CN115851990A - 一种用于快速检测沙门氏菌的扩增引物、试剂盒及其应用 - Google Patents
一种用于快速检测沙门氏菌的扩增引物、试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种快速检测沙门氏菌的引物、试剂盒及其应用，所述检测试剂盒由核酸快速扩增试剂和荧光免疫层析试纸、运行缓冲液组成。核酸快速扩增试剂包括含石墨烯的扩增缓冲液、沙门氏菌特异性扩增引物和质控品。所述荧光免疫层析试纸由样品垫、包被荧光微球抗体(抗DNA扩增产物一端标记物)偶联物的结合垫、包含检测线(抗DNA扩增产物另一端标记物)和控制线的NC膜、吸水纸以及PVC胶板组成。核酸快速扩增反应完成后加入运行缓冲液，混匀后滴加到试纸加样窗口，2min后使用荧光分析仪进行荧光信号判读。整个过程可在30min内完成。本发明沙门氏菌快速检测试剂盒，操作简便、快速、灵敏，结果可靠，有利于实际应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于快速检测沙门氏菌的扩增引物、试剂盒及其快速检测沙门氏菌的方法，属于分子生物学检测技术等技术领域。
背景技术
沙门氏菌是导致食物中毒及胃肠道感染最常见的革兰氏阴性菌之一，其包含超过2600种能够在多种宿主中引起感染的血清型。沙门氏菌的感染源主要包括牛奶、鸡蛋、肉类(家禽、牛肉)、蔬菜和新鲜水果，每年导致全球数以千万计的感染病例，造成巨大的经济和社会损失。此外，沙门氏菌也是动物饲料和宠物食品中的主要致病性微生物。这些饲料的安全性不仅关乎动物健康，同时也关乎动物源食品或处理宠物食品的人员健康。
为了减少与食品和饲料产品相关的沙门氏菌爆发和疾病，需要从农场到餐桌进行多环节的检测和控制。目前，沙门氏菌检测和鉴定的标准方法主要包括细菌分离和生化鉴定。基于培养法的细菌分离虽然结果可信度高，但操作程序复杂、耗时费力(通常需要5～7天)且在肠杆菌科下不同物种之间可发生交叉生化反应。以血清学检测为代表的免疫学方法简单快速，但灵敏度和特异性仍有待提高。且以聚合酶链反应(PCR)为代表的高灵敏度和特异性的核酸扩增方法已广泛应用于沙门氏菌等病原微生物的检测。然而，检测结果的判断主要依赖于传统的琼脂糖凝胶电泳检测，由于需使用含有毒性的核酸染料等试剂，实验安全性有待提高。实时荧光定量PCR技术等能够在不使用有毒试剂的情况下对靶标进行定量检测，但由于仪器和试剂成本较高而未能在基层和实际检验工作中广泛使用。因此，建立一种不需要昂贵的设备和试剂且适于沙门氏菌现场即时检测(Point-of-care testing，POCT)的分子分析方法对于有效防控沙门氏菌的传播具有极为重要的意义。
根据目前已公开的文献或专利中基于核酸的沙门氏菌检测技术包括常规PCR、荧光定量PCR、数字PCR、免疫PCR、等温扩增(如环介导等温扩增、重组酶聚合酶扩增等)及其衍生技术。这些方法均有着各自的局限性，如依赖存在安全威胁的琼脂糖凝胶电泳、操作要求严格、检测试剂和仪器成本高、引物设计要求高或引物需多次筛选等局限性。
近年来，以免疫反应为基础的胶体金试纸检测技术目前正逐步应用于核酸检测，如胶体金法等。此方法方便快捷，可实现比色判断，但扩增产物中潜在的引物二聚体、多聚体等复杂结构产物容易导致假阳性结果的产生。因此，有效解决扩增产物中复杂结构产物对扩增产物判断的干扰问题是试纸检测技术的关键之一。此外，为了更有利于实现病原体的早期检测，基于胶体金试纸的核酸检测技术的灵敏度也亟待提高。
