospodarza i stymulacji syntezy białek wirusowych. Tak jak wiele innych białek, które regulują procesy post-translacyjne białko NS1 oddziałuje ze specyficznymi sekwencjami i strukturami RNA. Donoszono, że białko NS1 wiąże się z różnymi rodzajami RNA, łącznie z vRNA, poli-A, U6snRNA, regionem nie podlegającym translacji, jak mRNA wirusa oraz dsRNA (Qiu i inni, 1995, RNA 1: 304; Qiu i inni 1994, J. Virol. 68: 2425; Hatada Fukuda 1992, J. Gen. Virol. 73: 3325-9. Ekspresja białka NS1 z cDNA w transfekowanych komórkach powiązano z kilkoma skutkami: inhibicją transportu jądrowo-cytoplazmatycznego mRNA, inhibicją splicingu pre-mRNA, inhibicją poliadenylacji mRNA gospodarza i stymulacją translacji wirusowego mRNA (Fortes i inni, 1994, EMBO J. 13: 704; Enami i inni, 1994, J. Virol. 68: 1432; de la Luna i inni 1995, J. Virol. 69: 2427; Lu i inni, Genes Dev. 8: 1617; Park i inni, 1995, J. Biol Chem. 270, 28433; Nemeroff i inni, 1998, Mol. Cell. 1:1991; Chen i inni, 1994, EMBO J. 18: 2273-83).
PL 219 128 B1
2.2 Wirusy atenuowane
Inaktywowane szczepionki wirusowe otrzymuje się przez „zabicie” patogenu wirusowego np. przez traktowanie wysoką temperaturą lub formaliną w taki sposób, że nie jest on zdolny do replikacji. Inaktywowane szczepionki mają ograniczone wykorzystanie, ponieważ nie zapewniają długotrwałej odporności, a zatem zapewniają ograniczone zabezpieczenie. Alternatywnym podejściem wytwarzania szczepionek wirusowych jest stosowanie atenuowanych żywych szczepionek wirusowych. Atenuowane wirusy są zdolne do replikacji, lecz nie są patogenne, a zatem zapewniają dłużej trwającą odporność i większe zabezpieczenie. Jednakże, konwencjonalne metody wytwarzania atenuowanych wirusów obejmują przypadkową izolację szeregu mutantów gospodarza, z których wiele jest wrażliwych na temperaturę; np. wirusa pasażuje się przez nienaturalnego gospodarza i selekcjonuje wirusy potomne, które są immunogenne, jeszcze niepatogenne.
Konwencjonalnym substratem do izolacji i hodowli wirusów grypy do celów szczepionek są jaja kurze z zarodkami. Wirusy grypy zwykle rosną w ciągu 2-4 dni w temperaturze 37°C w jajach 10-11 dniowych. Mimo, że większość pierwotnych izolatów ludzkich wirusów grypy A i B rośnie lepiej w worku owodniowym zarodków, po 2 do 4 pasażach wirusy dostosowują się do wzrostu w komórkach jamy omoczniowej, która jest dostępna z zewnątrz jaja (Murphy, B.R. i R.G. Webster, 1996. Orthomyxoviruses, strona 1397-1445. W Fields Virology. Lippicott-Raven P.A).
Technologia rekombinacji DNA i techniki inżynierii genetycznej teoretycznie pozwalają na lepsze podejście do wytwarzania atenuowanego wirusa, ponieważ w genomie wirusa można celowo dokonać specyficznych mutacji. Jednakże, zmiany genetyczne wymagane do atenuacji wirusów nie są ani znane, ani przewidywalne. Ogólnie, próby stosowania technologii rekombinacji DNA do opracowania szczepionek wirusowych dotyczą w większości produkcji szczepionek podjednostkowych, które zawierają tylko podjednostki białka patogenu, związane z odpowiedzią immunologiczną, poddane ekspresji w rekombinowanych wektorach wirusowych, takich jak wirus krowianki lub bakulowirus. Ostatnio techniki rekombinacji DNA wykorzystano w próbie wytworzenia mutantów delecyjnych herpeswirusa lub poliowirusów, które naśladują atenuowane wirusy występujące w naturze lub znane szeregi mutantów gospodarzy. Do 1990 wirusy o ujemnej nici RNA nie były wcale podatne na manipulacje miejscowo-specyficzne, a więc nie mogły być genetycznie przekształcane.
Atenuowane żywe wirusy grypy wytwarzane dotąd mogły nie być zdolne do supresji odpowiedzi interferonowej u gospodarza, w którym replikują. Zatem, mimo, że wirusy te są dogodne, ponieważ są one immunogenne i niepatogenne, trudno je namnożyć w konwencjonalnych substratach do celów wytwarzania szczepionek. Ponadto, atenuowane wirusy mogą posiadać cechy wirulencji, które są łagodne i nie pozwalają gospodarzowi na wytworzenie odpowiedzi immunologicznej wystarczającej do obrony przed późniejszymi prowokacjami.
3. Omówienie wynalazku
Niniejszy wynalazek dotyczy atenuowanych wirusów o ujemnej nici RNA, mających zaburzoną zdolność do antagonizacji odpowiedzi IFN komórki, oraz zastosowania takich wirusów w szczepionce i preparatach farmaceutycznych. Zmutowane wirusy z zaburzoną aktywnością antagonistyczną wobec IFN są atenuowane, czyli są zakaźne, mogą replikować in vivo, zapewniając subkliniczny poziom infekcji, i nie są patogenne. Zatem, są one idealnymi kandydatami do żywych szczepionek wirusowych. Ponadto, atenuowane wirusy mogą indukować silną odpowiedź INF, która ma inne konsekwencje biologiczne in vivo, powodując zabezpieczenie przed późniejszymi chorobami zakaźnymi i/lub indukując odpowiedź przeciwnowotworową. Zatem, atenuowane wirusy można stosować farmaceutycznie do zapobiegania lub leczenia innych chorób zakaźnych, nowotworu u osób o wysokim ryzyku i/lub chorób leczonych IFN.
Przedmiotem wynalazku jest genetycznie zmodyfikowany, atenuowany, chimerowy wirus grypy, charakteryzujący się tym, że jego genom zawiera segment genu wirusa grypy kodujący sekwencję heterologiczną i który zawiera skrócone białko NS1 o pomiędzy 90 a 130 resztach aminokwasowych z pierwszych 90 do 130 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1, i przy czym genetycznie zmodyfikowany wirus grypy ma zaburzony fenotyp antagonistyczny wobec interferonu.
Przedmiotem wynalazku jest także genetycznie zmodyfikowany, atenuowany, chimerowy wirus grypy, charakteryzujący się tym, że jego genom zawiera segment genu wirusa grypy kodujący sekwencję heterologiczną i który zawiera:
PL 219 128 B1
a. skrócone białko NS1 o pomiędzy 60 a 70 resztach aminokwasowych z pierwszych 60 do 70 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1;
b. skrócone białko NS1 o pomiędzy 70 a 80 resztach aminokwasowych z pierwszych 70 do 80 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1;
c. skrócone białko NS1 o pomiędzy 90 a 100 resztach aminokwasowych z pierwszych 90 do 100 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1;
d. skrócone białko NS1 o pomiędzy 100 a 110 resztach aminokwasowych z pierwszych 100 do 110 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1;
e. skrócone białko NS1 o pomiędzy 110 a 120 resztach aminokwasowych z pierwszych 110 do 120 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1; lub
f. skrócone białko NS1 o pomiędzy 120 a 130 resztach aminokwasowych z pierwszych 120 do 130 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1, i przy czym genetycznie zmodyfikowany wirus grypy ma zaburzony fenotyp antagonistyczny wobec interferonu.
Korzystnie w takich genetycznie zmodyfikowanych, atenuowanych, chimerowych wirusach według wynalazku jak określono powyżej sekwencję heterologiczną stanowi antygen wariantu szczepu wirusa grypy.
Przedmiotem wynalazku jest również genetycznie zmodyfikowany, atenuowany, chimerowy wirus grypy, charakteryzujący się tym, że jego genom zawiera segment genu wirusa grypy kodujący sekwencję heterologiczną i który zawiera skrócone białko NS1 o pomiędzy 90 a 130 resztach aminokwasowych z pierwszych 90 do 130 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto genetycznie zmodyfikowany, atenuowany, chimerowy wirus grypy, charakteryzujący się tym, że jego genom zawiera segment genu wirusa grypy kodujący sekwencję heterologiczną i który zawiera:
a. skrócone białko NS1 o pomiędzy 60 a 70 resztach aminokwasowych z pierwszych 60 do 70 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1;
b. skrócone białko NS1 o pomiędzy 70 a 80 resztach aminokwasowych z pierwszych 70 do 80 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1;
c. skrócone białko NS1 o pomiędzy 90 a 100 resztach aminokwasowych z pierwszych 90 do 100 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1;
d. skrócone białko NS1 o pomiędzy 100 a 110 resztach aminokwasowych z pierwszych 100 do 110 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1;
e. skrócone białko NS1 o pomiędzy 110 a 120 resztach aminokwasowych z pierwszych 110 do 120 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1; lub
f. skrócone białko NS1 o pomiędzy 120 a 130 resztach aminokwasowych z pierwszych 120 do 130 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1.
Korzystnie w takich genetycznie zmodyfikowanych, atenuowanych, chimerowych wirusach według wynalazku jak określono powyżej stosowanym segmentem genu wirusa grypy jest segment genu hemaglutyniny lub neuraminidazy.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto genetycznie zmodyfikowany, atenuowany, chimerowy wirus grypy, charakteryzujący się tym, że jego genom zawiera sekwencję heterologiczną, która koduje segment genu wirusa grypy, i który zawiera skrócone białko NS1 o pomiędzy 90 a 130 resztach aminokwasowych z pierwszych 90 do 130 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wi6
PL 219 128 B1 rusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu 20 wirusa grypy to 1, i przy czym genetycznie zmodyfikowany wirus grypy ma zaburzony fenotyp antagonistyczny wobec interferonu.
Przedmiotem wynalazku jest również genetycznie zmodyfikowany, atenuowany, chimerowy wirus grypy, charakteryzujący się tym, że jego genom sekwencję heterologiczną, która koduje segment genu wirusa grypy, i który zawiera:
a. skrócone białko NS1 o pomiędzy 60 a 70 resztach aminokwasowych z pierwszych 60 do 70 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1;
b. skrócone białko NS1 o pomiędzy 70 a 80 resztach aminokwasowych z pierwszych 70 do 80 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1;
c. skrócone białko NS1 o pomiędzy 90 a 100 resztach aminokwasowych z pierwszych 90 do 100 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1;
d. skrócone białko NS1 o pomiędzy 100 a 110 resztach aminokwasowych z pierwszych 100 do 110 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1;
e. skrócone białko NS1 o pomiędzy 110 a 120 resztach aminokwasowych z pierwszych 110 do 120 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1; lub
f. skrócone białko NS1 o pomiędzy 120 a 130 resztach aminokwasowych z pierwszych 120 do 130 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1, i przy czym genetycznie zmodyfikowany wirus grypy ma zaburzony fenotyp antagonistyczny wobec interferonu.
Korzystnie w takich genetycznie zmodyfikowanych, atenuowanych, chimerowych wirusach grypy według wynalazku jak określono powyżej sekwencja heterologiczna, która koduje segment genu wirusa grypy, koduje jest segment genu hemaglutyniny lub neuraminidazy.
Korzystnie w każdym z takich genetycznie zmodyfikowanych, atenuowanych, chimerowych wirusów grypy według wynalazku jak określono powyżej genom koduje skrócone białko NS1 o pomiędzy 120 a 130 resztach aminokwasowych z pierwszych 120 do 130 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa 15 grypy to 1.
Korzystnie w każdym z takich genetycznie zmodyfikowanych, atenuowanych, chimerowych wirusów grypy według wynalazku jak określono powyżej genom koduje:
a. skrócone białko NS1 o resztach aminokwasowych 1 do 60 białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1;
b. skrócone białko NS1 o resztach aminokwasowych 1 do 70 białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1;
c. skrócone białko NS1 o resztach aminokwasowych 1 do 89 białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1; 16
d. skrócone białko NS1 o resztach aminokwasowych 1 do 90 białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1;
e. skrócone białko NS1 o resztach aminokwasowych 1 do 99 białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1; lub
f. skrócone białko NS1 o resztach aminokwasowych 1 do 100 białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1,
g. skrócone białko NS1 o resztach aminokwasowych 1 do 110 białka NS1 szczepu wirusa grypy przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1,
h. skrócone białko NS1 o resztach aminokwasowych 1 do 120 białka NS1 szczepu wirusa grypy przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1, lub
i. skrócone białko NS1 o resztach aminokwasowych 1 do 130 białka NS1 szczepu wirusa grypy przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1.
Korzystnie atenuowanego wirusa grypy stanowi wirus grypy typu A.
Korzystnie atenuowanego wirusa grypy stanowi wirus grypy typu B.
PL 219 128 B1
Przedmiotem wynalazku jest ponadto preparat szczepionki, charakteryzujący się tym, że zawiera dowolnego z określonych powyżej genetycznie zmodyfikowanych atenuowanych chimerowych wirusów grypy według wynalazku i odpowiednią zaróbkę.
Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że zawiera dowolnego z określonych powyżej genetycznie zmodyfikowanych atenuowanych chimerowych wirusów grypy według wynalazku i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
Przedmiotem wynalazku jest także preparat szczepionki jak określono powyżej do zastosowania w profilaktyce choroby wirusowej wywołanej zakażeniem wirusem grypy u podmiotu.
Korzystnie podmiotem jest człowiek.
Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna jak zdefiniowano powyżej do zastosowania w profilaktyce lub leczeniu choroby zakaźnej u podmiotu.
Przedmiotem wynalazku jest też kompozycja farmaceutyczna jak zdefiniowano powyżej do zastosowania w indukcji odpowiedzi immunologicznej u podmiotu.
Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna jak zdefiniowano powyżej do zastosowania w leczeniu lub profilaktyce tworzenia guzów nowotworowych u podmiotu.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie dowolnego z określonych powyżej genetycznie zmodyfikowanych atenuowanych chimerowych wirusów grypy według wynalazku do wytwarzania leku do zastosowania w profilaktyce lub leczeniu choroby zakaźnej u podmiotu.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie dowolnego z określonych powyżej genetycznie zmodyfikowanych atenuowanych chimerowych wirusów grypy według wynalazku do wytwarzania leku do zastosowania w indukowaniu odpowiedzi immunologicznej u podmiotu.
Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie dowolnego z określonych powyżej genetycznie zmodyfikowanych atenuowanych chimerowych wirusów grypy według wynalazku do wytwarzania leku do zastosowania w profilaktyce tworzenia guza nowotworowego u podmiotu lub leczenia guzów nowotworowych u podmiotu.
Korzystnie w przypadku kompozycji do zastosowania w profilaktyce lub leczeniu choroby zakaźnej jak określono powyżej albo w zastosowaniu dowolnego z określonych powyżej genetycznie zmodyfikowanych atenuowanych chimerowych wirusów grypy według wynalazku do wytwarzania leku do zastosowania w profilaktyce lub leczeniu choroby zakaźnej chorobą zakaźną jest choroba wirusowa.
Korzystniej choroba wirusowa wywołana jest zakażeniem wirusem grypy.
Korzystnie w przypadku kompozycji do zastosowania w profilaktyce lub leczeniu choroby zakaźnej u podmiotu, do zastosowania w indukcji odpowiedzi immunologicznej, do zastosowania w leczeniu lub profilaktyce tworzenia guzów nowotworowych, a także w przypadku zastosowania do wytwarzania leku do zastosowania w profilaktyce lub leczeniu choroby zakaźnej, w indukowaniu odpowiedzi immunologicznej oraz do zastosowania w profilaktyce tworzenia guza nowotworowego lub leczenia guzów nowotworowych podmiotem jest człowiek.
Wirusy o ujemnej nici RNA stosowane zgodnie z wynalazkiem, obejmują wirusy zarówno segmentowane jak i niesegmentowane; zalecane postacie realizacji obejmują, lecz bez ograniczenia, wirusa grypy, wirusa syncytialnego płuc (RSV), wirusa choroby Newcastle (NDV), wirusa pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej (VSV) oraz wirusa paragrypy (PIV). Wirusy stosowane w wynalazku można selekcjonować ze szczepów występujących naturalnie, odmian lub mutantów; wirusów mutagenizowanych (np. utworzonych przez ekspozycję na mutageny, powtórzone pasaże i/lub pasaże w gospodarzach niedozwolonych); reasortanów (w przypadku segmentowanych genomów wirusowych); i/lub wirusów genetycznie zmodyfikowanych (np. przy użyciu technik „genetyki odwrotnej” mających pożądany fenotyp, czyli zaburzoną zdolność do antagonizacji odpowiedzi IFN komórki). Mutowane lub genetycznie zmodyfikowane wirusy można selekcjonować na podstawie różnicowania wzrostu w układach z niedoborem IFN względem układów kompetentnych pod względem IFN. Przykładowo, można selekcjonować wirusy, które rosną w układzie z niedoborem IFN, lecz nie rosną w układzie kompetentnym pod względem IFN (lub które rosną gorzej w układzie kompetentnym pod względem IFN).
Tak wyselekcjonowany atenuowany wirus może być stosowany sam jako składnik aktywny w szczepionce lub preparatach farmaceutycznych. Alternatywnie, atenuowany wirus może być stosowany jako wektor lub „szkielet szczepionek wytwarzanych rekombinacyjnie. Jak dotąd technikę „genetyki odwrotnej można stosować do konstruowania mutacji lub wprowadzania obcych epitopów do atenuowanego wirusa, który służyłby jako szczep „rodzicielski. W ten sposób można opracować szczepionki do immunizacji przeciw odmianom szczepów, lub alternatywnie, przeciw całkowicie innym czynnikom zakaźnym lub antygenom chorobowym. Przykładowo, atenuowanego wirusa można zmo8
PL 219 128 B1 dyfikować do ekspresji epitopów neutralizujących innych wstępnie wyselekcjonowanych szczepów. Alternatywnie, do atenuowanego mutanta można wbudować epitopy wirusów innych niż wirusy o ujemnej nici RNA (np. gp160, gp120 lub gp41 HIV). Alternatywnie, do wirusa można wbudować epitopy niewirusowych patogenów zakaźnych (np. pasożytów, bakterii, grzybów). W jeszcze innej opcji, można wytworzyć szczepionki nowotworowe, np. przez wbudowanie antygenów nowotworowych do atenuowanego szkieletu wirusowego.
W poszczególnej postaci realizacji, obejmującej wirusy RNA z genomami segmentowanymi, można stosować techniki reasortacji, do przeniesienia atenuowanego fenotypu z rodzicielskiego szczepu wirusa o segmentowanym RNA (naturalny mutant, wirus mutagenizowany lub wirus genetycznie zmodyfikowany) do różnych szczepów wirusowych (wirus dzikiego typu, naturalny mutant, wirus mutagenizowany lub wirus genetycznie zmodyfikowany).
Wirusy atenuowane, które indukują silne odpowiedzi IFN u gospodarza, można także stosować w preparatach farmaceutycznych do profilaktyki lub leczenia innych infekcji wirusowych lub chorób możliwych do leczenia IFN, takich jak nowotwór. Pod tym względem, można zmieniać tropizm atenuowanego wirusa, aby nakierować wirusa na pożądany docelowy narząd, tkankę lub komórki in vivo lub ex vivo. Przy zastosowaniu tego podejścia odpowiedź IFN można indukować miejscowo, w docelowym miejscu, unikając w ten sposób lub minimalizując skutki uboczne układowego traktowania IFN. W tym celu można zbudować atenuowanego wirusa do ekspresji liganda specyficznego pod względem receptora docelowego narządu, tkanki lub komórek.
