CN114457176A - 基于mpn算法的生态生物识别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于MPN算法的生态生物识别方法，包括如下步骤：样品采集：用预先灭菌的采样瓶采集水样，水样采集后放入冰盒中保存；水样梯度稀释：采用三个连续梯度进行稀释；水样增菌培养：将三个稀释度的样品分别加入增菌液混匀，每个稀释度做5份，放入42℃恒温培养箱中培养24h；DNA提取：采用玻璃珠法、磁珠法、微柱法或有机溶剂萃取法提取并纯化细菌DNA；PCR扩增:将提取到的DNA样本作为模板，以沙门氏菌属特异性引物进行PCR扩增；通过MPN算法进行统计分析计算水样含菌量。本发明通过MPN法的设置，能够定量检测水中沙门氏菌活体含量，并提高检测的特异性，避免了其他微生物的干扰，操作简便可行，适用于地表水、污水等多种水样的检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物识别技术领域，尤其涉及基于MPN算法的生态生物识别方法。
背景技术
沙门氏菌分布广泛，学界共识认为该菌是食品中污染程度最高的一类菌，在世界各地的细菌性食物中毒病例统计中，由沙门氏菌引起的案例数常占首位或次位。迄今为止，世界范围内已经报道的沙门氏菌血清型大于2600种。沙门氏菌导致的伤寒、副伤寒、发热等是发展中国家最为常见的疾病，在环境卫生条件较差的地区甚至会导致死亡。有报道显示，每年全球有大约9400万例肠胃炎以及15.5万例死亡病例均是由沙门氏菌导致，其中有85％是食物引起的。
沙门氏菌属种类极多，其性状在水环境中时常会出现变异，常常出现实际生化反应结果与沙门氏菌鉴别表中的类型不相符的情况，造成检测失败。现有检测识别方法的最大弊端是无法区分活体和已死亡的菌体，无法深入研究水环境中沙门氏菌对人体健康的影响。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了基于MPN算法的生态生物识别方法。
本发明提出的基于MPN算法的生态生物识别方法，包括如下步骤：
S1样品采集：用预先灭菌的采样瓶采集水样，水样采集后放入冰盒中保存；
S2水样梯度稀释：采用三个连续梯度进行稀释；
S3水样增菌培养：将三个稀释度的样品分别加入增菌液混匀，每个稀释度做5份，放入42℃恒温培养箱中培养24h；
S4 DNA提取：采用玻璃珠法、磁珠法、微柱法或有机溶剂萃取法提取并纯化细菌DNA；
S5 PCR扩增:将提取到的DNA样本作为模板，以沙门氏菌属特异性引物进行PCR扩增；
S6通过MPN算法进行统计分析计算水样含菌量。
优选的，所述步骤S2水样梯度稀释步骤：称取25mL食品样本加入225mL无菌BPW中，拍击式均质25s或其他方式充分震摇混合，使样本表面或内部可能存在的沙门氏菌散布于BPW中，静置数秒所得上清液作为1:10样本稀释液；吸取1:10稀释液1mL，注入含有9mL BPW的试管内，振摇试管混匀，制备1:100的稀释液；另取1mL灭菌吸管，按上条操作依次制备10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌吸管。
优选的，所述步骤S4中DNA提取步骤：分别取上述增菌液1mL，8000r/min离心，弃去上清液以去除有机酸等细菌代谢产物对PCR的不利影响，无菌水重悬后，采用玻璃珠法、磁珠法、微柱法或有机溶剂萃取法提取并纯化细菌DNA。
优选的，所述步骤S5扩增可直接采用或荧光定量PCR法或PCR-电泳法或在扩增体系中加入不影响扩增的DNA染料。
优选的，所述步骤S5PCR扩增后需进行扩增产物检测：扩增后直接于激发光下观察荧光强度以确证每份扩增中是否有PCR扩增产物的存在。
优选的，所述增菌液配制方法是：称取24g氯化镁孔雀绿固体干粉溶于800mL超纯水中，加热煮沸至完全溶解，分装，高压蒸汽灭菌备用。
优选的，所述步骤S5PCR扩增反应在PCR仪上进行，反应条件为：95℃预变性5min；95℃，30s，65℃，30s，72℃，30s，进行30个循环；最后72℃延伸4min。
优选的，所述步骤S6根据PCR为沙门氏菌阳性的试管管数，通过MPN软件，报告每mL样品中沙门氏菌的MPN值。
本发明中，所述基于MPN算法的生态生物识别方法，通过MPN法的设置，能够定量检测水中沙门氏菌活体含量，并提高检测的特异性，避免了其他微生物的干扰，操作简便可行，适用于地表水、污水等多种水样的检测。
附图说明
图1为本发明提出的基于MPN算法的生态生物识别方法的流程示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
参照图1，基于MPN算法的生态生物识别方法，包括如下步骤：
S1样品采集：用预先灭菌的采样瓶采集水样，水样采集后放入冰盒中保存；
S2水样梯度稀释：采用三个连续梯度进行稀释；
S3水样增菌培养：将三个稀释度的样品分别加入增菌液混匀，每个稀释度做5份，放入42℃恒温培养箱中培养24h；
S4 DNA提取：采用玻璃珠法、磁珠法、微柱法或有机溶剂萃取法提取并纯化细菌DNA；
S5 PCR扩增:将提取到的DNA样本作为模板，以沙门氏菌属特异性引物进行PCR扩增；
