CN108034692A - 用于鉴别沙门氏菌和单增李斯特菌的检测分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于鉴别沙门氏菌和单增李斯特菌的检测分析方法，其包括以下步骤：(1)样品的制备；(2)样品的测定：采用近红外光谱仪对沙门氏菌、单增李斯特菌的各组分进行近红外光谱透射扫描；(3)数据处理：将处理后的光谱数据利用主成分分析法PCA法进行数据的处理，选取前两个主成分的得分值，并采用分析软件OPUS 6.5中主成分分析法对光谱数据进行分析。本发明通过测定沙门氏菌、单增李斯特菌等致病菌的近红外光谱图，利用基于主成分分析技术的投影判别对光谱数据进行分析，结果表明，不论是利用全细胞、细胞壁还是细胞质的近红外光谱分析，都可以通过本发明的方法将沙门氏菌和单增李斯特菌区分开来。

Description

用于鉴别沙门氏菌和单增李斯特菌的检测分析方法
技术领域
本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种用于鉴别沙门氏菌和单增李斯特菌的检测分析方法。
背景技术
沙门氏菌是一种人畜共患和食源性疾病的致病菌。人畜感染后可呈无症状带菌状态，也可表现为有临床症状的致死疾，它可能加重病态或死亡率，或者降低动物的繁殖生产力。自19世纪后期，沙门氏菌首次被鉴定为人类的一种病原以来，检测方法都是建立在采取感染病人的粪便或血液作为临床病料的基础上。此后的60年间，用于从食品中分离沙门氏菌的方法实质上与那些用于从临床病料中分离沙门氏菌的方法是相同的。虽然这些方法本身证明是可靠的，但却很费力、耗时，需要4～7d才能完成。
单核细胞增生李斯特菌也是一种人畜共患病的病原菌。感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。单增李斯特菌在各年龄段人群中均可发病，尤其免疫机能低下者和新生儿、孕妇、老年人等，病死率为20％～30％。应用常规方法检验耗时费力，程序复杂。采用聚合酶链反应(PCR)法检测，也需要24h才能完成检测过程，但仍然满足不了实时检测的需要。
进入90年代，近红外分析技术逐步受到分析化学家的重视，应用逐步扩展到石油化工、医药、生物化学、烟草、纺织品等领域，现已发展成为一种独立的分析技术活跃在光谱分析领域。傅立叶变换近红外光谱(FTNIR)分辨率高，不仅能提供分子基团特征的振动吸收谱带，而且能敏锐地探测分子基团及周围环境的变化。细胞的近红外光谱能够反映核酸、蛋白质、糖蛋白和生物膜等分子在细胞内的含量、构型、构象及其所发生的变化。本工作通过建立其近红外光吸收模型，找到食品中稳定期的沙门氏菌、单增李斯特菌的近红外特征吸收光谱，使得不同致病菌能够区分开来。
发明内容
为克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种用于鉴别沙门氏菌和单增李斯特菌的检测分析方法，使有害微生物的检测更加灵敏、简便、快速。
用于鉴别沙门氏菌和单增李斯特菌的检测分析方法，包括以下步骤：
(1)样品的制备：
选择对数期的沙门氏菌全细胞制备悬液，以转速3 000r.min-1离心分离湿菌体，以无菌水分三次洗涤沉淀部分，充分振荡摇匀使菌体分散开来，平板菌落计数法进行菌落计数，另用移液枪移取1mL菌液于大试管中，加入9mL无菌水，充分振荡摇匀形成10倍稀释菌悬液，然后逐级进行19次10倍稀释，制成一组20个浓度梯度的沙门氏菌全细胞悬液，浓度梯度值呈比差为10的等差序列，备用；一组20个浓度梯度的单增李斯特氏菌全细胞悬液的制备同沙门氏菌全细胞悬液制备过程；