Wynalazek opiera się częściowo na stwierdzeniu twórców wynalazku, że NS1 wirusa grypy dzikiego typu działa jak antagonista IFN, w taki sposób, że NS1 hamuje odpowiedź za pośrednictwem IFN komórek gospodarza zakażonych wirusem. Stwierdzono, że mutanty wirusowe z niedoborem aktywności NS1 są silnymi induktorami odpowiedzi komórkowej IFN, i przedstawiały atenuowany fenotyp in vivo; czyli zmutowane wirusy replikują in vivo, lecz dają mniejsze skutki patogenne. Nie chcąc wiązać się jakąkolwiek teorią lub wytłumaczeniem jak działa wynalazek, cechy atenuacji wirusów według wynalazku są prawdopodobnie spowodowane ich zdolnością do indukcji silnej komórkowej odpowiedzi IFN oraz ich zaburzonej zdolności do antagonizowania odpowiedzi IFN gospodarza. Jednakże, korzystne cechy atenuowanych wirusów według wynalazku nie muszą być przypisywane jedynie wpływowi na komórkową odpowiedź interferonu. W rzeczywistości, zmiany innych aktywności związanych z NS1 mogą nadawać pożądany atenuowany fenotyp.
Wykazano, że zmutowany wirus grypy o zaburzonej aktywności antagonistycznej wobec IFN replikuje in vivo, wytwarzając miana, które są wystarczające do indukcji odpowiedzi immunologicznej i cytokinowej. Przykładowo, szczepienie atenuowanym wirusem grypy zmniejszało miano wirusa u zwierząt, które później sprowokowano wirusem grypy dzikiego typu. Atenuowane wirusy grypy przedstawiały także aktywność antywirusową i przeciwnowotworową. Wstępna infekcja (zakażenie) atenuowanym wirusem grypy hamowało replikacje innych szczepów wirusa grypy dzikiego typu i innych wirusów (takich jak wirus Sendai) nadkażonych w jajach z zarodkami. Szczepienie atenuowanym wirusem grypy u zwierząt, którym wstrzyknięto komórki nowotworowe, zmniejszyło liczbę utworzonych ognisk. Ponieważ wirus grypy jak wiadomo indukuje odpowiedź CTL (cytotoksyczne limfocyty T), atenuowany wirus jest bardzo atrakcyjnym kandydatem do szczepionek nowotworowych.
Do szczepionek wirusowych zalecane są mutacje, które zmniejszają lecz nie znoszą aktywności antagonistycznej IFN wirusa, takie wirusy można selekcjonować pod względem wzrostu zarówno w konwencjonalnych jak i niekonwencjonalnych substratach, oraz pod względem wirulencji pośredniej. W szczególności, twórcy wynalazku pokazali, że mutant o skróconym C-terminalnie NS1 replikuje do wysokich mian w substratach z niedoborem IFN, takich jak 6 i 7-dniowe zarodki kurze, jak również w błonie omoczniowej 10-dniowych zarodków kurzych, substracie konwencjonalnym dla wirusa grypy, który nie pozwala na wzrost mutantów wirusa grypy, w których usunięto cały gen NS1 (przytaczanych także w niniejszym jako mutanty „znokautowane „z wyłączeniem”). Jednakże, replikacja mutanta o skróconym końcu C NS1 jest mniejsza w 12-dniowych zarodkach kurzych. Podejście to pozwala, pierwszy raz, na utworzenie i identyfikację żywych atenuowanych wirusów o ujemnej nici RNA, którym zmieniono lecz nie zniesiono aktywność antagonistyczną wobec IFN i które są zdolne do wzrostu w substratach odpowiednich do tworzenia szczepionek. Podejście to pozwala także, po raz pierwszy, na układ skutecznej selekcji identyfikacji pod względem grypy lub innych wirusów, które zawierają mutacje nadające zmienioną lecz nie zniesioną aktywność antagonistyczną wobec interferonu.
Układy z niedoborem IFN mogą być stosowane do namnażania atenuowanych wirusów, które nie mogą być hodowane w układach konwencjonalnych stosowanych aktualnie do wytwarzania szczePL 219 128 B1 pionek. Określenie „układy z niedoborem IFN” jaki się tu stosuje, odnosi się do układów, np. komórek, linii komórkowych i zwierząt, takich jak myszy, kurczęta, indyki, króliki, szczury itd., które nie wytwarzają IFN lub wytwarzają IFN na niskim poziomie, nie odpowiadających lub odpowiadających mniej skutecznie na IFN, i/lub mających braki w indukowanej przez IFN aktywności genów antywirusowych. W tym celu, twórcy wynalazku zidentyfikowali lub opracowali liczne układy z niedoborem IFN, które można stosować, włączając lecz bez ograniczenia, młode zarodki kurze, linie komórkowe z niedoborem IFN (takie jak komórki VERO lub genetycznie zmodyfikowane linie komórkowe takie jak nokauty STAT1). Alternatywnie, zarodki kurze lub linie komórkowe można wstępnie traktować związkami, które hamują układ IFN (łącznie z lekami, przeciwciałami, antysensami, rybozymami, itd.). Jeszcze inna postać realizacji obejmuje stosowanie jaj z niedoborem układu IFN np. jaj wytworzonych przez ptaki ujemne pod względem STAT1, zwłaszcza drób, w tym, lecz bez ograniczenia, transgeniczne kurczęta, kaczki lub indyki.
4. Opis rysunków
Fig. 1. Wirus delNS1 hamuje replikację wirusa grypy A dzikiego typu w jajach. Jaja kurze z zarodkami w wieku 10 dni zaszczepiono wskazanymi pfu wirusa delNS1. Osiem godzin później jaja zakażono 3
103 pfu wirusa WSN. Po dwóch dniach inkubacji w temperaturze 37°C zebrano płyn omoczniowy i określono miana wirusa WSN przez test łysinek w komórkach MDCK. Wyniki są średnią z dwóch jaj.
Fig. 2. Indukcja odpowiedzi antywirusowej przez wirusa delNS1 w zarodkach kurzych. Jaja kurze z zarodkami w wieku 10 dni zaszczepiono PBS (nie traktowano) lub 2x104 pfu wirusa delNS1 3 (traktowane delNS1). Osiem godzin później jaja ponownie zakażono 103 pfu wirusa grypy A/WSN/33 (H1N1), wirusa grypy A/PR8/34 (H+N1), wirusa grypy A/X-31 (H3N2), wirusa grypy B/Lee/40 lub wirusa Sendai. Po dwóch dniach inkubacji zebrano płyn omoczniowy i określono miana wirusa przez test hemaglutynacji. Wyniki są średnią z dwóch jaj.
Fig. 3. Komórki CV1 transfekowano plazmidem, wykazującym ekspresję IRF-3 poddanego fuzji z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP). Pozwoliło to na określenie lokalizacji IRF-3 wewnątrz komórek, przez mikroskopię fluorescencyjną. W niektórych przypadkach, plazmid ekspresyjny NS1 kotransfekowano plazmidem ekspresyjnym IRF-3 we wskazanych stosunkach. 24 godziny po transfekcji komórki zakażano wirusem PR8 (WT) lub delNS1 przy wysokim moi, zgodnie ze wskazaniami. 10 godzin po zakażeniu komórki analizowano pod mikroskopem fluorescencyjnym pod względem lokalizacji IRF-3-GFP. Zaznaczono odsetek komórek wykazujących wyłącznie lokalizację cytoplazmatyczną (CYT) jaki lokalizację zarówno cytoplazmatyczną jak i jądrową IRF-3 (Nuc+Cyt).
5. Szczegółowy opis wynalazku
Zgodnie z wynalazkiem opisano wytwarzanie, selekcję i identyfikację atenuowanych wirusów o ujemnej nici RNA, które posiadają zaburzoną zdolność do antagonizowania odpowiedzi komórkowej IFN, oraz zastosowania takich wirusów w preparatach szczepionek i preparatach farmaceutycznych.
Wirusy mogą mieć genomy segmentowane lub niesegmentowane i można je selekcjonować ze szczepów występujących naturalnie, odmian lub mutantów; wirusów mutagenizowanych (np. utworzonych przez ekspozycję na promieniowanie UV, mutageny, i/lub pasaże); reasortantów (dla segmentowanych genomów wirusowych); i/lub wirusów genetycznie zmodyfikowanych. Przykładowo, wirusy zmutowane można wytworzyć przez naturalną zmienność, ekspozycję na promieniowanie UV, ekspozycję na mutageny chemiczne, przez pasażowanie w gospodarzach niedozwolonych, przez reasortację (czyli przez koinfekcję atenuowanego segmentowanego wirusa z innym szczepem, mającym pożądane antygeny) i/lub przez genetyczną modyfikację (np. przy użyciu „genetyki odwrotnej). Wirusy selekcjonowane do zastosowania w wynalazku, mają defektywną aktywność antagonizującą IFN i są atenuowane; czyli są one zakaźne i mogą replikować in vivo, lecz wytwarzają tylko niskie miana, wywołując poziom subkliniczny infekcji, który nie jest patogenny. Takie atenuowane wirusy są idealnymi kandydatami do żywych szczepionek.
W zalecanej postaci realizacji atenuowane wirusy selekcjonowane do zastosowania w wynalazku powinny być zdolne do indukcji silnej odpowiedzi IFN u gospodarza, cechy, która przyczynia się do wytworzenia silnej odpowiedzi immunologicznej przy stosowaniu jako szczepionki, i która ma inne konsekwencje biologiczne, które czynią wirusy użytecznymi jako środki farmaceutyczne do profilaktyki i/lub leczenia innych infekcji wirusowych, lub tworzenia guzów nowotworowych u osób z wysokim ryzykiem, lub innych chorób, które leczy się IFN.
Wynalazek opiera się częściowo na licznych stwierdzeniach i obserwacjach dokonanych przez twórców wynalazku podczas pracy z mutantami wirusa grypy. Jednakże, zasady można analogicznie stosować i ekstrapolować w stosunku do innych segmentowanych i niesegmentowanych wirusów o ujemnej nici RNA, w tym, lecz bez ograniczenia, paramyksowirusów (wirus Sendai, wirus paragrypy,
PL 219 128 B1 świnki, wirus choroby Newcastle), morbiliwirusów (wirus odry, wirus nosówki i wirus księgosuszu); pneumowirusów (wirus syncytialny dróg oddechowych i bydlęcy wirus dróg oddechowych); oraz rabdowirusów (wirus pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej i wirus wścieklizny).
Po pierwsze, odpowiedź IFN jest istotna dla infekcji wirusowych in vivo. Twórcy wynalazku stwierdzili, że wzrost wirusa grypy dzikiego typu A/WSN/33 u myszy z niedoborem IFN (myszy STAT1 -/-) spowodował infekcję wielonarządową; czyli infekcja wirusowa nie ograniczała się tylko do płuc, jak to się dzieje u myszy dzikiego typu, u których powstaje odpowiedź IFN (Garcia-Sastre i inni, 1998, J. Virol. 72: 8550, które załącza się tu w całości jako odniesienie). Po drugie, twórcy wynalazku ustalili, że NS1 wirusa grypy działa jako antagonista IFN. Twórcy wynalazku stwierdzili, że mutant wirusa grypy z delecją całego genu NS1 (czyli „nokaut” NS1) nie był zdolny do wzrostu do wysokich mian w komórkach gospodarza kompetentnych pod względem IFN, i mógł się namnażać tylko w gospodarzach z niedoborem IFN. Wirus z wyłączonym (znokautowanym) genem NS1 wykazywał fenotyp atentowany (czyli był on letalny u myszy STAT1 -/- bez IFN, lecz nie był u myszy dzikiego typu) i stwierdzono, że jest on silnym induktorem odpowiedzi IFN w komórkach gospodarza (Garcia-Sastre i inni 1998, Virology, 252:324-330, które załącza się tu w całości jako odniesienie). Wstępne zakażenie zmutowanym wirusem z wyłączonym NS1 zmniejszyło miana wirusów grypy dzikiego typu i innych (np. Sendai) nadkażonych w jajach kurzych z zarodkami. W innym doświadczeniu, zakażenie zmutowanym wirusem grypy z wyłączonym NS1, zmniejszyło tworzenie ognisk u zwierząt zaszczepionych komórkami nowotworowymi. Tak więc, wirus grypy z wyłączonym NS1 wykazywał interesujące właściwości biologiczne. Jednakże, wirusy grypy znokautowane pod względem NS1 nie mogły się namnażać w konwencjonalnych układach do wytwarzania szczepionek. W celu przezwyciężenia tego problemu twórcy wynalazku opracowali układy z niedoborem IFN, które pozwalają na wytwarzanie rozsądnych ilości atenuowanego wirusa.
Oprócz tego twórcy wynalazku opracowali mutanty delecyjne NS1, które nie mają delecji całego genu. Niespodziewanie te mutanty NS1 okazały się wykazywać „pośredni” fenotyp, to znaczy wirus może rosnąć w konwencjonalnych gospodarzach stosowanych do namnażania wirusa grypy (choć wzrost jest lepszy w układach z niedoborem IFN, gdzie dają wyższe miana). Najistotniejsze jest to, że mutanty delecyjne są atenuowane in vivo i indukują silną odpowiedź IFN. Szczepienie mutantami wirusa grypy ze skróconym NS1 powodowało niższe miana wirusa u zwierząt później prowokowanych wirusem dzikiego typu, i powodowało zabezpieczenie przed chorobą.
Opracowano także substraty do izolacji, identyfikacji i hodowli wirusów do celów uzyskiwania szczepionek. W szczególności, opisano substraty z niedoborem interferonu do skutecznego hodowania mutantów wirusa grypy. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem substratem z niedoborem interferonu jest taki substrat, który jest defektywny pod względem zdolności do wytwarzania lub odpowiedzi wobec interferonu. Taki substrat można stosować do hodowli każdej ilości wirusów, które mogą wymagać środowiska wzrostu nie zawierającego interferonu. Takie wirusy mogą obejmować, lecz bez ograniczenia, paramyksowirusy (wirus Sendai, wirus paragrypy, świnki, wirus choroby Newcastle), morbiliwirusy (wirus odry, wirus nosówki i wirus księgosuszu); pneumowirusy (wirus syncytialny dróg oddechowych i bydlęcy wirus dróg oddechowych); oraz rabdowirusy (wirus pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej i wirus wścieklizny).
Wynalazek odnosi się także do zastosowania atenuowanego wirusa według wynalazku w szczepionkach i preparatach farmaceutycznych przeznaczonych dla ludzi i zwierząt. W szczególności, atenuowane wirusy można stosować jako szczepionki przeciw szerokiemu zakresowi wirusów i/lub antygenów, w tym, lecz bez ograniczenia, antygeny wariantów szczepów, różne wirusy lub inne patogeny zakaźne (np. bakterie, pasożyty, grzyby) lub antygeny specyficzne wobec guza nowotworowego. W innej postaci realizacji, atenuowane wirusy, które hamują replikację wirusową i tworzenie guza nowotworowego, można stosować do profilaktyki lub leczenia infekcji (patogenami wirusowymi lub niewirusowymi) lub tworzenia guzów nowotworowych lub leczenia chorób, dla których zalecana jest terapia IFN. Można stosować wiele metod wprowadzania żywych atenuowanych preparatów wirusowych do podmiotu ludzkiego lub zwierzęcego, aby indukować odporność lub odpowiednią odpowiedź cytokinową. Obejmują one, lecz bez ograniczenia, drogę donosową, dotchawiczą, doustną, przezskórną, domięśniową, dootrzewnową, dożylną i podskórną. W zalecanej postaci realizacji atenuowane wirusy według niniejszego wynalazku opracowuje się w postać do dostarczania donosowego.
5.1. Wytwarzanie mutantów o zmienionej aktywności antagonistycznej IFN
Zgodnie z wynalazkiem można wyselekcjonować i użyć każdego zmutowanego wirusa, który posiada zmniejszoną aktywność antagonistyczną dla IFN. W jednej postaci realizacji można wyselekPL 219 128 B1 cjonować mutanty występujące naturalnie lub odmiany, albo mutanty spontaniczne, które posiadają zaburzoną zdolność do antagonizacji komórkowej odpowiedzi wobec IFN. W innej postaci realizacji, zmutowane wirusy można wytworzyć przez ekspozycję wirusa na mutageny, takie jak promieniowanie ultrafioletowe lub mutageny chemiczne, lub przez wielokrotne pasażowanie i/lub pasaż w niedozwolonym gospodarzu. Skrining w różnicującym układzie wzrostowym można stosować do selekcji pod względem tych mutantów, które mają zaburzoną funkcję antagonistyczną wobec IFN. W przypadku wirusów o genomie segmentowanym, fenotyp atenuowany można przenieść do innego szczepu, mającego pożądany antygen, przez reasortację (czyli koinfekcję atenuowanego wirusa i pożądanego szczepu oraz selekcję reasortantów wykazujących oba fenotypy).
Mutacje można wbudować do wirusa o ujemnej nici RNA, takiego jak wirus grypy, RSV, NDV, VSV i PIV, stosując podejścia „genetyki odwrotnej”. W ten sposób, mutacje naturalne lub inne, które nadają fenotyp atenuowany, można wbudować w szczepy do szczepionek. Przykładowo, można wbudować delecje, insercje lub substytucje regionu kodującego odpowiedzialnego za aktywność antagonistyczną wobec IFN (tak jak NS1 grypy). Bierze się także pod uwagę delecje, substytucje lub insercje regionu niekodującego genu odpowiedzialnego za aktywność antagonistyczną wobec IFN. W tym celu można wbudować mutacje w sygnały odpowiedzialne za transkrypcję, replikację, poliadenylację i/lub upakowanie genu odpowiedzialnego za aktywność antagonistyczną wobec IFN. Przykładowo, w wirusie grypy, takie modyfikacje mogą obejmować, lecz bez ograniczenia, substytucję regionów niekodujących genu wirusa grypy B (Muster i inni 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5177), wymiany par zasad w regionach niekodujących genu wirusa grypy (Fodor i inni, 1998, J. Virol. 72:6283), mutacje w regionie promotorowym genu wirusa grypy (Piccone i inni, 1993, Virus Res. 28:99; Li i inni 1992, J. Virol 66:4331), substytucje i delecje w całej rozciągłości reszt urydynowych przy końcu 5' genu wirusa grypy, wpływające na poliadenylację (Luo i inni, 1991, J. Virol. 65:2861; Li i inni J. Virol. 1994, 68 (2):1245-9). Takie mutacje, np. w stosunku do promotora, mogą obniżać ekspresję genu odpowiedzialnego za aktywność antagonistyczną wobec IFN. Mutacje w genach wirusowych, które mogą regulować ekspresję genu odpowiedzialnego za aktywność antagonistyczną wobec IFN, wchodzą w zakres wirusów, które można zastosować zgodnie z wynalazkiem.
Zgodnie z wynalazkiem brano także pod uwagę mutacje w stosunku do segmentu genowego NS1, które niekoniecznie wynikają ze zmiany aktywności antagonistycznej wobec IFN lub fenotypu indukującego IFN, lecz raczej wywołują zmiany funkcji wirusowych i fenotyp atenuowany np. zmianę inhibicji eksportu jądrowego mRNA zawierającego poli(A), zmianę inhibicji splicingu pre-mRNA, zmianę inhibicji aktywacji PKR przez sekwestrację dsRNA, zmianę wpływu na translację RNA wirusa i zmianę inhibicji poliadenylacji mRNA gospodarza (np. patrz Krug w Textbook of Influenza, Nicholson i inni, wydawca, 1998, 82-92 i odniesienia tam cytowane).
