CN115558707A - 可视化口蹄疫、水泡性口炎和蓝舌病多重rt-lamp检测方法及引物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可视化口蹄疫、水泡性口炎和蓝舌病多重RT‑LAMP检测方法及引物。本发明设计了多套引物，优化筛选特异性引物组合，首次在LAMP方法中加入了荧光‑淬灭复合探针，探针3’端标记不同的荧光基团，最终成功建立了在同一反应管里鉴别诊断FMDV，VSV和BTV的多重RT‑LAMP检测方法，该法特异性好，敏感性高，最低能检测到1copies/反应病毒RNA，反应时间快，全程只需要65分钟就能完成检测，反应后可通过反应产物观察颜色直接读取结果，可用于临床鉴别诊断和流行病学调查，可在条件较差的基层地区开展现场检疫。

Description

可视化口蹄疫、水泡性口炎和蓝舌病多重RT-LAMP检测方法及 引物

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种可视化口蹄疫、水泡性口炎和蓝舌病多重RT-LAMP检测方法及引物。

背景技术

口蹄疫，水泡性口炎和蓝舌病是三种牛常见高度急性病毒传染病，在全球范围内广泛流行，一旦暴发必给养牛业造成巨大的经济损失，被世界动物卫生组织(OIE)列为必须通报的动物疫病，也是我国动物和动物产品国际贸易中的重要检疫对象。口蹄疫是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)引起的偶蹄类动物共患的急性高度接触性传染病，具有传播广、发病急、危害大等流行病学特点，主要感染牛、猪、羊和骆驼等个20科的70多种家养和野生哺乳动物。水泡性口炎是由水泡性口炎病毒(Vesicular StomatitisVirus，VSV)引起的多种哺乳动物的高度接触性传染病，可以自然感染牛、猪、马及其他哺乳动物，昆虫和植物也是VSV潜在的贮存者，节肢动物媒介可以传播VSV。蓝舌病是由蓝舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)引起的反刍动物非接触性传染病，可通过库蠓等昆虫感染宿主，主要感染绵羊、牛及野生反刍动物。

三种病毒感染动物均表现为发烧，流涎，口腔粘膜，乳头皮肤及蹄冠部皮肤出现水泡及糜烂等症状，且经常混合感染，难以区分。FMDV一旦暴发，只能通过屠宰和集体焚毁的方式进行处理，VSV在我国属于外来必检病，BTV在牛体上一般呈隐性感染，已在我国多个省份广泛存在，时时危害着畜牧业的健康发展。

随着我国养牛业逐步向规模化和集约化转变，国内外活畜和冻精贸易日益频繁，各类疫病防控困难逐渐加大。近年来我国口蹄疫不断发生，疫情复杂多样，加上周边国家口蹄疫流行毒株的跨境传播，更加大我国口蹄疫防控的复杂性和难度。据报导蓝舌病在我国多省份陆续流行和存在。水泡性口炎作为外来疫病虽未在我国发现，但仍时时威胁着我国畜牧业的发展。因此需建立能同时快速鉴别诊断三种疫病的检测方法，开展患畜早期筛查，防止动物疫情的流行爆发。

目前已有不少学者建立了这三种病的不同组合的多重RT-PCR和荧光RT-PCR，敏感性和特异性各异，但检测过程必须依赖实验室才能完成，无法满足当今传染病现场快速诊断的需求。目前对这三种病的实验室诊断主要有病毒分离、血清学诊断和生物学方法。血清学诊断包括：血清中和试验，补体结合试验，琼脂扩散试验和ELISA。生物学方法主要有RT-PCR和荧光定量RT-PCR。但RT-PCR和荧光RT-PCR都有一些自身的局限性，如RT-PCR敏感性较低，荧光RT-PCR成本较高，需要昂贵的仪器设备等。

环介导的体外等温扩增检测技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)在PCR方法上发展起来的新兴核酸检测技术，突破了恒温扩增的技术难点，6条引物同效率时增，敏感性高，特异性好，已在多种疾病的检测上得到应用。但LAMP由于其结果判定方法的局限(浊度，颜色，加染料)，多重LAMP方法一直未有较大进展。虽然目前国内外已有多位学者建立多重LAMP检测方法，但这些方法都有一定的不足：只能检测样品是否带病，但不能确定具体是哪一种病原引起的阳性反应，不是真正意义上的鉴别诊断。

发明内容

本发明一个目的是提供一种成套试剂。

本发明提供的成套试剂，为如下1)或2)：

1)所示的试剂由引物探针组Ⅰ、引物探针组Ⅱ和引物探针组Ⅲ组成；

所述引物探针组Ⅰ由引物FMDV-F3、引物FMDV-B3、引物FMDV-FIP、引物FMDV-BIP、引物FMDV-Floop、引物FMDV-Bloop、探针FMDV-FD和探针FMDV-BD组成；

所述引物探针组Ⅱ由引物VSV-F3、引物VSV-B3、引物VSV–FIP、引物VSV-BIP、引物VSV-Floop、引物VSV-Bloop、探针VSV-FD和探针VSV-BD组成；

所述引物探针组Ⅲ由引物BTV-F3、引物BTV-B3、引物BTV-FIP、引物BTV-BIP、引物BTV-Floop、引物BTV-Bloop、探针BTV-FD和探针BTV-BD组成；

2)所示的试剂由引物探针组A、引物探针组B和引物探针组C组成；

所述引物探针组A由引物FMDV-FIP、引物FMDV-BIP、引物FMDV-F3、引物FMDV-B3、复合物FMDV FIP-FD、复合物FMDV BIP-BD、引物FMDV-Floop和引物FMDV-Bloop组成；

所述引物探针组B由引物VSV-FIP、引物VSV BIP、引物VSV-F3、引物VSV-B3、复合物VSV FIP-FD、复合物VSV BIP-BD、VSV-Floop和VSV-Bloop组成；

所述引物探针组C由引物BTV-FIP、引物BTV-BIP、引物BTV-F3、引物BTV-B3、复合物BTV FIP-FD、复合物BTV BIP-BD、引物BTV-Floop和引物BTV-Bloop组成；

