CN117418045A - 神经坏死病毒的lamp检测引物组、试剂盒及应用 - Google Patents

神经坏死病毒的lamp检测引物组、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种神经坏死病毒的LAMP检测引物组、试剂盒及应用，属于微生物检测领域。所述的LAMP引物组如SEQ ID NO.1‑6所示。本发明还提供神经坏死病毒的环介导等温扩增检测试剂盒及应用，所述试剂盒包括环介导等温扩增反应液、Bst DNA聚合酶、AMV反转录酶、钙黄绿素显色液、阳性对照质控品、阴性对照质控品和检测引物组。本发明所述LAMP检测引物组是基于神经坏死病毒的RdRp基因为特异性靶基因设计，所制备的试剂盒特异性强、操作方便简单、无需昂贵的仪器设备。

Description

神经坏死病毒的LAMP检测引物组、试剂盒及应用
技术领域
本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种神经坏死病毒的环介导等温扩增检测引物组、试剂盒及应用。
背景技术
神经坏死病毒(Nervous necrosis virus,NNV)为野田村病毒科的单链RNA病毒，NNV病毒粒子很小，其直径大约为25-30nm，无囊膜，整个病毒粒子呈正二十面体，从感染的病鱼组织和细胞中观察到病毒粒子呈晶格状紧密排列，主要在细胞质中。NNV临床症状主要表现为：黑身、厌食、泳动失调、打转，幼鱼死亡率明显高于成鱼，石斑鱼幼鱼7天死亡率高达100％。病理切片检测表明感染鱼中枢神经系统大面积坏死：大脑和视网膜出现大量空泡同时伴随着炎性坏死。患病拟鲹组织切片表明除了神经系统的空泡化坏死，皮肤、鳃盖和口腔的上皮细胞也出现空泡坏死现象。
目前针对神经坏死病毒的检测方法主要包括免疫学检测和分子生物学检测方法(如普通PCR、实时荧光定量PCR检测方法)等，但这类检测方法的操作性、使用成本、检测场地、人员素质等方面都有一定的局限性，不能达到现场和基层实时快速监测病原的目的。与之相比，环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification method,LAMP)是一种新兴的核酸扩增方法，依靠Bst DNApolymerase特有的链置换功能和较强的热稳定性和根据靶基因的设计2对引物或者3对引物，可以在30-60min和60-65℃内将极少拷贝数的DNA扩增数百万倍。多引物与靶区域的高符合性、针对性和Bst DNA聚合酶的特性使得LAMP有着与实时荧光定量PCR相似的灵敏性和特异性，且较普通PCR方法的灵敏性可高出10-100倍。同时，LAMP反应结果还可以通过肉眼直接观察，缩短了电泳检测所需时间，简化了LAMP检测程序。因此，该技术具有方便、简单、快速、特异性高、结果可视化等优点，应用前景极为广阔。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种神经坏死病毒的LAMP检测引物组、试剂盒及应用。所述引物组特异性强，利用LAMP方法进行检测操作方便简单、无需昂贵的仪器设备。
本发明的第一个目的是提供一种神经坏死病毒的LAMP检测引物组，所述的检测引物组如下所示：
前外引物F3:5’-GTCTCCAAGCCGAGTGTG-3’(如SEQ ID NO.1所示)；
后外引物B3:5’-CCAGCAATACGACCGTCAAT-3’(如SEQ ID NO.2所示)；
前内引物FIP:
5’-TGTCGTAGGCACTACCAACTGCGGTCGTGCATAAACCTGGC-3’(如SEQ ID NO.3所示)；
后内引物BIP:
5’-TTACGCGCGTGAGTACGCTCAGCTCGTTGGAACGTGAC-3’(如SEQ ID NO.4所示)；
前环引物LF:5’-TTGGTAATGACGAGCAAGATC-3’(如SEQ ID NO.5所示)；