Technika genetyki odwrotnej obejmuje wytwarzanie syntetycznych rekombinowanych RNA wirusów, które zawierają regiony niekodujące ujemnej nici RNA wirusa, które są zasadnicze dla rozpoznania przez polimerazy wirusowe i dla sygnałów upakowania koniecznych do wytworzenia dojrzałego wirionu. Rekombinowane RNA syntetyzuje się z rekombinowanej matrycy DNA i odtwarza in vitro z kompleksem oczyszczonej polimerazy wirusowej, tworząc rekombinowane rybonukleoproteiny (RNP), które można stosować do transfekcji komórek. Skuteczniejszą transfekcję uzyskuje się jeśli białka polimerazy wirusowej są obecne podczas transkrypcji syntetycznego RNA albo in vitro albo in vivo. Syntetyczne rekombinowane RNP można odtworzyć do zakaźnych cząstek wirusowych. Powyższe techniki opisano w patencie U.S nr 5,166,057 wydanym 25 listopada 1992; patencie U.S nr 5,854,037 wydanym 29 grudnia 1998; w europejskiej publikacji patentowej EP 0702085A1, opublikowanej 20 lutego 1996; w zgłoszeniu patentowym U.S numer 09/152,845; w międzynarodowych publikacjach patentowych: PCT WO97/12032 opublikowanej 3 kwietnia 1997; WO 96/34625 opublikowanej 7 listopada 1996; w europejskiej publikacji patentowej EP-A780475; WO 99/02625 opublikowanej 21 stycznia 1999; WO 98/53078 opublikowanej 26 listopada 1998; WO 98/02530 opublikowanej 22 stycznia 1998; WO 99/15672 opublikowanej 1 kwietnia 1999; WO 98/13501 opublikowanej 2 kwietnia 1998; WO 97/06270 opublikowanej 20 lutego 1997; oraz EPO 780 47SA1 opublikowanej 25 czerwca 1997, z których każdą załącza się tu w całości jako odniesienie.
Atenuowane wirusy wytworzone z użyciem genetyki odwrotnej można stosować w szczepionkach i preparatach farmaceutycznych tu opisanych. Techniki genetyki odwrotnej można także stosować do wprowadzania dodatkowych mutacji w innych genach wirusowych istotnych dla wytwarzania szczepionki, to jest do atenuowanego wirusa można wbudować epitopy użytecznych odmian szczepów do szczepionek. Alternatywnie, do atenuowanego szczepu można wbudować całkiem obce epi12
PL 219 128 B1 topy, w tym antygeny pochodzące z innych patogenów wirusowych lub niewirusowych. Przykładowo, do atenuowanego szczepu można wbudować antygeny niespokrewnionych wirusów, takich jak HIV (gp160, gp120, gp41), antygeny pasożytów (np. malarii), antygeny bakteryjne lub grzybowe albo antygeny nowotworowe. Alternatywnie, do chimerowych atenuowanych wirusów według wynalazku można wbudować epitopy, które zmieniają tropizm wirusa in vivo.
W alternatywnej postaci realizacji do skonstruowania atenuowanych wirusów mających pożądane epitopy w przypadku wirusów o segmentowanym RNA można użyć połączenie techniki genetyki odwrotnej i reasortacji. Przykładowo, atenuowany wirus (utworzony przez naturalną selekcję, mutagenezę lub technikę genetyki odwrotnej) oraz szczep niosący pożądany epitop szczepionki (utworzony przez naturalną selekcję, mutagenezę lub technikę genetyki odwrotnej), można koinfekować w gospodarzu, który pozwala na reasortację segmentowanych genomów. Następnie można wyselekcjonować formy z reasortowanym genomem, które obrazują zarówno fenotyp atenuowany jak i pożądany epitop.
W innej postaci realizacji, wirus, który będzie zmutowany jest wirusem posiadającym DNA (np. krowianki, adenowirus, bakulowirus) lub wirusem o dodatniej nici RNA (np. wirus polio). W takich przypadkach, można stosować techniki rekombinacji DNA, które są dobrze znane w dziedzinie (np. patrz opis patentowy U.S nr 4,769,330 Paoletti'ego, opis patentowy U.S nr 4,215,051 Smitha, które załącza się tu w całości jako odniesienie).
Zgodnie z wynalazkiem można skonstruować dowolnego wirusa, w tym, lecz bez ograniczenia, rodziny przedstawione w tabeli 2 poniżej.
T a b e l a 2. Rodziny wirusów ludzkich i zwierzęcych
Cechy wirusa Rodzina wirusa
dsDNA z osłonką Poxviridae Irididoviridae Herpesviridae
Bez osłonki Adenoviridae Papovaviridae Hepadnaviridae
ssDNA bez osłonki Parvoviridae Reaoviridae
dsRNA bez osłonki Birnaviridae
ssRNA z osłonką genom o dodatniej polarności (sensowny) brak etapu DNA w replikacji Togaviridae Flaviviridae Coronaviridae Wirus zapalenia wątroby typu C
Etap DNA w replikacji Retroviridae
Genom o ujemnej polarności (antysensowny)
Genom niesegmentowany Paramyxoviridae Rhabdoviridae Filoviridae
Genom segmentowany Orthomyxoviridae Bunyaviridae Arenaviridae
Bez osłonki Picornaviridae Caliciviridae
Stosowane skróty: ds = podwójna nić; ss = pojedyncza nić; z osłonką = posiadający zewnętrzną podwójną warstwę lipidową pochodzącą z błony komórkowej gospodarza; genom sensowny = dla wirusów RNA, genomy, które składają się z sekwencji nukleotydowej podlegającej bezpośredniej translacji na rybosomach, = dla wirusów DNA, genomy, które składając się z sekwencji nukleotydowych, które są takie same jak mRNA; genom antysensowny = genomy, które składają się z sekwencji nukleotydowej komplementarnej do nici sensownej.
W zalecanej postaci realizacji, niniejszy wynalazek odnosi się do genetycznie zmodyfikowanych wirusów grypy, zawierających delecje i/lub skrócenia produktu genowego NS1. Szczególnie korzystne
PL 219 128 B1 są mutanty NS1 wirusa grypy A i B. W jednym podejściu, można zachować części regionu aminoterminalnego produktu genowego NS1, ale usunąć region C-terminalny produktu genowego NS1. Specyficzne pożądane mutacje można skonstruować poprzez insercje kwasu nukleinowego, delecje, lub mutację w odpowiednim kodonie. W szczególności, skrócone białka NS1 mają od 1-60 aminokwasów, 1-70 aminokwasów, 1-80 aminokwasów, 1-90 aminokwasów (aminokwas N-terminalny jest 1), a korzystnie 90 aminokwasów; od 1-100 aminokwasów; a korzystnie 99 aminokwasów; od 1-110 aminokwasów; od 1-120 aminokwasów; lub od 1-130 aminokwasów, a korzystnie 124 aminokwasy produktu dzikiego typu genu NS1.
Niniejszy wynalazek odnosi się także do dowolnego genetycznie zmodyfikowanego wirusa grypy, w którym produkt genowy NS1 został zmodyfikowany przez skrócenie lub modyfikację białka NS1, które zmutowanym wirusom nadają następujące fenotypy: zdolność wirusów do wzrostu do wysokich mian w substratach niekonwencjonalnych, takich jak jaja kurze z zarodkami 6-7 dniowymi, lub zdolność wirusów do indukcji odpowiedzi interferonowej gospodarza. Dla wirusów grypy A, obejmują one, lecz bez ograniczenia, wirusy ze skróceniami NS1.
Niniejszy wynalazek obejmuje zastosowanie naturalnie występujących zmutowanych wirusów grypy A lub B, mających fenotyp atenuowany, jak również szczepów wirusa grypy zmodyfikowanych tak, aby zawierały takie mutacje odpowiedzialne za fenotyp atenuowany. Dla wirusów grypy A, obejmują one, lecz bez ograniczenia, wirusy, mające NS1 o 124 aminokwasach (Norton i inni, 1987, Virology 156: 204-213, które załącza się tu w całości jako odniesienie). Dla wirusów grypy B obejmują one, lecz bez ograniczenia, wirusy mające mutację skrócenia NS1, zawierające 110 aminokwasów pochodzących z końca N (B/201) (Norton i inni, 1987, Virology 156: 204-213, które załącza się tu w całości jako odniesienie), oraz wirusy, mające mutację skrócenia NS1, obejmujące 89 aminokwasów pochodzących z końca C (B/AWBY-234) (Tobita i inni 1990 Virology 174:314-19, które załącza się tu w całości jako odniesienie). Niniejszy wynalazek obejmuje zastosowanie naturalnie występujących mutantów analogicznych do NS1/38, NS1/80, NS1/124, (Egorov i inni, 1998, J. Virol. 72 (8): 6437-41) jak również naturalnie występujących mutantów, A/Turkey/ORE/71, B/201 lub B/AWBY-234.
Atenuowany wirus grypy można dodatkowo modyfikować tak, aby wykazywał ekspresję antygenów innych szczepów do szczepienia (np. przy użyciu genetyki odwrotnej lub reasortacji). Alternatywnie, atenuowany wirus grypy można skonstruować przy użyciu genetyki odwrotnej lub reasortacji z genetycznie zmodyfikowanymi wirusami tak, aby wykazywał ekspresję całkowicie obcych epitopów, np. antygenów innych patogenów zakaźnych, antygenów nowotworowych lub antygenów kierunkujących. Ponieważ segment RNA NS jest najkrótszy wśród ośmiu RNA wirusowych, możliwe jest, że RNA NS będzie tolerować dłuższe insercje sekwencji heterologicznych niż inne geny wirusowe. Ponadto, segment RNA NS kieruje syntezą dużych ilości białka w zakażonych komórkach, sugerując, że byłby to idealny segment do insercji obcych antygenów. Jednakże, zgodnie z niniejszym wynalazkiem każdy z ośmiu segmentów wirusów grypy można stosować do insercji sekwencji heterologicznych. Przykładowo, jeśli pożądana jest prezentacja antygenu powierzchniowego, można użyć segmenty kodujące białka strukturalne np. HA lub NA.
5.2 Układ selekcji w oparciu o restrykcję gospodarza
Zgodnie z wynalazkiem opisano sposoby selekcji wirusów, które posiadają pożądany fenotyp, czyli wirusów, które posiadają niską lub brak aktywności antagonistycznej wobec IFN, otrzymany z naturalnych odmian, odmian spontanicznych (czyli odmian, które ewoluują podczas namnażania wirusa), mutagenizowanych naturalnych odmian, reasortantów i/lub wirusów genetycznie zmodyfikowanych. Takie wirusy można najlepiej przesiewać w testach wzrostu różnicującego, które porównują wzrost w układach z niedoborem IFN względem układów gospodarza kompetentnych pod względem IFN. Wybiera się wirusy, które wykazują lepszy wzrost w układach z niedoborem IFN względem układów gospodarza kompetentnych pod względem IFN; dogodnie wybiera się wirusy, które rosną do mian o co najmniej jeden logarytm wyższych w układach z niedoborem IFN w porównaniu z układem kompetentnym pod względem IFN.
Alternatywnie, wirusy można przesiewać przy użyciu układów testowych IFN, np. układów testowych opartych na transkrypcji, w których ekspresja genu reporterowego jest kontrolowana przez promotor odpowiadający na IFN. W celu identyfikacji wirusów, które skutecznie indukują odpowiedź wobec IFN, lecz które są niezdolne do antagonizacji odpowiedzi IFN, można mierzyć ekspresję genu reporterowego w komórkach zakażonych względem niezakażonych. Jednak w zalecanej postaci realizacji stosuje się testy wzrostu różnicującego do selekcji wirusów, mających pożądany fenotyp, ponie14
PL 219 128 B1 waż stosowany układ gospodarza (kompetentny pod względem IFN względem układu z niedoborem IFN) stosując odpowiednią presję selekcyjną.
Przykładowo, wzrost wirusa (mierzony przez miano) można porównać w różnych komórkach, liniach komórkowych lub zwierzęcych układach modelowych, które wykazują ekspresję IFN oraz składników odpowiedzi IFN. W tym celu można porównać wzrost wirusa w liniach komórkowych, takich jak linie VERO (które wykazują niedobór IFN) względem komórek MDCK (które są kompetentne pod względem IFN). Alternatywnie, można otrzymać i ustalić linie komórkowe z niedoborem IFN od zwierząt hodowanych lub genetycznie zmodyfikowanych tak, aby wykazywały niedobór w układzie IFN (np. zmutowane myszy STAT1 -/-). Można mierzyć wzrost wirusa w takich liniach komórkowych, w porównaniu z komórkami kompetentnymi pod względem IFN, otrzymanymi np. od zwierząt dzikiego typu (np. myszy dzikiego typu). W jeszcze innej postaci realizacji można skonstruować linie komórkowe, które są kompetentne pod względem IFN i wiadomo, że podtrzymują wzrost wirusa dzikiego typu tak, aby wykazywały niedobór IFN (np. przez nokaut STAT1, IRF3, PKR itd.). Można stosować techniki, które są dobrze znane w dziedzinie namnażania wirusów w liniach komórkowych (patrz np. przykłady działania poniżej). Można porównać wzrost wirusa w standardowej kompetentnej pod względem IFN linii komórkowej przeciwko genetycznie zmodyfikowanej linii komórkowej z niedoborem IFN.
Można także stosować układy zwierzęce. Przykładowo dla grypy, można porównać wzrost w jajach kurzych z zarodkami z niedoborem IFN, np. około 6 do 8-dniowych, ze wzrostem w jajach kurzych z zarodkami kompetentnymi pod względem IFN, np. około 10 do 12 dniowych.
W tym celu można stosować techniki dobrze znane w dziedzinie do zakażania i namnażania w jajach (np. patrz przykłady działania poniżej). Alternatywnie, można porównać wzrost u myszy z niedoborem IFN STAT1 -/-, z myszami dzikiego typu kompetentnymi pod względem IFN. W jeszcze innej realizacji można porównać wzrost w zarodkach kurzych z niedoborem IFN, wytworzonych przez np. transgeniczny drób STAT1 -/-, ze wzrostem w jajach kompetentnych pod względem IFN, wytworzonych przez drób dzikiego typu.
Jednak do celów skriningu można stosować układy krótkotrwałe z niedoborem IFN, zamiast układów genetycznie zmodyfikowanych. Przykładowo, układ gospodarza można traktować związkami, które hamują wytwarzanie IFN i/lub składników odpowiedzi IFN (np. leki, przeciwciała przeciwko IFN, przeciwciała przeciwko receptorowi IFN, inhibitory PKR, cząsteczki antysensowne i rybozymy, itd.). Wzrost wirusa można porównać w nietraktowanych kontrolach kompetentnych pod względem IFN względem układów traktowanych z niedoborem IFN. Przykładowo, starsze jaja kompetentne pod względem IFN można wstępnie traktować takimi lekami przed zakażeniem przesiewanym wirusem. Wzrost porównuje się ze wzrostem uzyskanym w nietraktowanych jajach kontrolnych w tym samym wieku.
Sposoby skriningu tu opisane zapewniają prosty i łatwy przesiew w celu identyfikacji zmutowanych wirusów o zniesionej aktywności antagonistycznej wobec IFN, przez niezdolność zmutowanego wirusa do wzrostu w środowisku odpowiadającym na IFN, w porównaniu ze zdolnością zmutowanego wirusa do wzrostu w środowisku z niedoborem IFN. Sposoby skriningu tu opisane można także stosować do identyfikacji zmutowanych wirusów o zmienionej lecz nie zniesionej aktywności antagonistycznej wobec IFN, przez pomiar zdolności zmutowanego wirusa do wzrostu zarówno w odpowiadających na IFN, np. 10-dniowych jajach z zarodkami lub komórkach MDCK jak i środowiskach z niedoborem IFN, np. 6 do 7-dniowych jajach z zarodkami lub komórkach VERO. Przykładowo, wirusy grypy, wykazujące o co najmniej jeden logarytm niższe miana w 10-dniowych zarodkach w stosunku do 6- 7-dniowych zarodków, będą uważane za posiadające zakłóconą zdolność do hamowania odpowiedzi wobec IFN. W innym przykładzie, wirusy grypy, wykazujące o co najmniej jeden logarytm niższe miano u 12-dniowych zarodków (które wykazują wysoką odpowiedź wobec IFN) w stosunku do 10-dniowych zarodków (które wykazują średnią odpowiedź wobec IFN) uznaje się za częściowo zakłóconą pod względem zdolności do antagonizacji odpowiedzi IFN i uznaje się za atrakcyjnych kandydatów do szczepionki.
Sposoby selekcji tu opisane obejmują także identyfikację tych zmutowanych wirusów, które indukują odpowiedzi wobec IFN. Zgodnie ze sposobami selekcji tu opisanymi, indukcję odpowiedzi wobec IFN można mierzyć przez testowanie poziomu ekspresji IFN lub ekspresji genów docelowych lub genów reporterowych indukowanych przez IFN po zakażeniu zmutowanym wirusem lub aktywacji transaktywatorów związanych z ekspresją IFN i/lub odpowiedzią IFN.
Indukcję odpowiedzi IFN można określać przez pomiar stanu fosforylacji składników szlaku IFN po zakażeniu testowanym zmutowanym wirusem, np. IRF-3, który jest ufosforylowany w odpowiedzi
PL 219 128 B1 na podwójną nić RNA. W odpowiedzi na IFN typu I, następuje szybka fosforylacja tyrozyny kinazy Jak1 i kinazy TyK2, podjednostek receptora IFN, STAT1 i STAT2. Tak więc, w celu określenia czy zmutowany wirus indukuje odpowiedź IFN, komórki, takie jak komórki 293, zakaża się testowanym zmutowanym wirusem i po infekcji komórki poddaje się lizie. Składniki szlaku IFN, takie jak kinaza Jak1, lub kinaza TyK2, poddaje się immunoprecypitacji z lizatów zakażonych komórek, przy użyciu specyficznych surowic poliklonalnych lub przeciwciał i określa stan fosforylacji kinazy tyrozynowej, przez testy odcisku immunologicznego z użyciem przeciwciała anty-fosfotyrozynowego (np. patrz Krishnan i inni 1997., Eur. J.Biochem.247:298-305). Stan zwiększonej fosforylacji jakiegokolwiek składnika szlaku IFN po zakażeniu zmutowanym wirusem będzie wskazywać na indukcję odpowiedzi IFN przez zmutowanego wirusa.
Układy selekcyjne tu opisane obejmują pomiar zdolności do wiązania specyficznych sekwencji DNA lub translokacji czynników transkrypcji indukowanej w odpowiedzi na infekcje wirusową, np. IRF3, STAT1, STAT2 itd. W szczególności, STAT1 i STAT2 są ufosforylowane i translokowane z cytoplazmy do jądra, w odpowiedzi na IFN typu I. Zdolność do wiązania specyficznych sekwencji DNA lub translokacji czynników transkrypcji można mierzyć technikami znanymi fachowcom, np. EMSA (ang. electromobility shift assay), barwienia komórek itd.
Indukcję odpowiedzi IFN można określić przez pomiar aktywacji transkrypcji zależnej od IFN po zakażeniu testowym zmutowanym wirusem. Ekspresję genów o których wiadomo, że są indukowane przez IFN, np. Mx, PKR, 2-5-oligoadenylanosyntetazy, głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) klasy I, itd., można analizować technikami znanymi fachowcom (np. northern blot, western blot, PCR itd.).
