CN106434862A - 实时检测食源性沙门氏菌的lamp试剂盒 - Google Patents

实时检测食源性沙门氏菌的lamp试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了实时检测食源性沙门氏菌的LAMP引物组，包括一对内引物FIP和BIP、一对外引物F3和B3和一条环引物LP，并据此构建了相应的LAMP试剂盒。应用本发明结合浊度仪使用，根据浊度值的变化可以实现对对整个反应过程中产物量的实时、定量监控；根据体系的浊度值可以判断反应结果；同时，反应结束后还可以通过肉眼观察荧光染料钙黄绿素/MnCl2的颜色变化直接判断结果，从而实现对肉类食品中沙门氏菌的实时、快速、结果可视化检测，为基层实验室的快速检测食源性沙门氏菌带来了方便。

Description

实时检测食源性沙门氏菌的LAMP试剂盒
技术领域
本发明属于食源性沙门氏菌检测领域，尤其涉及一种实时检测食源性沙门氏菌的LAMP试剂盒。
技术背景
沙门氏菌(Salmonella)是一种常见的人畜共患病原菌，拥有2500多种不同的血清型，呈全球性分布。该细菌通常存在于亚临床感染动物的肠道以及排泄物中，在肉类屠宰加工中经常由于不当的操作导致肠道内的沙门氏菌污染肉类胴体或者屠宰场水源而造成交叉污染，人类食用被污染的肉类可导致食物中毒而引发公共卫生问题。我国细菌性食物中毒的70％～80％是由沙门氏菌引起的，其中90％的食物中毒是由畜禽肉、水产品及相关制品引起的。由于沙门氏菌引起的食物中毒一般是突发性公共安全事件，因此研究一种针对肉类等食品中沙门氏菌的快速检测技术具有重要的公共卫生意义。目前，检测食源性沙门氏菌的检测方法主要有国家标准检测技术GB/T 4789-2008，以免疫学为基础的检测方法如乳胶凝集试验、ELISA等，以分子生物学为基础的快速检测方法如PCR、荧光定量PCR、基因芯片技术等。其中，国标分离鉴定法大体过程是：食物样品的剪碎处理-预增菌-选择性增菌-选择性平板分离-生化实验、血清学试验，该方法结果准确但是过程繁杂、耗时长，需要5～7天；ELISA法比国标分离法快速、简便，可将检测时间缩短至2天，但是也有一些难以克服的缺点如：与相似抗原成分的细菌有交叉反应性、敏感性不高、容易导致假阴性的结果等；PCR、荧光定量PCR、基因芯片技术等分子生物学技术检验快速，在敏感性和特异性方面都较好，可以弥补ELISA的缺点，但是需要复杂的仪器、成本过高。这些方法在成本、检测时间、灵敏度以及操作方便性上都存有缺陷，一定程度上限制了它们在基层实验室中的实际应用。
环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术，是一种新型的核酸检测方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计特异引物，利用链置换DNA聚合酶在60-65℃的恒温水浴锅内作用15-60min，即可实现对靶基因的109-1010倍扩增，若设计两条环状引物还可使反应速度提升1/3-1/2。通过扩增副产物焦磷酸镁沉淀或者加入荧光染料即可判断是否发生反应。与其它分子生物学检测方法相比，LAMP具有试验条件低、特异性强、灵敏度高等优势，非常适合应用于基层单位。但是，以往报道的技术中所采用的LAMP方法检测需要扩增40-60min后加入荧光染料或者借助琼脂糖凝胶电泳才能判断结果，缺乏对整个反应过程的实时、定量性监控，而且若在反应前加入荧光染料SYBR Green会干扰链置换反应而造成不准确的结果，采用琼脂糖凝胶电泳需要开盖加样，极容易导致气溶胶的污染。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高、实时快速、结果可视化的实时检测食源性沙门氏菌的LAMP试剂盒，该试剂盒适用于肉类食品中沙门氏菌的快速检测，可方便在基层检测单位实现食源性沙门氏菌的快速、准确检测和鉴定。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
实时检测食源性沙门氏菌的LAMP引物组，包括一对内引物FIP和BIP、一对外引物F3和B3和 一条环引物LP，