因此，本领域亟需一种操作简单、灵敏快速、用户友好且结果可靠的沙门氏菌快速检测试剂盒及其非诊断性检测方法。
发明内容
发明目的：针对现有检测技术在检测沙门氏菌应用中存在的操作程序复杂、时间长、成本高、使用条件存在限制、不满足POCT要求等问题，本发明的第一目的是提供一种基于沙门氏菌基因组快速扩增的引物，本发明的第二目的是提供一种含有用于快速检测沙门氏菌的扩增引物的试剂盒，本发明的第三目的是提供一种利用该扩增引物或试剂盒快速检测沙门氏菌的方法。
技术方案：本发明所述一种用于快速检测沙门氏菌的扩增引物是基于基于沙门氏菌bcfC基因特异性保守区域设计，包括正向引物bcf-F和反向引物bcf-R，所述正向引物bcf-F序列如SEQ ID NO：1所示，所述反向引物bcf-R序列如SEQ ID NO：2。
进一步地，所述正向和反向引物的5’或3’端均可标记标记物，所述标记物包括磷酸化、生物素、地高辛、氨基、羧基、巯基或引物可修饰荧光基团，使扩增后的DNA双链产物两端含有不同的标记物。
进一步地，引物可修饰荧光基团包括FITC、FAM、Cy3、Cy5、HEX、JOE、ROX、TAMRA、Fluorescein、TET、R110或Texas Red。
进一步地，所述标记物优选标记在正向引物bcf-F或反向引物bcf-R的5’端。
本发明所述的一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明所述用于快速检测沙门氏菌的扩增引物。
进一步地，所述试剂盒还包括石墨烯、扩增缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、聚乙二醇、甜菜碱、无酶水、阳性对照和阴性对照。
进一步地，所述石墨烯包括氧化石墨烯、还原石墨烯、石墨烯量子点、功能化改性的石墨烯。
进一步地，功能化改性的石墨烯包括单层或多层石墨烯、多孔石墨烯、石墨烯纳米管、石墨烯纳米片、纳米石墨烯粉、氮掺杂石墨烯、羧基化石墨烯、氨基化石墨烯、巯基化石墨烯或石墨烯膜。
进一步地，所述试剂盒中正向引物bcf-F与反向引物bcf-R摩尔比为1:1～1:2。
进一步地，所述正向引物bcf-F和反向引物bcf-R的浓度均为0.1～30μM。
进一步地，所述试剂盒还包括荧光免疫层析试纸和运行缓冲液。
进一步地，所述运行缓冲液中包括0.001～1M的三羟甲基氨基甲烷(Tris)、0.001～0.5M乙二胺四乙酸(EDTA)和0.001～0.8M氯化钠
本发明还包括一种快速检测沙门氏菌的方法，所述检测方法是利用本发明所述的用于快速检测沙门氏菌的扩增引物或所述的试剂盒，采用荧光检测方法进行沙门氏菌的检测。
进一步地，所述方法包括以下步骤：在待测液中加入本发明所述的用于快速检测沙门氏菌的扩增引物或本发明所述的试剂盒进行扩增反应，扩增反应结束后，向反应管中加入运行缓冲液，吹打混匀，静置，通过荧光分析仪读取数值。若荧光信号值大于122，则说明待检样品中含有沙门氏菌；若荧光信号值小于等于122，则说明待检样品中没有沙门氏菌。
进一步地，进行扩增分析反应时，扩增引物的反应温度为两步温度快速循环，所述第一步温度为辅助变性温度，范围为70～78℃，第二步温度为扩增反应温度，范围为55～70℃，每步温度反应时间均为1～10秒。循环数为35～45.