Alternatywnie, testowane komórki, takie jak ludzkie komórki zarodkowe nerek lub ludzkie komórki mięsaka kościotwórczego, modyfikuje się tak, aby wykazywały krótkotrwałą lub konstytutywną ekspresję genów reporterowych, takich jak gen reporterowy lucyferazy lub gen reporterowy transferazy chloramfenikolowej (CAT) pod kontrolą elementu odpowiedzi stymulowanej IFN, takiego jak promotor stymulowany IFN genu ISG-54K (Bluyssen i inni 1994, Eur. J. Biochem. 220:395-402). Komórki zakaża się testowym zmutowanym wirusem i poziom ekspresji genu reporterowego porównuje z komórkami niezakażonymi lub komórkami zakażonymi wirusem dzikiego typu. Zwiększenie poziomu ekspresji genu reporterowego po zakażeniu testowym wirusem będzie wskazywać, że testowy zmutowany wirus indukuje odpowiedź IFN.
Układy selekcyjne tu opisane obejmują pomiar indukcji IFN przez określenie, czy ekstrakt z komórek lub jaj zakażonych testowym zmutowanym wirusem jest zdolny do nadawania aktywności zabezpieczającej przeciw infekcji wirusowej. Konkretniej, grupy 10-dniowych jaj z zarodkami zakaża się testowym zmutowanym wirusem lub wirusem dzikiego typu. Około 15 do 20 godzin po zakażeniu zbiera się płyn omoczniowy i testuje pod względem aktywności IFN, przez określenie najwyższego rozcieńczenia z zabezpieczającą aktywnością przed infekcją VSV w komórkach hodowli tkankowej, takiej jak komórki CEF.
5.3 Namnażanie wirusa w substratach wzrostowych z niedoborem interferonu
Do hodowli i izolacji naturalnie występujących lub zmodyfikowanych zmutowanych wirusów, mających zmienioną aktywność antagonistyczną wobec IFN, można stosować także sposoby i substraty z niedoborem IFN. Substraty z niedoborem IFN, które można stosować do podtrzymywania wzrostu atenuowanych zmutowanych wirusów, obejmują, lecz bez ograniczenia, naturalnie występujące komórki, linie komórkowe, zwierzęta lub jaja z zarodkami, które wykazują niedobór IFN, np. komórki Vero, młode jaja z zarodkami; rekombinowane komórki lub linie komórkowe, które są tak zmodyfikowane, aby wykazywały niedobór IFN, np. linie komórkowe z niedoborem IFN pochodzące z myszy z wyłącznym STAT1 lub innych podobnie zmodyfikowanych zwierząt transgenicznych; jaja z zarodkami otrzymane od ptaków z niedoborem IFN, zwłaszcza drobiu (np. kur, kaczek, indyków), łącznie ze stadem, które jest tak hodowane, aby wykazywało niedobór IFN, lub ptaków transgenicznych (np. nokautów STAT1). Alternatywnie, układ komórek gospodarza, linie komórkowe, jaja lub zwierzęta można genetycznie zmodyfikować tak, aby wykazywały ekspresję transgenów, kodujących inhibitory układu IFN, np. dominujące mutanty ujemne, takie jak STAT1 bez domeny wiążącej DNA, antysensowny RNA, rybozymy, inhibitory wytwarzania IFN, inhibitory sygnału IFN i/lub inhibitory genów antywirusowych indukowanych przez IFN. Należy pamiętać, że zwierzęta, które są hodowane lub genetycznie zmodyfikowane tak, aby wykazywały niedobór IFN, będą wykazywać nieco obniżoną odporność immunologiczną, i powinny być utrzymywane w kontrolowanym środowisku pozbawionym chorób. Tak więc należy przedsięwziąć odpowiednie środki (włączając stosowanie antybiotyków w diecie), aby ograniczyć ryzyko ekspozycji na czynniki zakaźne zwierząt transgenicznych z niedoborem IFN,
PL 219 128 B1 takich jak stada kur hodowlanych, kaczek, indyków, itd. Alternatywnie, układ gospodarza, np. komórki, linie komórkowe, jaja lub zwierzęta można traktować związkiem, który hamuje wytwarzanie IFN i/lub szlak IFN, np. lekami, przeciwciałami, cząsteczkami antysensownymi, cząsteczkami rybozymowymi ukierunkowanymi na gen STAT1 i/lub genami antywirusowymi indukowanymi przez IFN.
Niedojrzałe jaja kurze z zarodkami obejmują jaja, które naturalnie są w poniżej dziesięciu dni, dogodnie sześć do dziewięciu dni; oraz jaja, które sztucznie naśladują niedojrzałe jaja w wieku poniżej dziesięciu dni, w wyniku zmian warunków wzrostu, np. zmian temperatury inkubacji, co powoduje opóźniony rozwój jaj tak, że układ IFN jaja nie jest w pełni rozwinięty w porównaniu z jajami 10- do 12-dniowymi.
5.3.1 Naturalne substraty z niedoborem IFN
Naturalnie występujące i zmodyfikowane zmutowane wirusy mogą być namnażane w niekonwencjonalnych substratach, takich jak niedojrzałe jaja z zarodkami, które jeszcze nie wykształciły układu IFN. Niedojrzałych jaj z zarodkami nie stosuje się zazwyczaj do hodowli wirusów, z powodu ich delikatności i mniejszej objętości omoczni. Niniejszy wynalazek obejmuje hodowlę zmutowanych wirusów w zarodkach mniej niż 10-dniowych; dogodnie hodowlę zmutowanego wirusa w 8-dniowych zarodkach i najkorzystniej w 6- do 8-dniowych zarodkach.
Zgodnie z wynalazkiem opisano także sposoby hodowli i izolacji zmutowanych wirusów, posiadających zmienioną aktywność antagonistyczną wobec IFN, w komórkach i liniach komórkowych, które naturalnie nie posiadają szlaku IFN lub wykazują niedobór szlaku IFN lub niedobory w szlaku IFN, np. niski poziom ekspresji IFN w porównaniu z komórkami dzikiego typu. W szczególnie zalecanej postaci opisano sposoby hodowli zmutowanych wirusów, posiadających zmienioną aktywność antagonistyczną wobec IFN, w komórkach Vero.
5.3.2 Genetycznie zmodyfikowane substraty z niedoborem IFN
Zgodnie z wynalazkiem opisano sposoby hodowli i izolowania zmutowanych wirusów, posiadających zmienioną aktywność antagonistyczną wobec IFN, w genetycznie zmodyfikowanym substracie z niedoborem IFN. Zgodnie z wynalazkiem opisano transgeniczne ptactwo, u którego zmutowano gen zasadniczy dla układu IFN, np. STAT1, które będzie składać jaja z niedoborem IFN. Zgodnie z wynalazkiem opisano dodatkowo transgeniczne ptactwo, które wykazuje ekspresję dominujących ujemnych czynników transkrypcyjnych, np. braku domeny wiążącej DNA STAT1, rybozymów, antysensownego RNA, inhibitorów wytwarzania IFN, inhibitorów sygnalizacji IFN i inhibitorów genów antywirusowych indukowanych w odpowiedzi na IFN. Korzyść ze stosowania jaj od transgenicznego ptactwa z niedoborem IFN jest taka, że do hodowli wirusa można stosować konwencjonalne 10-dniowe jaja, które są stabilniejsze i mają większą objętość z powodu większego rozmiaru. W jeszcze innej postaci realizacji, można zbudować linie komórkowe można aby wykazywały niedobór IFN. Niniejszy wynalazek obejmuje linie komórkowe, w których mutuje się geny zasadnicze do syntezy IFN, szlaku IFN i/lub genu (genów) antywirusowego indukowanego przez IFN, np. STAT1.
Zgodnie z wynalazkiem opisano rekombinowane linie komórkowe lub zwierzęta, w szczególności ptaki, u których jeden lub więcej genów zasadniczych dla szlaku IFN, np. receptor interferonowy STAT1 itd., został przerwany, czyli jest „znokautowany; zwierzęciem rekombinowanym może być każde zwierzę, lecz w zalecanej postaci realizacji jest to ptak, np. kurczak, indyk, kura, kaczka itd. (patrz np. Sang, 1994, Trends Biotechnol. 12:415; Perry i inni 1993, Trasgenic Res. 2:125; Stern, C.D. 1996, Curr Top Microbiol Immunol 212:195-206; oraz Shuman, 1991, Experimentia 47: 897 w celu przeglądu pod względem wytwarzania ptaków transgenicznych, które załącza się tu w całości jako odniesienie). Taką linię komórkową lub zwierzę można wytworzyć każdą metodą znaną w dziedzinie, pod względem przerywania genu na chromosomie komórki lub zwierzęcia. Takie techniki obejmują, lecz bez ograniczenia, mikroiniekcję do przedjądrzy (Hoppe i Wagner, 1989, opis patentowy nr 4 873,191); przenoszenie genu za pośrednictwem retrowirusa do linii zarodkowych (Van der Putten i inni, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82:6148-6152); celowanie genowe w zarodkowych komórkach macierzystych (Thompson i inni, 1989, Cell 56:313); elektroporację zarodków (Lo, 1983, Mol Cell. Biol. 3:1803); oraz przenoszenie genu za pośrednictwem nasienia (Lavitrano i inni, 1989, Cell 57:717); itd. Dla przeglądu takich technik, patrz Gordon, 1989, Transgenic Animals, Intl. Rev. Cytol. 115:171, które załącza się tu w całości jako odniesienie.
W szczególności znokautowane zwierzę STAT1 można wytworzyć przez pobudzenie rekombinacji homologicznej między genem STAT1 w jego chromosomie i egzogennym genem STAT1, który uczyniono biologicznie nieaktywnym (dogodnie przez insercje sekwencji heterologicznej, np. genu
PL 219 128 B1 oporności na antybiotyk). Metody rekombinacji homologicznej do przerywania genów w genomie myszy opisano np. w Capecchi (1989, Science, 244:1288) i Mansour i inni (1988, Nature 336:348).
W skrócie, całość lub część klonu genomowego STAT1 izoluje się z genomowego DNA od tego samego gatunku, jak znokautowana komórka lub zwierzę. Klon genomowy STAT1 można izolować każdą metodą znaną w dziedzinie pod względem izolacji klonów genomowych (np. przez sondowanie biblioteki genomowej sondą pochodzącą od sekwencji STAT1, takiej jak sekwencje dostarczone do wglądu przez Meraz i innych 1996, Cell 84: 431; Durbin i innych 1996, Cell 84:443 i odniesienia tam cytowane). Po wyizolowaniu klonu genomowego całość lub część klonu wprowadza się do rekombinowanego wektora. Dogodnie część klonu wprowadzanego do wektora zawiera co najmniej część egzonu genu STAT1, czyli zawiera sekwencję kodującą białko STAT1. Następnie do egzonu genu STAT1 wprowadza się sekwencję niehomologiczną do sekwencji STAT1, dogodnie dodatni marker selekcji, taki jak gen kodujący oporność na antybiotyk. Marker selekcji jest dogodnie związany w sposób umożliwiający działanie z promotorem, dogodniej promotorem konstytutywnym. Sekwencję niehomologiczną wprowadza się w dowolnym miejscu sekwencji kodującej STAT1, co będzie przerywać aktywność STAT1, np. w pozycji, w której mutacje punktowe lub inne mutacje inaktywują, jak przedstawiono, działanie białka STAT1. Przykładowo, lecz bez ograniczenia, sekwencję niehomologiczną można wprowadzić do sekwencji kodującej część białka STAT1, zawierającej całość lub część domeny kinazy (np. sekwencji kodującej co najmniej 50, 100, 150, 200 lub 250 aminokwasów domeny kinazy).
Dodatnim markerem selekcji jest dogodnie gen oporności neomycynowej (gen neo) lub gen oporności higromycynowej (gen hygro). Promotorem może być każdy promotor znany w dziedzinie; np. promotorem może być promotor kinazy fosfoglicerynianowej (PGK) (Adra i inny, 1987, Gene 60:65-74), promotor PolII (Soriano i inni, 1991 Cell 64:693-701) lub promotor MC1, który jest promotorem syntetycznym przeznaczonym do ekspresji w komórkach macierzystych pochodzących od zarodka (Thomas i Capecchi, 1987, Cell 51:503-512). Zastosowanie markera selekcji, takiego jak gen oporności na antybiotyk pozwala na selekcję komórek, do których wprowadzono wektor celujący (np. ekspresja produktu genu neo nadaje oporność na G418, a ekspresja produktu genu hygro nadaje oporność na higromycynę).
W zalecanej postaci realizacji ujemny marker selekcji dla etapu selekcji przeciwnej do rekombinacji homologicznej wektora, w przeciwieństwie do niehomologicznej, wprowadza się na zewnątrz insertu klonu genomowego STAT1. Przykładowo, takim ujemnym markerem selekcji jest gen kinazy tymidynowej HSV (HSV-tk), którego ekspresja uwrażliwia komórki na gancyklowir. Ujemny marker selekcji znajduje się dogodnie pod kontrolą promotora, takiego jak, lecz bez ograniczenia, promotor PGK, promotor PolII lub promotor MC1.
Gdy nastąpi rekombinacja homologiczna, części wektora, które są homologiczne do genu STAT1, jak również niehomologiczny insert wewnątrz sekwencji genu STAT1, wprowadza się do genu STAT1 w chromosomie, a pozostałość wektora traci się. Tak więc, ze względu na to, że ujemny marker selekcji znajduje się na zewnątrz regionu homologii z genem STAT1, komórki, w których zaszła rekombinacja homologiczna (lub ich potomstwo), nie będą zawierać ujemnego markera selekcji. Przykładowo, jeśli ujemnym markerem selekcji jest gen HSV-tk, komórki w których zaszła rekombinacja homologiczna, nie będą wykazywały ekspresji kinazy tymidynowej i przeżyją ekspozycję na gancyklowir. Procedura ta pozwala na selekcję komórek, w których zaszła rekombinacja homologiczna w porównaniu z rekombinacją niehomologiczną, w której prawdopodobnie ujemny marker selekcji jest także wprowadzony do genomu razem z sekwencjami STAT1 i dodatnim markerem selekcji. Tak więc, komórki, w których zaszła rekombinacja niehomologiczna, będą najprawdopodobniej wykazywać ekspresję kinazy tymidynowej i będą wrażliwe na gancyklowir.
Po wytworzeniu wektora celującego, linearyzuje się go z użyciem enzymu restrykcyjnego, dla którego istnieje unikalne miejsce w wektorze celującym, i linearyzowany wektor wprowadza się do komórek macierzystych (ES) pochodzących z zarodka (Gossler i inni 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9065-9069) jakąkolwiek metodą znaną w dziedzinie, np. przez elektroporację. Jeśli wektor celujący zawiera dodatni marker selekcji oraz ujemny, marker selekcji przeciwnej, komórki ES, w których zaszła rekombinacja homologiczna, można wyselekcjonować przez inkubację w pożywkach selektywnych. Przykładowo, jeśli markery selekcji są genem oporności neo i genem HSV-tk, komórki są poddawane ekspozycji na G418 (np. około 300 μg/ml) i gancyklowir (np. około 2 μΜ).
PL 219 128 B1
W celu potwierdzenia, że przerwane sekwencje STAT1 rekombinowały homologicznie do genu STAT1 w genomie komórek ES, można stosować każdą technikę znaną w dziedzinie do genotypowania, np. lecz bez ograniczenia, analizę Southern blot lub reakcję łańcuchową polimerazy. Ponieważ mapa restrykcyjna klonu genomowego STAT1 jest znana i znane są sekwencje kodujące sekwencję STAT1 (patrz Meraz i inni 1996, Cell 84: 431; Durbin i inni 1996, Cell 84: 443-450, wszystkie cytowane tam odniesienia), można określić wielkość poszczególnych fragmentów restrykcyjnych lub produktów powielania PCR wytworzonych z DNA zarówno od przerwanych jak i nieprzerwanych alleli. Tak więc, testując pod względem fragmentu restrykcyjnego lub produktu PCR, wielkość, o jaką różnią się przerwany i nieprzerwany gen STAT1, można określić czy zaszła rekombinacja homologiczna przerywająca gen STAT1.
Następnie komórki ES z przerwanym lokus STAT1 można wprowadzić do blastocyst przez mikroiniekcję, a potem blastocysty można wszczepić do macic myszy będących w ciąży rzekomej, stosując rutynowe techniki. Zwierzę, które rozwinie się z wszczepionej blastocysty jest chimerowe pod względem przerwanego allelu. Chimerowe samce można krzyżować z samicami, i taka krzyżówka może być tak zaplanowana, że transmisja linii zarodkowej allelu łączy się z transmisją pewnej barwy powlekającej. Transmisję linii zarodkowej allelu można potwierdzić przez Southern blotting lub analizę PCR, jak opisano powyżej, genomowego DNA wyizolowanego z próbek tkanek.
5.3.3 Krótkotrwałe substraty z niedoborem IFN
Komórki, linie komórkowe, zwierzęta lub jaja, można wstępnie traktować związkami, które hamują układ IFN. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem związki, które hamują syntezę IFN, lub aktywność albo ekspresję składników układu IFN, można stosować do wstępnego traktowania gospodarza, np. związki hamujące syntezę IFN, aktywność IFN, receptor IFN, inne cele w szlaku przenoszenia sygnału IFN, lub które hamują aktywność genów antywirusowych indukowanych przez IFN. Przykładami związków, które można stosować zgodnie z niniejszym wynalazkiem są, lecz bez ograniczenia, cząsteczki kwasu nukleinowego, przeciwciała, peptydy, antagoniści receptora IFN, inhibitory szlaku STAT1, inhibitory PKR itd. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, cząsteczki kwasu nukleinowego obejmują cząsteczki antysensowne, rybozymy i cząsteczki o potrójnej helisie, które celują w geny, kodujące zasadnicze składniki układu IFN, np. STAT1. Cząsteczki kwasu nukleinowego obejmują także nukleotydy kodujące dominujące mutanty ujemne składników układu IFN; np. przed infekcją mutantem wirusowym, komórki można transferować DNA, kodującym skróconego mutanta receptora IFN niekompetentnego pod względem sygnału.
Dominujące mutanty ujemne, które można stosować zgodnie z niniejszym wynalazkiem do hamowania szlaku IFN, obejmują wersje z niedoborem kinazy Jak1, TyK2 lub czynniki transkrypcyjne bez domen wiążących DNA STAT1 oraz STAT2 (patrz np. Krishman i inni 1997, Eur. J. Biochem. 247:298-305).
5.4 Preparaty szczepionki
Wynalazek obejmuje preparaty szczepionki, zawierające atenuowane wirusy o ujemnej nici RNA, mające zaburzoną zdolność do antagonizacji komórkowej odpowiedzi IFN, oraz odpowiedni nośnik. Wirus stosowany w preparacie szczepionki można wybrać spośród naturalnie występujących mutantów lub odmian, wirusów zmutowanych lub genetycznie zmodyfikowanych. Szczepy atenuowane wirusów o segmentowanym RNA można także wytworzyć przez techniki reasortacji lub stosując połączenie technik podejścia genetyki odwrotnej i reasortacji. Naturalnie występujące odmiany obejmują wirusy wyizolowane z natury, jak również odmiany spontanicznie występujące, wytworzone podczas namnażania wirusa, posiadające zaburzoną zdolność do antagonizacji odpowiedzi komórkowej IFN. Atenuowany wirus można stosować sam jako składnik aktywny w preparacie szczepionki. Alternatywnie, atenuowany wirus można stosować jako wektor lub „szkielet szczepionek wytworzonych w sposób rekombinowany. W tym celu można stosować techniki rekombinacji, takie jak genetyka odwrotna (lub dla wirusów segmentowanych, połączenia genetyki odwrotnej i technik reasortacji), aby wprowadzić mutacje lub wprowadzić obce antygeny do atenuowanego wirusa stosowanego w preparacie szczepionki. W ten sposób można opracować szczepionki do immunizacji przeciw odmianom szczepów lub alternatywnie przeciw całkiem innym czynnikom zakaźnym lub antygenom chorobowym.
