CN103224988A - 一种用于检测食品中的沙门氏菌的试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于检测食品中的沙门氏菌的试剂盒，所述试剂盒包括：反应混合液，所述反应混合液包含：浓度均为0.2μM的外引物F3和外引物B3；浓度均为1.6μM的内引物FIP和内引物BIP；浓度均为0.8μM的环引物LoopF和环引物LoopB；20mM pH8.8 Tris buffer、10mM KCl、10mM NH4SO4、0.1重量％的吐温20、4至8mM MgSO4、0.8M甜菜碱、1.2mM dNTP、0.04至0.08mM的钙黄绿素、0.4至1.6mM的MnCl2和0.32U/μL的Bst DNA聚合酶；DNA提取试剂A；DNA提取试剂B；阳性对照。本发明还涉及该试剂盒的使用方法。与传统检测方法相比，本发明所述的方法检测用时短、成本低，结果可直接判定，不需仪器。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学检测领域，具体的说，本发明涉及一种用于检测食品中的沙门氏菌的试剂盒及其使用方法。
背景技术
环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种新型核酸扩增方法，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)在恒温条件下进行特异、敏感和高效的核酸扩增，LAMP反应需要特异性设计2条内引物(FIP和BIP)和2条外引物(F3和B3)，靶DNA在60℃～65℃恒温条件下(如水浴箱内)保温约60min，即可完成LAMP核酸扩增反应。LAMP最终产物包括大量茎环状DNA混合物，由于LAMP扩增产生了巨大数量的DNA产物及焦磷酸根离子，因此焦磷酸根离子与反应体系中的镁离子反应会生成焦磷酸镁沉淀，故可通过反应管内副产物的浊度或荧光来对产物进行检测。
钙黄绿素染色原理是：反应之初钙黄绿素与荧光猝灭剂锰离子结合而不发生荧光，反应管呈橙色；反应开始后，生成的焦磷酸根离子更易于与锰离子结合形成沉淀而释放出游离的钙黄绿素，钙黄绿素与镁离子结合发出绿色荧光，反应管呈绿色。
沙门氏菌属(Salmonella)是引起细菌性食物中毒的重要病原体之一，也是肠杆菌科中最复杂的菌属，目前全世界已分离出2523个血清型，我国已发现216个。许多血清型的沙门氏菌都能产生毒素，以肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌最常见。传统的沙门氏菌生物检测方法存在很大缺点，如耗时长、灵敏度低、需要昂贵的仪器设备等。因此，开发一种新型快速、不依托昂贵仪器设备的检测方法显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测食品中的沙门氏菌的试剂盒。
本发明目的还在于提供该试剂盒的使用方法。
为了实现本发明的目的，本发明提供一种用于检测食品中的沙门氏菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
反应混合液，所述反应混合液包含：浓度为0.2μM的外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；浓度为0.2μM的外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；浓度为1.6μM的内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；浓度为1.6μM的内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；浓度为0.8μM的环引物LoopF，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；浓度为0.8μM的环引物LoopB，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；20mM pH8.8 Tris buffer、10mM KCl、10mM NH4SO4、0.1重量％的吐温20、4至8mM MgSO4、0.8M甜菜碱、1.2mM dNTP、0.04至0.08mM的钙黄绿素、0.4至1.6mM的MnCl2和0.32U/μl的Bst DNA聚合酶；
DNA提取试剂A，所述DNA提取试剂A为25mM NaOH；
DNA提取试剂B，所述DNA提取试剂B为1M pH8.0 Tris-HCl；
阳性对照：沙门氏菌DNA。
具体而言，本发明中使用的引物序列如下：
外引物
F3：5’-GCGAAGCGTACTGGAAAGG-3’
B3：5’-TCAACAATGCGGGGATCTG-3’
内引物
