CN102154472A

CN102154472A - 一种水中沙门氏菌活体的定量检测方法

Info

Publication number: CN102154472A
Application number: CN2011100205050A
Authority: CN
Inventors: 张崇淼; 王晓昌; 船水尚行
Original assignee: Xian University of Architecture and Technology
Current assignee: Xian University of Architecture and Technology
Priority date: 2011-01-18
Filing date: 2011-01-18
Publication date: 2011-08-17
Anticipated expiration: 2031-01-18
Also published as: CN102154472B

Abstract

本发明公开了一种水中沙门氏菌属活体的定量检测方法，该方法根据沙门氏菌的生长特性和invA基因的保守性，采用多管发酵法从水样中初步筛选出以沙门氏菌为主的活体细菌。利用沙门氏菌属通用引物139和141，通过PCR扩增来鉴别沙门氏菌阳性菌落。通过MPN计数方法，定量检测水中的沙门氏菌活体。该方法能够准确检测水中沙门氏菌活体的含量，特异性高，操作简便可行，适用于地表水、污水等多种水样的检测。

Description

一种水中沙门氏菌活体的定量检测方法

技术领域

本发明涉及地表水体、污水的检测方法，具体涉及一种水中沙门氏菌活体的定量检测方法，该方法将多管发酵技术、PCR技术和最大可能数（MPN）计数方法相结合，能够准确的定量检测水中沙门氏菌活体的含量。适合于地表水体、污水等多种水样中沙门氏菌活体的定量检测。

背景技术

前对于沙门氏菌的检测，可以分为培养法、免疫学检测法和核酸检测法三类。培养法和免疫学检测法通常是根据沙门氏菌的生长特性，采用选择性的培养基使沙门氏菌成为优势菌群，然后基于沙门氏菌的生化特性和菌体表面抗原特性，利用生化反应和抗原-抗体反应的特异性进行沙门氏菌的检测。这些方法大都存在操作复杂、易受干扰、难以定量检测的问题。沙门氏菌属种类极多，其性状在水环境中时常会出现变异，常常出现实际生化反应结果与沙门氏菌鉴别表中的类型不相符的情况，造成检测失败。核酸检测法是利用PCR技术对沙门氏菌保守的基因片段进行检测来实现准确检测的目的，然而其最大的弊端是无法区分活体和已死亡的菌体，单纯利用PCR技术无法深入研究水环境中沙门氏菌对人体健康的影响。因此，目前还没有一种适用于水中沙门氏菌活体的定量检测方法。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种水中沙门氏菌活体的定量检测方法。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种水中沙门氏菌活体的定量检测方法，其特征在于，按下列步骤进行：

步骤一，样品采集：

用预先灭菌的采样瓶采集水样1L，水样采集后立即放入冰盒内保存，6h内进行检测；

步骤二，水样的浓缩：

对于沙门氏菌浓度低的水样，真空抽滤1000mL水样通过微孔滤膜，过滤完毕后取出滤膜，置于已灭菌的烧杯中，加入10mL磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液的pH值为7.4，用磁力搅拌洗脱滤膜30min；弃滤膜，保存洗脱产物，取洗脱产物1mL，加入到9mL超纯水中，混匀后再取出1mL，加入到9mL超纯水中，依次梯度稀释，得到10^-0、10^-1和10^-2三种稀释度的样品；

对于沙门氏菌浓度高的水样，取原水1mL，加入到9mL超纯水中，混匀后再取出1mL，加入到9mL超纯水中，依次梯度稀释，得到10^-0、10^-1和10^-2稀释度的样品；

步骤三，水样前增菌：

将10^-0、10^-1和10^-2这三种稀释度的样品分别加入前增菌液混匀，每个稀释度做5份，放入37℃恒温培养箱中培养24h；

步骤四，选择性增菌：

将各个稀释度样品的前增菌产物1mL转入到100 mL选择性增菌液中并混匀，在42℃下进行选择性增菌培养24h；

步骤五，平板划线分离：

挑取选择性增菌产物，分别在XLD平板和BS平板上划线分离和培养，其中，XLD平板在37℃下培养24h，BS平板在37℃下培养48h；

步骤六，阳性菌落的鉴定：

培养完毕，观察在XLD和BS平板上生长的菌落形态，分别挑取不同形态的菌落，置于PCR反应管中，以沙门氏菌属通用引物进行扩增，扩增片段长度为284 bp；并对PCR产物在100V下电泳40min，观察在284 bp位置上是否有明亮的扩增条带出现，若有，则该菌落为沙门氏菌阳性；