W rzeczywistości, w wirusach według wynalazku można skonstruować dowolną sekwencję genu heterologicznego do zastosowania w szczepionkach. Dogodnie, epitopy, które indukują zabezpieczającą odpowiedź immunologiczną wobec dowolnego z różnych patogenów, lub antygeny, które wiążą przeciwciała neutralizujące, mogą podlegać ekspresji przez wirusy lub ich część. Przykładowo, heterologiczne sekwencje genowe, które można skonstruować w wirusach według wynalazku do zaPL 219 128 B1 stosowania w szczepionkach, obejmują lecz bez ograniczenia, epitopy ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV), taki jak gp120; antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg); glikoproteiny wirusa opryszczki (np. gD, gE); VP1 poliowirusa; determinanty antygenowe patogenów nie wirusowych, takich jak bakterie i pasożyty. W innej postaci realizacji, może zachodzić ekspresja całości lub części genów immunoglobulin. Przykładowo, w wirusach według wynalazku można skonstruować regiony zmienne immunoglobulin antyidiotypowych, które naśladują takie epitopy. W jeszcze innej postaci realizacji, może zachodzić ekspresja antygenów związanych z guzem nowotworowym.
Można opracowywać albo żywe rekombinowane szczepionki wirusowe, albo inaktywowane rekombinowane szczepionki wirusowe. Żywe szczepionki mogą być zalecane, ponieważ namnożenie w gospodarzu prowadzi do przedłużenia bodźca podobnego rodzaju i zwiększenie w stosunku do bodźca występującego przy naturalnych infekcjach, a zatem nadaje zasadniczą, długotrwałą odporność. Wytwarzanie takich żywych rekombinowanych preparatów szczepionek wirusowych można osiągnąć przy zastosowaniu konwencjonalnych metod obejmujących namnożenie wirusa w hodowli komórkowej lub omoczni zarodków kurzych, po czym oczyszczenie.
Preparaty szczepionki mogą zawierać genetycznie zmodyfikowane wirusy o ujemnej nici RNA, które mają mutacje w genie NS1 lub analogicznym, w tym, lecz bez ograniczenia, mutanty grypy o skróconym NS1 opisane w przykładach realizacji poniżej. Można je także opracowywać przy użyciu naturalnych odmian grypy A, tak jak naturalna odmiana grypy A A/turkey/Ore/71, lub B/201 i B/AWBY234, które są naturalnymi odmianami grypy B.
Gdy opracowuje się postać żywej szczepionki wirusowej, należy stosować zakres wynoszący około 104 pfu do około 5x106 pfu na dawkę.
Do wprowadzania preparatu szczepionki opisanego powyżej można stosować wiele metod, obejmują one, lecz bez ograniczenia, drogę donosową, dotchawiczą, doustną, przezskórną, domięśniową, dootrzewnową, dożylną i podskórną. Zalecane będzie wprowadzanie preparatu szczepionki wirusowej poprzez naturalną drogę zakażenia patogenem, dla którego przeznaczona jest szczepionka, lub poprzez naturalną drogę zakażenia rodzicielskiego wirusa atenuowanego. Przy stosowaniu preparatu żywej szczepionki wirusowej, zalecane jest wprowadzanie preparatu poprzez naturalną drogę infekcji wirusem grypy. Dogodnie, można wykorzystać zdolność wirusa grypy do indukcji energicznej komórkowej odpowiedzi wydzielniczej i odpornościowej. Przykładowo, zakażenie dróg oddechowych wirusami grypy może indukować silną wydzielniczą odpowiedź immunologiczną, np. w układzie moczopłciowym, ze współistniejącym zabezpieczeniem przed poszczególnymi czynnikami powodującymi chorobę.
Szczepionkę według niniejszego wynalazku, zawierającą 104-5x106 pfu zmutowanych wirusów o zmienionej aktywności antagonistycznej wobec IFN, można podawać raz. Alternatywnie, szczepionkę według niniejszego wynalazku, zawierającą 104-5x106 pfu zmutowanych wirusów o zmienionej aktywności antagonistycznej wobec IFN, można podawać tak często jak potrzeba, zwierzęciu, w szczególności ssakowi, a zwłaszcza człowiekowi.
5.5 Kompozycje farmaceutyczne
Niniejszy wynalazek obejmuje kompozycje farmaceutyczne, zawierające zmutowane wirusy o zmienionej aktywności antagonistycznej wobec IFN, do zastosowania jako środki antywirusowe lub środki antynowotworowe lub jako środki przeciw chorobom wrażliwym na IFN. Kompozycje farmaceutyczne mają zastosowanie jako profilaktyczne środki antywirusowe i można je podawać osobnikom z ryzykiem nabycia zakażenia lub wobec których oczekuje się ekspozycji na wirusa. Przykładowo, w przypadku dziecka wracającego do domu ze szkoły, gdzie zostało ono poddane ekspozycji na grypę u kilku kolegów, rodzice podaliby antywirusową kompozycję farmaceutyczną sobie, dziecku i innym członkom rodziny, w celu zapobiegnięcia infekcji wirusowej i późniejszej chorobie. Leczeni mogą być także ludzie, którzy podróżują do części świata, gdzie powszechne są pewne choroby zakaźne (np. wirus zapalenia wątroby typu A, malaria itd.).
Alternatywnie, kompozycje farmaceutyczne można stosować do leczenia guzów nowotworowych lub zapobiegania tworzeniu guzów nowotworowych, np. u pacjentów, którzy mają raka lub u których istnieje wysokie ryzyko powstania nowotworu lub raka. Przykładowo, pacjenci z rakiem mogą być leczeni w celu zapobiegania dalszemu tworzeniu się nowotworu. Alternatywnie, leczone mogą być podmioty, które są poddane lub mogą być poddane ekspozycji na substancje rakotwórcze; leczone mogą być osobniki związane z czystością środowiska, które mogą się stykać z zanieczyszczeniami (np. azbestem). Alternatywnie, osobniki, które mają być poddane ekspozycji na promieniowanie, moż20
PL 219 128 B1 na leczyć przed ekspozycją i po niej (np. pacjenci poddawani ekspozycji na wysokie dawki promieniowania lub którzy muszą brać leki rakotwórcze).
Zastosowanie atenuowanych wirusów według wynalazku jako środków antyrakowych opiera się na stwierdzeniu twórców wynalazku, że atenuowany mutant wirusa grypy, zawierający delecję w genie antagonizującym IFN, jest zdolny do zmniejszania tworzenia guza nowotworowego u myszy. Właściwości przeciwnowotworowe według wynalazku mogą być co najmniej częściowo związane z ich zdolnością do wzrostu w komórkach nowotworowych i zabijania komórek nowotworowych, o których wiadomo, że wiele z nich ma niedobory w układzie IFN. Bez względu na mechanizm (mechanizmy) cząsteczkowe odpowiedzialne za właściwości przeciwnowotworowe, atenuowane wirusy według wynalazku można stosować do leczenia guzów nowotworowych lub do zapobiegania tworzeniu guzów nowotworowych.
Niniejszy wynalazek obejmuje dodatkowo zmutowane wirusy o zmienionym fenotypie antagonistycznym wobec IFN, które są wycelowane w konkretne narządy, tkanki i/lub komórki w organizmie, w celu indukcji miejscowego efektu terapeutycznego lub zapobiegawczego. Zaletą takiego podejścia jest to, że wirusy indukujące IFN według wynalazku są skierowane na konkretne miejsca, np. umiejscowienia guza nowotworowego, aby indukować IFN w sposób specyficzny dla miejsca, bardziej dla efektu terapeutycznego niż indukcji układowej IFN, która może mieć skutki toksyczne.
Zmutowane wirusy indukujące IFN według wynalazku można zmodyfikować z zastosowaniem opisanych tu sposobów do ekspresji białek lub peptydów, które nakierowywałyby wirusy na szczególne miejsce. W zalecanej postaci realizacji wirusy indukujące IFN byłyby kierowane do miejsca, w którym umiejscawiają się guzy nowotworowe. W takiej postaci realizacji zmutowane wirusy można zmodyfikować do ekspresji miejsca łączenia antygenu z przeciwciałem, które rozpoznaje antygen specyficzny dla guza nowotworowego, kierując w ten sposób wirusa indukującego IFN do guza nowotworowego. W jeszcze innej postaci realizacji, jeśli docelowy guz nowotworowy wykazuje ekspresję receptora hormonu, tak jak guzy sutka lub jajnika, które wykazują ekspresję receptorów estrogenowych, wirus indukujący IFN można zmodyfikować tak, aby wykazywał ekspresję odpowiedniego hormonu. W jeszcze innej postaci realizacji, jeśli docelowy guz nowotworowy wykazuje ekspresję receptora czynnika wzrostu, np. VEGF, EGF lub PDGF, wirus indukujący IFN można tak zmodyfikować, aby wykazywał ekspresję odpowiedniego czynnika wzrostu lub jego części. Tak więc, zgodnie z wynalazkiem, wirusy indukujące IFN można tak zmodyfikować, aby wykazywały ekspresję każdego docelowego produktu genowego, włączając peptydy, białka, takie jak enzymy, hormony, czynniki wzrostu, antygeny lub przeciwciała, które będą działać kierując wirusa do miejsca potrzebującego aktywności antywirusowej, antybakteryjnej, antydrobnoustrojowej lub antynowotworowej.
Sposoby wprowadzania obejmują, lecz bez ograniczenia, drogą donosową, dotchawiczą, doustną, przezskórną, domięśniową, dootrzewnową, dożylną i podskórną. Kompozycje farmaceutyczne według niniejszego wynalazku można podawać jakąkolwiek dogodną drogą, np. przez infuzję lub iniekcję w bolusie, przez absorpcję przez nabłonek lub śluzówkę (np. śluzówkę jamy ustnej, odbytu i jelita, itd.), oraz można je podawać razem z innymi czynnikami biologicznie aktywnymi. Podawanie może być układowe lub miejscowe. Oprócz tego, w zalecanej postaci realizacji, może być pożądane wprowadzenie kompozycji farmaceutycznych według wynalazku do płuc, każdą odpowiednią drogą. Podawanie dopłucne można także wykorzystać np. stosując inhalator lub nebulizator oraz preparat ze środkiem aerozolowym.
W specyficznej postaci realizacji może być pożądane podawanie kompozycji farmaceutycznych według wynalazku miejscowo do obszaru wymagającego leczenia; można to osiągnąć np. lecz bez ograniczenia, przez infuzję miejscową podczas operacji, nałożenie na powierzchnię, np. w połączeniu z opatrunkiem na ranę po operacji, przez iniekcję, za pomocą cewnika, za pomocą czopka, lub za pomocą implantu, przy czym wymieniony implant jest materiałem porowatym, nieporowatym lub żelowym, włączając błony, takie jak błony sialastyczne lub włókna. W jednej postaci realizacji podawanie może następować przez bezpośrednią iniekcję w miejscu (lub poprzednim miejscu) guza złośliwego lub nowotworowego lub tkanki przednowotworowej.
W jeszcze innej postaci realizacji kompozycję farmaceutyczną można dostarczać w układzie kontrolowanego uwalniania. W jednej postaci realizacji można stosować pompę (patrz Langer jak wyżej; Sefton, 1987 CRC Crit, Ref. Biomed.Eng. 14:201; Buchwalf i inni, 1980, Surgery 88: 507; Saudek i inni, 1989, N.Engl.J.Med. 321:574). W innej postaci realizacji można stosować materiały polimeryczne (patrz Medical Applications of Controlled Release Langer i Wise (wydawcy), CRC Press., Boca Raton, Floryda (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, SmoPL 219 128 B1 len i Ball (wydawcy), Wiley, Nowy Jork (1984); Ranger i Peppas, 1983, J. Macromol.Sci.Rev. Macromol.Chem. 23:61; patrz także Levy i inni, 1985, Science, 228:190; During i inni, 1989, Ann.Neurol. 25:351 (1989); Howard i inni, 1989, J. Neurosurg. 71:105). W jeszcze innej postaci realizacji, układ kontrolowanego uwalniania można umieścić w pobliżu celu kompozycji, czyli płuca, co wymaga jedynie frakcji dawki układowej (patrz np. Goodson, 1984, w Medical Application of Controlled Release, jak wyżej, tom 2, strony 115-138). Inne układy kontrolowanego uwalniania zostały omówione w przeglądzie Langera (1990, Science, 249:1527-1533).
Kompozycje farmaceutyczne według niniejszego wynalazku obejmują terapeutycznie skuteczną ilość atenuowanego wirusa oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. W konkretnej postaci realizacji określenie „farmaceutycznie dopuszczalny oznacza zaakceptowany przez federalną lub rządową agencję prawodawczą, lub wymieniony w Farmakopei amerykańskiej, albo innej generalnie uznawanej farmakopei do stosowania u zwierząt, a szczególnie u ludzi. Określenie „nośnik odnosi się do rozcieńczalnika, adiuwanta, zaróbki lub podłoża, z którym podaje się kompozycję farmaceutyczną. Jako nośniki ciekłe można wykorzystać także roztwory soli i wodne roztwory dekstrozy i glicerolu, szczególnie do roztworów do wstrzyknięć. Odpowiednimi zaróbkami farmaceutycznymi są skrobia, glukoza, laktoza, sacharoza, żelatyna, słód, ryż, mąka, kreda, żel krzemionkowy, stearynian sodowy, monostearynian glicerolu, talk, chlorek sodu, sproszkowane mleko odtłuszczone, glicerol, glikol propylenowy, woda, etanol i temu podobne. Kompozycje te mogą przybierać postać roztworów, zawiesin, emulsji, tabletek, pigułek, kapsułek, proszków, preparatów do opóźnionego uwalniania i temu podobnych. Kompozycje te można opracowywać w postaci czopków. Preparaty doustne mogą obejmować standardowe nośniki, takie jak farmaceutycznej czystości mannitol, laktoza, skrobia, stearynian magnezu, sacharyna sodowa, celuloza, węglan magnezu, itd. Przykłady odpowiednich nośników farmaceutycznych opisano w „Remington's Pharmaceutical Sciences E.W. Martina. Takie kompozycje będą zawierały terapeutycznie skuteczną ilość środka terapeutycznego, dogodnie w postaci oczyszczonej, razem z odpowiednią ilością nośnika, tak aby zapewnić postać do odpowiedniego podawania pacjentowi. Preparat powinien pasować do sposobu podawania.
Ilość kompozycji farmaceutycznej według wynalazku, która będzie skuteczna w leczeniu poszczególnych schorzeń lub stanów, będzie zależeć od charakteru schorzenia lub stanu i można ją określić standardowymi technikami klinicznymi. Oprócz tego można ewentualnie wykorzystać testy in vitro, pomocne w identyfikacji optymalnych zakresów dawkowania. Dokładna dawka do wykorzystania w preparacie będzie zależeć także od drogi podawania i ciężkości choroby lub schorzenia, i powinna być określona zgodnie z oceną lekarza oraz okolicznościami każdego pacjenta. Jednakże odpowiednie zakresy dawkowania do podawania, wynoszą generalnie około 104-5x106 pfu i można je podawać raz lub wiele razy, z przerwami tak częstymi jak potrzeba. Kompozycje farmaceutyczne według niniejszego wynalazku, zawierające 104-5x106 pfu zmutowanych wirusów o zmienionej aktywności antagonistycznej wobec IFN, można podawać donosowo, dotchawicznie, domięśniowo lub podskórnie. Skuteczne dawki można ekstrapolować z krzywych odpowiedzi na dawkę otrzymanych z układów testowych in vitro lub modelu zwierzęcego.
6. Przykład: Wytwarzanie i charakteryzacja mutantów o skróconym NS1 wirusa grypy typu A
6.1 Materiały i metody
Wirus grypy A/PR/8/34 (PR8) namnożono w 10-dniowych jajach kurzych z zarodkami w temperaturze 37°C. Wirus grypy A 25A-1, wirus reasortant, zawierający segment NS od przystosowanego do zimna szczepu A/Leningrad/134/47/57 i pozostałe geny z wirusa PR8 (Egorov i inni 1994, Vopr.Virusol. 39:201-205; Shaw i inni 1996, w Options of control of influenza III, wydawca Brown, Hampson Webster (Elsevier Science) strony 433-436) hodowano w komórkach Vero w temperaturze 34°C. Wirus 25A-1 jest wrażliwy na temperaturę w komórkach ssaków i użyto go jako wirusa pomocniczego do odzyskania transfektanta wirusa NS1/99. Komórki Vero i komórki MDCK utrzymywane w minimalnej pożywce podstawowej (MEM), zawierającej 1 μg/ml trypsyny (Difco Laboratories, Detroid, Michigan) użyto do hodowli wirusa grypy. Komórki Vero użyto także do selekcji, oczyszczania łysinek i mianowania wirusa NS1/99. Komórki MDCK utrzymywano w DMEM (minimalna pożywka podstawowa
Dulbecco), zawierającej 10% płodową surowicę cielęcą inaktywowaną ciepłem. Komórki Vero hodowano w pożywce AIM-V (Life Technologies, Grand Island, NY).
W następujący sposób skonstruowano plazmid pT3NS1/99, zawierający C-terminalnie skróconą 99 aminokwasową postać NS1. Po pierwsze, pUC19-T3/NS PR8, zawierający kompletny gen NS z wirusa PR8 oflankowany przez promotor polimerazy RNA T3 oraz miejsce restrykcyjne BpuAI, powielono przez odwrotną PCR (Ochman i inni, 1998, Genetics 120:621-623) stosując odpowiednie
PL 219 128 B1 startery. Otrzymany cDNA zawierający w ten sposób skrócony gen NS1 poddano fosforylacji, traktowano polimerazą Klenowa, poddano samoligacji i namnożono w szczepie TG1 E.coli. Konstrukcję otrzymaną po oczyszczeniu nazwano pT3NS1/99 i zweryfikowano przez sekwencjonowanie. Plazmidy ekspresyjne białek NP, PB1, PB2 i PA wirusa PR8 (pHMG-NP, pHMG-PB1, pHMG-PB2 i pHMG-PA) opisano wcześniej (Pleschka i inni, 1996, J. Virol. 70: 4188-4192). Wykonano pPOLI-NS-RB przez substytucję otwartej ramki odczytu CAT pPOLI-NS-RT (Pleschka i inni, 1996, J. Virol. 70: 4188-4192) wewnątrz produktu RT-PCR otrzymanego z regionu kodującego genu NS wirusa grypy A/WSN/33 (WSN). Plazmid ten wykazuje ekspresję specyficznych dla NS segmentów RNA wirusa WSN pod kontrolą skróconego ludzkiego promotora polimerazy I.
