KR100637937B1 - 변형된 인터페론 길항물질을 보유하고, 백신 및 약제로사용되는 약독화된 네거티브 가닥 바이러스 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 일반적으로, 세포내 인터페론(IFN) 반응에 대한 길항 능력이 손상된 약독화된 네거티브-가닥 RNA 바이러스에 관하고, 또한, 이런 약독화된 바이러스의 백신과 제약학적 조성물에서 용도에 관한다. 본 발명은 또한, 이런 약독화된 바이러스의 선별을 위한 IFN-결손된 시스템의 개발과 용도에 관한다. 특히, 본 발명은 NS1 유전자가 변형되어 세포내 IFN 반응에 길항작용하는 NS1 유전자 산물의 능력이 감소 또는 제거된 약독화된 인플루엔자 바이러스에 관한다. 돌연변이 바이러스는 in vivo에서 복제되지만 감소된 병원성을 보이기 때문에, 살아있는 바이러스 백신과 제약학적 조성물에 매우 적합하다.

Description

변형된 인터페론 길항물질을 보유하고, 백신 및 약제로 사용되는 약독화된 네거티브 가닥 바이러스{ATTENUATED NEGATIVE STRAND VIRUSES WITH ALTERED INTERFERON ANTAGONIST ACTIVITY FOR USE AS VACCINES AND PHARMACEUTICALS}
본 출원에서 기술한 발명은 국립보건원의 지원을 받은 것으로, 정부는 본 발명에 대하여 특정 권한을 요구할 수 있다.
본 출원은 출원 NO. 60/117, 683(January 29, 1999); 60/108,832(November 18, 1998); 60/089,103(June 12, 1998)의 일부-계속 출원인데, 상기 공개공보는 여기에 참고문헌으로 한다.
1. 도입
본 발명은 일반적으로, 세포내 인터페론(IFN) 반응에 길항작용할 수 있는 능력이 손상된 약독화된 네거티브-가닥 RNA 바이러스에 관하고, 이런 약독화된 바이러스의 백신과 제약학적 조성물에서 용도에 관한다. 또한, 본 발명은 이런 약독화된 바이러스의 선별, 동정, 증식을 위한 IFN-결손된 시스템의 개발과 용도에 관한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 세포내 IFN 반응에 길항작용하는 NS1 유전자 산물의 능력을 감소 또는 제거하는 NS1 유전자상의 변이를 보유한 약독화된 인플루엔자 바이러스에 관한다. 돌연변이 바이러스는 in vivo에서 복제되긴 하지만, 병원 성이 감소되어 간 바이러스 백신 및 제약학적 조성물에 사용하기 적합하다.
2.1 인플루엔자 바이러스
네거티브-센스 게놈의 외피형 단일-가닥 RNA 바이러스를 보유한 바이러스 과는 비-분절된 게놈을 보유한 그룹(파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae), 라브도바이러스과(Rhabodoviridae), 필로바이러스과(Filoviridae), 보르나병 바이러스) 또는 분절된 게놈을 가진 그룹(오르토믹소바이러스과(Orthomyxoviridae), 부니야바이러스과(Bunyaviridae), 아레나바이러스과(Arenaviridae))으로 구분한다. 하기에 자세히 기술하고, 실시예에서 사용한 오르토믹소바이러스과(Orthomyxoviridae)에는 인플루엔자, A, B, C형 바이러스, 토코토바이러스와 도오리바이러스, 감염성 연어 빈혈 바이러스가 포함된다.
인플루엔자 바이러스는 단일-가닥 RNA 게놈을 보유한 내부 리보뉴클레오티드 코어(나선형 뉴클레오캡시드) 및 매트릭스 단백질(M1)에 의해 내부에 정렬된 외부 리포단백질 외피로 구성된다. 인플루엔자 A 바이러스의 분절된 게놈은 10개의 폴리펩티드: RNA-의존 RNA 중합효소 단백질(PB2, PB1, PA)과 뉴클레오캡시드를 구성하는 핵단백질(NP); 매트릭스 막 단백질(M1, M2); 외피를 보유한 지질로부터 돌출된 2개의 표면 당단백질(혈구응집소(HA)와 뉴우라미니다제(NA)); 비구조 단백질(NS1)과 핵 수출 단백질(NEP)을 인코드하는 8개의 선형 네거티브 극성, 단일 가닥 RNA로 구성된다. 게놈의 전사와 복제는 핵에서 일어나고, 혈장 막에서 출아를 통해 조합된다. 바이러스는 혼합 감염동안 유전자를 재집합시킬 수 있다.
인플루엔자 바이러스는 HA를 통해 세포막 당단백질과 당지질상의 시알일올리고사카라이드에 흡수된다. 바이러스의 세포내이입후, HA 분자의 형태 변화는 세포 엔도좀내에서 발생하는데, 이것은 막 융합을 용이하게 하고, 따라서 탈피복을 촉발한다. 뉴클레오캡시드는 핵으로 이동하는데, 여기서 바이러스 mRNA는 전사된다. 바이러스 mRNA는 독특한 기작에 의해 전사되는데, 이런 기작동안 바이러스 엔도뉴클레아제는 세포내 이형이질성 mRNA로부터 캡핑된 5'-단부를 절단하는데, 상기 mRNA는 바이러스 전사효소에 의한 바이러스 RNA 주형의 전사를 위한 프라이머 역할을 한다. 전사는 주형 단부로부터 15 내지 22번 염기위치에서 종결되는데, 여기서, 올리고(U) 서열은 폴리(A)다발의 첨가를 위한 시그널 역할을 한다. 이렇게 만들어진 8개의 바이러스 RNA 분자중에서, 6개는 단백질 HA, NA, NP 및 바이러스 중합효소 단백질 PB2, PB1, PA로 직접 번역되는 모노시스트론이다. 다른 2개의 전사체는 접합되는데, 이들 각각에서 상이한 해독틀로 번역되는 2개의 mRNA이 만들어지고, 여기에서 M1, M2, NS1, NEP가 생산된다. 다시 말하면, 8개의 바이러스 RNA 분절은 10개의 단백질: 9개의 구조 단백질과 1개의 비구조 단백질을 기호화한다. 인플루엔자 바이러스의 유전자와 이들의 단백질 산물은 하기 표1에 요약 제시한다.
표 1
Figure 112000026386313-pct00001
인플루엔자 A 바이러스 게놈은 네거티브 극성의 단일-가닥 RNA의 8개 분절을 보유하는데, 이들 분절은 1개의 비구조 단백질과 9개의 구조 단백질을 기호화한다. 비구조 단백질 NS1은 인플루엔자 바이러스 감염된 세포에서는 풍부하게 존재하지만, 바이러스에서는 검출되지 않는다. NS1은 감염 초기의 핵 및 후기 바이러스 사 이클의 세포질에서 발견되는 인단백질이다(King et al., 1975, Virology 64:378). NS 유전자에 병소를 보유하는 온도-감수성(ts) 인플루엔자 돌연변이체를 이용한 연구에서, NS1 단백질은 바이러스가 숙주 세포 유전자 발현을 저해하고 바이러스 단백질 합성을 촉진할 수 있는 기작의 전사 및 전사후 조절물질이라는 것을 짐작할 수 있다. NS1 단백질은 전사후 과정을 조절하는 다른 다수의 단백질과 유사하게, 특이적 RNA 서열 및 구조와 상호작용한다. NS1 단백질은 상이한 RNA 종류: vRNA, 폴리-A, U6 snRNA, 바이러스 mRNA의 5' 비번역된 영역, dsRNA와 결합하는 것으로 보고되고 있다(Qiu et al., 1995, RNA 1: 304; Qiu et al., 1994, J. Virol. 68:2425; Hatada Fukuda 1992, J Gen Virol. 73:3325-9).
감염된 세포상의 cDNA로부터 NS1 단백질의 발현은 몇몇 효과: mRNA의 뉴클레오-세포질 전달, 사전-mRNA 접합, 숙주 mRNA 폴리아데닐화의 저해, 바이러스 mRNA의 번역 촉진과 관계한다(Fortes, et al., 1994, EMBO J. 13:704; Enami, et al, 1994, J. virol. 68: 1432; de la Luna, et al., 1995, J. Virol. 69:2427; Lu, et al., 1994, Genes Dev. 8:1817; Park, et al., 1995, J. Biol Chem. 270, 28433; Nemeroff et al., 1998, Mol. Cell. 1:1991; Chen, et al., 1994, EMBO J. 18:2273-83).
2.2 약독화된 바이러스
불활화된 바이러스 백신은 바이러스 병원균을 죽임으로써, 예를 들면, 가열 또는 포르말린 처리하여 병원균이 복제하지 못하도록 하여 만든다. 불활화된 백신은 용도가 제한적인데, 그 이유는 이들은 장기간 지속되는 면역을 제공하지 못하 고, 따라서, 제한적인 보호를 제공하기 때문이다. 바이러스 백신을 만드는 대안은 약독화된 살아있는 바이러스 백신을 이용하는 것이다. 약독화된 바이러스는 복제할 수는 있지만 병원성을 나타내지 않고, 따라서 좀더 장기간 지속되는 면역을 제공하고 좀더 확대된 보호를 가능하게 한다. 하지만, 약독화된 바이러스를 만드는 통상적인 방법은 숙주내 돌연변이체를 임의 선별하는 것인데, 상기 변이체의 대부분은 온도 감수성이다; 예를 들면, 바이러스는 비자연적 숙주를 통과시키고, 병원성이 아닌 면역원성을 나타내는 자손 바이러스를 선별한다.
백신 목적의 인플루엔자 바이러스를 분리하고 성장시키기 위한 통상적인 기질은 미발달 계란이다. 인플루엔자 바이러스는 일반적으로 37℃에서 2-4일 동안, 10-11일된 계란에서 성장한다. 인플루엔자 A와 B 바이러스의 대다수 사람 일차 분리체는 배아의 양막낭에서 훨씬 잘 자라지만, 2 내지 3회 계대접종후, 바이러스는 난의 외부로부터 접근가능한 요막 구멍의 세포에 적응하여 성장할 수 있게 된다(Murphy, b.R., and R.G. Webster, 1996. Orthomyxoviruses p. 1397-1445. In Vields Virology. Lippincott-Raven P.A.).
이론적으로, 재조합 DNA 기술과 유전자 조작 기술을 이용하면 바이러스 게놈에 특이적 돌연변이를 정교하게 조작할 수 있다는 점에서, 약독화된 바이러스를 효과적으로 생산할 수 있다. 하지만, 바이러스의 약독화에 필요한 유전자 변형은 알 수가 없거나 또는 예상할 수 없다. 일반적으로, 바이러스 백신을 조작하는데 재조합 DNA 기술을 사용하려는 시도는 우두 바이러스 또는 바쿨로바이러스와 같은 재조합 바이러스 벡터에서 발현되고 면역반응에 관여하는 병원균의 단백질 소단위를 보 유하는 소단위 백신의 생산에 주로 이루어지고 있다. 최근에, 재조합 DNA 기술은 자연 또는 공지된 숙주 범위 변이체에서 발견되는 약독화된 바이러스와 유사한 포진 바이러스 결손 변이체 또는 폴리바이러스를 만드는데 사용되었다. 1990년까지, 네거티브 가닥 RNA 바이러스에는 특정 부위 돌연변이를 사용할 수 없었고, 따라서, 이의 유전자를 조작하는 것은 불가능하였다.
이렇게 만들어진 약독화된 살아있는 인플루엔자 바이러스는 복제가 일어나는 숙주세포에서 인터페론 반응을 억제하지 못할 수 도 있다. 따라서, 이들 바이러스가 비병원성이고 면역원성이라는 점에서 유익하긴 하지만, 이들은 백신 제조 목적의 통상적인 기질에서 증식하기 어렵다. 또한, 약독화된 바이러스가 매우 경미한 독력을 보유하는 경우, 숙주는 이후의 위험에 대비할 수 있을 만큼 충분한 면역반응을 준비하지 못하게 된다.
3. 본 발명의 요약
본 발명은 세포내 인터페론(IFN) 반응에 길항작용할 수 있는 능력이 손상된 약독화된 네거티브-가닥 RNA 바이러스에 관하고, 이런 약독화된 바이러스의 백신과 제약학적 조성물에서 용도에 관한다. 손상된 IFN 길항작용을 보유한 변이체 바이러스는 약독화된다--이들은 감염성이고, in vivo에서 복제하여 무증상 감염을 제공할 수 있지만, 병원성을 보이지는 않는다. 따라서, 이들은 살아있는 간 백신의 이상적인 후보다. 또한, 약독화된 바이러스는 in vivo에서 다른 생리결과를 나타내는 강한 IFN 반응을 유도할 수 있어, 이후의 감염성 질병에 대한 보호를 제공하거나 또는 항종양 반응을 유도한다. 따라서, 약독화된 바이러스는 다른 감염성 질 병, 암발생 가능성이 높은 개체, 또는 IFN-치료가능 질병의 예방 또는 치료를 위한 제약학적 분야에 사용할 수 있다.
본 발명에 따라 사용하는 네거티브 가닥 RNA 바이러스에는 분절된 바이러스와 비-분절된 바이러스가 포함된다; 적절한 구체예에는 인플루엔자 바이러스, 호흡기 합포체 바이러스(RSV), 뉴캐슬병 바이러스(NDV), 수포성 구내염 바이러스(VSV), 파라인플루엔자 바이러스(PIV)가 포함되지만, 이들에 국한시키지 않는다. 본 발명에 사용되는 바이러스는 원하는 표현형을 보유한 바이러스--다시 말하면, 세포내 IFN 반응에 길항작용하는 능력이 손상된 자연 발생 균주, 변이체 또는 돌연변이체; 돌연변이 유발시킨 바이러스(예, 돌연변이원에 노출, 비-복제허용 숙주에서 반복적인 계대접종으로 발생); 재집합체(분절된 바이러스 게놈의 경우); 또는 유전자 조작된 바이러스(예, 역 유전학 기술이용)에서 선별한다. 돌연변이체 또는 유전자 조작된 바이러스는 IFN 결손된 시스템 대 IFN 콤피던트 시스템상의 상이한 성장에 기초하여 선별할 수 있다. 가령, IFN 결손된 시스템에서는 성장하나 IFN 콤피던트 시스템에서 성장하지 못하는(또는 IFN 콤피던트 시스템에서 적게 성장하는) 바이러스를 선별할 수 있다.
이렇게 선별된 약독화 바이러스 자체를 백신 또는 제약학적 조성물에 사용할 수 있다. 대안으로, 약독화된 바이러스는 벡터 또는 재조합방식으로 만들어진 백신의 "기본골격"으로 사용할 수 있다. 이런 경우, "역 유전학 기술"을 사용하여 돌연변이를 조작하거나 또는 약독화된 바이러스에서 외래에피토프를 생산할 수 있는데, 여기서, 상기 약독화된 바이러스는 "양친" 균주역할을하게 된다. 이런 방식 으로, 균주 변이체에 대한 또는 완전히 상이한 작용물질이나 질병 항원에 대한 예방주사용 백신을 고안할 수 있다. 가령, 약독화된 바이러스는 다른 사전선택된 균주의 중화 에피토프를 발현하도록 조작할 수 있다. 대안으로, 네거티브 RNA 바이러스를 제외한 바이러스의 에피토프는 약독화된 돌연변이 바이러스(예, HIV의 gp160, gp120 또는 gp41)에 조립할 수 있다. 대안으로, 비-바이러스 감염 병원균(기생충, 박테리아, 곰팡이)의 에피토프는 바이러스에 조작하여 넣을 수 있다. 또 다른 대안으로, 암 백신은 예를 들면, 종양 항원을 약독화된 바이러스 골격에 조작하여 넣음으로써 만들 수 있다.
분절된 게놈을 보유한 RNA 바이러스와 관련된 특정 구체예에서, 재집합 기술을 사용하여, 양친 분절된 RNA 바이러스 균주(자연 돌연변이, 돌연변이 유발시킨 바이러스 또는 유전자 조작된 바이러스)로부터 얻은 약독화된 표현형을 상이한 바이러스 균주(야생형 바이러스, 자연 돌연변이체, 돌연변이 유발시킨 바이러스 또는 유전자 조작된 바이러스)로 전달할 수 있다.
숙주에서 강한 IFN 반응을 유도하는 약독화된 바이러스는 또한, 다른 바이러스 감염 또는 IFN-치료가능 질병(예, 암)의 예방 또는 치료를 위한 제약학적 조성물에 사용할 수 있다. 이런 측면에서, 약독화된 바이러스의 향성을 변형하여, in vivo 또는 ex vivo에서 바이러스가 원하는 목표 기관, 조직 또는 세포를 향하도록 할 수 있다. 이런 방식을 이용하여, IFN 반응은 표적위치에서 국소적으로 유도할 수 있고, 따라서, 전신 IFN 치료의 부작용을 회피 또는 최소화할 수 있다. 이런 경우, 약독화된 바이러스는 표적 기관, 조직 또는 세포의 수용체에 특이적인 리간 드를 발현하도록 조작할 수 있다.
본 발명은 부분적으로, NS1이 바이러스-감염된 숙주 세포의 IFN 매개된 반응을 저해한다는 점에서 야생형 인플루엔자 바이러스의 NS1이 IFN 길항물질로서 기능한다는 출원인의 발견에 기초한다. NS1 활성이 결핍된 바이러스 돌연변이체는 세포내 IFN 반응의 강력한 유도물질인 것으로 밝혀졌고, in vivo에서 약독화된 표현형을 나타낸다; 다시 말하면, 돌연변이체 바이러스는 in vivo에서 복제하지만 감소된 병원성을 보인다. 본 발명을 실시하는 방법에 대한 임의의 이론 또는 설명에 제한하지 않고, 본 발명 바이러스의 약독화된 특징은 강한 세포내 IFN 반응을 유도하는 능력 및 숙주 IFN 반응에 대한 손상된 길항능력에 기인한 것으로 추정된다. 하지만, 본 발명의 약독화된 바이러스의 유용한 특징은 세포내 인터페론 반응에 대한 효과에만 기인하는 것은 아니다. 실제로, NS1과 관련된 다른 활성의 변형이 약독화된 표현형에 기여한다.