FIP：5’-ATGATGCCGGCAATAGCGTCACAAAGCCAGCTTTACGGTTCC-3’
BIP：5’-GGATGACCCGCCATGGTATGG-ACCATCACCAATGGTCAGC-3’
环引物
LoopF：TGATAAACTTCATCGCACCGTC
LoopB：ATTTGTCCTCCGCTCTGTCTACT
上述引物例如可以由上海生工生物工程有限公司合成。
优选地，本发明所述的试剂盒还包括保护液，所述保护液为液体石蜡。
更优选地，所述MgSO4的浓度为8mM。
更优选地，所述钙黄绿素的浓度为0.08mM。
更优选地，所述MnCl2的浓度为0.4mM。
本发明还提供一种用于检测食品中的沙门氏菌的试剂盒的使用方法，该方法包括下列步骤：
1)待测样品的DNA模版提取：当所述待测样品为食品时，将所述待测样品加入用于沙门氏菌增菌培养的缓冲蛋白胨水培养基中进行增菌培养，从而得到增菌液；将200μL的所述增菌液加入1.5mL的离心管中，在7000g下离心2min，吸弃上清液；然后加入100μL的DNA提取试剂A，混匀，在98℃下加热10min；接着加入20μL的DNA提取试剂B，混匀，在7000g下离心2min，上清液即为待检DNA模版，其中所述DNA提取试剂A为25mM NaOH，所述DNA提取试剂B为1MpH8.0 Tris-HCl；当所述待测样品为细菌纯培养物时，挑取纯培养加入到含200μL无菌去离子水的1.5mL离心管中，在98℃下加热10min，在7000g下离心2min，上清液即为待检DNA模版；
2)提供23μL的反应混合液，所述反应混合液包含：浓度为0.2μM的外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；浓度为0.2μM的外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；浓度为1.6μM的内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；浓度为1.6μM的内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；浓度为0.8μM的环引物LoopF，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；浓度为0.8μM的环引物LoopB，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；20mM pH8.8 Tris buffer、10mMKCl、10mM NH4SO4、0.1重量％的吐温20、4至8mM MgSO4、0.8M甜菜碱、1.2mM dNTP、0.04至0.08mM的钙黄绿素、0.4至1.6mM的MnCl2和0.32U/μl的Bst DNA聚合酶；
3)使2μL的所述待检DNA模版、阳性对照、阴性对照分别和23μL的所述反应混合液在64℃恒温反应60min，其中所述阳性对照为沙门氏菌DNA，阴性对照为制备DNA模版的空白试剂；以及
4)分析判断反应产物结果：绿色浑浊表示结果为阳性，橙色澄清表示结果为阴性。
优选地，在所述步骤3)的恒温反应之前加入保护液，所述保护液为液体石蜡。液体石蜡浮在反应液的上面，从而避免反应产物从反应容器中溢出以造成相互干扰。
更优选地，所述MgSO4的浓度为8mM。
更优选地，所述钙黄绿素的浓度为0.08mM。
更优选地，所述MnCl2的浓度为0.4mM。
常规的LAMP方法，需要在反应结束后开盖加入1000×SYBRGreen I荧光染料或Gene Finder染料来显色，反应产物易形成气溶胶而污染周围环境，容易污染环境而造成假阳性，同时SYBR Green I荧光染料或Gene Finder染料还会因为引物二聚体而引起假阳性。因此本发明使用钙黄绿素染色技术替代了SYBR Green I荧光染料和GeneFinder这些染料，在配置LAMP反应液时就可以加入反应液中，无需LAMP反应后开盖，并且钙黄绿素仅在发生LAMP反应时才显色，避免了SYBR Green I荧光染料和Gene Finder染料造成的假阳性问题，具有更好的特异性。与传统检测方法相比，本发明所述的方法检测用时短、成本低，结果可直接判定，不需仪器。本发明的试剂盒将所有反应试剂都合并到同一反应液中，使得反应步骤更加简便，试剂盒的结构更为简单。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
在本发明中，除非特别指明，否则使用的菌株如下：
沙门氏菌(ATCC 50041，源自中国CDC营养与食品安全所)。
实施例1 本发明的试剂盒