更进一步地，所述第一步温度为74～76℃，第二步温度为58～62℃,每步温度反应时间为1～3秒。
进一步地，向反应管中加入80～90μL运行缓冲液，静置时间为不少于2min。
本发明的引物和扩增方法相较现有技术具有操作简单、快速、灵敏、准确、用户友好以及适于POCT等显著优势。而且本发明方法可扩增大于等于20个核苷酸的靶序列，且与其他肠道病原微生物基因组无交叉反应性，未来可根据沙门氏菌血清型变化灵活调整引物设计，方便快捷、临床检测适用性强，具有细菌培养、免疫学方法、PCR等不具备的技术优势。
本发明所述快速检测沙门氏菌的荧光检测试剂盒及检测方法，可在30min内完成沙门氏菌核酸快速检测。具有操作便捷、简单快速、灵敏度高、特异性强、数字化判读、适于POCT等优势，有利于实际应用。
有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下显著优点：
(1)检测用时短：扩增反应只需约27min，从核酸扩增到结果判定可在30min内完成。
(2)操作简单、安全：常规PCR仪即可完成扩增反应，且无需通过操作复杂且存在安全威胁的琼脂糖电泳试验进行结果观察。
(3)有效避免潜在的假阳性问题：基于石墨烯的反应系统可有效避免潜在的引物二聚体干扰荧光信号问题。
(4)支持目视判断：可采用荧光成像设备直接观察试纸检测结果，进行定性分析。
(5)灵敏度高：微纳米级荧光微球具有比表面积大、良好的荧光稳定性和抗光漂白能力等显著优势，相较胶体金可有效提高检测灵敏度。
(6)特异性强：本发明引物扩增高效特异，仅特异性扩增沙门氏菌基因组，而与其他肠道微生物基因组无交叉反应性。
(7)广泛的适用性：核酸快速扩增方法及其检测试剂盒具有广泛的适用性，对靶序列无特殊要求，常规引物即可扩增，应用前景广阔。
(8)适于现场即时检测(POCT)：本发明使用荧光免疫层析试纸进行即时定量检测，简单快速、灵敏度高，适于第三方医学检验机构及基层现场检测。
综上，本发明的沙门氏菌检测试剂盒及其检测方法具有用时短、操作简单、可扩增短序列等优点，为食品监管、医疗卫生、畜牧兽医、疫病防控、出入境检验检疫等单位筛查和检测沙门氏菌提供了新的技术支持，具有广阔的市场前景和较大的社会、经济效益。
附图说明
图1为本发明中荧光免疫层析试纸的结构示意图；
图2为本发明中沙门氏菌备选扩增引物试验结果图；
图3为本发明中基于沙门氏菌bcfC和invA基因所设计引物试验结果图；
图4为本发明中石墨烯材料在扩增反应中的作用验证结果图；
图5为本发明中阳性对照(沙门氏菌参考株)荧光检测结果示意图；
图6为本发明中阴性对照(灭菌双蒸水)荧光检测结果示意图；
图7为本发明中沙门氏菌阳性质控和阴性质控试纸暗场成像结果对比图；
图8为本发明方法快速检测阳性对照和阴性对照重复性结果图；
图9为本发明沙门氏菌荧光定量试纸检测方法的灵敏度结果图；
图10为本发明沙门氏菌荧光定量试纸检测方法的特异性结果图；
图11为本发明沙门氏菌荧光定量试纸检测方法的抗干扰测试结果图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1：沙门氏菌快速扩增引物的设计
根据美国生物技术信息中心基因序列数据库GenBank中已公开的沙门氏菌(bcfC)全基因组序列(Salmonella Typhimurium_CP007581，Salmonella Enteritidis_CP099973，Salmonella Worthington_NZ_CP039503，Salmonella Agona_NZ_CP100736，SalmonellaPullorum_CP075028，Salmonella California_NZ_CP028900，Salmonella Infantis_NZ_CP019202)，使用BLASTn、BRIG、DNASTAR等分子生物学工具进行全基因组多序列比对分析，筛选沙门氏菌基因组特异性的保守基因及序列。根据筛选出的保守基因bcfC及invA序列，利用Primer Premier 5.0、Oligo 6.0和在线工具NUPACK(http://www.nupack.org/)进行快速扩增引物的设计。所设计引物进一步通过BLASTn和Primer-BLAST检索验证，引物信息如下：