用超声波细胞粉碎仪破碎沙门氏菌的全细胞，以转速15 000r.min-1离心分离，沉淀部分为细胞壁、上清液为细胞质，将细胞质悬液充分振荡摇匀，用移液枪移取1mL菌液于大试管中，加入9mL无菌水，充分振荡摇匀形成10倍稀释菌悬液，然后逐级进行19次10倍稀释过程，制成一组浓度梯度的沙门氏菌细胞质悬液，20个浓度梯度值呈比差为10的等差序列，备用；一组20个浓度梯度的单增李斯特氏菌细胞质悬液的制备同沙门氏菌细胞质悬液制备过程；
一组20个浓度梯度的沙门氏菌细胞壁悬液的制备同沙门氏菌细胞质悬液制备过程；一组20个浓度梯度的单增李斯特氏菌细胞壁悬液的制备同单增李斯特氏菌细胞质悬液制备过程；
(2)样品的测定：
采用近红外光谱仪对沙门氏菌、单增李斯特菌的各组分进行近红外光谱透射扫描；
(3)数据处理：
将处理后的光谱数据利用主成分分析法PCA法进行数据的处理，选取前两个主成分的得分值，并采用分析软件OPUS 6.5中主成分分析法对光谱数据进行分析。
优选的，步骤(1)中，沙门氏菌的平板菌落计数法进行菌落计数结果为80亿.mL-1；单增李斯特氏菌的平板菌落计数法进行菌落计数结果为175亿.mL-1。
优选的，步骤(1)中，沙门氏菌的全细胞的超声波破碎参数选为400W、破碎5s、间隔5s、实际破碎总时间50min。
优选的，步骤(1)中，单增李斯特氏菌的全细胞的超声波破碎参数为500W、破碎4s、间隔5s、实际破碎总时间50min。
优选的，步骤(2)中，采用完全相同的仪器参数对沙门氏菌、单增李斯特菌的各组分进行近红外光谱透射扫描，其中，将近红外光谱仪的分辨率设定为为4cm-1，扫描次数为64次，扫描范围4 000～12 000cm-1，环境温度控制在20℃，空气湿度为70％，数据格式为Log(1/R)，每个样品重复扫描3次，其平均值作为该样品的光谱数据，每张光谱包含2 075个波长点的吸光度。
进一步，步骤(3)中，通过PCA分析，所述沙门氏菌全细胞的第一组分得分范围为-0.05～0.03，第二组分得分范围为-0.13～-0.02；所述单增李斯特菌的全细胞的第一组分得分范围为-0.09～0.04，第二组分得分范围为0.01～0.25。
进一步，步骤(3)中，通过PCA分析，所述沙门氏菌的细胞壁的第一组分得分范围为-0.10～0.05，第二组分得分范围为-0.02～0.15；所述单增李斯特菌的细胞壁的第一组分得分范围为0.05～0.28，第二组分得分范围为-0.30～-0.02。
进一步，步骤(3)中，通过PCA分析，所述沙门氏菌的细胞质的第一组分得分范围为0.04～0.12，第二组分得分范围为-0.22～-0.10；所述单增李斯特菌的细胞质的第一组分得分范围为0.02～0.06，第二组分得分范围为-0.03～0.12。
与现有技术相比，本发明方法具有如下优点：
本发明采用近红外光谱结合主成分分析法鉴别沙门氏菌和单增李斯特菌，通过测定沙门氏菌、单增李斯特菌等致病菌的近红外光谱图，利用基于主成分分析技术的投影判别对光谱数据进行分析，结果表明，不论是利用全细胞、细胞壁还是细胞质的近红外光谱分析，都可以通过本发明的方法将沙门氏菌和单增李斯特菌区分开来。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1为沙门氏菌全细胞的原始光谱；
图2为李斯特菌病全细胞的原始光谱；
图3为沙门氏菌、单增李斯特菌全细胞主成分得分图；
图4为沙门氏菌、单增李斯特氏菌细胞壁主成分得分图；
图5为沙门氏菌、单增李斯特菌细胞质主成分得分图。
具体实施方式
本发明方法中使用的试剂与仪器具体如下：
Thermo is50型傅立叶变换红外光谱仪；Thermo台式低速控温离心机；台式高速控温离心机；超声波细胞粉碎仪。
沙门氏菌、单增李斯特菌标准菌株。
实施例1
用于鉴别沙门氏菌和单增李斯特菌的检测分析方法，包括以下步骤：
(1)样品的制备：
