CN111662993A - 一种对创伤弧菌Sv4血清型O抗原血清型分子分型的检测方法 - Google Patents

一种对创伤弧菌Sv4血清型O抗原血清型分子分型的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及对创伤弧菌（Vibrio vulnificus，Vv）Sv4血清型的O抗原进行分析，并建立了使用基于MGB探针的实时荧光TaqMan聚合酶链式反应快速检测体系。本发明以创伤弧菌O抗原基因簇内的特异基因，即orf5为靶基因，设计了用于对创伤弧菌的O抗原加以鉴别分型的引物及MGB探针，为创伤弧菌的O抗原分型提供了有效途径。利用本发明中的MGB探针检测不同来源样品中的创伤弧菌中的Sv4血清型，具有高灵敏度、高特异性及快速检测等诸多优点。

Description

一种对创伤弧菌Sv4血清型O抗原血清型分子分型的检测方法
技术领域
本发明涉及对样品中创伤弧菌Sv4血清型菌株O抗原分型的TaqMan-MGB技术及其制备方法。本发明还设计利用所述的MGB探针进行检测的方法。
背景技术
创伤弧菌，或称为海洋弧菌，是一种栖息于海洋中的细菌，属革兰氏阴性弧菌。在液体培养基中菌体大小为0.7×2-3μm，稍弯曲。在固体培养基中呈多样性，有极端单鞭毛。最适生长温度为30℃，兼性厌氧。创伤弧菌广泛分布在海水中，可从牡蛎等海产品中分离得到。本菌主要通过伤口接触海水造成感染，也可经口感染。经伤口感染时可导致蜂窝织炎及骨髓炎等多种炎症，经口感染时常迅速导致菌血症或败血症。感染本菌后如不及时治疗，病死率很高。它对常用抗生素的耐药率有逐年增加的趋势，并引起临床医生和微生物学者的严重关注。但是在血清学水平上，利用创伤抗血清进行鉴定受到变异、可用性和特异性的限制，所以需要一个更具体可行的分子分型方案。已知细菌表面多糖对不同的血清有特异性，如O抗原或荚膜，而根据O抗原的多样性可以对创伤弧菌的不同菌株进行分型鉴定。
TaqMan-MGB实时荧光PCR（Real-time fluorescence PCR）技术原理：将标记有荧光素的TaqMan探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的TaqMan探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值。
TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针，其5'末端携带荧光基团，如FAM、TET、VIC、HEX等，3'端携带淬灭基团，如TAMRA、BHQ等。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
TaqMan-MGB 探针是近年来在 TaqMan探针的基础上改进的一种新技术,它在探针3′端增加了MGB分子，这种物质能够提高探针的退火温度(Tm值)，从而使它能够分辨1个碱基的差别，完全配对，有荧光信号；只要有一个碱基不匹配,就没有信号。探针的设计首先为15-30 nt长度，Tm为68-70 ℃。在探针的5'末端，避免了可能引起荧光猝灭的G的存在。探针由AuGCT Biotechnology Corporation（中国北京）合成，分别在5'和3'末端具有6-羧基荧光素（FAM）和小沟结合（MGB）部分。引物的长度约为25 nt，Tm在55-60 ℃之间。产生的PCR产物在50-200 bp之间。引物由Invitrogen（中国上海）合成。如果正向引物的3'末端距离探针的5'末端1-20 nt（通常为10 nt或更少），则可能更好。
利用TaqMan MGB PCR检测时，扩增反应在25 μL的总体积中进行，包括12.5 μLPremix Ex TaqTM（Takara），0.3 μL各10 μM正向和反向引物，0.3 μL 10 μM探针，0.2 μLROXII，0.3 μL DNA和11 μl ddH2O。 一个方案包括在95 ℃下进行3分钟的初始变性步骤，然后在95 ℃下变性15秒，在60 ℃下退火45秒进行40个循环，一式三份进行7500实时PCR系统（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA），随后利用仪器（如ABI 7500）进行检测和结果分析。Ct值<30且出现扩增曲线则为阳性。
发明内容
为实现上述目的，本发明公开了对样品中创伤弧菌Sv4血清型O抗原分型的MGB探针，该探针含有5'报告染料（FAM）和3'非荧光猝灭剂（NFQ），在3'末端与小沟结合物（MGB）缀合；其主要特征在于所述的创伤弧菌Sv4血清型O抗原分型指的是：从创伤弧菌Sv4血清型的O抗原基因簇特异基因序列，具有从SEQ ID NO:3所示的DNA序列。
本发明所述对样品中创伤弧菌Sv4血清型O抗原分型的TaqMan引物，其特征在于所述的引物序列：具有SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:2所示的引物。