表1基于沙门氏菌特异性保守区域设计的备选快速扩增引物
以沙门氏菌参考株ATCC14028(浓度约5×106CFU/mL)基因组为模板，20μL反应体系包括：2μL的10×扩增缓冲液(其组分包括200mM Tris-HCl，100mM(NH4)2SO4，500mM KCl，20mM MgSO4，1％Triton X-100，pH 8.6～8.8)、2μL dNTPs(包含dGTP、dCTP、dATP、dTTP，浓度均为10mM)、1μL液态聚乙二醇、1μL甜菜碱(10mM)、正向引物bcf-F(10μM)和反向引物bcf-R(10μM)各2μL、0.8μL Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、1μL石墨烯分散液(20ng/μL)、1μL EvaGreen(20×)、3μL模板和4.2μL无酶水。将反应体系配制于微型反应管中，同时设置阴性对照(灭菌双蒸水)。其中，引物分别使用上述表格中的引物进行同步实验。将含有反应体系的反应管混匀后瞬时离心，将反应管置于普通PCR仪中。反应程序为：74℃1秒，59℃1秒，共40个循环。反应结束后，向反应管中加入80μL运行缓冲液，吹打混匀后滴入荧光免疫层析试纸(如图1所示)加样窗口。静置2min，使用便携式荧光分析仪读取荧光信号。结果如图2和图3所示。
图2为本发明中沙门氏菌备选扩增引物试验结果图；图3为本发明中基于沙门氏菌bcfC和invA基因所设计引物试验结果图；由图2和图3可知，除基于bcfC的第二对引物(bcfC-F2/R2)的阳性对照扩增产物信号较弱外，基于bcfC基因的第一对引物(bcfC-F/R)和invA基因的引物均能对阳性对照进行有效扩增且扩增产物荧光信号值较高。此外，invA基因的阴性对照产物的荧光信号值也较高，而基于bcfC基因的第一对引物(bcfC-F/R)的阴性对照产物的荧光信号值较低(荧光信号曲线峰接近x轴)。因此，优选基于bcfC基因的第一对引物(bcfC-F/R)作为后续实验的扩增引物。
实施例2：沙门氏菌快速荧光检测方法的建立
(1)石墨烯在扩增反应中的作用验证
为了验证石墨烯的作用，本实验选取石墨烯分散液(20ng/μL)进行验证，反应体系分为2组：
不添加石墨烯组：以沙门氏菌参考株ATCC14028(浓度约5×106CFU/mL)基因组为模板，20μL反应体系包括：2μL的10×扩增缓冲液(其组分包括200mM Tris-HCl，100mM(NH4)2SO4，500mM KCl，20mM MgSO4，1％Triton X-100，pH 8.6～8.8)、2μL dNTPs(包含dGTP、dCTP、dATP、dTTP，浓度均为10mM)、1μL液态聚乙二醇、1μL甜菜碱(10mM)、引物F和R(10μM)各2μL、0.8μL Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、1μL Eva Green(20×)、3μL模板和5.2μL无酶水。将反应体系配制于微型反应管中，同时设置阴性对照(灭菌双蒸水)。将含有反应体系的反应管混匀后瞬时离心，将反应管置于普通PCR仪中。反应程序为：74℃1秒，59℃1秒，共40个循环。反应结束后，向反应管中加入80μL运行缓冲液，吹打混匀后滴入荧光免疫层析试纸加样窗口。静置2min，使用便携式荧光分析仪读取荧光信号。
添加石墨烯组：以沙门氏菌参考株ATCC14028(浓度约5×106CFU/mL)基因组为模板，20μL反应体系包括：2μL的10×扩增缓冲液(其组分包括200mM Tris-HCl，100mM(NH4)2SO4，500mM KCl，20mM MgSO4，1％Triton X-100，pH 8.6～8.8)、2μL dNTPs(包含dGTP、dCTP、dATP、dTTP，浓度均为10mM)、1μL液态聚乙二醇、1μL甜菜碱(10mM)、引物F和R(10μM)各2μL、0.8μL Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、1μL石墨烯分散液(20ng/μL)、1μL Eva Green(20×)、3μL模板和4.2μL无酶水。将反应体系配制于微型反应管中，同时设置阴性对照(灭菌双蒸水)。将含有反应体系的反应管混匀后瞬时离心，将反应管置于普通PCR仪中。反应程序为：74℃1秒，59℃1秒，共40个循环。反应结束后，向反应管中加入80μL运行缓冲液，吹打混匀后滴入荧光免疫层析试纸加样窗口。静置2min，使用便携式荧光分析仪读取荧光信号。