内引物(上游)FIP序列为5’-ACGCACGGAAACACGTTCGCAAGAAGTGCTCAGACATGCC-3’(SEQ.ID.No.9)；
内引物(下游)BIP序列为5’-TGTGGGCGCCAAGAGAAAAAGAATAACGCGCCATTGCTCC-3’(SEQ.ID.No.10)；
外引物(上游)F3序列为5’-GGACCAACTGGAAGCGAAAT-3’(SEQ.ID.No.11)；
外引物(下游)B3序列为5’-TCGTAATTCGCCGCCATTG-3’(SEQ.ID.No.12)；
环引物LP序列为5’-CGCTGCAAAACTTCAGATATACGT-3’(SEQ.ID.No.13)。
实时检测食源性沙门氏菌的LAMP试剂盒，包括LAMP反应组分，标准阳性DNA模板，阴性对照，荧光显色剂，LAMP反应组分中含有LAMP引物组，LAMP引物组包括一对内引物FIP和BIP、一对外引物F3和B3和一条环引物LP；
内引物FIP序列为5’-ACGCACGGAAACACGTTCGCAAGAAGTGCTCAGACATGCC-3’；
内引物BIP序列为5’-TGTGGGCGCCAAGAGAAAAAGAATAACGCGCCATTGCTCC-3’；
外引物F3序列为5’-GGACCAACTGGAAGCGAAAT-3’；
外引物B3序列为5’-TCGTAATTCGCCGCCATTG-3’；
环引物LP序列为5’-CGCTGCAAAACTTCAGATATACGT-3’。
该试剂盒含有以下试剂：
(1)LAMP反应组分：含有10×ThermoPol Buffer(内含甜菜碱)2.5μL，100mMMgSO41.5μL，10mM dNTP 3.5μL，LAMP引物组共5μL，Bst大片段DNA聚合酶1μL，超纯水9.5μL；LAMP引物组包括40pmol/μL的内引物FIP和BIP，5pmol/μL的外引物F3和B3，20pmol/μL环引物LP各1μL；
(2)标准阳性DNA模板2μL；
(3)阴性对照2μL
(4)荧光染料钙黄绿素/MnCl22μL。
标准阳性DNA模板的拷贝数为8×1010copies/μL。
标准阳性DNA模板是由鼠伤寒沙门氏菌标准株CMCC 50115invA基因上250bp的高度保守序列与pUC-T载体构建的的重组质粒pUC-T-invA。
食源性沙门氏菌来自肉类食品。
针对现有沙门氏菌检测存在的问题，发明人依据环介导等温扩增(LAMP)技术的原理，设计了实时检测食源性沙门氏菌的LAMP引物组，包括一对内引物FIP和BIP、一对外引物F3和B3和一条环引物LP，并据此构建了相应的LAMP试剂盒。本发明引物及试剂盒只能对沙门菌属中常见不同血清型的沙门氏菌进行特异性扩增，不与其它属的常见细菌发生非特异性反应。应用本发明结合浊度仪使用，根据浊度值的变化可以实现对对整个反应过程中产物量的实时、定量监控；根据体系的浊度值可以判断反应结果；同时，反应结束后还可以通过肉眼观察荧光染料钙黄绿素/MnCl2的颜色变化直接判断结果，从而实现对肉类食品中沙门氏菌的实时、快速、结果可视化检测，为基层实验室的快速检测食源性沙门氏菌带来了方便。总之，本发明具有操作简便、快速、特异性强、灵敏度高(是普通PCR灵敏度的1000 倍)、不造成气溶胶污染、结果可视化等优点，为实验室和基层单位准确快速地检测食源性沙门氏菌带来了便利。
附图说明
图1是本发明引物组的筛选结果，图中：1是A组引物扩增结果，2是B组引物扩增结果，3是C组引物扩增结果。
图2是本发明中反应时间以及有或者无环引物对照图，图中：左边曲线是有环引物LP，右边曲线是无环引物LP。
图3是本发明特异性试验中6种常见非沙门菌株以及灭菌超纯水的扩增结果，图中：1是大肠杆菌O157：H7标准株ATCC35150；2是福氏志贺氏菌标准株CMCC51572；3是空肠弯曲菌标准株ATCC33560；4单核细胞增生李斯特氏菌；5金黄色葡萄球菌；6副溶血性弧菌；7灭菌双蒸水。
图4是特异性试验不同血清型沙门氏菌中8种常见血清型的沙门氏菌代表株的扩增结果，图中1是S.Typhimurium CMCC50115；2是S.Kentucky；3是.S.Derby；4是S.Agona；5是S.Enteritiadis；6.是Gallinarum；7是S.Newlands；8是S.Riggil。