Wytworzenie wirusa NS1/99 przeprowadzono przez transfekcję rybonukleoproteiny (RNP) (Luythes i inni, 1989, Cell 59:1107-1113). RNP utworzono przez transkrypcję polimerazy RNA T3 z pT3NS1/99 linearyzowanego BpuAI w obecności oczyszczonej nukleoproteiny i polimerazy wirusa grypy 25A-1 (Enami i inni, 1991, J. Virol. 65:2711-2713). Kompleksy RNP transfekowano do komórek Vero, które wcześniej zakażono wirusem 25A-1. Transfekowane komórki inkubowano przez 18 godzin w temperaturze 37°C i supernatant pasażowano dwukrotnie w komórkach Vero w temperaturze 40°C i oczyszczono łysinki trzykrotnie w komórkach Vero pokrytych nadlewką agarową w temperaturze 37°C. Wyizolowany wirus NS1/99 analizowano przez RT-PCR stosując specyficzne startery. Wirus transfekcyjny dzikiego typu transfekowano plazmidami pHMG-NP, pHMG-PB1, pHMG-PB2, pHMG-PA i pPOLI-NS-RB, jak opisano wcześniej (Pleschka i inni, 1996, J. Virol. 70: 4188-4192). Dwa dni po transfekcji komórki zakażono 5x106 pfu wirusa delNS1 i inkubowano jeszcze dwa dni w temperaturze 37°C. Supernatant komórkowy pasażowano raz w komórkach MDCK i dwukrotnie w jajach kurzych z zarodkami. Wirusy transfekcyjne klonowano przez ograniczone rozcieńczania w jajach. Genomowy RNA z oczyszczonego wirusa transfekcyjnego NS1/99 analizowano przez elektroforezę w żelu poliakrylamidowym, jak opisano poprzednio (Zheng i inni, 1996, Virology, 217:242-251). Ekspresję skróconego białka NS1 przez wirus NS1/99 weryfikowano przez immunoprecypitację znakowanych zakażonych ekstraktów komórkowych, przy użyciu króliczych poliklonalnych surowic odpornościowych przeciwko NS1.
3
Jamę omoczniową jaja kurzego z zarodkami w wieku 6, 10 i 14 dni, zaszczepiono około 103 pfu wirusów PR8, NS1/99 lub delNS1 (z delecją całego genu NS1), inkubowano w temperaturze 37°C przez dwa dni i wirusy obecne w płynie omoczniowym mianowano przez test hemaglutynacji (HA).
Grupy 5 myszy BALB/c (Taconic Farms) zaszczepiono donosowo 5x106 pfu lub 5x103 pfu wirusa dzikiego typu A/PR/8/34 (PR8) lub NS1/99. Szczepienie przeprowadzono w znieczuleniu przy użyciu 50 μΐ MEM, zawierającej odpowiednią ilość jednostek tworzących łysinkę odpowiedniego wirusa. Zwierzęta monitorowano cały dzień i uśmiercono po zakończeniu obserwacji. W następnym doświadczeniu wszystkie myszy, które przeżyły, sprowokowano cztery tygodnie później dawką 100 LD50 wirusa PR8 dzikiego typu. Wszystkie procedury były zgodne z wytycznymi dotyczącymi opieki i używania zwierząt laboratoryjnych.
6.2 Wyniki: atenuacja wirusów grypy A przez delecje NS1
Twórcy wynalazku pokazali poprzednio, że wirus grypy A z delecją genu NS1 (wirus delNS1) jest zdolny do wzrostu do mian wynoszących około 107 pfu/ml w komórkach z niedoborem wytwarzania interferonu typu I (IFN), takich jak komórki Vero. Jednakże, wirus ten miał zaburzoną zdolność do replikacji i powodował chorobę u myszy (Garcia-Sastre i inni, 1998, Virology, 252:324). Dla kontrastu, wirus del NS1 był zdolny do wzrostu i zabijał myszy STAT1 -/-. Wyniki te pokazały, że białko NS1 wirusa grypy A jest czynnikiem wirulencji związanym z inhibicją odpowiedzi antywirusowych u gospodarza, za pośrednictwem IFN typu I. Przeprowadzono następujące doświadczenia w celu określenia, czy można wytworzyć wirusy grypy z cechami wirulencji pośredniej między wirusami typu dzikiego i delNS1 przez delecję części genu NS1, i czy niektóre z tych wirusów mogłyby posiadać optymalne cechy do stosowania jako żywe atenuowane szczepionki przeciw wirusom grypy, czyli stabilność i odpowiednią równowagę między atenuacją, immunogennością i wzrostem w substratach odpowiednich do wytwarzania szczepionek, takich jak jaja kurze z zarodkami.
W celu przetestowania tej hipotezy wytworzono wirusa grypy A/PR/8/34 (PR8), w którym zmodyfikowano gen NS1, w celu pokierowania ekspresją skróconego białka NS1, zawierającego tylko 99 aminokwasów przy końcu aminowym, wspólnie z 230 aminokwasami białka NS1 dzikiego typu. Wirus ten (NS1-99) otrzymano przez transfekcję RNP sztucznie skonstruowanego genu NS przy użyciu wirusa pomocniczego 25A-1, jak opisano poprzednio (Garcia-Sastre i inni, 1998, Virology,
PL 219 128 B1
252:324). Analiza ekspresji NS1 w komórkach zakażonych wirusem ujawniła skrócony charakter białka NS1 wirusa NS1-99.
Analizowano zdolność wirusów delNS1, NS1-99 i PR8 dzikiego typu, do wzrostu w jajach kurzych z zarodkami w różnym wieku. Przesłanki dla tego doświadczenia pochodzą z faktu, że zdolność zarodków kurzych do syntetyzowania i odpowiedzi na IFN typu I w warunkach odpowiedniego bodźca, jest zależna od wieku. W rzeczywistości, zarówno możliwość indukowania IFN jak i odpowiedź, zaczyna się w wieku około 10 dni, a potem wyraźnie rośnie z wiekiem (Sekellick i inni 1990, In Vitro Cell Dev. Biol. 26:997; Sekellick i inni 1985, J. Interferon Res. 5: 657). Zatem stosowanie jaj w różnym wieku stanowi unikalny system do testowania zdolności różnych wirusów do hamowania odpowiedzi 3
IFN. Jaja w wieku 6, 10 i 14 dni zaszczepiono około 10* 1 * 3 * pfu wirusów PR8, NS1-99 lub delNS1, inkubowano w temperaturze 37°C przez 2 dni i wirusy obecne w płynie omoczniowym mianowano przez test hemaglutynacji (HA). Jak ukazano w tabeli 3, podczas gdy wirus dzikiego typu rósł do podobnych mian HA w jajach z zarodkami 6, 10 i 14-dniowymi, delNS1 replikował do wykrywalnego miana HA tylko w jajach 6-dniowych. Dla kontrastu, wirus NS1-99 wykazywał zachowanie pośrednie między wirusami delNS1 i dzikiego typu, i był zdolny do wzrostu do mian HA podobnych do wirusa dzikiego typu w jajach 10-dniowych, lecz nie w jajach 14-dniowych.
T a b e l a 3. Replikacja wirusa w jajach kurzych zarodkami Miano hemaglutynacji1
Wirus Wiek jaj 6 dni 10 dni 14 dni
WT PR82 2,048 4,096 1.071
NS1/99 N.D.3 2,048 <2
delNS1 64 <2 <2
1 Miana reprezentują najwyższe rozcieńczenie z aktywnością hemaglutynacji 2 Wirus grypy A/PR/8/34 dzikiego typu 3 Nie określono.
Cechy atenuacji wirusa NS1-99 określono następnie u myszy. Do tego celu, grupy 5 myszy 6 5 3
BALB/c zakażono donosowo 5x106 pfu, 1,5x105 pfu lub 1,5x103 pfu wirusa PR8 dzikiego typu lub NS1-99. Następnie myszy monitorowano przez 3 tygodnie pod względem przeżycia. Wyniki podano w tabeli 4. Wirus NS1-99 miał LD50 co najmniej trzy logarytmy wyższe od wirusa dzikiego typu.
T a b e l a 4. Atenuacja wirusa NS1-99 u myszy Myszy, które przeżyły
Wirus Dawka zakażająca (pfu): 5x106 1,5x105 1,5x103
WT PR81 1/5 1/5 1/5
NS1-99 3/5 5/5 5/5 1Wirus grypy A/PR/8/34 dzikiego typu.
7. Przykład: Wytwarzanie i charakteryzacja mutantów wirusa grypy typu B o skróconym NS1
7.1. Materiały i metody
Szczegóły doświadczalne są podobne do tych z sekcji 6.1. Dwa zmutowane wirusy grypy B, B/610B5B/201 (B/201) oraz B/AWBY-234, o długości odpowiednio 127 aminokwasów i 90 aminokwasów (C-terminalne skrócone białka NS1) (Norton i inni, 1987 Virology 156:204; Tobita i inni 1990 Virology 174:314) otrzymano z doświadczeń koinfekcji w hodowli tkankowej, obejmującej wirusy B/Yamagata/1/73 (B/Yam) oraz A/Aichi/2/68, w obecności przeciwciała przeciwko wirusowi A (H3N2). Wzrost zmutowanych wirusów grypy w jajach z zarodkami w różnym wieku, porównano z wirusem rodzicielskim B/Yam, który posiada dzikiego typu białko NS1 o 281 aminokwasach. Jaja w wieku 6, 10 3 i 14 dni zaszczepiono około 103 pfu wirusów B/Yam, B/201 lub B/AWBY-234, inkubowano w temperaturze 35°C przez 2 dni i wirusy obecne w płynie omoczniowym mianowano przez test HA.
Dodatkowo określono cechy atenuacji wirusów B/201 i B/AWBY-234 u myszy. Grupy trzech 5 myszy BALB/c zakażono donosowo 3x105 pfu dzikiego typu B/Yam lub zmutowanymi wirusami B/201
PL 219 128 B1 i B/AWBY/234, i określono zdolność tych wirusów do replikacji, przez pomiar mian wirusów w płucach w 3 dniu po infekcji, ponieważ dzikiego typu B/Yam nie indukuje widocznych oznak choroby u myszy.
7.2 Wyniki
T a b e l a 5. Replikacja wirusa grypy typu B w jajach kurzych z zarodkami Miano hemaglutynacji1
Wirus Wiek jaj 6 dni 10 dni 14 dni
B/Yam 362 256 <2
B/201 32 <2 <2
B/AWBY-234 8 <2 <2
Wyniki wzrostu wirusów zmutowanych i dzikiego typu grypy typu B w jajach kurzych z zarodkami, ukazane w tabeli 5, pokazują, że jak w przypadku wirusów grypy A, karboksyterminalne skrócenie NS1 wirusa grypy B jest odpowiedzialne za niższe wydajności replikacji w starszych jajach kurzych z zarodkami, ze skuteczną odpowiedzią IFN. Wskazuje to, że NS1 wirusa grypy B jest także związany z inhibicją odpowiedzi IFN u gospodarza, oraz że delecje w genie NS1 wirusa grypy B powodują fenotyp atenuowany.
Wyniki z doświadczeń replikacji u myszy podano w tabeli 6. Miana wirusów B/201 i B/AWBY234 były około o trzy logarytmy niższe niż miana B/Yam, wskazując, że skrócenie domeny karboksyterminalnej NS1 wirusa grypy B odpowiada za fenotyp atenuowany u myszy.
T a b e l a 6. Replikacja wirusa grypy typu B w płucach myszy
Wirus Miana w płucu w 3 dniu po infekcji (pfu/płuco)
B/Yam 2x104 1x104 3x104
B/201 30 <10 60
B/AWBY-234 <10 40 <10
8. Zabezpieczenie przed infekcją wirusem grypy dzikiego typu u myszy immunizowanych wirusami grypy typu A i B z delecją w białkach NS1
W celu określenia, czy myszy immunizowane atenuowanymi wirusami grypy typu A i B, zawierającymi skrócone białka NS1, były zabezpieczone przed prowokacją odpowiednikami tych wirusów, ale dzikiego typu, przeprowadzono następujące doświadczenie. Myszy BALB/c immunizowano donosowo wirusem A/NS1-99 i trzy tygodnie później zakażono je 100 LD50 wirusa grypy A/PR/8/34 dzikiego typu. Immunizowane zwierzęta były zabezpieczone przed śmiercią, podczas gdy wszystkie kontrolne nietraktowane myszy padły po prowokacji (patrz tabela 7). W drugim doświadczeniu myszy
BALB/c immunizowano donosowo wirusami grypy typu B B/201 lub B/AWBY-234, wykazującymi eks5 presję skróconego białka NS1. Trzy tygodnie później myszy sprowokowano 3x105 pfu wirusa B/Yam/1/73 dzikiego typu. Ponieważ ten szczep wirusa grypy B nie indukuje objawów choroby u myszy, stopień zabezpieczenia określono przez pomiar mian wirusa w płucu w 3 dniu po prowokacji. Podczas gdy nietraktowane zwierzęta kontrolne miały miana około 104 pfu/płuco, nie wykryto wirusów w płucach zwierząt immunizowanych (patrz tabela 8). Stwierdzenia te sugerują, że wirusy grypy A jak również grypy B, zawierające zmodyfikowane geny SN1 były zdolne do indukcji odpowiedzi odpornościowej u myszy, które są w pełni zabezpieczone przed późniejszą prowokacją wirusem dzikiego typu.
T a b e l a 7. Przeżycie myszy immunizowanych wirusem grypy A/NS1-99 po prowokacji 100 LD50 wirusa grypy A/PR/8/34 dzikiego typu
Dawka immunizująca wirusa A/NS1-99 Liczba myszy, które przeżyły/Całość
5x106 pfu 3/3
1m5x105 pfu 4/4
PBS
0/5
PL 219 128 B1
T a b e l a 8. Miana w płucu u myszy immunizowanych 20 wirusami B/201 i B/AWBY-234 po prowokacji 3x105 pfu wirusa grypy B/Yamagata/73 dzikiego typu.
Dawka immunizująca Miana w płucu (pfu/płuco)
3x105 pfu B/201 <101, <101, <101, <101, <101,
3x105 pfu B/AWBY-234 <101, <101, <101, <101, <101,
PBS 2,5x104; 1x104; 1,7x104; 3x104; 5x104
9. Przykład: indukcja interferonu typu I w jajach z zarodkami zakażonymi wirusem delNS1
Następnie określono zdolność wirusa delNS1, wirusa grypy A bez genu NS1, do indukcji sekrecji IFN typu I w jajach kurzych z zarodkami. Do tego celu, grupy dwóch 10-dniowych jaj kurzych z za3 rodkami zakażono 5x103 pfu wirusów delNS1 i dzikiego typu PR8. Osiemnaście godzin po inkubacji w temperaturze 37°C zebrano płyn omoczniowy i dializowano przeciwko kwasowemu pH przez noc, aby inaktywować zakaźne wirusy. Po traktowaniu kwasowym pH, próbki dializowano przeciwko PBS i testowano pod względem aktywności IFN, przez określenie najwyższego rozcieńczenia z zabezpieczającą aktywnością przeciw infekcji VSV (około 200 pfu w komórkach CEF. Wyniki ukazane w tabeli 9 wskazują, że przy nieobecności NS1, wirusy grypy A są lepszymi induktorami IFN.
T a b e l a 9. Indukcja IFN w jajach
Wirus IFN (U/ml)
PR8 <16, <16
delNS1 400, 400
pusta <16, <16
10. Przykład: Aktywność antywirusowa wirusa delNS1
Eliminacja genu antagonizmu IFN (NS1) z wirusa grypy A może powodować zdolność tego wirusa do indukcji wysokich poziomów IFN. Jeśli ma to miejsce w tym przypadku, wirus delNS1 będzie „zakłócał” replikację wirusów wrażliwych na IFN. Aby przetestować tę możliwość, twórcy wynalazku prześledzili zdolność wirusa delNS1 do inhibicji replikacji wirusa grypy A/WSN/33 (WSN), powszechnie stosowanego szczepu laboratoryjnego wirusa grypy, w jajach. Jak widać na fig. 1, traktowanie tylko 2 pfu wirusa delNS1 spowodowało redukcję ostatecznych mian wirusa WSN w płynie omoczniowym o jeden logarytm. Oprócz tego, traktowanie 2x104 pfu wirusa delNS1 spowodowało praktycznie kompletne ograniczenie replikacji WSN w jajach. Wirus delNS1 był także zdolny do zakłócania replikacji w jajach innych szczepów wirusa grypy typu A (H1N1 i H3N2), wirusa grypy typu B oraz innych wirusów, takich jak wirus Sendai (fig. 2).
Zachęceni tymi wynikami, twórcy wynalazku określili następnie zdolność wirusa delNS1 do zakłócania replikacji wirusa grypy dzikiego typu u myszy. Mimo, że traktowanie IFN typu I hodowli tkankowej zapobiega replikacji in vitro wirusa grypy typu A, traktowanie myszy IFN nie jest w stanie zahamować replikacji wirusów grypy (Haller 1981, Current Top Microbiol Immunol 92:25052). Jest to prawda dla większości wsobnych szczepów myszy, z wyjątkiem myszy A2G. Myszy A2G, jak również znaczny udział dzikich myszy (około 75%), zawierały co najmniej jeden nieuszkodzony allel Mx1, podczas gdy większość szczepów laboratoryjnych było Mx1-/- (Haller, 1986 Current Top Microbiol Immunol 127:331-337). Białko Mx1, które jest homologiem ludzkiego białka MxA (Aebi 1989, Mol.Cell.Biol. 11:5062) jest silnym inhibitorem replikacji wirusa grypy (Haller 1980, Nature, 283:660). Białko to nie ulega konstytutywnej ekspresji, lecz jego ekspresja jest indukowana transkrypcyjnie przez IFN typu I. Tak więc, myszy A2G można użyć do testowania zdolności induktorów IFN do stymulacji odpowiedzi antywirusowej przeciwko wirusom grypy A (Haller, 1981, Current Top Microbiol Immunol 92:25052).
Twórcy wynalazku zakazili donosowo osiem 4-tygodniowych myszy A2G 5x106 pfu wysoko patogennego izolatu wirusowego A/PR/8/34 (Haller, 1981, Current Top Microbiol Immunol 92:25052). Połowa myszy otrzymała donosowe leczenie 5x106 pfu delNS1 24 godziny przed zakażeniem PR8. Inne cztery myszy były traktowane PBS. Monitorowano zmiany masy ciała i przeżycie. Wyniki te pokazują, że traktowanie delNS1 umożliwiło zabezpieczenie myszy A2G przed śmiercią indukowaną wirusem grypy i utratą masy ciała. Takie samo traktowanie było nieskuteczne u myszy Mx1-/- wskazując, że w mechanizmie zabezpieczenia przed wirusem pośredniczył Mx1, czyli IFN.
PL 219 128 B1
11. Przykład: Właściwości przeciwnowotworowe wirusa delNS1 u myszy
Ponieważ IFN typu I i/lub induktory IFN typu I okazały się posiadać aktywność przeciwnowotworową (Belardelli i Gresser, 1996, Immunology Today 17: 369-372; Qin i inni, 1998, Proc.Natl.Acad.Sci. 95: 14411-14416) jest prawdopodobne, że traktowanie nowotworów wirusem delNS1 mogłoby pośredniczyć w regresji nowotworu. Alternatywnie, wirus delNS1 mógłby mieć właściwości onkolityczne, czyli mógłby być zdolny do specyficznego wzrostu i zabijania komórek nowotworowych, z których o wielu wiadomo, że posiadają niedobory układu IFN. Aby przetestować aktywność przeciwnowotworową wirusa delNS1, przeprowadzono następujące doświadczenie, przy użyciu mysiej linii komórkowej mięsaka CT26.WT w mysim nowotworowym modelu przerzutowania do płuc (Restifo i inni, 1998 Viro5 logy 249:89-97). 5x105 komórek CT26.WT wstrzyknięto dożylnie dwunastu 6-tygodniowym myszom
BALB/c. Połowę z tych myszy traktowano donosowo 106 pfu wirusa delNS1 co 24 godziny w dniach 1, 2 i 3 po zaszczepieniu. Dwanaście dni po wstrzyknięciu guza nowotworowego myszy uśmiercono i obliczono przerzuty płucne. Jak ukazano w tabeli 10, traktowanie delNS1 spowodowało istotną regresję przerzutów do płucnych u myszy.
T a b e l a 10. Aktywność przeciwnowotworowa wirusa delNS1 u myszy BALB/c, którym wstrzyknięto komórki nowotworowe CT2 6.WT.