所述的沙门氏菌属通用引物包括上游引物139和下游引物141，其中：

上游引物139的序列为：5'- GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3'；

下游引物141的序列为：5'- TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3'；

步骤七，鉴定XLD和BS两种平板上的阳性菌落，并进行互补计数，对于每个稀释度的样品，对应的XLD平板和BS平板只要有其一是阳性平板，则该稀释度即为阳性；以阳性组合的方式记录平板上阳性菌落的结果，对照MPN表查找对应的MPN值，除以在步骤二中水样浓缩的倍数，得到100 mL水样的沙门氏菌活体含量（MPN/100mL）。

所述的PCR扩增的条件是：

（1）PCR反应体系总体积25μL，其中各成分终浓度为：引物139和引物141各0.4μmol/L，0.75U Taq酶，0.8 mmol/L dNTPs，2.5 mmol/L MgCl₂；

（2）PCR扩增反应在PCR仪上进行，反应条件为：95℃预变性5min；95℃，30s，65℃，30s，72℃，30s，进行30个循环；最后72℃延伸4min。

本发明的水中沙门氏菌活体的定量检测方法，能够定量检测水中沙门氏菌活体含量，并提高检测的特异性，操作简便可行，适用于地表水、污水等多种水样的检测。

附图说明

图1是沙门氏菌属通用引物的PCR产物电泳图，其中的泳道的标号分别为，M泳道表示DNA marker；1泳道表示鼠伤寒沙门氏菌；2泳道表示伤寒沙门氏菌（CMCC 50071）；3泳道表示大肠埃希菌（ATCC25922）；4泳道表示金黄色葡萄球菌（ATCC25923）；5泳道表示金黄色葡萄球菌（ATCC29213）；6泳道表示铜绿假单胞菌（ATCC27853）；7泳道表示志贺氏菌；8泳道表示枯草芽孢杆菌；N泳道表示阴性对照。

以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。

具体实施方式

1、设备和试剂

（1）PCR仪；

（2）核酸水平电泳仪；

（3）凝胶成像仪；

（4）恒温培养箱

（5）高压蒸汽灭菌器

（6）不锈钢真空抽滤器

（7）微波炉

（8）0.22μm混合纤维素酯微孔滤膜

（9）鼠伤寒沙门氏菌；

（10）木糖赖氨酸去氧胆酸盐琼脂培养基（XLD）

（11）亚硫酸铋琼脂培养基（BS）

（12）氯化镁孔雀绿增菌液

（13）蛋白胨

（14）琼脂糖

（15）Tris干粉

（16）Na₂EDTA·2H₂O

（17）核酸染料

（18）DNA marker

（19）6×Loading buffer

（20）Taq酶

（21）dNTPs

（22）PCR buffer

（23）沙门氏菌属通用引物，包括上游引物139和下游引物141；上、下游引物由专业生物工程公司合成。上游引物139的核苷酸序列为：5'- GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA -3'；下游引物141的核苷酸序列为：5'- TCATCGCACCGTCAAAGGAACC -3'，特异性扩增片段为284bp。

2、试剂配制

（1）前增菌液配制：称取8g蛋白胨溶于400mL超纯水中，加热煮沸至完全溶解，定量分装，高压蒸汽灭菌备用。

（2）选择性增菌液配制：称取24g氯化镁孔雀绿固体干粉溶于800mL超纯水中，加热煮沸至完全溶解，分装，高压蒸汽灭菌备用。

（3）XLD平板的制备：称取21.57g XLD培养基溶于400mL超纯水中，加热煮沸至完全溶解，冷却至55℃左右，摇匀，倾注平板，室温冷却备用。

（4）BS平板的制备：称取19.84g BS培养基溶于400mL超纯水中，加热煮沸至完全溶解，冷却至55℃左右，摇匀，倾注平板，室温冷却备用。

（5）电泳缓冲液的制备：称量242g Tris干粉和37.2g Na₂EDTA·2H₂O置于烧杯中，加入约800 mL的超纯水，57.1mL醋酸，充分搅拌溶解。加超纯水定容至1L后，得到50×TAE Buffer。根据需要，以1：50的比例稀释，即得到1×TAE Buffer，作为电泳缓冲液。