首先进行沙门氏菌细胞的活化和分离纯化，选择对数期沙门氏菌悬液的制备。以转速3000r.min-1离心分离湿菌体，以一定体积无菌水分三次洗涤沉淀部分，充分振荡摇匀使菌体分散开来，平板菌落计数法进行菌落计数结果为80亿.mL-1。另用移液枪移取1mL菌液于大试管中，加入9mL无菌水，充分振荡摇匀形成10倍稀释菌悬液，然后逐级进行19次10倍稀释，制成一组20个浓度梯度的沙门氏菌全细胞悬液，浓度梯度值呈比差为10的等差序列，备用。
用超声波细胞粉碎仪破碎沙门氏菌的全细胞，破碎参数选为400W、破碎5s、间隔5s、实际破碎总时间50min，进行沙门氏菌细胞破碎，以转速15 000r.min-1离心分离，沉淀部分为细胞壁、上清液为细胞质。将细胞质悬液充分振荡摇匀，用移液枪移取1mL菌液于大试管中，加入9mL无菌水，充分振荡摇匀形成10倍稀释菌悬液，然后逐级进行19次10倍稀释过程，制成一组浓度梯度的沙门氏菌细胞质悬液，20个浓度梯度值呈比差为10的等差序列，备用。一组20个浓度梯度的沙门氏菌细胞壁悬液的制备同细胞质悬液制备过程。
单增李斯特氏菌样品的制备，首先对单增李斯特氏菌进行细胞的活化和分离纯化。选对数期进行单增李斯特氏菌菌悬液的制备，再以转速3 000r.min-1离心分离湿菌体，以一定体积无菌水分三次洗涤沉淀部分，充分振荡摇匀使菌体分散开来，平板菌落计数法进行菌落计数结果为175亿.mL-1。选择超声波破碎参数为500W、破碎4s、间隔5s、实际破碎总时间50min进行单增李斯特氏菌细胞破碎，最后以转速15 000r.min-1离心分离，沉淀部分为细胞壁、上清液为细胞质。三组10倍稀释浓度梯度的单增李斯特氏菌细胞壁、细胞质悬液的制备同沙门氏菌。
(2)样品的测定
在相同的试验条件下，采用近红外光谱仪按仪器工作条件对沙门氏菌、单增李斯特菌的各组分进行近红外光谱透射扫描。为了获得较好的光谱图，整个试验的仪器分辨率、扫描次数等参数保持严格一致。
仪器分辨率为4cm-1，扫描次数为64次，扫描范围4 000～12 000cm-1，环境温度控制在20℃左右，空气湿度70％左右，数据格式为Log(1/R)，每个样品重复扫描3次，其平均值作为该样品的光谱数据，每张光谱包含2 075个波长点的吸光度。
(3)数据处理
主成分分析(PCA)是多元统计中的一种数据压缩技术，该方法广泛用于化学实验数据的统计分析，是化学计量学中的基础方法。PCA是对多变量数据进行统计处理的一种数据线性投影方法，它在尽可能保留原有信息的基础上将高维空间中的样本映射到较低微的主成分空间中。通过分析原始数据的相互关系，采用坐标变换的方法对数据进行正交变换，消除数据间的相关关系，具有分析多变量主次关系的功能。近红外光谱谱带严重重叠，可造成分析的困难，而PCA在不丢失主要光谱信息的前提下选择为数较少的新变量来代替原来较多的变量，可有效解决光谱重叠的问题,从而提取所需的化学信息。
通过测定沙门氏菌、单增李斯特菌细胞质、细胞壁的近红外光谱图，采用分析软件OPUS6.5中主成分分析法对光谱数据进行分析。
实施例2
对利用实施例1的方法获得的鉴定结果进行如下分析。
1、沙门氏菌、单增李斯特菌全细胞的近红外光谱
不同浓度的沙门氏菌、单增李斯特菌全细胞的近红外光谱叠加图分别见图1和图2。结果表明：未经破损的两种致病菌全细胞近红外光谱谱图与经破碎处理的谱图具有高度的相似性。
2、沙门氏菌、单增李斯特菌全细胞的主成分投影判别分析
以沙门氏菌、单增李斯特菌全细胞不同波数点下的吸光度为特征值，进行多元散射预处理后进行PCA分析，选取前两个主成分拟合原数据的效果见图3，图3中横纵坐标的标注分别是第一主分和第二主分的得分值。
由图3可知，PCA分析可以良好地反映出沙门氏菌、单增李斯特菌全细胞的差异性信息。沙门氏菌第一组分得分范围在-0.05～0.03之间，第二组分得分范围在-0.13～-0.02之间；单增李斯特菌第一组分得分范围在-0.09～0.04之间，第二组分得分范围在0.01～0.25之间。可见两种菌的第一主分得分范围明显不同，而第二主分得分范围几乎完全相同。不同的细菌，其细胞的物质组成是不一样的。不同的物质在经过近红外光照射后会在不同的波段产生红外特异性吸收，且有着不同的吸收谱段，因此可以通过近红外光谱法区分开来。