结果如图4所示，图4为本发明中石墨烯材料在扩增反应中的作用验证结果图；由图4可知，当反应体系中不含石墨烯时，阳性对照和阴性对照的扩增产物具有较高的荧光信号值。当反应体系中加入石墨烯后，沙门氏菌参考株基因组和阴性对照的扩增产物荧光信号均有所降低，且阴性对照已无可见的荧光曲线峰(靠近x轴)。结果表明，基于石墨烯的反应系统可以有效增强本发明方法中阳性和阴性结果的对比度，有利于实际应用。
(2)沙门氏菌快速荧光检测方法的建立
以沙门氏菌参考株ATCC14028(浓度约5×106CFU/mL)基因组为模板，20μL反应体系包括：2μL的10×扩增缓冲液(其组分包括200mM Tris-HCl，100mM(NH4)2SO4，500mM KCl，20mM MgSO4，1％Triton X-100，pH 8.6～8.8)、2μL dNTPs(包含dGTP、dCTP、dATP、dTTP，浓度均为10mM)、1μL液态聚乙二醇、1μL甜菜碱(10mM)、引物F和R(10μM)各2μL、0.8μL Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、1μL石墨烯分散液(20ng/μL)、1μL Eva Green(20×)、3μL模板和4.2μL无酶水。将反应体系配制于微型反应管中，同时设置阴性对照(灭菌双蒸水)。将含有反应体系的反应管混匀后瞬时离心，将反应管置于普通PCR仪中。反应程序为：74℃1秒，59℃1秒，共40个循环。反应结束后，向反应管中加入80μL运行缓冲液，吹打混匀后滴入荧光免疫层析试纸加样窗口。静置2min，使用便携式荧光分析仪读取荧光信号。
如图5和图6所示，图5为本发明中阳性对照(沙门氏菌参考株)荧光检测结果示意图；图6为本发明中阴性对照(灭菌双蒸水)荧光检测结果示意图；由图5和图6可以看出，使用基于bcfC基因的优选扩增引物，阳性对照的荧光信号值可达20000以上，而阴性对照的荧光信号值较低(靠近x轴)。
图7为阳性对照和阴性对照扩增产物使用荧光免疫层析试纸检测后的暗场成像结果。如图7中所示，阳性对照对应的试纸条的检测线和控制线均有明亮的条带，而阴性对照对应的试纸条仅控制线显示明亮的条带。实验结果表明，本发明结果判断方式有利于实际应用。
实施例3：沙门氏菌快速荧光检测方法的重复性测试
以沙门氏菌参考株ATCC14028(浓度约5×106CFU/mL)基因组为模板，20μL反应体系包括：2μL的10×扩增缓冲液(其组分包括200mM Tris-HCl，100mM(NH4)2SO4，500mM KCl，20mM MgSO4，1％Triton X-100，pH 8.6～8.8)、2μL dNTPs(包含dGTP、dCTP、dATP、dTTP，浓度均为10mM)、1μL液态聚乙二醇、1μL甜菜碱(10mM)、引物F和R(10μM)各2μL、0.8μL Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、1μL石墨烯分散液(20ng/μL)、1μL Eva Green(20×)、3μL模板和4.2μL无酶水。将反应体系配制于微型反应管中，同时设置阴性对照(灭菌双蒸水)。将含有反应体系的反应管混匀后瞬时离心，将反应管置于普通PCR仪中。反应程序为：74℃1秒，59℃1秒，共40个循环。反应结束后，向反应管中加入80μL运行缓冲液，吹打混匀后滴入荧光免疫层析试纸加样窗口。静置2min，使用便携式荧光分析仪读取荧光信号。
结果如图8和表2所示，图8为本发明方法快速检测阳性对照和阴性对照重复性结果图，由图8和表2可知，通过对沙门氏菌参考株ATCC14028基因组(阳性对照)和阴性对照(灭菌双蒸水)分别进行10次扩增测试，两种样品的扩增产物荧光信号均相对稳定(变异系数分别约为0.06和0.22)，有利于实际应用。同时，根据阴性对照的扩增产物荧光信号值计算出cutoff值(阴性对照扩增产物的荧光信号均值加上3倍的标准偏差)为122。