손상된 IFN 길항활성을 보유한 돌연변이체 인플루엔자 바이러스는 면역학적 반응과 사이토킨 반응을 유도할 만큼 충분한 in vivo 발생 역가로 복제되는 것으로 밝혀졌다. 가령, 약독화된 인플루엔자 바이러스를 예방주사하면, 이후 야생형 인플루엔자 바이러스로 위협한 동물에서 바이러스 역가가 감소하였다. 약독화된 인플루엔자 바이러스 또한, 항바이러스 활성과 항종양 활성을 보였다. 약독화된 인플루엔자 바이러스로 사전 감염시키면, 야생형 인플루엔자 바이러스 및 미발달 난에서 중간염(superinfection)된 다른 바이러스(예, 센다이 바이러스) 균주의 복제가 저해되었다. 종양 세포를 주사한 동물에 약독화된 인플루엔자를 접종하면, 형 성되는 병소의 수가 감소하였다. 인플루엔자 바이러스는 CTL(세포독성 T 림프구) 반응을 유도하는 것으로 밝혀졌기 때문에, 약독화된 바이러스는 암 백신을 위한 매력적인 후보중의 하나다.
바이러스의 IFN 활성을 감소시키지만, 이를 완전히 제거하지는 않은 돌연변이가 백신 조성물에 바람직하다--이런 바이러스는 통상적인 기질과 비통상적인 기질 모두에서 성장하고 중간정도의 독력을 보유한다. 특히, 출원인은 NS1 C-단부-절두된 돌연변이체가 IFN 결손된 기질(예, 6 내지 7일된 미발달 계란) 및 전체 NS1 유전자가 결손된 인플루엔자 바이러스 돌연변이체(녹아웃 돌연변이체로 지칭)의 성장을 불허하는 인플루엔자 바이러스의 통상적인 기질(예, 10일된 미발달 계란의 요막)에서 고 역가로 복제된다. 하지만, NS1-C 단부 절두된 돌연변이체의 복제는 12일된 미발달 난에서 감소한다. 이런 방식을 통해, IFN 길항활성을 변형했지만 이를 완전히 제거하지는 않아서, 백신 조제에 적합한 기질에서 성장할 수 있는 살아있는 약독화된 네거티브 가닥 RNA 바이러스의 생산과 동정이 처음으로 가능해졌다. 또한, 이런 방식을 통해, 변형되었지만 완전히 제거되지는 않은 인터페론 길항활성을 공여하는 돌연변이를 보유한 인플루엔자 또는 다른 바이러스에 대한 효과적인 선별 동정 시스템이 처음으로 가능해졌다.
본 발명은 또한, 현재 백신 생산에 사용되는 통상적인 시스템에서 성장할 수 없는 약독화된 바이러스를 증식시키기 위한 IFN 결손된 시스템의 용도에 관한다. 이 글에서 IFN-유도된 시스템은 세포, 세포주, 동물(예, 생쥐, 닭, 칠면조, 토끼, 쥐등)과 같은 시스템을 의미하는데, 이들은 IFN를 생산하지 않거나 또는 낮은 수준 의 IFN를 생산하고, IFN에 반응하지 않거나 또는 IFN에 비효율적으로 반응하고, 또는 IFN에 의해 유도된 항바이러스 유전자의 활성이 결핍된다. 이를 위해, 출원인은 사용할 수 있는 다수의 결손 시스템을 동정 또는 고안하였는데, 이런 시스템에는 어린 미발달 난, IFN-결손된 세포주(예, VERO 세포) 또는 유전자 조작된 세포주(예, STAT1 녹아웃)가 포함되지만, 이들에 국한시키지 않는다. 대안으로, 미발달 난 또는 세포주는 IFN 시스템을 저해하는 화합물(예, 약물, 항체, 안티센스, 리보자임등)로 사전처리할 수 있다. 또 다른 구체예는 IFN 시스템이 결핍된 난, 예를 들면, STAT1 네거티브 조류, 특히, 가금에 의해 생산된 난의 용도에 관하는데, 상기 가금에는 닭, 오리, 칠면조등이 포함되지만, 이들에 국한시키지 않는다.
도 1은 난에서 야생형 인플루엔자 A 바이러스 복제를 저해하는 DelNS1 바이러스를 보여준다. 지정된 pfu의 delNS1 바이러스를 10일된 미발달 계란에 접종하였다. 8시간후, 난은 103 pfu의 WSN 바이러스로 감염시켰다. 37℃ 접종 2일후, 요막액은 수거하고, WSN 바이러스 역가는 MDBK 세포에서 플라크 분석으로 측정하였다. 결과는 평균 2개의 난이다.
도 2는 delNS1 바이러스에 의한 미발달 난에서 항바이러스 반응의 유도를 보여준다. 10일된 미발달 계란은 PBS(비처리) 또는 2x104 pfu의 delNS1(delNS1 처리)로 접종하였다. 8시간후, 난은 103 pfu의 인플루엔자 A/WSN/33 (H1N1) 바이러 스, 인플루엔자 A/PR8/34 (H+N1) 바이러스, 인플루엔자 A/X-31(H3N2) 바이러스, 인플루엔자 B/Lee/40 바이러스 또는 센다이 바이러스로 감염시켰다. 접종 2일후, 요막액은 수거하고, 바이러스 역가는 혈구 응집 반응 분석으로 측정하였다. 결과는 평균 2개의 난이다.
도 3에서 CV1 세포는 녹색 형광 단백질(GFP)에 융합된 IRF-3을 발현하는 플라스미드로 감염시켰다. 이를 통해, 세포내 IRF-3의 국소화를 형광 현미경으로 측정하였다. 일부 경우에, NS1 발현 플라스미드는 지정된 비율의 IRF-3 발현 플라스미드와 공동감염시켰다. 트랜스펙션 24 시간후의 세포는 지정된 바와 같이 높은 moi의 PR8(WT) 또는 delNS1 바이러스로 감염시켰다. 감염 10시간후, 세포는 형광현미경에서 IRF-3-GFP 국소화를 분석하였다. IRF-3의 배타적인 세포질 국소화(CYT) 및 세포질과 핵 국소화(Nuc+Cyt)를 보여주는 세포의 퍼센트를 표시한다.
본 발명은 세포내 IFN 반응에 대한 길항작용 능력이 손상된 약독화된 네거티브 가닥 RNA의 발생, 선별, 동정에 관하고, 또한, 이런 바이러스의 백신과 제약학적 조성물에서 용도에 관한다.
상기 바이러스는 분절된 또는 비-분절된 게놈을 보유하고, 자연 발생 균주, 변이체 또는 돌연변이체; 돌연변이 유발시킨 바이러스(예, UV 방사선 노출, 돌연변이원 또는 계대접종으로 발생); 재집합체(분절된 바이러스 게놈의 경우); 또는 유전자 조작된 바이러스(예, 역 유전학 기술이용)에서 선별한다. 가령, 돌연변이 바 이러스는 자연 변이, UV 방사선에 노출, 화학적 돌연변이원에 노출, 비-복제허용 숙주에서 계대접종, 재집합(즉, 약독화된 분절된 바이러스와 원하는 항원을 보유한 다른 항원과의 공동감염) 또는 유전자 조작(예, "역 유전학"이용)으로 만들 수 있다. 본 발명에 사용하기 위하여 선별된 바이러스는 결손된 IFN 길항활성을 보유하고, in vivo에서 복제할 수 있지만, 낮은 역가를 발생시켜 비-병원성인 무증상 감염을 유발할 수 있다. 이런 약독화된 바이러스는 살아있는 백신의 이상적인 후보가 된다.
적절한 구체예에서, 본 발명에 사용하기 위하여 선별된 약독화된 바이러스는 숙주에서 다른 생리결과를 나타내는 강한 IFN 반응을 유도--이런 특성은 백신으로 사용되는 경우 강한 면역 반응의 발생에 기여-할 수 있기 때문에, 이들 바이러스는 다른 바이러스의 감염, 개체에서 종양형성, 또는 IFN으로 치료하는 다른 질환의 예방이나 치료를 위한 제약학적 조성물로 사용할 수 있다.
본 발명은 인플루엔자 바이러스 돌연변이체를 이용한 작업중에 이루어진 본 출원인의 다수 발견과 관찰에 부분적으로 기초한다. 하지만, 원칙은 다른 분절된 네거티브 가닥 RNA 바이러스와 비-분절된 네거티브 가닥 RNA 바이러스에 동일하게 적용하고 외삽할 수 있는데, 이들 바이러스의 예로는 파라믹소바이러스(센다이 바이러스, 파리인플루엔자 바이러스, 멈프스, 뉴캐슬병 바이러스), 모르빌리바이러스(홍역 바이러스, 개 디스템프 바이러스, 린덜페스트 바이러스); 뉴모바이러스(호흡기 합포체 바이러스, 소 호흡기 바이러스); 로브도바이러스(수포성 구내염 바이러스, 광견병 바이러스)를 들 수 있지만, 이들에 국한시키지 않는 다.
먼저, IFN 반응은 in vivo에서 바이러스 감염을 억제하는데 중요하다. 출원인들은 IFN-결손된 생쥐(STAT1-/- 생쥐)에서 야생형 인플루엔자 바이러스 A/WSN/33의 성장이 광범위한 장기의 감염을 유발한다는 것을 발견했다; 다시 말하면, 바이러스 감염은 IFN 반응을 보이는 야생형 생쥐에서와 같이 폐에 한정되지 않았다(Garcia-Sastre, et al., 1998, J. Virol. 72:8550). 둘째, 출원인들은 인플루엔자바이러스의 NS1이 IFN 길항물질 역할을 한다는 것을 확인했다. 출원인들은 전체 NS1 유전자가 결핍된 인플루엔자 바이러스 돌연변이(즉, NS1 "녹아웃")는 IFN-콤피던트 숙주 세포에서 고 역가로 성장할 수 없고, 단지 IFN-결손된 숙주에서만 증식할 수 있다는 것을 밝혀냈다. NS1 녹아웃 바이러스는 약독화된 표현형을 나타내고(즉, 이것은 IFN 결손된 STAT1-/-생쥐에서는 치명적이지만, 야생형 생쥐에서는 그렇지 않다), 세포에서 IFN 반응의 강력한 유도물질인 것으로 밝혀졌다(Garcia-Sastre, et al., 1998, Virology 252:324-330). NS1 녹아웃 돌연변이 바이러스로 사전 감염시키면, 미발달 난에서 중감염시킨 야생형 인플루엔자와 다른 바이러스(예, 센다이)의 역가가 감소하였다. 다른 실험에서, NS1 녹아웃 돌연변이 인플루엔자 바이러스로 감염시키면, 종양세포를 접종한 동물에서 병소 형성이 감소하였다. 따라서, NS1 녹아웃 인플루엔자 바이러스는 흥미로운 생물학적 특성을 보였다. 하지만, NS1 녹아웃 돌연변이 바이러스는 백신 제조를 위한 통상적인 시스템에서 증식되지 않았다. 이런 문제를 극복하기 위하여, 출원인들은 IFN-결손된 시스템을 사용하고 개발했는데, 이런 시스템을 이용하면 상당한 양의 약독 화된 바이러스를 생산할 수 있다.
또한, 출원인들은 전체 게놈이 결손된 NS1의 결손 변이체를 고안하였다. 놀랍게도, 이들 NS1 돌연변이체는 "중간정도" 표현형을 보이는 것으로 밝혀졌다--이들 바이러스는 인플루엔자 바이러스를 증식하는데 사용하는 통상적인 숙주에서 성장할 수 있다(하지만, IFN-결손된 시스템에서 성장이 더 효율적이고, 더 높은 역가로 생산된다). 더욱 중요한 점은 결손 돌연변이체가 in vivo에서 약독화되고, 강한 IFN 반응을 유도한다는 것이다. 인플루엔자 바이러스 NS1 절두된 돌연변이체를 예방주사하면, 이후에 야생형 바이러스로 위협한 동물에서 바이러스 역가 발생이 현저히 감소되어, 질병에 대한 보호가 이루어지게 된다.
본 발명은 또한, 백신용 바이러스의 분리, 동정, 성장을 위해 고안된 기질에 관한다. 특히, 인플루엔자 바이러스 돌연변이체를 효율적으로 성장시키기 위한 인터페론-결손된 기질을 제시한다. 본 발명에 따른 인터페론-결손된 기질은 인터페론을 생산하거나 또는 이에 반응하는 능력이 결손된다. 본 발명의 기질은 인터페론-결손 성장 환경을 필요로 하는 다양한 바이러스의 성장을 위해 사용할 수 있다. 이런 바이러스에는 파라믹소바이러스(센다이 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 멈프스, 뉴캐슬병 바이러스), 모르빌리바이러스(홍역 바이러스, 개 디스템프 바이러스, 린덜페스트 바이러스); 뉴모바이러스(호흡기 합포체 바이러스, 소 호흡기 바이러스); 로브도바이러스(수포성 구내염 바이러스, 광견병바이러스)가 포함되지만, 이들에 국한시키지 않는다.
본 발명은 또한, 본 발명의 약독화된 바이러스의 사람과 동물을 위한 백신 및 제약학적 조성물에서 용도에 관한다. 특히, 약독화된 바이러스는 광범위한 바이러스 또는 항원에 대한 백신으로 사용할 수 있는데, 이런 항원에는 균주 변이체, 상이한 바이러스 또는 다른 감염성 병원균(예, 박테리아, 기생충, 곰팡이)의 항원, 또는 종양 특이적 항원이 포함되지만, 이들에 국한시키지 않는다. 다른 구체예에서, 바이러스 복제와 종양 형성을 저해하는 약독화된 바이러스는 감염(바이러스 또는 비바이러스 병원균), 종양 형성 또는 IFN이 치료에 도움이 되는 질병의 예방 또는 치료에 사용할 수 있다. 다양한 방법을 사용하여 살아있는 약독화된 바이러스 조성물을 사람 또는 동물 개체에 투여하는데, 이를 통해 면역 또는 적합한 사이토킨 반응을 유도한다. 이런 방법에는 비강내, 기관내, 경구, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 경피 투여가 포함되지만, 이들에 국한시키지 않는다. 적절한 구체예에서, 본 발명의 약독화된 바이러스는 비강내 전달용 조성물로 제조한다.
5.1 약독화된 IFN 길항활성을 보유한 돌연변이체의 제조
감소된 IFN 길항활성을 보유한 임의의 돌연변이 바이러스 또는 균주는 본 발명에 따라 선별하고 사용할 수 있다. 한 구체예에서, 세포내 IFN 반응에 대한 길항 능력이 손상된 자연 발생 돌연변이체나 변이체, 또는 자발적인 돌연변이체를 선별할 수 있다. 다른 구체예에서, 돌연변이 바이러스는 돌연변이원(예, 자외선) 또는 화학적 돌연변이원에 노출시켜, 또는 다중 계대접종이나 비-복제허용 숙주에서 계대접종하여 만들 수 있다. 상이한 성장 시스템에서 선별은 IFN 길항 능력이 손상된 돌연변이체를 선별하는데 사용할 수 있다. 분절된 게놈을 보유한 바이러스의 경우, 약독화된 표현형은 재집합(즉, 약독화된 바이러스와 원하는 균주의 공동감염 및 양 표현형을 보이는 재집합체의 선별)으로 원하는 항원을 보유한 다른 균주로 전이시킬 수 있다.
또 다른 구체예에서, 돌연변이는 "역 유전학" 방식을 이용하여, 네거티브 가닥 RNA 바이러스, 예를 들면, RSV, NDV, VSV, PIV내에 유발시킬 수 있다. 이런 방식으로, 약독화된 표현형을 공여하는 자연 또는 다른 돌연변이는 백신 균주에 조작하여 넣을 수 있다. 가령, IFN 길항활성을 담당하는 유전자의 코딩 영역(예, 인플루엔자의 NS1)에 결실, 삽입 또는 치환을 생각해 볼 수 있다. 이런 경우, IFN-길항활성을 담당하는 유전자의 전사, 복제, 폴리아데닐화 또는 패킹을 주관하는 신호에 돌연변이를 유발시킬 수 있다. 가령, 인플루엔자에서 이런 변형에는 인플루엔자 B 바이러스 유전자 비-코딩 영역에 의한 인플루엔자 A 바이러스 유전자 비-코딩 영역의 치환(Muster, et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:51777), 인플루엔자 바이러스 유전자의 비-코딩 영역에서 염기쌍 변화(Fodor, et al., 1998, J Virol. 72:6283), 인플루엔자 바이러스 유전자의 프로모터 영역에서 돌연변이(Piccone, et al., 1993, Virus Res. 28:99; Li, et al., 1992, J virol. 66:4331), 폴리아데닐화에 영향을 주는 인플루엔자 바이러스 유전자의 5' 단부에서 우리딘 잔기의 배열에서 치환 또는 결실(Luo, et al., 1991, J Virol. 65:2861; Li, et al., J Virol. 1994, 68(2):1245-9)이 포함되지만, 이들에 국한시키지 않는다. 가령, 프로모터에 대한 이런 돌연변이는 IFN 길항활성을 담당하는 유전자의 발현을 하향-조절할 수 있다. IFN 길항활성을 담당하는 유전자의 발현을 조절하는 바이러스 유전자상의 돌연변이체는 또한, 본 발명의 따라 사용할 수 있는 바이러스 의 범주에 포함된다.