后环引物LB:5’-TGACTCAAACTGCTGTATTTCCAA-3’(如SEQ IDNO.6所示)。
本发明的第二个目的是提供神经坏死病毒的环介导等温扩增检测试剂盒，包括环介导等温扩增反应液、Bst DNA聚合酶、AMV反转录酶、钙黄绿素显色液、阳性对照质控品、阴性对照质控品和检测引物组，所述的检测引物组如上所述。
进一步，所述的阳性对照质控品为含鱼类神经坏死病毒的RdRp基因(GenBank登录号为AOC89548.1)的质粒DNA，可以通过从神经坏死病毒的RNA反转录扩增得到；所述的阴性对照质控品为超纯水。
本发明还提供所述引物组在鉴定鱼类神经坏死病毒中的应用，所述应用为非疾病诊断目的。
本发明还提供所述试剂盒在鉴定鱼类神经坏死病毒中的应用，所述应用为非疾病诊断目的。
进一步，所述的应用方法：
(1)对样品进行收集，提取样品的RNA作为模板；
(2)使用上述的神经坏死病毒的环介导等温扩增检测引物组，与环介导等温扩增反应液、Bst聚合酶、AMV反转录酶、钙黄绿素显色液及样品上清液混合形成环介导等温扩增反应体系，进行环介导等温扩增反应；
(3)扩增反应结束后，通过钙黄绿素荧光显色法和/或凝胶电泳分析检测样品中是否含有神经坏死病毒。
进一步，所述的通过钙黄绿素荧光显色法检测样品中是否含有神经坏死病毒具体为：若扩增产物颜色为亮绿色，则样品中含有神经坏死病毒；若扩增产物颜色保持橙黄色不变，则样品中不含有神经坏死病毒。
进一步，所述的通过凝胶电泳分析检测样品中是否含有神经坏死病毒具体为：将扩增产物进行凝胶电泳，若有梯状条带，则样品中含有神经坏死病毒；若无梯状条带，则样品中不含有神经坏死病毒。
优选，所述的环介导等温扩增反应体系总体积25μL，包括10×ThermoPol Buffer2.5μL，5×AMV RT Buffer 3μL，100mmol/LMgSO4 2μL，10mmol/LdNTP Mix 3μL，引物FIP、10μmol/LBIP各3μL，10μmol/L引物F3、B3各0.5μL，10μmol/L引物LF、LB 1μL，8U Bst DNA聚合酶1μL，AMV反转录酶1μL，5mmol/L钙黄绿素显色液(含20mmol/LMnCl2)0.5μL和模板1μL，余量为去离子水。
所述的环介导等温扩增反应的反应条件优选为：62℃反应35min，80℃终止反应5min。
本发发明与现有技术相比的有益效果：本发明根据神经坏死病毒(Nervousnecrosis virus,NNV)的RdRp基因设计特异性引物组，具有很好的特异性，可用于检测神经坏死病毒。本发明设计和筛选了一套特异性检测引物组以及含有该引物组的检测试剂盒和使用该检测试剂盒通过环介导等温扩增的检测方法，进而确定检测的样品中是否存在神经坏死病毒。本发明的检测引物组，检测试剂盒和检测方法具特异性强，操作方便简单，检测时间短，无需昂贵的仪器设备等优点，特别适合基层的现场检测，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是特异性实验中LAMP扩增产物的显色分析结果图；1：含神经坏死病毒的RdRp基因的重组质粒；2：神经坏死病毒；3：石斑鱼虹彩病毒；4：传染性脾肾坏死病毒；5：虾血细胞虹彩病毒；6：传染性皮下及造血组织坏死病毒；7：白斑综合症病毒；8：超纯水；其中1，2为亮绿色，3～8为橙黄色。
图2是特异性实验中LAMP扩增产物的凝胶电泳结果图；M：标准分子量DL2000；1：含神经坏死病毒的RdRp基因的重组质粒；2：神经坏死病毒；3：石斑鱼虹彩病毒；4：传染性脾肾坏死病毒；5：虾血细胞虹彩病毒；6：传染性皮下及造血组织坏死病毒；7：白斑综合症病毒；8：超纯水。
图3是神经坏死病毒灵敏性实验中LAMP扩增产物的显色分析结果图；1：10fg/μl；2：100fg/μl；3：1pg/μl；4：10pg/μl；5：100pg/μl；6：1ng/μl；7：10ng/μl；8：100ng/μl；9：阳性对照，其中2～9为亮绿色，1为橙黄色。