表2本发明沙门氏菌快速检测方法检测阳性质控和阴性质控结果对比
注：CV表示变异系数。
实施例4：沙门氏菌快速荧光检测试剂盒的敏感性测试
本实施例测试本发明快速荧光检测试剂盒检测沙门氏菌的敏感性，将沙门氏菌参考株ATCC14028从约5×106CFU/mL进行10倍梯度稀释至5×10-1CFU/mL。反应体系和程序如下所示：
20μL扩增反应体系包括：2μL的10×扩增缓冲液(其组分包括200mM Tris-HCl，100mM(NH4)2SO4，500mM KCl，20mM MgSO4，1％Triton X-100，pH 8.6～8.8)、2μL dNTPs(包含dGTP、dCTP、dATP、dTTP，浓度均为10mM)、1μL液态聚乙二醇、1μL甜菜碱(10mM)、引物F和R(10μM)各2μL、0.8μL Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、1μL石墨烯分散液(20ng/μL)、1μL EvaGreen(20×)、3μL模板和4.2μL无酶水。将反应体系配制于微型反应管中，同时设置阴性对照(灭菌双蒸水)。将含有反应体系的反应管混匀后瞬时离心，将反应管置于普通PCR仪中。反应程序为：74℃1秒，59℃1秒，共40个循环。反应结束后，向反应管中加入80μL运行缓冲液，吹打混匀后滴入荧光免疫层析试纸加样窗口。静置2min，使用便携式荧光分析仪读取荧光信号。
检测结果如图9所示，图9为本发明沙门氏菌荧光定量试纸检测方法的灵敏度结果图，图9中：荧光扩增曲线对应的核酸标准物质模板浓度分别约为5×106CFU/mL、5×105CFU/mL、5×104CFU/mL、5×103CFU/mL、5×102CFU/mL、5×101CFU/mL、5×100CFU/mL，且荧光信号值均大于122，而5×10-1CFU/mL和阴性对照则看不到明显的曲线(靠近x轴)，且荧光信号值小于122。因此，判定本试剂盒的检测灵敏度为5×100CFU/mL，具有较高的敏感性和应用价值。
实施例5：沙门氏菌快速荧光检测试剂盒的特异性测试
将肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、印第安纳沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、火鸡沙门氏菌、山夫登堡沙门氏菌、鸭沙门氏菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、福氏志贺氏菌、宋内志贺氏菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、多杀性巴氏杆菌参考(分离)菌株进行培养、提取基因组DNA，按照实施例2确定的优化反应体系和反应条件进行快速扩增。
20μL扩增反应体系包括：2μL的10×扩增缓冲液(其组分包括200mM Tris-HCl，100mM(NH4)2SO4，500mM KCl，20mM MgSO4，1％Triton X-100，pH 8.6～8.8)、2μL dNTPs(包含dGTP、dCTP、dATP、dTTP，浓度均为10mM)、1μL液态聚乙二醇、1μL甜菜碱(10mM)、引物F和R(10μM)各2μL、0.8μL Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、1μL石墨烯分散液(20ng/μL)、1μL EvaGreen(20×)、3μL模板和4.2μL无酶水。将反应体系配制于微型反应管中，同时设置阴性对照(灭菌双蒸水)。将含有反应体系的反应管混匀后瞬时离心，将反应管置于普通PCR仪中。反应程序为：74℃1秒，59℃1秒，共40个循环。反应结束后，向反应管中加入80μL运行缓冲液，吹打混匀后滴入荧光免疫层析试纸加样窗口。静置2min，使用便携式荧光分析仪读取荧光信号。结果如图10和表3所示。