본 발명은 또한, 변형된 IFN 길항활성 또는 IFN-유도 표현형을 유발하지 않고, 오히려 변형된 바이러스 기능과 약독화된 표현형, 예를 들면, 폴리(A)-포함한 mRNA의 핵 수출의 변형된 저해, 사전-mRNA 접합의 변형된 저해, dsRNA를 격리시켜 PKR 활성화의 변형된 저해, 바이러스 RNA의 번역에 대한 변형된 효과, 숙주 mRNA 폴리아데닐화의 변형된 저해를 유발하는 NS1 유전자 분절에 대한 돌연변이에 관한다(Krug in Textbook of Influenza, Nicholson et al. Ed. 1998, 82-92).
역 유전학 기술에는 바이러스 중합효소에 의한 인식 및 네거티브 가닥 바이러스 RNA의 비-코딩 영역을 보유한 합성 재조합 바이러스 RNA의 제조가 포함되는데, 상기 네거티브 가닥 바이러스 RNA는 성숙 비리온을 만드는데 필요한 패킹 신호에 필수적이다. 재조합 RNA는 재조합 DNA로부터 합성하고 정제된 바이러스 중합효소 복합체로 in vitro에서 재구성하여, 세포를 트랜스펙션시키는데 사용할 수 있는 재조합 리보뉴클레오단백질(RNP)을 만든다. 바이러스 중합효소 단백질이 합성 RNA의 in vitro 또는 in vivo 전사동안 존재하는 경우, 좀더 효과적인 트랜스펙션을 달성할 수 있다. 합성 재조합 RNP는 감염성 바이러스 입자로 회수할 수 있다. 전술한 기술은 U.S. 특허 5,166,057(November 24, 1992); U.S. 특허 5,854,037(December 29, 1998); 유럽 특허 출원 EP 0702085A1(February 20, 1996); U.S. 특허 출원 09/152,845; 국제 특허 공개공보 PCT WO97/12032(April 3, 1997 공개); WO96/34625(November 7, 1996 공개); 유럽 특허 공개공보 EP-A780475; WO 99/02657(January 21, 1999 공개); WO 98/53078(November 26, 1998 공개); WO 98/02530(January 22, 1998 공개); WO 99/15672(April 1, 1999 공개); WO 98/13501(April 2, 1998 공개); WO 97/06270(February 20, 1997 공개), EPO 780 47SA1(June 25, 1997 공개)에서 제시한다.
역 유전학 방식으로 만들어진 약독화된 바이러스는 이 글에서 밝힌 백신과 제약학적 조성물에 사용할 수 있다. 역 유전학 기술은 또한, 백신 생산에 중요한 추가적인 돌연변이를 조작하는데 사용할 수 있다--다시 말하면, 유용한 백신 균주 변이체의 에피토프는 약독화된 바이러스로 조작하여 넣을 수 있다. 대안으로, 다른 바이러스 또는 비-바이러스 병원균에서 유래된 에피토프를 비롯한 완전 외래 에피토프는 약독화된 균주에 조작하여 넣을 수 있다. 가령, HIV(gp160, gp120, gp41) 기생충 항원(예, 말라리아), 박테리아 또는 곰팡이 항원, 또는 종양항원과 같은 무관한 바이러스의 항원은 약독화된 균주에 조작하여 넣을 수 있다. 대안으로, in vivo에서 바이러스의 향성을 변형하는 에피토프는 본 발명의 약독화된 키메라 바이러스로 조작하여 넣을 수 있다.
다른 구체예에서, 역 유전학 기술과 재조합 기술을 병용하여 분절된 RNA 바이러스상의 원하는 에피토프를 보유한 약독화된 바이러스를 조작할 수 있다. 가령, 약독화된 바이러스(자연 선택, 돌연변이유발 또는 역 유전학 기술로 만듦) 및 원하는 백신 에피토프를 보유한 균주(자연 선택, 돌연변이유발 또는 역 유전학 기술로 만듦)는 분절된 게놈의 재집합을 가능하게 하는 숙주에서 공동-감염시킬 수 있다. 약독화된 표현형과 원하는 에피토프를 모두 보이는 재집합체는 이후에 선별할 수 있다.
다른 구체예에서, 돌연변이되는 바이러스는 DNA 바이러스(예, 우두, 아데노바이러스, 바쿨로바이러스) 또는 파지티브 가닥 RNA 바이러스(예, 폴리오바이러스)이다. 이런 경우에, 당분야에 공지된 재조합 DNA 기술을 사용할 수 있다(U.S. Patent No. 4,769,330(Paoletti); U.S. Patent No. 4,215,051(Smith)).
본 발명에 따라 임의의 바이러스를 조작할 수 있는데, 이런 바이러스에는 하기 표2에서 제시한 바이러스 과가 포함되지만, 이들에 국한시키지 않는다.
표 2
Figure 112000026386313-pct00002
약어: ds=이중 가닥; ss= 단일가닥; 외피형=숙주 세포막으로부터 유래된 외부 지질이중층 보유; 파지티브-센스 게놈= RNA 바이러스의 경우 리보좀으로 직접 번역되는 뉴클레오티드 서열로 구성된 게놈, = DNA 바이러스의 경우 mRNA와 동일한 뉴클레오티드 서열로 구성된 게놈; 네거티브-센스 게놈= 파지티브-센스 가닥과 상보적인 뉴클레오티드 서열로 구성된 게놈
적절한 구체예에서, 본 발명은 NS1 유전자 산물의 결실 또는 절두를 보유한 유전자 조작된 인플루엔자 바이러스에 관한다. 인플루엔자 A와 B의 NS1 돌연변이체가 특히 바람직하다. 한가지 방식에서, NS1 유전자 산물의 아미노단부 영역은 계속 보유하는 반면, NS1 유전자 산물의 C-단부 영역은 적합한 코돈에서 핵산 삽입, 결실 또는 돌연변이를 통해 조작할 수 있다. 특히, 절두된 NS1 단백질은 야생형 NS1 유전자 산물의 1-60개 아미노산, 1-70개 아미노산, 1-80개 아미노산, 1-90개 아미노산(N-단부 아미노산은 1이다), 바람직하게는 90개 아미노산; 1-100개 아미노산, 바람직하게는 99개 아미노산; 1-110개 아미노산; 1-120개 아미노산; 또는 1-130개 아미노산, 바람직하게는 124개 아미노산을 보유한다.
본 발명은 또한, 임의의 유전자 조작된 인플루엔자 바이러스에 관하는데, 여기서, NS1 유전자 산물은 다음의 표현형: 비통상적인 기질, 예를 들면, 6-7일된 계란에서 고 역가로 성장하는 바이러스의 능력 또는 숙주 인터페론 반응을 유도하는 바이러스의 능력을 돌연변이 바이러스에 공여하는 NS1 단백질을 절두 또는 변형함으로써 변형한다. 인플루엔자 A 바이러스의 경우, 이들에는 NS1 절두를 보유한 바이러스가 포함되지만, 이에 국한시키지 않는다.
본 발명에는 약독화된 표현형을 보유한 자연 발생 돌연변이 인플루엔자 바이러스 A 또는 B 및 약독화된 표현형을 담당하는 이런 돌연변이를 보유하도록 조작된 인플루엔자 바이러스 균주의 사용이 포함된다. 인플루엔자 A 바이러스의 경우, 이들에는 124개 아미노산의 NS1을 보유한 바이러스가 포함되지만, 이들에 국한시키지 않는다(Norton et al., 1986, Virology 156:204-213). 인플루엔자 B 바이러스의 경우, 이들에는 N-단부로부터 유래된 127개 아미노산으로 구성된 NS1 절두된 돌연변이체(B/201)를 보유한 바이러스(Nortonet al., 1987, Virology 156:204-213) 및 N-단부로부터 유래된 90 아미노산으로 구성된 NS1 절두된 돌연변이체(B/AWBY-234)를 보유한 바이러스(Tobita et al., 1990, Virology 174:314-19)가 포함되지만, 이들에 국한시키지 않는다. 본 발명에는 NS1 NS1/38, NS1/80, NS1/124와 유사한 자연 발생 돌연변이체(Egorov, et al., 1998, j. virol. 72(8):6437-41) 및 자연 발생 돌연변이체 A/Turkey/ORE/71, B/201 또는 B/AWBY-234의 사용이 포함된다.
약독화된 인플루엔자 바이러스는 추가로 조작하여, 다른 백신 균주의 항원을 발현할 수 있다(예, 역 유전학 또는 재집합을 이용). 대안으로, 약독화된 인플루엔자 바이러스는 유전자조작된 바이러스를 이용한 유전학 또는 재집합으로 조작하여, 완전 외래 에피토프, 예를 들면, 다른 감염성 병원균의 항원, 종양 항원 또는 표적 항원을 발현할 수 있다. NS RNA 분절은 8개의 바이러스 RNA중 가장 짧기 때문에, NS RNA에는 다른 바이러스 유전자에서보다 긴 이형이질성 서열을 삽입할 수 있다. 또한, NS RNA 분절은 감염된 세포에서 높은 수준의 단백질 합성을 주도하는데, 이것은 상기 분절이 외래 항원의 삽입을 위한 이상적인 분절이 된다는 것을 암시한다. 하지만, 본 발명에 따른 인플루엔자의 8개 분절 모두를 이형이질성 서열 삽입에 사용할 수 있다. 가령, 표면 항원 제시가 바람직한 경우, 구조 단백질, 예 를 들면 HA 또는 NA를 인코드하는 분절을 사용한다.
5.2 숙주-제한 기초의 선별 시스템
본 발명에는 자연 변이체, 자발적인 변이체(즉, 바이러스 증식동안 진화하는 변이체), 돌연변이 유발된 자연 변이체, 재집합체 또는 유전자조작된 바이러스로부터 수득되는 원하는 표현형을 보유한 바이러스, 다시 말하면, IFN 길항활성이 적거나 또는 없는 바이러스를 선별하는 방법이 포함된다. 이런 바이러스는 IFN-결손된 숙주계 대 IFN-콤피던트 숙주계에서 성장을 비교하는 분화 성장 분석에서 최적 선별할 수 있다. IFN-결손된 시스템 대 IFN 콤피던트 시스템에서 더 효율적인 성장을 보이는 바이러스를 선별한다; 가급적, IFN-콤피던트 시스템에 비하여 IFN-결손된 시스템에서 1로그이상 더 많은 역가로 성장하는 바이러스를 선별한다.
대안으로, 바이러스는 IFN 분석 시스템, 예, 전사 기초의 분석 시스템을 이용하여 선별할 수 있는데, 여기서, 리포터 유전자는 IFN-감응성 프로모터로 조절한다. 감염된 세포 대 감염되지 않은 세포에서 리포터 유전자 발현은 IFN 반응을 효율적으로 유도하긴 하지만, IFN 반응에 길항 작용할 수 없는 바이러스를 동정하여 측정할 수 있다. 하지만, 적절한 구체예에서 원하는 표현형을 보유한 바이러스를 선별하기 위하여 분화 성장 분석을 이용하는데, 그 이유는 사용한 숙주계(IFN-콤피던트 대 IFN-결손된)에 적절한 선별압이 적용되기 때문이다.
가령, 바이러스의 성장(역가로 측정)은 IFN 또는 IFN 반응의 성분을 발현하는 다양한 세포, 세포주 또는 동물 모델 시스템 대 IFN 또는 IFN 반응의 성분이 결핍된 다양한 세포, 세포주 또는 동물 모델 시스템에서 비교할 수 있다. 이를 위 해, VERO 세포와 같은 세포주(IFN 결손) 대 MDCK 세포(INF-콤피던트)에서 바이러스의 성장을 비교할 수 있다. 대안으로, IFN-결손된 세포주는 INF 시스템이 결손되어 태어난 또는 유전자조작된 동물(예, STAT1-/- 돌연변이 생쥐)로부터 유도하여 확립할 수 있다. 이런 세포주의 성장은 야생형 동물(예, 야생형 생쥐)로부터 유래된 IFN-콤피던트 세포와 비교하여 측정할 수 있다. 다른 구체예에서, IFN-콤피던트이고, 야생형 바이러스의 성장을 뒷받침하는 것으로 알려진 세포주는 IFN이 결손되도록 조작할 수 있다(예, STAT1, IRF3, PKR등을 녹아웃시킴). 세포주에서 바이러스의 증식을 위하여 당분야에 공지된 기술을 사용할 수 있다(작업 실시예 참고). 표준 IFN 콤피던트 세포주 대 IFN 결손된 유전자조작 세포주에서 바이러스의 성장을 비교할 수 있다.
동물 시스템을 또한, 사용할 수 있다. 가령, 어린(6 내지 8일) 미발달 IFN-결손된 난에서 성장은 오래된(10 내지 12일) IFN-콤피던트 난에서 성장과 비교할 수 있다. 이를 위해, 난에서 감염과 증식을 위하여 당분야에 공지된 기술을 사용할 수 있다(작업 실시예 참고). 대안으로, IFN-결손된 STAT -/-생쥐에서 성장은 IFN-콤피던트 야생형 생쥐와 비교할 수 있다. 또 다른 대안으로, STAT -/-외래유전자도입 가금에 의해 생산된 IFN-결손된 미발달 난에서 성장은 야생형 가금에 의해 생산된 IFN-콤피던트 난에서 성장과 비교할 수 있다.
하지만, 선별 목적을 위해 유전자조작된 시스템대신에 임시 IFN-결손된 시스템을 사용할 수 있다. 가령, 숙주계는 IFN 생산 또는 IFN 반응의 성분을 저해하는 화합물(예, 약물, IFN에 대한 항체, IFN-수용체에 대한 항체, PKR의 저해물질, 안 티센스 분자, 리보자임등)로 처리할 수 있다. IFN-콤피던트 비처리된 컨트롤 대 IFN-결손된 처리 시스템에서 바이러스의 성장을 비교할 수 있다. 가령, IFN-콤피던트인 오래된 난은 선별할 바이러스로 감염시키기 전에, 이런 약물로 사전처리할 수 있다. 성장은 동일 연령의 비처리된 컨트롤 난에서 얻은 성장과 비교한다.
본 발명의 선별 방법을 통하여, IFN-감응성 환경에서 성장할 수 없는 돌연변이 바이러스의 무능으로 인해 IFN 길항활성이 제거된 돌연변이 바이러스는 IFN-결손된 환경에서 성장할 수 있는 돌연변이 바이러스의 능력과 비교하여 간단하고 쉽게 동정할 수 있다. 또한, 본 발명의 선별방법을 사용하여, IFN-감응성 환경(예, 10일된 미발달 난 또는 MDCK 세포) 및 IFN-결손된 환경(예, 6 내지 7일된 미발달 난 또는 Vero 세포)에서 성장하는 돌연변이 바이러스의 능력을 측정함으로써, 변형되었지만 IFN 길항활성이 제거되지 않은 돌연변이 바이러스를 동정할 수 있다. 가령, 10일된 난 대 6-7일된 난에서 적어도 1로그 적은 역가를 보이는 인플루엔자 바이러스는 IFN 반응을 저해하는 능력이 손상된 것으로 간주하게 된다. 다른 예에서, 12일된 난(최고 IFN 반응) 대 10일된 난(중간정도의 IFN 반응)에서 적어도 1로그 적은 역가를 보이는 인플루엔자 바이러스는 IFN 반응을 저해하는 능력이 부분적으로 손상된 것으로 간주하는데, 이들은 매력적인 백신 후보가 된다.
본 발명의 선별 방법에는 또한, IFN 반응을 유도하는 돌연변이 바이러스를 동정하는 방법이 포함된다. 본 발명의 선별 방법에 따라, IFN 반응의 유도는 돌연변이 감염 또는 IFN 발현이나 IFN 반응에 관여하는 트랜스활성물질의 활성화후 IFN에 의해 유도되는 IFN 발현 또는 목표 유전자나 리포터 유전자의 발현 수준을 분석 함으로써 측정할 수 있다.
본 발명의 선별 시스템의 다른 구체예에서, 이중-가닥 RNA에 반응하여 인산화되는 실험 돌연변이 바이러스(예, IRF-3)로 감염시킨 후, IFN 경로 성분의 인산화 상태를 측정하여 IFN 반응의 유도를 측정할 수 있다. I형 IFN(Jak1 키나아제와 TyK2 키나아제)에 반응하여, IFN 수용체의 소단위 STAT1과 STAT2는 급속하게 티로신 인산화된다. 따라서, 돌연변이 바이러스가 IFN 반응을 유도하는 지를 측정하기 위하여, 293세포와 같은 세포는 실험 돌연변이 바이러스로 감염시키고, 감염후, 세포는 용해시킨다. IFN 경로 성분, 예를 들면, Jak1 키나아제 또는 TyK2 키나아제는 특이적 다클론 혈청 또는 항체를 이용하여 감염된 세포 용해질로부터 면역침전시키고, 상기 키나아제의 티로신 인산화 상태는 항-인산티로신 항체를 이용한 면역블랏 분석법으로 측정한다(Kirshnan et al. 1997, Eur. J. Biochem. 247:298-305). 돌연변이 바이러스 감염후 IFN 경로의 임의 성분의 향상된 인산화 상태는 돌연변이 바이러스에 의한 IFN 경로 유도를 시사한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 선별 시스템에는 특이적 DNA 서열에 결합하는 능력 또는 바이러스 감염에 반응하여 유도된 전사 인자, 예를 들면, IRF3, STAT1, STAT2등의 전좌를 측정하는 것이 포함된다. 특히, STAT1과 STAT2는 인산화되고, I형 IFN에 반응하여 세포질로부터 핵으로 전좌된다. 특이적 DNA와 결합하는 능력 또는 전사인자의 전좌는 당업자에게 공지된 기술, 예를 들면, 전기유동 겔 이동 분석, 세포 염색등으로 측정할 수 있다.