图4是是神经坏死病毒灵敏性实验中LAMP扩增产物的凝胶电泳结果图；M：标准分子量DL2000；1：10fg/μl；2：100fg/μl；3：1pg/μl；4：10pg/μl；5：100pg/μl；6：1ng/μl；7：10ng/μl；8：100ng/μl；9：阳性对照。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1引物的设计与合成；
根据环介导等温扩增引物的设计原则，在NCBI GenBank数据库中查找神经坏死病毒适用于环介导等温扩增的靶基因序列，最终选择特异性较强的RdRp基因(GenBank登录号为AOC89548.1)为靶基因。根据神经坏死病毒RdRp基因特异性区域，依照环介导等温扩增引物设计原则，利用LAMP引物设计软件Primer Designer设计5套引物，并筛选出一组特异性最佳的引物组。
由此设计的鱼类神经坏死病毒的环介导等温扩增检测引物为：
前外引物F3:5’-GTCTCCAAGCCGAGTGTG-3’(如SEQ ID NO.1所示)；
后外引物B3:5’-CCAGCAATACGACCGTCAAT-3’(如SEQ ID NO.2所示)；
前内引物FIP:
5’-TGTCGTAGGCACTACCAACTGCGGTCGTGCATAAACCTGGC-3’(如SEQ ID NO.3所示)；
后内引物BIP:
5’-TTACGCGCGTGAGTACGCTCAGCTCGTTGGAACGTGAC-3’(如SEQ ID NO.4所示)；
前环引物LF:5’-TTGGTAATGACGAGCAAGATC-3’(如SEQ ID NO.5所示)；
后环引物LB:5’-TGACTCAAACTGCTGTATTTCCAA-3’(如SEQ ID NO.6所示)。
实施例2核酸提取；
使用诺唯赞RNA提取试剂盒提取神经坏死病毒样品的RNA，使用诺唯赞基因组DNA提取试剂盒提取石斑鱼虹彩病毒样品、传染性脾肾坏死病毒样品、虾血细胞虹彩病毒样品、传染性皮下及造血组织坏死病毒样品、白斑综合症病毒样品的DNA，作为LAMP扩增反应的模板。
实施例3RdRp重组质粒的构建；
人工构建的含神经坏死病毒的RdRp基因的重组质粒DNA的制备方法为：使用pEASY-T1-simple vector作为载体，以神经坏死病毒的RdRp基因为DNA目的片段，通过连接酶将RdRp目标片段连接到pEASY-T1-simple vector上，构建重组质粒T1-RdRp，并转化到Escherichia coli DH5α感受态细胞中，经100mg/mL氨苄青霉素筛选出阳性克隆，用质粒提取试剂盒提取重组质粒，最后经PCR检测并送测序，检测重组质粒是否构建成功。
实施例4LAMP方法的特异性；
样品的环介导等温扩增反应体系为25μL，包括：10×ThermoPol Buffer 2.5μL，5×AMV RT Buffer 3μL，MgSO4(100mmol/L)2μL，dNTP Mix(10mmol/L)3μL，引物FIP、BIP(10μmol/L)各3μL，引物F3、B3(10μmol/L)各0.5μL，引物LF、LB(10μmol/L)各1μL，8U Bst DNA聚合酶1μL，AMV反转录酶1μL，钙黄绿素显色液(5mmol/L，含20mmol/LMnCl2)0.5μL和模板(分别为实施例2获得的各病毒DNA或RNA)1μL，去离子水补齐至25μL。
阳性对照质控品的环介导等温扩增体系为25μL，包括：10×ThermoPol Buffer2.5μL，5×AMV RT Buffer 3μL，MgSO4(100mmol/L)2μL，dNTP Mix(10mmol/L)3μL，引物FIP、BIP(10μmol/L)各3μL，引物F3、B3(10μmol/L)各0.5μL，引物LF、LB(10μmol/L)各1μL，8U BstDNA聚合酶1μL，AMV反转录酶1μL，钙黄绿素显色液(5mmol/L，含20mmol/LMnCl2)0.5μL和人工构建的含神经坏死病毒的RdRp基因的质粒DNA 1μL，去离子水补齐至25μL。