所述复合物FMDV FIP-FD由所述引物FMDV-FIP和与其F1C段互补的探针FMDV-FD退火得到；

所述复合物FMDV BIP-BD由所述引物FMDV-BIP和与其B1C段互补的探针FMDV-BD退火得到；

所述复合物VSV FIP-FD由所述引物VSV-FIP和与其F1C段互补的探针VSV-FD退火得到；

所述复合物VSV BIP-BD由所述引物VSV-BIP和与其B1C段互补的探针VSV-BD退火得到；

所述复合物BTV FIP-FD由所述引物BTV-FIP和与其F1C段互补的探针BTV-FD退火得到；

所述复合物BTV BIP-BD由所述引物BTV-BIP和与其B1C段互补的探针BTV-BD退火得到；

所述引物FMDV-F3、引物FMDV-B3、引物FMDV-FIP、引物FMDV-BIP、引物FMDV-Floop、引物FMDV-Bloop、探针FMDV-FD、探针FMDV-BD、引物VSV-F3、引物VSV-B3、引物VSV–FIP、引物VSV-BIP、VSV-Floop、VSV-Bloop、探针VSV-FD、探针VSV-BD、引物BTV-F3、引物BTV-B3、引物BTV–FIP、引物BTV-BIP、引物BTV-Floop、引物BTV-Bloop、探针BTV-FD和探针BTV-BD的核苷酸序列分别为序列1至序列24，或分别为将序列1至序列24中的至少一个经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得的与原序列功能相同的序列；

所述FMDV-FIP、所述FMDV-BIP、所述VSV-FIP、所述VSV-BIP、所述BTV-FIP、所述BTV-BIP的末端标记淬灭基团；

所述FMDV-FD、所述FMDV-BD、所述VSV-FD、所述VSV-BD、所述BTV-FD、所述BTV-BD的末端标记荧光基团，且不同病原菌标记显示不同颜色的荧光基团，同一病原菌的FD探针和BD探针标记相同的荧光基团。

上述成套试剂中各个引物、探针或复合物单独包装。

本发明另一个目的是提供环介导等温扩增试剂。

本发明提供的环介导等温扩增试剂，含有上述中2)所示的试剂。

上述环介导等温扩增试剂中，所述复合物FMDV FIP-FD、复合物FMDV BIP-BD、复合物VSV FIP-FD、复合物VSV BIP-BD、复合物BTV FIP-FD、复合物BTV BIP-BD、引物FMDV-F3、引物FMDV-B3、引物VSV-F3、引物VSV-B3、引物BTV-F3、引物BTV-B3、引物FMDV-Floop、引物FMDV-Bloop、引物VSV-Floop、引物VSV-Bloop、引物BTV-Floop、引物BTV-Bloop、引物FMDVFIP、引物BTV FIP、引物VSV FIP、引物FMDV BIP、引物BTV BIP和引物VSV BIP在所述试剂中的摩尔比为8：8：8：8：8：8：1：1：1：1：1：1：2：2：2：2：2：2：8：8：8：8：8：8。

上述环介导等温扩增试剂中，所述复合物FMDV FIP-FD、复合物FMDV BIP-BD、复合物VSV FIP-FD、复合物VSV BIP-BD、复合物BTV FIP-FD、复合物BTV BIP-BD、引物FMDV-F3、引物FMDV-B3、引物VSV-F3、引物VSV-B3、引物BTV-F3、引物BTV-B3、引物FMDV-Floop、引物FMDV-Bloop、引物VSV-Floop、引物VSV-Bloop、引物BTV-Floop、引物BTV-Bloop、引物FMDVFIP、引物BTV FIP、引物VSV FIP、引物FMDV BIP、引物BTV BIP和引物VSV BIP在所述试剂中的浓度依次为0.8μM、0.8μM、0.8μM、0.8μM、0.8μM、0.8μM、0.1μM、0.1μM、0.1μM、0.1μM、0.1μM、0.1μM、0.2μM、0.2μM、0.2μM、0.2μM、0.2μM、0.2μM、0.8μM、0.8μM、0.8μM、0.8μM、0.8μM和0.8μM。

上述试剂中还包括dUTP、热敏UDG、可视化的PH值指示剂、DNA聚合酶和反转录酶。

上述成套试剂或上述环介导等温扩增试剂在制备试剂盒中的应用也是本发明保护的范围；所述试剂盒的用途为如下(d1)或(d2)或(d3)：

(d1)鉴别或辅助鉴别口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒或蓝舌病病毒；

(d2)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒和/或蓝舌病病毒；

(d3)鉴定或辅助鉴定待测样本是否感染了口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒和/或蓝舌病病毒。

含有上述成套试剂或上述环介导等温扩增试剂的试剂盒也是本发明保护的范围；所述试剂盒的用途为如下(d1)或(d2)或(d3)：

(d1)鉴别或辅助鉴别口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒或蓝舌病病毒；

(d2)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒和/或蓝舌病病毒；

(d3)鉴定或辅助鉴定待测样本是否感染了口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒和/或蓝舌病病毒。

上述试剂盒的制备方法也是本发明保护的范围，该方法包括将上述成套试剂中各物质单独包装的步骤。

本发明还有一个目的是提供一种鉴别或辅助鉴别、鉴定或辅助鉴定待测病毒为口蹄疫病毒还是水泡性口炎病毒还是蓝舌病病毒的方法。

本发明提供方法，包括如下步骤：

(1)提取待测病毒的总RNA；

(2)以步骤(1)得到的总RNA为模板，采用上述的环介导等温扩增试剂进行环介导等温扩增，检测环介导等温扩增产物；

若所述环介导等温扩增产物显色FMDV-FD或FMDV-BD标记的荧光基团颜色，则待测病毒为或候选为口蹄疫病毒；反之，则不为；

若所述环介导等温扩增产物显色VSV-FD或VSV-BD标记的荧光基团颜色，则待测病毒为或候选为水泡性口炎病毒；反之，则不为；

若所述环介导等温扩增产物显色BTV-FD或BTV-BD标记的荧光基团颜色，则待测病毒为或候选为蓝舌病病毒；反之，则不为；

若所述环介导等温扩增产物显色上述探针任两种组合的荧光基团混合颜色，则待测病毒为或候选为荧光基团对应标记探针对应的病毒混合；反之，则不为；

若所述环介导等温扩增产物显色上述探针三种组合的荧光基团混合颜色，则待测病毒为或候选为三种病毒混合；反之，则不为。

本发明提供了一种鉴定或辅助鉴定待测样本是否感染口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒和/或蓝舌病病毒的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测病毒的总RNA；