본 발명의 선별 시스템의 또 다른 구체예에서, IFN 반응의 유도는 실험 돌연 변이 바이러스로 감염시킨후, IFN-의존한 전사 활성화를 측정하여 결정한다. 이 구체예에서, IFN에 유도되는 것으로 알려진 유전자, 예를 들면, Mx, PKR, 2-5-올리고아데닐레이트합성효소, 주요 조직적합성 복합체(MHC) I형 등의 발현은 당업자에게 공지된 기술(예, 노잔 블랏, 웨스턴 블랏, PCR등)로 분석할 수 있다. 대안으로, 사람 배아 신장 세포 또는 사람 골발생 육종 세포와 같은 실험 세포는 인터페론 자극한 반응 요소, 예를 들면, ISG-54K 유전자의 IFN-촉진 프로모터의 조절하에, 루시페라제 리포터 유전자 또는 클로람페니콜 전이효소(CAT) 리포터 유전자와 같은 리포터 유전자를 임시로 또는 구조적으로 발현하도록 조작한다(Bluyssen et al., 1994, Eur. J. Biochem. 220:395-402). 세포는 실험 돌연변이 바이러스로 감염시키고, 비감염된 세포 또는 야생형 바이러스로 감염된 세포의 발현수준과 리포터 유전자의 발현 수준을 비교한다. 실험 바이러스로 감염시킨 후, 리포터 유전자의 발현 수준 증가는 실험 돌연변이 바이러스가 IFN 반응을 유도한다는 것을 시사한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 선별 시스템에는 실험 바이러스로 감염시킨 세포 또는 난에서 얻은 추출물이 바이러스 감염에 대한 보호를 제공할 수 있는지를 측정함으로써 IFN 유도를 측정하는 것이 포함된다. 좀더 구체적으로, 10일된 미발달 계란 군은 실험 돌연변이 바이러스 또는 야생형 바이러스로 감염시킨다. 감염 15 내지 20시간후, 요막액은 수거하고, 조직 배양 세포(예, CEF 세포)에서 VSV 감염에 대한 보호활성을 보유하는 최대 희석도를 측정하여 IFN 활성을 검사하였다.
5.3 인터페론 결손된 성장 기질에서 바이러스의 증식
본 발명에는 또한, 변형된 IFN 길항활성을 보유한 자연 발생 또는 조작된 돌연변이 바이러스의 성장과 분리를 위한 IFN-결손된 기질이 포함된다. 약독화된 돌연변이 바이러스의 성장을 뒷받침하는데 사용할 수 있는 IFN-결손된 기질에는 자연 발생 세포, 세포주, IFN 결손된 동물이나 미발달 난(예, Vero 세포), 어린 미발달 난; IFN이 결손되도록 조작된 재조합 세포 또는 세포주(예, STAT1 녹아웃 생쥐 도는 다른 유사하게 조작된 외래유전자도입 동물로부터 유래된 IFN-결손된 세포주); IFN 결손된 새, 특히, IFN이 결손되어 태어난 새 또는 외래유전자도입 새를 비롯한 가금(예, 닭, 오리, 칠면조)으로부터 수득한 미발달 난이 포함되지만, 이들에 국한시키지 않는다. 대안으로, 숙주계, 세포, 세포주, 난 또는 동물은 IFN 시스템의 저해물질, 예를 들면, DNA 결합 도메인이 결핍된 STAT1과 같은 네거티브 위주의 돌연변이체, 안티센스 RNA, 리보자임, IFN 생산의 저해물질, IFN 신호발생의 저해물질 또는 IFN에 의해 유도된 항바이러스 유전자의 저해물질을 인코드하는 외래도입유전자를 발현하도록 유전자조작할 수 있다. IFN이 결손되어 태어난 또는 결손되도록 유전자조작된 동물은 다소 면역이 약화되기 때문에 통제된 무질병 환경에서 보관해야 한다. 따라서, 외래유전자도입 IFN 결손된 동물, 예를 들면, 부화하는 암탉, 오리, 칠면조의 감염원에 대한 노출 위험을 최소화시키기 위한 적절한 조치를 취해야 한다. 대안으로, 숙주계, 예를 들면, 세포, 세포주, 난 또는 동물은 IFN 생산 또는 IFN 경로를 저해하는 화합물, 예를 들면, 약물, 항체, 안티센스 분자, STAT1 유전자를 표적으로 하는 리보자임 분자, 또는 IFN에 의해 유도된 항바이러스 유전자로 처리할 수 있다.
본 발명에 따라, 미숙한 미발달 계란에는 자연 과정으로 10일이 되지 않은, 바람직하게는 6 내지 9일된 난 및 성장 조건에 대한 변화, 예를 들면, 배양 온도의 변화; 약물처리; 또는 발달 저해된 난을 유발하는 임의 다른 변형의 결과로 난의 IFN 시스템이 10 내지 12일된 난과 비교할 때 완전히 발달되지 않음으로써 미성숙 난을 인공적으로 모방시킨 난이 포함된다.
5.3.1 자연적으로 IFN 결손된 기질
한 구체예에서, 본 발명은 비통상적인 기질, 예를 들면, IFN 시스템이 발달하지 않은 미성숙 미발달 난에서 자연발생 및 조작된 돌연변이 바이러스에 관한다. 미성숙 미발달 난은 일반적으로 연약한 조건과 소량의 요막부피로 인해, 바이러스를 성장시키는데 사용하지 않는다. 본 발명에는 10일미만의 미발달 난, 바람직하게는 8일된 미발달 난, 가장 바람직하게는 6 내지 8일된 난에서 돌연변이 바이러스를 성장시키는 것이 포함된다.
본 발명에는 또한, IFN 경로를 보유하지 않는, 결손된 IFN 경로를 보유한 또는 IFN 시스템이 결핍된(예, 야생형 세포에 비하여 IFN 발현 수준이 낮은) 세포 또는 세포주에서, 변형된 IFN 길항활성을 보유한 돌연변이 바이러스를 성장시키고 분리하는 방법이 포함된다. 특히 바람직한 구체예에서, 본 발명은 Vero 세포에서 변형된 IFN 길항활성을 보유한 돌연변이 바이러스를 성장시키는 방법에 관하다.
5.3.2 유전자조작된 IFN 결손 기질
본 발명은 유전자조작된 IFN 결손 기질에서 변형된 IFN 길항활성을 보유한 돌연변이 바이러스를 성장시키고 분리하는 방법에 관한다. 본 발명에는 IFN 결손 된 난을 낳는 외래유전자도입 조류가 포함되는데, 여기서, IFN 시스템에 필수적인 유전자, 예를 들면, STAT1이 돌연변이된다. 본 발명에는 또한, 네거티브 주도의 전사 인자, 예를 들면, DNA 결합 도메인이 결핍된 STAT1, 리보자임, 안티센스 RNA, IFN 생산의 저해물질, IFN 신호의 저해물질, IFN에 반응하여 유도된 항바이러스 유전자의 저해물질을 발현하는 외래유전자도입 조류가 포함된다. IFN-결손된 외래유전자도입 조류에서 얻은 난을 이용하는 장점은 통상의 10일된 난이 크기 때문에, 좀더 안정적이고 더 큰 부피를 보유한 바이러스를 성장시킬 수 있다는 점이다. 다른 구체예에서, 세포주는 IFN이 결손되도록 유전자조작할 수 있다. 본 발명에는 IFN 합성에 필수적인 유전자, IFN 경로 또는 IFN에 유도된 항바이러스 유전자, 예를 들면, STAT1이 돌연변이된 세포주가 포함된다.
본 발명은 재조합 세포주 또는 동물, 특히, 조류를 제공하는데, 여기서, IFN 경로에 필수적인 하나 또는 복수의 유전자, 예를 들면, 인터페론 수용체, STAT1등이 파괴된, 다시 말하면, "녹아웃"된다; 재조합 동물은 임의의 동물에서 선택할 수 있지만, 적절한 구체예는 조류, 예를 들면, 닭, 칠면조, 암탉, 오리등이 된다(Sang, 1994, Trends Biotechnol. 12:415; Perry, et al., 1993, Transgenic Res. 2:125; Stern, C.D., 1996, Curr Top Microbiol Immunol 212:195-206; and Shuman, 1991, Experientia 47:897 for reviews regarding the production of avian transgenics). 이런 세포주 또는 동물은 세포 또는 동물의 크로모좀에서 유전자를 파괴하는 당분야에 공지된 임의의 방법으로 만들 수 있다. 이런 기술에는 전핵 미세주사(Hoppe & Wagner, 1989, U.S. Pat. No. 4,873,191); 생식세포계로의 레트로바이러스 매개된 유전자 전이(Van der Putten et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82:6148-6152); 배아 간세포에서 유전자 표적화(Thompson et al., 1989, Cell 56:313); 배아의 에렉트로포레이션(Lo, 1993, Mol Cell. Biol. 3:1803); 정액-매개된 유전자 전이(Lavitrano et al., 1989, Cell 57:717)등이 포함되지만, 이들에 국한시키지 않는다. 이런 기술의 검토해 보려면, Gordon, 1989, Transgenic Animals, Intl. Rev. Cytol. 115:171을 참고한다.
특히, STAT1 녹아웃 동물은 크로모좀상의 STAT1 유전자와 생물학적으로 불활화된(가급적, 이형이질성 서열, 예를 들면, 항생제 저항성 유전자 삽입) 외인성 STAT1 유전자사이의 상동성 재조합을 촉진하여 만들 수 있다. 생쥐 게놈상의 유전자를 파괴하는 상동성 재조합 방법은 Capecchi(1989, Science 244:1288)와 Mansour 등(1988, Nature 336:348)에서 제시한다.
간단히 말하면, STAT1 게놈 클론의 전부 또는 일부는 녹아웃 세포 또는 동물과 동일한 종으로부터 게놈 DNA로부터 분리한다. STAT1 게놈 클론은 게놈 클론의 분리를 위해 당분야에 공지된 임의의 방법(예, Meraz et al., 1996, Cell 84:431; Durbin et al. 1996, Cell 84:443에서 제시한 서열과 같은 STAT1 서열로부터 유래된 프로브로 게놈 라이브러리 조사)으로 분리할 수 있다. 일단 게놈 클론이 분리되면, 클론의 전부 또는 일부는 재조합 벡터로 도입한다. 가급적, 벡터로 도입되는 클론 부분은 STAT1 유전자의 엑손 일부를 적어도 보유한다, 다시 말하면, STAT1 단백질 코딩 서열을 보유한다. 이후, STAT1 서열과 상동하지 않은 서열, 가급적, 항생제 저항성 유전자를 인코드하는 유전자와 같은 파지티브 저항성 마크는 STAT1 유전자 엑손으로 도입한다. 선별가능 마크는 프로모터, 좀더 바람직하게는 구조성 프로모터에 실시가능하게 연결시킨다. 비-상동성 서열은 STAT1 활성을 파괴하는 STAT1 코딩 서열상의 임의 위치, 예를 들면, 점 돌연변이 또는 다른 돌연변이가 발생하여 STAT1 단백질 기능이 불활화되는 위치에 도입한다. 가령, 비-상동성 서열은 키나아제 도메인의 전부 또는 일부를 보유한 STAT1 단백질의 일부분에 대한 코딩 서열(예, 키나아제 도메인의 적어도 50, 100, 150, 200 또는 250개 아미노산을 코딩한 뉴클레오티드 서열)로 삽입할 수 있다.
파지티브 선별가능 마크는 가급적, 네오마이신 저항성 유전자(neo 유전자) 또는 히그로마이신 저항성 유전자(hygro 유전자)가 된다. 프로모터는 당분야에 공지된 임의의 프로모터, 예를 들면, 인산글리세리트 키나아제(PGK) 프로모터(Adra et al., 1987, Gene 60:65-74), PolII 프로모터(Soriano et al., 1991. Cell 64:693-701) 또는 MC1 프로모터(배아-유래된 간세포에서 발현을 위해 고안된 합성 프로모터)를 사용한다(Thomas & Capecchi, 1987, Cell 51:503-512). 항생제 저항성 유전자와 같은 선별가능 마크를 사용하면, 표적 벡터를 통합한 세포를 선별할 수 있다(예, neo 유전자 산물의 발현은 G418에 대한 저항성을 공여하고, hygro 유전자 산물의 발현은 히그로마이신에 대한 저항성을 공여한다).
적절한 구체예에서, 벡터의 비-상동성 재조합과는 반대로 벡터의 상동성 재조합에 대한 대응선별 단계를 위한 네거티브 선별가능 마크는 STAT1 게놈 클론 삽입체의 외부에 삽입한다. 가령, 네거티브 선별가능 마크는 HSV 티미딘 키나아제 유전자(HSV-tk)인 경우, 이것이 발현되면 세포는 간시클로비르에 감수성을 나타내 게 된다. 네거티브 선별가능 마크는 가급적, 프로모터로 조절하는데, 이런 프로모터에는 PGK 프로모터, PolIII 프로모터 또는 MC1 프로모터가 포함되지만, 이들에 국한시키지 않는다.
상동성 재조합이 일어나면, STAT1 유전자와 상동한 벡터의 일부와 STAT1 유전자 서열내 비-상동성 삽입체는 크로모좀상의 STAT1 유전자에 통합되고, 벡터의 나머지 부분은 소멸된다. 따라서, 네거티브 선별가능 마크는 STAT1 유전자와 상동한 영역외부에 존재하기 때문에 상동성 재조합이 일어나는 세포는 네거티브 선별가능 마크를 보유하지 않게 된다. 가령, 네거티브 선별가능 마크가 HSV-tk인 경우, 상동성 재조합이 일어난 세포는 티미딘 키나아제를 발현하지 않고, 간시클로비르에 대한 노출을 극복하게 된다. 이런 과정을 통하여, 상동성 STAT1 서열과 파지티브 선별가능 마크와 함께 네거티브 선별가능 마크가 게놈에 통합될 가능성이 높은 비-상동성 재조합에 비하여, 상동성 재조합이 발생한 세포의 선별이 용이하다. 따라서, 비-상동성 재조합이 일어난 세포는 티미딘 키나아제를 발현하고 간시클로비르에 감수성을 나타낼 가능성이 매우 높다.
일단 표적 벡터가 만들어지면, 이것은 표적 벡터상의 유일 위치가 존재하는 제한 효소로 선형화시키고, 선형화된 벡터는 당분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들면, 에렉트로포레인션으로 배아-유도된 간(ES) 세포로 도입한다(gossler et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9065-9069). 표적 벡터가 파지티브 선별가능 마크와 네거티브 대응선별가능 마크를 보유한 경우, 상동성 재조합이 일어난 ES 세포는 선별배지에서 배양하여 선별할 수 있다. 가령, 선별가능 마크가 neo 저항 성 유전자와 HSV-tk 유전자인 경우, 세포는 G418(예, 대략 300㎍/ml)과 간시클로비르(예, 대략 2μM)에 노출시킨다.
유전형표현을 위해 당분야에 공지된 임의의 기술, 예를 들면, 서잔 블랏 분석 또는 중합효소 연쇄 반응을 이용하여, 파괴된 STAT1 서열이 ES 게놈상의 STAT1 유전자로 상동성 재조합되는지를 확인할 수 있다. STAT1 게놈 클론의 제한 지도 및 STAT1 코딩 서열의 서열이 공지되어 있기 때문에(Meraz et al., 1996, Cell 84:431; Durbin et al., 1996, Cell 84:443-450), 파괴된 대립유전자와 파괴되지 않은 대립유전자로부터 얻은 DNA에서 만들어진 특정 제한 단편 또는 PCR 증폭 산물을 측정할 수 있다. 따라서, PCR 산물의 제한 단편에 대하여 파괴된 STAT1 유전자와 파괴되지 않은 STAT1 유전자의 상이한 크기를 분석함으로써, 상동성 재조합이 발생하여 STAT1 유전자가 파괴되었는지를 측정할 수 있다.
이후, 파괴된 STAT1 좌위를 보유한 ES는 미세주사로 포배에 도입하고, 상기 포배는 통상의 기술을 이용하여 가임신한 생쥐의 자궁에 이식할 수 있다. 이식된 포배로부터 발달된 동물은 파괴된 대립유전자에 대하여 키메라가 된다. 키메라 수컷은 암컷과 교미할 수 있는데, 이런 교미는 대립 유전자의 생식세포계 전달이 특정 외피색깔의 전달과 연결되도록 고안할 수 있다. 대립유전자의 생식세포계 전달은 전술한 바와 같이 조직 샘플로부터 분리된 게놈 DNA의 서잔 블라팅 또는 PCR 분석으로 확인할 수 있다.
5.3.3 일시적으로 IFN 결손된 기질
세포, 세포주, 동물 또는 난은 IFN 시스템을 저해하는 화합물로 사전 처리할 수 있다. 본 발명에 따라, IFN의 합성 또는 IFN 시스템 성분의 활성이나 발현을 저해하는 화합물, 예를 들면, IFN의 합성, IFN의 활성, IFN 수용체, IFN 신호전달 경로상의 다른 표적을 저해하는 화합물 또는 IFN에 의해 유도된 항바이러스 유전자의 활성을 저해하는 화합물을 사용하여 숙주를 사전처리할 수 있다. 본 발명에 따라 사용하는 화합물의 예로는 핵산 분자, 항체, 펩티드, IFN 수용체의 길항물질, STAT1 경로의 저해물질, PKR의 저해물질등을 들 수 있지만, 이들에 국한시키지 않는다. 본 발명에 따른 핵산 분자에는 IFN 시스템의 필수 성분을 인코드하는 유전자, 예를 들면, STAT1을 표적으로 하는 안티센스 분자, 리보자임, 삼중 나선 분자가 포함된다. 핵산 분자에는 또한, IFN 시스템 성분의 네거티브 주도의 돌연변이체를 인코드하는 뉴클레오티드가 포함된다; 예를 들면, 바이러스 돌연변이체로 감염시키기 전에, 세포는 IFN 수용체의 절두된 신호발생무능 돌연변이체를 인코드하는 DNA로 트랜스펙션시킬 수 있다.