图5是本发明LAMP检测方法的敏感性检测结果图一，图中：1-11反应管内PUC-T-invA质粒DNA标准品的拷贝数分别为8×1010copies/μL、8×109copies/μL、8×108copies/μL、8×107copies/μL、8×106copies/μL、8×105copies/μL、8×104copies/μL、8×103copies/μL、8×102copies/μL、8×101copies/μL、8×100copies/μL。
图6是本发明LAMP检测方法的敏感性检测结果二，图中：从左到右各曲线分别代表图5中11个不同浓度(图例中1-11)质粒标准品不同时间的扩增曲线图。
图7是以外引物F3和B3为PCR引物检测PCR灵敏度的结果，图中1～8浓度分别为8×1010～8×103copies/μL的质粒DNA标准品，9为阴性对照灭菌超纯水。
图8是本发明LAMP检测方法的荧光可视化的结果，图中：左侧2个管为标准阳性DNA模板扩增结果，右侧2管为阴性对照灭菌双蒸水扩增结果。
具体实施方式
1菌株
鼠伤寒沙门氏菌标准株CMCC 50115、大肠杆菌O157：H7标准株ATCC35150、福氏志贺氏菌标准株CMCC51572、空肠弯曲菌标准株AT CC33560，均由广西壮族自治区疾病防控中心赠与；单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌，以及32株不同血清型的食源性沙门氏菌S.Derby、S.Agona、S.Enteritidis、S.Riggil、S.Kentucky、S.BraenderupII、S.Ayinde、S.Stanley、S.Newlands、S.Muenster、S.Lagos、S.Chester、S.Onarimon、S.Sinchew、S.Ughelli、S.Wegbridge、S.Tumodi、S.Tennessee、S.SomoneII、S.Moscow、S.London、S.Lindenburg、S.Lika、S.Tripoli、S.Durban、S.DammanII、S.Bonariensis、S.Edmonton、S.Lome，S.Israel、S.Gallinarum和S.Abony，均由本实验室鉴定并保存。
2LAMP引物的设计与合成
根据GenBank中收录的沙门菌属共有的侵袭蛋白A(invasion protein A，invA)的基因保守序列(序列号为U43273应用在线软件Primer Explorer V4.0设计了A、B、C三组LAMP引物，每组引物都包括内引物FIP和BIP、外引物F3和B3，引物信息见表1。
表1三组LAMP引物的序列
3LAMP反应体系的配制
按表2的成分组成配置25μ的LAMP反应体系：
表2LAMP反应体系
加完上述试剂后在反应管盖子上加2μL的钙黄绿素/MnCl2。
4结果的判定
将反应管置于LA-320C浊度仪中于63℃下反应，浊度仪每6s检测一次体系在650nm处的吸光度，生成浊度变化曲线，当反应体系浊度超过0.25以及浊度的变化速率大于0.1时判断为阳性反应，达到实时监测产物的目的；反应结束后将反应管倒置混匀后静置2min，根据荧光染料的颜色变化可以肉眼观察判断反应结果，当体系变为翠绿色时判断为阳性反应，体系为橙色时为阴性。
5LAMP引物组的筛选
使用细菌总DNA提取试剂盒提取鼠伤寒沙门氏菌标准株CMCC 50115的总DNA，经PCR鉴定后，分别用A、B、C三组LAMP引物扩增该模板，并根据LA-320C指示的反应结果合理筛选引物组。结果如图1所示，图中纵坐标是反应结束后体系的浊度值，只有当浊度值大于0.25时，反应才判断为阳性，通道显示红色代表体系浊度值超过0.25，反应为阳性，通道显示绿色代表反应结果为阴性。由图可知，只有C组引物可以扩增沙门氏菌标准株，其他两组引物均被淘汰。
针对C组设计环引物LP，其序列为5’-CGCTGCAAAACTTCAGATATACGT-3’(SEQ.ID.No.13)，分别比较有无环引物的体系在反应速度上的区别。结果如图2所示，加入了环引物LP的体系在10min开始扩增，14min后浊度值超过0.25，并在35分钟内完成扩增；而无环引物的体系18min才开始扩增，22min后浊度值超过0.25，加入环引物LP可使扩增时间缩短了8min。