所述试剂盒：包括24个反应管，每管中含有23μL的反应混合液和30μL的液体石蜡；1管阳性对照(50μL)；2管DNA提取试剂A(1300μL/管)；1管DNA提取试剂B(600μL)。所述反应混合液包含：浓度为0.2μM的外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；浓度为0.2μM的外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；浓度为1.6μM的内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；浓度为1.6μM的内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；浓度为0.8μM的环引物LoopF，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；浓度为0.8μM的环引物LoopB，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；20mM pH8.8 Trisbuffer、10mM KCl、10mM NH4SO4、0.1重量％的吐温20、8mMMgSO4、0.8M甜菜碱、1.2mM dNTP、0.08mM的钙黄绿素、0.4mM的MnCl2和0.32U/μl的Bst DNA聚合酶。所述DNA提取试剂A为25mMNaOH。所述DNA提取试剂B为1M pH8.0 Tris-HCl。阳性对照：沙门氏菌DNA。
阴性对照：制备待检DNA模版用空白试剂。
实施例2 本发明的方法的灵敏度测试
BPW培养基配制：称取CM201缓冲蛋白胨水培养基(购自北京陆桥技术有限责任公司的增菌培养基)4.5g，加入水配制成225mL的增菌培养基，即为BPW培养基。pH值为7.0±0.2。121℃灭菌15min，备用。
将沙门氏菌接种到4mL的BPW培养基中，37℃过夜培养。将40μL的过夜培养菌液接种到另外的新的4mL的BPW培养基中，在35℃150rpm下培养4h，获得中期细胞。然后用生理盐水10倍梯度稀释法进行稀释，每个浓度的处理都进行三次。选取10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-76个稀释度的溶液100μL，涂布在TSA平板(购自北京陆桥技术有限责任公司)上，在37℃孵化过夜。菌落计数结果下表1，10-6菌液中沙门氏菌浓度平均值为86cfu/100μL。
表1
分别选取10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-76个稀释度的溶液100μL，至1.5mL的离心管，98℃加热10min，7000g离心1min，分别取50μL的上清液加入到含有50μL灭菌去离子水的新离心管中，作为LAMP反应的DNA模版。
分别选取上述2μL的6个稀释度的LAMP反应的DNA模版溶液(每个稀释度重复三次)、2μL的阴性对照依次加入含有23μL的实施例1中所述的反应液及30μL的液体石蜡的反应管中，64℃反应60min，反应管呈绿色为阳性，橙色为阴性。LAMP检测结果以3次全部检出为最高灵敏度，结果见下表2。即10-4稀释度可全部检出，10-5稀释度两次阳性，一次阴性。考察5倍稀释的10-4菌液，检测结果全阳性，灵敏度为18cfu。
表2
注：“+”代表阳性“-”代表阴性
实施例3 本发明的方法的特异性测试
分别挑取13株沙门氏菌(Sal)、6株大肠埃希氏菌(E.coli)、8株副溶血性弧菌(V.P.)、2株志贺氏菌(Shi)、12株单增李斯特氏菌(L.M.)以及6株金黄色葡萄球菌(S.A.)加入200μL灭菌去离子水中，98℃加热10min，7000g离心2min，取上清液作为LAMP检测DNA模版溶液。
将上述制备的DNA模版溶液2μL加入含有23μL的实施例1中所述的反应液及30μL的液体石蜡的反应管中，64℃反应60min，阳性为绿色，阴性为橙色。
结果显示只有沙门氏菌检测管为阳性，其他菌株检测管为阴性。
实施例4 散装牛肉中沙门氏菌的检测
BPW培养基配制：称取CM201缓冲蛋白胨水培养基(购自北京陆桥技术有限责任公司的增菌培养基)4.5g，加入水配制成225mL的增菌培养基，即为BPW培养基。pH值为7.0±0.2。121℃灭菌15min，备用。
样品制备：将散装牛肉的冷冻样品在45℃以下不超过15min或2℃～5℃不超过18h解冻。在无菌操作条件下取检样品25g，加入BPW培养基225mL，用旋转刀片式均质器以8,000r/min均质1min。分为两份，一份作为待检样品，另一份再加入1mL过夜活化培养的沙门氏菌菌液。使用实施例1中所述的试剂盒来检测其中是否存在沙门氏菌。
增菌：分别将上述样品的1∶10的稀释液在36℃±1℃下培养12h，以得到增菌液。
增菌液DNA模版制备：取增菌液200μL加到1.5mL离心管中，7000g离心2min，尽量吸弃上清液，加入100μL的DNA提取试剂A，98℃加热10min，加入20μL的DNA提取试剂B，混匀，7000g离心2min，上清液即为DNA模版，-20℃可保存6个月备用。