图10为本发明沙门氏菌荧光定量试纸检测方法的特异性结果图，由图10和表3可知，仅10株沙门氏菌参考菌株显示出特异性荧光曲线(荧光信号值大于122)，而非沙门氏菌参考/分离株共9株以及阴性对照均无可见的荧光曲线峰(荧光信号值小于122)(表3)。
结果表明，本发明快速荧光检测方法的特异性好，具有较高的检测应用价值。
表3本发明特异性评价试验结果
注：表格结果一栏中，“+”表示阳性，“－”表示阴性。
实施例6：沙门氏菌快速荧光检测试剂盒的抗干扰测试
将肠炎沙门氏菌ATCC13076、大肠埃希氏菌ATCC25922、肺炎克雷伯氏菌ATCC700603和宋内志贺氏菌CMCC51592接种脑心浸液肉汤培养基进行培养，再将培养液使用灭菌双蒸水稀释1000倍后使用商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组。将提取的基因组DNA分为2份，样品A为肠炎沙门氏菌、大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌和宋内志贺氏菌参考株1:1:1:1混合物，样品B号样品为大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌和宋内志贺氏菌参考株1:1:1混合物，同时设置阴性对照(灭菌双蒸水)。按照实施例2确定的优化反应体系和反应条件进行快速扩增。
20μL扩增反应体系包括：2μL的10×扩增缓冲液(其组分包括200mMTris-HCl，100mM(NH4)2SO4，500mMKCl，20mM MgSO4，1％Triton X-100，pH 8.6～8.8)、2μL dNTPs(包含dGTP、dCTP、dATP、dTTP，浓度均为10mM)、1μL液态聚乙二醇、1μL甜菜碱(10mM)、引物F和R(10μM)各2μL、0.8μL Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、1μL石墨烯分散液(20ng/μL)、1μL Eva Green(20×)、3μL模板和4.2μL无酶水。将反应体系配制于微型反应管中，同时设置阴性对照(灭菌双蒸水)。将含有反应体系的反应管混匀后瞬时离心，将反应管置于普通PCR仪中。反应程序为：74℃1秒，59℃1秒，共40个循环。反应结束后，向反应管中加入80μL运行缓冲液，吹打混匀后滴入荧光免疫层析试纸加样窗口。静置2min，使用便携式荧光分析仪读取荧光信号。
结果如图11所示，图11为本发明沙门氏菌荧光定量试纸检测方法的抗干扰测试结果图，由图11可以看出，样品A扩增产物的检测线显示出明显的荧光信号，样品B和阴性对照的检测线荧光信号微弱(低于122)。试验结果表明，本发明方法具有较好的抗干扰能力。
实施例7：检测试剂盒的组装
根据实施例1表中的基于bcfC基因设计的沙门氏菌特异性扩增引物(正向引物5’端修饰生物素，反向引物5’端修饰地高辛)委托生物科技公司进行合成，使用灭菌双蒸水将正向引物和反向引物均稀释成10μM，等体积混合后得到检测引物；使用商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒提取沙门氏菌ATCC14028(浓度不低于5×105CFU/mL)基因组DNA作为阳性对照；核酸扩增试剂：10×扩增缓冲液(其组分包括200mM Tris-HCl，100mM(NH4)2SO4，500mMKCl，20mM MgSO4，1％Triton X-100，pH 8.6～8.8)、dNTPs(包含dGTP、dCTP、dATP、dTTP，浓度均为10mM)、Bst DNA聚合酶(8U/μL)、甜菜碱(10mM)、液态聚乙二醇、石墨烯分散液(20ng/μL)、本发明用于快速检测沙门氏菌的扩增引物、无酶水、阳性对照以及阴性对照(灭菌双蒸水)以及运行缓冲液。运行缓冲液组成为0.01M的三羟甲基氨基甲烷(Tris)、0.01M乙二胺四乙酸(EDTA)和0.05M氯化钠(NaCl)。荧光免疫层析试纸组成包括底板、吸水纸、硝酸纤维膜、结合垫、样品垫。底板上粘贴硝酸纤维膜，硝酸纤维膜的一端连接吸水纸、另一端粘贴结合垫，结合垫上搭接样品垫。硝酸纤维膜上设有一条包被有生物素的控制线，还设有一条与控制线平行的包被有抗地高辛抗体的检测线。将标记链霉亲和素的荧光微球探针(5mg/mL)喷洒在结合垫上，制得固定有探针的结合垫及经过处理的样品垫。所述试纸条装在卡壳中，上盖设置有加样窗口和信号读取窗口，其中加样窗口与样品垫对应，信号读取窗口与控制线、检测线对应。