6LAMP特异性与灵敏度试验
6.1特异性检测
分别提取大肠杆菌O157：H7标准株ATCC35150、福氏志贺氏菌标准株CMCC51572、空肠弯曲菌标准株AT CC33560、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌的总DNA，以及灭菌超纯水作为阴性对照进行LAMP扩增，检验LAMP方法的特异性；同时扩增本文本中“1菌株”里所述32株不同血清型的沙门氏菌。
结果如图3和图4所示，图中通道为绿色表示在实时浊度仪中反应结束后该反应管浊度值未达到0.25，反应结果判定为阴性，通道为红色代表浊度值超过0.25，反应结果判定为阴性。由图3可知，6种常见非沙门菌株和灭菌双蒸水的浊度值均为0，扩增结果均为阴性，均无扩增曲线。图4可知常见血清型的沙门氏菌的扩增结果都为阳性。说明本发明只能特异性扩增沙门氏菌对非沙门氏菌不产生扩增。
6.2灵敏度检测
6.2.1质粒标准品的构建
以LAMP外引物F3和B3为PCR引物扩增模板，用北京全式金生物公司细菌总DNA提取试剂盒提取鼠伤寒沙门氏菌标准株CMCC 50115的总DNA作为模板，PCR扩增250bp的invA基因目的片段，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳和胶回收；取胶回收产物3μL、pUC-T载体1μL、连接Buffer 5μL、T4DNA Ligase1μL，混匀后于25℃反应5分钟，4℃保存备用；将连接产物转化DH5α感受态细胞，克隆摇菌后送至上海英骏生物技术有限公司进行测序；经测序鉴定后用北京全式金生物公司质粒小抽提试剂盒抽提质粒，并测得质粒浓度为252ng/μL；根据公式计算质粒拷贝数，得到拷贝数为8×1010copies/μL的在质粒DNA标准品PUC-T-invA，此标准品亦作为LAMP试剂盒的标准DNA阳性模板；
将质粒DNA标准品做10倍倍比稀释，得到拷贝数分别为8×1010-8×100copies/μL的质粒DNA标准品；
6.2.2LAMP灵敏度试验
以不同稀释度的上述标准品作为样品，进行LAMP扩增，检测该LAMP方法的灵敏度；
6.2.3PCR灵敏度试验
以LAMP外引物F3和B3为PCR引物，对上述不同稀释度的质粒DNA标准品进行PCR扩增，检测PCR的灵敏度并与LAMP进行对比。
LAMP和PCR对不同浓度的质粒DNA标准品的的扩增结果分别见图5和图7，图5中LAMP对质粒DNA标准品的检测限为8×102copies/μL，图7中PCR对质粒DNA标准品的检测限为8×105copies/μL，本发明LAMP灵敏度为PCR的1000倍；图6中是LAMP对不同浓度质粒DNA标准品的扩增曲线图，可见本发明建立的LAMP在63℃下，10min左右开始扩增8×1010copies/μL的质粒DNA标准品，并且在35min内完成扩增。
6.3可视化检测
于反应前在反应管的盖子上加入荧光染料钙黄绿素/MnCl22μL，只需在反应结束后，将反应管倒置后混匀然后静置2min即可根据颜色变化判断反应结果。
结果如图8所示，右侧2个反应管中加入了阴性对照，结果为橙色，反应为阴性；左侧2个反应管中加入了标准阳性样品，结果为翠绿色，反应为阳性，两者对比明显，结果肉眼就能够容易判定，在没有实时浊度仪LA-320C的基层单位完全可以根据荧光染色即可进行结果判断。
6.4样品的LAMP检测
6.4.1细菌总DNA的提取
采用热裂解法提取细菌的总DNA，步骤如下：取7.2中选择性增菌后的的菌液1000μL，置于1.5mL的EP管中，加入25mmol·L-1的NaOH 50μl混合均匀后100℃水浴10min，然后加入4μL 1mol·L-1的Tris-HCl，将上述混悬液12000r·min-1离心5min，上清液DNA提取物作为LAMP反应模板。
6.4.2LAMP扩增
按照步骤3中构建的LAMP体系，以上述DNA提取物为模板进行加样，加样后置于LA-320C中于63℃下进行反应，观察反应中体系浊度变化，反应结束后观察荧光显色结果。