본 발명에서 IFN 경로를 저해하기 위하여 사용하는 네거티브 주도의 돌연변이체에는 Jak1의 키나아제 결손형, TyK2 또는 DNA 결합 도메인 STAT1과 STAT2가 결핍된 전사 인자가 포함된다(Krishnan et al., 1997, Eur. J. Biochem. 247:298-305).
5.4. 백신 조성물
본 발명은 세포의 IFN 반응을 길항하는 손상된 능력을 가지는 약독화된 네거티브 가닥 RNA 및 적절한 부형제로 구성된 백신 조성물을 포함한다. 백신 조성물에 이용되는 바이러스는 자연발생 돌연변이 또는 변이체, 돌연변이된 바이러스 또 는 유전자조작된 바이러스에서 선택될 수 있다. 재분류 기술을 이용하여, 분절화된 RNA 바이러스의 약독화된 균주를 만들 수 있다. 자연 발생되는 변이체에는 자연으로부터 분리된 바이러스뿐만 아니라 바이러스 번식동안에 발생되는 자발적으로 발생되는 변이체가 포함되는데, 이들은 세포 IFN 반응을 길항하는 능력이 손상된 것들이다. 약독화된 바이러스 자체를 백신 조성물에 활성 성분으로 이용할 수도 있다. 또는, 약독화된 바이러스를 벡터로 이용하거나 재조합으로 만들어질 백신의 "기본골격"으로 이용할 수 있다. 이를 위해서, 역 유전학(또는 분절화된 바이러스의 경우에, 역 유전학 및 재분류 기술을 복합하여)과 같은 재조합 기술을 이용하여, 돌연변이를 조작하거나 외부 항원을 백신 조성물에 이용되는 약독화된 바이러스로 도입시킬 수 있다. 이와 같은 방식으로 균주 변이체에 대해 면역을 가지는 백신을 고안하거나 또는 여러 감염성 물질 또는 질환 항원에 완전하게 대항할 수 있는 백신을 고안할 수 있다.
실제, 임의 이형 유전자 서열은 백신으로 이용하기 위해 본 발명의 바이러스내로 작제할 수 있다. 바람직하게는, 다양한 병원균중 일부 또는 중화 항체에 결합할 수 있는 항원에 대해 보호성 면역 반응을 유도할 수 있는 에피토프를 바이러스에 의해 또는 바이러스의 일부분으로 발현시킬 수 있다. 예를 들면, 백신으로 이용하기 위해 본 발명의 바이러스내로 작제될 이형 유전자 서열에는 사람의 면역결핍 바이러스(HIV)의 에피토프 가령, gp120; 간염 B 바이러스 표면 항원(HBsAg); 허피스 바이러스의 당단백질(gD, gE); 폴리오바이러스의 VP1; 박테리아 및 기생충과 같은 비-바이러스성 병원균의 항원 결정부위등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. 또 다른 구체예에서, 면역글로블린 유전자의 전부 또는 일부가 발현될 수 있다. 예를 들면, 이와 같은 에피토프를 닮은 항-이디오타입 면역글로블린의 다양한 부위를 본 발명의 바이러스내로 작제할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 종양과 관련된 항원을 발현시킬 수도 있다.
살아있는 재조합 바이러스성 백신 또는 비활성화된 재조합 바이러스성 백신으로 조제할 수 있다. 숙주에서 다중 복제함으로써 자연 감염의 경우에 발생하는 것과 유사한 종류 및 정도의 연장된 자극이 있어, 실제 장시간 면역성을 부여하기 때문에 살아있는 백신이 더 바람직하다. 이와 같은 살아있는 재조합 바이러스 백신 조제물은 세포 배양물에서 바이러스를 증식시키거나 병아리 배의 요막에서 증식시키고 정제하는 과정등의 통상의 방법을 통하여, 만들 수 있다.
백신 조제물에는 NS1 또는 유사한 유전자 가령, 실시예에서 설명하는 절두형 NS1 인플루엔자 돌연변이체를 포함하는 돌연변이를 가지는 유전공학적으로 조작된 네거티브 가닥 RNA 바이러스가 포함된다. 이들은 A/turkey/Ore/71 인플루엔자 A의 자연 변이체, 인플루엔자 B의 자연 변이체인 B/201, B/AWBY-234와 같은 자연 변이체를 이용하여 조제할 수 있다. 살아있는 바이러스 백신으로 조제할 경우에, 약량당 약 104 pfu 내지 5x106 pfu 범위가 이용된다.
상기에서 설명하는 백신 조제물을 도입시키는데에는 많은 방법이 이용될 수 있는데, 예를 들면, 비강내, 기관내, 경구, 피하, 근육, 복막, 정맥, 피하 경로를 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 바람직한 방법으로는 백신이 고안된 병원균 의 자연 감염 경로를 통하여 또는 부계의 약독화된 바이러스가 감염되는 자연 경로를 통하여 바이러스 백신 조제물을 도입시키는 것이다. 살아있는 인플루엔자 바이러스 백신 조제물이 이용되는 경우에, 인플루엔자 바이러스의 자연 감염 경로를 통하여 도입시키는 것이 바람직하다. 예를 들면, 인플루엔자 바이러스가 호흡기 기관으로 감염되는 경우에, 비뇨생식기관에서 강한 분비성 면역 반응을 유도하여, 특정 질병을 유발시키는 물질에 대해 보호하게 된다.
본 발명의 변경된 IFN 길항활성을 가지는 104 내지 5x106 pfu의 돌연변이된 바이러스를 1회 투여할 수 있다. 또는, 변경된 IFN 길항활성을 가지는 104 - 5x106 pfu로 구성된 돌연변이된 바이러스는 약량 범위내에서 2 내지 6개월 간격으로 2회 또는 3회로 나누어서 투여될 수 있다. 또는 변경된 IFN 길항활성을 가지는 104 - 5x106 pfu 돌연변이된 바이러스는 동물 적절하게는 포유류, 가장 바람직하게는 사람에서 필요할 때마나 투여될 수 있다.
5.5. 제약학적 조성물.
본 발명은 IFN-감응성 질병에 대한 물질 또는 항-종양 물질 또는 항-바이러스 물질로 이용할 수 있는 IFN 길항활성이 변경된 돌연변이 바이러스로 구성된 제약학적 조성물을 포함한다. 제약학적 조성물은 항-바이러스 예방에 유용하고, 이를 바이러스에 감염된 또는 바이러스에 감염될 것으로 예상되는 개체에 투여할 수 있다. 예를 들면, 학급에 몇몇 감기에 걸린 친구와 접촉한 후 집으로 귀가한 아이 의 경우에, 부모는 본 발명의 항-바이러스성 제약학적 조성물을 아이를 포함한 가족 구성원에 투여하여, 바이러스 감염으로 인한 부차적인 질병을 예방할 수 있다. 특정 질병(가령, 간염 A 바이러스, 말라리아등)이 만연하는 지역으로 여행을 가는 사람의 경우에도 이를 이용할 수 있다.
또는, 제약학적 조성물을 이용하여, 암 환자 또는 신조직형성 또는 암 발생 위험이 상당히 높은 사람에서 종양을 치료하거나 종양 형성을 예방할 수 있다. 예를 들면, 암 환자는 추가로 종양이 형성되지 않도록 치료를 받을 수 있다. 또는, 암발생 요인에 노출된 또는 노출된 것으로 예상이 되는 개체를 치료할 수도 있다; 오염물질(석면)에 노출될 수 있는 환경 청소업에 관계하는 사람의 경우에도 치료를 받을 수 있다. 또는 방사능에 노출된 사람을 노출전에 또는 노출후에 치료를 할 수 있다(가령, 상당량의 방사능에 노출된 환자 또는 발암성 약물을 복용한 사람).
본 발명의 약독화된 바이러스를 항종양제로 이용할 수 있는 것은 출원인이 IFN-길항 유전자를 포함하는 약독화된 인플루엔자 바이러스 돌연변이가 생쥐에서 종양 발생을 억제할 수 있다는 것을 발견한 것에 기초한다. 또는 본 발명의 약독화된 바이러스의 항종양 성질은 종양 세포에서 특이적으로 생장하여, 종양세포를 죽이는 이들의 능력 때문인데, 이들의 대부분은 IFN 시스템에 결함을 가지는 것으로 알려져 있다. 항종양 성질을 맞고 있는 약독화된 바이러스는 이용하여 종양을 치료하거나 또는 종양 형성을 억제할 수 있을 것이다.
본 발명은 또한, IFN-길항 표현형이 변형된 돌연변이 바이러스를 포함하는데, 이들은 신체의 특정 기관, 조직 또는 세포로 향하게 하여, 국소적으로 치료요 법적 또는 예방적 효과를 유도할 수 있다. 이와 같은 방법의 한 가지 장점으로는 본 발명의 IFN 유도성 바이러스는 특정 부위 가령, 종양 위치로 향하게 하여, 독성 효과를 가지는 IFN을 전신에서 유도하기보다는 치료요법적 효과를 가지는 독특한 방식으로 그 부위에서 IFN을 유도할 수 있다는 것이다.
본 발명의 돌연변이 IFN 유도성 바이러스는 특정 부위로 바이러스를 향하게 할 수 있는 단백질 또는 펩티드를 발현시키기 위해 여기에서 설명하는 방법을 이용하여 만들 수 있다. 적절한 구체예에서, IFN-유도성 바이러스를 종양 부위로 향하게 할 수 있다. 이와 같은 구체예에서, 돌연변이 바이러스는 종양 특이적인 항원을 인지하는 항체와 항원이 복합되도록 하여, 종양으로 IFN-유도성 바이러스를 향하게 하는 것이다. 또 다른 구체예에서, 표적으로 하는 종양이 에스트로겐 수용체를 발현시킬 수 있는 유방 또는 난소 종양과 같은 종양이 호르몬 수용체를 발현시키는 경우에, IFN-유도성 바이러스가 적절한 호르몬을 발현할 수 있도록 조작하는 것이다. 또 다른 구체예에서는 표적이 되는 종양이 VEGF, EGF, PDGF와 같은 생장 인자에 대한 수용체를 발현하는 경우에, IFN-유도성 바이러스를 생장 인자 또는 이의 일부분을 발현시킬 수 있도록 조작할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명에 따라, IFN-유도성 바이러스는 효소, 호르몬, 생장인자, 항원 또는 항체와 같은 펩티드 또는 단백질을 포함하는 임의 표적 유전자 생성물을 발현하도록 조작하여, 바이러스가 항-바이러스, 항박테리아성, 항-미생물성 또는 항-암 활성을 필요로 하는 부위로 향하게 하는 것이다.
도입 방법에는 경피, 근육내, 복막내, 정맥내, 피내, 비강내, 경막밖, 구강 경로를 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 본 발명의 제약학적 조성물은 임의 편리한 경로를 통하여 투여할 수 있는데, 가령, 주입, 볼 주사, 상피 또는 점막 라이닝을 통하여 흡수(가령, 구강 점막, 직장, 내장 점막등)시킬 수 있고, 또는 다른 생물학적으로 활성이 있는 물질과 함께 투여할 수 있다. 투여는 전신 또는 국소적으로 이루어질 수 있다. 또한, 적절한 구체예에서, 본 발명의 제약학적 조성물은 임의 적절한 경로를 통하여 폐로 도입될 수 있다. 흡입기 또는 분무기를 이용하여 또는 에어로졸화 물질로 제조하여, 폐로 투여할 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 제약학적 조성물은 치료를 요하는 부위에 국소적으로 투여하는 것이 바람직한데, 예를 들면, 외과술 동안에 국소 주입, 외과술 후에 상처 드레싱과 함께 국소 이용, 주사, 카테테르를 이용, 좌약, 이식물을 이용하여 실시할 수 있는데, 이식물을 이용하는 경우에, 이식물은 다공성 또는 비다공성 또는 젤라틴성 재질 예를 들면, 시알라스틱 막, 섬유를 포함하는 재질이 된다. 한 구체예에서, 악성 종양 또는 신형성 또는 전-신형성 조직 부위로 직접 주사하여 투여할 수도 있다.
또 다른 구체예에서, 제약학적 조성물은 방출이 조절되는 시스템을 이용하여 운반될 수도 있다. 한 구체예에서, 펌프를 이용할 수 있다(see Langer, super; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Seudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). 또 다른 구체예에서는, 고분자 재질이 이용되었다(see Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Produat Design and Performance, Smolen and Bal (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger & Peppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; see also Levy et al., 1985; Science 228:190; During et al, 1989, Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105). 또 다른 구체예에서는 조성물이 표적으로 하는 예를 들면, 폐의 전단에 방출이 조절되는 시스템을 배치시킨다(see, e.g., Goodson, 1984, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138). Langer(1990, Science 249:1527-1533)에서 언급한 것과 같이 다른 형태의 방출이 조절되는 시스템을 이용할 수 있다.
본 발명의 제약학적 조성물은 치료요법적으로 효과량의 약독화된 바이러스와 제약학적으로 수용 가능한 담체로 구성된다. 특정 구체예에서, "제약학적으로 수용가능한"은 미국의 약전 및 다른 일반적으로 인지된 약전에서 동물 특히 사람에서 이용할 수 있는 연방 정부 또는 주 정부가 승인한 일반적인 물질을 의미한다. "담체"는 제약학적 조성물과 함께 투여되는 희석액, 어쥬번트, 부형제, 또는 운반체를 말하는 것이다. 염용액, 수용성 덱스트로즈, 글리세롤 용액이 액체 담체 적절하게는 주사용 용액으로 이용될 수 있다. 적절한 제약학적 부형제에는 전분, 포도당, 락토즈, 슈크로즈, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 호분, 실리카겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤, 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조된 탈지 우유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올등이 포함된다. 이와 같은 조성물은 용액, 현탁액, 에멸젼, 정제, 알약, 캡슐, 분말, 지연 방출형 조제물의 형태로 만들어질 수 있다. 경구 조제물에는 제약학적으로 이용될 수 있는 만니톨, 락토즈, 전분, 스테아르산 마그네슘, 사카린 나트륨, 셀룰로오즈, 탄산 마그네슘등과 같은 표준 담체가 포함된다. 적절한 제약학적 담체는 "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W.Martin에서 설명하고 있다. 이와 같은 조성물에는 치료에 효과적인 약이 정제된 상태로 포함되는데 이때 적절한 양의 담체가 포함되어, 환자로 적절한 투여형에 맞게 만들 수 있게 된다. 조제물은 투여 방식에 맞아야 한다.
특정 질환 또는 질병을 치료하는데 효과적인 본 발명의 제약학적 조성물의 양은 질병의 성질에 따라 달라지기 때문에, 표준 임상 기술로 결정하면 된다. 또한, in vitro 검사를 적절하게 이용하여, 최적의 약량 범위를 결정할 수 있다. 조제물에 이용되는 정확한 약량은 투여 경로, 질병의 심각성에 따라 달라지기 때문에, 각 환자의 상태에 맞게 주치의가 판단해야 한다. 그러나, 투여하기에 적절한 약량 범위는 일반적으로 104 - 5x106 pfu가 되고, 이를 1회 투여하거나 또는 필요할 때마다 투여할 수 있다. 본 발명의 제약학적 조성물은 IFN 길항활성이 변경된 104 - 5x106 pfu 돌연변이 바이러스로 구성되어, 비강, 관내 또는 근육내 또는 피하로 투여할 수 있다. 효과적인 약량은 in vitro 또는 동물 모델에서 유도한 약량 반응 곡선으로부터 외삽하여 얻을 수 있다.
6. 실시예; 인플루엔자 A 바이러스의 NS1 절두형 돌연변이 생성 및 이의 특징
6.1. 재료 및 방법.
인플루엔자 A/PR/8/34 (PR8) 바이러스를 37℃에서 10일된 병아리 미발달 난에서 증식시켰다. 인플루엔자 25A-1 바이러스(차가운 것에 적응이 된 균주 A/Leningrad/134/47/57의 NS 단편 및 PR8 바이러스 (Egorov et al., 1994, Vopr. Virusol. 39:201-205; Shaw et al., 1996, in Options of the control of influenza III, eds. Brown, Hampson Webster (Elsevier Science) pp. 433-436)의 나머지 유전자를 포함하는 바이러스)를 Vero 세포에서 34℃상에서 생장시켰다. 25A-1 바이러스는 포유류 세포에서 온도 감응성이 있어, NS1/99 트렌스펙션된 바이러스를 얻기 위한 헬퍼 바이러스로 이용된다. Vero 세포 및 MDCK 세포를 최소 필수 배지(MEM)에 1㎍/ml 트립신(Difco Laboratories, Detroid, Michigan)을 보충시킨 것에 유지시킨 다음 이를 인플루엔자 바이러스 생장에 이용하였다. Vero 세포는 또한, NS1/99 바이러스의 선별, 플라크 형성, 역가를 측정하는데 이용한다. MDCK 세포는 DMEM(Dulbecco's 최소 필수 배지)에 10% 열-변성시킨 태아 송아지 혈청을 넣은 배지에 유지시킨다. Vero 세포는 AIM-V 배지상에서 생장시켰다(Life Technologies, Grand Island, NY).