LAMP检测：将2μL的上述DNA模版、阳性对照、阴性对照(空白试剂)分别加入含有23μL的反应液及30μL保护液的反应管中，64℃反应60min，反应管呈绿色为阳性，橙色为阴性。
LAMP检测结果：待检样品管为橙色，加入1mL过夜活化培养的沙门氏菌菌液的样品管为绿色，说明此次检测的散装牛肉中无沙门氏菌污染。
实施例5 增菌液中LAMP检测灵敏度考察
取过夜活化培养沙门氏菌菌液，使用生理盐水10倍梯度稀释至10-6数量级，每个稀释度吸取200μL，重复三次，菌落计数，10-5菌液中沙门氏菌浓度平均值为21cfu/100μL。
取过夜培养的无沙门氏菌的待检增菌液200μL加到1.5mL离心管中，重复18次。分别加入上述稀释处理的沙门氏菌菌液100μL(10-1～10-6)，每个稀释度重复3次。
计数结果见下表3：
表3
制备上述增菌液DNA模版，方法同上。
LAMP检测：2μL的上述10-2-10-49个DNA模版、阳性对照、阴性对照分别加入含有23μL反应液及30μL保护液的反应管中，64℃反应60min，反应管呈绿色为阳性，橙色为阴性。
检测结果：10-2-10-3DNA模版检测全阳性，10-4检测一次阳性，两次阴性，增菌液中灵敏度为42cfu。如果食品样品中有沙门氏菌，经增菌后浓度可达到108cfu/mL，即2×107cfu/200μL，而上述LAMP检测灵敏度可达到2100cfu/200μL，能够达到食品检测要求。
对比例1
按照和实施例1相同的方式制备试剂盒，并且按照和实施例3相同的方式进行检测(使用同一沙门氏菌DNA模板)，以考察钙黄绿素和氯化锰浓度对于染色效果的影响，不同之处在于，钙黄绿素和氯化锰浓度以及染色结果如下：
(1)钙黄绿素0.04mM，氯化锰0.8mM，阳性对照为橙色沉淀，阴性为橙色澄清，染色失败。
(2)钙黄绿素0.08mM，氯化锰0.8mM，阳性对照为橙绿色浑浊，阴性为橙色澄清，可以染色，但效果稍差。
(3)钙黄绿素0.08mM，氯化锰1.6mM，阳性对照为橙色澄清，阴性为橙色澄清，抑制LAMP反应。
(4)钙黄绿素0.08mM，氯化锰0.4mM，阳性对照为绿色浑浊，阴性为橙色澄清，染色效果好。
本发明人吃惊地发现，钙黄绿素和氯化锰不同的浓度配比会产生不同的染色效果。例如，在钙黄绿素为0.08mM的情况下，氯化锰为0.8mM时可以染色，但效果稍差；提高氯化锰为1.6mM时，会抑制LAMP反应。降低氯化锰为0.4mM时反而染色效果较好；由此可见，钙黄绿素和氯化锰的浓度配比直接影响染色效果。
对比例2
按照和实施例1相同的方式制备试剂盒，并且按照和实施例3相同的方式进行检测(使用同一沙门氏菌DNA模板)，来考察不同浓度的硫酸镁对于LAMP效果的影响，不同之处在于，硫酸镁的浓度分别为4mM和6mM。结果发现，在硫酸镁的浓度分别为4mM、6mM、8mM，LAMP反应正常进行，但是4mM、6mM、8mM开始出现颜色的时间分为60min、50min、40min。本发明人吃惊地发现，在硫酸镁的浓度为8mM时，LAMP反应时间大大缩短，只要40分钟即可以观察到染色结果，该染色结果和硫酸镁浓度为4mM、6mM的染色结果相比具有十分显著的优势。
对比例3
按照和实施例5相同的方式来检测散装牛肉增菌液中沙门氏菌，同样取过夜培养的无沙门氏菌增菌液200μL加到1.5mL离心管中，7000g离心2min，尽量吸弃上清液，重复18次，分别加入实施例5中稀释处理的沙门氏菌菌液100μL(10-1～10-6)，每个稀释度重复3次。不同之处在于，在制备DNA模版时，不使用DNA提取试剂A和DNA提取试剂B，而是采用加入100μL TE或10％Chelex 100 98℃加热10分钟的方法来提取。选取10-2～10-49个DNA模板进行LAMP检测，结果发现，TE或10％Chelex 100法提取到的DNA模板，10-2的3个模板检测结果全部为阳性，10-3的3个模板检测结果2个阳性1个阴性，灵敏度均低于使用DNA提取试剂A和DNA提取试剂B得到的DNA模板。
Claims (10)
1.一种用于检测食品中的沙门氏菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