阴性对照质控品的环介导等温扩增反应体系为25μL，包括：10×ThermoPolBuffer 2.5μL，5×AMV RT Buffer 3μL，MgSO4(100mmol/L)2μL，dNTP Mix(10mmol/L)3μL，引物FIP、BIP(10μmol/L)各3μL，引物F3、B3(10μmol/L)各0.5μL，引物LF、LB(10μmol/L)各1μL，8U Bst DNA聚合酶1μL，AMV反转录酶1μL，钙黄绿素显色液(5mmol/L，含20mmol/LMnCl2)0.5μL和超纯水1μL，去离子水补齐至25μL。
分别将上述3种环介导等温扩增体系混合均匀后，放入恒温水浴箱中，反应条件为62℃，35min；终止反应为80℃，5min。
在反应体系中添加了钙黄绿素显色液，在反应结束后，观察反应产物颜色是否发生变化，如颜色呈亮绿色，为阳性；颜色呈橙色，为阴性。如图1所示，钙黄绿素荧光显色法检测结果显示：神经坏死病毒和阳性对照质控品RdRp重组质粒DNA扩增产物呈亮绿色，为阳性；而石斑鱼虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒、虾血细胞虹彩病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、白斑综合症病毒以及超纯水等的扩增反应产物呈橙黄色，为阴性。
环介导等温扩增反应结束后，取5μL的扩增产物，点样于2％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，180V通电20min，如图2所示，电泳分析检测结果显示，神经坏死病毒和阳性对照质控品RdRp重组质粒DNA的扩增产物，电泳条带呈特异性梯状条带(阳性)；而石斑鱼虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒、虾血细胞虹彩病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、白斑综合症病毒以及超纯水的扩增产物，其电泳结果无特异性条带(阴性)。这表明本发明的神经坏死病毒的环介导等温扩增检测引物具有极高的专一性，特异性强，因此可以用于快速的检测样品中是否含有神经坏死病毒。
实施例5：LAMP方法的灵敏度
将过夜培养的T1-RdRp阳性菌通过诺唯赞的质粒提取试剂盒提取菌株的质粒。质粒用ddH2O进行10倍梯度稀释,分别为10fg/μl，100fg/μl，1pg/μl，10pg/μl，100pg/μl，1ng/μl，10ng/μl，100ng/μl，作为LAMP灵敏度检测的模板。
LAMP灵敏度检测的环介导等温扩增反应体系为25μL，包括：10×ThermoPolBuffer 2.5μL，5×AMV RT Buffer 3μL，MgSO4(100mmol/L)2μL，dNTP Mix(10mmol/L)3μL，引物FIP、BIP(10μmol/L)各3μL，引物F3、B3(10μmol/L)各0.5μL，引物LF、LB(10μmol/L)各1μL，8U Bst DNA聚合酶1μL，AMV反转录酶1μL，钙黄绿素显色液(5mmol/L，含20mmol/LMnCl2)0.5μL以及各稀释浓度的模板1μL，去离子水补齐至25μL。LAMP扩增体系混合均匀后，放入恒温水浴箱中，反应条件为62℃，35min；终止反应为80℃，5min。
结果如图3和图4所示，本发明的环介导等温扩增检测方法的灵敏度为：100fg/μl。钙黄绿素荧光显色法检测结果为100fg/μl～100ng/μl为绿色(阳性)，10fg/μl，为橙黄色(阴性)；2％凝胶电泳结果为100fg/μl～100ng/μl有特异性条带(阳性)，10fg/μl无特异性条带(阴性)；荧光显色法检测结果(图3)与凝胶电泳结果(图4)相一致，由此说明，本发明的环介导等温扩增检测方法的灵敏度为100fg/μl。