将以上所涉试剂和产品共同包装，再配以产品使用说明书(包括产品保存条件、反应程序和结果判定方法等)，组装成本发明所述的沙门氏菌核酸快速检测试剂盒。
实施例8：临床细菌分离株样本验证
采用实施例7中的试剂盒用实施例1的方法对实验室保存的181份临床细菌分离株样本进行检测验证，上述样本经畜产品检测技术食品中沙门氏菌检测标准(GB4789.4-2016)方法鉴定出沙门氏菌阳性为45份。按照本发明方法检测结果如表4所示，本发明提供的检测方法检出45株细菌分离株为沙门氏菌阳性，检测结果与国标检测方法一致。验证结果表明，本发明试剂盒所建立的检测方法具有较好的临床应用价值。
表4采集样本验证结果
Claims (11)
1.一种用于快速检测沙门氏菌的扩增引物，其特征在于，所述扩增引物基于基于沙门氏菌bcfC基因特异性保守区域设计，包括正向引物bcf-F和反向引物bcf-R，所述正向引物bcf-F序列如SEQ ID NO：1所示，所述反向引物bcf-R序列如SEQ ID NO：2。
2.根据权利要求1所述的用于快速检测沙门氏菌的扩增引物，其特征在于，所述正向和反向引物的5’或3’端均可标记标记物，所述标记物包括磷酸化、生物素、地高辛、氨基、羧基、巯基或引物可修饰荧光基团，使扩增后的DNA双链产物两端含有不同的标记物。
3.根据权利要求2所述的用于快速检测沙门氏菌的扩增引物，其特征在于，所述标记物标记在正向引物bcf-F或反向引物bcf-R的5’端。
4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3任一项所述的用于快速检测沙门氏菌的扩增引物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括石墨烯、扩增缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、聚乙二醇、甜菜碱、无酶水、阳性对照和阴性对照。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述石墨烯包括氧化石墨烯、还原石墨烯、石墨烯量子点或功能化改性的石墨烯。
7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中正向引物bcf-F与反向引物bcf-R摩尔比为1:1～1:2，所述正向引物bcf-F和反向引物bcf-R的浓度均为0.1～30μM。
8.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括荧光免疫层析试纸和运行缓冲液，所述运行缓冲液中包括0.001～1M的三羟甲基氨基甲烷、0.001～0.5M乙二胺四乙酸和0.001～0.8M氯化钠。
9.一种快速检测沙门氏菌的方法，其特征在于，所述检测方法是利用权利要求1-3任一项所述的用于快速检测沙门氏菌的扩增引物或权利要求4-8任一项所述的试剂盒，采用荧光检测方法进行检测沙门氏菌。
10.根据权利要求10所述的快速检测沙门氏菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：在待测液中加入权利要求1-3任一项所述的用于快速检测沙门氏菌的扩增引物或权利要求4-8任一项所述的试剂盒进行扩增反应，扩增反应结束后，向反应管中加入运行缓冲液，吹打混匀，静置，通过荧光分析仪读取数值。若荧光信号值大于122，则说明待检样品中含有沙门氏菌；若荧光信号值小于等于122，则说明待检样品中没有沙门氏菌。
11.根据权利要求9所述的快速检测沙门氏菌的方法，其特征在于，进行扩增分析反应时，扩增引物的反应温度为两步温度快速循环，所述第一步温度为辅助变性温度，范围为70～78℃，第二步温度为扩增反应温度，范围为55～70℃，每步温度反应时间均为1～10秒，循环数为35～45。
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