플라스미드 pT3NS1/99(99개 아미노산으로된 NS1의 C-말단 절두형을 포함하는 플라스미드)는 다음과 같이 만들 수 있다. 우선, 적절한 프라이머를 이용하여, pPUC19-T3/NS PR8(PR 바이러스의 완전한 NS 유전자와 이에 접하여, T3 RNA 중합효소 프로모터 및 BpuAI 제한효소 부위를 포함)을 역 PCR을 이용하여 증폭시켰다(Ochman et al., 1988, Genetics 120:621-623). 따라서, 수득된 cDNA는 절두형 NS1 유전자를 가지고 있고, 이를 인산화시킨 후에, Klenow로 처리하고, 자 체 결찰시켜, E. coli 균주 TG1에서 증식시켰다. 정제후에 수득된 구조체는 pT3NS1/99라고 명명하고, 서열을 조사하여 확인하였다. PR8 바이러스의 NP, PB1, PB2, PA 단백질 발현을 위한 플라스미드(pHMG-NP, pHMG-PB1, pHMG-PB2, pHMG-PA)는 이미 설명된 바 있다(Pleschka et al., 1996, J. Virol. 70:4188-4192). pPOLI-NS-RB CAT는 인플루엔자 A/WSN/33(WSN) 바이러스의 NS유전자의 코딩 부분으로부터 유도된 RT-PCR 생성물내에 pPOLI-CAT-TR(Pleschka et al., 1996, J. Virol. 70:4188-4192)의 CAT 오픈 리딩 프레임을 치환시켜 만들었다. 이 플라스미드는 절두된 사람 중합효소 I 프로모터의 조절하에서 WSN 바이러스의 NS-특이적인 바이러스성 RNA를 발현시킨다.
NS1/99 바이러스는 리보뉴클레오단백질(RNP) 트렌스펙션을 이용하여 만들 수 있다(Luytjes et al., 1989, Cell 59:1107-1113). RNP는 정제된 핵단백질 및 인플루엔자 25A-1 바이러스의 중합효소 존재하에 BpuAI로 선형화된 pT3NS1/99의 T3 RNA 중합효소 전사에 의해 만들 수 있다(Enami, et al., 1991, J. Virol.65:2711-2713). RNP 복합체를 이미 25A-1 바이러스에 감염된 Vero 세포로 트렌스펙션시킨다. 트렌스펙션된 세포는 18시간동안 37℃상에서 배양시키고, 상층액은 40℃에서 Vero 세포로 2회 계대하고, 37℃상에서 한천 배지를 덮은 Vero 세포에서 플라크를 3회 정제하였다. 분리된 NS1/99 바이러스는 특정 프라이머를 이용하여, RT-PCR 방법으로 분석하였다. 야생형 트렌스펙션된 바이러스는 다음과 같이 생성한다; 35-mm 배양 접시에 있는 Vero 세포는 이미 설명된 바와 같이(Pleschka et al., 1996, J. Virol. 70:4188-4192), 플라스미드 pHMG-NP, pHMG-PB1, pHMG-PB2, pHMG-PA, pPOLI-NS-RB로 트렌스펙션시켰다. 트렌스펙션 후 2일 뒤에, 세포에 5 x 104pfu의 delNS1 바이러스를 감염시키고, 추가 2일간을 37℃상에서 배양시켰다. 세포 상층액을 MDCK 세포로 1회 계대시키고, 병아리 미발달 난에 2회 계대한다. 트렌스펙션된 바이러스는 난에서 제한 희석에 의해 클론된다. 정제된 NS1/99 트렌스펙션된 바이러스에서 얻은 게놈 RNA는 Zheng et al., 1996, Virology 217:242-251에서 설명하는 것과 같이 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 이용하여 분석하였다. NS1/99 바이러스에 의한 절두형 NS1 단백질 발현은 NS1에 대한 토끼 다클론성 항혈청을 이용한 면역침전 라벨된 감염 세포 추출을 이용하여 확인할 수 있다.
각 6, 10, 14일된 병아리 미발달 난의 요막 강에 약 103 pfu의 PR8, NS1/99, delNS1(전체 NS1이 결손된 것) 바이러스를 접종시키고, 2일간 37℃상에서 배양하여, 요막액에 있는 바이러스를 적혈구 응집(HA) 검사를 이용하여 역가를 측정하였다.
5마리 BALB/c 생쥐(Taconic Farms)군의 비강으로 5x106pfu, 1.5x105pfu, 5x103pfu 야생형 A/PR/8/34(PR8) 또는 NS1/99 바이러스를 접종시켰다. 국소마취하에 적절한 바이러스의 플라크 형성 단위를 포함하는 50㎕ MEM 배지를 이용하여 접종하였다. 동물을 매일 관찰하고, 과격함이 나타날 때, 동물을 죽인다. 연속 실험에서 모든 살아있는 생쥐에 100LD50 약량의 PR8 바이러스를 4주뒤에 제공하였다. 모든 과정은 NIH 지침에 따라 실행되었다.
6.2. 결과: NS1 결손에 의해 인플루엔자 A 바이러스의 약독화
출원인인 이미 NS1 유전자가 결손된 바이러스(delNS1 바이러스)는 Vero 세포와 같은 타입 I 인터페론(IFN) 생산 결함이 있는 세포에 약 107 pfu/ml역가를 가질 수 있을 정도로 생장할 수 있다는 것을 확인한 바 있다. 그러나, 이와 같은 바이러스는 복제 능력이 손상되었고, 이로 인하여 생쥐에서 질병의 원인이 된다(Garcia-Sastre et al., 1998, Virology 252:324). 대조적으로, delNS1 바이러스는 STAT1 -/- 생쥐에서 생장하여, 이를 죽일 수 있다. 이와 같은 결과를 볼 때, 인플루엔자 A 바이러스의 NS1 단백질은 타입 I IFN에 의해 중개되는 숙주의 항-바이러스성 반응을 저해하는데 관계하는 독성인자라는 것을 설명한다. 다음의 실험을 실행하여, NS1 유전자의 일부가 결손됨으로써 야생형과 delNS1 바이러스사이에 독성 특징이 조절되는 인플루엔자 바이러스를 만들 수 있는 지, 그리고 이들 바이러스중에 일부가 인플루엔자 바이러스에 대해 살아있는 약독화된 백신으로 이용될 수 있는 적절한 특징(다시 말하면, 약독화, 면역성사이에 안정성 및 적절한 균형, 병아리 미발달 난과 같은 백신 조제물에 적합한 기질에서 생장할 수 있는 성질)을 가지는 지를 결정할 수 있다.
이와 같은 가설을 테스트하기 위해, 인플루엔자 A/PR/8/34(PR8) 바이러스를 만들었는데, 이는 NS1 유전자가 변형되어, 야생형 NS1단백질의 230개 아미노산과 공통의 아미노 말단에 단지 99개 아미노산을 포함하는 절두형 NS1 단백질를 발현한다. 이와 같은 바이러스(NS1-99)는 Garcia-Sastre et al., 1998, Virology 252:324에서 설명하는 것과 같은 25A-1 헬퍼 바이러스를 이용하여 인공적으로 조작한 NS유전자를 RNP-트렌스펙션시켜 얻을 수 있다. 바이러스 감염된 세포에서, NS1 발현 분석에서 NS1-99 바이러스의 NS1 단백질의 절두된 성질이 나타났다.
delNS1, NS1-99, 야생형 PR8 바이러스가 병아리 미발달 난에서 생장할 수 있는 능력이 있는 지에 대해 테스트하였다. 이 실험은 적절한 자극하에서 타입 I IFN을 합성하고 이에 반응하는 미발달된 난의 능력이 난 의존성이라는 사실에서 나온 것이다. 사실, IFN 유도성 및 반응성은 약 10일경에 시작되고, 그 다음 일수가 증가됨에 따라 기하급수적으로 증가된다(Sekellick et al., 1990, In Vitro Cell. Dev. Biol. 26:997; Sekellick & Marcus, 1985 J.Interferon Res. 5:657). 따라서, 여러 가지 다른 연령대의 난을 이용하여 IFN 반응을 저해하는 여러 가지 다른 바이러스의 능력을 테스트하는 독특한 시스템을 제공할 수 있다. 6, 10, 14일 된 알에 약 103 pfu PR8, NS1-99, delNS1 바이러스를 접종시키고, 이틀간 37℃상에서 배양시킨 다음, 요막액에 있는 바이러스는 적혈구 응집(HA) 검사를 이용하여 역가를 측정하였다. 표 3에서 볼 수 있는 것과 같이, 야생형 바이러스는 6, 10, 14된 난에서 유사한 HA 역가를 가지는데, delNS1은 6일된 난에서만 감지할 정도의 HA역가를 가진다는 것이다. 대조적으로, NS1-99 바이러스는 delNS1과 야생형 바이러스사이에 중간정도의 거동을 나타내어, 10일된 난에서는 야생형과 유사한 HA 역사를 가질 정도로 생장하나, 14일된 난에서는 이런 경향이 없다.
표 3
병아리 미발달 난에서 바이러스 복제
바이러스 난의 연령 적혈구 응집 역가 1
6일 10일 14일
WT PR82 2,048 4,096 1,071
NS1/99 N.D.3 2,048 <2
delNS1 64 <2 <2
1. 역가는 적혈구 응집 활성을 가지는 최대 희석을 나타낸다.
2. 야생형 인플루엔자 A/PR/8/34 바이러스
3. 결정되지 않음
NS1-99 바이러스의 약독화 특징을 생쥐에서도 결정하였다. 이를 위해, 5마리 BALB/c 생쥐군의 비강으로 5x106 pfu, 1.5x105, 1.5x103pfu 야생형 PR8 또는 NS1-99 바이러스를 감염시켰다. 그 다음 생쥐를 생존 3주동안에 모니터한다. 결과는 다음 표 4에 제공한다. NS1-99 바이러스는 야생형 바이러스보다는 적어도 3 로그이상의 LD50 값을 가진다.
표 4
생쥐에서 NS1-99 바이러스의 약독화
생존수
바이러스 감염 약량(pfu): 5X106 1.5X105 5X103
WT PR81 1/5 1/5 1/5
NS1-99 3/5 5/5 5/5
1. 야생형 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34
7. 실시예: 인플루엔자 B 바이러스에서 NS1 절두형 돌연변이생성 및 이의 특징조사
7.1. 재료 및 방법
실험적으로 자세한 것은 단락 6.1과 비슷하다. 두 개 돌연변이 인플루엔자 B 바이러스, B/610B5B/201(B/201)(127개 아미노산) 및 B/AWBY-234(90개 아미노산)(C-말단 절두형 NS1 단백질)(Norton et al., 1987 Virology 156:204; Tobita et al., 1990 Virology 174:314)은 항-A(H3N2) 바이러스 항체 존재하에서 B/Yamagata/1/73(B/Yam) 및 A/Aichi/2/68 바이러스 관련된 조직 배양물에 공동 감염 실험으로부터 유도하였다. 다양한 일수의 미발달 난에서 돌연변이 인플루엔자 바이러스 생장을 부계 바이러스 B/Yam(야생형 281개 아미노산 NS1 단백질을 가짐)과 비교하였고, 일수가 6,10, 14된 난에 약 103 pfu의 B/Yam, B/201, B/AWBY-234를 접종시켜, 2일간 35℃상에서 배양시켜, 요막 액체에 있는 바이러스는 HA 검사를 통 하여 역가를 측정하였다.
추가로, B/201 및 B/AWBY-234 바이러스의 약독화 성질에 대해서 생쥐에서 결정하였다. 3마리 BALB/c 생쥐 군에 비강으로 3x105pfu의 B/YAM, B/201, B/AWBY/234 돌연변이 바이러스를 접종시키고, 이들 바이러스의 복제 능력을 감염 3일 후에 폐에서 바이러스 역가를 측정하여 평가하는데, 그 이유는 생쥐에서 야생형 B/Yam은 눈에 띄는 질병의 징후를 유도하지 않기 때문이다.
7.2. 결과
표 5
병아리 미발달 난에서 인플루엔자 B 바이러스 복제
바이러스 난의 연령 적혈구 응집 역가 1
6일 10일 14일
B/Yam 362 256 <2
B/201 32 <2 <2
B/AWBY-234 8 <2 <2
표 5에서 볼 수 있는 것과 같이 돌연변이 및 야생형 인플루엔자 B 바이러스의 생장으로부터 인플루엔자 A 바이러스의 경우와 같이, 인플루엔자 B 바이러스의 NS1 카르복시-말단 절두가 효과적인 IFN 반응을 가지는 나이든 병아리 미발달 난에서 복제 능력을 낮게 한다는 것이다. 이와 같은 발견으로 인플루엔자 B 바이러스의 NS1은 숙주의 IFN 반응을 저해하는데 관계한다는 것을 알 수 있고, 인플루엔자 B 바이러스의 NS1 유전자의 결손으로 약독화된 표현형이 된다는 것을 알 수 있다.
생쥐에서 복제 실험 결과를 표 6에 나타내었다. B/201 및 B/AWBY-234 바이러스 역가는 B/Yam 역가보다 약 300배정도 낮다는 것을 알 수 있는데, 이는 인플루엔자 B 바이러스의 NS1의 카르복시-말단의 절두가 생쥐에서 약독화된 표현형을 가지게 하는 원인이 된다는 것을 말하는 것이다.
표 6
생쥐 폐에서 인플루엔자 B 바이러스 복제
바이러스 감염 3일후에 폐 역가(pfu/폐)
B/Yam 2X104 1X104 3X104
B/201 30 <10 60
B/AWBY-234 <10 40 <10
8. NS1 단백질이 결손된 인플루엔자 A 및 B 바이러스로 예방주사한 생쥐에서 야생형 인플루엔자 바이러스 감염에 대해 보호 효과
절두형 NS1 단백질을 포함하는 약독화된 인플루엔자 A 및 B 바이러스로 예방주사한 생쥐가 이들의 야생형 바이러스의 도전에 대해 보호받을 수 있는 지를 결정하기 위해, 다음과 같은 실험을 실시하였다. BALB/c 생쥐에 A/NS1-99 바이러스를 비강으로 예방주사하여, 3주일 후에, 이들에 야생형 인플루엔자 A/PR/8/34 바이러스 100 LD50으로 감염시켰다. 예방주사한 동물은 죽음을 면하였지만, 모든 기준이 되는 고유의 생쥐들은 이와 같은 감염 도전을 받은 후에 모두 죽었다(표 7 참고). 두 번째 실험에서, BALB/c 생쥐에 절두형 NS1 단백질을 발현시키는 인플루엔자 B 바이러스 B/201 또는 B/AWBY-234로 비강을 통하여 예방주사하였다. 3주일 후에, 생쥐에 3x105pfu의 야생형 인플루엔자 B/Yam/1/73 바이러스의 도전을 받았다. 이 인플루엔자 B바이러스 균주는 생쥐에서 질병 징후를 유도하지 못하기 때문에, 도전 3일 후에 폐에서 바이러스 역가를 측정함으로써 보호 정도를 결정하였다. 고유 기준 동물은 폐에서 약 104pfu의 역가를 가지는 반면에, 예방주사한 동물의 폐에서는 바이러스가 감지되지 않았다(표 8 참고). 이와 같은 발견으로, 변형된 NS1 유전자를 포함하는 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B는 야생형 바이러스 도전에 대해 생쥐를 완전하게 보호할 수 있는 생쥐에서의 면역 반응을 유도할 수 있다는 것이다.
표 7
야생형 인플루엔자 A/PR/8/34 바이러스 100LD50으로 도전을 받은 후에 인플루엔자 A/NS1-99 바이러스로 예방주사한 생쥐의 생존
A/NS1-99 바이러스의 면역화 약량 전체 수에 대해 생존 생쥐의 수
5X106pfu 3/3
1.5X105pfu 4/4
PBS 0/5
표 8
야생형 인플루엔자 B/Yamagata/73 바이러스 3X105pfu50으로 도전을 받은 후에 인플루엔자 B/AWBY-234 바이러스로 예방주사한 생쥐의 폐에서의 바이러스 역가
면역화 약량 폐 역가(pfu/폐)
3X106pfu B/201 <101,<101,<101,<10 1,<101
3X106pfu B/AWBY-234 <101,<101,<101,<10 1,<101
PBS 2.5X104, 1X104, 1.7X104, 3X104, 5X104
9. 실시예 DELNS1 바이러스로 감염된 배발생된 난에서의 타입 I 인터페론의 유도
delNS1 바이러스, 즉 NS1 유전자가 결손된 인플루엔자 A 바이러스가 병아리의 미발달된 난에서 타입 I IFN 분비를 유도하는 능력에 대해 측정하였다. 이를 위해, 10일된 병아리 미발달 난 2개 군에 5X103 pfu의 delNS1 또는 야생형 PR8 바이러스로 감염시켰다. 37℃에서 18시간 배양한 후에, 요막 액체를 수득하여, 산성 pH에 대해 하룻밤동안 투석시키고, 감염성 바이러스를 비활성화시켰다. 산 pH 처리후에, 샘플은 PBS에 대해 투석시킨 다름, CEF 세포에서 VSV 감염(약200pfu)에 대해 보호 활성을 가지는 최대 희석비를 결정하여, IFN 활성을 테스트하였다. 표 9에 나타낸 결과를 보면, NS1이 없는 경우에, 인플루엔자 A바이러스가 IFN을 더 많이 유도한다는 것을 알 수 있다.