Liczba przerzutów płucnych
Traktowanych PBS Traktowanych delNS1
Mysz 1 >250 120
Mysz 2 >250 28
Mysz 3 >250 9
Mysz 4 >250 6
Mysz 5 >250 2
Mysz 6 >250 1
12. Przykład: Białko NS1 hamuje translokację IFR-3 podczas infekcji wirusem grypy
Wyniki tu opisane sugerują, że białko NS1 wirusa grypy jest odpowiedzialne za inhibicję odpowiedzi IFN typu I przeciwko wirusowi, oraz że mutacje/delecje w tym białku powodują atenuację wirusów w związku ze wzmocnieniem odpowiedzi IFN typu I podczas infekcji. Wiadomo, że synteza IFN typu I podczas infekcji wirusowej może być stymulowana przez dwuniciowy RNA (dsRNA). IRF-3 jest czynnikiem transkrypcyjnym, który zazwyczaj znajduje się w formie nieaktywnej w cytoplazmie komórek ssaków. Dwuniciowy RNA indukuje fosforylację (aktywację) czynnika transkrypcyjnego IRF-3 powodując jego translokację do jądra, gdzie indukuje transkrypcję specyficznych genów, w tym genów kodujących IFN typu I (Weaver i inni, 1998, Mol.Cell.Biol. 18:1359). Aby określić czy NS1 grypy działa na IRF-3, monitorowano lokalizację IRF-3 w komórkach CV1 zakażonych dzikiego typu PR8 lub wirusem grypy A delNS1. Fig. 3 ukazuje, że translokacja IRF-3 jest minimalna w komórkach zakażonych PR8 (w ponad 10% komórek). Przeciwnie, około 90% komórek zakażonych delNS1 wykazywało lokalizację jądrową IRF-3.
Co zastanawiające, możliwa była częściowa inhibicja translokacji IRF-3 w komórkach zakażonych delNS1, przez ekspresję NS1 z plazmidu w układzie trans. Wyniki pokazują, że NS1 wirusa grypy typu A jest zdolny do inhibicji translokacji IRF-3 w komórkach zakażonych wirusem. Prawdopodobnie wirus grypy NS1 zapobiega aktywacji za pośrednictwem dsRNA IRF-3 przez sekwestrację dsRNA podczas infekcji wirusowej, powodując w ten sposób inhibicję syntezy IFN.
Niniejszy wynalazek nie powinien być ograniczony w zakresie przez opisane specyficzne postacie realizacji, które w zamierzeniu są pojedynczymi ilustracjami poszczególnych aspektów wynalazku i każda konstrukcja lub wirusy, które są funkcjonalnie równoważne, wchodzą w zakres tego wynalazku. Oczywiście, różne modyfikacje wynalazku oprócz tych ukazanych i tu opisanych, staną się widoczne dla fachowca z powyższego opisu i załączonych rysunków. Takie modyfikacje w zamierzeniu wchodzą w zakres załączonych zastrzeżeń.

Claims (26)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Genetycznie zmodyfikowany, atenuowany, chimerowy wirus grypy, znamienny tym, że jego genom zawiera segment genu wirusa grypy kodujący sekwencję heterologiczną i który zawiera skrócone białko NS1 o pomiędzy 90 a 130 resztach aminokwasowych z pierwszych 90 do 130 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1, i przy czym genetycznie zmodyfikowany wirus grypy ma zaburzony fenotyp antagonistyczny wobec interferonu.
  2. 2. Genetycznie zmodyfikowany, atenuowany, chimerowy wirus grypy, znamienny tym, że jego genom zawiera segment genu wirusa grypy kodujący sekwencję heterologiczną i który zawiera:
    a. skrócone białko NS1 o pomiędzy 60 a 70 resztach aminokwasowych z pierwszych 60 do 70 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1;
    b. skrócone białko NS1 o pomiędzy 70 a 80 resztach aminokwasowych z pierwszych 70 do 80 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1;
    c. skrócone białko NS1 o pomiędzy 90 a 100 resztach aminokwasowych z pierwszych 90 do 100 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1;
    d. skrócone białko NS1 o pomiędzy 100 a 110 resztach aminokwasowych z pierwszych 100 do 110 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1;
    e. skrócone białko NS1 o pomiędzy 110 a 120 resztach aminokwasowych z pierwszych 110 do 120 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1; lub
    f. skrócone białko NS1 o pomiędzy 120 a 130 resztach aminokwasowych z pierwszych 120 do 130 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1, i przy czym genetycznie zmodyfikowany wirus grypy ma zaburzony fenotyp antagonistyczny wobec interferonu.
  3. 3. Genetycznie zmodyfikowany, atenuowany, chimerowy wirus grypy, znamienny tym, że jego genom zawiera segment genu wirusa grypy kodujący sekwencję heterologiczną i który zawiera skrócone białko NS1 o pomiędzy 90 a 130 resztach aminokwasowych z pierwszych 90 do 130 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1.
  4. 4. Genetycznie zmodyfikowany, atenuowany, chimerowy wirus grypy, znamienny tym, że jego genom zawiera segment genu wirusa grypy kodujący sekwencję heterologiczną i który zawiera:
    a. skrócone białko NS1 o pomiędzy 60 a 70 resztach aminokwasowych z pierwszych 60 do 70 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1;
    b. skrócone białko NS1 o pomiędzy 70 a 80 resztach aminokwasowych z pierwszych 70 do 80 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1;
    c. skrócone białko NS1 o pomiędzy 90 a 100 resztach aminokwasowych z pierwszych 90 do 100 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1;
    d. skrócone białko NS1 o pomiędzy 100 a 110 resztach aminokwasowych z pierwszych 100 do 110 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1;
    e. skrócone białko NS1 o pomiędzy 110 a 120 resztach aminokwasowych z pierwszych 110 do 120 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1; lub
    f. skrócone białko NS1 o pomiędzy 120 a 130 resztach aminokwasowych z pierwszych 120 do 130 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1.
    PL 219 128 B1
  5. 5. Genetycznie zmodyfikowany, atenuowany, chimerowy wirus według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że sekwencję heterologiczną stanowi antygen wariantu szczepu wirusa grypy.
  6. 6. Genetycznie zmodyfikowany, atenuowany, chimerowy wirus według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, znamienny tym, że stosowanym segmentem genu wirusa grypy jest segment genu hemaglutyniny lub neuraminidazy.
  7. 7. Genetycznie zmodyfikowany, atenuowany, chimerowy wirus grypy, znamienny tym, że jego genom zawiera sekwencję heterologiczną, która koduje segment genu wirusa grypy, i który zawiera skrócone białko NS1 o pomiędzy 90 a 130 resztach aminokwasowych z pierwszych 90 do 130 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1, i przy czym genetycznie zmodyfikowany wirus grypy ma zaburzony fenotyp antagonistyczny wobec interferonu.
  8. 8. Genetycznie zmodyfikowany, atenuowany, chimerowy wirus grypy, znamienny tym, że jego genom sekwencję heterologiczną, która koduje segment genu wirusa grypy, i który zawiera:
    a. skrócone białko NS1 o pomiędzy 60 a 70 resztach aminokwasowych z pierwszych 60 do 70 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1;
    b. skrócone białko NS1 o pomiędzy 70 a 80 resztach aminokwasowych z pierwszych 70 do 80 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1;
    c. skrócone białko NS1 o pomiędzy 90 a 100 resztach aminokwasowych z pierwszych 90 do 100 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1;
    d. skrócone białko NS1 o pomiędzy 100 a 110 resztach aminokwasowych z pierwszych 100 do 110 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1;
    e. skrócone białko NS1 o pomiędzy 110 a 120 resztach aminokwasowych z pierwszych 110 do 120 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1; lub
    f. skrócone białko NS1 o pomiędzy 120 a 130 resztach aminokwasowych z pierwszych 120 do 130 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1, i przy czym genetycznie zmodyfikowany wirus grypy ma zaburzony fenotyp antagonistyczny wobec interferonu.
  9. 9. Genetycznie zmodyfikowany, atenuowany, chimerowy wirus według zastrz. 7 albo 8, znamienny tym, że sekwencja heterologiczna, która koduje segment genu wirusa grypy, koduje jest segment genu hemaglutyniny lub neuraminidazy.
  10. 10. Genetycznie zmodyfikowany, atenuowany, chimerowy wirus grypy według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, albo 9, znamienny tym, że genom koduje skrócone białko NS1 o pomiędzy 120 a 130 resztach aminokwasowych z pierwszych 120 do 130 N-końcowych reszt aminokwasowych białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1.
  11. 11. Genetycznie zmodyfikowany, atenuowany, chimerowy wirus grypy według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, albo 9, znamienny tym, że genom koduje:
    a. skrócone białko NS1 o resztach aminokwasowych 1 do 60 białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1;
    b. skrócone białko NS1 o resztach aminokwasowych 1 do 70 białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1;
    c. skrócone białko NS1 o resztach aminokwasowych 1 do 89 białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1;
    d. skrócone białko NS1 o resztach aminokwasowych 1 do 90 białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1;
    e. skrócone białko NS1 o resztach aminokwasowych 1 do 99 białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1; lub
    f. skrócone białko NS1 o resztach aminokwasowych 1 do 100 białka NS1 szczepu wirusa grypy, przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1,
    PL 219 128 B1
    g. skrócone białko NS1 o resztach aminokwasowych 1 do 110 białka NS1 szczepu wirusa grypy przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1,
    h. skrócone białko NS1 o resztach aminokwasowych 1 do 120 białka NS1 szczepu wirusa grypy przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1, lub
    i. skrócone białko NS1 o resztach aminokwasowych 1 do 130 białka NS1 szczepu wirusa grypy przy czym N-końcowa reszta aminokwasowa białka NS1 szczepu wirusa grypy to 1.
  12. 12. Genetycznie zmodyfikowany, atenuowany, chimerowy wirus grypy według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, albo 9, albo 10, albo 11, znamienny tym, że atenuowanego wirusa grypy stanowi wirus grypy typu A.
  13. 13. Genetycznie zmodyfikowany, atenuowany, chimerowy wirus grypy według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, albo 9, albo 10, albo 11, znamienny tym, że atenuowanego wirusa grypy stanowi wirus grypy typu B.
  14. 14. Preparat szczepionki, znamienny tym, że zawiera genetycznie zmodyfikowanego atenuowanegochimerowego wirusa grypy określonego w jednym z zastrz. 1 do 13 i odpowiednią zaróbkę.
  15. 15. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera genetycznie zmodyfikowanego atenuowanego chimerowego wirusa grypy określonego w jednym z zastrz. 1 do 13 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
  16. 16. Preparat szczepionki jak określono w zastrz. 14 do zastosowania w profilaktyce choroby wirusowej wywołanej zakażeniem wirusem grypy u podmiotu.
  17. 17. Preparat szczepionki według zastrz. 16, znamienny tym, że podmiotem jest człowiek.
  18. 18. Kompozycja farmaceutyczna jak zdefiniowano w zastrz. 15 do zastosowania w profilaktyce lub leczeniu choroby zakaźnej u podmiotu.
  19. 19. Kompozycja farmaceutyczna jak zdefiniowano w zastrz. 15 do zastosowania w indukcji odpowiedzi immunologicznej u podmiotu.
  20. 20. Kompozycja farmaceutyczna jak zdefiniowano w zastrz. 15 do zastosowania w leczeniu lub profilaktyce tworzenia guzów nowotworowych u podmiotu.
  21. 21. Zastosowanie genetycznie zmodyfikowanego atenuowanego chimerowego wirusa grypy jak określono w jednym z zastrz. 1 do 13 do wytwarzania leku do zastosowania w profilaktyce lub leczeniu choroby zakaźnej u podmiotu.
  22. 22. Zastosowanie genetycznie zmodyfikowanego atenuowanego chimerowego wirusa grypy jak określono w jednym z zastrz. 1 do 13 do wytwarzania leku do zastosowania w indukowaniu odpowiedzi immunologicznej u podmiotu.
  23. 23. Zastosowanie genetycznie zmodyfikowanego atenuowanego chimerowego wirusa grypy jak określono w jednym z zastrz. 1 do 13 do wytwarzania leku do zastosowania w profilaktyce tworzenia guza nowotworowego u podmiotu lub leczenia guzów nowotworowych u podmiotu.
  24. 24. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 18, albo zastosowanie według zastrz. 21, znamienne tym, że chorobą zakaźną jest choroba wirusowa.
  25. 25. Kompozycja farmaceutyczna albo zastosowanie według zastrz. 24, znamienne tym, że choroba wirusowa wywołana jest zakażeniem wirusem grypy.
  26. 26. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 18 albo 19, albo 20, albo zastosowanie według zastrz. 22 albo 23, albo 24, znamienne tym, że podmiotem jest człowiek.
PL398576A 1998-06-12 1999-06-11 Genetycznie zmodyfikowane atenuowane chimerowe wirusy grypy, preparat szczepionki, kompozycja farmaceutyczna, kompozycja farmaceutyczna do zastosowania oraz zastosowania takich wirusów PL219128B1 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8910398P 1998-06-12 1998-06-12
US10883298P 1998-11-18 1998-11-18
US11768399P 1999-01-29 1999-01-29

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL398576A1 PL398576A1 (pl) 2012-10-08
PL219128B1 true PL219128B1 (pl) 2015-03-31

Family

ID=27376229

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL386473A PL212316B1 (pl) 1998-06-12 1999-06-11 Zastosowania preparatów szczepionek, zastosowania preparatów farmaceutycznych oraz sposoby wytwarzania szczepionek
PL346212A PL200977B1 (pl) 1998-06-12 1999-06-11 Atenuowany wirus grypy, genetycznie zmodyfikowany atenuowany wirus grypy, kompozycje szczepionek i kompozycje farmaceutyczne
PL398576A PL219128B1 (pl) 1998-06-12 1999-06-11 Genetycznie zmodyfikowane atenuowane chimerowe wirusy grypy, preparat szczepionki, kompozycja farmaceutyczna, kompozycja farmaceutyczna do zastosowania oraz zastosowania takich wirusów

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL386473A PL212316B1 (pl) 1998-06-12 1999-06-11 Zastosowania preparatów szczepionek, zastosowania preparatów farmaceutycznych oraz sposoby wytwarzania szczepionek
PL346212A PL200977B1 (pl) 1998-06-12 1999-06-11 Atenuowany wirus grypy, genetycznie zmodyfikowany atenuowany wirus grypy, kompozycje szczepionek i kompozycje farmaceutyczne

Country Status (24)

Country Link
US (12) US6669943B1 (pl)
EP (4) EP2316923B1 (pl)
JP (7) JP4837827B2 (pl)
KR (2) KR20060080249A (pl)
CN (1) CN1312725A (pl)
AT (1) ATE351901T1 (pl)
AU (2) AU771110B2 (pl)
BR (1) BR9911163A (pl)
CA (2) CA2334850C (pl)
CY (1) CY1113689T1 (pl)
CZ (2) CZ302601B6 (pl)
DE (1) DE69934885T2 (pl)
DK (4) DK2316923T3 (pl)
ES (4) ES2281177T3 (pl)
HU (1) HUP0102441A3 (pl)
IL (6) IL140264A0 (pl)
MX (2) MXPA00012403A (pl)
NO (1) NO20006328L (pl)
NZ (2) NZ509055A (pl)
PL (3) PL212316B1 (pl)
PT (1) PT1085904E (pl)
RU (1) RU2236252C2 (pl)
SK (3) SK288567B6 (pl)
WO (2) WO1999064068A1 (pl)

Families Citing this family (77)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030044384A1 (en) 1997-10-09 2003-03-06 Pro-Virus, Inc. Treatment of neoplasms with viruses
US7470426B1 (en) 1997-10-09 2008-12-30 Wellstat Biologics Corporation Treatment of neoplasms with viruses
US7780962B2 (en) 1997-10-09 2010-08-24 Wellstat Biologics Corporation Treatment of neoplasms with RNA viruses
PL212316B1 (pl) * 1998-06-12 2012-09-28 Sinai School Medicine Zastosowania preparatów szczepionek, zastosowania preparatów farmaceutycznych oraz sposoby wytwarzania szczepionek
EP1390046A4 (en) * 1999-04-15 2005-04-20 Wellstat Biologics Corp TREATMENT OF NEOPLASMS WITH VIRUSES
ES2260057T3 (es) 1999-09-17 2006-11-01 Wellstat Biologics Corporation Virus oncolitico.