(2)以步骤(1)得到的总RNA为模板，采用上述环介导等温扩增试剂进行环介导等温扩增，检测环介导等温扩增产物；

若所述环介导等温扩增产物显色FMDV-FD或FMDV-BD标记的荧光基团颜色，则待测样本感染或候选感染口蹄疫病毒；反之，则不为；

若所述环介导等温扩增产物显色VSV-FD或VSV-BD标记的荧光基团颜色，则待测样本感染或候选感染口蹄疫病毒水泡性口炎病毒；反之，则不为；

若所述环介导等温扩增产物显色BTV-FD或BTV-BD标记的荧光基团颜色，则待测样本感染或候选感染口蹄疫病毒蓝舌病病毒；反之，则不为；

若所述环介导等温扩增产物显色上述探针任两种组合的荧光基团混合颜色，则待测样本感染或候选感染荧光基团对应标记探针对应的病毒混合；反之，则不为；

若所述环介导等温扩增产物显色上述探针三种组合的荧光基团混合颜色，则待测样本感染或候选感染三种病毒混合；反之，则不为。

上述成套试剂或上述的环介导等温扩增试剂或上述试剂盒在如下任一中的应用也是本发明保护的范围：

1)鉴别或辅助鉴别口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒或蓝舌病病毒；

2)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒或蓝舌病病毒；

3)鉴定或辅助鉴定待待测样本是否感染了口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒和/或蓝舌病病毒。

本发明采取一种新的技术路线：在内引物FIP和BIP上各增加一条互补探针FD和BD。FD探针与FIP上的F1C片断互补，探针FD 3’端标记荧光基团(FD-F)，内引物FIP 5’端标记淬灭基团(FIP-Q)，反应前将FIP与FD进行退火形成荧光-淬灭复合探针(FIP-Q/FD-F)。由于FD与FIP的F1C位置互补，此时荧光基团与淬灭基团位置靠近，荧光被淬灭不发光。在扩增过程中，FIP仍保持原来内引物的功能继续进行扩增，在BIP引导的反向扩增时，FD被新合成的链从FIP-Q/FD-F复合探针上分离，从而释放荧光。同理，BD探针与BIP上B1C片断互补，探针BD 3’端标记荧光基团(BD-F)，内引物BIP 5’端标记淬灭基团(BIP-Q)，反应前将BIP与BD进行退火形成荧光-淬灭复合探针(BIP-Q/BD-F)。由于BD与BIP的B1C位置互补，此时荧光基团与淬灭基团位置靠近，荧光被淬灭不发光。在扩增过程中，BIP仍保持原来内引物的功能继续进行扩增，在FIP引导的反向扩增时，BD被新合成的链从BIP-Q/BD-F复合探针上分离，从而释放荧光。LAMP扩增效率非常高，可以在短时间内迅速合成大量的DNA，因此反应产物中含有大量游离的FD-荧光和BD-荧光，最终达到肉眼可见的水平。FIP与BIP同时进行双荧光标记，反应后荧光增量更高，更有效抑制假阳性的产生，区分更明显。根据探针所标记的荧光颜色不同，可进行多重鉴别检测，反应结束后直接观察反应管颜色判读反应结果，不需要电泳和添加染料，方便快速，省时省力。

该方法有如下优点：1、继承了LAMP的优点：简便、快速、灵敏、成本低。2、不需要单独设计探针，探针序列与内引物互补，3’端标记荧光基团，反应前与内引物退火，直接加入体系反应使用。3、特异性更好：扩增过程中链的延伸导致荧光基团的释放，需要消耗反应能量，可抑制假阳性的产生。相比普通PCR，LAMP引物成倍增加，多重体系内存在数十条引物，引物间相互缠绕，可能会导致非特异性扩增。在本发明中，偶尔在实时浊度仪上能监测到非特异性扩增的浊度曲线，但反应结束后，在多色荧光成像分析系统下，荧光基团未被释放，因此不能发光，可见该多重RT-LAMP方法特异性较好。4、减少实验室核酸污染，反应后直接观察反应管颜色判读结果，不需要电泳或开盖添加染料，大大降低LAMP后续的气溶胶污染。5、结果准确：本发明使用了三种不同荧光基团：ALEXA FLUOR 488，CY5和CY3,这三种荧光基团的激发光和吸收光均有差异，因此可呈现不同的颜色：ALEXA FLUOR 488吸收波为520nm，呈黄绿色；CY5吸收波为664nm，呈大红色；CY3吸收波为570nm，呈蓝色(CY3原始色为橙色，影像仪赋予其蓝色，结果判读更清晰)，且不同的荧光基团仅能在特定的通道下观察到，即在520通道下只能观察到ALEXA FLUOR 488，无法观察到CY5，多重阳性结果可在对应的2～3个通道下同时可见，颜色呈混合色。相比沉淀物观察，电泳和加染料等方式更准确，是第一次实现了真正意义上的多重LAMP鉴别检测。

New England Biolabs的WarmStart 2×预混液内含有UDG和染料，以及Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶和WarmStart RT×反转录酶。Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶和WarmStart RT×反转录酶均经过基因工程改造，在LAMP反应中的扩增效率和性能更高，且耐室温放置。预混液中的dUTP和热敏UDG可有效降低残留污染风险，可消除先前扩增产生的气溶胶造成的底物污染，热敏UDG在温度＞50℃时可完全失活，因此对反应没有影响。预混液中含有可视化的PH值指示剂，在LAMP的反应过程中，DNA聚合酶发挥聚合作用，改变质子数量进而改变PH值，使粉色反应液变成黄色，颜色改变清晰，肉眼可见：阳性反应结果变为黄色，阴性反应结果仍为粉色。本发明旨在鉴别诊断三种牛急性传染病，若临床使用中只要求检测阳性不合格样品不需要区分这三种病毒，可以使用该预混液直接进行现场检疫，反应后凭肉眼观察产物颜色变化的方法判断结果。

本发明的方法实现了二重到三重的最大技术难点突破，具体如下：

1、第三种荧光通道的寻找：

多色荧光成像分析系统购自美国BIO-RAD公司产品目录号为Universal HoodⅢ的检测波长为：495-750nm，而蓝色荧光的波长范围为：422-455nm，也就是说现存的仪器无法检测蓝色荧光。发明人比较4种荧光基团(ROX、Alexa Flour 586、CY3、Texas Red)，最终发现只有CY3只可以在570通道下显色的荧光,且与另外520nm和670nm通道无交叉，但CY3荧光原始色是橙色，并不是蓝色，但橙色与绿色，很难肉眼区分。发明人通过编程，使CY3在呈象仪中输出显示为蓝色，因此找到第三种蓝色荧光，可用于三重反应。

2、荧光淬灭复合探针对反应有抑制作用，通过添加一定浓度的内引物消除抑制：

发明人发现使用荧光淬灭复合探针FIP-FD(或BIP-BD)完全代替标准FIP(或BIP)引物时，不仅荧光本底值高，对扩增也有一定相对的抑制作用甚至不反应。FIP-FD(或BIP-BD)通过搭配一定配比的标准FIP(或BIP)引物，这种抑制作用显著降低。