结果：国标方法分离鉴定出17株沙门氏菌，LAMP扩增出18个阳性，LAMP与国标方法检测结果基本一致。
7食品样品的LAMP检测
7.1肉类食品样品采集
自超市和市场采集100份新鲜肉样，包括猪肉25份、牛肉25份、鸭肉25份和鸡肉25份。
7.2肉类肉类食品的预处理
称取25g待检肉样，剪碎后置于225mL的BPW中37℃预增菌8-10h，取1mL上述菌液至9mL的SC或者TTB培养基中于37℃摇床中选择性增菌12h；
7.3样品的沙门氏菌国标检测方法(GB/T4789-2008)
取上述选择性增菌液划线于沙门氏菌鉴别培养基XLD及BS培养基37℃培养18-24h，挑取鉴别培养基上的可疑菌落纯培养后，用沙门氏菌生化鉴定试剂盒进行生化鉴定，以及用沙门菌属诊断血清A-F进行血清学鉴定，此过程历时48h。
应用本发明的LAMP技术检测食品中的沙门氏菌自样品的增菌培养至检测结束只需24h左右，而按照食源性沙门氏菌的国家标准检测方法则需要96h，在准确地检测出食源性沙门氏菌的前提下，本发明将检测时间缩短了72h。
综上，本发明建立的实时检测食源性沙门氏菌的LAMP检测方法及试剂盒与传统检测手段相比，具有以下优点：
1.特异性强：非沙门氏菌对照株以及超纯水检测结果均为阴性，而常见血清型的沙门氏菌检测结果均为阳性，本试剂盒只能特异性扩增沙门氏菌。
2.灵敏度高：PCR检测方法的灵敏度为8×105copies/μL，而本发明检测限为8×102copies/μL，因此本发明检测的灵敏度是普通PCR的1000倍。
3.反应快速，检测周期短：普通PCR需要2-4小时左右才能得出结果，一般LAMP方法也要1小时，本发明提供的检测方在63℃恒温下10分钟左右即开始特异性扩增沙门氏菌invA基因，并在35分钟内完成扩增，尤其是环引物LP的设计，将反应时间比常规的LAMP方法缩短了8min左右；对肉类食品样品的检测周期比食品源性沙门氏菌检测的国标方法GB/T4789-2008缩短了72h。
4.产物的实时监测：利用LA-320浊度仪每6s检测一次体系在650nm处的吸光度，生成浊度变化曲线，当反应体系浊度超过0.25以及浊度的变化速率大于0.1时，达到实时监测判断产物的目的。
5.结果可视化、不开盖、不造成污染：于反应前在反应管的盖子上加入荧光染料钙黄绿素/MnCl22μL，只需在反应结束后，将反应管倒置后混匀然后静置2min即可根据颜色变化判断反应结果，检测过程无需开盖，不会造成气溶胶污染。

Claims (6)

1.一种实时检测食源性沙门氏菌的LAMP引物组，包括一对内引物FIP和BIP、一对外引物F3和B3和一条环引物LP，其特征在于：
所述内引物FIP序列为5'-ACGCACGGAAACACGTTCGCAAGAAGTGCTCAGACATGCC-3’；
所述内引物BIP序列为5'-TGTGGGCGCCAAGAGAAAAAGAATAACGCGCCATTGCTCC-3’；
所述外引物F3序列为5’-GGACCAACTGGAAGCGAAAT-3’；
所述外引物B3序列为5'-TCGTAATTCGCCGCCATTG-3’；
所述环引物LP序列为5’-CGCTGCAAAACTTCAGATATACGT-3’。
2.一种实时检测食源性沙门氏菌的LAMP试剂盒，包括LAMP反应组分，标准阳性DNA模板，阴性对照，荧光显色剂，其特征在于所述LAMP反应组分中含有LAMP引物组，LAMP引物组包括一对内引物FIP和BIP、一对外引物F3和B3和一条环引物LP；
所述内引物FIP序列为5'-ACGCACGGAAACACGTTCGCAAGAAGTGCTCAGACATGCC-3’；
所述内引物BIP序列为5'-TGTGGGCGCCAAGAGAAAAAGAATAACGCGCCATTGCTCC-3’；
所述外引物F3序列为5’-GGACCAACTGGAAGCGAAAT-3’；
所述外引物B3序列为5'-TCGTAATTCGCCGCCATTG-3’；
所述环引物LP序列为5’-CGCTGCAAAACTTCAGATATACGT-3’。
3.根据权利要求2所述的实时检测食源性沙门氏菌的LAMP试剂盒，其特征在于该试剂盒含有以下试剂：