3、沙门氏菌、单增李斯特菌细胞壁的主成分投影判别分析
以沙门氏菌、单增李斯特菌细胞壁不同波数点下的吸光度为特征值，进行多元散射预处理后进行PCA分析，选取前两个主成分拟合原数据的效果见图4，图4中横纵坐标的标注分别是第一主分和第二主分的得分值。
由图4可知，PCA分析可以良好地反映出沙门氏菌、单增李斯特菌细胞壁的差异性信息。沙门氏菌第一组分得分范围在-0.10～0.05之间，第二组分得分范围在-0.02～0.15之间；单增李斯特菌第一组分得分范围在0.05～0.28之间，第二组分得分范围在-0.30～-0.02之间。可见两种菌的第一主分和第二主分得分范围完全不同。细菌的细胞壁都含有一定量的肽聚糖，此外，革兰氏阴性菌的细胞壁还含有外膜这一特殊组分，包括脂多糖、脂质双层、脂蛋白三部分；革兰氏阳性菌还含有大量特殊组分磷壁酸。沙门氏菌为革兰氏阴性菌，单增李斯特氏菌为革兰氏阳性菌，其细胞壁组分不尽相同，不同的物质在经过近红外光照射后会在不同的波段产生红外特异性吸收，且有着不同的吸收谱段，因此可以通过近红外光谱法区分开来。
4、沙门氏菌、单增李斯特菌细胞质的主成分投影判别分析
以沙门氏菌、单增李斯特菌细胞质不同波数点下的吸光度值为特征值，进行多元散射预处理后进行PCA分析，选取前两个主成分拟合原数据的效果见图5，图中纵横坐标的标注分别是第一主分和第二主分的得分值。
由图5可知，PCA分析可以良好的反映出沙门氏菌、单增李斯特菌细胞质的差异性信息。沙门氏菌第一组分得分范围在0.04～0.12之间，第二组分得分范围在-0.22～-0.10之间；单增李斯特菌第一组分得分范围在0.02～0.06之间，第二组分得分范围在-0.03～0.12之间。可见两种菌的第一主分得分范围明显不同，而第二主分得分范围有相似的地方。细菌的细胞质是指被细胞膜包围的除核区以外的一切半透明、胶体状、颗粒状物质的总称，主要成分为核糖体、贮藏物、各种酶类、中间代谢物、质粒、各种营养物质和大分子的单体等。两种不同的细菌其细胞质组分部分也不同，所以可以通过近红外光谱法区分开来。
由上可知：
1)由于沙门氏菌、单增李斯特菌的全细胞、细胞壁和细胞质的组分不同，造成它们对近红外光的吸收不同，主成分投影判别分析法对其分析鉴别可以达到理想的效果。
2)采用矢量归一预处理方法，分别对不同浓度梯度下的沙门氏菌、单增李斯特菌的全细胞、细胞壁和细胞质进行主成分投影判别分析，结果显示全细胞、细胞壁、细胞质的近红外光谱分析都可以将大肠杆菌和单增李斯特菌区分开来。
3)未经破损处理的两种致病菌全细胞同样可以通过近红外光谱技术进行区分，达到同样的效果。
4)近红外光谱技术可以对沙门氏菌、单增李斯特菌进行分类鉴别。
本发明通过不同浓度梯度的沙门氏菌、单增李斯特菌细胞的红外光谱来获得沙门氏菌、单增李斯特菌的近红外光谱信息，继而研究单增李斯特菌、沙门氏菌的近红外光谱的鉴别方法以及检出限，这将有可能对有害微生物的鉴别测定提供一种快速简便的检测方法，且具有较好的应用前景。此外，近红外光谱分析技术在微生物学方面的应用，可能为人类疾病的早期诊断提供科学依据。研究近红外光谱分析技术来检测食品中常见的致病菌，具有极大的经济和和社会效益。
以上所述仅为发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.用于鉴别沙门氏菌和单增李斯特菌的检测分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)样品的制备：