표 9
난에서의 IFN 유도
바이러스 IFN(U/㎖)
PR8 <16, <16
delNS1 400, 400
mock <16, <16
10. 실시예: delNS1 바이러스의 항바이러스 활성
인플루엔자 A 바이러스로부터 IFN 길항성(NS1) 유전자를 제거하면, 바이러스는 IFN을 더 높은 수준으로 유도하는 능력을 가진다. 이와 같은 경우에, delNS1 바이러스는 IFN-감음성 바이러스의 복제를 "간섭"하게 될 것이다. 이와 같은 가능성을 테스트하기 위해, 출원인은 난에서 인플루엔자 바이러스 균주로 흔히 이용되는 인플루엔자 A/WSN/33 (WSN) 바이러스의 복제를 저해하는 delNS1 바이러스의 능력에 대해 조사하였다. 도 1에서 볼 수 있는 것과 같이, 2pfu의 delNS1 바이러스만으로 처리하였을 경우에도 요막 유체에서 최종 WSN 바이러스 역가를 10배 감소시킬 수 있다. 또한, 2x104pfu의 delNS1 바이러스로 처리하면, 난에서 WSN 복제가 완전하게 제거된다. DelNS1 바이러스는 또한, 다른 인플루엔자 A 바이러스 균주(H1N1 및 H3N2), 인플루엔자 B 바이러스 및 다른 바이러스(가령, 센다이 바이러스)가 난에서 복제하는 것을 방해할 수 있다(도 2).
이와 같은 결과에 힘을 얻은 출원인은 그 다음 생쥐에서 야생형 인플루엔자 바이러스 복제를 delNS1 바이러스가 간섭하는 능력에 대해 측정하기로 하였다. 비록 조직 배양물에서 타입 I IFN 처리로 인플루엔자 A 바이러스 복제가 in vitro에서 방해를 받지만, IFN로 생쥐를 처리하여도 인플루엔자 바이러스의 복제를 저해할 수는 없었다(Haller, 1981, Current Top Microbiol Immunol 92:25-52). 이것은 A2G 생쥐를 제외하고, 대부분의 동종번식 A2G에서 해당된다. A2G 생쥐뿐만 아니라 야생형 생쥐의 상당한 비율(약 75%)이 적어도 한 개의 고유 Mx1 대립형질을 포함하고 반면에 대부분의 실험실 균주는 Mx1 -/-이다(Haller, 1986, Current Top Microbiol Immunol 127:331-337). 사람의 MxA 단백질과 상동성이 있는 Mx1 단백질(Aebi, 1989, Mol. Cell. Biol. 11:5062)이 인플루엔자 바이러스 복제의 강력한 저해물질이다(Haller, 1980, Nature 283:660). 이 단백질은 구조적으로 발현되지는 않지만, 타입 I IFN에 의해 이의 발현이 전사적으로 유도된다. 따라서, A2G 생쥐를 이용하여 인플루엔자 A 바이러스에 대해 항-바이러스성 반응을 IFN-유도물질이 자극을 할 수 있는 지를 테스트할 수 있다(Haller, 1981, Current Top Microbiol Immunol 92:25-52).
출원인인 비강을 통하여 4주된 A2G 생쥐 8마리에 5x106 pfu의 매우 병원성이 강한 인플루엔자 A/PR/8/34 바이러스 분리체를 감염시켰다(Haller, 1981, Current Top Microbiol Immunol 92:25-52). 생쥐의 절반은 비강으로 PR8 감염에 대해 5x106 pfu의 delNS1를 24h전에 처리하였다. 체중 변화 및 생존율을 모니터하였다. 이 결과로 볼 때, delNS1로 처리하면, A2G 생쥐를 인플루엔자 바이러스에 의해 유도되 는 죽음 및 체중 손실로부터 생쥐를 보호할 수 있다는 것을 알 수 있다. 동일한 처리가 Mx1 -/- 생쥐에서는 효과가 없었는데, 이는 바이러스 보호 기작이 Mx1 즉 IFN에 의해 중개된다는 것을 의미한다.
11. 실시예: 생쥐에서 DelNS1 바이러스의 항종양 성질
타입 I IFN 또는 타입 I IFN 유도물질이 항종양 활성을 가지는 경우에(Belardelli and Gresser, 1996 Immunology Today 17: 369-372; Qin et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 14411-14416), DelNS1 바이러스를 이용하여 종양을 처리할 경우에, 종양 억제를 조절할 수도 있을 것이다. 또는, DelNS1 바이러스가 종양분해 성질을 가지는 경우에 즉, 종양에서 특이적으로 생장하여, 종양을 죽일 수 있는 능력이 있는 경우에, 이들 대부분은 IFN 시스템에 결손이 있는 것으로 알려져 있다. delNS1 바이러스의 항-종양 활성을 테스트하기 위해, 다음 실험을 폐 전이 생쥐 종양 모델에서 뮤린 암종 세포주 CT26. WT를 이용하여 실시하였다(Restifo et al., 1998 Virology 249:89-97) 5x105 CT26.WT 세포를 6주된 12마리 BALB/c 생쥐의 비강에 처리하였다. 생쥐의 절반에 접종 1, 2, 3일 후에 매 24시간마나 비강으로 106 pfu의 delNS1 바이러스를 처리하였다. 종양 주사후 12일 후에, 생쥐를 죽이고, vP 전이를 계산하였다. 표 10에서 볼 수 있는 것과 같이, delNS1 처리된 경우에 뮤린의 폐 전이를 상당 수준으로 퇴행시킨다는 것을 알 수 있다.
표 10
CT26.WT 종양 세포를 주사한 BALB/c 생쥐에서 delNS1 바이러스의 항종양 활성
폐 전이된 수
PBS-처리된 생쥐 delNS1-처리된 생쥐
생쥐 1 >250 120
생쥐 2 >250 28
생쥐 3 >250 9
생쥐 4 >250 6
생쥐 5 >250 2
생쥐 6 >250 1
12. 실시예: 인플루엔자 바이러스 감염동안에 NS1 단백질이 IRF-3의 전치를 저해한다.
여기에서 설명하는 결과는 인플루엔자 바이러스의 NS1 단백질이 바이러스에 대해 타입 I IFN 반응 저해를 담당하고, 이 단백질에 돌연변이/결손으로 감염동안에 IFN 반응이 강화되어 약독화된 바이러스가 된다는 것이다. 바이러스 감염동안에 타입 I IFN 합성은 이중 가닥 RNA(dsRNA)에 의해 촉진된다는 것은 알려진 사실이다. IRF-3는 포유류 세포의 세포질에서 비활성형으로 발견되는 전사인자이다. 이중 가닥의 RNA는 전사 인자 IRF-3의 인산화반응(활성화)을 유도하여, 핵으로 전치되는데, 여기에서, 타입 I IFN을 코딩하는 유전자를 포함하는 특정 유전자의 전사를 유도한다(Weaver et al., 1998, Mol. Cell. Biol. 18:1359). 인플루엔자의 NS1이 IRF-3에 작용하는 지를 결정하기 위해, 야생형 PR8 또는 delNS1 인플루엔자 A바이러스로 감염된 CV1 세포에서 IRF-3 위치를 모니터하였다. 도 3에서는 IRF-3 전치가 PR8-감염된 세포에서 최소로 나타났다(세포의 10% 미만). 대조적으로, delNS1-감염된 세포의 약 90%는 IRF-3이 핵으로 전치되었다는 것을 보여준다. 놀라운 것은, trans의 플라스미드로부터 NS1이 발현됨으로써 delNS1-감염된 세포에서 부분적으로 IRF-3의 전치를 저해할 수 있다는 것이다. 이와 같은 결과는 인플루엔자 A 바이러스의 NS1이 바이러스 감염동안에 발생되는 dsRNA를 격리시킴으로써, IRF-3의 delNS1-중개된 활성을 저해하여, IFN 합성을 저해할 수 있다는 것이다.
본 발명은 본 발명의 개별적인 몇 몇 특징을 설명하기 위한 의도로써 특정 구체예를 이용하여 설명하였으나, 이에 한정시키고자 함이 아니다. 임의 바이러스 구조체도 기능적으로 등가의 경우에 본 발명 범위내에서 이용될 수 있다. 또한, 본 발명을 다양하게 변형시킨 것도 본 발명의 범위에 속한다.
각종 언급된 문헌은 참고문헌으로 전문 첨부된다.

Claims (51)

  1. 변형된 NS1 유전자를 포함하는 약독화된 인플루엔자 바이러스에 있어서, NS1 단백질에서 아미노 단부로부터 99개 아미노산을 발현하도록 NS1 유전자가 결실 돌연변이된 NS1/99인 것을 특징으로 하는 약독화된 인플루엔자 바이러스.
  2. NS1 단백질에서 아미노 단부 아미노산을 1번으로 하여 아미노산 잔기 1-130, 아미노산 잔기 1-120, 아미노산 잔기 1-100, 아미노산 잔기 1-99, 아미노산 잔기 1-70, 또는 아미노산 잔기 1-60을 발현하도록 NS1 유전자가 결실 돌연변이된 약독화되고 유전자 조작된 인플루엔자 바이러스에 있어서, 상기 결실 돌연변이는 동일한 조건에서 증폭되는 경우에 인터페론-콤피던트 숙주 시스템에서 성장된 약독화된 바이러스의 역가보다 적어도 1로그 높은 역가로 인터페론-결손된 숙주 시스템에서 약독화된 바이러스가 성장할 수 있도록 하는 것을 특징으로 하는 약독화된 인플루엔자 바이러스.
  3. 제 1항에 있어서, 약독화된 바이러스는 유전자 조작된 것을 특징으로 하는 약독화된 인플루엔자 바이러스.
  4. 제 2항에 있어서, 약독화된 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스인 것을 특징으로 하는 약독화된 인플루엔자 바이러스.
  5. 제 2항에 있어서, 인터페론-결손된 숙주 시스템은 6 내지 8일된 난 이고, 인터페론-콤피던트 숙주 시스템은 10 내지 12일된 난 인 것을 특징으로 하는 약독화된 인플루엔자 바이러스.
  6. 제 2항에 있어서, 인터페론-결손된 숙주 시스템은 6 내지 7일된 난 이고, 인터페론-콤피던트 숙주 시스템은 10일된 난 인 것을 특징으로 하는 약독화된 인플루엔자 바이러스.
  7. 제 5항 또는 6항에 있어서, 난은 부화 계란인 것을 특징으로 하는 약독화된 인플루엔자 바이러스.
  8. 제 2항에 있어서, 인터페론-결손된 숙주 시스템은 STAT1(signal transducers and activation of transcription) 음성이고, 인터페론-콤피던트 숙주 시스템은 STAT1 양성인 것을 특징으로 하는 약독화된 인플루엔자 바이러스.
  9. 제 1항의 약독화된 인플루엔자 바이러스 및 생리학적으로 수용가능한 부형제를 함유하는 백신 조성물에 있어서, 개체에서 감염성 질환을 예방하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  10. 제 2항의 약독화된 인플루엔자 바이러스 및 생리학적으로 수용가능한 부형제를 함유하는 백신 조성물에 있어서, 개체에서 감염성 질환을 예방하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  11. 제 1항의 약독화된 인플루엔자 바이러스 및 생리학적으로 수용가능한 부형제를 함유하는 백신 조성물에 있어서, 개체에서 종양 형성을 예방하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  12. 제 2항의 약독화된 인플루엔자 바이러스 및 생리학적으로 수용가능한 부형제를 함유하는 백신 조성물에 있어서, 개체에서 종양 형성을 예방하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  13. 제 9항 또는 10항에 있어서, 감염성 질환은 인플루엔자 바이러스 감염인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  14. 제 9항 또는 11항에 있어서, 약독화된 인플루엔자 바이러스는 유전자 조작된 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  15. 제 10항 또는 12항에 있어서, 약독화된 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  16. 제 9항 내지 12항중 어느 한 항에 있어서, 면역 반응을 유도하는 효과량을 함유하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  17. 제 9항 내지 12항중 어느 한 항에 있어서, 약독화된 인플루엔자 바이러스 농도는 104 내지 5 x 106 pfu인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  18. 제 10항 또는 12항에 있어서, 인터페론-결손된 숙주 시스템은 6 내지 8일된 난 이고, 인터페론-콤피던트 숙주 시스템은 10 내지 12일된 난 인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  19. 제 10항 또는 12항에 있어서, 인터페론-결손된 숙주 시스템은 6 내지 7일된 난 이고, 인터페론-콤피던트 숙주 시스템은 10일된 난 인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  20. 제 18항에 있어서, 난은 부화 계란인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  21. 제 19항에 있어서, 난은 부화 계란인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  22. 제 10항 또는 12항에 있어서, 인터페론-결손된 숙주 시스템은 STAT1 음성이고, 인터페론-콤피던트 숙주 시스템은 STAT1 양성인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  23. 제 9항 내지 12항중 어느 한 항에 있어서, 백신 조성물은 비강내, 기관내, 경구, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 또는 피하 경로로 도입되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  24. 제 9항 내지 12항중 어느 한 항에 있어서, 개체는 인간인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  25. 제 1항의 약독화된 인플루엔자 바이러스 및 생리학적으로 수용가능한 부형제를 함유하는 제약학적 조성물에 있어서, 개체에서 감염성 질환을 치료하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  26. 제 2항의 약독화된 인플루엔자 바이러스 및 생리학적으로 수용가능한 부형제를 함유하는 제약학적 조성물에 있어서, 개체에서 감염성 질환을 치료하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  27. 제 1항의 약독화된 인플루엔자 바이러스 및 생리학적으로 수용가능한 부형제를 함유하는 제약학적 조성물에 있어서, 개체에서 종양을 치료하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  28. 제 2항의 약독화된 인플루엔자 바이러스 및 생리학적으로 수용가능한 부형제를 함유하는 제약학적 조성물에 있어서, 개체에서 종양을 치료하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  29. 제 1항의 약독화된 인플루엔자 바이러스 및 생리학적으로 수용가능한 부형제를 함유하는 제약학적 조성물에 있어서, 개체에서 인터페론이 치료 효능을 보이는 질환을 치료하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  30. 제 2항의 약독화된 인플루엔자 바이러스 및 생리학적으로 수용가능한 부형제를 함유하는 제약학적 조성물에 있어서, 개체에서 인터페론이 치료 효능을 보이는 질환을 치료하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  31. 제 25항 또는 26항에 있어서, 감염성 질환은 인플루엔자 바이러스 감염인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  32. 제 25항, 27항, 29항중 어느 한 항에 있어서, 약독화된 인플루엔자 바이러스는 유전자 조작된 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  33. 제 26항, 28항, 30항중 어느 한 항에 있어서, 약독화된 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  34. 제 25항, 26항, 29항, 30항중 어느 한 항에 있어서, 세포 인터페론 반응을 유도하는 효과량을 함유하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  35. 제 27항 또는 28항에 있어서, 세포 인터페론 반응 또는 종양붕괴(onclysis)를 유도하는 효과량을 함유하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  36. 제 25항 내지 30항중 어느 한 항에 있어서, 약독화된 인플루엔자 바이러스 농도는 104 내지 5 x 106 pfu인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  37. 제 26항, 28항, 30항중 어느 한 항에 있어서, 인터페론-결손된 숙주 시스템은 6 내지 8일된 난 이고, 인터페론-콤피던트 숙주 시스템은 10 내지 12일된 난 인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  38. 제 26항, 28항, 30항중 어느 한 항에 있어서, 인터페론-결손된 숙주 시스템은 6 내지 7일된 난 이고, 인터페론-콤피던트 숙주 시스템은 10일된 난 인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  39. 제 37항에 있어서, 난은 부화 계란인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  40. 제 38항에 있어서, 난은 부화 계란인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  41. 제 26항, 28항, 30항중 어느 한 항에 있어서, 인터페론-결손된 숙주 시스템은 STAT1 음성이고, 인터페론-콤피던트 숙주 시스템은 STAT1 양성인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  42. 제 25항 내지 30항중 어느 한 항에 있어서, 제약학적 조성물은 비강내, 경막외, 경구, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 또는 피하 경로로 도입되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  43. 제 25항 내지 30항중 어느 한 항에 있어서, 제약학적 조성물은 폐 투여로 도입되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  44. 제 27항 또는 28항에 있어서, 제약학적 조성물은 종양 부위에 직접 주사되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  45. 제 25항 내지 30항중 어느 한 항에 있어서, 제약학적 조성물은 서방 시스템으로 존재하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  46. 제 25항 내지 30항중 어느 한 항에 있어서, 개체는 인간인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  47. 제 27항 또는 28항에 있어서, 치료는 종양 형성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200100216A (ko) * 2019-02-15 2020-08-26 아이디바이오 주식회사 이종 인플루엔자 a 바이러스에 대한 면역/치료반응을 형성하는 신규한 재조합 인플루엔자 바이러스 및 이를 포함하는 유전자 전달체 및 치료백신

Families Citing this family (77)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7780962B2 (en) 1997-10-09 2010-08-24 Wellstat Biologics Corporation Treatment of neoplasms with RNA viruses
US20030044384A1 (en) 1997-10-09 2003-03-06 Pro-Virus, Inc. Treatment of neoplasms with viruses
US7470426B1 (en) 1997-10-09 2008-12-30 Wellstat Biologics Corporation Treatment of neoplasms with viruses
US6573079B1 (en) 1998-06-12 2003-06-03 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Methods and interferon deficient substrates for the propagation of viruses
EP1390046A4 (en) * 1999-04-15 2005-04-20 Wellstat Biologics Corp TREATMENT OF NEOPLASMS WITH VIRUSES
US8147822B1 (en) 1999-09-17 2012-04-03 Wellstat Biologics Corporation Oncolytic virus
NZ517573A (en) 1999-09-17 2004-02-27 Pro Virus Inc Sequences of the oncolytic virus strain vesicular stromatitis virus (VSV)
EP1259629B1 (en) * 2000-03-02 2005-07-20 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH Recombinant influenza a viruses
WO2001077394A1 (en) 2000-04-10 2001-10-18 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Screening methods for identifying viral proteins with interferon antagonizing functions and potential antiviral agents
DE10020505A1 (de) 2000-04-26 2001-10-31 Conzelmann Karl Klaus RSV NS Proteine antagonisieren die Interferon (IFN) Antwort
AU2002223560B2 (en) * 2000-09-25 2006-06-29 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung Gmbh Live influenza vaccine and method of manufacture
MX348185B (es) 2001-02-14 2017-06-02 Anthrogenesis Corp Placenta de mamíferos postparto, su uso y células madres placentales extraídas de ella.