US8147822B1 (en) 1999-09-17 2012-04-03 Wellstat Biologics Corporation Oncolytic virus
AU2001250352B2 (en) * 2000-03-02 2006-01-12 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung Gmbh Recombinant influenza a viruses
AU2001257001A1 (en) 2000-04-10 2001-10-23 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Screening methods for identifying viral proteins with interferon antagonizing functions and potential antiviral agents
DE10020505A1 (de) * 2000-04-26 2001-10-31 Conzelmann Karl Klaus RSV NS Proteine antagonisieren die Interferon (IFN) Antwort
KR20030061810A (ko) * 2000-09-25 2003-07-22 폴리문 사이언티픽 임무노이비오로기쉐 포르슝 게엠베하 생균 백신과 제조 방법
ES2522526T3 (es) 2001-02-14 2014-11-14 Anthrogenesis Corporation Placenta post-parto de mamíferos, su uso y células troncales placentarias de la misma
WO2002094423A1 (en) 2001-05-22 2002-11-28 Access Business Group International Llc Method and apparatus for blending and dispensing liquid compositions
US7282599B2 (en) 2001-07-16 2007-10-16 Avir Green Hills Biotechnology Research Devlopment Trade Ag Dithiocarbamate antiviral agents and methods of using same
US7037707B2 (en) * 2003-09-04 2006-05-02 St. Jude Children's Research Hospital Method for generating influenza viruses and vaccines
ES2694123T3 (es) 2004-06-01 2018-12-18 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Virus de la gripe porcina modificado por ingeniería genética y usos de los mismos
WO2006088481A2 (en) * 2005-02-15 2006-08-24 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Genetically engineered equine influenza virus and uses thereof
AT502275B8 (de) * 2005-08-08 2007-08-15 Greenhills Biotechnology Res D Immunantwort-induzierende zusammensetzungen
PL2251034T3 (pl) * 2005-12-02 2018-07-31 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Chimeryczne wirusy prezentujące nienatywne białka powierzchniowe i zastosowania tych wirusów
EP1911836A1 (en) 2006-10-12 2008-04-16 AVIR Green Hills Biotechnology Trading GmbH Medium supplement for virus production
US7860646B2 (en) * 2007-04-16 2010-12-28 The Boeing Company Method and apparatus for routing ocean going vessels to avoid treacherous environments
WO2008144067A1 (en) * 2007-05-21 2008-11-27 Board Of Regents, University Of Texas System Methods and compositions for treatment of cancer using oncolytic rsv activity
EP2045323A1 (en) * 2007-10-05 2009-04-08 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Linear expression constructs for production of influenza virus particles
EP2048237A1 (en) 2007-10-05 2009-04-15 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Replication deficient Influenza virus for the expression of heterologous sequences
EP2072058A1 (en) 2007-12-21 2009-06-24 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Modified influenza virus
US8108138B2 (en) * 2008-10-02 2012-01-31 The Boeing Company Optimal vehicle router with energy management system
WO2010060921A1 (en) 2008-11-25 2010-06-03 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag METHOD FOR PRODUCTION OF pH STABLE ENVELOPED VIRUSES
EP2233568A1 (en) 2009-03-19 2010-09-29 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade AG Novel method for generation of RNA virus
EP2376628B1 (en) 2008-12-16 2018-05-16 Ology Bioservices, Inc. Production of influenza vaccines
EP2233152A1 (en) 2009-03-24 2010-09-29 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag High growth reassortant influenza A virus
US8935174B2 (en) * 2009-01-16 2015-01-13 The Boeing Company Analyzing voyage efficiencies
WO2010091262A1 (en) 2009-02-05 2010-08-12 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Chimeric newcastle disease viruses and uses thereof
EP2413962A1 (en) 2009-03-30 2012-02-08 Mount Sinai School of Medicine Influenza virus vaccines and uses thereof
USH2283H1 (en) 2009-04-27 2013-09-03 Novartis Ag Vaccines for protecting against influenza
WO2010144797A2 (en) 2009-06-12 2010-12-16 Vaccine Technologies, Incorporated Influenza vaccines with enhanced immunogenicity and uses thereof
JP2012531929A (ja) * 2009-07-06 2012-12-13 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド バイオプロセシング
IN2012DN00729A (pl) 2009-07-22 2015-06-19 Avir Green Hills Biotechnology
WO2011014504A1 (en) 2009-07-27 2011-02-03 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Recombinant influenza virus vectors and uses thereof
US8828406B2 (en) 2009-07-30 2014-09-09 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza viruses and uses thereof
KR20120039047A (ko) 2009-07-31 2012-04-24 노파르티스 아게 역유전학 시스템
EP2295543A1 (en) * 2009-09-11 2011-03-16 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Method for the preparation of an influenza virus
CA2792537A1 (en) 2010-03-30 2011-10-06 Mount Sinai School Of Medicine Influenza virus vaccines and uses thereof
US8597637B1 (en) 2010-05-18 2013-12-03 Weidong Zhang Breast cancer therapy using an engineered respiratory syncytial virus
EP2576773A2 (en) * 2010-06-02 2013-04-10 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade AG Methods and helper viruses for the generation of rna virus
US9044499B1 (en) 2010-06-22 2015-06-02 Weidong Zhang NS1/2-deficient respiratory syncytial virus and melanoma treatment
US8377901B2 (en) * 2010-07-07 2013-02-19 The University Of Manitoba Target host factors for treating viral infection
CN102021149B (zh) * 2010-07-27 2013-04-24 张卫东 基因ns1缺陷型呼吸道合胞病毒及其治疗肺癌的应用
CN102021148A (zh) * 2010-07-27 2011-04-20 张卫东 一种基因ns1缺陷型呼吸道合胞病毒及其应用
EP2758075B1 (en) 2011-09-20 2023-05-03 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Influenza virus vaccines and uses thereof
US9157746B2 (en) 2011-11-16 2015-10-13 The Boeing Company Vessel routing system
JP2016508133A (ja) 2012-12-18 2016-03-17 アイカーン スクール オブ メディシン アット マウント サイナイ インフルエンザウイルスワクチン及びその使用
CN103330723A (zh) * 2013-01-14 2013-10-02 艾克星（武汉）生物医药科技有限公司 基因工程呼吸道合胞病毒（△ns1 rsv)在治疗癌症药物中的用途
BR112015021414B1 (pt) 2013-03-14 2020-11-10 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai vírus da doença newcastle e seus usos
US9908930B2 (en) 2013-03-14 2018-03-06 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Antibodies against influenza virus hemagglutinin and uses thereof
SG11201607130RA (en) 2014-02-27 2016-09-29 Viralytics Ltd Combination method for treatment of cancer
JP2018504412A (ja) 2015-01-23 2018-02-15 アイカーン スクール オブ メディシン アット マウント サイナイ インフルエンザウイルスワクチン接種レジメン
CN107250353B (zh) 2015-02-26 2021-07-23 勃林格殷格翰动物保健有限公司 二价猪流感病毒疫苗
US10947512B2 (en) 2015-08-14 2021-03-16 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Respiratory syncytial virus having altered NS1 protein function and related materials and methods
RU2628690C2 (ru) * 2015-11-06 2017-08-21 Общество С Ограниченной Ответственностью 'Фарминтерпрайсез' Аттенуированные гриппозные векторы для профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний, а также для лечения онкологических заболеваний
RU2660562C2 (ru) * 2016-03-30 2018-07-06 Общество с ограниченной ответственностью "ФАРМИНТЕРПРАЙСЕЗ БИОТЕХ" Аттенуированный гриппозный вектор и мукозальная универсальная гриппозная вакцина на его основе
EA037571B1 (ru) * 2015-11-06 2021-04-15 Общество с ограниченной ответственностью "ФАРМИНТЕРПРАЙСЕЗ БИОТЕХ" Аттенуированный вирус гриппа а, аттенуированный грипозный вектор, фармацевтическая композиция и их применение для профилактики или лечения инфекционных заболеваний, а также для лечения онкологических заболеваний
CA3005980A1 (en) 2015-11-24 2017-06-01 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Production of viruses in avian eggs
CN108603188A (zh) 2015-11-24 2018-09-28 联邦科学技术研究组织 在细胞培养物中产生病毒
EP3471767A4 (en) 2016-06-15 2020-01-15 Icahn School of Medicine at Mount Sinai INFLUENZA VIRUS HEMAGGLUTININS AND USES THEREOF
WO2018115308A1 (en) 2016-12-22 2018-06-28 Blue Sky Vaccines Gmbh Method for purifying virus
EP3596202A4 (en) 2017-03-14 2021-01-27 The Regents of the University of California GENOME-WIDE IDENTIFICATION OF IMMUNEVASIONAL FUNCTIONS IN A VIRUS
EP3606555A4 (en) 2017-04-07 2021-08-04 Icahn School of Medicine at Mount Sinai INFLUENZA VIRUS TYPE B ANTI-NEURAMINIDASE ANTIBODIES AND THEIR USES
JOP20190256A1 (ar) 2017-05-12 2019-10-28 Icahn School Med Mount Sinai فيروسات داء نيوكاسل واستخداماتها
US11339377B2 (en) 2017-11-08 2022-05-24 Bluesky Immunotherapies Gmbh SO3 chromatography for use in a method for virus purification
US20220160863A1 (en) 2019-01-24 2022-05-26 Blue Sky Vaccines Gmbh High growth influenza virus
WO2020163768A1 (en) * 2019-02-07 2020-08-13 Duke University Stabilized 9 and 10 segmented influenza viruses as a vaccine platform and methods of making and using same
KR102370100B1 (ko) * 2019-02-15 2022-03-07 아이디바이오 주식회사 이종 인플루엔자 a 바이러스에 대한 면역/치료반응을 형성하는 신규한 재조합 인플루엔자 바이러스 및 이를 포함하는 유전자 전달체 및 치료백신
JP7222552B2 (ja) * 2020-01-30 2023-02-15 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 豚デルタコロナウイルスの増殖方法
WO2022112595A1 (en) * 2020-11-30 2022-06-02 Bluesky Immunotherapies Gmbh Novel replication deficient influenza a virus inducing high levels of type i interferon
WO2022125789A1 (en) * 2020-12-09 2022-06-16 Yale University Compositions and methods for treating, ameliorating, and/or preventing viral infections
EP4351623A1 (en) 2021-06-09 2024-04-17 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Gene combination as a broad spectrum antiviral
CN115896035B (zh) * 2022-12-22 2024-04-16 苏州沃美生物有限公司 一种应用于病毒扩增的Vero细胞株、其构建方法及应用

Family Cites Families (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4071618A (en) * 1974-09-03 1978-01-31 Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University Process for preparing virus disease live vaccines
US4215051A (en) 1979-08-29 1980-07-29 Standard Oil Company (Indiana) Formation, purification and recovery of phthalic anhydride
JPS57136528A (en) 1981-02-09 1982-08-23 Hayashibara Biochem Lab Inc Preparation of viral vaccine
US4873191A (en) 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
US4769330A (en) 1981-12-24 1988-09-06 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus and methods for making and using the same
JPS5939831A (ja) 1982-08-27 1984-03-05 Biseibutsu Kagaku Kenkyusho:Kk 豚用インフルエンザウイルス不活化ワクチン
US5106619A (en) * 1983-12-20 1992-04-21 Diamond Scientific Co. Preparation of inactivated viral vaccines
US4693981A (en) * 1983-12-20 1987-09-15 Advanced Genetics Research Institute Preparation of inactivated viral vaccines
JPS60202827A (ja) * 1984-03-28 1985-10-14 Chibaken 弱毒痘そうワクチン株
US5786199A (en) 1989-08-28 1998-07-28 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand RNA virus expression systems and vaccines
US5854037A (en) 1989-08-28 1998-12-29 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand RNA virus expression systems and vaccines
US5840520A (en) * 1989-08-28 1998-11-24 Aviron Recombinant negative strand RNA virus expression systems
US5166057A (en) * 1989-08-28 1992-11-24 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand rna virus expression-systems
US5766601A (en) 1990-08-08 1998-06-16 University Of Massachusetts Medical Center Cross-reactive influenza a immunization
ES2112335T3 (es) 1991-10-07 1998-04-01 Biogen Inc Procedimiento profilactico o terapeutico de enfermedades de la piel causadas por celulas que presentan antigenos por medio de inhibidores de la interaccion entre cd2 y lfa-3.
US6162432A (en) * 1991-10-07 2000-12-19 Biogen, Inc. Method of prophylaxis or treatment of antigen presenting cell driven skin conditions using inhibitors of the CD2/LFA-3 interaction
ES2053413T3 (es) 1992-05-14 1997-11-16 Polymun Scient Immunbio Forsch Peptidos que inducen anticuerpos que neutralizan aislados de vih-1 geneticamente divergentes.
US7344722B1 (en) 1993-06-29 2008-03-18 The Regents Of The University Of Michigan Cold-adapted influenza virus
ES2210273T5 (es) 1994-07-18 2010-03-29 Conzelmann, Karl-Klaus, Prof. Dr. Virus con arn de cadena negativa no segmentado recombinante infeccioso.
US6300090B1 (en) 1994-07-29 2001-10-09 The Rockefeller University Methods of use of viral vectors to deliver antigen to dendritic cells
US6146873A (en) 1994-11-10 2000-11-14 Baxter Aktiengesellschaft Production of orthomyxoviruses in monkey kidney cells using protein-free media
US7153510B1 (en) 1995-05-04 2006-12-26 Yale University Recombinant vesiculoviruses and their uses
DE69510207T3 (de) 1995-08-09 2007-02-15 Schweiz. Serum- & Impfinstitut Bern Verfahren zur Herstellung von infektiösen minussträngigen RNA-Viren
US5840565A (en) * 1995-08-22 1998-11-24 The Regents Of The University Of California Methods for enhancing the production of viral vaccines in PKR-deficient cell culture
AU727923B2 (en) 1995-09-27 2001-01-04 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Production of infectious respiratory syncytial virus from cloned nucleotide sequences
GB9605808D0 (en) * 1996-03-20 1996-05-22 Isis Innovation CFTR gene regulator
BRPI9710363B8 (pt) 1996-07-15 2021-07-06 Us Gov Health & Human Serv partìcula de vìrus sincicial respirátorio recombinante (rsv) infeccioso atenuado, vacina para induzir proteção contra o vìrus sincicial respiratório recombinante (rsv), vetor de expressão, e, método de produção de um vìrus sincicial respiratório recombinante (rsv) infeccioso.
AU4427897A (en) 1996-09-27 1998-04-17 American Cyanamid Company 3' genomic promoter region and polymerase gene mutations responsible for att enuation in viruses of the order designated mononegavirales
US6330090B1 (en) * 1997-02-14 2001-12-11 Photonetics Optical fiber wavelength, multiplexer and demultiplexer
US6030785A (en) * 1997-03-05 2000-02-29 University Of Washington Screening methods to identify agents that selectively inhibit hepatitis C virus replication
US5891705A (en) * 1997-04-08 1999-04-06 Pentose Pharmaceuticals, Inc. Method for inactivating a virus
US6884414B1 (en) 1997-04-30 2005-04-26 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Recombinant influenza viruses expressing tumor-associated antigens as antitumor agents
KR100702523B1 (ko) 1997-05-23 2007-04-04 더 가번먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 아메리카, 에즈 레프리젠티드 바이 더 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비시즈 클로닝된 뉴클레오타이드 서열로부터 약독화된파라인플루엔자 바이러스를 제조하는 방법
DE69837764T2 (de) 1997-07-11 2008-01-31 Yale University, New Haven Rhabdovirus mit gentechnisch veränderter hülle
KR20010030630A (ko) 1997-09-19 2001-04-16 윌리암 에이취 캘넌, 에곤 이 버그 약독화 호흡 신시티아 바이러스
PL212316B1 (pl) 1998-06-12 2012-09-28 Sinai School Medicine Zastosowania preparatów szczepionek, zastosowania preparatów farmaceutycznych oraz sposoby wytwarzania szczepionek
DK1098961T3 (da) * 1998-06-12 2008-05-26 Andrej Y Dr Egorov Gensplejsede svækkede vira, der inducerer interferon
US6146642A (en) 1998-09-14 2000-11-14 Mount Sinai School Of Medicine, Of The City University Of New York Recombinant new castle disease virus RNA expression systems and vaccines
US6544785B1 (en) 1998-09-14 2003-04-08 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Helper-free rescue of recombinant negative strand RNA viruses
AT407958B (de) * 1999-02-11 2001-07-25 Immuno Ag Inaktivierte influenza-virus-vakzine zur nasalen oder oralen applikation
DE60033284T3 (de) 1999-07-14 2014-10-30 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai In vitro-rekonstitution von segmentierten, negativstrang-rna-viren
AU2001250352B2 (en) 2000-03-02 2006-01-12 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung Gmbh Recombinant influenza a viruses
AU2001257001A1 (en) * 2000-04-10 2001-10-23 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Screening methods for identifying viral proteins with interferon antagonizing functions and potential antiviral agents
DE10020505A1 (de) 2000-04-26 2001-10-31 Conzelmann Karl Klaus RSV NS Proteine antagonisieren die Interferon (IFN) Antwort
KR20030061810A (ko) 2000-09-25 2003-07-22 폴리문 사이언티픽 임무노이비오로기쉐 포르슝 게엠베하 생균 백신과 제조 방법
AUPR343601A0 (en) * 2001-02-28 2001-03-29 Dickins, Philip Trenching machine
WO2004043404A2 (en) 2002-11-13 2004-05-27 Rutgers, The State University Process for designing inhibitors of influenza virus non-structural protein 1
ES2694123T3 (es) * 2004-06-01 2018-12-18 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Virus de la gripe porcina modificado por ingeniería genética y usos de los mismos
WO2006088481A2 (en) 2005-02-15 2006-08-24 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Genetically engineered equine influenza virus and uses thereof
US20070116717A1 (en) 2005-08-01 2007-05-24 Shneider Alexander M Influenza vaccine compositions and methods
AT502275B8 (de) * 2005-08-08 2007-08-15 Greenhills Biotechnology Res D Immunantwort-induzierende zusammensetzungen
PL2251034T3 (pl) 2005-12-02 2018-07-31 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Chimeryczne wirusy prezentujące nienatywne białka powierzchniowe i zastosowania tych wirusów
US7507411B2 (en) 2006-06-23 2009-03-24 University Of Saskatchewan Attenuated influenza NS1 variants

Also Published As

Publication number Publication date
US6573079B1 (en) 2003-06-03
WO1999064570A9 (en) 2000-03-09
ES2281177T3 (es) 2007-09-16
IL140265A (en) 2008-06-05
JP4837827B2 (ja) 2011-12-14
JP2002517470A (ja) 2002-06-18
EP2316923A3 (en) 2014-04-09
CZ20004635A3 (en) 2001-06-13
EP1086207A1 (en) 2001-03-28
NO20006328D0 (no) 2000-12-12
WO1999064068A9 (en) 2000-03-09
NZ509055A (en) 2004-02-27
US20090053264A1 (en) 2009-02-26
JP5829655B2 (ja) 2015-12-09
AU771110B2 (en) 2004-03-11
SK19072000A3 (sk) 2001-09-11
DK2316923T3 (en) 2018-01-08
US20100158942A1 (en) 2010-06-24
US20120258134A1 (en) 2012-10-11
CY1113689T1 (el) 2016-06-22
JP2010142248A (ja) 2010-07-01
US9352033B2 (en) 2016-05-31
CA2334895A1 (en) 1999-12-16
US8765139B2 (en) 2014-07-01
DK1085904T3 (da) 2013-02-25
WO1999064068A1 (en) 1999-12-16
JP2002517229A (ja) 2002-06-18
US6669943B1 (en) 2003-12-30
EP1086207B1 (en) 2007-01-17
AU770619B2 (en) 2004-02-26
ATE351901T1 (de) 2007-02-15
HUP0102441A2 (hu) 2001-10-28
US20160279227A1 (en) 2016-09-29
JP2014036654A (ja) 2014-02-27
US20040109877A1 (en) 2004-06-10
PL398576A1 (pl) 2012-10-08
AU4434599A (en) 1999-12-30
CA2334850C (en) 2013-11-26
PL212316B1 (pl) 2012-09-28
DK2316924T3 (en) 2018-01-02
EP1086207A4 (en) 2003-01-22
ES2653557T3 (es) 2018-02-07
DE69934885D1 (de) 2007-03-08
US7494808B2 (en) 2009-02-24
IL140264A (en) 2008-03-20
PL200977B1 (pl) 2009-02-27
CZ306637B6 (cs) 2017-04-12
KR100637937B1 (ko) 2006-10-23
EP1085904B1 (en) 2012-11-28
BR9911163A (pt) 2002-01-15
NO20006328L (no) 2001-02-02
PL346212A1 (en) 2002-01-28
PT1085904E (pt) 2013-03-05
NZ509054A (en) 2004-01-30
KR20060080249A (ko) 2006-07-07
US7588768B2 (en) 2009-09-15
US20140341948A1 (en) 2014-11-20
ES2400445T3 (es) 2013-04-09
DE69934885T2 (de) 2007-11-08
IL140264A0 (en) 2002-02-10
JP2011050384A (ja) 2011-03-17
EP1085904A4 (en) 2004-12-29
RU2236252C2 (ru) 2004-09-20
JP4531255B2 (ja) 2010-08-25
EP2316923A2 (en) 2011-05-04
JP2010099081A (ja) 2010-05-06
JP2013226154A (ja) 2013-11-07
AU4434399A (en) 1999-12-30
SK288200B6 (sk) 2014-06-03
DK1086207T3 (da) 2007-05-29
KR20010052782A (ko) 2001-06-25
EP1085904A1 (en) 2001-03-28
US6852522B1 (en) 2005-02-08
EP2316924A3 (en) 2014-03-19
MXPA00012402A (es) 2003-07-14
EP2316924B1 (en) 2017-10-11
CA2334850A1 (en) 1999-12-16
EP2316924A2 (en) 2011-05-04
JP5810134B2 (ja) 2015-11-11
HUP0102441A3 (en) 2004-10-28
US20100233785A1 (en) 2010-09-16
WO1999064570A1 (en) 1999-12-16
JP5081220B2 (ja) 2012-11-28
IL140265A0 (en) 2002-02-10
SK288544B6 (sk) 2018-03-05
EP2316923B1 (en) 2017-10-18
SK288567B6 (sk) 2018-06-01
IL188362A0 (en) 2008-03-20
MXPA00012403A (es) 2003-05-15
CZ302601B6 (cs) 2011-08-03
US20050054074A1 (en) 2005-03-10
CA2334895C (en) 2016-01-19
US9387240B2 (en) 2016-07-12
US20090203114A1 (en) 2009-08-13
ES2650500T3 (es) 2018-01-18
CN1312725A (zh) 2001-09-12
US8057803B2 (en) 2011-11-15
IL189766A0 (en) 2008-08-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9387240B2 (en) Attenuated negative strand viruses with altered interferon antagonist activity for use as vaccines and pharmaceuticals