本实验优化了三重荧光LAMP体系中荧光淬灭复合探针FIP-FD(或BIP-BD)与标准内引物的配比，发现使用内引物FIP(或BIP)：荧光淬灭复合探针FIP-FD(或BIP-BD)＝1：1的配比可以有效减少抑制作用，并产生清晰的荧光信号，同时降底荧光本底值，又能保证稳定扩增，这在多重反应检测至关重要。

3、三重反应引物和探针间的争夺反应体系，整个反应系统失衡，不能反应。

每个反应通过添加5U Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶和5U WarmStart RT×反转录酶提高反应效率，达到三重反应平衡，各自不受干扰扩增。不添加酶之前，整个反应被抑制，不反应。

综上，本发明设计了多套引物，优化筛选特异性引物组合，首次在LAMP方法中加入了荧光-淬灭复合探针，探针3’端标记不同颜色的荧光基团，最终成功建立了在同一反应管里鉴别诊断FMDV，VSV和BTV的多重RT-LAMP检测方法，该法特异性好，敏感性高，每个反应最低能检测到1copies的病毒RNA，反应时间快，全程只需要65分钟就能完成检测，反应后可通过反应产物观察颜色直接读取结果，可用于临床鉴别诊断和流行病学调查，可在条件较差的基层地区开展现场检疫。

附图说明

图1为多重RT-LAMP特异性实验结果。

图2为多重荧光RT-LAMP敏感性结果。

图3为多重RT-LAMP检测方法干扰性结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

WarmStart RT-LAMP核酸扩增试剂盒购于New England Biolab公司产品目录号为#M1804S，Loopamp实时浊度仪购自日本Eiken Chemical公司产品目录号为LA-320C；RNA/DNA抽提试剂盒购自全式金公司产品目录号为ER201-01，质粒小量提取试剂盒购自全式金公司产品目录号为EM101-01；PCR SuperMix试剂盒购自北京全世金公司产品目录号为AS122-11；pGM-T载体购自天根公司产品目录号为VT202-01；T7体外转录试剂盒购自北京百奥莱博科技公司产品目录号为BTN91106；微量核酸测定仪购自美国Thermo Scientific公司产品目录号为NanoDrop 2000；多色荧光成像分析系统购自美国BIO-RAD公司产品目录号为Universal HoodⅢ。

实施例中用到的各个毒株如下表1所示：

表1 为实施例中用到的各个毒株

实施例1、口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、蓝舌病病毒LAMP检测的引物及方法

一、引物的设计

根据FMDV的3D基因，VSV的核蛋白N基因和BTV的VP7基因的保守区域，进行序列分析，在序列分析的基础上选择靶点并设计引物，得到由数千个引物对组成的引物对库。对引物对库中的各个引物对一一进行预实验，检测引物对的灵敏度、特异性和普适性，最终得到LAMP检测的引物，并在内引物FIP中引入荧光-淬灭复合探针，扩增过程中复合探针分离释放荧光。探针FD和BD的3’端分别标记荧光团ALEXA FLUOR 488、CY5和CY3，内引物FIP和BIP的5’端标记对应的BHQ系列淬灭基团，反应后根据反应产物颜色判读检测结果。

引物和探针序列见表2。

表2 为引物和探针序列

上述的引物和探针中，各个病原菌对应的探针FD与内引物FIP中的F1C互补，探针BD与内引物BIP中的B1C互补。

上述各个病原菌的内引物FIP的5‘端标记淬灭基团后命名为内引物FIP-淬灭(FIP-Q)，内引物BIP的5‘端标记淬灭基团后命名为内引物BIP-淬灭(BIP-Q)；

上述各个病原菌的探针FD的3‘端标记荧光基团后命名为探针FD-荧光(FD-F)；

上述各个病原菌的探针BD的3‘端标记荧光基团后命名为探针BD-荧光(BD-F)；

将上述各个引物和探针用宝生物公司RNase-free Water稀释到所需浓度，商品号9012，得到各个引物溶液和探针溶液。

在反应前将各个病原菌的内引物FIP-淬灭(FIP-Q)与其对应的探针FD-荧光(FD-F)进行退火，使荧光呈熄灭状态；将各个病原菌的内引物BIP-淬灭(BIP-Q)与其对应的探针FD-荧光(BD-F)进行退火，使荧光呈熄灭状态；具体如下：

50μM FIP-Q溶液与50μM FD-F溶液混匀，加热至98℃，将混合物慢慢冷却到室温完成退火，得到荧光-淬灭复合探针FIP-FD，备用。

50μM BIP-Q溶液与50μM BD-F溶液混匀，加热至98℃，将混合物慢慢冷却到室温完成退火，得到荧光-淬灭复合探针BIP-BD，备用。

二、多重RT-LAMP反应体系参数优化

上述表2所示的引物和探针进行LAMP反应的参数优化。被优化的参数包括反应体系的参数和反应程序的参数。反应体系的参数包括(20μL)：初始反应体系中，DNA聚合酶的含量、反转录酶含量、荧光-淬灭复合探针、F3、B3、Floop和Bloop的浓度。反应程序的参数包括：退火延伸温度。

荧光-淬灭复合探针FMDV FIP-FD为将50μM FMDV-FIP溶液与50μM FMDV-FD溶液混匀，加热至98℃，将混合物慢慢冷却到室温完成退火，得到荧光-淬灭复合探针FMDV FIP-FD，备用。

荧光-淬灭复合探针VSV FIP-FD为将50μM VSV-FIP溶液与50μM VSV-FD溶液混匀，加热至98℃，将混合物慢慢冷却到室温完成退火，得到荧光-淬灭复合探针VSV FIP-FD，备用。

荧光-淬灭复合探针BTV FIP-FD为将50μM BTV-FIP溶液与50μM BTV-FD溶液混匀，加热至98℃，将混合物慢慢冷却到室温完成退火，得到荧光-淬灭复合探针BTV FIP-FD，备用。

荧光-淬灭复合探针FMDV BIP-BD为将50μM FMDV-BIP溶液与50μM FMDV-BD溶液混匀，加热至98℃，将混合物慢慢冷却到室温完成退火，得到荧光-淬灭复合探针FMDV BIP-BD，备用。

荧光-淬灭复合探针VSV BIP-BD为将50μM VSV-BIP溶液与50μM VSV-BD溶液混匀，加热至98℃，将混合物慢慢冷却到室温完成退火，得到荧光-淬灭复合探针VSV BIP-BD，备用。