S6通过MPN算法进行统计分析计算水样含菌量。
本发明中，步骤S2水样梯度稀释步骤：称取25mL食品样本加入225mL无菌BPW中，拍击式均质25s或其他方式充分震摇混合，使样本表面或内部可能存在的沙门氏菌散布于BPW中，静置数秒所得上清液作为1:10样本稀释液；吸取1:10稀释液1mL，注入含有9mL BPW的试管内，振摇试管混匀，制备1:100的稀释液；另取1mL灭菌吸管，按上条操作依次制备10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌吸管。
本发明中，步骤S4中DNA提取步骤：分别取上述增菌液1mL，8000r/min离心，弃去上清液以去除有机酸等细菌代谢产物对PCR的不利影响，无菌水重悬后，采用玻璃珠法、磁珠法、微柱法或有机溶剂萃取法提取并纯化细菌DNA。
本发明中，步骤S5扩增可直接采用或荧光定量PCR法或PCR-电泳法或在扩增体系中加入不影响扩增的DNA染料。
本发明中，步骤S5PCR扩增后需进行扩增产物检测：扩增后直接于激发光下观察荧光强度以确证每份扩增中是否有PCR扩增产物的存在。
本发明中，增菌液配制方法是：称取24g氯化镁孔雀绿固体干粉溶于800mL超纯水中，加热煮沸至完全溶解，分装，高压蒸汽灭菌备用。
本发明中，步骤S5PCR扩增反应在PCR仪上进行，反应条件为：95℃预变性5min；95℃，30s，65℃，30s，72℃，30s，进行30个循环；最后72℃延伸4min。
本发明中，步骤S6根据PCR为沙门氏菌阳性的试管管数，通过MPN软件，报告每mL样品中沙门氏菌的MPN值。
本发明：样品采集：用预先灭菌的采样瓶采集水样，水样采集后放入冰盒中保存；水样梯度稀释：采用三个连续梯度进行稀释；水样增菌培养：将三个稀释度的样品分别加入增菌液混匀，每个稀释度做5份，放入42℃恒温培养箱中培养24h；DNA提取：采用玻璃珠法、磁珠法、微柱法或有机溶剂萃取法提取并纯化细菌DNA；PCR扩增:将提取到的DNA样本作为模板，以沙门氏菌属特异性引物进行PCR扩增；通过MPN算法进行统计分析计算水样含菌量。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.基于MPN算法的生态生物识别方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1样品采集：用预先灭菌的采样瓶采集水样，水样采集后放入冰盒中保存；
S2水样梯度稀释：采用三个连续梯度进行稀释；
S3水样增菌培养：将三个稀释度的样品分别加入增菌液混匀，每个稀释度做5份，放入42℃恒温培养箱中培养24h；
S4 DNA提取：采用玻璃珠法、磁珠法、微柱法或有机溶剂萃取法提取并纯化细菌DNA；
S5 PCR扩增:将提取到的DNA样本作为模板，以沙门氏菌属特异性引物进行PCR扩增；
S6通过MPN算法进行统计分析计算水样含菌量。
2.根据权利要求1所述的基于MPN算法的生态生物识别方法，其特征在于，所述步骤S2水样梯度稀释步骤：称取25mL食品样本加入225mL无菌BPW中，拍击式均质25s或其他方式充分震摇混合，使样本表面或内部可能存在的沙门氏菌散布于BPW中，静置数秒所得上清液作为1:10样本稀释液；吸取1:10稀释液1mL，注入含有9mL BPW的试管内，振摇试管混匀，制备1:100的稀释液；另取1mL灭菌吸管，按上条操作依次制备10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌吸管。
3.根据权利要求1所述的基于MPN算法的生态生物识别方法，其特征在于，所述步骤S4中DNA提取步骤：分别取上述增菌液1mL，8000r/min离心，弃去上清液以去除有机酸等细菌代谢产物对PCR的不利影响，无菌水重悬后，采用玻璃珠法、磁珠法、微柱法或有机溶剂萃取法提取并纯化细菌DNA。
4.根据权利要求1所述的基于MPN算法的生态生物识别方法，其特征在于，所述步骤S5扩增可直接采用或荧光定量PCR法或PCR-电泳法或在扩增体系中加入不影响扩增的DNA染料。
5.根据权利要求1所述的基于MPN算法的生态生物识别方法，其特征在于，所述步骤S5PCR扩增后需进行扩增产物检测：扩增后直接于激发光下观察荧光强度以确证每份扩增中是否有PCR扩增产物的存在。
6.根据权利要求1所述的基于MPN算法的生态生物识别方法，其特征在于，所述增菌液配制方法是：称取24g氯化镁孔雀绿固体干粉溶于800mL超纯水中，加热煮沸至完全溶解，分装，高压蒸汽灭菌备用。
7.根据权利要求1所述的基于MPN算法的生态生物识别方法，其特征在于，所述步骤S5PCR扩增反应在PCR仪上进行，反应条件为：95℃预变性5min；95℃，30s，65℃，30s，72℃，30s，进行30个循环；最后72℃延伸4min。
8.根据权利要求1所述的基于MPN算法的生态生物识别方法，其特征在于，所述步骤S6根据PCR为沙门氏菌阳性的试管管数，通过MPN软件，报告每mL样品中沙门氏菌的MPN值。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20220510 |