(1)LAMP反应组分：含有10×ThermoPol Buffer 2.5μL，100mM MgSO4 1.5μL，10mM dNTP3.5μL，LAMP引物组共5μL，Bst大片段DNA聚合酶1μL，超纯水9.5μL；所述LAMP引物组包括40pmol/μL的内引物FIP和BIP，5pmol/μL的外引物F3和B3，20pmol/μL环引物LP各1μL；
(2)标准阳性DNA模板2μL；
(3)阴性对照2μL
(4)荧光染料钙黄绿素/MnCl2 2μL。
4.根据权利要求1所述的实时检测食源性沙门氏菌的LAMP试剂盒，其特征在于：所述标准阳性DNA模板的拷贝数为8×1010copies/μL。
5.根据权利要求1所述的实时检测食源性沙门氏菌的LAMP试剂盒，其特征在于：所述标准阳性DNA模板是由鼠伤寒沙门氏菌标准株CMCC 50115invA基因上250bp的高度保守序列与pUC-T载体构建的的重组质粒pUC-T-invA。
6.根据权利要求1所述的实时检测食源性沙门氏菌的LAMP试剂盒，其特征在于：所述食源性沙门氏菌来自肉类食品。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107988401A (zh) * 2017-12-29 2018-05-04 广东环凯微生物科技有限公司 沙门氏菌干粉化lamp快速检测试剂盒
CN109402271A (zh) * 2017-08-14 2019-03-01 中国科学院微生物研究所 用于检测沙门氏菌的引物系统和试剂盒以及他们的应用和检测沙门氏菌的方法
WO2019114374A1 (zh) * 2017-12-12 2019-06-20 新希望双喜乳业（苏州）有限公司 一种乳制品中沙门氏菌的快速检测方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102586438A (zh) * 2012-02-28 2012-07-18 武汉大学 基于lamp的微生物目视化荧光显色基因检测方法
CN103224988A (zh) * 2013-05-16 2013-07-31 汇智泰康生物技术(北京)有限公司 一种用于检测食品中的沙门氏菌的试剂盒及其使用方法
CN103436623A (zh) * 2013-09-04 2013-12-11 湖北省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 一种食品中沙门氏菌活菌的快速检测试剂盒及使用方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102586438A (zh) * 2012-02-28 2012-07-18 武汉大学 基于lamp的微生物目视化荧光显色基因检测方法
CN103224988A (zh) * 2013-05-16 2013-07-31 汇智泰康生物技术(北京)有限公司 一种用于检测食品中的沙门氏菌的试剂盒及其使用方法
CN103436623A (zh) * 2013-09-04 2013-12-11 湖北省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 一种食品中沙门氏菌活菌的快速检测试剂盒及使用方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
王福厚 等: "环介导恒温扩增（LAMP）—检测沙门氏菌", 《中国动物检疫》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109402271A (zh) * 2017-08-14 2019-03-01 中国科学院微生物研究所 用于检测沙门氏菌的引物系统和试剂盒以及他们的应用和检测沙门氏菌的方法
WO2019114374A1 (zh) * 2017-12-12 2019-06-20 新希望双喜乳业（苏州）有限公司 一种乳制品中沙门氏菌的快速检测方法
CN107988401A (zh) * 2017-12-29 2018-05-04 广东环凯微生物科技有限公司 沙门氏菌干粉化lamp快速检测试剂盒

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