荧光-淬灭复合探针BTV BIP-BD为将50μM BTV-BIP溶液与50μM BTV-BD溶液混匀，加热至98℃，将混合物慢慢冷却到室温完成退火，得到荧光-淬灭复合探针BTV BIP-BD，备用。

建议初始反应体系为：

20μL标准LAMP反应体系如下：模板1μL、10μL WarmStart 2×预混液(含UDG和染料，New England Biolabs，MA，USA)、0-25U Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶、0-25UWarmStart RT×反转录酶、0.8μM FMDV FIP、0.8μM BTV FIP、0.8μM VSV FIP、0.1-50μMFMDV FIP-FD退火复合探针(其中FMDV-FIP：FMDV-FD质量比＝1：1)、0.1-50μM BTV FIP-FD退火复合探针(其中BTV-FIP：BTV-FD质量比＝1：1)、0.1-50μM VSV FIP-FD退火复合探针(其中VSV-FIP：VSV-FD质量比＝1：1)、0.8μM FMDV BIP、0.8μM VSV BIP、0.8μM BTV BIP、0.1-50 FMDV BIP-BD退火复合探针(其中FMDV-BIP：FMDV-BD质量比＝1：1)、0.1-50μM BTVBIP-BD退火复合探针(其中BTV-BIP：BTV-BD质量比＝1：1)、0.1-50μM VSV BIP-BD退火复合探针(其中VSV-BIP：VSV-BD质量比＝1：1)、0.01-20μM FMDV-F3、0.01-20μM BTV-F3、0.01-20μM VSV-F3、0.01-20μM FMDV-B3、0.1-20μM BTV-B3、0.1-20μM VSV-B3、0.02-20μM FMDV-Floop、0.02-20μM BTV-Floop、0.02-20μM VSV-Floop、0.02-20μM FMDV-Bloop、0.02-20μMBTV-Bloop、0.02-20μM VSV-Bloop，余量为水。

最优反应体系如下：

20μL标准LAMP反应体系如下：模板1μL、10μL WarmStart 2×预混液(含UDG和染料，New England Biolabs，MA，USA)、5U Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶、5U WarmStart RT×反转录酶、0.8μM FMDV FIP、0.8μM BTV FIP、0.8μM VSV FIP、0.8μM FMDV FIP-FD退火复合探针(含0.4μM FMDV-FIP与0.4μM FMDV-FD)、0.8μM BTV FIP-FD退火复合探针(含0.4μMBTV-FIP与0.4μM BTV-FD)、0.8μM VSV FIP-FD退火复合探针(含0.4μM VSV-FIP与0.4μMVSV-FD)、0.8μM FMDV BIP、0.8μM VSV BIP、0.8μM BTV BIP、0.8μM FMDV BIP-BD退火复合探针(含0.4μM FMDV-BIP与0.4μM FMDV-BD)、0.8μM BTV BIP-BD退火复合探针(含0.4μMBTV-BIP与0.4μM BTV-BD)、0.8μM VSV BIP-BD退火复合探针(含0.4μM VSV-BIP与0.4μMVSV-BD)、0.1μM FMDV-F3、0.1μM BTV-F3、0.1μM VSV-F3、0.1μM FMDV-B3、0.1μM BTV-B3、0.1μM VSV-B3、0.2μM FMDV-Floop、0.2μM BTV-Floop、0.2μM VSV-Floop、0.2μM FMDV-Bloop、0.2μM BTV-Bloop、0.2μM VSV-Bloop，余量为水。

建议反应程序：58-67℃60分钟扩增，80℃灭活酶5分钟结束反应；

最优反应程序为：63℃60分钟扩增，80℃灭活酶5分钟结束反应。

因此，表2所示的各个病原菌扩增所需引物和探针单独包装，用于制备口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、蓝舌病病毒LAMP检测试剂盒。

也可以将表2中各个病原菌的FIP和FD替换为荧光-淬灭复合探针FIP-FD，各个病原菌的BIP和BD替换为荧光-淬灭复合探针BIP-BD，与内引物、外引物和环引物分别单独包装，用于制备口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、蓝舌病病毒检测LAMP试剂盒。

上述试剂盒中还可以包括含UDG和可视化的PH值指示剂的2×预混液(如WarmStart 2×预混液)、Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶和WarmStart RT×反转录酶等。

三、方法的建立

1、采用RNA/DNA共提试剂盒提取待测样本的核酸。

2、取步骤1得到的核酸，作为模板进行如下LAMP反应，

最优反应体系如下：20μL标准LAMP反应体系如下：模板1μL、10μL WarmStart 2×预混液(含UDG和染料，New England Biolabs，MA，USA)、5U Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶、5U WarmStart RT×反转录酶、0.8μM FMDV FIP、0.8μM BTV FIP、0.8μM VSV FIP、0.8μMFMDV FIP-FD退火复合探针(含0.4μM FMDV-FIP与0.4μM FMDV-FD)、0.8μM BTV FIP-FD退火复合探针(含0.4μM BTV-FIP与0.4μM BTV-FD)、0.8μM VSV FIP-FD退火复合探针(含0.4μMVSV-FIP与0.4μM VSV-FD)、0.8μM FMDV BIP、0.8μM VSV BIP、0.8μM BTV BIP、0.8μM FMDVBIP-BD退火复合探针(含0.4μM FMDV-BIP与0.4μM FMDV-BD)、0.8μM BTV BIP-BD退火复合探针(含0.4μM BTV-BIP与0.4μM BTV-BD)、0.8μM VSV BIP-BD退火复合探针(含0.4μM VSV-BIP与0.4μM VSV-BD)、0.1μM FMDV-F3、0.1μM BTV-F3、0.1μM VSV-F3、0.1μM FMDV-B3、0.1μM BTV-B3、0.1μM VSV-B3、0.2μM FMDV-Floop、0.2μM BTV-Floop、0.2μM VSV-Floop、0.2μMFMDV-Bloop、0.2μM BTV-Bloop、0.2μM VSV-Bloop，余量为水。

反应程序：63℃60分钟扩增，80℃灭活酶5分钟结束反应，使用LA-320时实浊度仪或水浴锅完成。

反应结果读取：反应产物使用伯乐影像分析仪进行分析，在对应通道下观察反应管所荧光基团颜色判读结果：FDMV阳性(ALEXA FLUOR 488标记)在520通道下显绿色，VSV阳性(CY5标记)在670通道下显红色，BTV阳性(CY3标记)在570通道下显蓝色，CY3原始色为橙色，影像仪赋予其蓝色，不影响结果判读。