本发明进一步公开了对样品中创伤弧菌Sv4血清型O抗原分型的MGB探针，用于特异性快速检测创伤弧菌Sv4血清型O抗原分型方面的应用。其中该MGB探针用于创伤弧菌Sv4血清型中的O抗原分型检测。所述的创伤弧菌指的是分离于任何适合创伤弧菌生活的环境中所得到的样品的纯培养物的粗提。实验结果显示：
（1）本发明对于创伤弧菌Sv4血清型基因组样品的灵敏度为9 pg；
（2）本发明可以在较低的DNA浓度下对创伤弧菌Sv4血清型O抗原进行分型。
本发明提供的一种检测环境中创伤弧菌Sv4血清型的TaqMan-MGB PCR体系，该体系包括：2×Premix Ex TaqTM（Takara），10 μM正向和反向引物，10 μM探针，ROXII，0.3 μLDNA和ddH2O。其主要特征在于所述的根据从创伤弧菌Sv4血清型的O抗原基因簇特异基因序列设计的引物和探针：
（1）从创伤弧菌Sv4血清型的O抗原基因簇特异基因序列中用Primer Express3.0设计的引物长度约为25 nt，Tm在55-60 ℃之间；PCR产物在50-200 bp之间。如果正向引物的3'末端距离探针的5'末端1-20 nt（通常为10 nt或更少），则可能更好。
（2）从创伤弧菌Sv4血清型的O抗原基因簇特异基因序列中用Primer Express3.0设计的探针长度为15-30 nt，Tm为68-70 ℃。在探针的5'末端，避免了可能引起荧光猝灭的G的存在，分别在5'和3'末端具有6-羧基荧光素（FAM）和小沟结合（MGB）部分。本发明是TaqMan-MGB PCR技术的实际应用，用于创伤弧菌Sv4血清型分型鉴定。
由上述的技术方案可见，本发明首次将TaqMan-MGB PCR技术引入创伤弧菌Sv4血清型O抗原分型领域，建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的样品中创伤弧菌Sv4血清型检测MGB探针及其检测方法，利用本发明的MGB探针可以达到鉴定样品中常见的创伤弧菌Sv4血清型菌株的目的，由于操作简便，准确性高，重复性强，该发明对于各级医疗部门实时快速检测样品中创伤弧菌Sv4抗原分型具有重要的应用价值。
附图说明
图1 Sv4血清型探针自身阳性结果：Sv4：Ct=13.29；
图2 创伤弧菌Sv4血清型探针特异性检测，其中
A为Sv1-4：无Ct值，无扩增曲线；
B为Sv2-4：无Ct值，无扩增曲线；
C为Sv3-4：Ct=9.71；
D为Sv5-4：Ct=35.12；
E为Sv6-4：无Ct值，无扩增曲线；
F为Sv7-4：无Ct值，无扩增曲线；
Sv4的MGB探针特异性良好；
图3创伤弧菌Sv4血清型灵敏度检测（Sv4：灵敏度为9 pg）。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。
本发明所用到的创伤弧菌菌种来源如下表1所示：
表1 本实验所用到的菌种
Figure 685945DEST_PATH_IMAGE001
a，ATCC：American type culture collection
b，JCM：Japan Collection of Microorganisms
实施例1
引物、探针的设计
1、特异基因的筛选
通过比对分析，在创伤弧菌Sv4血清型的O抗原基因簇中选出相对特异性较强的基因作为设计探针的候选基因，通常会是一些罕见单糖基因或者是O-单元加工基因（wzx和wzy）。但是通过对其基因簇破解分析，发现其中并没有wzx/wzy基因，所以本发明通过对基因簇中所有的基因进行all_vs_all_blast的方法，进行比对，特异基因的匹配数必然会远小于保守基因。综合上述方法找到特异基因并对其设计探针引物。
2、引物和探针的设计
以挑选出来的创伤弧菌Sv4血清型的特异基因为模板设计TaqMan-MGB的引物和探针。使用Primer Express 3.0根据加工wzy基因的序列设计TaqMan MGB探针和引物。引物和探针的GC％含量在40-70％之间，避免了环发夹结构，自身二聚体和交叉二聚体的形成。通过使用BLAST搜索将它们的序列与GenBank中的所有序列进行比较来验证引物和探针的特异性。每种引物和探针的数量和序列信息列于表2和3中。
探针的设计首先为15-30 nt长度，Tm为68-70 ℃。在探针的5'末端，避免了可能引起荧光猝灭的G的存在。探针由AuGCT Biotechnology Corporation（中国北京）合成，分别在5'和3'末端具有6-羧基荧光素（FAM）和小沟结合（MGB）部分。
引物的长度约为25 nt，Tm在55-60 ℃之间。产生的PCR产物在50-200 bp之间。引物由Invitrogen（中国上海）合成。如果正向引物的3'末端距离探针的5'末端1-20 nt（通常为10nt或更少），则可能更好。