钙黄绿素荧光显色法与凝胶电泳分析检测结果一致，证明此方法数据可靠。可以直接通过扩增产物颜色判断样品中是否含有神经坏死病毒，极大地缩短了检测时间。
综上所述，本发明的神经坏死病毒的环介导等温扩增检测引物组及检测方法不仅可以快速、简便、灵敏地检测到神经坏死病毒，而且特异特异性强，准确性高。

Claims (9)

1.一种神经坏死病毒的LAMP检测引物组，其特征在于，所述的检测引物组如下所示：
前外引物F3:5’-GTCTCCAAGCCGAGTGTG-3’；
后外引物B3:5’-CCAGCAATACGACCGTCAAT-3’；
前内引物FIP:5’-TGTCGTAGGCACTACCAACTGCGGTCGTGCATAAA CCTGGC-3’；
后内引物BIP:5’-TTACGCGCGTGAGTACGCTCAGCTCGTTGGAACGT GAC-3’；
前环引物LF:5’-TTGGTAATGACGAGCAAGATC-3’；
后环引物LB:5’-TGACTCAAACTGCTGTATTTCCAA-3’。
2.一种神经坏死病毒的环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于，包括环介导等温扩增反应液、Bst DNA聚合酶、AMV反转录酶、钙黄绿素显色液、阳性对照质控品、阴性对照质控品和检测引物组，所述的检测引物组如上所述。
3.根据权利要求2所述的一种神经坏死病毒的环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照质控品为含鱼类神经坏死病毒的RdRp基因的质粒DNA，通过从神经坏死病毒的RNA反转录扩增得到；所述的阴性对照质控品为超纯水。
4.权利要求1所述引物组在鉴定鱼类神经坏死病毒中的应用，其特征在于，所述应用为非疾病诊断目的。
5.权利要求2所述试剂盒在鉴定鱼类神经坏死病毒中的应用，所述应用为非疾病诊断目的。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用具体方法：
(1)对样品进行收集，提取样品的RNA作为模板；
(2)使用上述的神经坏死病毒的环介导等温扩增检测引物组，与环介导等温扩增反应液、Bst聚合酶、AMV反转录酶、钙黄绿素显色液及样品上清液混合形成环介导等温扩增反应体系，进行环介导等温扩增反应；
(3)扩增反应结束后，通过钙黄绿素荧光显色法和/或凝胶电泳分析检测样品中是否含有神经坏死病毒。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，通过钙黄绿素荧光显色法检测样品中是否含有神经坏死病毒具体为：若扩增产物颜色为亮绿色，则样品中含有神经坏死病毒；若扩增产物颜色保持橙黄色不变，则样品中不含有神经坏死病毒。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，通过凝胶电泳分析检测样品中是否含有神经坏死病毒具体为：将扩增产物进行凝胶电泳，若有梯状条带，则样品中含有神经坏死病毒；若无梯状条带，则样品中不含有神经坏死病毒。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的环介导等温扩增反应体系总体积25μL，包括10×ThermoPol Buffer 2.5μL，5×AMV RT Buffer 3μL，100mmol/LMgSO42μL，10mmol/LdNTP Mix 3μL，引物FIP、10μmol/LBIP各3μL，10μmol/L引物F3、B3各0.5μL，10μmol/L引物LF、LB 1μL，8U Bst DNA聚合酶1μL，AMV反转录酶1μL，5mmol/L钙黄绿素显色液0.5μL和模板1μL，余量为去离子水；
所述的环介导等温扩增反应的反应条件优选为：62℃反应35min，80℃终止反应5min。
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