也可使用实时浊度仪读取结果，横坐标表示反应时间，纵坐标表示浊度强度，即RT-LAMP副产物焦磷酸镁白色沉淀的量，但是浊度曲线只能检测阳性样品，不能进行病原鉴定。

实施例2、口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、蓝舌病病毒LAMP检测特异性实验

待测样本为：口蹄疫灭活病毒A型(FMDV A型)，O型(FMDV O型)，Asia 1型(FMDVAsia 1型)，水泡性口炎灭活病毒新泽西型(NJ型，VSV NJ型)和印第安型(IND型，VSV IND型)，BTV 4型(即蓝舌病病毒4型)灭活病毒、BTV 18型(即蓝舌病病毒18型)灭活病毒和FMDV(A型)+VSV(NJ型)+BTV(8型)各病毒等量(病毒数量相同)混样。

蓝舌病(IBRV)参考毒株、PPRV(即小反刍兽疫病毒)灭活病毒，口蹄疫(MB)广西分离株和猪水泡(SVDV)灭活病毒为对照病原。

按照实施例1的三的方法进行检测。以IBRV，PPRV，MB，SVDV和VEV为对照病原。

结果如图1所示，1:FMDV A型,2:FMDV O型,3:FMDV Asia 1型,4:VSV IND型,5:VSVNJ型,6:BTV 4型,7:BTV 18型,8:FMDV(A型)+VSV(NJ型)+BTV(8型)三重,9:PPRV,10:SVDV,11:IBRV,12:MB,13:阴性对照(健康牛血抽提RNA)，14空白对照(水)；可以看出，多重RT-LAMP体系可同时扩增FMDV，VSV，BTV病毒及其混合样品，FMDV阳性管显绿色(1-3)，VSV阳性管显红色(4-5)，BTV阳性管显蓝色(6-7)，混合样品阳性管显混合色(8)，并在对应该的通道下可见，但对其它对照病毒均无扩增，特异性好。

实施例3、口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、蓝舌病病毒LAMP检测敏感性实验

一、标准品制备

提取FMDV A型灭活病毒的总RNA并反转录为cDNA，用FMDV外引物(FMDV-B3，FMDV-F3)、PCR(premixTaq，Takara，大连)扩增226bp片段(序列25)。

提取VSV NJ型灭活病毒的总RNA并反转录为cDNA，用VSV外引物(VSV-F3，VSV-B3)PCR(premixTaq，Takara，大连)扩增214bp片段(序列26)。

提取BTV 1型(即蓝舌病病毒1型)灭活病毒的总RNA并反转录为cDNA，用BTV外引物(BTV-F3,BTV-B3)PCR(premixTaq，Takara，大连)扩增223bp片段(序列27)。

用琼脂糖凝胶回收纯化上述PCR产物，连入pGM-T载体(天根，北京)，筛选获得含有目的病毒的特异性片段的阳性重组菌，用试剂盒(MidiPlasmidkid，天根，北京)提取阳性重组菌的质粒，得到各个标准品。

质粒FMDV为将序列表的序列25所示的双链DNA分子，克隆入pGM-T载体，得到质粒FMDV。

质粒VSV为将序列表的序列26所示的双链DNA分子，克隆入pGM-T载体，得到质粒VSV。

质粒BTV为将序列表的序列27所示的双链DNA分子，克隆入pGM-T载体，得到质粒BTV。

参照T7体外转录试剂盒(Fermentas)说明书分别将质粒FMDV、质粒VSV和质粒BTV酶切线性化，用DNA酶消除其中DNA的污染，体外转录为高纯度RNA，用NanoDrop 2000核酸测定仪测定RNA浓度，得到质粒FMDV体外转录RNA、质粒VSV体外转录RNA和质粒BTV体外转录RNA。

根据阿弗加德罗常数将浓度转换为拷贝数，将三种计算好拷贝数的体外制备RNA分别稀释至3.33×10⁸～1copies/μL，再将同浓度的RNA等体积混合，进行10倍稀释，制备成10倍梯度稀释后混合样本RNA标准品，其中每种RNA标准品的浓度均可达到1×10⁸～1copies/μL，置-70℃保存备用。

二、LAMP反应

将制备好的不同浓度的10倍梯度稀释后混合样本RNA标准品(每种体外转录RNA浓度为1×10⁸-1copies/μL)，每个梯度标准品取1μL为模板，按照实施例1的三的方法进行检测，评估其敏感性。

结果如图2所示，1：1×10⁸1copies/μL，2：1×10⁷1copies/μL，3：1×10⁶1copies/μL，4：1×10⁵1copies/μL，5：1×10⁴1copies/μL，6：1×10³1copies/μL，7：1×10²1copies/μL，8：1×10¹1copies/μL，9：1copies/μL(FMDV,VSV和BTV RNA混合模板标准品),10:阴性对照；多重荧光RT-LAMP灵敏度为1copies/反应病毒RNA，该方法灵敏性高。

实施例4、口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、蓝舌病病毒LAMP检测干扰性实验

在多重反应中，同一个反应管内多套引物同时竞争反应体系，高浓度的模板在反应一开始时可能会讯速夺取反应组份，抑制低浓度模板的扩增。

将三种质粒FMDV体外转录RNA、质粒VSV体外转录RNA和质粒BTV体外转录RNA按照不同浓度进行组合，制备不同浓度模拟混合感染样品：样品1(10²FMDV+10²VSV+10⁸BTV)，样品2(10²FMDV+10³VSV+10⁸BTV)，样品3(10²FMDV+10⁴VSV+10⁷BTV)，样品4(10²FMDV+10⁵VSV+10⁶BTV)，样品5(10²FMDV+10⁶VSV+10⁵BTV)，样品6(10²FMDV+10⁷VSV+10⁴BTV)，样品7(10²FMDV+10⁸VSV+10³BTV)，样品8(10²FMDV+10⁸VSV+10²BTV)。

样品1为将质粒FMDV体外转录RNA、质粒VSV体外转录RNA、质粒BTV体外转录RNA等体积混匀得到的样品，且各个RNA浓度分别为10²copies/μL、10²copies/μL、10⁸copies/μL；

其他样品类似，唯一区别就是浓度不同。

以上述不同浓度模拟混合感染样品为模板，按照实施例1的三的方法进行检测，评估不同模板浓度相差较大时，各模板间是否存在干扰现象。

结果如图3所示，1-8分别对应样品1-样品8；当一个模板浓度高而另一个模板浓度较低时，多重RT-LAMP仍然可同时检测到三个模板，表明混合样品中各样本浓度不影响彼此扩增结果，干扰性小。