表2 TaqMan-MGB所用到的引物
Figure 259271DEST_PATH_IMAGE002
表3 TaqMan-MGB所用到的探针
Figure 230638DEST_PATH_IMAGE003
实施例2
样本核酸的提取（分离于任何适合创伤弧菌生活的环境中所得到的，样品的纯培养物的粗提液）
1、样品处理：取1 mL过夜培养的细菌菌液加入1.5 mL离心管中，室温8000 rpm，离心1min，弃上清，收集菌体。加入400 µL Buffer Digestion，震荡混匀，65 ℃水浴1 h至细胞完全裂解。
水浴过程中，每10 min颠倒混匀一次，可促进样品裂解，混合液变澄清透明为裂解完全；
2、加入200 µL Buffer PB，充分颠倒混匀，-20 ℃冰箱放置5 min；
3、室温10000 rpm离心5 min，将上清液（500-550 µL）转移到新的1.5 mL离心管中；
4、加入等体积的异丙醇，颠倒5-8次使之充分混匀，室温放置2-3 min，室温10000 rpm离心5 min，弃上清；
5、加入1 mL 75%乙醇，颠倒漂洗1-3 min，10000 rpm离心2 min，弃上清；
6、重复步骤5一次；
7、开盖室温倒置5-10 min至残留的乙醇完全挥发；
8、得到的DNA用50-100 µL ddH2O溶解，并于-20 ℃冰箱备用；
9、定浓度至300 ng/µL。
实施例3
样本PCR扩增
以提取的核酸溶液作为PCR反应的模板，PCR反应体系及反应条件：
PCR反应体（25 µL）：
Figure 362542DEST_PATH_IMAGE004
实施例4
阳性检测
1、Real-Time PCR 体系（25 µL）
Figure 622622DEST_PATH_IMAGE005
3、检测结果
见图1创伤弧菌探针自身阳性结果，结果表明：在创伤弧菌基因组样品Sv4血清型的MGB探针能够自身识别。
实施例5
特异性检测
1、Real-Time PCR 体系（25µL）
Figure 498174DEST_PATH_IMAGE006
Figure 28775DEST_PATH_IMAGE007
Figure 128318DEST_PATH_IMAGE008
3、检测结果：
结果表明：
在创伤弧菌基因组样品Sv4的体系中分别加入Sv1、Sv2、Sv3、Sv5、Sv6和Sv7的基因组，其中Sv1-4：无Ct值，无扩增曲线；Sv2-4：无Ct值，无扩增曲线；Sv3-4：Ct=9.71；Sv5-4：Ct=35.12；Sv6-4：无Ct值，无扩增曲线；Sv7-4：无Ct值，无扩增曲线；Sv4的MGB探针特异性良好。
实施例6
灵敏度检测
为了探究该发明的检测灵敏度，我们对创伤弧菌Sv4血清型O抗原进行灵敏度检测实验，具体方法如下：
（1）用NanoDrop OD仪对提取的基因组浓度进行测定，基因组用量分别为90 ng，9 ng，0.9 ng，0.09 ng，9 pg，0.9 pg，0.09 pg，9 fg。
（2）对基因组进行Real-Time PCR，TaqMan引物和探针杂交，上机检测。
（3）检测结果见图3。
结果表明：
（1）本发明对于创伤弧菌Sv4血清型基因组样品的灵敏度为9 pg；
（2）本发明可以在较低的DNA浓度下对创伤弧菌Sv4血清型O抗原进行分型。
SEQUENCE LISTING
<110> 南开大学
<120> 一种对创伤弧菌Sv4血清型O抗原血清型分子分型的检测方法
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcttgcagtt cgagcatttc t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcgtcgagca tgacttcatt g 21
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aaccaatgtt cttctcg 17

Claims (4)

1.一种对样品中创伤弧菌Sv4血清型O抗原分型的TaqMan特异性引物，其特征在于所述的引物具有SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
2.一种含有权利要求1所述特异性引物的MGB探针，该探针含有5'报告染料（FAM）和3'非荧光猝灭剂（NFQ），在3'末端与小沟结合物（MGB）缀合；其主要特征在于具有SEQ ID NO:3所示的探针。
3.权利要求1所述对样品中创伤弧菌Sv4血清型O抗原分型的TaqMan特异性引物在用于特异性快速检测创伤弧菌Sv4血清型O抗原分型方面的应用。
4.权利要求3所述的应用，其中所述的创伤弧菌指的是：分离于任何适合创伤弧菌生活的环境中所得到的，样品的纯培养物的粗提。
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