反应混合液，所述反应混合液包含：浓度为0.2μM的外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；浓度为0.2μM的外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；浓度为1.6μM的内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；浓度为1.6μM的内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；浓度为0.8μM的环引物LoopF，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；浓度为0.8μM的环引物LoopB，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；20mM pH8.8 Tris buffer、10mMKCl、10mM NH4SO4、0.1重量％的吐温20、4至8mM MgSO4、0.8M甜菜碱、1.2mM dNTP、0.04至0.08mM的钙黄绿素、0.4至1.6mM的MnCl2和0.32U/μL的Bst DNA聚合酶；
DNA提取试剂A，所述DNA提取试剂A为25mM NaOH；
DNA提取试剂B，所述DNA提取试剂B为1M pH8.0 Tris-HCl；
阳性对照：沙门氏菌DNA。
2.根据权利要求1所述的用于检测食品中的沙门氏菌的试剂盒，其特征在于，还包括保护液，所述保护液为液体石蜡。
3.根据权利要求1或2所述的用于检测食品中的沙门氏菌的试剂盒，其特征在于，所述MgSO4的浓度为8mM。
4.根据权利要求1或2所述的用于检测食品中的沙门氏菌的试剂盒，其特征在于，所述钙黄绿素的浓度为0.08mM。
5.根据权利要求1或2所述的用于检测食品中的沙门氏菌的试剂盒，其特征在于，所述MnCl2的浓度为0.4mM。
6.一种用于检测食品中的沙门氏菌的试剂盒的使用方法，该方法包括下列步骤：
1)待测样品的DNA模版提取：当所述待测样品为食品时，将所述待测样品加入用于沙门氏菌增菌培养的缓冲蛋白胨水培养基中进行增菌培养，从而得到增菌液；将200μL的所述增菌液加入1.5mL的离心管中，在7000g下离心2min，吸弃上清液；然后加入100μL的DNA提取试剂A，混匀，在98℃下加热10min；接着加入20μL的DNA提取试剂B，混匀，在7000g下离心2min，上清液即为待检DNA模版，其中所述DNA提取试剂A为25mM NaOH，所述DNA提取试剂B为1M pH8.0 Tris-HCl；当所述待测样品为细菌纯培养物时，挑取纯培养加入到含200μL无菌去离子水的1.5mL离心管中，在98℃下加热10min，在7000g下离心2min，上清液即为待检DNA模版；
2)提供23μL的反应混合液，所述反应混合液包含：浓度为0.2μM的外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：l所示；浓度为0.2μM的外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；浓度为1.6μM的内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；浓度为1.6μM的内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；浓度为0.8μM的环引物LoopF，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；浓度为0.8μM的环引物LoopB，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；20mM pH8.8Tris buffer、10mM KCl、10mM NH4SO4、0.1重量％的吐温20、4至8mM MgSO4、0.8M甜菜碱、1.2mM dNTP、0.04至0.08mM的钙黄绿素、0.4至1.6mM的MnCl2和0.32U/μl的Bst DNA聚合酶；
3)使2μL的所述待检DNA模版、阳性对照、阴性对照分别和23μL的所述反应混合液在64℃恒温反应60min，其中所述阳性对照为沙门氏菌DNA，阴性对照为制备DNA模版的空白试剂；以及
4)分析判断反应产物结果：绿色浑浊表示结果为阳性，橙色澄清表示结果为阴性。
7.根据权利要求6所述的用于检测食品中的沙门氏菌的试剂盒的使用方法，其特征在于，在所述步骤3)的恒温反应之前加入保护液，所述保护液为液体石蜡。
8.根据权利要求7或8所述的用于检测食品中的沙门氏菌的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述MgSO4的浓度为8mM。
9.根据权利要求7或8所述的用于检测食品中的沙门氏菌的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述钙黄绿素的浓度为0.08mM。
10.根据权利要求7或8所述的用于检测食品中的沙门氏菌的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述MnCl2的浓度为0.4mM。
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