实施例5、方法的实际应用

待测样本为：对33份可疑牛样品进行检测。

采用实施例1的三的方法对33份可疑牛样品进行检测，结果同时检测到9份FMDV阳性样品，0份水泡性口炎阳性样品和1份BTV阳性样品，并未检测到混合感染样品。

同时采用OIE推荐引物(表3)对33份可疑牛样品进行荧光RT-PCR检测，结果与上述实施例1的三的方法检测结果一致，同时检测到9份FMDV阳性样品，0份水泡性口炎阳性样品和1份BTV阳性样品，并未检测到混合感染样品。

因此，本发明的方法检测结果与OIE推荐的荧光RT-PCR检测方法一致，符合率100％，临床诊断效果好。

表3 为OIE推荐引物

SEQUENCE LISTING

<110>广西壮族自治区兽医研究所

<120>可视化口蹄疫、水泡性口炎和蓝舌病多重RT-LAMP检测方法及引物

<160> 27

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

actgggtacg gcaaatgc 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

caggaaggtc tgacaagcaa 20

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

gcagtatctg gttccatggc gtactgagca tctacgaggc a 41

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

ttgacttcga gaacggcacg gttctccatg agctctaggg c 41

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

aagaccgtcg acgcctttga 20

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

tcggacccga ggtcgc 16

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

acgccatgga accagatact gc 22

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

ccgtgccgtt ctcgaagtca a 21

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

agaagacaaa tacacaacag aa 22

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 10

cttgtcaaac tctgccttg 19

<210> 11

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 11

ccaagccagt ccacgacatt tgatggtctg aagaaattag atgt 44

<210> 12

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 12

ggaaaaccca caccagatat gctgtctttt cacgaagtga ct 42

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 13

tcccaccaaa aggaagaaat gt 22

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 14

acttcgcaag aagagcagtc aac 23

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 15

aatgtcgtgg actggcttgg 20

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 16

gcatatctgg tgtgggtttt cc 22

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 17

gtactagcga cgccagaga 19

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 18

ctccagcatt cagtgacact 20

<210> 19

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 19

ccacgtcgaa gtctccccag taccttttac aacggaagcg g 41

<210> 20

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 20

agagactttc caacccggga gatccggacc acacactacc 40

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 21

cacgcgagca atctcattcg 20

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 22

ttcatgcgtg ccgctcaa 18

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 23

actggggaga cttcgacgtg g 21

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 24

tctcccgggt tggaaagtct ct 22

<210> 25

<211> 226

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 25

actgggtacg gcaaatgccc cactgagcat ctacgaggca atcaaaggcg tcgacggtct 60

tgacgccatg gaaccagata ctgcgcctgg tctccccggg gccctccagg ggaagcgccg 120

cggcgcactg attgacttcg agaacggcac ggtcggaccc gaggtcgcgg ctgccctaga 180

gctcatggag aaaagagaat acaaatttgc ttgtcagacc ttcctg 226

<210> 26

<211> 214

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 26

agaagacaaa tacacaacag aaaaagatga tggtctgaag aaattagatg tcccaccaaa 60

aggaagaaat gtcgtggact ggcttggctg gtatgatgac aatgggggaa aacccacacc 120

agatatgctc aacttcgcaa gaagagcagt caactctctg cagtcacttc gtgaaaagac 180

aattggcaaa tatgccaagg cagagtttga caag 214

<210> 27

<211> 223

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 27

gtactagcga cgccagagat accttttaca acggaagcgg cgaatgagat tgctcgcgtg 60

actggggaga cttcgacgtg gggaccagcg cgtcagccct atggtttttt ccttgaaact 120

gaagagactt tccaacccgg gagatggttc atgcgtgccg ctcaagcagt aaccgcggta 180

gtgtgtggtc cggatatgat tcaagtgtca ctgaatgctg gag 223

Claims (10)

1.成套试剂，为如下1)或2)：

1)所示的试剂由引物探针组Ⅰ、引物探针组Ⅱ和引物探针组Ⅲ组成；

所述引物探针组Ⅰ由引物FMDV-F3、引物FMDV-B3、引物FMDV–FIP、引物FMDV-BIP、引物FMDV-Floop、引物FMDV-Bloop、探针FMDV-FD和探针FMDV-BD组成；

所述引物探针组Ⅱ由引物VSV-F3、引物VSV-B3、引物VSV–FIP、引物VSV-BIP、VSV-Floop、VSV-Bloop、探针VSV-FD和探针VSV-BD组成；

所述引物探针组Ⅲ由引物BTV-F3、引物BTV-B3、引物BTV–FIP、引物BTV-BIP、引物BTV-Floop、引物BTV-Bloop、探针BTV-FD和探针BTV-BD组成；

2)所示的试剂由引物探针组A、引物探针组B和引物探针组C组成；

所述引物探针组A由引物FMDV FIP、引物FMDV BIP、引物FMDV-F3、引物FMDV-B3、复合物FMDV FIP-FD、复合物FMDV BIP-BD、引物FMDV-Floop和引物FMDV-Bloop组成；

所述引物探针组B由引物VSV FIP、引物VSV BIP、引物VSV-F3、引物VSV-B3、复合物VSVFIP-FD、复合物VSV BIP-BD、VSV-Floop和VSV-Bloop组成；

所述引物探针组C由引物BTV FIP、引物BTV BIP、引物BTV-F3、引物BTV-B3、复合物BTVFIP-FD、复合物BTV BIP-BD、引物BTV-Floop和引物BTV-Bloop组成；

所述复合物FMDV FIP-FD由所述引物FMDV-FIP和与其F1C段互补的探针FMDV-FD退火得到；

所述复合物FMDV BIP-BD由所述引物FMDV-BIP和与其B1C段互补的探针FMDV-BD退火得到；

所述复合物VSV FIP-FD由所述引物VSV-FIP和与其F1C段互补的探针VSV-FD退火得到；

所述复合物VSV BIP-BD由所述引物VSV-BIP和与其B1C段互补的探针VSV-BD退火得到；

所述复合物BTV FIP-FD由所述引物BTV-FIP和与其F1C段互补的探针BTV-FD退火得到；

所述复合物BTV BIP-BD由所述引物BTV-BIP和与其B1C段互补的探针BTV-BD退火得到；

所述引物FMDV-F3、引物FMDV-B3、引物FMDV-FIP、引物FMDV-BIP、引物FMDV-Floop、引物FMDV-Bloop、探针FMDV-FD、探针FMDV-BD、引物VSV-F3、引物VSV-B3、引物VSV–FIP、引物VSV-BIP、VSV-Floop、VSV-Bloop、探针VSV-FD、探针VSV-BD、引物BTV-F3、引物BTV-B3、引物BTV–FIP、引物BTV-BIP、引物BTV-Floop、引物BTV-Bloop、探针BTV-FD和探针BTV-BD的核苷酸序列分别为序列1至序列24，或分别为将序列1至序列24中的至少一个经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得的与原序列功能相同的序列；