JP2005505505A (ja) 2001-05-22 2005-02-24 アクセス ビジネス グループ インターナショナル リミテッド ライアビリティ カンパニー 液体成分を配合しかつ分取するための方法および装置
CN1549709A (zh) * 2001-07-16 2004-11-24 ����ɯ�ס����ڵ��ɿ� 一类抗病毒化合物在制造用于治疗或预防在呼吸道中病毒感染的制剂中的应用
US7037707B2 (en) * 2003-09-04 2006-05-02 St. Jude Children's Research Hospital Method for generating influenza viruses and vaccines
ES2694123T3 (es) * 2004-06-01 2018-12-18 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Virus de la gripe porcina modificado por ingeniería genética y usos de los mismos
US8137676B2 (en) * 2005-02-15 2012-03-20 Mount Sinai School Of Medicine Genetically engineered equine influenza virus and uses thereof
AT502275B8 (de) * 2005-08-08 2007-08-15 Greenhills Biotechnology Res D Immunantwort-induzierende zusammensetzungen
PT2251034T (pt) 2005-12-02 2018-05-22 Icahn School Med Mount Sinai Vírus da doença de newcastle quiméricos que apresentam proteínas de superfície não nativas e suas utilizações
EP1911836A1 (en) 2006-10-12 2008-04-16 AVIR Green Hills Biotechnology Trading GmbH Medium supplement for virus production
US7860646B2 (en) * 2007-04-16 2010-12-28 The Boeing Company Method and apparatus for routing ocean going vessels to avoid treacherous environments
WO2008144067A1 (en) * 2007-05-21 2008-11-27 Board Of Regents, University Of Texas System Methods and compositions for treatment of cancer using oncolytic rsv activity
EP2045323A1 (en) * 2007-10-05 2009-04-08 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Linear expression constructs for production of influenza virus particles
EP2048237A1 (en) * 2007-10-05 2009-04-15 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Replication deficient Influenza virus for the expression of heterologous sequences
EP2072058A1 (en) 2007-12-21 2009-06-24 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Modified influenza virus
US8108138B2 (en) * 2008-10-02 2012-01-31 The Boeing Company Optimal vehicle router with energy management system
EA024262B1 (ru) 2008-11-25 2016-09-30 Нанотерапьютикс Инк. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОИНФЕКЦИОННОГО ВИРУСА ГРИППА, СТАБИЛЬНОГО ПРИ НИЗКИХ pH
EP2233568A1 (en) 2009-03-19 2010-09-29 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade AG Novel method for generation of RNA virus
US9884105B2 (en) * 2008-12-16 2018-02-06 Ology Bioservices, Inc. Production of viral vaccine
EP2233152A1 (en) 2009-03-24 2010-09-29 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag High growth reassortant influenza A virus
US8935174B2 (en) * 2009-01-16 2015-01-13 The Boeing Company Analyzing voyage efficiencies
WO2010091262A1 (en) 2009-02-05 2010-08-12 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Chimeric newcastle disease viruses and uses thereof
EP2413962A1 (en) 2009-03-30 2012-02-08 Mount Sinai School of Medicine Influenza virus vaccines and uses thereof
DE102010018462A1 (de) 2009-04-27 2011-04-07 Novartis Ag Impfstoffe zum Schutz gegen Influenza
WO2010144797A2 (en) 2009-06-12 2010-12-16 Vaccine Technologies, Incorporated Influenza vaccines with enhanced immunogenicity and uses thereof
CA2767207A1 (en) * 2009-07-06 2011-01-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Bioprocessing
CN102648000A (zh) 2009-07-22 2012-08-22 阿维尔绿山生物技术研究发展贸易股份公司 新的流感病毒
US9217157B2 (en) 2009-07-27 2015-12-22 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Recombinant influenza viruses and uses thereof
JP5845180B2 (ja) 2009-07-30 2016-01-20 モウント シナイ スクール オフ メディシネ インフルエンザウイルス及びそれらの使用
CA2769673A1 (en) 2009-07-31 2011-02-03 Novartis Ag Reverse genetics systems
EP2295543A1 (en) * 2009-09-11 2011-03-16 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Method for the preparation of an influenza virus
KR20130075732A (ko) 2010-03-30 2013-07-05 마운트 시나이 스쿨 오브 메디슨 인플루엔자 바이러스 백신 및 이의 용도
US8597637B1 (en) 2010-05-18 2013-12-03 Weidong Zhang Breast cancer therapy using an engineered respiratory syncytial virus
US20130183740A1 (en) * 2010-06-02 2013-07-18 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Novel method for generation of rna virus
US9044499B1 (en) 2010-06-22 2015-06-02 Weidong Zhang NS1/2-deficient respiratory syncytial virus and melanoma treatment
US8377901B2 (en) * 2010-07-07 2013-02-19 The University Of Manitoba Target host factors for treating viral infection
CN102021149B (zh) * 2010-07-27 2013-04-24 张卫东 基因ns1缺陷型呼吸道合胞病毒及其治疗肺癌的应用
CN102021148A (zh) * 2010-07-27 2011-04-20 张卫东 一种基因ns1缺陷型呼吸道合胞病毒及其应用
EP2758075B1 (en) 2011-09-20 2023-05-03 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Influenza virus vaccines and uses thereof
US9157746B2 (en) 2011-11-16 2015-10-13 The Boeing Company Vessel routing system
AU2013362935B2 (en) 2012-12-18 2018-10-04 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccines and uses thereof
CN103330723A (zh) * 2013-01-14 2013-10-02 艾克星（武汉）生物医药科技有限公司 基因工程呼吸道合胞病毒（△ns1 rsv)在治疗癌症药物中的用途
US10947543B2 (en) 2013-03-13 2021-03-16 Yale University Interferon production using short RNA duplexes
WO2014159960A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Antibodies against influenza virus hemagglutinin and uses thereof
BR112015021414B1 (pt) 2013-03-14 2020-11-10 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai vírus da doença newcastle e seus usos
WO2015127501A1 (en) 2014-02-27 2015-09-03 Viralytics Limited Combination method for treatment of cancer
US10736956B2 (en) 2015-01-23 2020-08-11 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccination regimens
EP3261664A1 (en) 2015-02-26 2018-01-03 Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH Bivalent swine influenza virus vaccine
WO2017030997A1 (en) * 2015-08-14 2017-02-23 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Respiratory syncytial virus having altered ns1 protein function and related materials and methods
EA037571B1 (ru) * 2015-11-06 2021-04-15 Общество с ограниченной ответственностью "ФАРМИНТЕРПРАЙСЕЗ БИОТЕХ" Аттенуированный вирус гриппа а, аттенуированный грипозный вектор, фармацевтическая композиция и их применение для профилактики или лечения инфекционных заболеваний, а также для лечения онкологических заболеваний
RU2628690C2 (ru) * 2015-11-06 2017-08-21 Общество С Ограниченной Ответственностью 'Фарминтерпрайсез' Аттенуированные гриппозные векторы для профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний, а также для лечения онкологических заболеваний
RU2660562C2 (ru) * 2016-03-30 2018-07-06 Общество с ограниченной ответственностью "ФАРМИНТЕРПРАЙСЕЗ БИОТЕХ" Аттенуированный гриппозный вектор и мукозальная универсальная гриппозная вакцина на его основе
MX2018006373A (es) * 2015-11-24 2018-11-09 Commw Scient Ind Res Org Produccion de virus en cultivos celulares.
WO2017088017A1 (en) * 2015-11-24 2017-06-01 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Production of viruses in avian eggs
WO2017218624A1 (en) 2016-06-15 2017-12-21 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus hemagglutinin proteins and uses thereof
WO2018115308A1 (en) 2016-12-22 2018-06-28 Blue Sky Vaccines Gmbh Method for purifying virus
CN111511907A (zh) 2017-03-14 2020-08-07 加利福尼亚大学董事会 对病毒中免疫逃逸功能区域的全基因组鉴定
US11254733B2 (en) 2017-04-07 2022-02-22 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Anti-influenza B virus neuraminidase antibodies and uses thereof
JOP20190256A1 (ar) 2017-05-12 2019-10-28 Icahn School Med Mount Sinai فيروسات داء نيوكاسل واستخداماتها
WO2019092084A1 (en) 2017-11-08 2019-05-16 Blue Sky Vaccines Gmbh So3 chromatography for use in a method for virus purification
CN113853215A (zh) 2019-01-24 2021-12-28 蓝天免疫疗法有限责任公司 高生长流感病毒
US20230060867A1 (en) * 2019-02-07 2023-03-02 Duke University Stabilized 9 and 10 segmented influenza viruses as a vaccine platform and methods of making and using same
JP7222552B2 (ja) * 2020-01-30 2023-02-15 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 豚デルタコロナウイルスの増殖方法
CN116888139A (zh) * 2020-11-30 2023-10-13 蓝天免疫疗法有限责任公司 诱导高水平i型干扰素的新型复制缺陷型甲型流感病毒
WO2022125789A1 (en) * 2020-12-09 2022-06-16 Yale University Compositions and methods for treating, ameliorating, and/or preventing viral infections
EP4351623A1 (en) 2021-06-09 2024-04-17 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Gene combination as a broad spectrum antiviral
CN115896035B (zh) * 2022-12-22 2024-04-16 苏州沃美生物有限公司 一种应用于病毒扩增的Vero细胞株、其构建方法及应用

Family Cites Families (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4071618A (en) * 1974-09-03 1978-01-31 Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University Process for preparing virus disease live vaccines
US4215051A (en) 1979-08-29 1980-07-29 Standard Oil Company (Indiana) Formation, purification and recovery of phthalic anhydride
JPS57136528A (en) * 1981-02-09 1982-08-23 Hayashibara Biochem Lab Inc Preparation of viral vaccine
US4873191A (en) 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
US4769330A (en) 1981-12-24 1988-09-06 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus and methods for making and using the same
JPS5939831A (ja) 1982-08-27 1984-03-05 Biseibutsu Kagaku Kenkyusho:Kk 豚用インフルエンザウイルス不活化ワクチン
US4693981A (en) * 1983-12-20 1987-09-15 Advanced Genetics Research Institute Preparation of inactivated viral vaccines
US5106619A (en) * 1983-12-20 1992-04-21 Diamond Scientific Co. Preparation of inactivated viral vaccines
JPS60202827A (ja) * 1984-03-28 1985-10-14 Chibaken 弱毒痘そうワクチン株
US5786199A (en) 1989-08-28 1998-07-28 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand RNA virus expression systems and vaccines
US5166057A (en) 1989-08-28 1992-11-24 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand rna virus expression-systems
US5854037A (en) 1989-08-28 1998-12-29 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand RNA virus expression systems and vaccines
US5840520A (en) 1989-08-28 1998-11-24 Aviron Recombinant negative strand RNA virus expression systems
US5766601A (en) * 1990-08-08 1998-06-16 University Of Massachusetts Medical Center Cross-reactive influenza a immunization
US6162432A (en) * 1991-10-07 2000-12-19 Biogen, Inc. Method of prophylaxis or treatment of antigen presenting cell driven skin conditions using inhibitors of the CD2/LFA-3 interaction
EP0607332B1 (en) 1991-10-07 1997-12-17 Biogen, Inc. Method of prophylaxis or treatment of antigen presenting cell driven skin conditions using inhibitors of the cd2/lfa-3 interaction
DE570357T1 (de) 1992-05-14 1994-07-28 Polimun Scientific Immunbiologische Forschungsgesellschaft Mbh, Wien Peptide, die Antikörper induzieren, die genetisch divergierende HIV-1 Isolationen neutralisieren.
US7344722B1 (en) * 1993-06-29 2008-03-18 The Regents Of The University Of Michigan Cold-adapted influenza virus
ATE257175T1 (de) 1994-07-18 2004-01-15 Conzelmann Karl Klaus Prof Dr Rekombinantes infektiöses nicht-in-segmente- geteiltes, negativ-strange-rns-virus
US6300090B1 (en) * 1994-07-29 2001-10-09 The Rockefeller University Methods of use of viral vectors to deliver antigen to dendritic cells
US6146873A (en) * 1994-11-10 2000-11-14 Baxter Aktiengesellschaft Production of orthomyxoviruses in monkey kidney cells using protein-free media
US7153510B1 (en) 1995-05-04 2006-12-26 Yale University Recombinant vesiculoviruses and their uses
DE69510207T3 (de) 1995-08-09 2007-02-15 Schweiz. Serum- & Impfinstitut Bern Verfahren zur Herstellung von infektiösen minussträngigen RNA-Viren
US5840565A (en) 1995-08-22 1998-11-24 The Regents Of The University Of California Methods for enhancing the production of viral vaccines in PKR-deficient cell culture
JPH11512609A (ja) 1995-09-27 1999-11-02 アメリカ合衆国 クローン化されたヌクレオチド配列からの感染性ＲＳウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）の生産
GB9605808D0 (en) * 1996-03-20 1996-05-22 Isis Innovation CFTR gene regulator
EP2112220A3 (en) 1996-07-15 2010-01-06 The Government of the United States of America, as represented by The Department of Health and Human Services Production of attenuated respiratory syncytial virus vaccines from cloned nucleotide sequences
AU4427897A (en) 1996-09-27 1998-04-17 American Cyanamid Company 3' genomic promoter region and polymerase gene mutations responsible for att enuation in viruses of the order designated mononegavirales
US6330090B1 (en) * 1997-02-14 2001-12-11 Photonetics Optical fiber wavelength, multiplexer and demultiplexer
EP0975809A4 (en) 1997-03-05 2002-10-30 Univ Washington EXAMINATION PROCEDURE FOR DETECTING AGENTS FOR SELECTIVE INHIBITION OF HCV REPLICATION
US5891705A (en) * 1997-04-08 1999-04-06 Pentose Pharmaceuticals, Inc. Method for inactivating a virus
US6884414B1 (en) * 1997-04-30 2005-04-26 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Recombinant influenza viruses expressing tumor-associated antigens as antitumor agents
AU7797798A (en) 1997-05-23 1998-12-11 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Production of attenuated parainfluenza virus vaccines from cloned nucleotide sequences
PT1012244E (pt) 1997-07-11 2007-08-21 Univ Yale ''rabdovírus com revestimentos remanipulados''
CN1273603A (zh) 1997-09-19 2000-11-15 美国氰胺公司 减毒的呼吸道合胞病毒
US6573079B1 (en) * 1998-06-12 2003-06-03 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Methods and interferon deficient substrates for the propagation of viruses
DK1098961T3 (da) * 1998-06-12 2008-05-26 Andrej Y Dr Egorov Gensplejsede svækkede vira, der inducerer interferon
US6146642A (en) * 1998-09-14 2000-11-14 Mount Sinai School Of Medicine, Of The City University Of New York Recombinant new castle disease virus RNA expression systems and vaccines
US6544785B1 (en) * 1998-09-14 2003-04-08 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Helper-free rescue of recombinant negative strand RNA viruses
AT407958B (de) * 1999-02-11 2001-07-25 Immuno Ag Inaktivierte influenza-virus-vakzine zur nasalen oder oralen applikation
ATE353370T1 (de) 1999-07-14 2007-02-15 Sinai School Medicine In vitro-rekonstitution von segmentierten, negativstrang-rna-viren
EP1259629B1 (en) 2000-03-02 2005-07-20 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH Recombinant influenza a viruses
WO2001077394A1 (en) 2000-04-10 2001-10-18 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Screening methods for identifying viral proteins with interferon antagonizing functions and potential antiviral agents
DE10020505A1 (de) 2000-04-26 2001-10-31 Conzelmann Karl Klaus RSV NS Proteine antagonisieren die Interferon (IFN) Antwort
AU2002223560B2 (en) 2000-09-25 2006-06-29 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung Gmbh Live influenza vaccine and method of manufacture
AUPR343601A0 (en) * 2001-02-28 2001-03-29 Dickins, Philip Trenching machine
CA2505949A1 (en) * 2002-11-13 2004-05-27 Rutgers, The State University Process for designing inhibitors of influenza virus non-structural protein 1
ES2694123T3 (es) * 2004-06-01 2018-12-18 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Virus de la gripe porcina modificado por ingeniería genética y usos de los mismos
US8137676B2 (en) 2005-02-15 2012-03-20 Mount Sinai School Of Medicine Genetically engineered equine influenza virus and uses thereof
US20070116717A1 (en) * 2005-08-01 2007-05-24 Shneider Alexander M Influenza vaccine compositions and methods
AT502275B8 (de) * 2005-08-08 2007-08-15 Greenhills Biotechnology Res D Immunantwort-induzierende zusammensetzungen
PT2251034T (pt) 2005-12-02 2018-05-22 Icahn School Med Mount Sinai Vírus da doença de newcastle quiméricos que apresentam proteínas de superfície não nativas e suas utilizações
US7507411B2 (en) * 2006-06-23 2009-03-24 University Of Saskatchewan Attenuated influenza NS1 variants

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200100216A (ko) * 2019-02-15 2020-08-26 아이디바이오 주식회사 이종 인플루엔자 a 바이러스에 대한 면역/치료반응을 형성하는 신규한 재조합 인플루엔자 바이러스 및 이를 포함하는 유전자 전달체 및 치료백신
KR102370100B1 (ko) 2019-02-15 2022-03-07 아이디바이오 주식회사 이종 인플루엔자 a 바이러스에 대한 면역/치료반응을 형성하는 신규한 재조합 인플루엔자 바이러스 및 이를 포함하는 유전자 전달체 및 치료백신

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BR9911163A (pt) 2002-01-15
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