（6）琼脂糖凝胶的制备：称量1.5g琼脂糖，置于250mL锥形瓶中，加入100 mL 1×TAE Buffer，放入微波炉中加热至完全溶解，溶液清澈透明时取出。待稍冷，加入10μL 核酸染料，混匀后倾倒入已插入梳子的核酸水平电泳槽中。待琼脂糖凝胶完全凝固后即可使用。

3、测定程序

（1）样品采集：用预先灭菌的采样瓶采集水样1L，水样采集后立即放入冰盒内保存，6h内进行检测。

（2）水样的浓缩：将不锈钢真空抽滤器高压蒸汽灭菌，把已灭菌的微孔滤膜用超纯水润湿，平贴于真空抽滤器的承托片上，过滤1000mL水样。结束后，取出滤膜，置于无菌的烧杯中，其中盛有10mL磷酸盐缓冲液（pH7.4），磁力搅拌洗脱滤膜30min。取洗脱产物1mL，加入到9mL超纯水中，混匀后再取出1mL，加入到9mL超纯水中，依次梯度稀释，得到10^-0、10^-1和10^-2三种稀释度的样品。

（3）水样前增菌：取10^-0、10^-1和10^-2三种稀释度的样品各1mL，分别加入9 mL前增菌液，在具棉塞的锥形瓶中混匀，每种稀释度各做5管，放入37℃恒温培养箱中培养24h。

（4）选择性增菌：分别将各个稀释度样品的前增菌产物1mL转入到100 mL选择性增菌液中，在具棉塞的锥形瓶中混匀后置于42℃恒温培养箱中培养24h。

（5）平板划线分离：对于每一个进行选择性增菌的锥形瓶，都用接种环挑取其中的选择性增菌产物，分别在一个XLD平板和一个BS平板上划线分离单菌落，然后在37℃培养。XLD平板培养24h，BS平板培养48h。

（6）阳性菌落鉴定：培养完毕，观察XLD和BS平板上菌落生长形态。用接种针分别挑取各平板上不同形态的单菌落，置于PCR反应管中，加入沙门氏菌属通用引物139（10μmol/L）和141（10μmol/L）各1μL，0.15μL 5U/ul Taq酶，2μL 10 mmol/L dNTPs，2.5μL 25mmol/L MgCl₂，2.5μL 10×PCR buffer，15.85μL超纯水，总反应体积25 μL。PCR反应条件为：95℃预变性5min；然后95℃，30s，65℃，30s，72℃30s，共进行30个循环；最后72℃延伸4min。

反应结束后，取PCR产物1μL，加入5μL 6×Loading buffer混匀，取5μL置于琼脂糖凝胶的点样孔中，以100V的电压电泳约40 min。完毕后，取出凝胶，置于凝胶成像仪上，以DNA marker作为参照，观察样品扩增条带的位置。如果样品在284 bp的位置上有明亮的扩增条带，则证明该菌落为沙门氏菌属阳性。一个平板上只要出现一个阳性菌落，该平板即为阳性。

（7）MPN定量分析：对于每个稀释度的样品，其XLD平板和BS平板的阳性菌落鉴定结果互补计数。XLD平板和BS平板只要有其一是阳性平板，则该稀释度样品即为阳性。以阳性组合的方式记录每个稀释度样品的检测结果，查找最大可能数（MPN）表（附表1），得到对应的MPN值。例如：10^-0样品5管中有3管呈阳性，10^-1稀释度样品5管中有1管呈阳性，10^-2稀释度样品5管全部为阴性，则记录为“3-1-0”，查找最大可能数（MPN）表得到110MPN/100mL。由于在步骤（2）中进行了100倍的浓缩，因此水样的沙门氏菌活体含量为