所述FMDV-FIP、所述FMDV-BIP、所述VSV-FIP、所述VSV-BIP、所述BTV-FIP、所述BTV-BIP的末端均标记淬灭基团；

所述FMDV-FD、所述FMDV-BD、所述VSV-FD、所述VSV-BD、所述BTV-FD、所述BTV-BD的末端标记均荧光基团，且不同病原菌标记显示不同颜色的荧光基团，同一病原菌的FD探针和BD探针标记相同的荧光基团。

2.环介导等温扩增试剂，其特征在于：所述试剂中含有权利要求1中2)所示的试剂。

3.根据权利要求2所述的环介导等温扩增试剂，其特征在于：所述复合物FMDV FIP-FD、复合物FMDV BIP-BD、复合物VSV FIP-FD、复合物VSV BIP-BD、复合物BTV FIP-FD、复合物BTV BIP-BD、引物FMDV-F3、引物FMDV-B3、引物VSV-F3、引物VSV-B3、引物BTV-F3、引物BTV-B3、引物FMDV-Floop、引物FMDV-Bloop、VSV-Floop、VSV-Bloop、引物BTV-Floop、引物BTV-Bloop、引物FMDV FIP、引物BTV FIP、引物VSV FIP、引物FMDV BIP、引物BTV BIP和引物VSVBIP在所述试剂中的摩尔比为8：8：8：8：8：8：1：1：1：1：1：1：2：2：2：2：2：2：8：8：8：8：8：8。

4.根据权利要求2或3所述的环介导等温扩增试剂，其特征在于：

所述复合物FMDV FIP-FD、复合物FMDV BIP-BD、复合物VSV FIP-FD、复合物VSV BIP-BD、复合物BTV FIP-FD、复合物BTV BIP-BD、引物FMDV-F3、引物FMDV-B3、引物VSV-F3、引物VSV-B3、引物BTV-F3、引物BTV-B3、引物FMDV-Floop、引物FMDV-Bloop、引物VSV-Floop、引物VSV-Bloop、引物BTV-Floop、引物BTV-Bloop、引物FMDV FIP、引物BTV FIP、引物VSV FIP、引物FMDV BIP、引物BTV BIP和引物VSV BIP在所述试剂中的浓度依次为0.8μM、0.8μM、0.8μM、0.8μM、0.8μM、0.8μM、0.1μM、0.1μM、0.1μM、0.1μM、0.1μM、0.1μM、0.2μM、0.2μM、0.2μM、0.2μM、0.2μM、0.2μM、0.8μM、0.8μM、0.8μM、0.8μM、0.8μM和0.8μM。

5.权利要求1所述成套试剂或权利要求2-4任一所述的环介导等温扩增试剂在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(d1)或(d2)或(d3)：

(d1)鉴别或辅助鉴别口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒或蓝舌病病毒；

(d2)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒和/或蓝舌病病毒；

(d3)鉴定或辅助鉴定待测样本是否感染了口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒和/或蓝舌病病毒。

6.含有权利要求1所述成套试剂或权利要求2-4任一所述的环介导等温扩增试剂的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(d1)或(d2)或(d3)：

(d1)鉴别或辅助鉴别口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒或蓝舌病病毒；

(d2)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒和/或蓝舌病病毒；

(d3)鉴定或辅助鉴定待测样本是否感染了口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒和/或蓝舌病病毒。

7.权利要求6所述试剂盒的制备方法，包括将权利要求1所述成套试剂中各物质单独包装的步骤。

8.一种鉴别或辅助鉴别、鉴定或辅助鉴定待测病毒为口蹄疫病毒还是水泡性口炎病毒还是蓝舌病病毒的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测病毒的总RNA；

(2)以步骤(1)得到的总RNA为模板，采用权利要求2-4任一所述的环介导等温扩增试剂进行环介导等温扩增，检测环介导等温扩增产物；

若所述环介导等温扩增产物显色FMDV-FD或FMDV-BD标记的荧光基团颜色，则待测病毒为或候选为口蹄疫病毒；反之，则不为；

若所述环介导等温扩增产物显色VSV-FD或VSV-BD标记的荧光基团颜色，则待测病毒为或候选为水泡性口炎病毒；反之，则不为；

若所述环介导等温扩增产物显色BTV-FD或BTV-BD标记的荧光基团颜色，则待测病毒为或候选为蓝舌病病毒；反之，则不为；

若所述环介导等温扩增产物显色上述探针任两种组合的荧光基团混合颜色，则待测病毒为或候选为荧光基团对应标记探针对应的病毒混合；反之，则不为；

若所述环介导等温扩增产物显色上述探针三种组合的荧光基团混合颜色，则待测病毒为或候选为三种病毒混合；反之，则不为。

9.一种鉴定或辅助鉴定待测样本是否感染口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒和/或蓝舌病病毒的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测病毒的总RNA；

(2)以步骤(1)得到的总RNA为模板，采用权利要求2-4任一所述的环介导等温扩增试剂进行环介导等温扩增，检测环介导等温扩增产物；

若所述环介导等温扩增产物显色FMDV-FD或FMDV-BD标记的荧光基团颜色，则待测样本感染或候选感染口蹄疫病毒；反之，则不为；

若所述环介导等温扩增产物显色VSV-FD或VSV-BD标记的荧光基团颜色，则待测样本感染或候选感染口蹄疫病毒水泡性口炎病毒；反之，则不为；

若所述环介导等温扩增产物显色BTV-FD或BTV-BD标记的荧光基团颜色，则待测样本感染或候选感染口蹄疫病毒蓝舌病病毒；反之，则不为；

若所述环介导等温扩增产物显色上述探针任两种组合的荧光基团混合颜色，则待测样本感染或候选感染荧光基团对应标记探针对应的病毒混合；反之，则不为；

若所述环介导等温扩增产物显色上述探针三种组合的荧光基团混合颜色，则待测样本感染或候选感染三种病毒混合；反之，则不为。

10.权利要求1所述成套试剂或权利要求2-4任一所述的环介导等温扩增试剂或权利要求6所述的试剂盒在如下任一中的应用：

1)鉴别或辅助鉴别口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒或蓝舌病病毒；

2)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒或蓝舌病病毒；

3)鉴定或辅助鉴定待待测样本是否感染了口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒和/或蓝舌病病毒。

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