选择对数期的沙门氏菌全细胞制备悬液，以转速3 000r.min-1离心分离湿菌体，以无菌水分三次洗涤沉淀部分，充分振荡摇匀使菌体分散开来，平板菌落计数法进行菌落计数，另用移液枪移取1mL菌液于大试管中，加入9mL无菌水，充分振荡摇匀形成10倍稀释菌悬液，然后逐级进行19次10倍稀释，制成一组20个浓度梯度的沙门氏菌全细胞悬液，浓度梯度值呈比差为10的等差序列，备用；一组20个浓度梯度的单增李斯特氏菌全细胞悬液的制备同沙门氏菌全细胞悬液制备过程；
用超声波细胞粉碎仪破碎沙门氏菌的全细胞，以转速15 000r.min-1离心分离，沉淀部分为细胞壁、上清液为细胞质，将细胞质悬液充分振荡摇匀，用移液枪移取1mL菌液于大试管中，加入9mL无菌水，充分振荡摇匀形成10倍稀释菌悬液，然后逐级进行19次10倍稀释过程，制成一组浓度梯度的沙门氏菌细胞质悬液，20个浓度梯度值呈比差为10的等差序列，备用；一组20个浓度梯度的单增李斯特氏菌细胞质悬液的制备同沙门氏菌细胞质悬液制备过程；
一组20个浓度梯度的沙门氏菌细胞壁悬液的制备同沙门氏菌细胞质悬液制备过程；一组20个浓度梯度的单增李斯特氏菌细胞壁悬液的制备同单增李斯特氏菌细胞质悬液制备过程；
(2)样品的测定：
采用近红外光谱仪对沙门氏菌、单增李斯特菌的各组分进行近红外光谱透射扫描；
(3)数据处理：
将处理后的光谱数据利用主成分分析法PCA法进行数据的处理，选取前两个主成分的得分值，并采用分析软件OPUS 6.5中主成分分析法对光谱数据进行分析。
2.根据权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于：步骤(1)中，沙门氏菌的平板菌落计数法进行菌落计数结果为80亿.mL-1；单增李斯特氏菌的平板菌落计数法进行菌落计数结果为175亿.mL-1。
3.根据权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于：步骤(1)中，沙门氏菌的全细胞的超声波破碎参数选为400W、破碎5s、间隔5s、实际破碎总时间50min。
4.根据权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于：步骤(1)中，单增李斯特氏菌的全细胞的超声波破碎参数为500W、破碎4s、间隔5s、实际破碎总时间50min。
5.根据权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于：步骤(2)中，采用完全相同的仪器参数对沙门氏菌、单增李斯特菌的各组分进行近红外光谱透射扫描，其中，将近红外光谱仪的分辨率设定为为4cm-1，扫描次数为64次，扫描范围4 000～12 000cm-1，环境温度控制在20℃，空气湿度为70％，数据格式为Log(1/R)，每个样品重复扫描3次，其平均值作为该样品的光谱数据，每张光谱包含2 075个波长点的吸光度。
6.根据权利要求1～5任一项所述的检测分析方法，其特征在于：步骤(3)中，通过PCA分析，所述沙门氏菌全细胞的第一组分得分范围为-0.05～0.03，第二组分得分范围为-0.13～-0.02；所述单增李斯特菌的全细胞的第一组分得分范围为-0.09～0.04，第二组分得分范围为0.01～0.25。
7.根据权利要求1～5任一项所述的检测分析方法，其特征在于：步骤(3)中，通过PCA分析，所述沙门氏菌的细胞壁的第一组分得分范围为-0.10～0.05，第二组分得分范围为-0.02～0.15；所述单增李斯特菌的细胞壁的第一组分得分范围为0.05～0.28，第二组分得分范围为-0.30～-0.02。
8.根据权利要求1～5任一项所述的检测分析方法，其特征在于：步骤(3)中，通过PCA分析，所述沙门氏菌的细胞质的第一组分得分范围为0.04～0.12，第二组分得分范围为-0.22～-0.10；所述单增李斯特菌的细胞质的第一组分得分范围为0.02～0.06，第二组分得分范围为-0.03～0.12。
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