Figure 2011100205050100002DEST_PATH_IMAGE001

。

表1：最大可能数（MPN）表

对于沙门氏菌浓度高的水样，取原水1mL，加入到9mL超纯水中，混匀后再取出1mL，加入到9mL超纯水中，依次梯度稀释，得到10^-0、10^-1和10^-2稀释度的样品，其余测定步骤与上述相同。在步骤（7）中，水样浓缩的倍数为1，即从附表1中直接查得的MPN值即为水样的沙门氏菌活体含量。

本发明的方法与现有的沙门氏菌的检测技术相比较，具有以下显著的优点：

（1）准确检测沙门氏菌活体：

本发明是采用细菌培养法与PCR技术相结合的方法进行检测，仅有那些具有活性、能够在选择性培养基上生长的沙门氏菌才会被检测到，而不会检测到已死亡的菌体。

（2）能够定量检测沙门氏菌

目前沙门氏菌的检测大都是定性检测，不能得到样品中沙门氏菌的含量。本发明采用了最大可能数法来计数，尽管它是一种应用概率理论来估算细菌含量的方法，但在计数之前的步骤都经过了优化，通过检测已知菌量样品证明了本方法能够较准确的反映出水样中沙门氏菌的含量（见附表2）。

表2：已知沙门氏菌含量的水样的检测结果

（3）特异性大幅度提高

现有的沙门氏菌检测技术是基于沙门氏菌的生化特性和血清学特性来鉴定的，而沙门氏菌属种类繁多，目前已确认的就有2000多个血清型，而且沙门氏菌在水中的变异性很大，表面抗原很可能会产生变异或消失，很容易造成检测失败，而沙门氏菌属特有的基因片段则具有很强的稳定性。本发明采用PCR技术检测沙门氏菌属invA基因，与其他微生物均无交叉反应，具有极高的特异性（见附图1和附表3）。

表3：沙门氏菌通用引物涵盖的部分血清型

（4）操作步骤简单可行，省时省力

传统的沙门氏菌检测方法中都包括了极为繁琐的生化检验和血清学检验步骤，通常一个完整的检测程序需要1周才能完成。而且，对于很多水样，会出现实际生化反应结果与沙门氏菌鉴别表中的类型不相符的情况，使检测无法继续进行。本方法利用PCR技术作为鉴定手段，大大简化了操作步骤，3天以内即可完成检测。

Claims

1.一种水中沙门氏菌活体的定量检测方法，其特征在于，按下列步骤进行：

步骤一，样品采集：

步骤二，水样的浓缩：

步骤三，水样前增菌：

步骤四，选择性增菌：

步骤五，平板划线分离：

步骤六，阳性菌落的鉴定：

培养完毕，观察在XLD和BS平板上生长的菌落形态，分别挑取不同形态的菌落，置于PCR反应管中，以沙门氏菌属通用引物进行扩增，扩增片段长度为284 bp；并对PCR产物在100V下电泳40 min，观察在284 bp位置上是否有明亮的扩增条带出现，若有，则该菌落为沙门氏菌阳性；

上游引物139的序列为：5'- GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3'；

下游引物141的序列为：5'- TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3'；

步骤七，鉴定XLD和BS两种平板上的阳性菌落，并进行互补计数，对于每个稀释度的样品，对应的XLD平板和BS平板只要有其一是阳性平板，则该稀释度即为阳性；以阳性组合的方式记录平板上阳性菌落的结果，对照MPN表查找对应的MPN值，除以在步骤二中水样浓缩的倍数，得到100 mL水样的沙门氏菌活体含量。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的PCR扩增的条件是：

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的前增菌液配制方法是：称取8g蛋白胨溶于400 mL超纯水中，加热煮沸至完全溶解，定量分装，高压蒸汽灭菌备用。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的选择性增菌液配制方法是：称取24g氯化镁孔雀绿固体干粉溶于800mL超纯水中，加热煮沸至完全溶解，分装，高压蒸汽灭菌备用。